ΑΠΟ ΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΣΤΟΝ ΑΣΘΕΝΗ

ΤΑΧΕΙΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΛΕΓΧΟΥ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ. ΑΠΟ ΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΣΤΟΝ ΑΣΘΕΝΗ ΚΩΝ/ΝΑ Γ. ΓΚΑΡΤΖΟΝΙΚΑ Ιατρός Βιοπαθολόγος, Επίκουρη Καθηγήτρια Μικροβιολογίας, Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων

Απαιτείται ανίχνευση αντοχής?? Σημαντικός ο χρόνος ανίχνευσης αντοχής?? Τι σημαίνει ταχεία??? Πως μπορεί να επιτευχθεί?? Jim O Neil, 2014

Περιορισμένη ή μη in vitro δραστικότητα των χορηγούμενων αντιβιοτικών Η πιθανότητα θανάτου με μη κατάλληλη αρχική αντιμικροβιακή θεραπεία ήταν 2.33 φορές σε ασθενείς με BSI και VAP Υψηλότερο κόστος σε αντιμετώπιση BSI με ανεπαρκή αρχική θεραπεία

Tαχεία ανίχνευση αντοχής Διαχείριση (antimicrobial stewardship) Αποκλιμάκωση (antimicrobial de-escalation) Έλεγχος φορείας- Έλεγχος λοιμώξεων Υποστήριξη ανάπτυξης νέων αντιμικροβιακών Burnham et al., Nature Reviews/Microbiol, 2017;15:697-703

Ανθεκτικά-πολυανθεκτικά μικρόβια (MDR//XDR) Ανθεκτικά και Πολυανθεκτικά μικρόβια MDR bacteria: (Multidrug-Resistant Organisms, MDROs) Στελέχη μη ευαίσθητα σε Μεθικιλλίνη ανθεκτικός σταφυλόκοκκος (MRSA) Βανκομυκίνη ανθεκτικός εντερόκοκκος (VRE) Βακτήρια που παράγουν ευρέως φάσματος βακτήρια β-λακταμάσες (ESBLs) Βακτήρια ανθεκτικά στις καρβαπενέμες (CRO) Άλλα πολυανθεκτικά (Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa) ή παν-ανθεκτικά Gramαρνητικά παθογόνα βακτήρια (MTB..) 1 αντιμ. παράγοντες 3 ομάδες αντιβιοτικών Enterococcus faecium (VRE) Staphylococcus aureus (MRSA) Clostridium difficile (CD) Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa Enterobacteriaceae (CRKP/CRE) Cornaglia et al., EMCM, 2012, Magiorakos et al., CMI, 2011

25 % - <50% 10 %- <25 % 50 % EARS-Net surveillance data, 2017

50 %

MRSA: 25 % - <50% VRE faecium: 25 % - <50%

Διάμετρος Μέθοδοι ελέγχου ευαισθησίας (Antimicrobial Susceptibility Testing - AST) S I R MIC Μέθοδοι αναφοράς Μέθοδοι προτυποποιημένες Εύκολες στην εφαρμογή Γενικά αξιόπιστες Χαμηλό κόστος Αυτοματοποιημένα συστήματα ΧΡΟΝΟΒΟΡΕΣ ΚΑΙ 18-24 h

Τα διαθέσιμα τεστ διαβαθμισμένης συγκέντρωσης (E-test) υποεκτιμούν την MIC της Colistin (και την αντοχή σε αυτή) και πρέπει να αποφεύγονται. Προσοχή και με τον έλεγχο ευαισθησίας με τα αυτοματοποιημένα συστήματα

Livermore at et al. JAC, 2012;67:1569-1577 Determination of MICs is not always precise (σημαντικά λάθη έχουν αναφερθεί με τη χρήση των αυτοματοποιημένων συστημάτων) Βασιζόμενοι στον προσδιορισμό της ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά και τον φαινότυπο αντοχής, δεν μπορεί αξιόπιστα να γίνει διαχωρισμός των CP-CRE λόγω παραγωγής καρβαπεμενασών από τα CRE λόγω άλλων μηχανισμών http://www.eucast.org/clinical_breakpoints, CLSI supplement M 100-S, 2016,Nordmann P et al.,cmi 2012;18432-8

Θνητότητα με KPC: 48% Θνητότητα με ESBL: 22% Θνητότητα με Se KP: 17% Δράση νέων αντιμικροβιακών ουσιών Tamma et al., CID, 2017

I. Classic phenotypic methods Culture-based (dependent) methods Ανίχνευση με χρήση χρωμογόνων ή μη εκλεκτικών θρεπτικών υλικών Ανίχνευση βασισμένη στη δράση των παραγόμενων ενζύμων [Hodge test, Carbapenemase Inactivation Method (CIM) ] Ανίχνευση με χρήση αναστολέων (EDTA, βορονικό ) II. Immunological methods ΙII. Biochemical-based methods Χρωματομετρικές μέθοδοι π.χ. βασισμένες σε ενζυματική υδρόλυση Σπεκτροφωτομετρικές τεχνικές IV. Molecular methods Μέθοδοι ανίχνευσης αντιμικροβιακής αντοχής Burnham et al., Nature Reviews/Microbiol, 2017;15:697-703

Μη χρωμογόνα ενσωματωμένες συγκεντρώσεις αντιβιοτικών ή δίσκους αντιβιοτικών Χρωμογόνα καλλιεργητικά υλικά Αποικία Δείγματα φορείας Εφαρμογή για screening και ανίχνευση φορέων Απαιτούν 24-48 h επώαση ή και εμπλουτισμός (δείγμα φορείας) Για την ανίχνευση πιθανής αντοχής σε κάποιο αντιβιοτικό συνήθως απαιτείται η χρήση διαφορετικών χρωμογόνων Ανάλογα του μηχανισμού αντοχής π.χ. KPC, NDM, AmpC.. Ανάλογα του είδους του μικροβίου (εντεροβακτηριακά, Acinetobacter ) Απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση και επιβεβαίωση Brilliance MRSA,Chrom ID MRSA,BBL- CHROMagar MRSA, CHROMagar MRSA Brilliance VRE, Chrom ID VRE, CHROMagar VRE,Hardy CHROM VRE, Spectra VRE.. SuperPolymyxin medium, Brilliance ESBL/CRE, ChromID ESBL ή CARBA, CHROMagar ESBL, CHROMagar KPC, Colorex KPC,Hardy CHROM, Chrom ID CARBA SMART

KPC+MBL KPC MBL AmpC/ ESBL Φαινοτυπικές μέθοδοι Βασίζονται συχνά στη χρήση ειδικών αντιβιοτικώνυποδοχέων και αναστολέων σε μη εκλεκτικά υλικά Είναι εφαρμόσιμες από όλους και εύκολες, Δεν απαιτείται ειδικός εξοπλισμός ή εμπειρία Είναι αξιόπιστες και με σαφή κριτήρια επεξήγησης Έχουν χαμηλό κόστος Δυνατότητα ανίχνευσης νέων μηχανισμών αντοχής Καθυστέρηση των αποτελεσμάτων Προσδιορίζεται η οικογένεια π.χ. του ενζύμου (MBL), όχι όμως το υπεύθυνο γονίδιο (bla VIM, bla NDM..) Δεν υπάρχουν για όλους τους μηχανισμούς

II. Immunological methods: Μέθοδοι βασισμένοι σε συγκολλητινοαντιδράσεις Ικανοποιητικές αν ο μηχανισμός αντοχής σχετίζεται με παρουσία ενός Ag στο βακτηριακό παθογόνο (ΟΧΙ για ESBL, καρβαπενεμάσες..) Σε καλλιέργημα Χρόνος λήψης αποτελέσματος: 10-15 min Περιορισμένες για την ανίχνευση των PBP-2a των MRSA στελεχών Mέτρια Se (mec-a), ικανοποιητική Spe Ανίχνευση PBP2a με latex test Screening tests (CLSI, 2017) (33-35 o C): S. aureus: OST (MHA+4%NaCl+6μg/mL OXA) S. aureus+s.ludgunensis: 30 μg FOX (DD), 4μg/mL FOX (BMD) CNS: 30 μg FOX (DD) 16-24 h

Μέθοδοι ανοσοχρωματογραφίας: ανίχνευση καρβαπεμενασών Ανίχνευση σε στελέχη Εντεροβακτηριακών OXA-48 KPC NDM NDM + OXA-48 Negative Διαθέσιμα για ανίχνευση μίας οικογένειας ενζύμων ή περισσοτέρων (single/multiplex) Υψηλή Se/Spe : OXA-48-like, KPC, NDM, VIM Καλλιέργημα και σε (+) αιμοκαλλιέργεια Χρόνος : 5-15 min Εύκολο στη χρήση Δεν απαιτείται ειδικός εξοπλισμός ή εμπειρία Commersially available (Coris BioConcept, Quick Chaser IMP ) Multiplex lateral flow immunochromatographic test for OXA-48, KPC and NDM Meunier D et al.,jac, 2016, Dortet L et al., JAC, 2016, Glupczynski Y et al., JAC, 2017, Wareham et al, JCM. 2015

ΙΙΙ. Biochemical based assays Spectrometry Colorimetric Η ενζυμική υδρόλυση του αντιμικροβιακού ή μεταβολικά προϊόντα οδηγεί σε αλλαγή -λόγω μεταβολής του ph- χρώματος Mass spectrometry: - MALDI-TOF MS - Liquid chromatography LC-MS - Ultra-performance LC-MS - Capillary electrophoresis MS UV spectrophotometry- ESBL NDP, β-lacta Carba-NP, Blue- CARBA β-carba

ESBL NDP: ανίχνευση ESBLs σε Gram (-) βακτήρια Αρχή: in-vitro ανίχνευση υδρόλυσης μιας κεφαλοσπορίνης (cefotaxime) η οποία αναστέλλεται από ταζομπακτάμη. Εντεροβακτηριακά, Pseudomonas, Acinetobacter απευθείας από κ/α (MHΑ) Se 92.6%-95%, Spe 100% Χρόνος λήψης αποτελεσμάτων: 15-30min β-lacta test: γρήγορη ανίχνευση αντοχής Εντεροβακτηριακών σε γ γενεάς κεφαλοσπορίνες (Bio-Rad) 15 min Αποικία, δείγμα ούρων και (+) αιμοκαλλιέργεια Ικανοποιητική Se και Spe για ESBLs Χαμηλότερη Se για MBL στελέχη, AmpC Nordmann et al., JCM 2012;50:316-22; Dortet et al. JCM 2014:52:3701-6; Dortet et al. EID 2015;21:504-7, Renvoise A et al., JCM, 2013;51:4012-7, Poirel et al., JCM,2016;54:423-427, Vrioni et al., J Glob Antimicrοb Resist, 2017;18.pii:S2213-7165(17)30105-4.

Carba NP: ανίχνευση καρβαπεμενασών σε Gram (-) βακτήρια RAPIDEC Carba NP Αρχή: χρωματομετρική ανίχνευση υδρόλυσης της IMP Χρόνος λήψης αποτελέσματος < 2h (30min-2h) Ικανοποιητική Se και υψηλή Spe, Χαμηλότερη Se για ανίχνευση κάποιων OXA-48-like Και για έλεγχο φορείας Μη διάκριση της καρβαπενεμάσης In-house και εμπορικά διαθέσιμα [RAPIDEC CARBA NP//Rapid CARB Screen ] Carba NP test version II: διάκριση καρβαπεμενασών (τάξης Α, Β) Carba NP II Εναλλακτικά: Blue Carba test Άμεσα από κ/α [όλα τα gram(-)] β-carba test: αποικία για CPE ( 30 min) Nordmann et al. EID 2012;18:1503-7; Dortet et al. AAC 2012;56:6437-40; Dortet et al. CΜΙ 2014;20:340-4; Maurer et al. JCM 2015;53:95-104; Pires et al. JCM, 2013;51:4281-3; Pasteran et al. 2015;53:1996-1998, Compain F et al., JCM, 2016;54: 3065-3068

Rapid Polymyxin tests: ανίχνευση αντοχής στην Col των Gram (-) βακτηρίων Εντεροβακτηριακά, Acinetobacter, Pseudomonas (3 test) Αρχή: χρωματομετρική ανίχνευση μεταβολισμού Glu παρουσία βακτηριακής ανάπτυξης σε συγκεκριμένη συγκέντρωση Col Απευθείας από κ/α (ΜΗA, TSA..) Απευθείας από θετική αιμοκ/α ΜΟΝΟ για Εντεροβακτηριακά Χρόνος λήψης αποτελέσματος <2-4 h Υψηλή Se και Spe (ανεξάρτητα του μηχανισμού αντοχής) Εύκολη εφαρμογή και ερμηνεία (εμπορικά διαθέσιμο) Καλή συσχέτιση με μέθοδο αναφοράς (BMD) Έλεγχος σε 1, 2 ή 3 συγκεντρώσεις Εντερ: >2 mg/l (R) Acineto: 2-4 mg/l Pseud: 2-4 - 8 mg/l Νordmann et al., EID, 2016;22(6):1038-43

Μεθοδολογίες/Προσεγγίσεις του MALDI -TOF Non hydrolyzed pattern of ertapenem Ανίχνευση αντοχής Gram (+) [phyloproteomics analysis] Αλλαγές στο πρωτέομα βακτηρίων και μυκήτων προκαλούμενων από την έκθεση σε αντιμικροβιακούς παράγοντες Ανίχνευση μεταβολικών προϊόντων λακταμασών [π.χ προϊόντων υδρόλυσης των καρβαπενεμών (Mass spectrometric β-lactamase assay-msbl)] Gram (-) βακτηρίων 4 h PCR + φασματομετρία μάζας (PCR/ESI MS)- (π.χ. MDR-TB) Δυνατότητα ανίχνευσης μεγάλου εύρους γονιδίων αντοχής the full hydrolysis of ertapenem of a KPC- producing K. pneumoniae Addition of APBA inhibits the KPC mediated hydrolysis of ertapenem MSCSA (MS-Based Comparative Sequence Analysis): Ανίχνευση αντοχής σε αντιικούς παράγοντες (ganciclovir στον CMV).. Hrabac, JCM, 2012;50:2441-3; Johansson, BMC Microbiol 2014;14:89; Dortet, AAC, 2014;58:2441-5; Oviano, CMI, 2014; 20: 1146-57, Papagiannitsis CC et al., 2015, JCM;53:1731-1735, Posthuma C.C et al., JCV,2011;51(1):25-30

+ Δυνατότητα ελέγχου αντοχής στελέχους και δειγμάτων [ κυρίως επί (+) αιμοκαλλιέργειας, ούρων] Ταχεία διάγνωση (3-6 h μετά την απομόνωση στελέχους) Περιορισμός ανίχνευσης αντοχής Λίγες εφαρμογές σε κλινικά δείγματα Υψηλό κόστος Σε εξειδικευμένα εργαστήρια -

ΙV. Molecular assays PCR Realtime//Multiplex real time PCR DNA microarrays Next Generation sequencing (NGS)

Εξέλιξη Μοριακής διάγνωσης Ένας στόχος/ single PCR Πολλαπλοί στόχοι /multiple single PCR Multiplex PCR Απομόνωση-Εκχύλιση Extraction Πολλαπλασιασμός Amplification Ανίχνευση & Aποτέλεσμα Κλειστά συστήματα (όλα τα ενδιάμεσα στάδια σε ένα μηχάνημα) Ανιχνεύονται ένας ή πολλοί στόχοι ταυτόχρονα σε μικρό χρόνο Άρα Μείωση ανάγκης εκπαιδευμένου προσωπικού και χώρων Διεκπεραίωση εξέτασης σε όλες τις βάρδιες Βελτίωση χρόνου αποτελέσματος

FilmArray Platform: Nucleic-acid-based method (FDA) Nested PCR και melt curve analysis Δείγματα: θετική αιμοκαλλιέργεια κόπρανα δείγμα αναπνευστικού (ρινοφαρυγγικό) ΕΝΥ Αυτόνομο σακουλάκι με όλα τα αντιδραστήρια : Εκτελεί την εκχύλιση, ενίσχυση και ανίχνευση Είναι «κλειστό» σύστημα (=ελαχιστοποίηση επιμολύνσεων) Αποθηκεύει όλα τα αντιδραστήρια (t περιβάλλοντος)

Περιορισμένο εύρος ανίχνευσης γονιδίων Απλό: Μόνο 2 λεπτά χειρισμού Eύκολο: Δεν απαιτείται πιπετάρισμα ακριβείας Γρήγορο: Χρόνος ανάλυσης 1 h αντοχής

Real-time/Multiplex real-time PCR SME SME Πραγματοποιούνται σε στελέχη ή κλινικά δείγματα Ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών γονιδίων-στόχων αντοχής ακόμη και στο ίδιο στέλεχος (σημαντική για την αντοχή στις καρβαπενέμες) Μπορεί να συνδυαστούν με ή χωρίς sequencing των τελικών προϊόντων Παρουσιάζουν υψηλή ευαισθησία IMI OXA-48 KPC Multiplex PCR +υβριδισμός (π.χ) Genotype MTBDRplus ή MTBDRsl : INH, RIF, ETB, FLUQ Επεξεργασμένα δείγματα αναπνευστικού (5h)

Curetis Unyvero System: Unyvero pneumonia application Multiplex PCR-based method Σε δείγματα αναπνευστικού Ταυτοποίηση 17 παθογόνων Ανίχνευση 22 δεικτών αντοχής Χρόνος αποτελέσματος: 4-5 h ΜΗ ανίχνευση γονιδίων τάξης B Sample to- answer technology Jamal et al., JCM, 2014;52;2487-2492

DNA microarray technology Η τεχνική DNA microarray (μικροσυστοιχίες) στηρίζεται στο συνδυασμό τεχνικής PCR και υβριδισμού με χρήση ολιγονουκλεοτιδίων, ανιχνεύει ταυτόχρονα την παρουσία πολυάριθμων γονιδίων σε μια μόνο αντίδραση. Xρόνος λήψης αποτελέσματος: < 8 h (4-6h) Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα Καλύπτει πολλούς μηχανισμούς αντοχής Aνίχνευση καρβαπεμενασών και ESBL σε Εντεροβακτηριακά και αζυμωτικά, MTB, MRSA Check-Direct (CPE or ESBL) Check-MDR DNA microarray MVPLex system, StaphPlex CapitalBio DNA microarray. Από στελέχη και άμεσα από κλινικό δείγμα Επιχρίσματα (ρινικά, ορθικά ) Αίμα, ούρα Πυώδες, ιστικό τεμάχιο (INH/RIF MTB)

VERIGENE BC SYSTEM Microarray-based technology Επί (+) αιμοκαλλιέργειας Ταυτοποίηση και ανίχνευση γονιδίων αντοχής >93% συμφωνία με τις κλασικές μεθόδους (για AST) Χρόνος λήψης αποτελέσματος: 2,5 h

www.fda.gov/newevents/newsroom/pressannouncements/ucm543150.htm FISH / TIME-LAPSE IMAGING PhenoTestBC kit (FDA) Επί (+) αιμοκαλλιέργειας (ίσως σε BAL, τραυματικό υλικό ) Ταυτοποίηση 16 παθογόνων Έλεγχος ευαισθησίας σε 18 αντιβιοτικά Μέσω αναστολής ανάπτυξης βακτηρίου/mic CLSI ή EUCAST breakpoints (S, I, R) Ανίχνευση 2 φαινοτύπων αντοχής (MRSA, MLSb) Χρόνος λήψης αποτελεσμάτων: 6-7 h

Συμπεριλαμβάνεται: Ceftaroline (MRSA) 1. ΔΕΝ συμπεριλαμβάνεται Tig Col (μόνο για ερευνητικούς σκοπούς) 2. επιλογές για Acinetobacter

Next Generation Sequencing (NGS) Βασισμένοι στη γενετική πληροφορία o Ανίχνευση παρουσίας γονιδίων αντοχής (DNA NGS) ResFinder (bioinformatics): συσχέτιση δεδομένων αλληλούχισης με φαινοτυπική αντοχή Ανίχνευση όλων των εμπλεκόμενων στην αντοχή γονιδίων ή γενετικών στοιχείων ανακάλυψη νέων γονιδίων Ευρεία εφαρμογή σε HIV, παράσιτα.. Ταυτόχρονη αλληλούχιση πολλών γενωμάτων Πολλά υποσχόμενη για ανίχνευση αντοχής σε αργά αναπτυσσόμενα ή απαιτητικά βακτήρια Π.χ. MTB, N. gonorrhoeae Chan Kok-Gan, Exp Rev of Anti-Infect Therapy, 2016;14(7):617-619

Next Generation Sequencing (NGS) NGS: platforms for drug resistance testing

Μπορεί να αποτελέσει μέθοδο εκλογής αν επιτευχθεί: Μείωση κόστους Βελτιστοποίηση χρόνου αποτελέσματος ( 4-5 days) Βελτίωση ροής εργασίας Μεταγενωμική ανάλυση κλινικών δειγμάτων απλοποίηση λογισμικών προγραμμάτων ανάλυσης, «φιλικά» εργαλεία βιοπληροφορικής Πολύπλοκη Ακριβή Ειδικός εξοπλισμός Εξειδικευμένο προσωπικό

Πλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα μοριακών μεθόδων Ταχύτητα στην ανίχνευση γονιδίων αντοχής Καλύτερη διαχείριση ασθενούς- Άμεση θεραπευτική προσέγγιση Μείωση κόστους (θεραπείαςνοσηλείας)/ de-escalation Μείωση διασποράς ανθεκτικών στελεχών Πρόληψη λοιμώξεων Αποτελούν μεθόδους αναφοράς για την ανίχνευση γονιδίων σχετιζόμενων με αντοχή Απαιτούν ειδικό εξοπλισμό και εξειδικευμένο προσωπικό Έχουν υψηλό κόστος /// Δεν μπορούν άμεσα να χρησιμοποιηθούν από αίμα ( φορτίο) Όχι εύκολα διαθέσιμες για καθημερινή εργαστηριακή διαγνωστική Στην πλειονότητά τους τα είδη των γονιδίων που αναζητούνται είναι γνωστά

Πλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα μοριακών μεθόδων Ταχύτητα στην ανίχνευση γονιδίων αντοχής Απαιτούν ειδικό εξοπλισμό και εξειδικευμένο προσωπικό Καλύτερη διαχείριση ασθενούς- Άμεση θεραπευτική προσέγγιση Έχουν υψηλό κόστος /// Δεν μπορούν άμεσα να χρησιμοποιηθούν από αίμα ( φορτίο) Μείωση κόστους (θεραπείαςνοσηλείας)/ de-escalation Μείωση διασποράς ανθεκτικών στελεχών Όχι εύκολα διαθέσιμες για καθημερινή εργαστηριακή διαγνωστική Πρόληψη λοιμώξεων Δεν είναι όλοι οι φαινότυποι αντοχής προσδιορισμένοι από γονοτύπους Αποτελούν μεθόδους αναφοράς για την ανίχνευση γονιδίων σχετιζόμενων με αντοχή Πρόβλεψη αντοχής (έκφραση γονιδίου?) Είναι γνωστά τα είδη των γονιδίων που αναζητούνται

Δεδομένα- Προβληματισμοί για το μέλλον ΤΑΧΕΙΕΣ (ΤΑΧΥΤΕΡΕΣ ΑΠΟ ΆΛΛΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ)- ΑΞΙΟΠΙΣΤΕΣ Iδανικότερη θα ήταν η ανίχνευση αντοχής απευθείας σε κλινικά δείγματα (συνδυασμός με απομόνωση) Έλεγχος πιθανής αντοχής και όχι της ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά Έλεγχος ενός υποσυνόλου γονιδίων αντοχής που ενέχονται σε έναν μηχανισμό αντοχής περιορισμένη πληροφορία στα Gram (-) YOU ONLY GET WHAT YOU LOOK FOR Απαιτείται συχνά συνδυασμός φαινοτυπικών και γονοτυπικών ή άλλων μεθόδων για την πλήρη κατανόηση της πολυπλοκότητας της αντοχής στα αντιμικροβιακά Ο προσδιορισμός της αντοχής με μεθόδους βασισμένες στην καλλιέργεια αποτελούν μεθόδους αναφοράς Οι τεχνολογίες NGS και Μaldi-TOF φαίνεται να είναι το μέλλον στον έλεγχο αντοχής