ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ Η ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΗΣ ΚΑΡΔΙΑΚΗΣ ΤΡΟΠΟΝΙΝΗΣ Ι

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ Η ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΗΣ ΚΑΡΔΙΑΚΗΣ ΤΡΟΠΟΝΙΝΗΣ Ι ΣΕ ΣΚΥΛΟΥΣ ΜΕ ΟΞΕΙΑ Ή ΥΠΟΚΛΙΝΙΚΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΡΛΙΧΙΩΣΗ (EHRLICHIA CANIS) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2014 ΚΑΛΟΓΙΑΝΝΗ Γ. ΛΑΜΠΡΙΝΗ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ Α.Π.Θ. 1

2 Η ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΤΗΣ ΚΑΡΔΙΑΚΗΣ ΤΡΟΠΟΝΙΝΗΣ Ι ΣΕ ΣΚΥΛΟΥΣ ΜΕ ΟΞΕΙΑ Ή ΥΠΟΚΛΙΝΙΚΗ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΡΛΙΧΙΩΣΗ (EHRLICHIA CANIS) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΟΥ ΕΚΠΟΝΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΖΩΩΝ ΣΥΝΤΡΟΦΙΑΣ, ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ, ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κουτίνας Χ.Κ., Επίκουρος Καθηγητής, Επιβλέπων Μυλωνάκης Μ.Ε., Επίκουρος Καθηγητής, Μέλος Πολυζοπούλου Ζ.Σ., Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Μέλος 2

3 Στους γονείς μου 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Αριθμός σελίδας Πρόλογος 7 1.Εισαγωγή 9 2.Υλικά και Μέθοδοι Tοποθεσία, έγκριση και διάρκεια της 13 παρούσας μελέτης 2.2 Σκύλοι της παρούσας μελέτης Κλινική εξέταση στα πλαίσια της 15 παρούσας μελέτης 2.4 Χρονοδιάγραμμα αιμοληψίας και 15 μέτρηση της καρδιακής Τροπονίνης Ι (ctni) στον ορό του αίματος 2.5 Ηλεκτροκαρδιογράφημα (ΗΚΓ) 16 Πίνακας 1. Επεξήγηση των επιλεγμένων 17 ηλεκτροκαρδιογραφικών μετρήσεων 4

5 2.6 Υπερηχοκαρδιογράφημα 18 Πίνακας 2: Επεξήγηση και τρόπος 18 μέτρησης των υπερηχοκαρδιογραφικών όρων 2.7 Μέτρηση της αρτηριακής πίεσης Δήλωση της ερευνητικής ομάδας Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Συζήτηση Συμπεράσματα Επιστημονικές δημοσιεύσεις της 32 παρούσας μελέτης 7. Βιβλιογραφία 33 5

6 8. Πίνακες Παράρτημα Περίληψη Abstract 63 6

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν ενδείξεις ότι η Ehrlichia canis, ένα υποχρεωτικά ενδοκυτταρικό, αρνητικό κατά Gram βακτήριο, αποτελεί αίτιο υποκλινικής μυοκαρδίτιδας στο σκύλο. Μέχρι στιγμής, οι μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σε φυσικά περιστατικά ερλιχίωσης που χαρακτηρίζονται από μεγάλη ποικιλομορφία δεδομένων (φυλή των ζώων, ηλικία, στάδιο της ερλιχίωσης, συμπτώματα, συνυπάρχοντα νοσήματα, χρονική στιγμή στην οποία έγινε υπερηχοκαρδιογράφημα/ηλεκτροκαρδιογράφημα, χρονική στιγμή λήψης ορού για τη μέτρηση καρδιακών βιολογικών δεικτών, νεκροτομικά ευρήματα). Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να ξεπεραστεί η ποικιλομορφία των δεδομένων που παρατηρήθηκε στις προηγούμενες μελέτες, να μελετηθεί η διαχρονική διακύμανση των καρδιολογικών μετρήσεων, και να διερευνηθεί η μεταβολή της συγκέντρωσης της ctni σε σκύλους πειραματικά μολυσμένους με την E. canis. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον επίκουρο καθηγητή κ. Κουτίνα Κ.Χ., υπό την επίβλεψη του οποίου πραγματοποιήθηκε αυτή η εργασία, για όλη την προσπάθεια, την επιστημονική υποστήριξη, την καθοδήγηση και τον προσωπικό χρόνο που αφιέρωσε σε αυτή την εργασία. Ανεκτίμητη υπήρξε η συμβολή της κ. Θεοδώρου Κ., στη διδακτορική διατριβή της οποίας βασίστηκε αυτή η μελέτη, καθώς και του επίκουρου καθηγητή της Παθολογίας Ζώων Συντροφιάς, κ. Μυλωνάκη Μ.Ε. για τη συμπαράσταση και τις συμβουλές που μου προσέφερε κατά τη συγγραφή αυτής της εργασίας. Επιπλέον, ευχαριστώ θερμά την αναπληρώτρια καθηγήτρια Ζ.Σ. Πολυζοπούλου για την πολύτιμη βοήθεια που προσέφερε, ιδιαίτερα κατά την παρουσίαση αυτής της μελέτης στο εξωτερικό. Ευχαριστώ ακόμη τον επίκουρο καθηγητή κ Ν. Σούμπαση για την καθοριστική συμβολή του στον τρόπο συγγραφής μιας επιστημονικής εργασίας, και τους κ.κ. Ν.Μήττα και Θ. Θεοδοσίου για την επιμέλεια της στατιστικής ανάλυσης, καθώς και τους κκ Ξενούλη ΠΓ και Steiner JM για την μέτρηση της συγκέντρωσης της τροπονίνης. 7

8 8

9 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η Ehrlichia canis, ένα αρνητικό κατά Gram, υποχρεωτικά ενδοκυτταρικό βακτήριο, αποτελεί παγκοσμίως το κύριο αίτιο της μονοκυτταρικής ερλιχίωσης του σκύλου (ΜΕΣ) (Huxsoll et al 1969, Harrus et al 1997, Neer et al 2002). Στη φυσική νόσο, οι περισσότεροι σκύλοι με την οξεία μορφή της ΜΕΣ εμφανίζουν κλινική ίαση με ή χωρίς θεραπεία. Στη συνέχεια ακολουθεί η υποκλινική μορφή που μπορεί να διαρκεί αρκετούς μήνες ως χρόνια (Codner and Farris-Smith 1986, Waner et al 1997, Mylonakis et al 2010). Αν και στους ανοσοεπαρκείς σκύλους η μόλυνση μπορεί να εξαλειφθεί σε αυτή τη χρονική περίοδο, ένας απρόβλεπτος αριθμός σκύλων μπορεί να μεταπέσει στη χρόνια φάση της νόσου, που τυπικά χαρακτηρίζεται από πανκυτταροπενία, σοβαρή μυελοκαταστολή (απλαστική πανκυτταροπενία) και υψηλά ποσοστά θνησιμότητας (Harrus et al 1997, Frank and Breitschwerdt 1999, Neer et al 2002, Mylonakis et al 2004, Harrus et al 2012). Συνήθη κλινικά ευρήματα στη φυσική και πειραματική ΜΕΣ ανεξάρτητα από τη φάση της νόσου, αποτελούν η κατάπτωση, η ανορεξία, οι ωχροί βλεννογόνοι, οι πετέχειες ή/και εκχυμώσεις στο δέρμα και τους βλεννογόνους, ο πυρετός, η λεμφογαγγλιομεγαλία, η σπληνομεγαλία και οι οφθαλμικές αλλοιώσεις (Harrus et al 1997, De Castro et al 2004, Komnenou and Koutinas 2007, Rungsipipat et al 2008). Σε περιπτώσεις πειραματικής ερλιχίωσης είναι εύκολος ο διαχωρισμός των κλινικών σταδίων, ωστόσο η διάκρισή τους συχνά δεν είναι σαφής στη φυσική μορφή της νόσου. Τα συμπτώματα στην οξεία ΜΕΣ,, μετά από μια περίοδο επώασης που διαρκεί 8-20 ημέρες, είναι συνήθως ήπια και υποχωρούν 2-4 εβδομάδες μετά την έναρξή τους (Huxsoll et al 1972, De Castro et al 2004, Rungsipipat et al 2008). Τα συνηθέστερα αιματολογικά ευρήματα είναι η μη αναγεννητική αναιμία, η θρομβοκυτταροπενία και η ήπια λευκοκυτταροπενία, είτε στην οξεία είτε στην υποκλινική μορφή (Kuehn and Gaunt 1985, Mylonakis et al 2003). Η τελευταία χαρακτηρίζεται από την έλλειψη κλινικών συμπτωμάτων αλλά την παρουσία αιματολογικών ευρημάτων, με πιο 9

10 τυπική τη θρομβοκυτταροπενία (Codner and Farris-Smith 1986, Waner et al 1997, Neer et al 2002, Mylonakis et al 2004). Η ΜΕΣ έχει στο παρελθόν ενοχοποιηθεί για μυοκαρδιακή βλάβη, με βάση την παρουσία νεκροτομικών αλλοιώσεων, όπως μακροσκοπικών ή/και μικροσκοπικών επικαρδιακών, μυοκαρδιακών ή ενδοκαρδιακών αιμορραγιών και μη πυώδους μυοκαρδίτιδας (Hildebrandt et al 1973, Lakkawar et al 2003, Rungsipipat et al 2008). Επίσης, σε μια μελέτη φυσικών περιστατικών σε σκύλους με ερλιχίωση στη Βραζιλία και σε ένα κλινικό περιστατικό στο Ισραήλ αναφέρθηκαν παθολογικές μεταβολές στις υπερηχοκαρδιογραφικές και ηλεκτροκαρδιογραφικές μετρήσεις (Diniz et al 2008, Waner and Ohad 2008). Μεταξύ των μελετών αυτών υπήρχε συμφωνία ότι στην οξεία ερλιχίωση του σκύλου η καρδιακή τροπονίνη Ι (ctni) εμφανίζει αύξηση, ενώ παρόμοια αύξηση της τροπονίνης Ι διαπιστώθηκε και στη χρόνια μορφή του νοσήματος σε σκύλους με φυσική μόλυνση (Koutinas et al 2012). Mυοκαρδίτιδα έχει επίσης αναφερθεί σε περιστατικά μονοκυτταρικής ερλιχίωσης (E. chaffeensis) στον άνθρωπο (Jahangir et al 1998, Stone et al 2004) και στη νεορικετσίωση (Neorickettsia risticii) του αλόγου (Long et al 1995). Επειδή κατά την καρδιολογική εξέταση ρουτίνας (κλινική εξέταση, ηλεκτροκαρδιογράφημα, υπερηχοκαρδιογράφημα), δεν ανιχνεύεται η πρώιμη μυοκαρδιακή βλάβη, έχει προταθεί η χρήση των καρδιακών βιολογικών δεικτών. Η καρδιακή τροπονίνη Ι, το Ν-τελικό νατριουρητικό πεπτίδιο (N-terminal pro brain natriuretic peptide fragments, NTpro BNP), το νατριουρητικό πεπτίδιο του εγκεφάλου (brain natriuretic peptide, BNP) και το νατριουρητικό πεπτίδιο των κόλπων (atrial natriuretic peptide, ANP) χρησιμοποιούνται πλέον όλο και περισσότερο στην ανθρώπινη και κτηνιατρική καρδιολογία και εντατική θεραπεία ως ένας γρήγορος τρόπος αξιολόγησης της καρδιακής λειτουργίας και της μυοκαρδιακής βλάβης (Asano et al 1999, Sarko and Pollack 2002, Jortani et al 2004, Silver et al 2004, Oyama et al 2007, Boswood et al 2008, Connolly et al 2008, Boswood 2009, Boswood 2010). 10

11 Η καρδιακή τροπονίνη Ι ανήκει σε μια ομάδα ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών (Ι, Τ και C), οι οποίες ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση μεταξύ ακτίνης και μυοσίνης στον καρδιακό μυ. Από τα τρία είδη τροπονίνης, κλινική σημασία έχουν οι TnI και TnT (Adams et al 1993). Η ΤnC δεν είναι ειδική για το μυοκάρδιο και για το λόγο αυτό δεν έχει χρησιμοποιηθεί στην κλινική πράξη. Η τροπονίνη Τ συνδέει το σύμπλοκο της τροπονίνης στην τροπομυοσίνη (Filatov et al 1999), ενώ η τροπονίνη Ι είναι ανασταλτική (I - Inhibitory) και εμποδίζει τη σύσπαση της μυϊκής ίνας σε απουσία ασβεστίου και τροπονίνης C (Wells and Sleeper 2008). Oι τροπονίνες Ι και Τ απελευθερώνονται από τα καρδιακά μυικά κύτταρα στην κυκλοφορία του αίματος μετά από βλάβη ή νέκρωσή τους μέσα σε ώρες, φτάνουν τη μέγιστη συγκέντρωσή τους σε 2 ημέρες, και παραμένουν σε υψηλά επίπεδα για όσο συνεχίζεται η βλάβη (Serra et al 2010). Εξαιτίας της υψηλής ειδικότητάς τoυς για το μυοκάρδιο, της διαγνωστικής ευαισθησίας τους, της χαμηλής βασικής τους συγκέντρωσης στο αίμα σε απουσία μυοκαρδιακής βλάβης (Spratt et al 2005, Sleeper et al 2001), της άμεσης απελευθέρωσής τoυς και της μακροχρόνιας παραμονής τους σε ανιχνεύσιμα επίπεδα στο αίμα, αποτελούν την ιδανική μέθοδο εκτίμησης της μυοκαρδιακής βλάβης στον άνθρωπο (Sarko and Pollack 2002, Ο Brien et al 2006, Wells and Sleeper 2008). Έχει αποδειχθεί ότι η αύξηση της συγκέντρωσης της ΤnI στον ορό του αίματος συσχετίζεται με την παρουσία ιστοπαθολογικών μεταβολών στο μυοκάρδιο, ακόμα και σε απουσία συμπτωμάτων (Smith et al 1997, Ooi et al 2000, Ο Brien et al 2006), καθώς και με την έκταση της μυοκαρδιακής βλάβης, την ένταση των συμπτωμάτων και την πρόγνωση (Francis and Tang 2004, Ο Brien 2006, Wells and Sleeper 2008). Η ctnt χρησιμοποιήθηκε συχνά στο παρελθόν ως καρδιακός βιολογικός δείκτης λόγω του πλεονεκτήματός της να παραμένει σε υψηλά επίπεδα στον ορό του αίματος για αρκετές μέρες μετά την αρχική βλάβη του μυοκαρδίου. Ωστόσο, δεν θεωρείται εξίσου ειδικός δείκτης της μυοκαρδιακής βλάβης, επειδή σε απουσία μυοκαρδιακής βλάβης καθώς και σε κάποιες μυοπάθειες ή τη χρόνια νεφρική νόσο βρέθηκαν αυξημένα επίπεδα στον ορό του αίματος (Sarko and Pollack 2002). 11

12 Στο σκύλο, στην οξεία μυοκαρδιακή βλάβη (τραυματική μυοκαρδίτιδα και διάταση-στροφή στομάχου) φαίνεται ότι η ευαισθησία της ctni ήταν ανώτερη της ΤnT (Burgener et al 2006). Επίσης, η ctni αυξάνεται συχνότερα και νωρίτερα, συγκριτικά με την ctnt, στις διάφορες καρδιοπάθειες (Connolly et al 2003, Spratt et al 2005, Wells and Sleeper 2008). Σε σκύλους με μυοκαρδιοπάθεια έχει αποδειχτεί ότι συσχετίζεται με το μέγεθος της αριστερής κοιλίας και του αριστερού κόλπου (Oyama and Sisson 2004). Επίσης, αναφέρεται ότι η συγκέντρωσή της στον ορό αυξάνεται σε περιπτώσεις μυοκαρδίτιδας (Smith et al 1997).Αυτός είναι και ο λόγος που η ΤnT δε χρησιμοποιείται πλέον ως ο κύριος καρδιακός βιοδείκτης τόσο στην ιατρική όσο και την κτηνιατρική των ζώων συντροφιάς. Σε μελέτη που έγινε σε σκύλους με φυσική ερλιχίωση (Osathanon et al 2013), η ctnt δε φάνηκε να αυξάνεται σε ζώα με την οξεία μορφή της νόσου. Για όλους τους παραπάνω λόγους, στην παρούσα μελέτη επιλέχθηκε η ctni ως πιο έγκυρος βιολογικός δείκτης της βλάβης του μυοκαρδίου. Στην κλινική πράξη, ανεξάρτητα από το είδος του ζώου, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια πληθώρα μεθόδων για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της ctni στον ορό του αίματος, όπως η Access AccuTnI (Beckman Coulter), η Centaur ctni Ultra (Bayer), και η Reagent Flex ctni (RF 421C, Dade Behring), καθώς η αλληλουχία του μορίου της παραμένει ίδια σε όλα τα ζωικά είδη. Μεταξύ αυτών, η Centaur ctni Ultra θεωρείται από τις πλέον ευαίσθητες μεθόδους (Ο Brien et al 2006, Serra et al 2010). Σε δύο πρόσφατες κλινικές μελέτες με αντικείμενο τη φυσική ΜΕΣ αποδείχτηκε ότι στο 31,3% (Diniz et al 2008) και στο 45-60% των περιστατικών (Koutinas et al 2012), παρατηρείται αύξηση της συγκέντρωσης της ctni στον ορό, υποδηλώνοντας την παρουσία μυοκαρδίτιδας. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ της μονοκυτταρικής ερλιχίωσης και της μυκαρδιοπάθειας στο σκύλο, στα πλαίσια πειραματικής νόσου, η οποία επιτρέπει τον καθορισμό του κλινικού σταδίου της ΜΕΣ και τον αποκλεισμό άλλων συστηματικών νοσημάτων που θα μπορούσαν να επηρεάσουν το μυοκάρδιο, δεν έχει μελετηθεί στο παρελθόν. Ειδικότερα, δεν υπήρξε μέχρι σήμερα κάποια μελέτη πειραματικής μόλυνσης 12

13 σκύλων, ώστε να εκτιμηθεί η καρδιακή λειτουργία με βάση τη διαχρονική μέτρηση της τροπονίνης Ι στον ορό του αίματος, το υπερηχοκαρδιογράφημα και το ηλεκτροκαρδιογράφημα σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές πριν και κατά την εξέλιξη του νοσήματος. Με βάση τις οδηγίες της European Society of Veterinary Cardiology, για την εκτίμηση της συστολικής λειτουργίας ακόμα και σε απουσία συμπτωμάτων, χρησιμοποιούνται η συστολική και η διαστολική διάμετρος της αριστερής κοιλίας, η παρουσία αρρυθμιών, η παράμετρος EPSS (βλέπε Πίνακα 2), το κλάσμα βράχυνσης, και ο λόγος PEP/LVET (βλέπε Πίνακα 2), μεταξύ άλλων μετρήσεων (Ware 2007). Η υπόθεση που διερευνήθηκε στα πλαίσια της παρούσας μελέτης ήταν ότι μετά την πειραματική μόλυνση με την E. canis, οποιεσδήποτε παθολογικές μεταβολές (αύξηση) στις τιμές της ctni καθώς και στις επιλεγμένες μετρήσεις της συστολικής λειτουργίας στο υπερηχοκαρδιογράφημα και το ηλεκτροκαρδιογράφημα, θα υποδήλωναν την εμφάνιση μυοκαρδίτιδας συνδεόμενης με την οξεία ή την υποκλινική μονοκυτταρική ερλιχίωση. Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε με σκοπό να μελετηθεί η διαχρονική διακύμανση των δεικτών της συστολικής λειτουργίας και η μεταβολή της συγκέντρωσης της ctni κατά τη διάρκεια της οξείας όσο και της υποκλινικής φάσης της πειραματικής μονοκυτταρικής ερλιχίωσης. 2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Τοποθεσία, έγκριση και διάρκεια της παρούσας μελέτης Η κύρια μελέτη, που επέτρεψε την παράλληλη πραγματοποίηση της παρούσας μελέτης, είχε τίτλο "Αποτελεσματικότητα και ασφάλεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης στην αντιμετώπιση της πειραματικής μόλυνσης του σκύλου με την Ehrlichia canis", σημαντικό τμήμα των αποτελεσμάτων της οποίας έχει ήδη δημοσιευτεί (Theodorou et al. 2013). Η κύρια 13

14 μελέτη πραγματοποιήθηκε στην Κλινική Ζώων Συντροφιάς, του Τμήματος Κτηνιατρικής, της Σχολής Επιστημών Υγείας, του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης και το ερευνητικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (Γενική Συνέλευση του Τμήματος Κτηνιατρικής, αριθμός έγκρισης: 458/ ) και από την Διεύθυνση Κτηνιατρικής, Περιφέρεια Κεντρικής Μακεδονίας, Θεσσαλονίκη (αριθμός έγκρισης: 13/3152, ). Το πρωτόκολλο της παρούσας μελέτης, εγκρίθηκε από τη γενική συνέλευση του Τμήματος Κτηνιατρικής, της Σχολής Επιστημών Υγείας, του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης (αριθμός συνεδρίασης: 38/ ) H διάρκεια της παρούσας μελέτης, ξεκινώντας από την ημέρα της πειραματικής μόλυνσης των σκύλων, έφτασε τις 90 ημέρες. 2.2 Σκύλοι της παρούσας μελέτης Συνολικά στην παρούσα μελέτη περιλήφθηκαν δώδεκα σκύλοι, φυλής Beagle, που περιελάμβαναν έξι αρσενικούς και έξι θηλυκούς, γενετικά ακέραιους σκύλους, με διάμεση τιμή ηλικίας τους 12,9 μήνες (διακύμανση 5-49 μήνες). Κατά τη διάρκεια της μελέτης, τα ζώα διέμεναν σε χωριστά κλουβιά με ελεγχόμενη θερμοκρασία (20± 2 ο C), σιτίζονταν με εμπορικά διαθέσιμη ξηρή τροφή για σκύλους και είχαν στη διάθεσή τους άφθονο νερό. Τα ζώα που εντάχθηκαν στην παρούσα μελέτη πληρούσαν τα παρακάτω κριτήρια: Ήταν κλινικά υγιή με βάση την κλινική, την αιματολογική και βιοχημική εξέταση, το ηλεκτροκαρδιογράφημα και το υπερηχοκαρδιογράφημα πριν την έναρξη της μελέτης. Ήταν πλήρως εμβολιασμένα και αποπαρασιτωμένα για εξω-και ενδο-παράσιτα πριν και κατά τη διάρκεια της μελέτης. Ήταν οροαρνητικά για αντισώματα έναντι της E.canis, της Babesia canis και της Leishmania infantum (έμμεσος ανοσοφθορισμός, IFAT) καθώς και για τα αντιγόνα της 14

15 Dirofilaria immitis (Snap 3Dx, IDEXX, Westbrook, USA). Επίσης, η κυτταρολογική εξέταση στο επίχρισμα των λευκών αιμοσφαιρίων της στοιβάδας του αιματοκρίτη (σωλήνας Wintrobe) ήταν αρνητική για Babesia spp και Hepatozoon canis. Ήταν αρνητικά με τη δοκιμή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) για το DNA της E.canis στο αίμα, το σπλήνα και το μυελό των οστών πριν από την πειραματική μόλυνση. Δεν είχαν λάβει φάρμακα με δράση κατά της E.canis για 2 τουλάχιστον μήνες πριν την έναρξη της μελέτης. Η πειραματική μόλυνση των σκύλων της παρούσας μελέτης έγινε με το στέλεχος "611" της E. canis και έχει περιγραφεί λεπτομερώς σε προηγούμενη μελέτη (Theodorou et al. 2013). Μέχρι την ημέρα 20 μετά την πειραματική μόλυνση όλοι οι μολυσμένοι σκύλοι εμφάνισαν κλινικά συμπτώματα (ανορεξία 4/12, κατάπτωση 3/12, πυρετό 11/12, λεμφογαγγλιομεγαλία 8/12, πετέχειες/εκχυμώσεις 1/12, ωχρούς βλεννογόνους 2/12, σπληνομεγαλία 7/12) και θρομβοκυτταροπενία (εύρος τιμών των αιμοπεταλίων την ημέρα 20 μετά τη μόλυνση /μl, τιμές αναφοράς /μl). Επίσης μέχρι την ημέρα 20 μετά τη μόλυνση όλοι οι μολυσμένοι σκύλοι έγιναν οροθετικοί για το αντιγόνο της Ε.canis με εύρος τίτλων ανοσοφθορισμού (IFAΤ) 1/200-1/1600, διάμεσος 1/300, τιμές αναφοράς <1/100 και ήταν θετικοί με τη δοκιμή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) για το DNA της Ε.canis σε τουλάχιστον έναν ιστό (αίμα, μυελό οστών ή σπλήνα) κατά τη διάρκεια της παρούσας μελέτης (90 ημέρες μετά τη μόλυνση) (Theodorou et al 2013). 2.3 Κλινική εξέταση στα πλαίσια της παρούσας μελέτης Πλήρης κλινική εξέταση, με ιδιαίτερη έμφαση στην ακρόαση της καρδιάς και την ψηλάφηση του σφυγμού, έγινε σε όλους τους σκύλους πριν την πειραματική μόλυνση (time 0) και τις ημέρες των δειγματοληψιών για τη μέτρηση της cτni (βλέπε παρακάτω). 15

16 2.4 Χρονοδιάγραμμα αιμοληψίας και μέτρηση της καρδιακής Τροπονίνης Ι (ctni) στον ορό του αίματος Δείγματα αίματος λήφθηκαν από τη σφαγίτιδα σε φιαλίδιο χωρίς αντιπηκτικό, από όλους τους σκύλους (n=12) πριν τη μόλυνση, στις 20 ημέρες μετά τη μόλυνση (οξεία φάση της νόσου, n=12) και στις 90 ημέρες μετά την μόλυνση (υποκλινική φάση, n=8). Tα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν άμεσα μετά τη λήψη, στις 2000 στροφές για 20 λεπτά και ο ορός διαχωρίστηκε και καταψύχθηκε στους -80 o C μέχρι τα δείγματα να σταλούν σε εξωτερικό εργαστήριο για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της ctni. Το μέγιστο διάστημα παραμονής των δειγμάτων σε αυτή τη θερμοκρασία ήταν ένας χρόνος, και αποκαταψύχθηκαν μόνο μια φορά, κατά τη διάρκεια της μέτρησης. Τα δείγματα εξετάστηκαν στο Gastrointestinal Laboratory, Department of Small Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, USA. Οι συγκεντρώσεις της ctni μετρήθηκαν με τη μέθοδο Centaur ΤnI Ultra (Advia ), η οποία είναι μια μέθοδος 3 ης γενεάς, τριών σημείων, που χρησιμοποιεί άμεση τεχνολογία χημειοφωταύγειας (direct chemiluminometric technology). H μέθοδος αυτή έχει αξιολογηθεί στο σκύλο (Fonfara et al 2010, Serra et al 2010), αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε διάφορα ζωικά είδη καθώς η αλληλουχία της TnI την οποία ανιχνεύει είναι κοινή ανάμεσα στα ζωϊκά είδη. Στη μέθοδο αυτή, η ελάχιστη συγκέντρωση που μπορεί να μετρηθεί (αναλυτική ευαισθησία) είναι τα 0,0003 ng/ml, ενώ φυσιολογικές θεωρούνται οι συγκεντρώσεις < 0,052 ng/ml. 2.5 Ηλεκτροκαρδιογράφημα (ΗΚΓ) Οι καταγραφές του ΗΚΓ έγιναν και στους 12 σκύλους και στα τρία χρονικά σημεία: αμέσως πριν τη μόλυνση, 20 ημέρες μετά τη μόλυνση και 90 ημέρες μετά τη μόλυνση. Οι καταγραφές και των 6 απαγωγών έγιναν σε πλάγια κατάκλιση, με ήπια συγκράτηση, χωρίς ηρέμηση, και ταχύτητα χαρτιού στα 50mm/sec. Ο ηλεκτροκαρδιογράφος που χρησιμοποιήθηκε ήταν τύπου Kenz-Cardico 306, Japan. Οι μετρήσεις περιλάμβαναν τη 16

17 διάρκεια του QRS, το ύψος του R και τη συχνότητα των καρδιακών παλμών (Εικόνα 1, Πίνακας 1). Εικόνα 1. Μέτρηση των διαφόρων επαρμάτων, συμπλεγμάτων και χρονικών διαστημάτων στο ηλεκτροκαρδιογράφημα. Από χωρίς copyright. Πίνακας 1. Επεξήγηση των επιλεγμένων ηλεκτροκαρδιογραφικών μετρήσεων. Παράμετρος ΗΚΓ Ορισμός R έπαρμα: Aντιπροσωπεύει την εκπόλωση των κοιλιών στο ηλεκτροκαρδιογράφημα. Αυξάνεται σε ύψος και χρονική διάρκεια σε διάταση της αριστερής κοιλίας. QRS έπαρμα: Παράγεται από την εκπόλωση των κοιλιών (αριστερή κοιλία, μεσοκοιλιακό διάφραγμα, δεξιά κοιλία). Η διάταση των κοιλιών μπορεί να αυξήσει το εύρος του QRS. (Ware 2007). 17

18 2.6 Υπερηχοκαρδιογράφημα Σε όλα τα ζώα (n=12) έγινε υπερηχοκαρδιογράφημα, με μηχανικό ηχοβολέα 5-7 mhz σε Phillips ATL Apogee 300 αμέσως πριν τη μόλυνση, στις 20 ημέρες μετά τη μόλυνση και σε 8/12 ζώα στις 90 ημέρες μετά τη μόλυνση. Οι μετρήσεις περιλάμβαναν τη συστολική και διαστολική εσωτερική διάμετρο της αριστερής κοιλίας (LVΙDd, LVΙDs), το πάχος του ελεύθερου τοιχώματος της αριστερής κοιλίας στη συστολή και στη διαστολή (LVFWd, LVFWs) και το πάχος του μεσοκοιλιακού διαφράγματος στη συστολή και στη διαστολή (IVSd, IVSs) από το Μ-mode της αριστερής κοιλίας σε δεξιά παραστερνική τομή σε εγκάρσια λήψη στο ύψος των θηλοειδών μυών. (Πίνακας 2, Eικόνα 2). Με βάση τα LVDd και LVDs, υπολογίστηκε το κλάσμα βράχυνσης (%) (Πίνακας 2). Το EPSS μετρήθηκε επίσης στη δεξιά παραστερνική λήψη 5 κοιλοτήτων από το M-mode της μιτροειδούς βαλβίδας. (Πίνακας 2, Εικόνα 3). Κατά τη διερεύνηση της αορτικής ροής με παλμικό Doppler, υπολογίστηκαν οι παράμετροι PEP και LVET (Πίνακας 2) και υπολογίστηκε ο λόγος μεταξύ των δύο (PEP/LVET) (Εικόνα 4). Όλες οι μετρήσεις έγιναν με στόχο την εκτίμηση της συστολικής λειτουργίας του μυοκαρδίου. Πίνακας 2: Επεξήγηση και τρόπος μέτρησης των υπερηχοκαρδιογραφικών όρων. Παράμετρος Ορισμός Τρόπος μέτρησης (Boon, 2011) LVΙDs, LVΙDd Διάμετρος της αριστερής κοιλίας στη συστολή (LVDs) Στο M-mode, από την δεξιά παραστερνική εγκάρσια λήψη. και τη διαστολή (LVDd). LVFWs, LVFWd Πάχος του ελεύθερου Στο M-mode, από την δεξιά 18

19 τοιχώματος της αριστερής παραστερνική εγκάρσια λήψη. IVSs, IVSd FS (Left Ventricular Fractional Shortening): κοιλίας στη συστολή (LVFWs) και τη διαστολή (LVFWd). Πάχος του μεσοκοιλιακού διαφράγματος στη συστολή (IVSs) και τη διαστολή (IVSd). Κλάσμα βράχυνης. Aποτελεί το ποσοστό μεταβολής στη διάμετρο της αριστερής κοιλίας μεταξύ της διαστολής και της συστολής Στο M-mode, από την δεξιά παραστερνική εγκάρσια λήψη. Υπολογίζεται από τον τύπο: FS= (LVDd-LVDs)/LVDd x100 EPSS (E point to septal separation): Αποτελεί δείκτη διάτασης και λειτουργίας της αριστερής κοιλίας Ισούται με τη μικρότερη απόσταση από το σημείο Ε της μιτροειδούς βαλβίδας (μέγιστο άνοιγμα της βαλβίδας κατά τη φάση ταχείας πλήρωσης με αίμα στη διαστολή) ως το μεσοκοιλιακό διάφραγμα. Μετράται από το M-Mode της μιτροειδούς βαλβίδας. PEP/LVET: (Pre-Ejection Λόγος χρονικής διάρκειας Το PEP μετράται στο φασματικό Period) / (Left Ventricular Ejection Time) πριν από την εξώθηση του αίματος (PEP) προς χρονική διάρκεια εξώθησης του αίματος από την αριστερή κοιλία (LVET). Aποτελούν δείκτες της λειτουργίας της αριστερής κοιλίας, ωστόσο επηρεάζονται από την Doppler από την αρχή του QRS έως την έναρξη της συστολικής ροής, ενώ το LVET είναι η χρονική διάρκεια της αορτικής ροής (από την έναρξη της ροής μέχρι το τέλος της στη βασική γραμμή) (βλέπε Εικόνα 3). 19

20 πλήρωση του μυοκαρδίου με αίμα κατά τη διαστολή και από την αντίσταση της περιφερικής κυκλοφορίας. Η χρήση του λόγου αντί για τις χωριστές μετρήσεις μειώνει την επίδραση της καρδιακής συχνότητας. Εικόνα 2. Tρόπος μέτρησης των IVSd, IVSs, LVIDd, LVIDs, LVFWd, LVFWs σε φυσιολογικό σκύλο. 20

21 Εικόνα 3. Τρόπος μέτρησης του ΕPSS σε φυσιολογικό σκύλο. Εικόνα 4. Τα μικρά βέλη υποδηλώνουν τη χρονική διάρκεια του PEP, ενώ τα μεγάλα βέλη (οριζόντιο και κάθετο) του LVET. Για αισθητικούς λόγους, στην παραπάνω εικόνα τα 21

22 PEP και LVET έχουν μετρηθεί σε διαφορετικούς καρδιακούς κύκλους. Η σωστή μέτρηση αφορά το PEP και LVET του ίδιου κύκλου. 2.7 Μέτρηση της αρτηριακής πίεσης Σε όλα τα ζώα (n=12) κατά τη διάρκεια των τριών χρονικών στιγμών της μελέτης έγινε μέτρηση της αρτηριακής πίεσης με τη μέθοδο Doppler (Vet-Dop, Vmed, USA), με ήπια συγκράτηση, χωρίς ηρέμηση και με τα ζώα σε πλάγια κατάκλιση. Η μέτρηση έγινε από την έξω μετατάρσια αρτηρία, μετά από την τοποθέτηση της ανάλογης περιχειρίδας. Σε κάθε εξέταση, έγιναν συνολικά τρεις μετρήσεις και υπολογίστηκε ο μέσος όρος τους. 2.8 Δήλωση της ερευνητικής ομάδας Καθ όλη τη διάρκεια της μελέτης, οι χειρισμοί των ζώων έγιναν σύμφωνα με τις οδηγίες της European Committee for Care of Animals for Scientific Purposes. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο της κύριας μελέτης, σε περίπτωση που τα ζώα εμφάνιζαν σοβαρά κλινικά συμπτώματα εξαιτίας της πειραματικής ερλιχίωσης σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή της μελέτης, οι κτηνίατροι που παρακολουθούσαν τα ζώα θα χορηγούσαν άμεσα δοξικυκλίνη και ειδική υποστηρικτική αγωγή. Σε επανέλεγχο των σκύλων 150 ημέρες μετά την ολοκλήρωση της μελέτης, όλοι ήταν κλινικά υγιείς και PCR αρνητικοί στην E.canis, και χαρίστηκαν για υιοθεσία σε ιδιώτες. Υπογραμμίζεται, πως σε κανένα ζώο της μελέτης δεν διενεργήθηκε ευθανασία. 22

23 3. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Για κάθε παράμετρο τα περιγραφικά στατιστικά περιελάμβαναν το μέσο όρο και την τυπική απόκλιση, καθώς και το εύρος (ελάχιστο-μέγιστο). Οι μετρήσεις του ηλεκτροκαρδιογραφήματος και επιλεγμένες μετρήσεις στο υπερηχοκαρδιογράφημα (LVΙDs, LVΙDd, EPSS, PEP/LVET, FS), καθώς και οι συγκεντρώσεις της ctni στον ορό του αίματος συγκρίθηκαν μεταξύ χρονικών σημείων με το γραμμικό μοντέλο μικτών επιδράσεων (linear mixed-effect model). Στόχος ήταν να διαπιστωθεί η διακύμανση μέσα στο χρόνο της συστολικής λειτουργίας και της συγκέντρωσης της τροπονίνης. Η παρουσία συσχετίσεων μεταξύ ctni και LVΙDd, διάρκειας QRS και λόγου PEP/LVET αξιολογήθηκε με την μέθοδο Bland/Altman. Η στατιστική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας το R πρόγραμμα (R Core Team 2013) και τη λειτουργία lme από το πακέτο nlme (Pinheiro και Bates 2000). Όπου έλειπαν δεδομένα ή μετρήθηκαν κάτω από το κατώτερο όριο ανίχνευσης τιμής της ΤnΙ από τη δοκιμή Centaur Ultra χρησιμοποιήθηκε η τιμή «0,0003 ng/ml» για τη στατιστική ανάλυση. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο <0, ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κλινική εξέταση των σκύλων Τα κλινικά ευρήματα της ημέρας 20 περιλάμβαναν ανορεξία (4/12, 33,3%), κατάπτωση (3/12, 25%), πυρετό (11/12, 91.6%), λεμφογαγγλιομεγαλία (8/12, 66,6%), πετέχειες/εκχυμώσεις (1/12, 8,3%), ωχρούς βλεννογόνους (2/12, 16,66%), σπληνομεγαλία (7/12, 58,33%) Μέτρηση της ctni 23

24 Οι μετρήσεις της ctni πριν τη μόλυνση, στις 20 και στις 90 ημέρες μετά τη μόλυνση (20 dpi και 90 dpi αντίστοιχα) συνοψίζονται στον πίνακα 3. Η συγκέντρωση της cτnι παρέμεινε χαμηλότερη από τις τιμές αναφοράς ( 0,052 mg/l) σε όλους τους σκύλους (n=12), καθ όλη τη διάρκεια της μελέτης. Ηλεκτροκαρδιογραφικά και υπερηχοκαρδιογραφικά ευρήματα Όσον αφορά το εύρος του QRS, δε βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στις μετρήσεις ανάμεσα στα τρία χρονικά σημεία της μελέτης (Πίνακας 4) (P=0,421). Το ύψος του επάρματος R μειώθηκε σημαντικά στις 20 dpi (P=0,011 <0,05), σε σύγκριση με τις μετρήσεις πριν τη μόλυνση, ενώ παρέμεινε στα ίδια επίπεδα μεταξύ 20 dpi και 90 dpi (P=0,063). Η διάμεση τιμή των μετρήσεων της συστολικής αρτηριακής πίεσης ήταν 140 mm Hg ( mm Hg) στις 20 dpi και 145 mm Hg ( mm Hg) στις 90 dpi (Πίνακας 5), ενώ η διάμεση τιμή των καρδιακών παλμών ήταν 150/ λεπτό ( παλμοί / λεπτό) στις 20 dpi και 140/λεπτό ( παλμοί/λεπτό) στις 90 dpi (Πίνακας 6). Τα αποτελέσματα της υπερηχοκαρδιογραφικής εξέτασης συνοψίζονται στον πίνακα 7. Οι υπερηχοκαρδιογραφικοί δείκτες της συστολικής λειτουργίας που επιλέχθηκαν για στατιστική ανάλυση (LVIDs, LVIDd, PEP/LVET, FS) δεν μεταβλήθηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης (P>0,25), με εξαίρεση το EPSS το οποίο αυξήθηκε σημαντικά μεταξύ των χρονικών σημείων time 0 (ημέρα πριν την πειραματική μόλυνση) και 20 dpi (P<0,001), 20 dpi και 90 dpi (P=0,017 <0,05), και time 0 με 90 dpi (0,017). Επιπλέον, η συγκέντρωση της ctni δε μεταβλήθηκε σημαντικά καθ όλη τη διάρκεια της μελέτης (P=0,309) (Πίνακας 8). Τέλος, καμία συσχέτιση δε βρέθηκε μεταξύ της συγκέντρωσης της ctni και του LVIDd, της διάρκειας του QRS και του λόγου PEP/LVEΤ (P> 0,141) (Πίνακας 9). 24

25 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Με βάση τα μέχρι σήμερα κλινικά, βιοχημικά, υπερηχοκαρδιογραφικά, ηλεκτροκαρδιογραφικά και ιστοπαθολογικά ευρήματα, η ΜΕΣ έχει ενοχοποιηθεί ως αίτιο βλάβης του μυοκαρδίου στο σκύλο (Hildebrandt et al 1973, Frank and Breitschwerdt 1999, Lakkawar et al 2003, Rungsipipat et al 2008, Waner and Ohad 2008, Diniz et al 2008, Koutinas et al 2012). Η αιτιοπαθογένεια της μυοκαρδιοπάθειας δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Μέχρι σήμερα δεν έχει αποδειχθεί με κυτταρολογικές ή ιστολογικές εξετάσεις ότι η E. canis μολύνει άμεσα τα κύτταρα του μυοκαρδίου. Ωστόσο, η αγγειϊτιδα, η τοπική αιμορραγία (επικαρδιακή, ενδοκαρδιακή ή μυοκαρδιακή), η μυοκαρδίτιδα, η σοβαρή αναιμία και πιθανά η συστηματική φλεγμονώδης αντίδραση (SIRS), που προκαλούνται από τη ΜΕΣ είναι δυνατόν να συμμετέχουν, ανεξάρτητα ή σε συνδυασμό μεταξύ τους, στην αιτιοπαθογένεια της μυοκαρδιακής βλάβης (Hildebrandt et al 1973, Lakkawar et al 2003, Diniz et al 2008, Rungsipipat et al 2008). Στον άνθρωπο, η αύξηση της συγκέντρωσης της ctni στον ορό αντικατοπτρίζει τις ιστοπαθολογικές μεταβολές στον καρδιακό μυ (Ooi et al 2000, O Brien 2006, Wells and Sleeper 2008). Συγκεκριμένα η ctni αποκαλείται δείκτης «διαρροής» (leakage marker) επειδή ανιχνεύεται στην κυκλοφορία του αίματος μόνο μετά από φλεγμονή ή ταυτόχρονη καταστροφή μεγάλου αριθμού καρδιακών κυττάρων, ανεξάρτητα από το αίτιο που την προκάλεσε (Boswood 2009, Oyama and Solter 2002, O Brien et al 2006, Serra et al 2010). Ακόμα και σε περιπτώσεις υποκλινικής (αφανούς) μυοκαρδίτιδας, είναι πιθανή η αύξηση της συγκέντρωσης της ctni (Boswood 2010). Τα αποτελέσματα προηγούμενων μελετών με αντικείμενο τη συγκέντρωση της ctni στη φυσική μόλυνση από E. canis έδειξαν ότι περίπου 30-60% των σκύλων με φυσική ΜΕΣ εμφανίζουν αυξημένη συγκέντρωση ctni στον ορό του αίματος, συμβατές με μυοκαρδίτιδα (Diniz et al 2008, Koutinas et al 2012). Ωστόσο, στη μία από αυτές, δεν βρέθηκε διαφορά στη συχνότητα αύξησης της ctni ή στην απόλυτη τιμή της συγκέντρωσης της ctni μεταξύ 25

26 σκύλων που βρίσκονται στην οξεία (μη μυελοκατασταλτική) συγκριτικά με εκείνους που βρίσκονται στη χρόνια (μυελοκατασταλτική) φάση του νοσήματος (Koutinas et al 2012). Ταυτόχρονα, στην εργασία των Diniz και συν. (2008) διαπιστώθηκε ότι στην οξεία φάση της ΜΕΣ η συγκέντρωση της ctni ήταν υψηλότερη σε σύγκριση με αυτή που μετρήθηκε σε άλλα νοσήματα (Diniz et al 2008). Στην ίδια μελέτη, διαπιστώθηκε αύξηση της συγκέντρωσης της ctni στον ορό στο 31% των σκύλων με οξεία ΜΕΣ, καθώς και στο 20% των σκύλων που είχαν μολυνθεί με Anaplasma platys ή/και Babesia canis, και στο 28% των ασθενών αλλά μη μολυσμένων σκύλων. Ωστόσο, έχοντας ως μοναδικό κριτήριο τη συγκέντρωση της ΤnΙ δεν ήταν δυνατόν να γίνει διαχωρισμός μεταξύ των σκύλων με τα παραπάνω λοιμώδη νοσήματα. Παρά τις μεταξύ τους διαφορές στο σχεδιασμό και συνεπώς στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων, και οι δύο μελέτες καθώς και τα ευρήματα ενός μεμονωμένου κλινικού περιστατικού (Waner and Ohad 2008) στηρίζουν την υπόθεση ότι στην οξεία και ενδεχομένως και στην υποκλινική ΜΕΣ διαπιστώνεται μυοκαρδιακή βλάβη, με βάση τόσο κλινικές/εργαστηριακές όσο και υπερηχοκαρδιογραφικές/ηλεκτροκαρδιογραφικές παραμέτρους (Diniz et al 2008, Waner and Ohad 2008). Συγκεκριμένα, στο 33% των σκύλων διαπιστώθηκε διάταση της αριστερής κοιλίας στη συστολή και τη διαστολή και πάχυνση του ελεύθερου τοιχώματος της αριστερής κοιλίας με φυσιολογική ή μειωμένη εσωτερική διάμετρο της αριστερής κοιλίας στη διαστολή, ενώ το 16,7% παρουσίαζε μείωση του κλάσματος βράχυνσης (Diniz et al 2008). Στην παρούσα μελέτη, η συγκέντρωση της ctni δεν αυξήθηκε πάνω από τα φυσιολογικά όρια σε κανέναν από τους πειραματικά μολυσμένους σκύλους, καθ όλη τη διάρκεια της μελέτης, παρόλο που οι σκύλοι εμφάνισαν την τυπική οξεία μορφή της μονοκυτταρικής ερλιχίωσης, με βάση τα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. Ταυτόχρονα, η απουσία διαταραχών στους περισσότερους δείκτες της συστολικής λειτουργίας και τις μετρήσεις του ηλεκτροκαρδιογραφήματος, υποδηλώνει ότι οποιαδήποτε μυοκαρδιακή βλάβη, αν υπάρχει, δεν επηρεάζει σημαντικά την καρδιακή λειτουργία. Η σημαντική διαφορά στη 26

27 συχνότητα αύξησης της συγκέντρωσης της ctni μεταξύ των φυσικών και των πειραματικών περιστατικών δεν είναι εύκολο να εξηγηθεί. Εξαιτίας του αναδρομικού χαρακτήρα των προηγούμενων κλινικών μελετών, δεν είναι εύκολο να αποκλειστεί η πιθανότητα συνύπαρξης άλλων παθολογικών καταστάσεων, όπως για παράδειγμα λοιμώδη (Breitschwerdt et al 1999, Lobetti et al 2002) ή μεταβολικά νοσήματα (Hagman et al 2007, Porciello et al 2008, Serra et al 2010) ή τυχόν υποκείμενες συγγενείς ή επίκτητες καρδιοπάθειες (Oyama and Sisson 2004, Spratt et al 2005, Linklater et al 2007, Fonfara et al 2010), που θα μπορούσαν να εξηγήσουν, τουλάχιστον σε ένα ποσοστό των φυσικά μολυσμένων σκύλων, τη βλάβη στο μυοκάρδιο και την αύξηση της συγκέντρωσης της ΤnΙ στον ορό του αίματος. Για παράδειγμα, στη μια από τις προηγούμενες σχετικές μελέτες (Diniz et al 2008), περιλήφθηκαν σκύλοι φυλής Boxer και Doberman στους οποίους δεν αποκλείστηκε η παρουσία δεξιάς αρρυθμογόνου (Baumwart et al 2007) ή υποκλινικής μυοκαρδιοπάθειας, αντίστοιχα (Serra et al 2010), πριν ενταχθούν σε αυτήν. Eπίσης, η αναδρομική φύση της μελέτης αυτής δεν περιλάμβανε τη λήψη υπερηχο-και ηλεκτρο-καρδιογραφήματος πριν τη φυσική μόλυνση από E.canis, συνεπώς η ενοχοποίηση της E.canis ως αιτίου για τα ευρήματα αυτά δεν ήταν απολύτως τεκμηριωμένη. Από την άλλη, η παρουσία σοβαρής αναιμίας, συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης (SIRS) ή ακόμα και η μεγαλύτερη ηλικία των σκύλων (Fonfara et al 2010, Serra et al 2010), που ενδέχεται να διαπιστωθούν στη χρόνια βαριά ερλιχίωση, είναι δυνατόν να αυξήσουν τις τιμές της ctni στον ορό του αίματος. Σημειώνεται πως το πειραματικό στέλεχος 611 που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, ενδέχεται να είναι μικρότερης λοιμογόνου δύναμης σε σύγκριση με το φυσικό στέλεχος. Συγκεκριμένα, έχει αποδειχτεί ότι το στέλεχος αυτό περιέχει πολυμορφισμούς στην ακολουθία 16S rdna συγκριτικά με άλλα στελέχη της Ε.canis, όπως τα Ελληνικά στελέχη (GR21 and GR78) (Siarkou et al 2007), που εμπλέκονταν στα φυσικά περιστατικά προηγούμενης μελέτης (Koutinas et al 2012). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης σε συνδυασμό με αυτά των προηγούμενων κλινικών μελετών, στηρίζουν την άποψη ότι η σοβαρότητα της μυοκαρδιακής βλάβης ποικίλλει 27

28 ευρύτατα μεταξύ των μολυσμένων σκύλων και σε κάθε περίπτωση, δεν φαίνεται να συνδέεται με κλινικά σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα. Οι ιδιαίτερα χαμηλές συγκεντρώσεις της ctni στη παρούσα μελέτη ενδέχεται να οφείλονται, εν μέρει τουλάχιστον, στο ότι στα Βeagle έχουν διαπιστωθεί χαμηλότερες απόλυτες τιμές cτnι, συγκριτικά με τις άλλες φυλές (Serra et al 2010). Ωστόσο, αυτό έχει αποδειχτεί μόνο στα κλινικά υγιή ζώα και δεν φαίνεται να έχει ιδιαίτερη σημασία σε ζώα κλινικά ασθενή. Αν και η συγκέντρωση της TnI έχει αναφερθεί ότι μειώνεται σε δείγματα ορού που έχουν μείνει για μεγάλο χρονικό διάστημα σε θερμοκρασία δωματίου ή σε κατεψυγμένα δείγματα που έχουν αποψυχθεί πολλές φορές, ή ακόμη και σε δείγματα που διατηρήθηκαν στην κατάψυξη για πάνω από 1 χρόνο (Basit et al 2007), τα δείγματα της μελέτης μας αποψύχθηκαν μόνο μια φορά για την ανάλυση, η οποία και έγινε το αργότερο σε διάστημα ενός χρόνου από τη λήψη τους. Σε προηγούμενες μελέτες, η διάρκεια αποθήκευσης των δειγμάτων του ορού κυμαινόταν από 2 μέχρι και 10 χρόνια, χωρίς σημαντική υποβάθμιση της σταθερότητας της ctni (Diniz et al 2008, Κoutinas et al 2012). Οι συγκεκριμένες μετρήσεις στο ηλεκτροκαρδιογράφημα (ύψος R, διάρκεια QRS) χρησιμοποιήθηκαν επειδή η αύξησή τους υποδηλώνει διάταση ή υπερτροφία της αριστερής κοιλίας (Μartin 2000). Αντίθετα, τα διαστήματα S-T και Q-T, μεταβάλλονται κυρίως σε ηλεκτρολυτικές διαταραχές και τοξικώσεις ή χορήγηση φαρμάκων, ενώ το διάστημα P-R μεταβάλλεται σε διαταραχές της αγωγιμότητας (Martin 2000, Tilley et al 2008). Oι συγκεκριμένες μετρήσεις στο υπερηχοκαρδιογράφημα επιλέχθηκαν με βάση τις συστάσεις του Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine (Thomas et al 1993). Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι η συστολική λειτουργία μπορεί να μειωθεί, κατά τόπους ή συνολικά, σε περιπτώσεις μυοκαρδίτιδας από λοιμογόνους παράγοντες (Ware, 2007) όπως η πιροπλάσμωση (Breitschwerdt et al 1999) και η νόσος Lyme (Levy and Harrison 1998). Με βάση τις οδηγίες της European Society of Veterinary Cardiology, για την εκτίμηση της συστολικής λειτουργίας 28

29 στη διατατική μυοκαρδιοπάθεια χρησιμοποιούνται η συστολική και η διαστολική διάμετρος της αριστερής κοιλίας, η παρουσία αρρυθμιών, η παράμετρος EPSS, το κλάσμα βράχυνσης, και ο λόγος PEP/LVET, μεταξύ άλλων μετρήσεων (Ware 2007). Ακόμα και όταν απουσιάζουν τα συμπτώματα, η αύξηση των διαστάσεων της αριστερής κοιλίας, το μειωμένο κλάσμα βράχυνσης και η αύξηση του EPSS και PEP/LVET αποτελούν δείκτες επιδείνωσης της συστολικής λειτουργίας της αριστερής κοιλίας και απαιτούν επανεκτίμηση σε βάθος χρόνου για την πρώιμη ανίχνευση της διατατικής μυοκαρδιοπάθειας (Dukes-McEwan et al 2003). Τυχόν συνυπάρχοντα νοσήματα, καρδιογενή ή μεταβολικά, που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τις μετρήσεις (Lobetti et al 2002, Oyama and Sisson 2004, Spratt et al 2005, Porciello et al 2008, Fonfara et al 2010) αποκλείστηκαν εκ των προτέρων με αναλυτικές εξετάσεις και τακτικούς επανελέγχους κατά τη διάρκεια της μελέτης, ώστε οποιεσδήποτε μεταβολές καταγραφούν να οφείλονται αποκλειστικά στην πειραματική ερλιχίωση. Στη δική μας μελέτη, από όλους τους δείκτες της συστολικής λειτουργίας μόνο το EPSS αυξήθηκε κατά την εξέλιξη της πειραματικής μόλυνσης. Πρόκειται για έναν ευαίσθητο δείκτη (Child et al 1981) που ανιχνεύει μικρές μεταβολές στην κίνηση της μιτροειδούς βαλβίδας και συνεπώς εξαρτάται από τη ροή του αίματος μέσω της βαλβίδας (Boon 2011), ενώ αντίθετα, δεν επηρεάζεται από την παρουσία ταχυκαρδίας (Κirberger 1991). Aντίστοιχη μέτρηση δεν είχε πραγματοποιηθεί στις μελέτες με φυσική ερλιχίωση, και επομένως δε μπορεί να γίνει σύγκριση με προηγούμενα αποτελέσματα. Σε κάθε περίπτωση, το EPSS δεν αυξήθηκε σε κανέναν σκύλο και σε καμία χρονική στιγμή πάνω από το φυσιολογικό όριο (6 mm). Στις προηγούμενες μελέτες, οι παθολογικές μεταβολές που αναφέρονται στο ηλεκτροκαρδιογράφημα (ΗΚΓ) περιλαμβάνουν κολπικές εκτακτοσυστολές (Waner and Ohad 2008), συχνές κοιλιακές εκτακτοσυστολές και υπερκοιλιακή ταχυκαρδία (Diniz et al 2008). Οι δύο τελευταίες αρρυθμίες φάνηκαν να συσχετίζονται με αυξημένη συγκέντρωση της ctni (Diniz et al 2008). Ωστόσο, στην ίδια μελέτη, ήπιες ή έντονες μεταβολές στο ΗΚΓ 29

30 παρατηρήθηκαν και στο 17-22% των σκύλων με εμφανή συμπτώματα από διάφορα άλλα νοσήματα (αιμορραγική διάθεση, οφθαλμικές αλλοιώσεις, νευρολογικά συμπτώματα και πυρετό). Λαμβάνοντας υπόψη ότι στην παρούσα μελέτη το ΗΚΓ ήταν φυσιολογικό σε όλα τα χρονικά σημεία, δεν αποκλείεται στις άλλες μελέτες το αίτιο το ηλεκτροκαρδιογραφικών διαταραχών να μην ήταν η E.canis. Η μείωση του ύψους του R επάρματος ήταν παροδική και δε φαίνεται να έχει ιδιαίτερη κλινική σημασία. Το εύρημα αυτό διαπιστώνεται σε θωρακική συλλογή (υπεζωκοτική ή περικαρδιακή), παχυσαρκία, υποθυρεοειδισμό, υπερκαλιαιμία, και υποογκαιμία (Μartin 2000, Τilley et al 2008), που δε διαπιστώθηκαν σε κανένα από τα ζώα της μελέτης. Η υψηλή καρδιακή συχνότητα και η αυξημένη συστολική αρτηριακή πίεση σε αρκετά από τα ζώα της παρούσας μελέτης μπορούν να εξηγηθούν από τον πυρετό (οξεία φάση του νοσήματος), και από την γενική καταπόνηση των ζώων κατά την εξέταση (φαινόμενο της λευκής ποδιάς - white coat effect) (Belew et al 1999). To γεγονός ότι οι μεταβολές αυτές οφειλόταν στην υπερδιέγερση των νεαρών αυτών σκύλων και όχι σε καρδιακή ανεπάρκεια ή αληθή αρτηριακή υπέρταση επιβεβαιώνεται και από την απουσία συμβατών κλινικών ευρημάτων (π.χ. οφθαλμικές αλλοιώσεις, συμπτώματα καρδιακής ανεπάρκειας). Στην παρούσα μελέτη υπήρχαν αρκετοί περιορισμοί, όπως ο μικρός αριθμός των σκύλων και η έλλειψη της ιστοπαθολογικής εξέτασης, που αποτελεί και την ιδανική μέθοδο εκτίμησης της καρδιακής βλάβης σε περιπτώσεις μυοκαρδίτιδας (Ware 2007). Ωστόσο, κάτι τέτοιο θα απαιτούσε την ευθανασία ζώων που ήταν κατά τα άλλα υγιή και είχαν ιαθεί από τη νόσο. Επιπλέον, σε μελέτη που αναφερόταν στη δυσλειτουργία του μυοκαρδίου σε συστηματικά νοσήματα, βρέθηκε ότι μπορούν να υπάρχουν υπερηχοκαρδιογραφικά ευρήματα και αύξηση της συγκέντρωσης της ctni χωρίς απαραίτητα να διαπιστωθούν ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις (Νelson και Thompson 2006). Η διαχρονική εκτίμηση της ctni ως αντιπροσωπευτικού δείκτη βλάβης του μυοκαρδίου, παράλληλα με την πλήρη καρδιολογική εξέταση σε βάθος χρόνου, παρέχουν μια ολοκληρωμένη εικόνα της μυοκαρδιακής λειτουργίας 30

31 χωρίς να απαιτούνται επεμβατικές μέθοδοι. Το μεγάλο χρονικό διάστημα μέχρι την πρώτη δειγματοληψία μετά τη μόλυνση (21 ημέρες) ενδέχεται να προκάλεσε τη μείωση της ευαισθησίας της ctni ως δείκτη της μυοκαρδιακής βλάβης, δεδομένου ότι σε προηγούμενη μελέτη διαπιστώθηκε η σταδιακή μείωση της συγκέντρωσής της μέσα σε λίγες ημέρες από την αρχική προσβολή (Burgener et al 2006). Ωστόσο, σε άλλες εργασίες διαπιστώθηκε η διατήρηση των υψηλών συγκεντρώσεων της ctni στον ορό του αίματος, μετά από οξεία βλάβη του μυοκαρδίου (Babuin et al 2005, Fonfara et al 2010). Δεν είναι βέβαιο αν η μυοκαρδιακή βλάβη στην οξεία μορφή της ερλιχίωσης του σκύλου είναι μικρής ή μεγάλης διάρκειας, αλλά η ανίχνευση υψηλών συγκεντρώσεων της ctni στη χρόνια μορφή φαίνεται να υποδηλώνει την παρατεταμένη προσβολή του μυοκαρδίου από τη νόσο (Koutinas et al 2012). Εξάλλου, το χρονικό διάστημα της πρώτης δειγματοληψίας αποφασίστηκε με βάση το χρόνο επώασης της νόσου (8-20 ημέρες), οπότε και συμπίπτει με την εμφάνιση των συμπτωμάτων της οξείας μορφής (Harrus et al 2012). Ενδεχομένως, θα χρειαζόταν και μία δειγματοληψία για τη μέτρηση της συγκέντρωσης ctni στις 48 ώρες από την οξεία εμφάνιση της νόσου. Η λήψη απλών ακτινογραφημάτων του θώρακα δεν κρίθηκε απαραίτητη λόγω της χαμηλής ευαισθησίας της συγκεκριμένης μεθόδου στην υποκλινική μορφή της μυοκαρδίτιδας. Επιπλέον, δεν χρησιμοποιήθηκαν περισσότερο εξειδικευμένοι υπερηχοκαρδιογραφικοί δείκτες της συστολικής λειτουργίας, όπως για παράδειγμα το ΤΕΙ Index (Boon 2011, Kocaturk et al 2012), ή το ιστικό Doppler (Chetboul et al 2007), κυρίως λόγω τεχνικών περιορισμών. Οι δείκτες που τελικά χρησιμοποιήθηκαν, επιλέχθηκαν κυρίως για λόγους σύγκρισης με προηγούμενη μελέτη αλλά και γιατί αντιπροσωπεύουν τους πιο συχνά εκτιμούμενους δείκτες στην κλινική πράξη (Diniz et al, 2008). Τέλος, μπορεί να μην χρησιμοποιήθηκε χωριστή ομάδα υγιών μη μολυσμένων ζώων ως μάρτυρες (control group), ωστόσο η διαχρονική παρακολούθηση των σκύλων πριν και μετά τη μόλυνση, καθώς και το γεγονός της μη αύξησης της συγκέντρωσης της ctni στην παρούσα μελέτη καθιστά ελάχιστα χρήσιμη τη συμμετοχή μαρτύρων. 31

32 6.1. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ i. Η συγκέντρωση της καρδιακής τροπονίνης Ι παρέμεινε χαμηλότερη από τις τιμές αναφοράς σε όλους τους σκύλους, τόσο κατά τη διάρκεια της οξείας όσο και της υποκλινικής φάσης της πειραματικής μονοκυτταρικής ερλιχίωσης. Η απουσία διαταραχών στους περισσότερους δείκτες της συστολικής λειτουργίας και τις μετρήσεις του ηλεκτροκαρδιογραφήματος, υποδηλώνει ότι οποιαδήποτε μυοκαρδιακή βλάβη, αν υπάρχει στην ΜΕΣ, δεν επηρεάζει την καρδιακή λειτουργία. ii. Kαμία συσχέτιση δε βρέθηκε μεταξύ της συγκέντρωσης της ctni και του LVIDd, της διάρκειας του QRS και του λόγου PEP/LVEΤ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης παρουσιάστηκαν από την υποψήφια στο συνέδριο της European Society of Veterinary Clinical Pathology (ESVCP), στο Μιλάνο, τον Οκτώβριο του 2014, όπου και βραβεύτηκε ως η καλύτερη ελεύθερη ανακοίνωση του συνεδρίου. 32

33 Σύγκρουση συμφερόντων Όλοι οι συγγραφείς και τα μέλη της ερευνητικής ομάδας δηλώνουν την απουσία σύγκρουσης συμφερόντων για αυτή τη μελέτη. 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Asano K, Masuda K, Okumura M et al Plasma atrial and brain natriuretic peptide levels in dogs with congestive heart failure. J Vet Med Sci 61: Adams JE, Abendschein DR and Jaffe AS Biochemical markers of myocardial injury. Is MB creatine kinase the choice for the 1990s? Circulation 88(2): Babuin L, Jaffe AS Troponin: the biomarker of choice for the detection of cardiac injury. Can Med Assoc J 173(10): Baumwart RD, Orvalho J and Meurs KM Evaluation of serum cardiac troponin I concentration in Boxers with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. Am J Vet Res 68: Basit M, Bakshi N, Hashem M, et al The effect of freezing and long- term storage on the stability of cardiac troponin T. Am J Clin Pathol 128: Belew AM, Barlett T, Brown SA Evaluation of the white coat effect in cats. J Vet Intern Med 13: Boon JA Chapter 4, Evaluation of Size, Function and Hemodynamics. In: Veterinary Echocardiography, 2 nd Edn, Wiley-Blackwell, West Sussex, UK,

34 8. Boswood A, Dukes-McEwan J, Loureiro J et al The diagnostic accuracy of different natriuretic peptides in the investigation of canine cardiac disease. J Small Anim Pract 49(1): Boswood A Biomarkers in cardiovascular disease: beyond natriuretic peptides. J Vet Cardiol 11: S23-S Boswood A Chapter 8, Laboratory tests. In: BSAVA Manual of Small Animal Cardiorespiratory Medicine and Surgery, 2 nd Edn, Fuentes VL, Johnson L, Dennis S, Wiley, Breitschwerdt EB, Atkins CE, Brown TT et al Bartonella vinsonii subsp. berkhoffii and related members of the alpha subdivision of the Proteobacteria in dogs with cardiac arrhythmias, endocarditis or myocarditis. J Clin Microbiol 37: Breitschwerdt EB, Maggi RG, Chomel BB, et al Bartonellosis: an emerging infectious disease of zoonotic importance to animals and human beings. J Vet Emerg Crit Care (San Antonio) 20(1): Bretz F, Hothorn T, and Westfall P Multiple comparisons using R, Boca Raton. FL: CRC Press. 14. Brown S, Atkins C, Bagley R, et al Guidelines for the identification, evaluation, and management of systemic hypertension in dogs and cats. J Vet Intern Med 21: Burgener IA, Kovacevic A, Mauldin GN, et al Cardiac Troponins as Indicators of Acute Myocardial Damage in Dogs. J Vet Intern Med 20: Charpentier J, Luyt C, Fulla Y Brain natriuretic peptide: a marker of myocardial dysfunction and prognosis during severe sepsis. Crit Care Med, 32: Chetboul V, Gouni V, Sampedrano CC et al Assessment of regional systolic and diastolic myocardial function using tissue Doppler and strain imaging in dogs with dilated cardiomyopathy. J Vet Intern Med 21:

35 18. Child J, Krivokapich J, Perloff J Effect of left ventricular size on mitral E point to ventricular septal separation in assessment of cardiac performance. Am Heart J 101: Codner EC and Farris-Smith L Characterization of the subclinical phase of ehrlichiosis in dogs J Am Vet Med Assoc 189: Connolly D, Magalhaes RJ, Syme H et al Circulating natriuretic peptides in cats with heart disease. J Vet Intern Med 22(1): Connolly D, Cannata J, Boswood A et al Cardiac troponin I in cats with hypertrophic cardiomyopathy. J Feline Med Surg. 5: De Castro MB, Machado RZ, De Aquino LP, et al Experimental acute canine monocytic ehrlichiosis: clinicopathological and immunopathological findings. Vet Parasitol, 119 (1): Dickinson AE, Rozanski EA, Rush JE Reversible myocardial depression associated with sepsis in a dog. J Vet Intern Med 21: Diniz PP, De Morais HS, Breitschwerdt EB, et al Serum cardiac troponin I concentration in dogs with ehrlichiosis. J Vet Intern Med, 22(5): Dukes-McEwan J, Borgarelli M, Tidholm A et al Proposed guidelines for the diagnosis of canine idiopathic dilated cardiomyopathy. J Vet Cardiol 5: Eddlestone SM, Diniz PPVP, Neer TM et al Doxycycline clearance of experimentally induced chronic Ehrlichia canis infection in dogs. J Vet Intern Med 21: Fonfara S, Loureiro J, Swift S et al Cardiac troponin I as a marker for severity and prognosis of cardiac disease in dogs. Vet J 184 (3): Francis GS, Tang WH Cardiac troponins in renal insufficiency and other nonischemic cardiac conditions. Prog Cardiovasc Dis 47(3):

36 29. Frank LA, Clinical pharmacology of rifampin. J Am Vet Med Assoc 197 (1): Frank JR and Breitschwerdt EB A retrospective study of ehrlichiosis in 62 dogs from North Carolina and Virginia. J Vet Intern Med 13(3): Haberman CE, Kang CW, Morgan JD, et al Evaluation of oscillometric and Doppler ultrasonic methods of indirect blood pressure estimation in conscious dogs. Can J Vet Res. 70(3): Hagman R, Lagerstedt AS, Fransson BA et al Cardiac troponin I levels in canine pyometra. Acta Vet Scand 28; 49:6 33. Harrus S, Waner T, and Bark H Canine monocytic ehrlichiosis: an update. Comp Cont Ed Pract Vet 19: Harrus S, Waner T, Aizenberg I, et al Amplification of Ehrlichial DNA from Dogs 34 Months after infection with Ehrlichia canis. J Clin Microbiol 36 (1): Harrus S, Waner T, and Neer TM Chapter 26, Ehrlichia and anaplasma infections. In: Greene CE, ed. Infectious Diseases of the Dog and Cat, 4 th Edn, Elsevier Saunders, Hildebrandt PK, Huxsoll DL, Walker JS et al Pathology of canine ehrlichiosis (tropical canine pancytopenia). Am J Vet Res 34 (10): Huxsoll DL, Hildebrandt PK, Nims RM, et al Ehrlichia canis- The causative agent of a haemorrhagic disease of dogs? Vet Rec 85: Jahangir A, Kolbert C, Edwards W, et al Fatal pancarditis associated with human granulocytic Ehrlichiosis in a 44-year old man. Clin Infect Dis 27(6): Jortani SA, Prabhu SD, Valdes R Jr Strategies for developing biomarkers of heart failure. Clin Chem 50(2): Filatov VL, Katrukha AG, Bulargina TV, et al Troponin: structure, properties, and mechanism of functioning. Biochemistry (Moscow) 64:

37 41. Κirberger RM Mitral valve E point to ventricular septal separation in the dog. J S Afr Vet Assoc 62(4): Kocaturk M, Martinez S, Eralp O et al Tei index (myocardial performance index) and cardiac biomarkers in dogs with parvoviral enteritis. Res Vet Sci 92(1): Komnenou A and Koutinas AF Ocular manifestations of some canine infectious and parasitic diseases commonly encountered in the Mediterranean, EJCAP 17(3): Koutinas CK, Mylonakis ME, O Brien PJ et al Serum cardiac troponin I concentrations in naturally occurring myelosuppressive and non-myelosuppressive canine monocytic ehrlichiosis. Vet J 194 (2): Kuehn NF and Gaunt SD, Clinical and hematologic findings in canine ehrlichiosis. JAVMA 186 (4): Lakkawar AW, Nair MG, Varshney KC et al Pathology of canine monocytic ehrlichiosis in a German Shepherd dog. Slov Vet Res 40 (2): Levy SA, Harrison P Complete heart block in a dog seropositive with Borrelia burgdorferi. J Vet Intern Med 2: Linklater AK, Lichtenberger MK, Thamm DH et al Serum concentrations of cardiac troponin I and cardiac troponin T in dogs with class IV congestive heart failure due to mitral valve disease. J Vet Emerg Crit Care. 2007; 17: Little SE Ehrlichiosis and anaplasmosis in dogs and cats. Vet Clin North Am Small Anim Pract 40 (6): Lobetti R, Dvir E and Pearson J Cardiac troponins in canine babesiosis. J Vet Intern Med 16 (1):