Η ΜΕΘΟ ΟΣ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΚΑΙ Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ. ΚΩΝ/ΝΟΣ Ε. ΚΕΡΑΜΑΡΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ, PhD ΚΛΙΝΙΚΟΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ

Transcript

1 Η ΜΕΘΟ ΟΣ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΚΑΙ Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ ΚΩΝ/ΝΟΣ Ε. ΚΕΡΑΜΑΡΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ, PhD ΚΛΙΝΙΚΟΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ

2 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ

3

4 ΦΘΟΡΙΟΧΡΩΜΑ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ (nm) ΕΚΠΟΜΠΗ (nm) MW ΣΗΜΕΙΩΣΗ Hydroxycoumarin Succinimidyl ester Aminocoumarin Succinimidyl ester Methoxycoumarin Succinimidyl ester Cascade Blue 375; Hydrazide Lucifer yellow NBD NBD-X R-Phycoerythrin (PE) 480; k PE-Cy5 conjugates 480;565; aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red PE-Cy7 conjugates 480;565; phycoerythrin - cyanine APC-Cy7 conjugates 650; PharRed Red ; PE-Texas Red Fluorescein FITC; ph sensitive (fluororescein isothiocyanate) FluorX (AP Biotech) BODIPY-FL TRITC TRITC X-Rhodamine XRITC Lissamine Rhodamine B PerCP Peridinin chlorophyll protein Texas Red Sulfonyl chloride DAPI diamidino-2-phenylindole Allophycocyanin (APC) k TruRed 490, PerCP-Cy5.5 conjugate

5

6 Απορρόφηση UV από ηλεκτρόνιο που µεταπηδά σε ανώτερη ενεργειακή στάθµη. Επαναφορά του ηλεκτρονίου και εκποµπή του φωτονίου (φθορισµός)

7

8

9

10

11

12 Απεικόνιση αρτηρίας, µε συνεστιακό σαρωτικό µικροσκόπιο Laser, από ανθρώπινο δερµατικό ιστό µετά από σύνθεση 20 εικόνων. Montage of six 20X images of triple-stained artery in human skin acquired on a CARV nonlaser confocal microscope. Nerves are stained orange-red with a Cy3-secondary antibody used to detect anti-protein Gene Product 9.5. Type IV collagen in basement membrane is localized with Cy2-secondary antibody (green) and Cy5-Ulex Europeaus Agglutinin type I (pseudo-colored blue) is used to stain endothelial cells. Image contributed by Dr. William R. Kennedy and Dr. Gwen Wendelschafer-Crabb, Department of Neurology, University of Minnesota.

13 Αλληλεπίδραση ιού CMV µε το επιµολυσµένο κύτταρο Joerg Schroeer Department of Molecular Biology Human cytomegalovirus infected human endothelial cells. Multicolor Immunofluorescence (IF). Blue: DAPI = cellular DNA. Green = GFP (green fluorescence protein). Red + Magenta = two different viral proteins. Captured with a Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope.

14 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ ΡΟΗΣ

15 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ

16 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ

17 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ Κλινικό Φροντιστήριο: «Κυτταροµετρία ροής: Κλινικές και Ερευνητικές εφαρµογές». ΕΕΚΧ_ΚΒ

18

19 Ανοσοφθορισµός στη εργαστηριακή διάγνωση λοιµωδών και αυτοάνοσων νοσηµάτων

20 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΥ 1. Υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία εξαιτίας του οπτικού διαχωρισµού της περιοχής αντίδρασης. Τα αντισώµατα χρωµατίζουν τον ιστό ή τα κύτταρα σύµφωνα µε την µορφολογική κατανοµή του αντίστοιχου αντιγόνου. 2. Εύκολη προετοιµασία των κυτταρικών και ιστικών υποστρωµάτων (ψυκτικές τοµές, κυτταροκαλλιέργειες, κυτταρικό επίχρισµα). 3. Μία µέθοδος εκατοντάδες διαφορετικές εργαστηριακές παράµετροι. 4. Είναι η µέθοδος επιλογής αφού σε πλείστες περιπτώσεις το υπεύθυνο αντιγόνο δεν είναι διαθέσιµο. 5. υνατότητα για ταυτόχρονο έλεγχο σε δεκάδες διαφορετικά αυτοαντισώµατα σε ένα υπόστρωµα. 6. Χαµηλό κόστος αντιδραστηρίων για το εργαστήριο. ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ 1. Απαιτείται η επένδυση στην αγορά ενός υψηλού κόστους µικροσκοπίου και η διαµόρφωση κατάλληλου χώρου εργασίας και παρατήρησης. 2. Μεγάλη εµπειρία από το επιστηµονικό προσωπικό. Απαιτείται βαθιά γνώση του αντικειµένου, όχι µηχανιστική λειτουργία, αναγνώριση των πιθανών σφαλµάτων σε όλα τα βήµατα της διαδικασίας. 3. Η ύπαρξη διασταυρούµενων αντιδράσεων που οδηγεί σε λανθασµένο αποτέλεσµα. 4. ύσκολη πολλές φορές αξιολόγηση που έγκειται σε υποκειµενικά κριτήρια.

21 ΕΜΜΕΣΟΣ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ I Καθαρισµός πάγκου εργασίας. Παραµονή των αντιδραστηρίων σε θερµοκρασία δωµατίου για 15 πριν ανοιχτούν οι συσκευασίες. Αρίθµηση των πλακών και µαρκάρισµα µε ανεξίτηλο µαρκαδόρο λεπτής γραφής. Ποτέ δεν αγγίζουµε την επιφάνεια του υποστρώµατος. Ανακίνηση των δειγµάτων (vortex) πριν και µετά την αραίωση. Παρασκευάζουµε το ρυθµιστικό διάλυµα PBS µε αρίστης ποιότητος απεσταγµένο νερό. Αραιώνουµε τους ορούς σύµφωνα µε τις οδηγίες του εγχειριδίου χρήσης του διαγνωστικού προϊόντος. Εφαρµόζουµε το σωστό όγκο πάνω στο υπόστρωµα µε τρόπο ώστε να αποφεύγεται η πλευρική ανάµιξη των δειγµάτων.

22 ΕΜΜΕΣΟΣ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ II Αποµακρύνουµε τις φυσαλίδες αέρα. Παίρνουµε τα κατάλληλα µέτρα για την αποφυγή εξάτµισης (επώαση σε περιβάλλον κορεσµένης υγρασίας αν απαιτείται). εν επιµηκύνουµε ή µειώνουµε τους χρόνους επώασης. Ξεπλένουµε προσεκτικά χρησιµοποιώντας δοχείο µεγάλου στοµίου και βυθίζουµε αµέσως την πλάκα σε δοχείο µε PBS-Tween. Στραγγίζουµε τις πλάκες χωρίς τα αγγίζουµε το υπόστρωµα και επιστρώνουµε το δεύτερο αντίσωµα (conjugate). Σε κανένα στάδιο της διαδικασίας δεν πρέπει να στεγνώσει εντελώς το κυτταρικό ή ιστικό υπόστρωµα. εν χρησιµοποιούµε κλίβανο ή στεγνωτήρα µαλλίων. Αποφεύγουµε την έκθεση στο φως του ήλιου.

23 ΕΜΜΕΣΟΣ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ III Μετά το τελικό ξέπλυµα τοποθετούµε την καλλυπτρίδα, χρησιµοποιώντας γλυκερόλη-pbs, χωρίς υπερβολική πίεση και µε ιδιαίτερη προσοχή ώστε να µην παγιδευτούν φυσαλίδες αέρα. Αποµακρύνουµε την περίσσεια γλυκερόλης. Παρατηρούµε σε σκοτεινό δωµάτιο, χρησιµοποιώντας το µικροσκόπιο φθορισµού µε τα κατάλληλα φίλτρα, καθαρούς φακούς, ευθυγραµµισµένη δέσµη φωτός, λάµπα µε χρόνο λειτουργίας < 200 ώρες. Χρησιµοποιούµε τιτλοποιηµένους πρότυπους ορούς για τον έλεγχο της διαδικασίας. Αναγκαία και η χρησιµοποίηση θετικών ή αρνητικών ορών ασθενών. Κατά κανόνα τα controls της συσκευασίας δεν µας επιτρέπουν την σωστή αξιολόγηση του διαγνωστικού προϊόντος που χρησιµοποιούµε.

24 Αυτόµατος ανοσολογικός αναλυτής για προετοιµασία πλακών ανοσοφθορισµού IMMCO Diagnostics

25 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ

26 Προσδιορισµός αντισωµάτων έναντι µολυσµατικών παραγόντων µε Ανοσοφθορισµό

27 Αντισώµατα έναντι Bordetella pertussis

28 Αντισώµατα έναντι Candida albicans

29 Αντισώµατα έναντι Treponema pallidum (FTA)

30 Αντισώµατα έναντι Varicella zoster virus

31 Αντισώµατα έναντι Cytomegalovirus

32 Αντισώµατα έναντι των Chlamydia trachomatis

33 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΆΤΩΝ ΜΕ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟ AΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ 3-5% του γενικού πληθυσµού Oργανοειδικά-Συστηµατικά Αυτοαντιδραστικά T-λεµφοκύτταρα Aυτοαντισώµατα Ιστική βλάβη

34 ΑΙΤΙΑ ΑΥΤΟΑΝΟΣΙΑΣ Παράκαµψη των µηχανισµών που ελέγχουν την αυτοανοσία. ιέγερση αυτοαντιδρώντων κυττάρων από ξένα αντιγόνα. Απορύθµιση κυτταροκινών, ακατάλληλη έκφραση MHC και έλλειψη καταστολής. Μοριακή µίµηση. Απελευθέρωση αποµονωµένων αντιγόνων από τραυµατισµένους ιστούς. Γενετική προδιάθεση στην αυτοανοσία.

35 Χαµηλοί τίτλοι Τάξης IgM Παρόντα σε υγιείς Φυσικά αυτοαντισώµατα Παθογενετικά αυτοαντισώµατα Υψηλή συγκέντρωση στον ορό Παρουσία στην ιστική βλάβη Πρόκληση βλάβης του υποστρώµατος in vitro Mεταφορά νόσου σε πειραµατικά µοντέλα Υφεση νόσου όταν εξαφανίζονται

36 Προσδιορισµός ιστοειδικών και οργανοειδικών αυτοαντισωµάτων

37 Thyroid gl., prim.: αντι-µικροσωµιακά θυρεοειδικά

38 Thyroid gl., prim.: αντι - θυρεοσφαιρινικά

39 Kidney, prim.: αντισώµατα έναντι σπειραµατικής βασικής µεµβράνης (αντι-gbm)

40 Intestine/gliadin: αντισώµατα έναντι ενδόµυιου και Γλοιαδίνης

41 Oesophagus, prim.: αντισώµατα έναντι δεσµοσωµάτων

42 Oesoph., prim.: αντισώµατα έναντι Επιδερµικής Βασικής Μεµβράνης (αντι - ΕΒΜ)

43 cell cytopl. (Yo) Cerebellum/intest.: αντι - Purkinje

44 Pancreas/cerebellum, prim.: αντισώµατα έναντι GAD (αποκαρβοξυλάση του γλουταµικού οξέος)

45 Stomach, prim.: αντισώµατα έναντι τοιχωµατικών κυττάρων (PCA)

46 Stomach, rat: αντισώµατα έναντι λείων µυικών ινών (ASMA)

47 Kidney, rat: αντισώµατα έναντι µιτοχονδρίων (AMA)

48 Spermatozoa, human.: αντισώµατα έναντι σπερµατοζωαρίων

49 Thrombocytes, hum.: αντισώµατα έναντι αιµοπεταλίων

50 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΟΥ ΕΤΕΡΟΦΙΛΩΝ ΛΕΥΚΟΚΥΤΤΑΡΩΝ (ANCA)

51 canca αντιγόνα: πρωτεϊνάση 3 (PR3), BPI. Ουδετερόφιλα, ανθρώπινα (µονιµοποιηµένα σε αιθανόλη) panca αντιγόνα: µυελοϋπεροξειδάση (ΜΡΟ), καθεψίνη G, λακτοφερρίνη, ελαστάση, α-ενολάση, β- γλυκουρονιδάση, λυσοζύµη, αζουροσιδίνη, ΒΡΙ, κλπ. canca αντιγόνα: πρωτεϊνάση 3 (PR3). Ουδετερόφιλα, ανθρώπινα (µονιµοποιηµένα σε φορµαλδεΰδη) panca αντιγόνα: µυελοϋπεροξειδάση (ΜΡΟ) Ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα (HEp-2) Συκώτι (πρωτεύον) Granulocyte mosaic 3

52 Granulocyte mosaic 3 : αντισώµατα έναντι της MPO

53 Granulocyte mosaic 3 : panca (όχι anti-mpo)

54 Granulocyte mosaic 3 : αντισώµατα έναντι της PR3

55 Granulocyte mosaic 3 : ANA

56 Granulocyte mosaic 3 : ANA και anti-mpo

57 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ

58 ΑΝΤΙΠΥΡΗΝΙΚΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ Είναι µια ποικιλία αυτοαντισωµάτων που αντιδρούν µε συστατικά του πυρήνα, όπως DNA, RNA, ένζυµα, δοµικές πρωτεΐνες και ριβονουκλεοπρωτεΐνες. Ο προσδιορισµός τους στον ορό των ασθενών, στην καθηµερινή εργαστηριακή πρακτική, γίνεται κυρίως µε έµµεσο ανοσοφθορισµό σε κυτταρικό υπόστρωµα Hep-2 (επιθηλιακά κύτταρα από καρκίνο του λάρυγγα). Η αρχική αραίωση του ορού είναι 1:100 (EUROIMMUN), 1:80 (INOVA, κλπ). Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί περισσότερα από 30 αντιγόνα που αποτελούν στόχο των αυτοαντισωµάτων και σχετίζονται µε αυτοάνοσα νοσήµατα. Τα αντιπυρηνικά αντισώµατα που προσδιορίζονται είναι κλάσεως IgG. Τα IgM αντισώµατα, έως σήµερα, δεν εξετάζονται, αφού θεωρούνται µη ειδικά για το αυτοάνοσο νόσηµα και η παρουσία τους δεν αξιολογείται. Όµως, τελευταίες µελέτες δείχνουν ότι τα IgM φαίνεται να παράγονται ως µέρος της αυτόανοσης απόκκρισης µειώνοντας την δριµύτητα της αυτοάνοσης παθολογίας που σχετίζεται µε την παραγωγή των IgG. Αντίθετα η αυξηµένες συγκεντρώσεις των IgM αυτοαντισωµάτων φαίνεται να επιδεινώνουν την αυτοάνοση απόκκριση. Τα αντιπυρηνικά αντισώµατα ανιχνεύονται και σε ιστικές τοµές από όργανα µη ανθρώπινης προέλευσης (ήπαρ και νεφροί από πιθήκους και αρουραίους) καθώς και σε κύτταρα άλλων ανθρώπινων κυτταρικών σειρών, όπως HeLa, KB, κ.λπ. Ο τύπος του ανοσοφθορισµού έχει ιδιαίτερη διαγνωστική αξία και καθοδηγεί το θεράποντα ιατρό και το εργαστήριο στην αναζήτηση του υπεύθυνου αντιγόνου, εφαρµόζοντας µεθόδους ELISA και western blotting.

59 Προσδιορισµός Αντιπυρηνικών αντισωµάτων µε έµµεσο ανοσοφθορισµό (IIF) Πλήρη φάσµα αντιγόνων πυρηνικών και κυτταροπλασµατικών. Μέθοδος αναφοράς, πολύ υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Σύνθεση υποστρωµάτων: HEp-2 κύτταρα + συκώτι από πρωτεύον

60 ds D A ss D A R A Ιστόνες ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ ΜΕ ΤΙΣ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΑΝΤΙΓΟΝΑ πυρηνική µεµβράνη, lamins, nuclear pore Cyclin I (PC A) πυρηνικό αντιγόνο πολ/σιαζόµενων κυττάρων Cyclin II, σχέση µε CE P F (mitoses:dots) ΣΕΛ ΣΕΛ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ Συστ. ερυθηµατώδης λύκος ΣΕΛ, Φαρµακευτικός ΣΕΛ,ΠΜ, Μ, MCTD, ΣΣ, ΡΑ ΣΕΛ, σκληρόδερµα, ΣΣ ΣΕΛ, ρευµατοειδής αρθρ. διάφορα καρκινώµατα P ριβοσωµικές πρωτεΐνες Po, P1, P2 SS-A (Ro)- sr Ps (πρωτεΐνες 52 kda, 60 kda) SS-B (La)- sr Ps (48 kda) Sm (Smith)-R P (B, B,D,E,F,G) U1-nR P (70Κ, Α and C proteins)-splicing U3-nR P (fibrillarin, 34 kda) R A polymerase I Scl-70 (topoisomerase 1) 7-2-R P(To), 4-6-S-R A nucleolus organizer region ( OR) κεντροµερίδιο (κινητοχώρος) A, B, C πρωτεΐνες ΣΕΛ Σύνδροµο Sjogren s, SLE, PBC Σύνδροµο Sjogren s,sle ΣΕΛ ΜCTD, ΣΕΛ σκληρόδερµα progressive systemic sclerosis progressive systemic sclerosis progressive systemic sclerosis progressive systemic sclerosis progressive systemic sclerosis, CREST

61 ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΑΥΤΟΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ ΜΕ ΤΙΣ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ PM-Scl (PM-1) Jo-1,PL-7, PL-12, συνθετάσες t-r A H,T,A Ku, Mi-1, Mi-2, OJ, EJ,SRP (signal recognition particles) Sp100, PML, DP55, nuclear matrix-associated, PML oncog.domain (POD), nuclear bodies,kr bodies spindle fibres (ΜSA-1), midbody(msa2), centrioles, ΑΜΑ, pyruvate dehydrogenase M2 ΑΜΑ, Sulfite oxidase M4 ΑΜΑ, glycogen phosphorylase M9 Συσκευή Golgi ακτίνη βιµεντίνη, τροποµυοσίνη λυσσόσωµα RA A Πολυµυοσίτιδα,δερµατοµυοσίτιδα σκληρόδερµα (overlap syndrome) πολυµυοσίτιδα,δερµατοµυοσίτιδα πολυµυοσίτιδα δερµατοµυοσίτιδα SLE: chronic collagenosis πρωτοπαθής χολική κίρρωση (PBC) άγνωστη κλιν. συσχέτιση, ρευµατικές νόσοι πρωτοπαθής χολική κίρρωση, χρόνιες ηπατοπάθειες πρωτοπαθής χολική κίρρωση αρχική φάση PBC επιφαινόµενο σε ιική λοίµωξη, πρώιµο µήνυµα αυτοάνοσης νόσου, ΣΕΛ, ΣΣ, ΡΑ αυτοάνοση ηπατίτιδα άγνωστη κλινική συσχέτιση άγνωστη κλινική συσχέτιση ρευµατοειδή αρθρίτιδα

62 Προσδιορισµός Αντιπυρηνικών αντισωµάτων σε υπόστρωµα HEp-2 / liver Στικτός Οµοιογενής Περιφερικός Κύριο τύποι ανοσοφθορισµού Πυρηνισκικός 1. Στικτός 2. Οµοιογενής 3. Περιφερικός (Πυρηνικής Μεµβράνης) 4. Πυρηνισκικός 5. Κεντροµεριδιακός 6. Πυρηνικών κοκκίων Κεντροµεριδιακός Πυρηνικών κοκκίων

63 ΜΙΚΤΟΙ ΤΥΠΟΙ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΥ

64 Κατανοµή θετικότητας και τύπου σε µεγάλο αριθµό ασθενών στο εργαστήριό µας Φύλο Σύνολο δειγµάτων % ΑΝΑ 1/100 ΑΝΑ 1/320 ΑΝΑ αρνητικά Θήλυ Άρρεν 74,6 % 25,4 % 28,9 % 26 % 19,3 % 9,1 % 51,8 % 64,9 % ΑΝΑ θετικά Στικτός Οµοιογενής Πυρηνισκικός Πυρηνικών κοκκίων Κεντροµεριδιακός Πυρηνικής µεµβράνης (81 %) 97 (2,3 %) 420 (9,9 %) 58 (1,4 %) 117 (2,8 %) 110 (2,6 %)

65 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΝΑ Τίτλος ΑΝΑ 1/320 ΑΝΑ 1/100 Τύπος Στικτός Οµοιογ. Πυρην/κός Στικτός Οµοιογ. Πυρην/κός ΑΝΑ Θετικά αντι-ενα Θετικά ποσοστό % , , ,

66 Αυτοαντισώµατα έναντι πυρηνικών και κυτταροπλασµατικών αντιγόνων Έλεγχος σε κύτταρα HΕp-2/ τοµές από συκώτι µε ανοσοφθορισµό Αρνητικό Θετικό Χαρακτηριστικός τύπος ανοσοφθορισµού Οµοιογενής Στικτός πυρηνισκικός κοκκιώδης κ/πλασµατικός ds DNA SSA Scl-70 κεντροµερίδιο ΑΜA ss DNA SSB Pm-Scl Sp-100 Jo-1 ιστόνες nrnp φιµπριλλαρίνη nuclear matrix PL-7 Sm RNA πολυµ. Ι PL-12 Cyclin I,II 7-2- RNP Golgi Ku 4-6-S-RNA P-ριβ.πρωτεΐνες Mi-2 N. Organiser ακτίνη Mi-1 Φθορισµός πυρηνικής µεµβράνης: λαµίνες, πυρηνικοί πόροι. Φθορισµός µιτωτικών κυττάρων: κεντροσωµάτια, ινίδια µιτωτικής ατράκτου (µικροσωληνίσκοι;;), ενδιάµεσο σώµα (midbody), αντιγόνα σχετιζόµενα µε τα χρωµοσώµατα (ΜSA-3). βιµεντίνη τροποµυοσίνη λυσοσώµατα

67 Αντιπυρηνικά αντισώµατα σε άλλα νοσήµατα

68 ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΩΝ ΑΝΤΙΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ ΕΝΕΡΓΗ ΗΠΑΤΙΤΙ Α Β ΣΥΝΟΛΟ ANA(-) ANA(+) ANA(+) ANA(+) ΑΣΘΕΝΩΝ 1/100 1 /320 >1/ % 48% 24% 4%

69 ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΩΝ ΑΝΤΙΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ ΕΝΕΡΓΗ ΗΠΑΤΙΤΙ Α C Σύνολο ασθενών ANA(-) ANA(+) 1/100 ANA(+) 1/320 ANA(+) >1/ ,4% 14 40% 13 37,2% 4 11,4%

70 ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΤΙΤΛΟΥ ΤΩΝ ΑΝΤΙΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΟΠΑΘΕΙΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΣΥΝΟΛΟ ΑΝΑ (-) ΑΝΑ (+) ΑΝΑ (+) ΑΝΑ (+) ΑΣΘΕΝΩΝ 1/100 1/320 >1/ % 32% 28%

71

72 Προσδιορισµός αντιπυρηνικών και κυτταροπλασµατικών αυτοαντισωµάτων

73 Πυρηνικοί και κυτταροπλασµατικοί στόχοι αυτοαντισωµάτων P-ριβοσ. πρωτεΐνες Jo-1 EUROIMMUN Αντιγόνα σχετιζόµενα µε χρωµοσώµατα Ενδιάµεσο σώµα Κεντρίδιο Πυρηνική άτρακτος

74 Κυτταροπλασµατικοί στόχοι αυτοαντισωµάτων Μιτοχονδριακά αντιγόνα Λυσόσωµα Υπεροξύσωµα Σύµπλεγµα Golgi

75 Κυτταροπλασµατικοί στόχοι αυτοαντισωµάτων ακτίνη τροποµυοσίνη βιµεντίνη LMA LSP SLA

76 Υπόστρωµα HEp-2 κυττάρων + Συκώτι (primate) - Επιβεβαιωτικό πρότυπο, π.χ.: - ακτίνη - ριβ. P- πρωτεΐνη - ιαφοροποιηµένο πρότυπο, π.χ.: - κεντροµεριδικά πυρηνικά κοκκία - SS-A/-B Sm/RNP Ku - Επιπλέον αποτελέσµατα, π.χ.: - ANCA - ενδόµυιο / τρανσγλουταµινάση

77 HEp-2 κύτταρα Επιβεβαιωτικό πρότυπο Συκώτι (primate) actin Ριβοσ. P-πρωτεΐνη

78 Hep-2 κύτταρα ιαφοροποιηµένο πρότυπο Συκώτι (primate) κεντροµερίδιο Πυρηνικά κοκκία (nuclear dots)

79 ιαφοροποιηµένο πρότυπο Συκώτι (primate) HEp-2 κύτταρα IF-τύπου Sm/RNP IF-τύπου SS-A/SS-B Ku

80 Εναλλακτικές µέθοδοι προσδιορισµού αντισωµάτων έναντι πυρηνικών και κυτταροπλασµατικών στόχων

81 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ο Ανοσοφθορισµός είναι µια δυναµική µέθοδο υψηλής ειδικότητας και ευαισθησίας απαραίτητη για κάθε εργαστήριο. Η δυνατότητα σύνθεσης των πολλών διαφορετικών υποστρωµάτων δίνει το πλεονέκτηµα της γρήγορης και αξιόπιστης εργαστηριακής διερεύνησης σε µια τεράστια ποικιλία µολυσµατικών και αυτοάνοσων ασθενειών. Τα όποια µειονεκτήµατα µπορεί να περιοριστούν µε την γνώση και την εµπειρία του υπεύθυνου επιστηµονικού προσωπικού, καθώς και µε την εισαγωγή αυτόµατων αναλυτών και κατάλληλων λογισµικών για Η/Υ. Ειδικά στην διερεύνηση των αυτοάνοσων νοσηµάτων η µέθοδος του ανοσοφθορισµού θεωρείται αναντικατάστατη. Η προσήλωση σε ποιοτικά κριτήρια στην επιλογή των αντιδραστηρίων, στην µεθοδολογική διαδικασία και στην αξιολόγηση του αποτελέσµατος είναι άκρως απαραίτητη για την αξιοπιστία του αποτελέσµατος. Επιβάλλεται η συµµετοχή σε προγράµµατα εσωτερικού και εξωτερικού ποιοτικού ελέγχου.

82 200 διαφορετικές εργαστηριακές δοκιµασίες. 280 αλλεργιογόνα εξετάσεις το µήνα. Ποικιλία µεθόδων: ΜΕΙΑ, FPIA, χηµειοφωταύγεια, ELISA, ανοσοφθορισµός, western blot, ανοσοχρωµατογραφία. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ Συνάδελφοι Συνεργάτες Σοφία Φιλοηλία, Βιολόγος Παναγιώτα Κούκκου, Χηµικός Μίνα Ασπιώτη, Εκπαιδευόµενη

83 ΜΙΚΡΟΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΑΝΑΛΥΣΗ ΑΕΒΕ ΑΕΒΕ ΑΕΒΕ ΑΕΒΕ ΑΕΒΕ ΑΕΒΕ ΑΕΒΕ ΑΕΒΕ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΚΑΙ ΚΑΙ ΚΑΙ ΚΑΙ ΚΑΙ ΚΑΙ ΚΑΙ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΕΥΧΑΡΙΣΤΟΥΜΕ