Σύγχρονες Μέθοδοι της Μοριακής Βιολογίας. Γιάννης Χατζηδάκης και Κρίτων Καλαντίδης 2011

Transcript

1 Σύγχρονες Μέθοδοι της Μοριακής Βιολογίας Γιάννης Χατζηδάκης και Κρίτων Καλαντίδης 2011

2 Σειρά διαλέξεων 1. Προσεγγίσεις επιστημονικής μεθοδολογίας 2. PCR1 3. PCR2 4. Μοριακοί Δείκτες 5. Διαγονιδιακά Ζώα 6. Παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών 7. Γονιδιακή στόχευση σε βλαστοκύτταρα 8. RNA σίγηση 9. mirnas 10. Κυτταρομετρία ροής 11. Μικροσυστοιχίες και next generation sequencing I 12. Μικροσυστοιχίες και next generation sequencing II

3 Σειρά διαλέξεων 1. Προσεγγίσεις επιστημονικής μεθοδολογίας 2. PCR1 3. PCR2 4. Μοριακοί Δείκτες 5. Διαγονιδιακά Ζώα 6. Παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών 7. Γονιδιακή στόχευση σε βλαστοκύτταρα 8. RNA σίγηση 9. mirnas 10. Κυτταρομετρία ροής 11. Μικροσυστοιχίες και next generation sequencing I 12. Μικροσυστοιχίες και next generation sequencing II

4 Σύγχρονες Μέθοδοι της Μοριακής Βιολογίας Διάλεξη 1η Εισαγωγή-Προσεγγίσεις της Επιστημονικής Μεθόδου Διάλεξη 2η PCR 1.Αρχή μεθόδου-σχεδιασμός primers- Βελτιστοποίηση αντίδρασης 2.Εφαρμογές RT-PCR Διάλεξη 3η PCR (Εφαρμογές: Απομόνωση ολικού RNA/mRNA, αντίστροφη μεταγραφή, RT-PCR, Differential Display, RACE, Chromatin IP, ειδική μεταλλοξεγένεση) Real time PCR Διάλεξη 4η Μοριακοί Δείκτες Βασικοί όροι Βασικές Χρήσεις Κύριες μέθοδοι RFLP, RPD, Mini- and Micro- satellites, AFLP

5 Σύγχρονες Μέθοδοι της Μοριακής Βιολογίας Διάλεξη 5η Διαγονιδιακά ζώα Διαγονιδιακά θηλαστικά Διαδικασία δημιουργίας διαγονιδιακών θηλαστικών (δημιουργία κατασκευής, προετοιμασία DNA για τη μικροένεση, υπερωορρηξία, συλλογή και καλλιέργεια γον. ωαρίων, παρασκευή πιπετών και μικροχειριστών, διαδικασία μικροένεσης, μεταφορά γονιμοποιημένων ωαρίων). Σχεδιασμός φορέων για διαγονιδιακή έκφραση Έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης στο χώρο και στο χρόνο:επαγόμενη και ιστοειδική έκφραση, Συστήματα Tet-on, Tetoff, εκδυσόνης Ανάλυση της ενσωμάτωσης (ένθεσης) του διαγονιδίου (πολλαπλές σειρές διαγον. ποντικιών, αριθμός αντιγράφων διαγονιδίου, κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός περιστοιχιζουσών ενδογενών αλληλουχιών) Ανάλυση της έκφρασης του διαγονιδίου (Κλασσικές μέθοδοι (Northern, RT-PCR, Western, αναοσοφθορισμός, Elisa, λειτουργ. δοκιμασίες), συστήματα έκφρασης με β-gal, με GFP, συστήματα με IRES) Διαγονιδιακά ψάρια

6 Σύγχρονες Μέθοδοι της Μοριακής Βιολογίας Διάλεξη 6 η Σύνθεση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε θηλαστικά

7 Σύγχρονες Μέθοδοι της Μοριακής Βιολογίας Διάλεξη 7η Γονιδιακή στόχευση σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα Διαδικασία Απόμόνωση και καλλιέργεια εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων Σχεδιασμός φορέων για γονιδιακή στόχευση (υποκινητές, εσώνια, εξώνια, βραχίονες ομολογίας, γονιδιακοί δείκτες επιλογής) Εισαγωγή DNA σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, θετική-αρνητική επιλογή κλώνων με ομόλογο ανασυνδυασμό Μοριακή ανάλυση αποικιών για ομόλογο ανασυνδυασμό (γονιδιακή στόχευση) Ένεση ES κυττάρων σε βλαστοκύστες, παραγωγή χιμαιρικών ποντικιών Εφαρμογές γονιδιακής στόχευσης Πλήρης απώλεια έκφρασης/λειτουργίας (knock-out) Στόχευση συγκεκριμένων αλληλουχιών (knock-in) (Σημειακές μεταλλάξεις, στόχευση συγκεκριμένων επικρατειών, στόχευση ρυθμιστικών αλληλουχιών) Ιστοειδική γονιδιακή στόχευση (σύστημα Cre/loxP, σύστημα FRT) Επαγόμενη γονιδιακή στόχευση (συνδυασμός Cre/loxP με συστήματα Teton, Tet-off κλπ) Θεραπευτική κλωνοποίηση (ES κύτταρα στον άνθρωπο, ελεγχόμενη διαφοροποίηση, κλωνοποίηση και ΕS κύτταρα)

8 Σύγχρονες Μέθοδοι της Μοριακής Βιολογίας Διάλεξη 8η Γονιδιακή σίγηση Ο κόσμος του RNA Αρχές γονιδιακής σίγησης Ο κεντρικός μηχανισμός Γονιδιακή σίγηση σε διάφορους οργανισμούς Χρήσεις και εφαρμογές Βασικοί όροι Ρόλος Διάλεξη 9 η mirna Ορολογία Βιογένεση Βιολογικός ρόλος σε φυτά και ζώα Άλλα μικρά RNA μόρια

9 Σύγχρονες Μέθοδοι της Μοριακής Βιολογίας Διάλεξη 10η Κυτταρομετρία ροής Αρχή μεθόδου-οργανολογία (Laser, χρωμοφόρα, φίλτρα, φακοί) Αποθήκευση-Ανάλυση πληροφορίας (Περιοχές-«Πύλες» ανάλυσης) Εφαρμογές κυτταρομετρίας Χρώση για επιφανειακές πρωτεΐνες (δείκτες) Χρώση για ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες Χρώση DNA (Ανευπλοειδία, ανάλυση κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, νέκρωση) Παρακολούθηση κυτταρικών διαιρέσεων in vitro και ex vivo Κνητική παρακολούθηση αύξησης ενδοκυτταρικού ασβεστίου. Μέτρηση ενδοκυταρικού ph Κυτταρομετρία ροής και υδάτινα οικοσυστήματα Άλλες εφαρμογές Διάλεξη 11 η Μικροσυστοιχίες (Έλεγχος Γονιδιακής Ενεργότητας) Ορολογία Βασικές μέθοδοι Διάλεξη 12 η Τεχνολογίες «βαθείας αλληλούχισης»

10 Αρχές επιστημονικής προσέγγισης Τι είναι αυτό που λέμε επιστήμη;

11 Τι είναι αυτό που λέμε Επιστήμη; Θετικισμόςαρνείται την μεταφυσική - επαληθευσιμότη τα αξιώματος

12

13 Α. Αρχές επιστημονικής προσέγγισης Εμπειρισμός: όλα πηγάζουν από την εμπειρία-παρατήρηση Ορθολογισμός: όλα πηγάζουν από νοητικές κατασκευές

14 Επαγωγισμός: Η επιστήμη ως γνώση προερχόμενη από την εμπειρία. Εάν έχουν γίνει παρατηρήσεις κάτω από ένα ευρύ φάσμα συνθηκών, σε ένα μεγάλο αριθμό από Α και εάν όλα τα παρατηρηθέντα Α χωρίς εξαίρεση διαθέτουν την ιδιότητα Β, τότε όλα τα Α έχουν την ιδιότητα Β. Παρατήρηση Επαγωγικός Λογισμός

15 Α. Αρχές επιστημονικής προσέγγισης Από το γενικό στο ειδικό: Παραγωγή (Deduction) και από το ειδικό στο γενικό: Επαγωγή (Induction)

16 Αρχές επιστημονικής προσέγγισης Επαγωγική «επιστήμη»

17 Προβλήματα του Επαγωγισμού Επαγωγικός Λογισμός: 1. Δεν υπάρχει καμία «λογική υποχρέωση» επαγωγής: Τίποτα δεν «υποχρεώνει» μία επόμενη παρατήρηση να επιβεβαιώσει την θεωρία που δομήθηκε πάνω σε προηγούμενες θεωρίες. Το σύνηθες επιχείρημα των επαγωγιστών είναι κυκλικό

18 Προβλήματα του Επαγωγισμού Μήπωςόμωςμπορούμεναβασιστούμε στις πιθανότητες; «Οι πιθανότητα να είναι αληθής μία καθολική γενίκευση ισούται με το αποτέλεσμα της διαίρεσης ενός πεπερασμένου αριθμού δια του άπειρου, και άρα όσο μεγάλος και να είναι ο αριθμός των παρατηρήσεων το κλάσμα θα είναι πάντα ίσο με 0.»

19 Προβλήματα του Επαγωγισμού 2. Παρατήρηση -Εξαρτάται πάντα και από τη θεωρία -Είναι στην ουσία μια νοητική διεργασία (Οι οπτικές εμπειρίες δε καθορίζονται από τα είδωλα στον αμφιβληστροειδή) -Εξαρτάται πάντα από τον τρόπο παρατήρησης Τελικά όμως όλες οι επιστημονικές μέθοδοι κρίνονται και από την «αποτελεσματικότητά τους»: «[ο επαγωγισμός] σε σύγκριση με τις ανταγωνιστικές του προσεγγίσεις είναι ολοένα και λιγότερο ικανός να ρίξει νέο και ενδιαφέρον φως στη φύση της επιστήμης»

20 Προβλήματα του Επαγωγισμού Emanuel Kant ( ): «Όλες οι πραγματικές επιστημονικές παρατηρήσεις έχουν τον χαρακτήρα κρίσης, δηλαδή στην ουσία απαντούν σε ερωτήσεις που έχουν τεθεί εκ των προτέρων»

21 Μπορούμε να εμπιστευόμαστε τις αισθήσεις μας; AF Chalmers

22 Μπορούμε να εμπιστευόμαστε τις αισθήσεις μας;

23 Σύγχρονες Προσεγγίσεις της Επιστήμης Θετικισμός- αρνείται την μεταφυσική -επαληθευσιμότητα αξιώματος Διαψευσιμότητα: -αδύνατον να επαληθεύσεις μιαυπόθεσηγιατίοιυποθέσειςείναι κατασκευάσματα του μυαλού, δεχόμαστε μια θεωρία μέχρι να αποδειχτεί λάθος

25 Ναός Θετικισμού στο PORTO ALEGRE Το εθνικό motto της Βραζιλίας: Ordem e Progresso ("Order and Progress") Είναι εμπνευσμένο από τον θετικισμό του Comte Isidore Auguste Marie François Xavier Comte (19 January September 1857)

27 Σύγχρονες Προσεγγίσεις της Επιστήμης Karl Popper «Είναι δυνατόν, με την βοήθεια της ελεύθερης, αλλά όχι αλάθητης, λογικής μας να καταλάβουμε κάτι για τον κόσμο και ως ένα σημείο ίσως ακόμα και να τον αλλάξουμε»

28 Διαψευσιμότητα: -αδύνατον να επαληθεύσεις μια υπόθεση γιατί οι υποθέσεις είναι κατασκευάσματα του μυαλού, δεχόμαστε μια θεωρία μέχρι να αποδειχτεί λάθος. Για να είναι μία απόφανση «επιστημονική» πρέπει να είναι και δυνητικά διαψεύσιμη

29 Διαψευσιοκρατία «Μια πολύ καλή θεωρία χαρακτηρίζεται από το εύρος των ισχυρισμών της, πράγμα που την καθιστά περισσότερο διαψεύσιμη, και από την αντοχή της απέναντι στις απόπειρες διάψευσης μέσω πειραματικού ελέγχου» Η επιστήμη προχωρά με δοκιμές και λάθη

30 Διαψευσιοκρατία Πρωτοκαθεδρία των θεωριών επί της παρατήρησης: Η επιστήμη δεν ξεκινά από την παρατήρηση Η διαψευσιοκρατία μετατοπίζει το βάρος από τις αρετές μίας μεμονωμένης θεωρίας στα πλεονεκτήματα ανταγωνιστικών θεωριών

31 Διαψευσιοκρατία Στα πλαίσια της Δ. η σημασία των επικυρώσεων είναι επίσης μεγάλη και εξαρτάται κατά πολύ από το ιστορικό τους πλαίσιο Η αποδοχή των θεωριών είναι προσωρινή ενώ η απόρριψή τους μπορεί να είναι μόνιμη

32 Τι είναι αυτό που λέμε Επιστήμη;

33 Τα όρια της διαψευσιοκρατίας Όταν συγκρούεται η θεωρία και η παρατήρηση δεν υπάρχει καμία λογική αναγκαιότητα που να επιβάλει την απόρριψη της θεωρίας Μιαθεωρίαστηνπραγματικότηταδεν μπορεί ποτέ να διαψευστεί 100%

34 Ούτε η επαγωγή ούτε η Δ. είναι σε θέση να αποδώσουν τη συνθετότητα που χαρακτηρίζει την γένεση και την ανάπτυξη πραγματικών θεωριών Εκδόσεις Τροχαλία Ουγγαρία-Βρετανία

35 Τα «Ερευνητικά Προγράμματα» Ένα ερευνητικό πρόγραμμα μπορεί να είναι προοδευτικό ή εκφυλιζόμενο ανάλογα με το πόσο επιτυγχάνει ή διαρκώς αποτυγχάνει να οδηγεί στην ανακάλυψη καινούργιων φαινομένων Οι πειραματικοί έλεγχοι αποκτούν σημασία μόνο σε ένα σχετικά προχωρημένο στάδιο της ανάπτυξής τους

36 Σύμφωνα με το Lacatos η «βασική μονάδα» της επιστημονικής ανάπτυξης δεν είναι η επιστημονική θεωρία και η αντικατάσταση μιας θεωρίας από μια πιο επιτυχημένη. Αντίθετα η βασική μονάδα είναι τα «ερευνητικά προγράμματα». Η επιστήμη προοδεύει όταν ένα ερευνητικό πρόγραμμα γίνει πιο παραγωγικό και πιο χρήσιμο από ένα άλλο και έτσι γίνει το νέο επίκεντρο της έρευνας σε πόρους τόσο οικονομικούς όσο και ανθρώπινους. Ένα ερευνητικό πρόγραμμα χαρακτηρίζεται από έναν αριθμό "hard core" θεμελιωδών αρχών και χαρακτηρίζεται επιτυχές όσο αυτές εξακολουθούν να αυξάνουν.

37 Αρχές επιστημονικής προσέγγισης «Οι θεωρίες συσσωρεύουν «ανωμαλίες» με τον χρόνο μέχρι που αντικαθίστανται» «Οι επικρατούσες θεωρίες είναι οι θεωρίες των κυρίαρχων επιστημόνων» Thomas Kuhn

38 Τα επιστημονικά «παραδείγματα» του Kuhn H επιστημονικές κοινότητες οργανώνονται γύρω από επιστημονικά «παραδείγματα». -Ένα είδος επιστημονικού καθεστώτος- Η επιστήμη εξελίσσεται με επαναστάσεις: Προ-επιστήμη-κανονική επιστήμη-κρίση-επανάσταση-νέα κανονική επιστήμη-νέα κρίση

39 KK1 Τα επιστημονικά «παραδείγματα» του Kuhn Προεπιστήμη-κανονική επιστήμη-κρίση-επανάσταση-νέα κανονική επιστήμη-νέα κρίση Προεπιστήμη: οι πρώτες «ανοργάνωτες» νεωτερικές φωνές Κανονική επιστήμη: όταν το συγκεκριμένο «παράδειγμα» γίνει καθεστώς Κρίση: συσσώρευση προβλημάτων Επανάσταση: ομαδική εγκαταλείψει παλαιού «παραδείγματος» και ενστερνισμός νέου

40 Slide 39 KK1 Το μεγαλύτερο μέρος της γνώσης κατα την φάση της κανονικής επιστήμης αποτελείτε απο σιωπηρή γνώση Kriton; 14/2/2006

41 Τα επιστημονικά «παραδείγματα» του Kuhn Η μέχρις ενός σημείου έλλειψη κριτικής στάσης είναι ζωτικής σημασίας για την «κανονική επιστήμη» Εάν οι επιστήμονες κρατούσαν μια κριτική στάση στα στοιχεία του παραδείγματος απέναντι στο εσωτερικό του οποίου εργάζονται δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί καμία λεπτομερής εργασία

42 Τα επιστημονικά «παραδείγματα» του Kuhn Τελικά επιστήμονες που βρίσκονται σε διαφορετικά «παραδείγματα» ζουν σε «διαφορετικούς κόσμους» Τα διάφορα επιστημονικά παραδείγματα είναι συνήθως ασύμμετρα

43 Τελικά μήπως είναι όλες οι Θεωρίες «λάθος»; Σχετικισμός Αρνούνται την ύπαρξη κάποιου καθολικού και υπεριστορικού κριτηρίου στη βάση της οποίας μια θεωρία μπορεί να προτιμηθεί μιάς άλλης Αποδόμηση

44 Paul Feyerabend Αυστρία Against method: Outline of an Anarchistic Theory of Knowledge (London 1975)

45 Ο Σχετικισμός του Feyerabend Οι κανόνες επιστημονικής μεθοδολογικής συμπεριφοράς αδυνατούν να οδηγήσουν στις πιο προοδευτικές στιγμές της ιστορίας της επιστήμης Η επίθεση κατά της μεθόδου θίγει τις μεθοδολογίες στο βαθμό που αυτές εκλαμβάνονται ως προμηθευτές κανόνων για την καθοδήγηση των επιστημόνων

46 Ο Σχετικισμός του Feyerabend Η εξήγηση της υψηλής εκτίμησης που χαίρει η επιστήμη στην κοινωνία μας πρέπει να αναζητηθεί στην κοινωνία και όχι στην φύση της επιστήμης

47 Τι είναι αυτό που λέμε Επιστήμη;

48 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ; Ίσως οι επιστήμη να πλησιάζει όλο και περισσότερο τον κόσμο έτσι όμως όπως μπορεί να προσληφθεί από το ανθρώπινο μυαλό -όχι απαραίτητα με αντικειμενικό τρόπο-

49 Πολλές από τις θεωρίες που αφήνουμε πίσω μας ίσως να ήταν σωστές αλλά σε ένα πολύ συγκεκριμένο δικό τους πλαίσιο (Ευκλείδεια Γεωμετρία, Νευτώνεια Φυσική κ.α.)

50 Αρχές προσέγγισης Βιολογικών Συστημάτων Συστήματα πολύπλοκα με πολλές άγνωστες παραμέτρους Το επιστημονικό «παράδειγμα» της Σύγχρονης Βιολογίας: Όλα τα χαρακτηριστικά των ένβιων βασίζονται κατ αρχήν στο γενετικό τους υλικό

51 Αρχές προσέγγισης Βιολογικών Συστημάτων Μοριακή Βιολογία: -Προσεγγίζουμε το βιολογικό σύστημα στο επίπεδο της γενετικής πληροφορίας και την αποκωδικοποίηση της από το κύτταρο -Είμαστε αναγκασμένοι να μελετάμε συνήθως το αντικείμενό μας έμμεσα, κάθε βήμα έμμεσης προσέγγισης εισάγει το δικό του «λάθος»

52 Σύγχρονες Μέθοδοι της Μοριακής Βιολογίας Στο Επόμενο: ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ