3. Caracterizarea enzimelor (1) 3.6. Situsurile active ale enzimelor. Mutageneza. Modificarea specificității și stabilității enzimelor Porțiunea din structura terțiară a enzimelor care este responsabilă pentru activitatea catalitică este denumită situsul activ și constituie aproximativ 10-20% din volumul total al enzimei. Situsul activ este de obicei o crevasă hidrofobă sau cavitate care conține o rețea de grupări din catenele laterale ale aminoacizilor care au capacitatea de a lega substratul și a fi implicate în reacția enzimatică. În unele situații situsul activ acomodează și unul sau mai mulți cofactori care asistă reacția enzimatică. Chiralitatea situsului activ imprimă acestuia capacitatea de a lega un enantiomer al substratului. Cum se leagă la enzimă? Una dintre proprietățile remarcabile ale enzimelor este selectivitatea mare pentru substrat, datorată în special unor interacțiuni de tip necovalent dintre enzimă și substrat. Există patru tipuri de interacțiuni enzimă-substrat utilizate de enzime: a. Interacțiunile electrostatice. Molecula substratului conține de regulă grupări funcționale ionizabile care sunt de obicei încărcate (în soluții apoase la valori ale ph-ului în jur de valoarea 7) și pot fi implicate în interacțiuni electrostatice cu sarcinile opuse din catena laterală a aminoacizilor situați în situsul catalitic al enzimei. De exemplu, acizii carboxilici sunt încărcați negativ la ph neutru și interacționează cu grupările încărcate pozitiv (gruparea ɛ-amino a lizinei sau gruparea guanidinică protonată a argininei). Analog, grupările substratului încărcate pozitiv pot interacționa electrostratic cu grupările încărcate negativ (aspartat sau glutamat). Energia de legare pentru o asemenea interacțiune este de 25-50 kj/mol. b. Legăturile de hidrogen. Acest tip de interacțiuni sunt frecvent întâlnite în cazul substratelor care conțin legături polare. Tăria legăturilor de hidrogen depinde de natura chimică și de alinierea din punct de vedere geometric al grupărilor care interacționează. Studiile experimentale și teoretice asupra enzimelor a căror grupări implicate în legături de hidrogen au fost înlocuite specific au dovedit faptul că energia de legare între donorii și acceptorii neîncărcați este de aproximativ 2,0-7,5 kj/mol, iar între donorii și acceptorii încărcați în intervalul 12,5-25 kj/mol. c. Interacțiunile nepolare (Van der Waals). Acest tip de interacțiuni sunt rezultatul contactului interatomic dintre substrat și situsul catalitic. Dat fiind faptul că situsul catalitic este complementar cu substratul suma interacțiunilor enzimă-substrat de tipul Van der Waals poate fi substanțial (50-100 kj/mol), chiar dacă interacțiunile individuale sunt foarte slabe (6-8 kj/mol). d. Interacțiunile hidrofobe. Dacă substratul conține o grupare sau o suprafață hidrofobă atunci sunt favorizate interacțiuni de legare cu porțiuni hidrofobe din situsul activ al enzimei. De exemplu chimotripsina (protează) posedă în situsul catalitic un buzunar hidrofob care permite legarea grupărilor de hidrofobe (fenil) ale substratului (polipeptidic). Mutageneza Ingineria genetică permite astăzi designul unor mutații în genele care codează enzimele de interes. Scopul mutațiilor genetice este acela de a modifica grupările din 1
situsul catalitic al enzimei în scopul identificării grupărilor implicate în actul catalitic, modelării specificității și îmbunătățirii eficienței catalitice. Mai mult unele mutațiile permit obținerea unor enzime cu proprietăți superioare (stabilitate la temperatură ridicată - proprietate care poate fi speculată în cazul proteazelor folosite în industria detergenților). Prin proiectare rațională s-a reușit mărirea vitezei de reacție a superoxiddismutazei și s-a reușit conversia papainei la un mutant (Q19E) care posedă activitate nitrilhidrolazică. De asemenea s-au obținut mutanți punctiformi (N304L, N304K sau N304R) al deacetoxicefalosporin C sintazei (din Streptomyces clavuligerus), enzimă folosită pentru conversia penicilinei la cefalosporină, în scopul eficientizării conversiei catalitice. Tehnicile de evoluție directă au permis modificarea termostabilității enzimelor importante din punct de vedere comercial. De exemplu, s-a obținut un mutant al subtilizinei, o protează utilizată în industria detergenților, al cărui timp de înjumătățire (la temperatura de 60 0 C) a crescut cu circa 1200 ori. 3.7. Complecșii enzimatici Anumite enzime sunt organizate sub forma unor agregate fizice. Complexitatea unor astfel de sisteme este variată: de la două până la mai multe enzime pe complex (ribozom, asocierea enzimelor glicolitice din E. coli, complexul a 8 amino-acil ARNt sintetaze din ficatul de șoarece, asocierea unor enzime din ciclul Krebs). Asocierea necovalentă a subunităților în triptofan sintază Triptofan sintaza este un tetramer de tipul 2 2. Enzima catalizează reacția de conversie a indol-3-glicerol-fosfatului la triptofan. Subunitățile si catalizează fiecare cate o etapa partiala din cadrul actului catalitic: indol-3-glicerol-fosfat Subunitatea indol + 3-glicerol-fosfat indol + serina Subunitatile 2 triptofan Un alt exemplu îl constituie o enzimă (asparto kinaza-homoserin-dehidrogenaza) care catalizează două etape din cadrul biosintezei treoninei plecând de la acidul aspartic. ADN polimeraza posedă atât o activitate hidrolitică cât și una de polimerizare, lucru esențial pentru mecanismul de corectare a erorilor care apar la sinteza ADN-ului. Enzima este un tetramer ( 4) ale cărui subunități ( ) posedă activitate catalitică pentru ambele etape (lucru demonstrat prin digestia monomerului). Aceste porțiuni din cadrul unei subunități sunt legate covalent. Există și cazuri în care lanțul polipeptidic conține mai mult de 2 activități catalitice distincte. Complexul piruvat dehidrogenazei Piruvat dehidrogenaza este alcătuită din 3 lanțuri polipeptidice (enzima 1, E1, piruvat dehidrogenaza; enzima 2, E2, lipoat acil transferaza; enzima 3, E3, lipoamid dehidrogenaza) care catalizează decarboxilarea acidului piruvic. Complexul este format dintr-o parte centrală care conține 24 de molecule de E2 (aranjament octaedric). Transferul grupelor acetil este realizat prin intermediul a două resturi flexibile de lizină ( -NH2) pe care sunt grefate resturile de acid lipoic. 2
Avantajele complexelor multienzimatice Avantajele complexelor enzimatice comparativ cu sistemele singulare (care conțin doar o enzima în soluție) sunt următoarele: a) creșterea puterii catalitice prin reducerea timpului de difuzie a intermediarului de la o enzima la cealaltă; b) canalizarea substratului (intermediarului) de-a lungul complexului; c) protejarea intermediarilor reactivi mai instabili; d) transfer intermolecular mai rapid. 4. Caracterizarea enzimei (2) 4.1. Baze de date pentru structura primară. Determinarea masei moleculare și a punctului izoelectric Disponibilitatea unor secvențe complete ale genomului procariot și eucariot permite identificarea și analiza funcțională a proteinelor/enzimelor codate de acest genom. Analiza la scară largă a acestor proteine a permis obținerea unor cantități impresionante de date, datorate în special dezvoltării unor tehnici noi în domeniul proteomicii. De exemplu, spectrometria de masă este o tehnică folosită astăzi la identificarea proteinelor și la determinarea modificărilor posttranslaționale. Aceste metode fac posibilă identificarea rapidă a unui număr de proteine, analiza interacțiunilor dintre acestea, localizarea celulară sau studierea activității biologice 4.2. Secvențele semnal În celulele eucariote membranele interne permit organizarea unor compartimente subcelulare în interiorul acestora. Aceste compartimente, numite organite celulare legate de membrane includ nucleul, reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi, mitocondriile, cloroplastele etc. Prezența acestor compartimente permit celulei să se specializeze într-o multitudine de reacții metabolice, reacții care pot fi specifice unui compartiment celular. Există însă un impediment. Toate proteinele, indiferent de compartimentul celular, sunt sintetizate în ribozomi (în citozol). Translocarea proteinelor în compartimentele celulare necesită modalități de: a) identificare a organitelor pentru care acestea sunt destinate; b) livrare a acestora în organita celulară corespunzătoare. Mai precis, proteinele/enzimele trebuie să traverseze una sau mai multe membrane. Proteinele posedă anumite secvențe semnal care indică destinația (compartimentul) celular(ă). Secvențe semnal caracteristice sunt în secvența primară a unor proteine care sunt livrate către nucleu, mitocondrie etc. În tabelul 1 sunt exemplificate câteva secvențe semnal caracteristice unor compartimente celulare. Tabel 1. Secvențe semnal tipice pentru localizarea proteinelor Funcția peptidei semnal Exemplu de peptidă semnal Import în RE H 2N-MMSFVSLLLVGILFWATEAEQLTKCEVFE- Reținere în RE -KDEL-COOH Import în mitocondrie H 2N-MLSLRQSIRFFKPATKTLCSSKYLL- Import în nucleu -PPKKKRKV- Import în peroxizomi -SKL- De exemplu, amilaza din șoarece are secvența semnal MKFVLLLSLIGFCWA în timp ce -fibrinogenul uman MFSMRIVCLVLSVVGTAWT 3
4.3. Alinierea a două sau mai multe secvențe Compararea secvențelor de nucleotide sau aminoacizi cu alte secvențe în scopul stabilirii gradului de similitudine dintre acestea este o tehnică frecvent folosită. Un anumit grad de similitudine între două gene sau secvențe proteice poate sugera faptul că acestea provin, în decursul evoluției, dintr-o genă ancestrală. Aceste secvențe asemănătoare sunt numite omoloage și similitudinea evoluționistă dintre acestea este cunoscută sub denumirea de omologie. Un pas important în compararea a două secvențe este potrivirea dintre acestea prin alinierea acestora în așa manieră încât sunt observate similitudinile dintre acestea. Gradul de potrivire trebuie să fie destul de mare din punct de vedere statistic. O măsură cantitativă a similarității dintre două sau mai multe secvențe este dată de un scor, care reflectă gradul de potrivire. În cel mai simplu caz, unde resturile identice sunt luate în calcul, fracțiunea de aminoacizi identici (sau nucleotide) oferă o măsură a similarității cunoscută sub numele de identitate procentuală. Când secvențele proteice sunt comparate pot fi utilizate metode mai sofisticate. Unii aminoacizi prezintă asemănări în ceea ce privește proprietățile lor fizico-chimice și din acest motiv este posibil să sufere asemenea modificări în decursul evoluției. În practică, apar inserții, dispariții sau substituții în două secvențe omoloage în decursul evoluției. Din acest motiv rezultă două secvențe genetice sau proteice, de diferite lungimi, posedă regiuni care sunt caracterizate de secvențe similare care sunt separate de regiuni distincte care au lungimi diferite. În asemenea cazuri porțiuni de secvențe sunt glisate una peste cealaltă în așa manieră încât să se maximalizeze numărul de aminoacizi identici și similari. Diverși algoritmi sunt utilizați pentru alinierea secvențelor. Modelul statistic Hidden Markov ia în calcul toate combinațiile posibilele pentru potriviri, nepotriviri, decalaje astfel încât să se genereze o aliniere ideală a două sau mai multe secvențe. Alinierea secvențelor multiple permite compararea mai multor secvențe. Prin aceste metode se pot identifica porțiunile mici din secvențe care sunt caracterizate prin resturi identice (conservate) în toate secvențele din setul supus analizei. Alinierile de secvențe multiple, a proteinelor omoloage, din diferite specii, sunt utilizate pentru a obține așa-numita distanță evolutivă dintre perechile de specii pe baza gradului de diferențiere (similitudine) dintre o pereche de secvențe provenite din specii diferite. Diferențele dintre secvențe speciilor care diverg mai devreme sunt mai mari față de speciile care diverg mai recent. Aceste distanțe/diferențe pot fi utilizate pentru construirea arborelui filogenetic care are drept scop stabilirea unor relații de evoluție dintre specii sau membrii individuali din superfamilia unei proteine. 4.4. Exemple de motive structurale enzimatice Motivul Rossmann Motivul Rossmann constituie un motiv structura întâlnit la proteinele care leagă nucleotidele de tipul cofactorilor enzimatici FAD, NAD + sau NADP +. Acest tip de motiv structural este compus din segmente de tip β și -helix, unde segmentele de tip β formează structuri de tip β-pliat (prin intermediul legăturilor de hidrogen) și -helixurile înconjoară de o parte și de alta acest element structural pentru a da naștere unui sandwich format din trei straturi. Elementul structural Rossmann (denumit după Michael Rossmann, cercetător care a descris pentru prima oară în 1970 acest motiv în cazul 4
enzimei lactat dehidrogenaza) conține 6 segmente de tip β. În contrast, modul de împachetare Rossmann-oidic are doar 5 segmente de tip β. În motivul β- -β elementele de structură secundară (β și ) sunt conectate prin intermediul unor bucle. Aceste bucle sunt de obicei regiuni bogate în resturi de glicină. De exemplu, în cazul L-fenil oxidazei, prima bulcă a motivului Rossmann conține secvența GXGXXG care constituie situsul de legare a restului de ADP din FAD-ul enzimei. Lactat dehidrogenaza (LDH) catalizează dehidrogenarea lactatului la piruvat cu producerea concomitentă a NADH din NAD +. Structura tridimensională sugerează faptul că o buclă flexibilă acoperă situsul catalitic, regiune care acomodează substratul. Studii experimentale au dovedit faptul că prin înlocuirea punctuală a aminoacizilor faptul că viteza cu care această buclă închide situsul activ constituie etapa determinantă de viteză a întregii reacții catalitice. Astfel, în această buclă, s-a introdus un rest de triptofan, iar celelalte resturi de triptofan au fost înlocuite cu resturi de tirozină. S-a observat o descreștere în timp a fluoresceței după amestecarea complexului LDH-NADH cu un analog al piruvatului (oxamat). Această scădere a fluorescenței s-a corelat cu diminuarea concentrației NADH după omogenizarea complexului LDH-NADH cu piruvatul. Acest fapt confirmă o legătură strânsă dintre închiderea buclei și etapa determinantă de viteză. O buclă este un element care poate avea și rol funcțional în activitatea enzimatică, legarea ligandului la anticorpi sau receptori. Triozfosfat izometaza (TIM) este una dintre cele mai studiate și evoluate enzime. TIM este o enzimă cheie în procesul de glicoliză și catalizează interconversia dihidroxiaceton-fosfatului și D-gliceraldehid-3-fosfatului. O buclă din enzimă joacă un rol important în actul catalitic. Motivul β β este un motiv structural care apare și în TIM. O secvență de 10 aminoacizi formează o buclă flexibilă care sechestrează substratul în situsul catalitic. S-a dovedit faptul că îndepărtarea a 4 resturi din această buclă (IGTG) determină o micșorare dramatică a activității enzimatice (de circa 5 ordine de mărime). Probabil, această buclă previne descompunerea intermediarului de tip cis-enolic la metil-glioxal și fosfat. Există și alte motive structurale care sunt conservate în diverse enzime. De exemplu, enzimele care leagă piruvatul au un motiv de forma WGGAATXDXXXRFL. Motivul - Motivul - constituie o structură în care 2 -helixuri sunt conectate prin intermediul unor bucle. Acest motiv este întâlnit la proteine care leagă ionul de calciu sau ADNul. Motivul - a fost identificat pentru prima dată la proteina parvalbumină (din mușchiul de crap). Această proteină cu masă moleculară relativ mică și un număr de 108 resturi de aminoacizi are 6 -helixuri (notate A, B, C, D, E, F) de la N- la C-terminal. Această proteină posedă și 3 bucle simbolizate A-B, C-D și E-F. Două dintre aceste bucle (C-D și E-F) leagă un ion de Ca 2+ - motivul mâinii EF. Calmodulina este o moleculă care posedă 4 motive ale mâinii de tip EF și controlează activitatea unor enzime (Ca 2+ - ATPaza sau kinazele). Ca 2+ -ATPaza pompează ionii de Ca 2+ în exteriorul celulei. Ca 2+ se leagă la calmodulină și induce o schimbare a conformației. Complexul Ca 2+ -calmodulină se leagă la Ca 2+ -ATPază. Complexul proteinei cu Ca 2+ -ATPază pompează ionii de Ca 2+ în exteriorul celulei până când concentrația în acest ion scade semnificativ (10-7 -10-8 M). În momentul în care concentrația Ca 2+ scade complexul Ca 2+ -calmodulină disociază și astfel pompa de Ca 2+ încetează să mai pompeze ionii. 5
4.5. Baze de date cu structuri 3D Bazele de date sunt resurse ușor de distribuit disponibile prin intermediul unor domenii publice și reprezintă mijloace convenabile și eficiente de stocare a unei cantități impresionante de informații. SWISS-PROT oferă informații legate de funcția proteinelor, structura domeniilor acestora, modificările post-translaționale și este în strânsă legătură cu multe alte resurse. PDB (Protein data bank) este o colecție de structuri și date structurale despre proteine, acizi nucleici și alte macrobiomolecule. Este o sursă importantă în domeniile Biologiei structurale și Geneticii structurale. Structurile din PDB, depuse de cercetătorii din lumea întreagă, derivă de obicei din datele experimentale obținute prin cristalografie de raze X, spectroscopie RMN, microscopie crioelectronică sau din simulările teoretice (modelare moleculară). Din acest motiv, PDB constituie o platformă care colectează, organizează și distribuie informații structurale. În tabelul 2 sunt prezentate câteva baze de date care oferă informații structurale referitoare la macromoleculele importante din punct de vedere biologic. Tabel 2. Lista resurselor structurale pentru proteine și acizi nucleici Baza de date Informații oferite Adresa de web Protein Data Bank Structura macromoleculei http://www.wwpdb.org arhivă generală RCSB Protein Data Bank Structura macromoleculei http://www.rcsb.org Depozit de structuri, instrumente de căutare și analiză (SUA) PDB din Europa (PDBe) Structura macromoleculei http://www.pdbe.org Depozit de structuri, instrumente de căutare și analiză (Europa) PDB din Japonia (PDBj) Structura macromoleculei http://www.pdbj.org Depozit de structuri, instrumente de căutare și analiză (Japonia) BioMagResBank (BMRB) Set de date RMN, instrumente de http://www.bmrb.wisc.edu căutare și validare EMDataBank Date de microscopie crioelectronică http://www.emdatabank.org Instrumente de căutare și analiză Nucleic Acid Database Structura acizilor nucleici http://ndbserver.rutgers.edu (NDB) Instrumente de căutare și analiză BioIsis Deposit de date rezultate prin http://www.bioisis.net/ difracție clasică (la unghiuri mici) sau cu neutroni Protein Ensemble Database (pe-db) Deposit de date colectate prin tehnicile RMN sau difracție clasică (la unghiuri mici) pentru proteinele dezordonate http://pedb.vib.be BMRB este o colecție de date RMN care nu se focusează doar pe determinarea structurilor. Baza de date conține informații legate de atribuirile deplasărilor chimice, constante de cuplare, listă a picurilor pentru o gamă largă de macrobiomolecule (cu dimensiuni chiar mai mici decât cele din PDB). De asemenea, conține informații legate de rata de schimb izotopic a hidrogenilor, valori pka, parametrii de relaxare care permit explicarea în timp real a unor procese biochimice. BMRB conține și restricțiile RMN din intrările din baza de date PDB și date RMN despre metaboliți sau compuși standard. 6
Ansamblele biologice de dimensiuni mari pot fi studiate prin microscopie electronică tridimensională. Aceste date sunt disponibile în baza de date EMDataBank, un proiect de interfață a NCMI (National Center of Macromolecular Imaging), PDBe și RCSB. Adnotările din EMDataBank includ descrierea probei, componentele probei, stoichiometria, prepararea specimenelor, detalii despre experimentele de imagistică, procesarea imaginilor, metoda de reconstrucție, rezoluția și ID-ul din PDB. Dat fiind faptul că structurile 3DEM din această bază de date sunt tipice pentru complecșii biologici de dimensiuni mari (virusuri, ribozomi) remarcile permit descrierea ierarhică a componentelor din aceste complexe, cu capacitatea de a efectua o analiză la nivelul fiecărei entități. O altă sursă de informații pentru structura proteinelor este domeniul în curs de dezvoltare numit difracție la unghiuri mici (Eng. Small Angle Scattering, SAS). Popularitatea acestor metode crește deoarece majoritatea proteinelor nu sunt alcătuite în totalitate din domenii globulare; multe situsuri funcționale sunt structurate tranzitoriu sau există porțiuni mai dezordonate și din acest motiv nu pot fi vizualizate prin cristalografie și difracție cu raze X sau sunt prea mari pentru a fi studiate prin tehnica RMN. Există două baze de date care acum colectează astfel de informații: BioIsis (SAXS) și Protein Ensembles Database (pe-db) (RMN și SAS). În prezent, adnotările din aceste baze se limitează la captarea parametrilor experimentali și a unor elemente necesare cartografierii acestora în UniProt în scopul oferirii de informații funcționale. 4.6. Swiss PDB viewer modelarea structurii tridimensionale a enzimelor Vizualizarea structurii tridimensionale a proteinelor poate fi făcută cu ajutorul unor calculatoare performante pe care sunt instalate pachete ce permit vizualizarea, manipularea și interpretarea structurii enzimelor. Aceste macromolecule pot colorate, reprezentate cu umbre, nuanțate, sub forma unor suprafețe sau alte modalități atractive din punct de vedere grafic. Mai mult, aceste molecule pot fi mărite, rotite, micșorate doar printr-un click. În mod curent structura enzimelor poate fi reprezentată în 4 moduri: modele filiforme, diagrame cu panglici și spirale, bile și bețe, modele tridimensionale voluminoase. În prezent, sunt câteva plug-in-uri care permit vizualizarea și manipularea în timp real a structurilor tridimensionale cu browsere ca Jmol sau WebMol oferite de serverul PDB. De asemenea, se pot instala instrumente de manipulare de sine-stătătoare (SwissPDB, PyMOL, RasMol sau Cn3D) care oferă mai multe funcționalități. Unul dintre cele mai populare pachete de vizualizare este SwissPDB-Viewer sau DeepView. Acest program este compatibil cu diverse sisteme de operare. Pachetul oferă o gamă largă de aptitudini : redarea suprafețelor, modelări ale enzimelor omoloage, evaluarea calității structurii, minimizări energetice, mutageneza punctiformă, reconfigurarea unor bucle, calcule de câmp electrostatic, suprapuneri structurale, generarea unor diagrame de tip Ramachandran sau vizualizarea simultană a secvenței primare și a structurii 3D. 7