Σήψη Κλασικές μεθοδολογίες διάγνωσης: η συμβολή των σύγχρονων συστημάτων αιμοκαλλιέργειας

Σήψη Κλασικές μεθοδολογίες διάγνωσης: η συμβολή των σύγχρονων συστημάτων αιμοκαλλιέργειας ΜΑΡΙΑ ΠΑΝΟΠΟΥΛΟΥ Επίκουρη Καθηγήτρια Εργαστήριο Μικροβιολογίας Τμήμα Ιατρικής Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης

Ταχύτητα και ακρίβεια στη διάγνωση γιατί: Καλύτερη έκβαση ασθενούς Βελτίωση πολιτικής χρήσης αντιμικροβιακών Κάθε ώρα καθυστέρησης χορήγησης κατάλληλης ΑΜ αγωγής από την έναρξη της υπότασης αυξάνει τη θνητότητα κατά 7.6% Μείωση ποσοστών αντοχής Μείωση κόστους Belén Gutiérrez Lancet Infect Dis 2017 Garcia-Vazquez SJID 2013 Shorr CCM 2011 Klein Breteler SJID 2011 Kumar et al. Crit Care Med 2006

Huttunen R. Int J Infect Dis 2013

Τι καθιστά μια τεχνική πραγματικά ταχεία; Στο Εργαστήριο Ώρες λειτουργίας (24/7/365) Προσωπικό (εκπαιδευμένο) Γνώση Προτεραιότητα στο δείγμα Άμεση αναφορά αποτελέσματος Τηλεφωνικά Ηλεκτρονικά (LIS) Στα ΤΕΠ ή στην Κλινική / ΜΕΘ Εμπειρία στη διάγνωση Άμεσα οδηγίες για τη δέουσα εμπειρική αγωγή ανάλογα: ιστορικό ασθενούς κλινική εικόνα εργαστηριακά δεδομένα (γενική αίματος λευκά/τύπος, CRP, προκαλσιτονίνη, )

Καλλιέργεια αίματος gold standard Η καλλιέργεια αίματος παραμένει η μέθοδος αναφοράς στην απομόνωση και ταυτοποίηση του παθογόνου σε υποψία BSI Highly sensitive (related to the volume of the sample) Easy to perform Blood culture system used Ημέρα 1 2 3 2 4 5 6 57 (high quality blood culture broth) Continuous automated monitoring (24/7/365) Standard incubation 5 d (plus HACEK and Brucella spp.) Increased incubation for slow-growing microorganisms (Fungi and Mycobacteria) Gram χρώση Αρνητική Opota O et al. Clin Microbiol Infect 2015, Petti CA et al. JCM 2006, Baron EJ et al. CID 2005

Opota O et al. Clin Microbiol Infect 2015

Individualized Approaches are Needed for Optimized Blood Cultures Pre- and post-analytical areas for optimization of blood cultures and their impact Category Steps to be Optimized Impact Blood culture collection Collection of BCs prior to administration of antimicrobial agents, and from patients for whom BCs are appropriate Adequate blood volume per bottle (up to 10 ml) Improves BC yield Improves BC yield Sufficient numbers of draws (two or more from separate venipuncture sites) avoid single draw BCs Sufficient numbers of bottles (at least an aerobic and anaerobic bottle) with each draw Improves BC yield, allows discrimination of contamination Improves BC yield Transportation Efficient transportation of BCs bottles to the lab Reduces time to positivity Processing Timely placement of BC bottles onto BC instrument Reduces time to positivity Prompt removal of positive BC bottles from the instrument and immediate workup of those bottles Reduces time to organism identification Reporting Prompt communication of positive results to the clinicians Reduces time to optimal therapy Banerjee R, Özenci V. CID 2016

Gonsalves WI et al. JCM 2009, Opota O et al. CMI 2015 Category Blood culture collection Steps to be Optimized / Impact Sufficient numbers of draws (two or more from separate venipuncture sites) Increasing the number of blood cultures increases the sensitivity through the increased total volume collected (40 ml to 80 ml are necessary to detect a causative agent in 80% to 96% of bacteremia) Transient bacteraemia presence of microorganism during a short time-lapse in the bloodstream (less than 30 min)-manipulation of contaminated mucosa or invasive respiratory, gastrointestinal or urogenital acts a single episode of positive blood cultures Sustained bacteraemia fungaemia multiple positive bottles drawn at different times-presence of endovascular infections such as endocarditis high number of blood cultures become positive without any difference in the time to positivity for bottles drawn simultaneously from different sites blood cultures drawn from a catheter become positive more than 2 h before blood culture drawn from a venepuncture + catheter tip culture catheter infection is suspected sensitivity 91% and specificity 94% Persistent bacteraemia the persistence of positive blood cultures despite the introduction of an anti-infectious treatment due to organisms resistant to the prescribed antibiotic, to the presence of a second organism or to the site of infection being inaccessible to the antibiotic (e.g.septic thrombosis) Peripheral venepuncture, arterial or central venous accesses are associated with different contamination rates of 36%, 10% and 7%, respectively

Καλλιέργεια αίματος: όχι επαρκής στην έγκαιρη διάγνωση της μικροβιαιμίας Ψευδώς αρνητικά σε ~ 50% των περιπτώσεων πολύ μικρός αριθμός κυκλοφορούντων μικροβίων δύσκολα αναπτυσσόμενοι μικροοργανισμοί (Haemophilus, Actinobacillus, Cardiobacterium) μη καλλιεργούμενοι μικροοργανισμοί (Bartonella, Coxiella burnetii, Tropheryma whipplei) έναρξη αντιμικροβιακής αγωγής πριν την λήψη του αίματος Ψευδώς θετικά σε 5-50% των περιπτώσεων

Interpretation of positive blood cultures: contamination versus bloodstream infection Organism Blood cultures Analysis by isolated species and type of ward July - December 2016 January - June 2017 All Wards ICU Outpatients Other ALL Staphylococcus, coagulase negative 1432 668 48 62 2210 Escherichia coli 716 39 43 17 811 Staphylococcus aureus ss. aureus 338 41 23 13 406 Pseudomonas aeruginosa 224 151 15 13 399 Enterococcus sp. 364 157 16 6 543 Acinetobacter sp. 264 264 5 14 547 Klebsiella pneumoniae ss. pneumoniae 413 242 22 21 687 Enterobacter spp 129 35 7 10 181 Streptococcus sp. 149 17 11 6 183 Proteus spp 128 46 5 4 183 Stenotrophomonas (Xantho.) maltophilia 33 28 2 4 67 Serratia spp 41 20 1 1 63 Pseudomonas sp. 23 4 1 28 Salmonella sp. 13 1 1 15 Citrobacter spp 22 5 2 29 Klebsiella oxytoca 33 7 39 Candida spp 113 57 4 4 178 Organism All Wards ICU Outpatients Other ALL Staphylococcus, coagulase negative 1628 731 67 55 2481 Escherichia coli 577 28 28 8 641 Staphylococcus aureus ss. aureus 307 48 17 5 371 Pseudomonas aeruginosa 198 146 8 5 345 Enterococcus sp. 348 136 8 6 498 Acinetobacter sp. 256 290 3 12 550 Klebsiella pneumoniae ss. pneumoniae 343 250 14 5 598 Enterobacter spp 79 23 5 2 109 Streptococcus sp. 147 10 7 2 166 Proteus spp 119 44 7 1 171 Stenotrophomonas (Xantho.) maltophilia 31 20 1 52 Serratia spp 36 17 2 3 58 Pseudomonas sp. 15 7 1 23 Salmonella sp. 8 2 1 11 Citrobacter spp 16 6 3 1 26 Klebsiella oxytoca 27 5 1 1 34 Candida spp 138 69 2 3 212

Καλλιέργεια αίματος Ημέρα 1 2 3 2 4 5 6 ΑΡΝΗΤΙΚΗ

Αιμοκαλλιέργεια (BC) όχι επαρκής στην έγκαιρη διάγνωση της μικροβιαιμίας Ανάγκη νέων τεχνικών - μεθοδολογιών

Ταχείες μέθοδοι: διάκριση ανάλογα με το είδος δείγματος Θετική καλλιέργεια (π.χ. αιμοκαλλιέργεια) Nucleic-acid-based methods - Probes hybridization - Microarrays - Multiplex PCR MALDI-TOF MS Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry Κλινικό δείγμα (π.χ. γενική αίματος) Nucleic-acid-based methods - Multiplex real-time PCR - SeptiFast - Broad range PCR (16S / 18S rrna) - SeptiTest - Ειδικές παθογόνου (π.χ. Coxiella) PCR/ESI-MS (PCR & electrospray ionization mass spectrometry)

ID/AST methods from positive blood cultures

Colorimetric Sensor Array Allows Fast Detection and Simultaneous Identification of Sepsis-Causing Bacteria in Spiked Blood Culture array of diverse chemically responsive indicators embedded in a nanoporous matrix rapid and accurate discrimination of complex mixtures or volatile organic compounds Sung H. Lim et al. J Clin Microbiol 2014

18 clinically relevant species with 91.9% overall accuracy

Συνδρομική διάγνωση Μοριακές τεχνικές στη διάγνωση κλινικών συνδρόμων Σήψη (μικροβιαιμία) Νοσοκομειακές λοιμώξεις Αναπνευστικές (ιογενείς) λοιμώξεις Ταχύτητα στη διάγνωση Άμεσος αντίκτυπος στη θεραπεία των ασθενών Μείωση κόστους θεραπείας

Μοριακή διάγνωση Απομόνωση γενετικού υλικού Extraction Πολλαπλασιασμός Amplification Ανίχνευση και αποτέλεσμα Κλειστά συστήματα (όλα τα ενδιάμεσα στάδια σε ένα μηχάνημα) Μείωση ανάγκης εκπαιδευμένου προσωπικού και χώρων Διεκπεραίωση εξέτασης σε όλες τις βάρδιες Βελτίωση χρόνου αποτελέσματος

FilmArray platform: Nucleic-acid-based method Multiplex RT-PCR Δείγματα: θετική αιμοκαλλιέργεια κόπρανα δείγμα αναπνευστικού (φαρυγγικό) ΕΝΥ Αυτόνομο σακουλάκι με όλα τα αντιδραστήρια ενσωματωμένα: Αποθηκεύει όλα τα αντιδραστήρια (θ o C περιβάλλοντος) Εκτελεί την εκχύλιση, ενίσχυση και ανίχνευση Είναι «κλειστό» σύστημα (ελαχιστοποίηση επιμολύνσεων) FilmArray Blood Culture Identification (BCID) Panel: Information Sheet. BioFire Website. www.biofiredx.com/pdfs/filmarray

FilmArray τεχνική FilmArray Torch Απλό: Μόνο 2 λεπτά διαδικασία χειρισμού Eύκολο: Δεν απαιτείται πιπετάρισμα ακριβείας Γρήγορο: Χρόνος ανάλυσης περίπου 1 ώρα The FilmArray System. BioFire Website. www.filmarray.com/the-filmarray-system

Blaschke AJ et al. Diagn Microbiol Infect Dis 2012 Altun O et al. JCM 2013 Θετική BC: μεθοδολογία FilmArray Σύστημα (Κατασκευαστής) Μέθοδος Χρόνος μέχρι το αποτέλεσμα Παθογόνα Γονίδια αντοχής Ευαισθησία Ειδικότητα FilmArray (BioFire, Salt Lake City, UT) Multiplex PCR 1 ώρα 8 Gram-θετικά 11 Gramαρνητικά 5 Candida meca, vana/b, KPC 95 97 91 98 Σχόλια πλεονεκτήματα: ταχύτητα, ευαισθησία και ειδικότητα ευκολία μεθοδολογίας ανίχνευση γονιδίων αντοχής μειονεκτήματα: περιορισμένο φάσμα ανιχνευόμενων παθογόνων

http://www.unyvero.com/en/applications/ UNYVERO : Nucleic-acid-based method Multiplex RT-PCR Διάγνωση: μικροβιαιμία νοσοκομειακή πνευμονία λοιμώξεις μοσχευμάτων/ιστών Ποικιλία δειγμάτων Amplicon detection by array hybridization Under Development 4-5 ώρες

Gram-θετικά βακτήρια Staphyphylococcus aureus Coagulase negative staphylococci Streptococcus spp. - S. agalactiae - S. pneumoniae - S. pyogenes/dysgalactiae Enterococcus spp. Enterococcus faecalis Listeria monocytogenes Corynebacterium spp. Μύκητες Aspergillus spp. Candida spp. - C. albicans - C. dubliniensis - C. glabrata - C. krusei - C. parapsilosis - C. tropicalis Gram-αρνητικά βακτήρια Citrobacter freundii/koseri Escherichia coli Enterobacter cloacae complex Enterobacter aerogenes Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Klebsiella variicola Proteus spp. Serratia marcescens Acinetobacter baumannii complex Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas maltophilia Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis Μυκοβακτηρίδια Mycobacterium spp. Αναερόβια Propionibacterium acnes Unyvero: ποια παθογόνα / γονίδια αντοχής ανιχνεύει στην κασέτα BCU Γονίδια αντοχής aac(6 )aph(2 ), aaca4 - aminoglycoside erma- macrolide/lincosamide meca, meca oxacillin vana, vanb vancomycin resistance CTX-M 3 rd generation cephalosporine KPC- carbapenem resistance IMP - carbapenem resistance NDM - carbapenem resistance OXA-23, OXA-24/40, OXA-48, OXA-58 VIM carbapenem resistance

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Nucleic-acid-based methods Probes hybridization Στόχος rrna: 16S rrna για βακτήρια 18S rrna για μύκητες Συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (probes) μονής έλικας σημασμένα με fluorescein ή rhodamine ουδέτερης φόρτισης μικρό μέγεθος και υδροφοβικότητα διέλευση μέσω κυτταρικής μεμβράνης δεν απαιτείται κυτταρική λύση, ούτε απομόνωση γενετικού υλικού Επιλογή ανιχνευτών (probes) ανάλογα της Gram-χρώσης Ανίχνευση υβριδισμού με μικροσκόπιο φθορισμού

3 ώρες από Gram χρώση ως PNA FISH αποτέλεσμα QuickFISH testing platform Μείωση χρόνου σε 30 min

Multiplex Fluorescence in situ Hybridization (FISH) Assay and Automated Microscopy

Multiplex Fluorescence in situ Hybridization (FISH) Assay and Automated Microscopy 1. Identification: specific probes (FISH assay) 2. AST: Automated microscopy captured time-lapse images every 10 min for up to 4.5 h and analyzed growth features Proprietary software algorithms converted these growth features into a MIC value or positive or negative resistance phenotype test result

Gram-Positive

Gram-Negative

Pancholi et al. J Clin Microbiol, April 2018

Gram-positive cocci Six common Gram-positive cocci were evaluated for ID Five were tested against eight antibiotics and two resistance phenotypes (MRSA/MRS and MLSb) From the 4,142 AST results overall essential agreement (EA) and categorical agreement (CA) were 97.6% and 97.9%, respectively overall very major error (VME), major error (ME), and minor error (me) rates were 1.0%, 0.7%, and 1.3%, respectively Gram-negative rods Eight species of Gram-negative rods were evaluated against 15 antibiotics From the 6,331 AST results overall EA and CA were 95.4% and 94.3%, respectively. overall VME, ME, and me rates were 0.5%, 0.9%, and 4.8%, respectively Pancholi et al. J Clin Microbiol, April 2018

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight- Mass Spectrometry Ιονισμός πρωτεϊνών 50% των ανιχνευόμενων πρωτεϊνών είναι ριβοσωμικές πρωτεΐνες Επιτάχυνση των ιόντων προς την περιοχή του ανιχνευτή κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες και σε περιβάλλον κενού Ανίχνευση και ανάλυση των προκυπτουσών φασμάτων μάζας ταυτοποίηση των μακρομορίων μέσω του προσδιορισμού του λόγου μάζας προς φορτίο m/z (χρόνος 2 min) Δημιουργία χαρακτηριστικών εικόνων φασμάτων μάζας (πρωτεϊνικό προφίλ) μοναδικών για κάθε μικροοργανισμό Ακριβής ταυτοποίηση σε γένος και είδος Δυνατότητα τυποποίησης στελεχών Suarez S et al. Pathol Biol 2015

MALDI-TOF: Identifying Microorganisms by Their Protein Fingerprint MALDI Biotyper VITEK MS

MALDI-TOF-MS: εφαρμογή σε θετική αιμοκαλλιέργεια αν θετική Απομάκρυνση αίματος γιατί ψευδώς θετικά σήματα λόγω αιμοσφαιρίνης Δειγματοληψία Επώαση αιμοκαλλιεργειών Ετοιμασία του βακτηριακού ιζήματος Σύγκριση με βάση δεδομένων Αποτέλεσμα σε < 2 h Λήψη του πρωτεϊνικού προφίλ Τοποθέτηση του βακτηριακού ιζήματος στην MALDI μικροπλάκα

M.-C. Ge et al. J Microbiol Immunol Infect 2017

M.-C. Ge et al. J Microbiol Immunol Infect 2017

M.-C. Ge et al. J Microbiol Immunol Infect 2017

MALDI-TOF MS: ανίχνευση αντοχής Detection of enzymatic activity by MALDI-TOF MS Direct Detection of β-lactamase Activity Detection of rrna Methyltransferase Activity Direct MALDI-TOF MS analysis of bacterial extracts MRSA Detection β-lactamase Detection Detection of VRE Hrabák J et al. CMR 2013 Savic M et al. Nucleic Acids Res 2009

β-lactam molecule Burckhardt I, Zimmermann S. J Clin Microbiol 2011 Hrabák J et al. J Clin Microbiol 2011

Έμμεση ανίχνευση παραγωγής β-λακταμασών, ανιχνεύοντας το φασματικό profile του αντιβιοτικού και του προϊόντος αποδόμησής του λόγω υδρολυτικής δράσης του ενζύμου Hrabák J et al. CMR 2013

Carba-NP test(85%) identification of carbapenemase production in Enterobacteriaceae and Pseudomonas spp. and discrimination between the different types of carbapenemases (classes A, B, and D) based on the detection of the acidification resulting from imipenem hydrolysis, coupled with tazobactam and EDTA as inhibitors MALDI-TOF MS carbapenem-hydrolysis assay(99%) Clin Microbiol Infect 2014 J MicrobiolMethods 2015 Antimicrob Agents Chemother 2012

FilmArray, but not MALDI-TOF MS, can by used to identify microorganisms from blood culture (BC) bottles prior to positivity and in some cases even prior to incubation in the BC system J Clin Microbiol 2014

Anson et al. J Med Microbiol 2018

Li et al. SLAS Technol 2018 Emerging Microtechnologies and Automated Systems for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing