ΒΑΣΙΛΙΚΗ Π. ΝΤΥΜΕΝΟΥ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ DRV ΠΟΥ ΕΓΚΛΩΒΙΖΟΥΝ ΥΨΗΛΕΣ ΠΟΣΟΤΗΤΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΛΥΟΦΙΛΟΠΟΙΗΣΗ, ΩΣΤΕ ΝΑ ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ ΑΠΟΘΗΚΕΥΟΝΤΑΙ ΣΕ ΞΗΡΗ ΜΟΡΦΗ» Για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» ΒΑΣΙΛΙΚΗ Π. ΝΤΥΜΕΝΟΥ Φαρμακοποιός ΠΑΤΡΑ 2006

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΟΥΝΤΑΙ ΓΙΑ ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ DRV ΠΟΥ ΕΓΚΛΩΒΙΖΟΥΝ ΥΨΗΛΕΣ ΠΟΣΟΤΗΤΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΛΥΟΦΙΛΟΠΟΙΗΣΗ, ΩΣΤΕ ΝΑ ΜΠΟΡΟΥΝ ΝΑ ΑΠΟΘΗΚΕΥΟΝΤΑΙ ΣΕ ΞΗΡΗ ΜΟΡΦΗ» ΒΑΣΙΛΙΚΗ Π. ΝΤΥΜΕΝΟΥ Φαρμακοποιός ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σοφία Αντιμησιάρη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Κωνσταντίνος Αυγουστάκης Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής Παύλος Κλεπετσάνης Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής

3 Αφιερώνεται στους γονείς μου, Παναγιώτη και Μαρία

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική και Ανάλυση Φαρμάκων» κατά τα έτη Στο σημείο αυτό θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου προς την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Σ. Αντιμησιάρη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής για την ανάθεση του θέματος και την πολύτιμη αρωγή της κατά τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Π. Κλεπετσάνη και τον κ. Β. Δρακόπουλο για τη βοήθειά τους όσον αφορά στην πραγματοποίηση της μορφολογικής μελέτης των λιποσωμάτων. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου και όλους τους αγαπημένους μου ανθρώπους για την πολύπλευρη στήριξη που μου προσφέρουν πάντα και την πίστη τους σε μένα.

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 1 ABSTRACT 3 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Γενικά Δομικά στοιχεία-χαρακτηριστικά λιποσωμάτων Λιπίδια Θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης (Phase Transition Τ m ) Χοληστερόλη και ρόλος της Ταξινόμηση των λιποσωμάτων Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος Με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Μηχανική διασπορά Ακίδα υπερήχων (Probe sonicator) Εξώθηση μέσω φίλτρων Χρήση μικρογαλακτωματοποιητή Εξώθηση σε θάλαμο εφαρμογής μεγάλης πίεσης Ένεση λιπιδίων Δημιουργία μικτών μικυλλίων σε απορρυπαντικό Άλλες ειδικές μέθοδοι Αφυδατωμένα-Ενυδατωμένα σωματίδια (DRV) Ψύξη Απόψυξη Υπερήχηση (FTS) Τεχνική ενός βήματος (one step method) Μέθοδοι καθαρισμού λιποσωμάτων Χρωματογραφία στήλης (Gel filtration-column Chromatography) Διαπίδυση (Dialysis) Φυγοκέντρηση (Centrifugation) Δυναμικό επιφάνειας λιποσωμάτων (ζ-δυναμικό) Μεταβολική πορεία των λιποσωμάτων στον οργανισμό Οδοί χορήγησης λιποσωμικών μορφών.. 31

6 Παρεντερική χορήγηση Τοπική χορήγηση λιποσωμάτων Χορήγηση Per os Λιποσώματα: Εφαρμογές Ως φορείς εμβολίων Ως αντιμικροβιακά Λιποσώματα στη θεραπεία του καρκίνου Άλλες εφαρμογές των λιποσωμάτων Μακροχρόνια σταθερότητα λιποσωμάτων Λυοφιλοποίηση (Freeze-drying, Lyophilization) Ανάλυση παραγόντων που ασκούν πίεση κατά τη λυοφιλοποίηση Συμπεριφορά του νερού κατά την κατάψυξη Κρυοπροστασία Μηχανισμοί προστασίας κατά την αφυδάτωση Αλληλεπιδράσεις τρεαλόζης-πρωτεΐνης Λιποσωμική μεταφορά πεπτιδίων και πρωτεϊνών Ανατομικοί και φυσιολογικοί παράγοντες Νέες εξελίξεις στη λιποσωμική μεταφορά πεπτιδίων και πρωτεϊνών Στόχευση t-pa μέσω λιποσωμάτων για θρομβολυτική θεραπεία Αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) και λιποσώματα Γενικά Προσρόφηση BSA στις μεμβράνες των λιποσωμάτων Σκοπός παρούσας μελέτης ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Όργανα και υλικά Όργανα Υλικά Παρασκευή διαλυμάτων Μέτρηση λιπιδίου Υλικά... 66

7 Προσδιορισμός ενεργότητας του t-pa Υλικά Κρυοπροστατευτικά Υλικά Μέθοδοι Παρασκευή DRV λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν αλβουμίνη Παρασκευή DRV λιποσωμάτων που περιέχουν BSA και τρεαλόζη εντός των λιποσωμάτων Μέτρηση της ελεύθερης (μη εγκλωβισμένης στα λιποσώματα) πρωτεΐνης Προσδιορισμός λιπιδίου Μέθοδος Stewart Μελέτη επίδρασης FD σε DRV-BSA λιποσώματα παρουσία και απουσία κρυοπροστατευτικού Μορφολογική μελέτη SEM Πειράματα παρασκευής DRV λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν t-pa Μέτρηση ενεργότητας t-pa Υπολογισμός εγκλωβισμού πρωτεΐνης Μέτρηση λιπιδίου Μελέτη επίδρασης FD σε DRV-t-PA λιποσώματα παρουσία και απουσία κρυοπροστατευτικού Μέτρηση ενεργότητας συγκράτηση t-pa από τα λιποσώματα Μέτρηση λιπιδίου στα λιποσωμικά δείγματα μετά το FD ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Παρασκευή DRV λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν αλβουμίνη Υπολογισμός εγκλωβισμένης στα λιποσώματα αλβουμίνης Παρατηρήσεις Μελέτη επίδρασης προσθήκης τρεαλόζης στη σταθερότητα διαφόρων DRV λιποσωμάτων μετά από FD Υπολογισμός συγκράτησης της αλβουμίνης στα λιποσώματα Συμπεράσματα Μελέτη παρασκευής και σταθερότητας PC:PG:CHOL (9:1:5) λιποσωμάτων με προσθήκη τρεαλόζης εσωτερικά σε δύο μοριακές αναλογίες treh/pc:0.2 και 0.1 (mol/mol) Συμπεράσματα.. 96 Μελέτη παρασκευής DRV λιποσωμάτων που περιέχουν εσωτερικά τρεαλόζη σε μοριακή αναλογία treh/pc 0.2 (mol/mol) και λιποσωμάτων που δεν περιέχουν τρεαλόζη στο εσωτερικό των λιποσωμάτων Συμπεράσματα

8 Μελέτη επίδρασης FD σε DRV λιποσώματα που περιέχουν εσωτερικά(σε μοριακή αναλογία treh/pc=0.2) και εξωτερικά τρεαλόζη και σε λιποσώματα που περιέχουν τρεαλόζη μόνο εξωτερικά Συμπεράσματα Μελέτη παρασκευής και σταθερότητας PC:PG:CHOL (9:1:5) DRV λιποσωμάτων με προσθήκη τρεαλόζης εσωτερικά και εξωτερικά στην ίδια συγκέντρωση... Επίδραση συγκέντρωσης αλάτων στον αρχικό εγκλωβισμό της BSA σε DRV λιποσώματα PC:PG:CHOL (9:1:5) όταν προστίθεται τρεαλόζη εσωτερικά/εξωτερικά στην ίδια συγκέντρωση στα λιποσώματα... Επίδραση συγκέντρωσης αλάτων στην τελική συγκράτηση της BSA σε PC:PG:CHOL (9:1:5) DRV λιποσώματα... Επίδραση αλάτων στην τελική συγκράτηση της BSA σε PC:PG:CHOL (9:1:5) DRV λιποσώματα που περιέχουν τρεαλόζη εσωτερικά και εξωτερικά στην ίδια συγκέντρωση Επίδραση άλλων κρυοπροστατευτικών στην τελική συγκράτηση της BSA σε PC:PG:CHOL (9:1:5) DRV λιποσώματα που εγκλωβίζουν BSA Συμπεράσματα Μορφολογική μελέτη λιποσωμάτων Συμπεράσματα των μορφολογικών παρατηρήσεων Μελέτη παρασκευής DRV που εγκλωβίζουν t-pa Παρατηρήσεις Μελέτη σταθερότητας DRV λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν t-pa μετά από FD Σύγκριση με αποτελέσματα από BSA Γενικά συμπεράσματα από τα πειράματα με t-pa - Σύγκριση αποτελεσμάτων με αλβουμίνη ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

9 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ BSA CHOL CMC D/L DMPC DOPC DOPE DPPC DPPG DRV DSPC EPC FD FTS IUV IV ή ΕΦ LCL LUV MEL MLV MVV NMR PCS PE PEG (Bovine serum albumin) αλβουμίνη βόειου ορού (Cholesterol) χοληστερόλη (critical micelle concentration) κρίσιμη μικυλλιακή συγκέντρωση (Drug/lipid) φάρμακο ανά λιπίδιο (dimyristoylglycerophosphatidylcholine) διμυριστοϋλoγλυκεροφωσφατιδυλχολίνη (dioleoylphosphatidylcholine) διολεϋλοφωσφατιδυλoχολίνη (dioleoylphosphatidylethanolamine) διολεϋλφωσφατιδυλαιθανολαμίνη (dipalmitoylglycerophosphatidylcholine) Διπαλμιτοϋλογλυκεροφωσφατιδυλχολίνη (dipalmitoylphosphatidylglycerol) διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλογλυκερόλη (Dehydrated-rehydrated vesicle) Αφυδατωμένοεπανενυδατωμένο σωματίδιο (distearoylglycerophosphatidylcholine) διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλχολίνη (egg L-α-phosphatidylcholine) φωσφατιδυλχολίνη αυγού (Freeze-drying) λυοφιλοποίηση (Freeze-thaw sonication) ψύξη-απόψυξη-υπερήχηση (Intermediate unilamellar vesicle) ενδιάμεσου μεγέθους μονοστοιβαδιακό λιπόσωμα (Intravenous) Ενδοφλέβιος (Long circulating liposome) λιπόσωμα μακράς κυκλοφορίας (Large unilamellar vesicle) μεγάλο μονοστοιβαδιακό λιπόσωμα (Micro-emulsification liposome) λιπόσωμα μικρογαλακτωματοποίησης (Multilamellar vesicle) πολυστοιβαδιακό λιπόσωμα (Multivesicular vesicle) πολυσωματιδιακό λιπόσωμα (nuclear magnetic resonance) πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (photon correlation spectroscopy) Φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων (L-α-Phosphatidylethanolamine) φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (polyethylenglycol) πολυαιθυλενογλυκόλη

10 PG PI (phosphatidylglycerol) φωσφατιδυλογλυκερόλη (L-α-phosphatidylinositol) φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη POPC (1-palmitoyl 2-oleoyl phosphatidylcholine) 1-παλμιτοϋλ 2- ολεϋλοφωσφατιδυλοχολίνη PS (L-a-phosphatidylserine) φωσφατιδυλοσερίνη RES ή ΔΕΣ REV SEM SPLV SUV TBS T m Treh ULV Δεσμός H ΕΠ (Reticuloendothelial system) Δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (Reverse phase evaporation vesicle) αντίστροφης φάσης εξατμιζόμενο σωματίδιο (Scanning electron microscopy) Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (stable plurilamellar vesicle) σταθερό πολυστοιβαδιακό λιπόσωμα (Small unilamellar vesicle) μικρό μονοστοιβαδιακό λιπόσωμα (Tris buffer saline) ρυθμιστικό διάλυμα Tris (Transition temperature) θερμοκρασία μετάπτωσης (Trehalose) τρεαλόζη (Unilamellar vesicle) μονοστοιβαδιακό λιπόσωμα (Hydrogen bond) Δεσμός υδρογόνου Ενδοπεριτοναϊκός

11 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η λυοφιλοποίηση θεωρείται ιδανική μέθοδος για βραχύχρονη ή/ και μακρόχρονη αποθήκευση λιποσωμάτων. Στόχος αυτής της μελέτης ήταν να ευρεθούν οι ποσότητες κρυοπροστατευτικού που μπορεί να αυξήσουν τη συγκράτηση πρωτεϊνικών μορίων σε λιποσώματα τα οποία είναι ασταθή (δηλ. χάνουν μεγάλο τμήμα της εγκλωβισμένης πρωτεΐνης) μετά από λυοφιλοποίηση. Η μέθοδος παρασκευής των λιποσωμάτων που χρησιμοποιήθηκε ήταν η DRV μέθοδος. Είναι η πλέον κατάλληλη στην περίπτωση εγκλωβισμού πρωτεϊνικών μορίων καθώς επιτυγχάνει υψηλά ποσοστά εγκλωβισμού και επίσης χρησιμοποιεί ήπιες συνθήκες οπότε προστατεύεται η τριτοταγής δομή των πρωτεϊνών. Η διαδικασία βασίζεται στην αφυδάτωση μίγματος άδειων SUV (μικρών μονοστοιβαδιακών) λιποσωμάτων παρουσία του διαλύματος πρωτεΐνης που πρόκειται να εγκλωβιστεί. Μετά από ελεγχόμενη επανενυδάτωση της ξηρής κόνης σχηματίζονται τα DRV λιποσώματα. (από τις λέξεις dried-rehydrated vesicles που μεταφράζονται ως αφυδατωμέναεπανενυδατωμένα σωματίδια). Ως υλικά για την παρασκευή των λιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα εξής: Φωσφατιδυλοχολίνη αυγού (egg PC), διστεαροϋλο-γλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC), διπαλμιτοϋλο-γλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DPPC), διμυριστοϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DΜPC), φωσφατιδυλογλυκερόλη (PG) και χοληστερόλη (CHOL). Παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο DRV λιποσώματα διαφόρων λιποσωμικών συστάσεων προκειμένου να μελετηθεί η ικανότητα εγκλωβισμού για κάθε λιποσωμική σύσταση και να επιλεγούν αυτές που είναι πλέον ασταθείς για περαιτέρω μελέτη. Ως πρωτεΐνη μοντέλο χρησιμοποιήθηκε η αλβουμίνη βόειου ορού (BSA). Μελετήθηκε η επίδραση της λυοφιλοποίησης σε διάφορα DRV λιποσώματα παρουσία ή/ και απουσία κρυοπροστατευτικού παράγοντα (τρεαλόζη). Σε κάποιες περιπτώσεις προστέθηκε τρεαλόζη εντός των λιποσωμάτων κατά την αρχική παρασκευή των DRV (στο στάδιο της ανασύστασης). Επίσης, προκειμένου να αποκτήσουμε περαιτέρω πληροφορίες για τα λιποσώματα που μελετούσαμε, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός του μεγέθους των ορισμένων λιποσωμικών σειρών και μορφολογική μελέτη με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. Στη συνέχεια, με βάση τα αρχικά αποτελέσματα με την αλβουμίνη, επιλέχθηκαν ορισμένες λιποσωμικές συστάσεις προκειμένου να μελετηθεί η σταθερότητα λιποσωμάτων που εγκλωβίζουν ένα βιοδραστικό μόριο, το t-pa 1

12 ΠΕΡΙΛΗΨΗ (ιστικού τύπου ενεργοποιητή πλασμινογόνου) σε ξηρή μορφή. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με δείκτη τη διατήρηση της ενεργότητας του μορίου μετά από FD και προσθήκη ή όχι τρεαλόζης. Απώτερος σκοπός αυτής της εργασίας είναι η δυνατότητα παρασκευής σταθερών t-pa- λιποσωμικών μορφών σε ξηρή μορφή προκειμένου να μελετηθεί η δράση τους στη θεραπεία θρομβώσεων του αμφιβληστροειδούς. Τα βασικά συμπεράσματα της μελέτης είναι τα εξής: Σχετικά με αποτελέσματα πειραμάτων με BSA: Τα PC:PG:CHOL DRV λιποσώματα σταθεροποιούνται ικανοποιητικά αν πριν τη λυοφιλοποίηση προσθέσουμε αναλογία treh/lipid=5/1 στη λιποσωμική διασπορά. Η καλύτερη σταθεροποίηση επιτυγχάνεται με παρουσία σακχάρου στο εσωτερικό και εξωτερικό των λιποσωμάτων Πιθανή αλληλεπίδραση λαμβάνει χώρα μεταξύ των PC λιποσωμάτων και της αλβουμίνης, δίνοντας ψευδή υψηλά τελικά ποσοστά συγκράτησης μετά τη λυοφιλοποίηση Σχετικά με αποτελέσματα πειραμάτων με t-pa Τα αποτελούμενα από DSPC DRV λιποσώματα παραμένουν πολύ σταθερά διατηρώντας την ενεργότητα του t-pa μετά τη λυοφιλοποίηση και χωρίς την προσθήκη κρυοπροστατευτικού. Τα ασταθή PC:PG:CHOL και PC λιποσώματα σταθεροποιούνται ικανοποιητικά με προσθήκη τρεαλόζης πριν το FD. 2

13 ABSTRACT Lyophilization is considered to be an ideal technique for both short-term and long-term storage of liposomes. The objective of this study was to investigate the stability of liposomes encapsulating protein molecules and the effect of freeze-drying (FD) on the stability of dehydrated-rehydrated vesicles (DRV) with and without cryoprotective agents (CPA). Τhe liposomes were prepared by the DRV method. This is considered to be the most appropriate in the cases that entrapment of proteins is desired, since it gives liposomes with high encapsulation efficiencies and by using mild conditions it protects the tertiary structure of proteins retaining thus their biological activity. The procedure followed here was based on dehydration of a mixture of empty SUV liposomes and the protein solution (BSA) which is to be entrapped, followed by controlled rehydration of the dry powder. The materials used for the preparation of the liposomes were: Egg-PC (phosphatidylcholine), distearoyloglycerophosphatidylcholine(dspc), (DPPC) dipalmitoylglycerophosphatidylcholine, (DΜPC) dimyristoylglycerophosphatidylcholine, PG (phosphatidylglycerol) and CHOL (cholesterol). Liposomes of various lipid compositions were prepared so that the most unstable liposome compositions are found and available for further study. BSA was used as a protein model in these experiments. Furthermore, the influence of lyophilization for liposomes of various compositions was studied using trehalose as a cryoprotective agent. In some experiments, the dissacharide was added during the reconstitution of DRV. In order to have some more information about the liposomes under investigation, we conducted particle size determination (zetasizer) and morphological study by SEM (scanning electron microscopy. Eventually, based on the primary results with albumin, the stability of liposomes bearing a bioactive protein was studied. The protein used here was t-pa (tissue type plasminogen activator). We investigated the influence of FD on the stability of liposomes with or without the addition of a cryoprotective agent (trehalose) as a function of bioactivity retention. A long-term objective of our studies is to prepare stable after FD liposomaltpa-formulations that may be active for therapy of ocular thrombosis cases. The mail conclusions of this study were: Concerning the results obtained with BSA: 3

14 ABSTRACT PC:PG:CHOL DRV liposomes are adequately stabilized when trehalose in mass ratio treh/pc=5/1 is added in the liposomal dispersion Maximum retention of BSA is achieved when trehalose is added on both sides of liposomal membrane. There is a possible interaction between BSA and PC liposomes, which results in false estimation of BSA retention after FD. Concerning the results obtained with t-pa: DSPC DRV liposomes are very stable after FD and they preserve t-pa activity even in absence of cryoprotectant. Unstable PC:PG:CHOL and PC liposomes can be adequately stabilized by trehalose. 4

15 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

16 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ 1.1 Γενικά Τα λιποσώματα (μικροτεμαχιδιακά λιπιδικά σωματίδια) είναι υπό εκτεταμένη έρευνα για περισσότερα από 20 χρόνια για χρήση ως φορείς βελτιωμένης μεταφοράς για ένα ευρύ φάσμα παραγόντων. Σε αυτούς περιλαμβάνονται χημειοθεραπευτικοί παράγοντες, αντιγόνα, ανοσοτροποποιητές, χηλικές ενώσεις, αιμογλοβίνη και συμπαράγοντες, λιπίδια, και γενετικό υλικό. Στόχος οποιουδήποτε συστήματος διάθεσης φαρμάκου είναι να διαμορφώσει τη φαρμακοκινητική και την ιστική κατανομή του φαρμάκου με ωφέλιμο τρόπο. Στα ποικίλα συστήματα μεταφοράς που έχουν προταθεί όλα αυτά τα χρόνια ανήκουν πολλά συστήματα-φορείς τεμαχιδίων. Για παράδειγμα, μικροσφαίρες, νανοτεμαχίδια, λιποπρωτεΐνες, μικυλλιακά συστήματα και λιποσώματα. Tα λιποσώματα είναι ενυδατωμένες λιπιδικές διασπορές, αποτελούμενες κυρίως από φωσφολιπίδια, τα οποία σχηματίζουν διπλοστoιβάδες συγκροτώντας μακρομοριακές δομές γνωστές ως πολυστoιβαδιακά σωματίδια (MLV). Τα φωσφολιπίδια, όταν διασπαρούν σε θερμοκρασία πάνω από την θερμοκρασία μετάπτωσής τους (Τm) σε πλούσιο υδατικό περιβάλλον, σχηματίζουν αυθόρμητα σωματίδια που εγκλωβίζουν υδατικό πυρήνα. Τα λιποσωμικά συστήματα μεταφοράς φαρμάκων έχουν γνωρίσει ευρεία ανάπτυξη με διάφορα λιποσωμικά φάρμακα να βρίσκονται σε κλινικές δοκιμές ή να κυκλοφορούν ήδη στην αγορά. Είναι γνωστό από πολυάριθμες προκλινικές και κλινικές μελέτες ότι φάρμακα, όπως τα αντικαρκινικά φάρμακα, εγκλωβισμένα σε λιποσώματα επιδεικνύουν μειωμένη τοξικότητα, ενώ διατηρούν ή εμφανίζουν ακόμα κι αυξημένη αποτελεσματικότητα. Αυτό συμβαίνει, εν μέρει, λόγω μεταβολής της φαρμακοκινητικής του φαρμάκου, η οποία οδηγεί σε συσσώρευσή του στις πάσχουσες περιοχές όπως όγκοι- και μειωμένη διάθεση σε άλλους ευαίσθητους ιστούς. Υπό ανάπτυξη βρίσκονται και λιποσωμικά συστήματα προάγοντα τη σύντηξη με κυτταρικές μεμβράνες (fusogenic), τα οποία έχουν την ικανότητα να μεταφέρουν φάρμακα ενδοκυττάρια, γεγονός το οποίο αναμένεται να ενισχύει σημαντικά τη θεραπευτική ικανότητα των εγκλωβισμένων σε αυτά φαρμάκων. Οι εξελίξεις στο 5

17 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σχεδιασμό των λιποσωμάτων οδηγούν σε νέες πιθανές υποψηφιότητες για μεταφορά βιοτεχνολογικών προϊόντων, όπως είναι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια και κλωνοποιημένα γονίδια. Εικόνα 1.1: Αναπαράσταση ενός λιποσώματος σε διατομή (Avanti polar lipids) 1.2 Δομικά στοιχεία Χαρακτηριστικά λιποσωμάτων Λιπίδια Τα λιποσώματα μπορούν να παρασκευαστούν από ποικιλία λιπιδίων και μιγμάτων λιπιδίων. Ένα από τα βασικά είδη μεμβρανικών λιπιδίων περιλαμβάνουν τα φωσφολιπίδια. Αυτά έχουν μια πολική κεφαλή και δύο υδρογονανθρακικές αλυσίδες. Υπάρχουν δύο είδη φωσφολιπιδίων: τα φωσφοδιγλυκερίδια και τα σφιγγολιπίδια, μαζί με τα αντίστοιχα προϊόντα υδρόλυσής τους. Ένα παράδειγμα φωσφολιπιδίου φαίνεται στην εικόνα 1.2. Οι υδρόφοβες ουρές έλκονται μεταξύ τους, ενώ οι υδρόφιλες κεφαλές συνδέονται με το υδατικό μέσο (υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις, υδρόφοβη επίδραση) εξωτερικά και εσωτερικά της λιποσωμικής επιφάνειας. Με τον τρόπο αυτό σχηματίζονται διπλές λιπιδικές στιβάδες οι οποίες σφραγίζουν και δημιουργούν μικρά σωματίδια παρόμοια με τα σωματικά κύτταρα και τα οργανίδιά τους. Οι δυνάμεις που αναπτύσσονται σταθεροποιώντας τα λιποσώματα είναι οι εξής: i. Μεταξύ των λιπιδίων αλληλεπιδράσεις, όπως: υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις πολικές ομάδες και αλληλεπιδράσεις Van der Waals ανάμεσα στις υδρογονανθρακικές αλυσίδες και 6

18 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ii. Τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ λιπιδίων και νερού (υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις, υδρόφοβη επίδραση). Το ακραίο τμήμα των λιπιδίων που ξεκινά με NH 3 είναι η πολική ομάδα (ή πολική κεφαλή). Συνδέεται μέσω της γλυκερόλης με δύο λιπαρές αλυσίδες. Μια από τις αλυσίδες είναι ευθεία λιπαρή αλυσίδα (κορεσμένη), ενώ η άλλη παρουσιάζει κυρτότητα λόγω cis διπλού δεσμού (μη κορεσμένη). Αυτό επηρεάζει το πακετάρισμα και την κίνηση στο πλευρικό επίπεδο της μεμβράνης. Τα πιο κοινά φωσφολιπίδια είναι τα μόρια φωσφατιδυλχολίνης (PC), αμφίφιλα μόρια στα οποία μια γέφυρα γλυκερόλης συνδέει ένα ζεύγος υδρόφοβων υδρογονανθρακικών αλυσίδων με μια υδρόφιλη πολική κεφαλή, τη φωσφοχολίνη. Τα μόρια αυτά είναι αδιάλυτα στο νερό και σε υδατικό μέσο διατάσσονται ευθύγραμμα σε διπλοστοιβάδες με μορφή επίπεδων φύλλων ώστε να μειωθούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της λιπαρής αλυσίδας των υδρογονανθράκων και του υδατικού περιβάλλοντος. Εικόνα 1.2: Αναπαράσταση δομής φωσφολιπιδίου (Wolfe S.L., Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publishing Company, 1993, p 155.) Εκτός από τη φωσφατιδυλχολίνη, λιπιδικές διπλοστιβάδες μπορούν να σχηματιστούν και με σφιγγομυελίνη ή με ανάλογα αλκυλ-αιθέρων της λεκιθίνης. Στη σφιγγομυελίνη, η παρουσία αμιδίου και υδροξυλομάδων προκαλεί τη δημιουργία 7

19 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ δεσμών υδρογόνου οι οποίοι μπορεί να εξηγούν την καλύτερα διατεταγμένη φάση γέλης σε σχέση με τη φωσφατιδυλχολίνη. Στη σφιγγομυελίνη το υδρόφοβο τμήμα αποτελείται από μια μοναδική αλυσίδα λιπαρού οξέος που ενώνεται με αμιδικό δεσμό με το άζωτο της σφιγγοσύνης και η υδρόφιλη περιοχή είναι η ομάδα φωσφοχολίνης. Η λιπόφιλη ουρά είναι γνωστό ως κεραμίδιο. Ένα άλλο ουδέτερο φωσφολιπίδιο που απαντάται σε φυσικές μεμβράνες είναι η φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (PE). Tο λιπίδιο αυτό διαφέρει από το PC στο ότι η χαρακτηριστική ομάδα είναι μικρότερη και επίσης μπορεί να σχηματίσει δεσμούς υδρογόνου με γειτονικά μόρια στη μεμβράνη. Στα αρνητικά φορτισμένα λιπίδια ανήκουν η φωσφατιδυλγλυκερόλη (PG), η φωσφατιδυλινοσιτόλη (PI) και η φωσφατιδυλσερίνη (PS). Εικόνα 1.3: Δομή φωσφολιπιδίου και χαρακτηριστικές ομάδες Οι αλυσίδες των λιπαρών οξέων στα φωσφολιπίδια και τα γλυκολιπίδια συνήθως περιέχουν έναν άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα, συνήθως μεταξύ 14 και 24. Πιο συχνά βρίσκουμε τα λιπαρά οξέα με 16 και 18 άτομα άνθρακα. Τα λιπαρά οξέα μπορεί να είναι ακόρεστα ή κορεσμένα. Το ισόμερες που ανευρίσκεται στα ακόρεστα λιπαρά είναι σχεδόν πάντα στη cis μορφή. Ένα κεκορεσμένο λιπαρό οξύ περιέχει μόνο απλούς δεσμούς ενώ τα ακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν διπλούς δεσμούς στην υδρογονανθρακική αλυσίδα τους. Οι διπλοί δεσμοί των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων χωρίζονται από μια τουλάχιστον μεθυλενική ομάδα. Η διαμόρφωση και ο αριθμός αυτών των διπλών δεσμών καθώς και το μήκος της αλυσίδας επιδρά στο 8

20 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σημείο τήξης και στα χαρακτηριστικά ρευστότητας της μεμβράνης. Τα περισσότερα φωσφολιπίδια φυσικής προέλευσης είμαι «μίγματα» επειδή τα λιπαρά οξέα που συνάπτονται στις θέσεις 1 και 2 του ίδιου μορίου συνήθως είναι διαφορετικά μεταξύ τους. Η αλυσίδα του λιπαρού οξέως στην εσωτερική θέση είναι ακόρεστη ενώ της εξωτερικής θέσης είναι κεκορεσμένη και μεγαλύτερου μήκους όσο αφορά τον αριθμό των ατόμων άνθρακα. Πίνακας 1.1 Κυτταρικά λιπαρά οξέα Χημική δομή Ονομασία Κορεσμένο λιπαρό οξύ CH 3 (CH 2 ) 10 COOH CH 3 (CH 2 ) 12 COOH CH 3 (CH 2 ) 14 COOH CH 3 (CH 2 ) 16 COOH CH 3 (CH 2 ) 18 COOH CH 3 (CH 2 ) 22 COOH Λαουρικό Μυριστικό Παλμιτικό Στεαρικό Αραχιδικό Λινοσερικό Ακόρεστο λιπαρό οξύ CH 3 (CH 2 ) 5 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH CH 3 (CH 2 ) 7 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH CH 3 (CH 2 ) 4 CH=CHCH 2 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH CH 3 (CH 2 ) 4 (CH=CHCH 2 ) 3 CH=CH(CH 2 ) 3 COOH CH 3 CH 2 CH=CHCH 2 CH=CHCH 2 CH=CH(CH 2 ) 7 COOH Παλμιτολεϊκό Ολεϊκό Λινολεϊκό Αραχιδονικό Λινολενικό 9

21 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης (Phase transition -Tm) Oι μεμβράνες από φωσφατιδυλχολίνες υφίστανται σε διαφορετικές φάσεις όταν ευρίσκονται σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Η μετάβαση από τη μία φάση στην άλλη μπορεί να διαπιστωθεί με φυσικές μεθόδους κατά την αύξηση της θερμοκρασίας. Η πλέον διαδεδομένη τεχνική για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας μετάπτωσης είναι η θερμιδομετρία ( Huang C. et al., 1999). Οι πιο συχνά παρατηρούμενες αλλαγές φάσης συμβαίνουν στην υψηλότερη θερμοκρασία, στην οποία η μεμβράνη αποδιατάσσεται από την οργανωμένη μορφή της γέλης (gel) ή του στερεού (solid) και μεταβαίνει σε υγρή - κρυσταλλική δομή κατά την οποία οι βαθμοί ελευθερίας των μορίων είναι περισσότεροι. Γενικά αύξηση του μήκους της λιπαρής αλυσίδας ή αύξηση του κορεσμού της αλυσίδας αυξάνει την Tm. Η θερμοκρασία μετάπτωσης για τα φωσφολιπίδια που προέρχονται από το κρόκο αυγού ποικίλλει μεταξύ -15 C ( υψηλό βαθμό ακορεστότητας) και πάνω από 50 C για πλήρη κεκορεσμένα φωσφολιπίδια όπως είναι η διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC). Εικόνα 1.4: Σχέση ανάμεσα στη φάση της μεμβράνης και τη θερμοκρασία 10

22 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χοληστερόλη και o ρόλος της Η χοληστερόλη αποτελεί βασικό συστατικό των βιολογικών μεμβρανών επιτελώντας σημαντικές λειτουργίες. Στα λιποσώματα που χρησιμοποιούνται ως μοντέλα που προσομοιάζουν κυτταρικές μεμβράνες συνήθως προστίθεται χοληστερόλη για διάφορους λόγους. Αρχικά, είναι γνωστό ότι προσδίδει σταθερότητα στις διπλοστοιβάδες των λιποσωμάτων, ιδίως όταν πρόκειται για ασταθή λιποσώματα (PC). Συγκεκριμένα, η χοληστερόλη ενσωματώνεται σε φωσφολιπιδικές μεμβράνες επιφέροντας αλλαγές στις ιδιότητές τους π.χ. στη ρευστότητα και διαπερατότητά τους. Αυτό οφείλεται στη μεταβολή της κάμψης της αλυσίδας του φωσφολιπιδίου με αποτέλεσμα να σχηματίζονται πιο συμπαγείς μεμβράνες σε σύγκριση με λιποσώματα των οποίων οι μεμβράνες δεν περιέχουν χοληστερόλη. Άλλοι λόγοι προσθήκης χοληστερόλης σε λιποσώματα μπορεί να είναι οι εξής: Η παρουσία χοληστερόλης στη μεμβράνη των λιποσωμάτων οδηγεί σε σημαντική αύξηση (ή μείωση) της σειράς προσανατολισμού των υδρογονανθρακικών αλυσίδων πάνω (ή κάτω) από τη θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης και μείωση της γωνίας κλίσης της φωσφολιπιδικής αλυσίδας στη ρευστή φάση. Η χοληστερόλη μεταβάλλει τη θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης των λιποσωμικών μεμβρανών, ανάλογα με την κατάσταση του λιπιδίου. Συγκεκριμένα, όταν το λιπίδιο βρίσκεται σε θερμοκρασίες υψηλότερες από την θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης, η χοληστερόλη συμβάλλει στη μείωση της ελευθερίας των ανθρακικών αλυσίδων και τη συμπύκνωση τελικά της μεμβράνης και μείωση της ρευστότητάς της. Αντίθετα, χαμηλότερα από την θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης, η απόσταση μεταξύ των φωσφολιπιδίων αυξάνεται, η οργάνωση των πολικών κεφαλών εξασθενεί και η ρευστότητα της μεμβράνης αυξάνει. 11

23 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα 1.5: Χημική δομή της χοληστερόλης, όπου φαίνεται η πολική και η μη πολική περιοχή 1.3 Ταξινόμηση των λιποσωμάτων Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος MLVs Multilamellar vesicles (μεγάλα πολυστοιβαδιακά σωματίδια) Τα MLV λιποσώματα αποτελούνται από έναν μεγάλο αριθμό παράλληλων, ομόκεντρων φωσφολιπιδικών διπλοστοιβάδων. Πρόκειται για τον απλούστερο τύπο λιποσωμάτων όσον αφορά την παρασκευή τους. Η κυριότερη μέθοδος παρασκευής MLV λιποσωμάτων είναι η μέθοδος του Bangham (solvent evaporation method) (Bangham A.D. et al., 1965). Φάρμακα, καθώς και άλλες διαλυτές ενώσεις μπορούν να εγκλωβιστούν στα υδατικά μεσοδιαστήματα ανάμεσα στις μεμβράνες, ενώ τα υδρόφοβα τμήματά τους ή υδρόφοβα φάρμακα μπορούν να διαλυτοποιηθούν στο εσωτερικό της διπλοστοιβάδας. Τα λιποσώματα αυτά έχουν μεγάλες και ετερογενείς διαμέτρους (1-10μm), χαμηλή ικανότητα εγκλωβισμού όγκου ανά μόριο λιπιδίου και παρουσιάζουν πολλαπλά εσωτερικά διαμερίσματα. Η απόσταση μεταξύ των διαδοχικών διπλοστοιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία των ελκτικών δυνάμεων van der Waals, ηλεκτροστατικών και άλλων δυνάμεων άπωσης. Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν τη χρήση τους ως φορείς φαρμάκων και μεμβρανικά μοντέλα αρκετά πολύπλοκη. 12

24 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα 1.6: Σχηματική απεικόνιση πολυστοιβαδιακού λιποσώματος σε διατομή και μεγέθυνση των περιοχών του. LUVs & ΙUVs- Large unilamellar vesicles & Intermediate unilamellar vesicles (Μεγάλα & μεσαίου μεγέθους μονοστοιβαδιακά σωματίδια) Τα λιποσώματα αυτά έχουν διάμετρο της τάξης των 1000nm και είναι μονοστοιβαδιακά. Ανάλογα με το επιθυμητό μέγεθος, τα LUVs και IUVs μπορούν να παρασκευασθούν με διάφορες μεθόδους, όπως είναι η απομάκρυνση απορρυπαντικού, η μηχανική διασπορά και τα διφασικά συστήματα. Τα λιποσώματα αυτά θεωρούνται κατάλληλα για εγκλωβισμό υδατοδιαλυτών υλικών, αν και η παρουσία μιας μόνο λιπιδικής μεμβράνης έχει ως συνέπεια μικρότερη μηχανική σταθερότητα και συγκράτηση της ουσίας σε σχέση με τα MLVs. Ωστόσο, αυτός ο τύπος λιποσωμάτων κρίνεται αρκετά κατάλληλος για την ενεργή φόρτωση ιονιζόμενων μορίων. SUVs - Small unilamellar vesicles (Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) Τα SUV λιποσώματα αποτελούνται μόνο από μια διπλοστοιβάδα και έχουν διάμετρο nm. Διαθέτουν το μικρότερο δυνατό μέγεθος στο οποίο ένα φωσφολιπίδιο μπορεί να σχηματίσει λιποσωμική μορφή. Η δυνατότητα αυτή εξαρτάται από την ιονική ισχύ του διαλύματος φωσφολιπιδίου και από τη λιπιδική σύσταση των μεμβρανών. Πρόκειται για θερμοδυναμικά ασταθή λιποσώματα που είναι επιρρεπή σε συσσωμάτωση και σύντηξη, ιδίως κάτω από τη θερμοκρασία 13

25 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ μετάπτωσης φάσης. Οι μέθοδοι παρασκευής SUV λιποσωμάτων είναι (i) η κατεργασία με υπέρηχους και (ii) η μέθοδος διαδοχικών κύκλων ψύξης - απόψυξης (freeze - thaw). Εικόνα 1.7: Διατομή ενός μονοστοιβαδιακού λιποσώματος. Οι υδατοδιαλυτές ενώσεις μπορούν να εγκλωβιστούν στον υδατικό πυρήνα (περιοχή 1) ή να συνδεθούν στην εξωτερική επιφάνεια (περιοχή 3). Τα υδροφοβικά μόρια μπορούν να εγκλωβιστούν στη διπλοστοιβάδα (περιοχή 2). Στα φθορίζοντα λιποσώματα, οι φθορίζουσες ενώσεις είναι εγκλωβισμένες στο εσωτερικό και συνδεδεμένες στην επιφάνεια του λιποσώματος. (σήμανση F) Με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές Το λιποσωμικό σύστημα μεταφοράς φαρμάκων διαθέτει ένα μεγάλο πλεονέκτημα έναντι άλλων κολλοειδών συστημάτων μεταφοράς: Επιτρέπει σχεδόν άπειρες πιθανότητες μεταβολής των δομικών και φυσικοχημικών χαρακτηριστικών. Αυτό το χαρακτηριστικό της ευελιξίας επιτρέπει στους επιστήμονες να τροποποιούν την in vivo συμπεριφορά των λιποσωμάτων και να σχεδιάζουν τις διάφορες λιποσωμικές μορφές ανάλογα με τις θεραπευτικές ανάγκες. Με βάση τη σύνθεση και την επιθυμητή in vivo εφαρμογή, τα λιποσώματα διακρίνονται σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες (εικ.1.8) 14

26 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα 1.8: Σχηματική απεικόνιση διαφορετικών τύπων λιποσωμάτων: Συμβατικά (Conventional) λιποσώματα, Στερεοχημικά σταθεροποιημένα (Stealth) λιποσώματα, Στοχευμένα (Targeted), Κατιονικά (Cationic) λιποσώματα. Συμβατικά λιποσώματα (Conventional liposomes): Αυτά μπορούν να οριστούν ως λιποσώματα που αποτελούνται μόνο από φωσφολιπίδια (ουδέτερα ή/και αρνητικά φορτισμένα) ή/και χοληστερόλη. Πρόκειται για την πλέον χρησιμοποιούμενη κατηγορία λιποσωμάτων στη μεταφορά φαρμάκων. Διαφέρουν ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, όπως το μέγεθος, τη λιπιδική σύσταση, το επιφανειακό φορτίο και τον αριθμό και ρευστότητα των λιπιδικών διπλοστoιβάδων. Τα συμβατικά λιποσώματα χαρακτηρίζονται από σχετικά μικρό χρόνο κυκλοφορίας στο αίμα. Όταν χορηγούνται in vivo (συχνά ενδοφλέβια) έχουν την τάση να συσσωρεύονται γρήγορα στα φαγοκύτταρα του μονοπυρηνικού συστήματος φαγοκυττάρων, γνωστό επίσης και ως δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (RES). Tα κύρια όργανα συσσώρευσης είναι το ήπαρ και η σπλήνα. Το γεγονός αυτό έχει αποτελέσει στόχο για διάθεση φαρμάκων μέσω λιποσωμάτων σε μολυσμένα μακροφάγα. Επιπλέον, τα συμβατικά λιποσώματα έχουν χρησιμοποιηθεί για μεταφορά αντιγόνων. Λιποσωμικά εμβόλια έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά κατά ιικών, βακτηριακών και παρασιτικών μολύνσεων καθώς επίσης και εναντίον όγκων. 15

27 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας (Long circulating liposomes, stealth, or sterically stabilized): Η ανάπτυξή τους αποτέλεσε ορόσημο στην έρευνα των λιποσωμικών συστημάτων μεταφοράς και αναζωπύρωσε το ενδιαφέρον γύρω από την έρευνα περί λιποσωμάτων. Στην πραγματικότητα, τα λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας άνοιξαν νέους δρόμους σε θεραπευτικές δυνατότητες που μέχρι τότε θεωρούνταν ανέφικτες για τα συμβατικά λιποσώματα. Το πιο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό τους είναι ότι έχουν την ικανότητα να βγαίνουν εκτός κυκλοφορίας σε περιοχές όπου η διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος είναι αυξημένη. Αυτό συμπίπτει με το γεγονός ότι οι περιοχές αυξημένης τριχοειδικής διαπερατότητας περιλαμβάνουν παθολογικές περιοχές, όπως στέρεους όγκους και περιοχές μολύνσεως και φλεγμονής. Προς το παρόν, ο πιο δημοφιλής τρόπος παραγωγής τέτοιων λιποσωμάτων είναι η ομοιοπολική σύνδεση του πολυμερούς πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) στην εξωτερική επιφάνεια. Αυτά τα λιποσώματα λέγονται επίσης stealth ή στερεοχημικώς σταθεροποιημένα. Ο πρώτος όρος αναφέρεται στην ικανότητά τους να διαφεύγουν των μακροφάγων και ο δεύτερος στο μηχανισμό στερεοχημικής σταθεροποίησής τους, που είναι υπεύθυνος για την αύξηση του χρόνου κυκλοφορίας. Το τελευταίο οφείλεται σε φραγμό που δημιουργείται και αποτρέπει τις αλληλεπιδράσεις με μόρια και κυτταρικά συστατικά του βιολογικού περιβάλλοντος, κυρίως πρωτεΐνες. Ανοσολιποσώματα (Immunoliposomes): Διαθέτουν ειδικά αντισώματα ή κλάσματα αντισωμάτων (Fab ή αντισώματα μονής αλυσίδας) στην επιφάνειά τους προκειμένου να ενισχύσουν τη στοχευμένη πρόσδεση. Αν και έχουν εξεταστεί για πληθώρα θεραπευτικών εφαρμογών, η εστίαση έχει γίνει στη μεταφορά αντικαρκινικών παραγόντων. Όπως και άλλα σωματίδια στην κυκλοφορία του αίματος, είναι δύσκολο στα ανοσολιποσώματα να εγκαταλείψουν την κυκλοφορία σε άλλα διαμερίσματα πλην του ήπατος και του σπλήνα. Γι αυτό, προκειμένου να εξασφαλιστεί προσιτότητα των υποδοχέων, επιχειρείται τοπική χορήγηση των λιποσωμάτων στις σωματικές κοιλότητες. 16

28 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικ. 1.9:.Σχηματική απεικόνιση ενός στερεοχημικά σταθεροποιημένου λιποσώματος. Τα stealth λιποσώματα εγκλωβίζουν το φάρμακο (1) σε μια φωσφολιπιδική διπλοστοιβάδα (2).Η PEG επικάλυψη (3) επιτρέπει στα λιποσώματα να αποφεύγουν το ανοσοποιητικό σύστημα αυξάνοντας το χρόνο ημιζωής του φαρμάκου στο σώμα. Κατιονικά λιποσώματα (Cationic liposomes): Αυτά εκπροσωπούν σχετικά νέα μέλη της οικογένειας των λιποσωμάτων. Βρίσκονται στην πρώτη γραμμή ως συστήματα μεταφοράς γενετικού υλικού. Τα κατιονικά λιπιδικά συστατικά τους αλληλεπιδρούν με και εξουδετερώνουν- το αρνητικά φορτισμένο DNA, συμπυκνώνοντας έτσι το DNA σε μια πιο συμπαγή δομή. Τα σύμπλοκα λιπιδίου-dna παρέχουν προστασία και επάγουν την κυτταρική εσωτερίκευση και έκφραση του συμπυκνωμένου πλασμιδίου. Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenic liposomes): Τα λιποσώματα αυτά μπορούν να διευκολύνουν την ενδοκυτταρική μεταφορά εγκλωβισμένων φαρμάκων μέσω σύντηξης με τη μεμβράνη των κυττάρων στόχων. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι παρασκευής τους μεταξύ των οποίων είναι η χρήση λιπιδίων (όπως το DOPE) που είναι ικανά να προάγουν την αποσταθεροποίηση της διπλοστοιβάδας και να προκαλούν φαινόμενα σύντηξης. Επίσης, πρωτεΐνες που επάγουν τη σύντηξη μπορούν να ενσωματωθούν σε λιποσώματα. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η ενίσχυση της ικανότητας 17

29 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σύντηξης των λιποσωμάτων μπορεί να εφαρμοστεί προκειμένου να ενισχυθεί η αποτελεσματικότητα των λιποσωμικών συστημάτων μεταφοράς γενετικού υλικού. Πίνακας 1.2 Κύριες εφαρμογές των κύριων τύπων λιποσωμάτων ΤΥΠΟΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΚΥΡΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΜΑΚΡΟΦΑΓΩΝ ΣΥΜΒΑΤΙΚΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΤΟΠΙΚΗ ΕΝΑΠΟΘΕΣΗ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΜΑΚΡΑΣ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΣΕ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΜΙΚΡΟΔΕΞΑΜΕΝΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑΣ ΑΝΟΣΟΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΕΙΔΙΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ ΚΑΤΙΟΝΙΚΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ Γενικά, ο μέγεθος, η ακαμψία των διπλοστοιβάδων, το φορτίο και οι τροποποιήσεις της επιφάνειας της διπλοστοιβάδας αποτελούν παραμέτρους που καθορίζουν την τύχη των λιποσωμάτων κατά την αποθήκευση και in vivo Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Γενικά Στην πράξη, οι περισσότερες μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων οδηγούν σε αρκετά ετερογενείς πληθυσμούς σωματιδίων με ευρεία κατανομή μεγέθους. Δεδομένου ότι ο διαθέσιμος προς εγκλωβισμό, όγκος λιποσωμάτων ποικίλλει ανάλογα με την κατανομή μεγέθους, είναι πολύ σημαντικό οι λιποσωμικές παρασκευές να χαρακτηρίζονται ως προς το μέγεθος, ώστε να προβλέπεται με 18

30 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ σχετική ακρίβεια η in vitro και in vivo συμπεριφορά τους. Ακόμη και λιποσώματα με το ίδιο μέγεθος και τον ίδιο αριθμό στοιβάδων είναι δυνατό να διαφέρουν στην εσωτερική κατανομή της υδατικής φάσης και στην ποσότητα λιπιδίου που συμμετέχει στη δομή των σωματιδίων. Η επιλογή του τύπου λιποσωμάτων που θα χρησιμοποιηθεί για συγκεκριμένη εφαρμογή εξαρτάται εν μέρει από το είδος της ουσίας που πρόκειται να εγκλωβιστεί αλλά και από την επιθυμητή συμπεριφορά του λιποσώματος μετά την παρασκευή του. Εικόνα 1.10: Συνήθεις μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων. MLV (πολυστοιβαδιακά), MVV (πολυκυστιαδιακά), REV (αντίστροφης φάσης), SPLV (σταθερά πολυστοιβαδιακά), SUV (μικρά μονοστοιβαδιακά), ULV (μονοστοιβαδιακά) Μηχανική διασπορά Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηματισμό λεπτού υμενίου (film) κατά την εξάτμιση διαλυμάτων λιπιδίων σε οργανικό διαλύτη ή μίγμα διαλυτών. Για να απομακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χημική αποικοδόμηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο σχηματίζεται το λεπτό υμένιο, εκτίθεται σε ρεύμα αζώτου. Η ενυδάτωση 19

31 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ (hydration) του υμενίου που ακολουθεί πραγματοποιείται με νερό ή με ρυθμιστικό διάλυμα ή με διάλυμα της προς εγκλωβισμό δραστικής ουσίας. Το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτμισης των διαλυτών, πραγματοποιούνται σε θερμοκρασίες υψηλότερες της θερμοκρασίας μετάβασης φάσης του χρησιμοποιούμενου λιπιδίου. Προς τούτο το διάλυμα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερμανθεί σε αυτή τη θερμοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. Με μηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υμένιο αποκολλάται από τα τοιχώματά της, οπότε λαμβάνεται μία θολερή διασπορά με πολυστοιβαδιακά λιποσώματα μεγάλου μεγέθους MLV. Η μείωση του μεγέθους των MLV λιποσωμάτων και η δημιουργία ομογενούς σε αναφορά με το μέγεθος πληθυσμού, υλοποιείται με τη χρήση κυρίως λουτρού υπερήχων (bath sonicator), αλλά και διαφόρων άλλων τεχνικών, όπως εξώθηση μέσω φίλτρων ή μεμβρανών (extrusion), μικρoγαλακτωματοποίηση (microemulcification) κ.ά. Στο τελευταίο στάδιο πραγματοποιείται η διαδικασία του "annealing", κατά την οποία τα λιποσώματα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο και πάντα σε θερμοκρασία υψηλότερη αυτής της μετάπτωσης του λιπιδίου, όπου παραμένουν για μία περίπου ώρα ώστε να ολοκληρωθεί και να ομαλοποιηθεί η μορφοποίηση της δομής τους. Η διάμετρος των λιποσωμάτων που λαμβάνονται με τη μέθοδο αυτή κυμαίνεται από μερικά έως 5-6 μm Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator) Τα λιποσώματα (SUV) που λαμβάνονται με τη χρήση ακίδας υπερήχων έχουν διάμετρο της τάξης μερικών δεκάδων nm. Το σημείο εκκίνησης είναι συνήθως μία διασπορά πολυστιβαδιακών MLV λιποσωμάτων. Δεδομένου ότι αυτά τα σωματίδια θα σπάσουν ολοκληρωτικά στην πορεία, δεν είναι απαραίτητο να ληφθεί προσοχή σχετικά με το αρχικό μέγεθος των MLV λιποσωμάτων, το ποσοστό εγκλωβισμού και το πάχος του λιπιδικού υμενίου. Η ακίδα υπερήχων προτιμάται για διασπορές που απαιτούν υψηλή ενέργεια σε μικρό όγκο (π.χ. υψηλές συγκεντρώσεις λιπιδίου, ή παχύρρευστη υδατική φάση), ενώ το λουτρό υπερήχων είναι περισσότερο κατάλληλο για μεγάλους όγκους διαλυμένου 20

32 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ λιπιδίου και για περιπτώσεις που δεν είναι απαραίτητη η απόδοση οριακού μεγέθους σωματιδίων. Την υπερήχηση με ακίδα ακολουθεί φυγοκέντρηση στις στροφές για πέντε λεπτά προκειμένου να απομακρυνθούν αδιάσπαρτα κομμάτια λιπιδίου και MLV λιποσώματα ή συσσωματώματά τους καθώς και ρινίσματα τιτανίου που αποδεσμεύονται λόγω της μεγάλης δύναμη τριβής που αναπτύσσεται μεταξύ της διασποράς και της ακίδας Εξώθηση μέσω φίλτρων Στα λιποσώματα αυτού του τύπου η μείωση μεγέθους επιτυγχάνεται με τη χρήση φίλτρων των οποίων οι πόροι έχουν συγκεκριμένη διάμετρο. Η μέθοδος παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι παρέχει επαναλήψιμα αποτελέσματα, ενώ το λιπίδιο δεν υφίσταται κάποια σημαντική μεταβολή. Επιπλέον μπορεί να διπλασιαστεί το ποσοστό εγκλωβισμού διαφόρων ουσιών. Η εξώθηση μέσω φίλτρων διαμέτρου 0,2 μm οδηγεί σε εξαιρετικά ομοιογενείς πληθυσμούς λιποσωμάτων διαμέτρου 270 nm (Olson F.et al., 1979) Χρήση Μικρογαλακτωματοποιητή Για την παρασκευή λιποσωμάτων μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν γαλακτωματοποιητές (Mayhew E. et al., 1984). Οι μικρογαλακτωματοποιητές είναι συσκευές που αντλούν το ρευστό, στην προκειμένη περίπτωση τα λιποσώματα, με πολύ υψηλές πιέσεις μέχρι και (10000 p.s.i., bar) μέσα από φίλτρα διαμέτρου 5μm. Στη συνέχεια διαπερνούν το μίγμα χωρισμένο σε δύο τμήματα με πολύ μεγάλη ταχύτητα, από μικρά κανάλια που αναμιγνύουν τα δύο ρεύματα υπό ορθή γωνία παρέχοντας με τον τρόπο αυτό πολύ μεγάλη ενέργεια. Τα λιπίδια εισάγονται στο μικρογαλακτωματοποιητή με τη μορφή εναιωρήματος μεγάλων λιποσωμάτων MLV ή με τη μορφή μη ενυδατωμένου λιπιδίου εντός υδατικού μέσου. Με την τεχνική αυτή παρασκευάζονται μικρά MLV λιποσώματα με καλή κατανομή μεγέθους nm (micro emulsification liposomes, MEL). Οι γαλακτωματοποιητές μπορούν να χρησιμοποιηθούν και στη βιομηχανική παραγωγή για την παρασκευή μεγάλων ποσοτήτων λιποσωμάτων (Vemuri S. et al., 1989). 21

33 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εξώθηση σε θάλαμο εφαρμογής μεγάλης πίεσης Η τεχνική περιλαμβάνει την εισαγωγή προσχηματισμένων μεγάλων λιποσωμάτων σε θάλαμο (French Press) υπό μεγάλη πίεση ( p.s.i.), και αποδίδει ομοιογενείς μονο- ή ολιγο- στιβαδιακές λιποσωμικές διασπορές ενδιάμεσων μεγεθών (30 80 nm σε διάμετρο ανάλογα με την εφαρμοζόμενη πίεση) (Barenholtz Y. et al., 1979). Τα λιποσώματα που λαμβάνονται με τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιούνται για τη μεταφορά ευαίσθητων μακρομορίων και είναι πιο σταθερά από τα κατεργασμένα με υπέρηχους λιποσώματα Ένεση λιπιδίων Περιλαμβάνει μεθόδους κατάλληλες για την παρασκευή SUV και LUV λιποσωμάτων. Διάλυμα λιπιδίου σε οργανικό διαλύτη ενίεται ταχέως σε περίσσεια υδατικού μέσου που περιέχει την ουσία που πρόκειται να εγκλωβισθεί στα λιποσώματα. Στη διεπιφάνεια μεταξύ νερού και οργανικού διαλύτη, τα φωσφολιπίδια αυτοδιατάσσονται σε λιποσώματα μικρής διαμέτρου. Τα μεγάλα συγκριτικά πλεονεκτήματα των μεθόδων είναι η εύκολη εφαρμογή της και ο περιορισμένος κίνδυνος αποικοδόμησης των λιπιδίων. Μειονέκτημα των μεθόδων είναι το χαμηλό ποσοστό εγκλωβισμού για υδατοδιαλυτές ουσίες. Οι πιο συχνά εφαρμοζόμενες μεθοδολογίες παρασκευής τέτοιων λιποσωμικών διασπορών περιγράφονται παρακάτω και αφορούν σε περιπτώσεις κατά τις οποίες: I. ο οργανικός διαλύτης είναι αναμίξιμος με την υδατική φάση, II. ο οργανικός διαλύτης είναι μη αναμίξιμος με την υδατική φάση, III. ο οργανικός διαλύτης είναι σε περίσσεια και μη αναμίξιμος με την υδατική φάση. Έγχυση Αιθανόλης Κατά την τεχνική αυτή το ή τα λιπίδια διαλύονται σε αιθανόλη και στη συνέχεια τοποθετούνται σε περίσσεια υδατικού μέσου ή κάποιου άλατος με χρήση σύριγγας. Τα μόρια του λιπιδίου έρχονται σε επαφή με τα μόρια του νερού και με τον τρόπο αυτό σχηματίζονται αστραπιαία λιποσώματα μικρής διαμέτρου (25 nm). Το ποσοστό εγκλωβισμού που επιτυγχάνεται με τη μέθοδο αυτή είναι εξαιρετικά χαμηλό 22

34 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ εάν οι προς εγκλωβισμό ουσίες είναι διαλυτές στην υδατική φάση. Επιπλέον η περιορισμένη διαλυτότητα λιπιδίων στην αιθανόλη (40 mm για PC), ο μικρός όγκος λιπιδίων (διαλυμένων σε αιθανόλη) που μπορεί να εισαχθεί στο υδατικό διάλυμα καθώς και η δυσκολία απομάκρυνσης της αιθανόλης από τις λιποσωμικές μεμβράνες κυρίως με διαπίδυση (dialysis), συμπεριλαμβάνονται στα μειονεκτήματα της μεθόδου. (Batzri et al., 1973). Λιποσώματα με αυτή τη μέθοδο παρασκευάσθηκαν για πρώτη φορά από τους Szoka και Papahadjopoulos το Τα λιποσώματα αυτά ονομάζονται αντίστροφης φάσης εξατμιζόμενα σωματίδια (reverse phase evaporation vesicles, REV). Κατά τη μέθοδο αυτή χρησιμοποιείται γαλάκτωμα νερού σε έλαιο (αναστροφή του τυπικού "έλαιο σε νερό" γαλακτώματος) και η απομάκρυνση του διαλύτη από το γαλάκτωμα γίνεται με εξάτμιση. Έγχυση Αιθέρα Η τεχνική αυτή παρουσιάζει αρκετές διαφορές συγκριτικά με την ένεση αιθανόλης (Deamer D.W. et al., 1976). Περιλαμβάνει την ένεση μη αναμίξιμου με το νερό οργανικού διαλύματος με αργούς ρυθμούς εντός υδατικής φάσης με χρήση βελόνας μικρής εσωτερικής διαμέτρου. Η θερμοκρασία έγχυσης πρέπει να είναι τέτοια ώστε να επιτρέπει την εξάτμιση του οργανικού διαλύτη κατά τη διαδικασία προσθήκης του. Λόγω άμεσης εξάτμισης του διαλύτη αυξάνει η βαθμίδωση του λόγου νερού / αιθέρα στη διεπιφάνεια της λιπιδικής μονοστοιβάδας και των δύο μέσων. Η αναδίπλωση της σχηματιζόμενης διπλοστοιβάδας οδηγεί στο σχηματισμό μεγάλων λιποσωμάτων (LUV). Η μέθοδος χρησιμοποιείται αποτελεσματικά στην περίπτωση ευπαθών λιπιδίων, καθώς μειώνει σημαντικά την πιθανότητα οξείδωσής τους, με την προϋπόθεση ότι ο αιθέρας έχει επαναποσταχθεί προσεκτικά για την απομάκρυνση τυχόν υπεροξειδίων που προκύπτουν από την αυθόρμητη οξείδωσή του. Επιπλέον ο ρυθμός απομάκρυνσης του διαλύτη είναι ίσος με το ρυθμό εισαγωγής, οπότε δεν υπάρχει περιορισμός στην τελική συγκέντρωση λιποσωμάτων και η όλη διαδικασία μπορεί να διαρκεί για μεγάλο χρονικό διάστημα καταλήγοντας σε λιποσώματα με υψηλό ποσοστό ενκαψυλίωσης. 23

35 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Νερό σε οργανική φάση Περιλαμβάνει το σχηματισμό λιποσωμάτων σε δύο φάσεις. Πρώτα παρασκευάζεται η εσωτερική μονοστοιβάδα και έπειτα η δεύτερη εξωτερική. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της τεχνικής, κατά βάση όμως παράγεται ένα γαλάκτωμα νερού σε έλαιο με την εισαγωγή μικρής ποσότητας υδατικού μέσου (που περιέχει την προς εγκλωβισμό ουσία) σε μεγάλο όγκο μη αναμίξιμου διαλύματος λιπιδίων, συνοδευόμενη από μηχανική ανάδευση ώστε η υδατική φάση να διασπαστεί σε μικροσκοπικά σταγονίδια ύδατος. Τα σταγονίδια αυτά σταθεροποιούνται από την παρουσία της λιπιδικής διπλοστοιβάδας στη διεπιφάνεια των δύο φάσεων. Το μέγεθος των σταγονιδίων εξαρτάται από την ένταση της μηχανικής ενέργειας κατά την παρασκευή του γαλακτώματος και από το ποσό του λιπιδίου σχετικά με τον όγκο της υδατικής φάσης αφού κάθε σταγονίδιο απαιτεί μια ολοκληρωμένη μονοστοιβάδα φωσφολιπιδίου που να καλύπτει πλήρως την επιφάνειά της ώστε να παρεμποδισθεί η συσσωμάτωση με άλλες σταγόνες. Το υδατικό τμήμα που περιβάλλεται από αυτή τη διπλοστοιβάδα θα αποτελέσει τον τελικό πυρήνα του τελικού λιποσώματος. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι προετοιμασίας των σταγονιδίων νερού σε έλαιο πριν την προσθήκη της εξωτερικής κάλυψης, οι οποίοι υπό κατάλληλες συνθήκες παράγουν διαφορετικά μεγέθη σταγονιδίων. Με την επίδραση ακίδας υπερήχων λαμβάνονται σταγονίδια διαμέτρου 100 nm Δημιουργία μικτών μικκυλίων με απορρυπαντικά Κατά την ανάμιξη λιπιδίων με απορρυπαντικά ιονικά αμφοτερικά ή μη ιονικά σε ρυθμιστικό διάλυμα, σχηματίζονται αυθόρμητα μεικτά μικκύλια (micelles). Το είδος και η κατανομή των πολικών και λιπόφιλων ομάδων του απορρυπαντικού μέσα στο μικκύλιο καθορίζουν το μέγεθος και το σχήμα του. Η συγκέντρωση απορρυπαντικού στο νερό κατά την οποία αρχίζουν να σχηματίζονται μικκύλια είναι γνωστή ως κρίσιμη συγκέντρωση μικκυλίων (critical micelle concentration, CMC). Σε συγκεντρώσεις μικρότερες της κρίσιμης τα μόρια του απορρυπαντικού απαντούν ελεύθερα στο διάλυμα, ενώ σε μεγαλύτερες σχηματίζουν ολοένα μεγαλύτερες ποσότητες μικκυλίων. 24

36 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Τα απορρυπαντικά διακρίνονται σύμφωνα με την κατανομή της πολικής και υδρόφοβης περιοχής που διαθέτουν σε πεπλατυσμένα (αλκυλογλυκοσίδια που δίνουν σφαιρικά μικκύλια) και επιμήκη (χολικά άλατα που σχηματίζουν δισκοειδή μικκύλια). Η απομάκρυνση του απορρυπαντικού από τα μικκύλια γίνεται με διαπίδυση ή χρωματογραφία στήλης και έτσι σχηματίζονται λιποσώματα που εγκλωβίζουν ότι υπάρχει στην υδατική φάση. Στο στάδιο αυτό είναι εύκολο να απομακρυνθούν και μικρά μόρια, γι` αυτό τα ποσοστά εγκλωβισμού με αυτή την τεχνική δεν είναι αξιόλογα. Είναι όμως αποτελεσματική μέθοδος για το σχηματισμό λιποσωμάτων που φέρουν λιπόφιλα μόρια, αφού αυτά μπορούν να εισαχθούν στα μικκύλια παρουσία ήπιων απορρυπαντικών με ποσοστό εγκλωβισμού ακόμη και 100% Άλλες ειδικές μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Αφυδατωμένα Ενυδατωμένα Σωματίδια (DRV) Η μέθοδος αυτή έχει αναπτυχθεί από τους C. Kirby and G.Gregoriadis, το Κατά την τεχνική αυτή, πραγματοποιείται λυοφιλοποίηση (freeze - drying) διασποράς άδειων SUV λιποσωμάτων παρουσία διαλύματος της προς εγκλωβισμό ουσίας. Εδώ, σε αντίθεση με την κλασσική παρασκευή μέσω εξάτμισης του διαλύτη όπου τα μόρια του λιπιδίου είναι σε τυχαία κατανομή, το λιπίδιο το οποίο βρίσκεται στα κενά SUV είναι πολύ καλά οργανωμένο στη δομή της μεμβράνης. Έτσι, κατά την προσθήκη του υδατικού μέσου σχηματίζονται λιποσώματα με υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού και διάμετρο από 400 nm μέχρι μερικά μm. Μερικά από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι: η απλότητα στη χρήση, οι ήπιες συνθήκες που χρησιμοποιούνται (σημαντικές για ευαίσθητα μόρια), και υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού για μεγάλη ποικιλία ουσιών. Η απλότητα της μεθόδου καθιστά ιδιαίτερα δυνατή την διαδικασία scale-up προκειμένου για εφαρμογή στη φαρμακευτική βιομηχανία. Η πιθανότητα διακοπής της διαδικασίας μετά το στάδιο της αφυδάτωσης και η αποθήκευση κάτω από ειδικές συνθήκες αποτελεί ένα επιπλέον πλεονέκτημα. Σε αντίθεση με τη διασπορά ενός στεγνού λιπιδικού υμενίου, η ανασύσταση του λυοφιλοποιημένου προϊόντος είναι εξαιρετικά ταχεία. 25

37 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η DRV μέθοδος διαφέρει από τις περισσότερες άλλες μεθόδους υψηλής ικανότητας εγκλωβισμού στο ότι παράγεται μεγάλη αναλογία ολιγο- και πολυστοιβαδιακών λιποσωμάτων. Η ύπαρξη λιποσωμάτων με πολλές στοιβάδες έχει το πλεονέκτημα ότι μειώνει το ρυθμό απώλειας της εγκλωβισμένης ουσίας παρουσία του πλάσματος. Ο κύριος περιορισμός της μεθόδου, ο οποίος είναι κοινός και σε άλλες μεθόδους που παράγουν μεγάλα λιποσώματα είναι το γεγονός ότι τα DRV λιποσώματα τείνουν να παρουσιάζουν ετερογένεια όσον αφορά το μέγεθος. Η ομοιογένεια στο μέγεθος μπορεί να μη θεωρείται απαραίτητη για φαρμακευτικούς σκοπούς, αλλά είναι σημαντική για την επαναληψιμότητα πειραμάτων. Tα DRV μπορούν να μετατραπούν σε πιο ομοιογενείς παρασκευές αν χρειαστεί, χρησιμοποιώντας συνδυασμό φίλτρων και διαπίδυσης Ψύξη Απόψυξη Υπερήχηση (Freeze thaw sonication method, FTS) Η προηγούμενη DRV μέθοδος είναι παραλλαγή μίας άλλης παρόμοιας που αναπτύχθηκε νωρίτερα από τους Pick, Kasahara and Hinckle, 1981, κατά την οποία το προς εγκλωβισμό υλικό εισάγεται στα λιποσώματα επίσης μετά το σχηματισμό τους. Σε αυτή την περίπτωση ακολουθείται μία πορεία επαναλαμβανόμενης ψύξης απόψυξης για τη διάρρηξη των SUV λιποσωμάτων, κατά τη διάρκεια της οποίας η διαλυμένη ουσία εξισορροπείται μεταξύ εσωτερικού και εσωτερικού, ενώ τα λιποσώματα συντήκονται και αυξάνουν αξιοσημείωτα σε μέγεθος. Έτσι επιτυγχάνονται ποσοστά εγκλωβισμού μέχρι και 30%. Τα λιποσώματα που παράγονται με τη μέθοδο αυτή παρουσιάζουν σημαντικά μειονεκτήματα σε σύγκριση με τα DRV λιποσώματα. Το κυριότερο είναι ότι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ουδέτερα λιπίδια και ειδικά το PC, γιατί πιθανώς η παρουσία φορτίου απαιτείται για το σχηματισμό των κρυστάλλων κατά τη διαδικασία της ψύξης, που βοηθούν στη συνέχεια την πορεία θραύση / σύντηξη. Για παρόμοιους λόγους η σακχαρόζη, δισθενή μεταλλικά ιόντα (που μπορούν να εξουδετερώνουν το επιφανειακό φορτίο) και υψηλής ιονικής ισχύος διαλύματα αλάτων δεν μπορούν να εγκλωβιστούν αποτελεσματικά. Ωστόσο η μέθοδος είναι πολύ απλή, ταχεία, ήπια και καταλήγει σε μεγάλα μονοστοιβαδιακά σωματίδια, χρήσιμα για τη μελέτη φαινομένων μεταφοράς μέσω μεμβρανών. 26