ΣΥΝΘΕΣΗ2-ΒΕΝΖΟΘΕΙΑΖΟΛΥΛ-ΛΙΠΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΑΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΓΙΑ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΤΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ Aβ1-42

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗ2-ΒΕΝΖΟΘΕΙΑΖΟΛΥΛ-ΛΙΠΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΑΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΓΙΑ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΤΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ Aβ1-42 Για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος «Ιατρική Χημεία και Σχεδιασμός Φαρμακευτικών Προϊόντων» Χριστοδούλου Παναγιώτα Χημικός Πάτρα

2 UNIVERSITY F PATRA FACULTY F HEALTH SCIENCES DEPARTMENT F PHARMACY LAB F PHARMACEUTICAL TECHNLGY THESIS << Synthesis of lipid 2-benzothiazole derivatives and the embodiment of this in liposome for suspension of aggregation peptide Ab 1-42>> To obtain the Postgraduate Diploma «Medicine Chemistry and Pharmaceutical Design» CHRISTDULU PANAYITA CHEMIST PATRA

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗ2-ΒΕΝΖΟΘΕΙΑΖΟΛΥΛ-ΛΙΠΙΔΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΚΑΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥΣ ΣΕ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΓΙΑ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΤΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ Aβ1-42 Χριστοδούλου Παναγιώτα Χημικός ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σοφία Αντιμησιάρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Κλεομένης Μπάρλος Καθηγητής Τμήματος Χημείας Δημήτριος Γάτος Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Χημείας 3

4 UNIVERSITY F PATRA FACULTY F HEALTH SCIENCES DEPARTMENT F PHARMACY LAB F PHARMACEUTICAL TECHNLGY THESIS << Synthesis of lipid 2-benzothiazole derivatives and the embodiment of this in liposome for suspension of aggregation peptide Ab 1-42>> CHRISTDULU PANAYITA CHEMIST EXAMINATIN CMMITTEE Sofia antimisiari Professor of department of pharmacy Kleomenis Barlos Professor of department of chemistry Dimitrios Gatos Associate Professor of department of chemistry 4

5 Αφιερώνεται στους γονείς μου, Μάριο και Νίκη 5

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος «Ιατρική Χημεία και Σχεδιασμός Φαρμακευτικών Προϊόντων» κατά τα έτη Στο σημείο αυτό θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου προς την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Σ. Αντιμησιάρη, Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής για την ανάθεση του θέματος και την πολύτιμη αρωγή της κατά τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον μεταδιδάκτορα κ. Σπύρο Μουρτά για την ουσιαστική καθοδήγηση του όσον αφορά στην σχεδίαση και πραγματοποίηση της σύνθεσης των λιπιδικών παραγώγων, και στην Παρασκευή και μελέτη της σταθερότητας των λιποσωμάτων καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές του, και τη συνεχή επίβλεψη των εργασιών καθόλη τη διάρκεια εκπόνησης της διπλωματικής. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου και όλους τους αγαπημένους μου ανθρώπους για την πολύπλευρη στήριξη που μου προσφέρουν πάντα και την πίστη τους σε μένα. 6

7 Περίληψη Η νόσος Αλτζχάιμερ, είναι μια χρόνια εκφυλιστική νόσος του εγκεφάλου και αποτελεί τη συχνότερη μορφή της άνοιας. Τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος στην έρευνα για νανοσωματίδια που φέρουν πρoσδέτες για τα Αβ πεπτίδια και έχουν διερευνηθεί για διαγνωστικούς αλλά και θεραπευτικούς σκοπούς. Ένας από τους στόχους για τη διάγνωση και θεραπεία της νόσου αυτής είναι τα Αβ πεπτίδια. Έχει βρεθεί από μελέτες ότι παράγωγα των 2-βενζοθειαζολυλ-ενώσεων παρουσιάζουν υψηλή συγγένεια για τα Aβ πεπτίδια γεγονός στο οποίο βασίζεται και η παρούσα έρευνα. Τα λιποσώματα είναι σφαιρικά σωματίδια αποτελούμενα από ενυδατωμένες διπλοστοιβάδες φωσφολιπιδίων οι οποίες σχηματίζονται αυθόρμητα κατά τη διασπορά λιπιδίων στο νερό, εγκλωβίζοντας υδατικό διάλυμα στο εσωτερικό τους και αποτελούν ένα από τα πιο διαδεδομένα συστήματα μεταφοράς φαρμάκων. Επιπρόσθετα η εισαγωγή κατάλληλων ομάδων στην επιφάνεια των λιποσωμάτων μπορεί να βοηθήσει στη στόχευση συγκεκριμένων κυττάρων ή φραγμών (όπως και του αιματεγκεφαλικού φραγμού) και συνεπώς στη στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων. Ως εκ τούτου, σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η σύνθεση νέων λιπιδικών 2- βενζοθειαζολικών παραγώγων και η παρασκευή λιποσωμάτων με 2-βενζοθειαζολυλομάδες στην επιφάνειά τους, μέσω ενσωμάτωσης των νέων αυτών λιπιδικών παραγώγων στη λιπιδική διπλοστοιβάδα. Σε πρώτη φάση συντέθηκε ένα λιπίδιο-βενζοθειαζόλιο το οποίο στη συνέχεια ενσωματώθηκε σε SUV (smallunillamelarvesicles) τύπου λιποσώματα. Για τα νέα αυτά λιποσώματα μετρήθηκε το μέγεθός τους και το επιφανειακό τους φορτίο (ζ δυναμικό) καιμελετήθηκεησταθερότητατουμεγέθους τουςκαιημεταβολήτουφορτίουτουςσεδιάστημ αενόςμηνός. Στη συνέχεια διενεργήθηκαν μελέτες σταθερότητας (ακεραιότητα) των λιποσωμάτων (μέσω μέτρησης του ρυθμού αποδέσμευσης ενσωματωμένης καλσείνης) σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS 7.4 και παρουσία πρωτεϊνών πλάσματος (στους 37 ο C). Λέξεις κλειδιά: λιποσώματα, αλτζχάιμερ, βενζοθειαζόλιο, αβ πεπτίδια 7

8 Abstract Alzheimer's disease is a chronic degenerative disease of the brain and is the most common cause of dementia.. ne of the targets for the diagnosis and treatment of this disease is the Aβ peptides. In recent years there has been great progress in research on nanoparticles bearing ligands for ΑΒ Peptides and have been investigated for diagnostic and therapeutic purposes.it has been found from studies that the 2-benzothiazolyl compounds show high affinity for Aβ peptides fact underlying the present research. Liposomes are spherical particles consisting of hydrated bilayers of phospholipids which spontaneously form during lipid dispersion in water, entrapping aqueous solution within and are one of the most common drug delivery systems.they are used to administer drugs. Additionally, the introduction of appropriate groups on the liposome surface can help in the targeting of specific factors and therefore in the targeted delivery of drugs. The aim of this work was the synthesis of new lipid 2-benzothiazole derivatives and the preparation of liposomes with 2-benzothiazolyl groups on their surface, by incorporation of these new lipid derivatives in the lipid bilayer. Initially we synthesized a lipid-benzothiazole which was subsequently incorporated in SUV (small unillamelar vesicles) type liposomes. These new liposomes were subjected to physicochemical characterization (size and surface charge -z potentialmeasurements) and the corresponding size and surface charge stability. Liposome integrity studies have been also conducted (by measuring the integrated calcein release rate) in PBS 7.4 and in the presence of plasma proteins (at 37 ο C). Key words: liposomes, altzhaimer, benzothiazol, ab peptide 8

9 ΣΥΝΤΟΜΕΥΣΕΙΣ CHL PC HPC DPPC SUV PEG DPPG XRD MLV PBS Tm DMAP DIC Χοληστερόλη (Phosphatidilocholine) φωσφατιδιδυλοχολίνη (hydrogenated phosphatidylcholine) υδρογονοποιημένη Φωσφατιδυλοχολίνη (dipalmitoylglycerophosphatidylcholine) Διπαλμιτοϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχλινη (small unilamellar vesicle) μικράμονοστοιβαδιακά λιποσώματα (polyethylenglycol) πολυαιθυλενογλυκόλη (dipalmitoylglycerophosphoglycerol) Διπαλμιτοϋλογλυκεροφωσφογλυκερόλη (X ray Diffraction ) Περίθλαση ακτίνων Χ (multilamellar vesicle) πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (phosphate buffer saline) ρυθμιστικόδιάλυμα φωσφορικών (Transition temperature) Θερμοκρασία μετάπτωσης 4-Διμεθυλαμινοπυριδίνη (N,N -Diisopropylcarbodiimide), διισοπροπυλοκαρβοδιμίδιο lipid-bth Λιπίδιο βενζοθειαζόλιο Οξικός αιθυλεστέας EtAc Et2 DCM Hex THF ET3SIH MeH H22 Διαιθυλεθαίρας Διχλωρομεθάνιο Εξάνιο Τριφθοροξικό οξύ Τριαιθυλσιλάνιο Μεθανόλη Υπεροξείδιο του υδρογόνου 9

10 Περιεχόμενα Θεωρητικό μέρος Εισαγωγή στα λιποσώματα Αμφίφιλα μόρια Οργάνωση αμφίφιλων μορίων Λιπίδια και φωσφολιπίδια Διπλοστοιβάδες λιπιδίων (A) Χοληστερόλη (B) Φωσφατιδυλοχολίνη (PC) Θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης (TM) Ταξηνόμηση των λιποσωμάτων Ταξηνόμηση με βάση το μέγεθος Πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (Multilamellar Vesicles, MLVs) Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (LargeUnilamellarVesicles, LUVs) Ενδιάμεσουμεγέθουςμονοστοιβαδιακάλιποσώματα (IntermediatesizedUnilamellarVesicles, IUVs) Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Small Unilamellar Vesicles, SUVs) Ταξινόμηση με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές Συμβατικά λιποσώματα (Conventionalliposomes): Λιποσώματαμακράςκυκλοφορίας (Long circulating liposomes, stealth, or stericallystabilized): Λιποσώματα ευαίσθητα σε ph (ph-sensitiveliposomes): Ανοσολιποσώματα (Immunoliposomes): Κατιονικά λιποσώματα (Cationicliposomes): Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenicliposomes): Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Multilamellar λιποσώματα (MLV) Μηχανική διασπορά Μέθοδος σφαιριδίων διαλύτη Μικρά λιποσώματα Unilamellar (SUV) Sanitation method

11 Γαλλική μέθοδος πίεσης κυττάρων Μεγάλα λιποσώματα Unilamellar (LUV) Μέθοδοι εγχύσεως διαλύτη Μέθοδοι αφαίρεσης απορρυπαντικών Μέθοδος εξάτμισης ανάστροφης φάσης Προκλητή από ασβέστιο μέθοδος σύντηξης Μέθοδος Microfluidization Εξώθηση υπο άζωτο μέσω polycarboriate φίλτρων Στιγμιαίος σχηματισμός ομοιογενών LUV Αφυδατωμένα Ενυδατωμένα Σωματίδια (DRV) Μέθοδος Freeze Thaw Γιγαντιαία λιποσώματα Λιποσώματα Multivesicular Τεχνικές καθαρισμού λιποσωμάτων Διαπίδυση ισορροπίας (dialysis) Φυγοκέντρηση (centrifugation) Χρωματογραφία γέλης (gelchromatography) Φυσικές ιδιότητες λιποσωμάτων Μέτρηση μεγέθους Επιφανειακό φορτίο Μεταβολική πορεία των λιποσωμάτων στον οργανισμό Συμβατικά Λιποσώματα Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας Μακροχρόνια σταθερότητα λιποσωμάτων με τη μέθοδο της Λυοφιλοποίησης (Freezedrying / lyophilization) Νόσος Αλτζχάιμερ (Αlzheimer) Αβ πεπτίδια Αιματεγκεφαλικός Φραγμός (ΑΕΦ) Νόσος Αλτζχάιμερ (Αlzheimer) Χαρακτηριστικά της Νόσου Alzheimer Αβ πεπτίδια και νευριτικές πλάκες Σχηματισμός Αβ πεπτιδίων

12 3. Μέθοδοι σύνθεσης 2-βενζοθειαζολυλ-παραγώγων Σκοπός: ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Λιποσώματα Συσκευές και όργανα Υλικά Διαλύματα Οργανική σύνθεση ΜΕΡΟΣ Α Σύνθεση της 3-Benzyl-sn-glycerol Σύνθεση του 3-benzyl-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol Σύνθεση του 1,2-palmitoyl-sn-glycerol Σύνθεση του 1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol-3--succinic acid monoester ΜΕΡΟΣΒ Bis(2-aminophenyl) disulfide ΜΕΡΟΣ Γ Σύνθεση του lipid-bth Μέθοδοι Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας(tlc) Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Μέθοδος παρασκευής πολυστοιβαδιακών λιποσωμάτων(mlv) Μέθοδος λεπτού υμενίου Παρασκευή μικρών μονοστοιβαδιακών λιποσωμάτων (SUV) Χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Μέτρηση συγκέντρωσης λιπιδίου Μέθοδος Stewart Μέτρηση μεγέθους λιποσωμάτων Μέτρηση ζ δυναμικού Μελέτη ωσμωτικότητας Μελέτη της in vitro σταθερότητας λιποσωμάτων Καθαρισμός λιποσωμάτων από τη μη εγκλωβισμένη καλσεΐνη

13 Επώαση λιποσωμάτων Μέτρηση συγκράτησης καλσεΐνης ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σύνθεση του Bis(2-aminophenyl) disulfide Σύνθεση του palm-bth Σύνθεση του λιπιδικού παραγώγου 2-βενζοθειαζολίου (lipid-bth) Ενσωμάτωση του lipid-bth σε λιποσώματα Size stability Σταθερότητα μεγέθους Stability-Σταθερότητα ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

14 Θεωρητικό μέρος 1.1 Εισαγωγή στα λιποσώματα Τα λιπίδια, οι πρωτεΐνες και τα νουκλεϊνικά οξέα, αποτελούν τα απαραίτητα βιομόρια για τη δομή και τη λειτουργία της ζωντανής ύλης. Υπάρχουν διάφορα είδη λιπιδίων για παράδειγμα λίπη, κεριά ωστόσο η παρακάτω μελέτη περιορίζεται στα αποκαλούμενα αμφίφιλα λιπίδια. Αυτός ο τύπος λιπιδίου είναι η κυρίαρχη δομική μονάδατων βιολογικών μεμβρανών, καθώς επίσης και των λιποσωμάτων. Τα λιποσώματα είναι κολλοειδή σωματίδια σφαιρικού σχήματος στα οποία μια μεμβράνη λιπιδικήςδιπλοστοιβάδας που αποτελείται από αυτοσυγκροτούμενα μόρια φωσφολιπιδίων εγκλείει στο εσωτερικό της, ένα μέρος από την υδάτινη φάση στην οποία τα λιποσώματα διασπείρονται. Στη λιπιδική μεμβράνη, οι υδρόφιλες κεφαλές των λιπαρών οξέων είναι στραμμένες προς τα έξω, ενώ οι υδρόφοβες ουρές έρχονται σε επαφή μεταξύ τους, σε αντιστοιχία με τη δομή της κυτταρικής μεμβράνης. Το μέγεθος ενός λιποσώματος κυμαίνεται από περίπου 20 nmμέχριδιάφορα μικρόμετρα και μπορούν να αποτελούνται από μια ή περισσότερες ομόκεντρες μεμβράνες, κάθε μια με έναπάχος περίπου 4 nm.τα λιποσώματα βρίσκουν πολλαπλές εφαρμογές ως εργαλεία της βιοχημείας και της Ιατρικής, για παράδειγμα, ως φορείς για τη μεταφορά φαρμακευτικών ουσιών (φαρμάκων, βιταμινών κλπ.) εντός των κυττάρων ή ως υποστρώματα για τη μελέτη των ιδιοτήτων της μεμβράνης. Ανάλογα με τη διαλυτότητα και τα χαρακτηριστικά της κατανομής της (partitioning ), τα μόρια της ουσίας εντοπίζονται σε διαφορετικά σημεία του κυστιδίου των λιποσωμάτων και έχουν διαφορετική παγίδευση και ιδιότητες απελευθέρωσης. Οι ισχυρά λιπόφιλες ουσίες παγιδεύονται σχεδόν αποκλειστικά στη λιπιδική διπλοστοιβάδα των λιποσωμάτων για το λόγο ότι είναι ελάχιστα διαλυτές στο νερό, έτσι προβλήματα που 14

15 σχετίζονται με την απώλεια της εγκλωβισμένης ουσίας στο υδατικόπεριβάλλον των λιποσωμάτων κατά την αποθήκευση, είναι αμελητέα. Επιπλέον, υπάρχει δυνατότητα της ρύθμισης του μεγέθους και του επιφανειακού φορτίου τους με την προσθήκη ποικίλων παραγόντων στη λιπιδική μεμβράνη. Τα τροποποιημένα λιποσώματα σε νανοκλίμακα έχει βρεθεί ότι εμφανίζουν εξαιρετικό φαρμακοκινητικόπροφίλ κατά τη μεταφορά του DNA, sirna, πρωτεϊνών και χημικοθεραπευτικών ουσιών. Ωστόσο τα λιποσώματα παρουσιάζουν κάποια μειονεκτήματα όπως χαμηλή σταθερότητα, μειωμένη αποτελεσματικότητα ενκαψακίωσης φαρμάκου και γρήγορη αρχική αποδέσμευση του φαρμάκου. Για αυτόν το λόγο γίνονται προσπάθειες για την εξάλειψη των παραπάνω προβλημάτων όπως για παράδειγμα την προσθήκη αλυσίδων πολυαιθυλενογλυκόλης η οποία δημιουργεί ένα προστατευτικό στρώμα στην επιφάνεια των λιποσωμάτων με στόχο την αύξηση του χρόνου παραμονής τους στη κυκλοφορία του αίματος (1). Μια σχηματική απεικόνιση ενός λιποσώματος παρουσιάζεται στο Σχήμα 1. 15

16 Εικόνα 1: Σχηματική αντιπροσώπευση ενός λιποσώματος.(η εικόνα είναι από το sitewww.integratedhealthblog.combyhankliers ). 1.2 Αμφίφιλα μόρια Τα αμφίφιλα μόρια έχουν ως κύριο και ειδικό χαρακτηριστικό τους να συσσωματώνονται αυθόρμητα (δηλ. αυτό οργάνωση) σε ποικίλες δομές πουτους επιτρέπουν να είναι χρήσιμα σε έναν μεγάλο αριθμό εφαρμογών Οργάνωση αμφίφιλων μορίων Τα αμφίφιλα μόρια συσσωματώνονται για να διαμορφώσουν μια ποικιλία από μικροδομές. Αυτό οφείλεται στον ειδικό συνδυασμό των τμημάτων τα οποία φέρουν και συνδυάζουν ευελιξία, κατάλληλη διαμόρφωση, αλλά και σε τμήματα με διαλυτότητες σε διαλύτες με μεγάλη διαφορά στη πολικότητα. Όλα τα αμφίφιλα αποτελούνται από ένα μέρος που είναι πολικό και ένα δεύτερο μέρος που είναι άπολο. Έτσι, η διάλυση των ενώσεων αυτών είτε σε μη πολικούς διαλύτες είτε σε πολύ πολικούς διαλύτες, όπως το νερό, έχει ως συνέπεια την αυτό-οργάνωση και αυτοδόμηση των μορίων αυτών κατά τρόπο ώστε τα τμήματα τα μη διαλυτά στον αντίστοιχο διαλύτη να προστατεύονται από το περιβάλλον του διαλύτη. Αυτό σημαίνει ότι οι διαλύτες που είναι είτε μη πολικοί, είτε πολύ πολικοί, προάγουν τη αυτό οργάνωση. Στα περισσότερα αμφίφιλα, το υδροφοβικό μέρος αποτελείται από αλυσίδες υδρογονανθράκων, ενώ το υδρόφιλο μέρος αποτελείται από αυτό που ονομάζεται πολική κεφαλή. Στα υδατικά διαλύματα, τα αμφίφιλα μόρια διαλύονται ως μονομερή, καταρχάς, αλλά επάνω από μια ορισμένη συγκέντρωση, συσσωματώνονται αυθόρμητα για να μειώσουν όσο μπορούν τις υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις.η αυθόρμητη συσσωμάτωση οφείλεται, όχι μόνο στην προαναφερθείσα υδροφοβική συμβολή, αλλά συσχετίζεται επίσης με τις μοριακές 16

17 ιδιότητες του αμφίφιλου.η αυξανόμενη εντροπία που προκύπτειαπό τη συσσωμάτωσηπροέρχεται από τις αλληλεπιδράσεις νερού-υδρογονανθράκων, που αναγκάζουν τα μόριανερού σε μια διατεταγμένη δομήγύρω από το υδροφοβικό μέρος, όταν τα αμφίφιλα καταβυθίζονται ελεύθερα σαν μονομερή. 1.3 Λιπίδια και φωσφολιπίδια Τα λιποσώματα είναι δυνατόν να παρασκευαστούν από διάφορα είδη λιπιδίων και μείγματα λιπιδίων.ένα βασικό είδος μεμβρανικού λιπιδίου είναι τα φωσφολιπίδια τα οποία είναι οργανικές ενώσεις που µαζί µε τα ουδέτερα λίπη και τα στεροειδή, αποτελούν τις βασικές κατηγορίες των λιπιδίων. Η δοµή των περισσότερο διαδεδοµένωνφωσφολιπιδίων αποτελείται από 1 µόριο γλυκερόλης, 2 µόρια λιπαρών οξέων ένα µόριο φωσφορικού οξέος και ένα πολικό µόριο (π.χ. η λεκιθίνη που ως πολικό µόριο φέρειαζωτούχο βάση, τη χολίνη)(εικόνα2).τα φωσφολιπίδια αποτελούν το δοµικό υλικό της κυτταρικής µεµβράνης και η χηµικήσυμπεριφοράς τους καθορίζει τη γενικότερη κυτταρική λειτουργία.αποτελούνται από µια υδρόφιλη και µια υδρόφοβη περιοχή, την «κεφαλή» τουµορίου και την «ουρά» του µορίου αντίστοιχα. Οι υδρόφοβες ουρές έλκονται μεταξύ τους, ενώ οι υδρόφιλες κεφαλές συνδέονται με το υδατικό μέρος. Με αυτό τον τρόπο σχηματίζονται διπλές λιπιδικές στοιβάδες οι οποίες ενώνονται και δημιουργούν μικρά σωματίδια, τα οποία μοιάζουν με τα σωματικά κύτταρα.οι δυνάμεις που αναπτύσσονται και κάνουν σταθερά τα λιποσώματα είναι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των λιπιδίων (υδρόφιλες ανάμεσα σε πολικές ομάδες και αλληλεπιδράσεις VanderWaalsανάμεσα στις άπολες ομάδες) και οι αλληλεπιδράσεις των λιπιδίων με το νερό (υδρόφιλες ή υδρόφοβες αλληλεπιδρασεις). 17

18 Εικόνα 2: οµήφωσφολιπιδίου (WebsiteofDavidP. ChynowethMSPH, PhD) (2) 1.4 Διπλοστοιβάδες λιπιδίων Η διπλοστοιβάδα λιπιδίου είναι μια λεπτή μεμβράνη φτιαγμένη από δύο στρώματα μορίων λιπιδίου. Αυτές οι μεμβράνες είναι επίπεδα φύλλα που διαμορφώνουν ένα συνεχές φράγμα γύρω από τα κύτταρα. Η κυτταρική μεμβράνη σχεδόν όλων των ζώντων οργανισμών και πολλών ιών αποτελείται από διπλοστοιβάδα λιπιδίων, όπως επίσης και οι μεμβράνες που περιβάλλουν τουςπυρήνες των κυττάρων και άλλες υπομοριακές δομές. Οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων είναι το φράγμα που συγκρατεί ιόντα, πρωτεΐνες και άλλα μόρια το οποίο είναι απαραίτητο ώστε να αποτραπείη διάχυση στις περιοχέςόπου δεν πρέπει να είναι. 18

19 Οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων ταιριάζουν ιδανικά σε αυτόν τον ρόλο επειδήείναι αδιαπέραστες από τα περισσότερα υδατοδιαλυτά (υδρόφιλα) μόρια. Επίσης οι διπλοστοιβάδες είναι ιδιαίτερα αδιαπέραστες από τα ιόντα, κάτι το οποίο επιτρέπει στα κύτταρα να ρυθμίζουν τη συγκέντρωση και το ph με την άντληση των ιόντων στις μεμβράνες τους,χρησιμοποιώντας πρωτεΐνες, τις αποκαλούμενες ιονικές αντλίες. Το κέντρο της διπλοστοιβάδας δεν περιέχει σχεδόν καθόλουύδωρ και αποκλείει επίσης μόρια όπως σάκχαρα ή άλατα που διαλύονται στο νερό αλλά όχι σε οργανικούς διαλύτες. Επειδή οι διπλοστοιβάδες λιπιδίων είναι αρκετά ευαίσθητες και είναι τόσο λεπτές που είναι αόρατες σε ένα κοινό μικροσκόπιο, η μελέτη τους αποτελεί πρόκληση. Τα φωσφολιπίδια με ορισμένες ομάδες στη κεφαλή τους μπορούν να αλλάξουν τη χημεία στην επιφάνειας μιας διπλοστοιβάδας και μπορούν για παράδειγμαναχαρακτηρίσουν ένα κύτταρο για καταστροφή από το ανοσοποιητικό σύστημα. Οι ουρές λιπιδίων μπορούν, επίσης, να έχουν επιπτώσεις στις ιδιότητες μεμβρανών, όπως με τον καθορισμό της φάσης της διπλοστοιβάδας.οι βιολογικές μεμβράνες περιλαμβάνουν χαρακτηριστικά διαφόρων τύπων λιπιδίων εκτός από τα φωσφολιπίδια. Η κατηγορία λιπιδίων που θα εξεταστεί μέσα στην παρούσα εργασία είναι τα γλυκεροφωσφολιπίδια, συχνά αποκαλούμενα και φωσφολιπίδια (A) Χοληστερόλη Η χοληστερόλη αποτελεί βασικό συστατικό των βιολογικών μεμβρανών επιτελώντας σημαντικές λειτουργίες. Η χοληστερόλη προστίθεται στα λιποσώματα τα οποία χρησιμοποιούνται ως πρότυπα και προσομοιάζουν τις κυτταρικές μεμβράνες, για πολλούς λόγους. Μία από τις σημαντικότερες λειτουργίες της, είναι ότι προσδίδει σταθερότητα στα λιποσώματα ειδικά όταν αυτά είναι πολύ ασταθή (PC).ρόλος της χοληστερόλης συγκεκριμένα είναι, να ενσωματώνεται στις φωσφολιπιδικέςμεμβράνες 19

20 και να αλλάζει μερικές από τις ιδιότητες τους, όπως τη ρευστότητα ή τη διαπερατότητα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό μεμβρανών περισσότερο συμπαγών, από αυτές των λιποσωμάτων των οποίων οι μεμβράνες δεν περιέχουν χοληστερόλη. (εικόνα 3). Επίσης η παρουσία της χοληστερόλης στις μεμβράνες των λιποσωμάτων οδηγεί σε σημαντική αύξηση ή μείωση της σειράς προσανατολισμού των υδρογονανθρακικών αλυσίδων πάνω ή κάτω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης και μείωση της γωνίας κλίσης της φωσφολιπιδικής αλυσίδας στη ρευστή φάση.επιπλέον, η χοληστερόλη έχει τη δυνατότητα να μεταβάλλει τη θερμοκρασία μετάπτωσης των λιποσωμικών μεμβρανών ανάλογα με το αν το λιπίδιο βρίσκεται σε υψηλότερη θερμοκρασία από τη θερμοκρασία μετάπτωσης ή σε χαμηλότερη. Πιο συγκεκριμένα αν βρίσκεται σε υψηλότερη θερμοκρασία τότε η χοληστερόλη βοήθα στη μείωση της ελεύθερης κίνησης, τη συμπύκνωση της μεμβράνης και τη μείωση της ρευστότητας της σε αντίθεση με το όταν η θερμοκρασία του λιπιδίου είναι χαμηλότερη που εκεί υπάρχει αύξηση της απόστασης μεταξύ των φωσφολιπιδίων, η οργάνωση των πολικών κεφαλών εξασθενεί και η ρευστότητα της μεμβράνης αυξάνεται. 20

21 Εικόνα 3:Χημική δομή της χοληστερόλης όπου διακρίνετε η πολική και η μη πολική περιοχή(wolfe S.L., Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publishing Company, 1993, p 155.) (B) Φωσφατιδυλοχολίνη (PC) Οι φωσφατιδυλχολίνες ανήκουν σε µια κατηγορία φωσφολιπιδίων όπου στην πολικήκεφαλήτους ενσωματώνονταιχολίνες (δηλ. υδατοδιαλυτά θρεπτικά συστατικά). Αποτελούν βασικό συστατικό των βιολογικών μεμβρανών και μπορούν εύκολα να αποµονωθούν από άµεσαδιαθέσιµες πηγές όπως είναι ο κρόκος αυγού και τα φασόλια σόγιας. Ανήκουν επίσης στις οµάδες των λεκιθίνων που ανιχνεύονται τόσο σε ζωικούς όσο και σε φυτικούς ιστούς. Οι φωσφατιδυλχολίνες, αποτελούνται από πολικές κεφαλές χολίνων και γλυκεροφωσφορικώνοξέων και από δύο αλυσίδες λιπαρών οξέων, µια κορεσµένη και µία ακόρεστη (εικόνα 4). Οι φωσφατιδυλχολίνεςχρησιµοποιούνται αρκετά χρόνια ως δοµικά στοιχεία τωνλιποσωµάτων. Τα λιποσώµατα που χρησιμοποιούνται ως φορείς φαρµάκων μπορούν να εγχυθούν στη συστηµατική κυκλοφορία µε την μορφή ενέσιµουδιαλύµατος. Σηµαντικό μειονέκτημα στη μέθοδο αυτή χορήγησης είναι ότι οι λιποσωµικές μορφές µπορούν να παραµείνουν στη κυκλοφορία του αίµατος για πολύ μικρό χρονικό διάστηµα (από μερικά λεπτά έως κάποιες ώρες) ανάλογα και µε την δοµήτου λιποσώµατος. Το πρόβληµα αυτό μπορεί να αντιμετωπισθεί µε την Παρασκευή λιποσωµάτων από φωσφατιδυλχολίνη, που επικαλύπτεται µε υδρόφιλα πολυµερή (π.χ. PEG) αυξάνοντας έτσι το χρόνο παραµονής τους στη συστηµική κυκλοφορία σε τουλάχιστον μερικές εβδομάδες. Η συγκεκριμένημέθοδος παρασκευής λιποσωµάτων µε επικάλυψη PEG χρησιμοποιείται ευρύτατα σε τοµείς όπως η ελεγχόµενη χορήγηση φαρµάκων καθώς επίσης και στην κοσµητική αφού παρουσιάζει εξαιρετικές ιδιότητες σε φαρμακευτικές αλοιφές για 21

22 δερµατική χορήγηση. Εικόνα 4: Η φωσφατίδιλοχολινη, όπου φαίνεται η πολική και η μη πολική περιοχή.( 1.5 Θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης (TM) Οι λιπιδικές μεμβράνες που αποτελούνται από φώσφολιπιδια μπορούν να υπάρξουν σε διάφορες φάσεις όταν βρίσκονται σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Η μετάβαση από τη μία φάση στην άλλη μπορεί να διαπιστωθεί με φυσικές μεθόδους κατά τη αύξηση της θερμοκρασίας. Σήμερα, η πιο διαδεδομένη τεχνική για το προσδιορισμό τηςθερμοκρασίας μετάπτωσης είναι η Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης. (3) Οι πιο συχνά παρατηρούμενες αλλαγές φάσης συμβαίνουν στην υψηλότερη θερμοκρασία 22

23 στην οποία η μεμβράνηαποδιατάσσεται από την οργανωμένη μορφή της γέλης (gel) ή του στερεού (solid) και μεταβαίνει σε υγρή - κρυσταλλική δοµή κατά την οποία οι βαθµοίελευθερίας των µορίων είναι περισσότεροι. Συγκεκριμένα, σε μια δεδομένη θερμοκρασία η διπλοστοιβάδα μπορεί να υπάρξει είτε σε μια υγρήείτε στερεά φάση. Η στερεά φάση αναφέρεται συνήθως ως φάση "πηκτωμάτων". Όλα τα λιπίδια έχουν μια χαρακτηριστική θερμοκρασία στην οποία κάνουν μιαμετάβαση(λειώνουν)από το πήκτωμα στην υγρή φάση. Και στις δύο φάσεις τα μόρια λιπιδίων περιορίζονται στο δισδιάστατο επίπεδο της μεμβράνης, αλλά στην υγρή φάση τα μόρια είναι διάχυτα ελεύθερα μέσα σε αυτό το επίπεδο. Κατά συνέπεια, σε μία υγρή διπλοστοιβάδα ένα δεδομένο λιπίδιοθα ανταλλάξει γρήγορα θέσεις με τα γειτονικά εκατομμύριαφορές το δευτερόλεπτο και μέσω της διαδικασίας του random walk, μεταναστεύει σε μεγάλες αποστάσεις. (εικόνα 5) Σε αντίθεση με αυτήν την μεγάλη κινητικότητα στο επίπεδο, είναι πολύ δύσκολο για τα μόρια λιπιδίων να μετακινηθούν από μια πλευρά της διπλοστοιβάδας σε άλλη. Σε μια διπλοστοιβάδα φωσφατυδιλοχολινών αυτή η διαδικασία εμφανίζεται χαρακτηριστικά σε ένα χρονοδιάγραμμα εβδομάδων. Για να μετακινηθεί ένα λιπίδιο από τη μια πλευρά στην άλλη, η πολική κεφαλή πρέπει να διασχίσει τον υδροφοβικό πυρήνα της διπλοστοιβάδας, μια δυσμενής ενεργειακά διαδικασία. Αντίθετα από τις υγρής φάσης διπλοστοιβάδες, τα λιπίδια σε φάση πηκτώματος είναι κλειδωμένα σε μια θέση και δεν παρουσιάζουν ούτε μεταφορά από την μια στοιβάδα στην άλλη ούτε την πλευρική κινητικότητα. Αυτή η λειτουργία είναι ένας από τους λόγους που οι μεμβράνες κυττάρων αποτελούνται συνήθως από ρευστής φάσης διπλοστοιβάδες. 23

24 Εικόνα 5: Σχέση ανάμεσα στη φάση της μεμβράνης και τη θερμοκρασία 1.6 Ταξηνόμηση των λιποσωμάτων 1.6.1Ταξηνόμηση με βάση το μέγεθος 24

25 Πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (Multilamellar Vesicles, MLVs) Τα MLV λιποσώματα αποτελούνται από έναν μεγάλο αριθμό παράλληλων,ομόκεντρων φωσφολιπιδικών διπλοστοιβάδων. Πρόκειται για τον απλούστερο τύπο λιποσωμάτων όσον αφορά την παρασκευή τους. Φάρμακα, καθώς και άλλες διαλυτές ενώσεις μπορούν να εγκλωβιστούν στα υδατικά μεσοδιαστήματα ανάμεσα στις μεμβράνες, ενώ τα υδρόφοβα τμήματά τους ή υδρόφοβα φάρμακα μπορούν να διαλυτοποιηθούν στοεσωτερικό της διπλοστοιβάδας.τα λιποσώματα αυτά έχουν μεγάλες και ετερογενείς διαμέτρους (1-10μm),χαμηλή ικανότητα εγκλωβισμού όγκου ανά μόριολιπιδίου και παρουσιάζουν πολλαπλά εσωτερικά διαμερίσματα. Η απόσταση μεταξύ των διαδοχικών διπλοστοιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία των ελκτικών δυνάμεων van der Waals, ηλεκτροστατικών και άλλων δυνάμεων άπωσης. Όλα αυτά 25

26 τα χαρακτηριστικά καθιστούν τη χρήση τους ως φορείς βιοδραστικών ουσιών και μεμβρανικά μοντέλα αρκετά πολύπλοκη Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (LargeUnilamellarVesicles, LUVs) Ως LUVs χαρακτηρίζονται τα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα με διαμέτρουςμερικών εκατοντάδων nm μέχρι και μερικά μm, ανάλογα με την μέθοδο παρασκευήςτους Ενδιάμεσουμεγέθουςμονοστοιβαδιακάλιποσώματα (IntermediatesizedUnilamellarVesicles, IUVs). Σε αυτή την κατηγορία ανήκουν τα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα με διαμέτρους περίπου 100 nm ή και περισσότερο Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (Small Unilamellar Vesicles, SUVs) Τα SUV λιποσώματα αποτελούνται μόνο από μια διπλοστοιβάδα και έχουν διάμετρο nm. Διαθέτουν το μικρότερο δυνατό μέγεθος στο οποίο ένα φωσφολιπίδιο μπορεί να σχηματίσει λιποσωμική μορφή. Η δυνατότητα αυτή εξαρτάται από τηνιονική ισχύ του διαλύματος φωσφολιπιδίου και από τη λιπιδικήσύσταση των μεμβρανών. Πρόκειται για θερμοδυναμικά ασταθή λιποσώματα που είναιεπιρρεπή σε συσσωμάτωση και σύντηξη, ιδίως κάτω από τη θερμοκρασiαμετάπτωσης φάσης. 26

27 Εικόνα 6 :SUV,LUV,MLV(H εικόνα τροποποιήθηκε μερικώς από αυτή που είναι στοbraz. Αrch. Βiol. Technol. vol.59, Curitiba 2016,Epub Mar 08, 2016) Ταξινόμηση με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές Το λιποσωμικό σύστημα μεταφοράς βιοδραστικών ουσιών διαθέτει ένα μεγάλο πλεονέκτημα έναντι άλλων κολλοειδών συστημάτων μεταφοράς: Επιτρέπει σχεδόν άπειρες πιθανότητες μεταβολής των δομικών και φυσικοχημικών χαρακτηριστικών. Αυτό το χαρακτηριστικό της ευελιξίας επιτρέπει στους επιστήμονες να τροποποιούν την in vivo συμπεριφορά των λιποσωμάτων και να σχεδιάζουν τις διάφορες λιποσωμικέςμορφές ανάλογα με τις θεραπευτικές ανάγκες. Με βάση τη σύνθεση και την επιθυμητή in vivo εφαρμογή, τα λιποσώματα διακρίνονται σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες: Συμβατικά λιποσώματα Κατιονικά λιποσώματα Στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα, και Ανοσολιποσώματα 27

28 Εικόνα 7: Σχηματική απεικόνιση διαφορετικών τύπων λιποσωμάτων: Συμβατικά (Conventional) λιποσώματα, Στερεοχημικά σταθεροποιημένα (Stealth) λιποσώματα, Στοχευμένα (Targeted), Κατιονικά (Cationic) λιποσώματα Συμβατικά λιποσώματα (Conventionalliposomes): Αυτά μπορούν να οριστούν ως λιποσώματα που αποτελούνται μόνο απόφωσφολιπίδια (ουδέτερα ή/και αρνητικά φορτισμένα) ή/και χοληστερόλη. Πρόκειται για την πλέον χρησιμοποιούμενη κατηγορία λιποσωμάτων στη μεταφοράβιοδραστικών ουσιών. Διαφέρουν ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, όπως το μέγεθος, τη λιπιδική σύσταση, το επιφανειακό φορτίο και τον αριθμό και ρευστότητατων λιπιδικώνδιπλοστoιβάδων.τα συμβατικά λιποσώματα χαρακτηρίζονται από σχετικά 28

29 μικρό χρόνοκυκλοφορίας στο αίμα. Όταν χορηγούνται in-vivo (συχνά ενδοφλέβια) έχουν τηντάση να συσσωρεύονται γρήγορα στα φαγοκύτταρα του δίκτυοενδοθηλιακούμονοπυρηνικού συστήματος (RES). Τα κύρια όργανα συσσώρευσης είναι το ήπαρ και η σπλήναγεγονός αυτό έχει αποτελέσει στόχο για διάθεση βιοδραστικών ουσιώνμέσω λιποσωμάτων σε μολυσμένα μακροφάγα. Επιπλέον, τα συμβατικά λιποσώματαέχουν χρησιμοποιηθεί για μεταφορά αντιγόνων. Λιποσωμικά εμβόλια έχουναποδειχθεί αποτελεσματικά κατά ιικών, βακτηριακών και παρασιτικών μολύνσεωνκαθώς επίσης και εναντίον όγκων Λιποσώματαμακράςκυκλοφορίας (Long circulating liposomes, stealth, or stericallystabilized): Η ανάπτυξή τους αποτέλεσε ορόσημο στη χρήση των λιποσωμάτων ωςσυστήματα μεταφοράς φαρμάκων και αναζωπύρωσε το ενδιαφέρον γύρω από τηνέρευνα περί λιποσωμάτων. Στην πραγματικότητα, τα λιποσώματα μακράςκυκλοφορίας άνοιξαν νέους δρόμους σε θεραπευτικές δυνατότητες που μέχρι τότεθεωρούνταν ανέφικτες για τα συμβατικά λιποσώματα.το πιο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό τους είναι ότι έχουν την ικανότητα ναεξωαγγειώνονται μετά από ενδοφλέβια χορήγηση σε περιοχές όπου η διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος είναι αυξημένη. Αυτό μαζί με το γεγονός ότι οι περιοχέςαυξημένης τριχοειδικής διαπερατότητας είναι κυρίως παθολογικές περιοχές, όπως στερεοί όγκοι και περιοχές μολύνσεως και φλεγμονής, εξηγεί την εφαρμογή τωνστερεοχημικά σταθεροποιημένων λιποσωμάτων ως συστήματα χορήγησηςαντικαρκινικών ή αντιφλεγμονωδών ουσιών. Προς το παρόν, ο πιο δημοφιλής τρόποςπαραγωγής τέτοιων λιποσωμάτων είναι η ομοιοπολική σύνδεση του πολυμερούςπολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) (MB 2000) στην εξωτερική επιφάνεια των κυστιδίων. 29

30 Εικόνα 8: Απεικόνιση stealth λιποσωμάτων(biotencheminano) Τα λιποσώματα αυτά ονομάζονται επίσης stealth ή στερεοχημικώςσταθεροποιημένα (ss). Ο πρώτος όρος αναφέρεται στην ικανότητά τους ναδιαφεύγουν από τα μακροφάγα κύτταρα του ΔΕΣ και ο δεύτερος στο μηχανισμόστερεοχημικής σταθεροποίησής τους, που είναι υπεύθυνος για την αύξηση τουχρόνου κυκλοφορίας. Το τελευταίο οφείλεται σε στερεοχημική παρεμπόδιση που αποτρέπει τις αλληλεπιδράσεις με συστατικά του αίματος, κυρίως πρωτεΐνες,απολιποπρωτεΐνες κ.α.οι περισσότερες από τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τη σύζευξη τουpeg σε λιπίδια, περιλαμβάνουν σύνδεση του PEG στη δραστικήαμινομάδα της φωσφατίδυλοαιθανολαμίνης (PE). Στο εμπόριο είναι διαθέσιμα πολλά προϊόντα (PEGλιπίδια)από διάφορες πηγές, όπως για παράδειγμα η διστεαροϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη συζευγμένη σε πολυαιθυλενογλυκόλη (DSPE-PEG) μέσωενός πεπτιδικού δεσμού. Οι φυσικές ιδιότητες των PEG-λιπιδίων είναι παρόμοιες μεαυτές των επιφανειοδραστικών ενώσεων. Μελέτες με PE-PEG δείχνουν ότι μπορεί νασχηματίσει μικκύλια δίνοντας διαυγή διαλύματα στο νερό και ότι μπορεί νααποσταθεροποιήσει το σχηματισμό των διπλοστοιβάδων, όταν προστίθεται σε υψηλόποσοστό σε σχέση με τα άλλα λιπίδια (4) (10 mol% περίπου). Τα στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα με PEG παρασκευάζονταιείτε με προσθήκη του PEG-λιπιδίου στο μείγμα πριν το σχηματισμό λιποσωμάτων,είτε με σύζευξη του PEG σε ήδη σχηματισμένα λιποσώματα (5). 30

31 Έχει πλέον επικρατήσει η πρώτη τεχνική.ένα παράγωγο PEG με ενεργό άκρο μπορεί να συζευχθεί με ορισμένεςενεργές ομάδες στη λιποσωμική επιφάνεια όμως η ομάδα μαλεϊμιδίου, η βιοτίνη κτλ.αυτή η τεχνική συνήθως ονομάζεται post-coating τεχνική και είναι κατάλληλη γιατην προσκόλληση PEG στη επιφάνεια προπαρασκευασμένων ανοσολιποσωμάτων. Σ αυτή την περίπτωση οι αλυσίδες του πολυμερούς θα βρίσκονται τελικά μόνο στηνεξωτερική πλευρά των λιποσωμάτων Λιποσώματα ευαίσθητα σε ph (ph-sensitiveliposomes): Αποτελούνται από φωσφολιπίδια όπως φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (PE) ήδιολεϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (DPE). Σε χαμηλό ph ενώνονται με τηκυτταρική μεμβράνη του ενδοσώματος και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους στο κυτταρόπλασμα (εικόνα 9). Είναι κατάλληλα για ενδοκυτταρική μεταφοράασθενών βάσεων και μακρομορίων. Η βιοκατανομή και η φαρμακοκινητική τους είναι ανάλογη με αυτή των συμβατικών λιποσωμάτων. Εικόνα 9: Λιποσώματα ευαίσθητα σε ph. (Μεταπτυχιακή εργασία Παπαδιά Κωνσταντίνα) 31

32 Ανοσολιποσώματα (Immunoliposomes): Διαθέτουν ειδικά αντισώματα (MΑb) ή κλάσματα αντισωμάτων (FΑb) ήαντισώματα μονής αλυσίδας στην επιφάνειά τους προκειμένου να ενισχύσουν τηστοχευμένη πρόσδεση. Αν και έχουν εξεταστεί για πληθώρα θεραπευτικώνεφαρμογών, η εστίαση έχει γίνει στη μεταφορά αντικαρκινικών παραγόντων. Όπως και άλλα σωματίδια στην κυκλοφορία του αίματος, είναι δύσκολο σταανοσολιποσώματα να εγκαταλείψουν την κυκλοφορία σε άλλα διαμερίσματα πληντου ήπατος και του σπλήνα εάν δεν έχουν μικρό μέγεθος (<200nm). Γι αυτό,προκειμένου να εξασφαλιστεί προσιτότητα των υποδοχέων, επιχειρείται τοπικήχορήγηση μεγάλων ανοσολιποσωμάτων σε σωματικές κοιλότητες. 32

33 Εικόνα 10:Σχηματική απεικόνιση ενός στερεοχημικά σταθεροποιημένουλιποσώματος. Τα stealth λιποσώματα εγκλωβίζουν το φάρμακο (1) σε μια φωσφολιπιδικήδιπλοστοιβάδα (2).Η PEG επικάλυψη (3) επιτρέπει στα λιποσώματα να αποφεύγουν τοανοσοποιητικό σύστημα αυξάνοντας το χρόνο ημιζωής του φαρμάκου στο σώμα. (BioteChemiNano) Κατιονικά λιποσώματα (Cationicliposomes): Αυτά εκπροσωπούν σχετικά νέα μέλη της οικογένειας των λιποσωμάτων.βρίσκονται στην πρώτη γραμμή ως συστήματα μεταφοράς γενετικού υλικού. Τακατιονικά λιπίδια αλληλεπιδρούν και εξουδετερώνουν το αρνητικά φορτισμένοdna, συμπυκνώνοντας έτσι το DNA σε μια πιο συμπαγή δομή. Τα σύμπλοκαλιπιδίου-dna παρέχουν προστασία και επάγουν την ενδοκυττάρωση και έκφρασητου συμπυκνωμένου πλασμιδίου. 33

34 Εικόνα 11: Κατιονικά λιποσώματα (Μεταπτυχιακή εργασία Κωνσταντίνος Παχής) Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenicliposomes): Τα λιποσώματα αυτά μπορούν να διευκολύνουν την ενδοκυτταρική μεταφοράεγκλωβισμένων βιοδραστικών ουσιών μέσω σύντηξης με τη μεμβράνη των κυττάρων στόχων. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι παρασκευής τους μεταξύ των οποίων και η χρήσηλιπιδίων που είναι ικανά να προάγουν την αποσταθεροποίηση της διπλοστοιβάδας καινα προκαλούν φαινόμενα σύντηξης (όπως το DPE). Επίσης, μπορούν ναενσωματωθούν σε λιποσώματα και πρωτεΐνες που επάγουν τη σύντηξη. Διάφορεςμελέτες έχουν δείξει ότι η ενίσχυση της ικανότητας σύντηξης των λιποσωμάτων μπορεί να εφαρμοστεί προκειμένου να ενισχυθεί η αποτελεσματικότηταλιποσωμάτων στη μεταφορά γενετικού υλικού.γενικά, το μέγεθος, η ακαμψία των διπλοστοιβάδων, το φορτίο και οιτροποποιήσεις της επιφάνειας της διπλοστοιβάδας αποτελούν παραμέτρους πουκαθορίζουν την τύχητων λιποσωμάτων 34

35 τόσο κατά την αποθήκευση όσο και μετά τηχορήγηση. 1.7 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων Στην πράξη, οι περισσότερες μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων οδηγούν σεαρκετά ετερογενείς πληθυσμούς σωματιδίων με ευρεία κατανομή μεγέθους.δεδομένου ότι ο διαθέσιμος προς εγκλωβισμό, όγκος λιποσωμάτων ποικίλλειανάλογα με την κατανομή μεγέθους, είναι πολύ σημαντικό οι λιποσωμικέςπαρασκευές να χαρακτηρίζονται ως προς το μέγεθος, ώστε να προβλέπεται μεσχετική ακρίβεια η in-vitro και in-vivo συμπεριφορά τους. Ακόμη και λιποσώματα με το ίδιο μέγεθος και τον ίδιο αριθμό στοιβάδων είναι δυνατό να διαφέρουν στηνεσωτερική κατανομή της υδατικής φάσης και στην ποσότητα λιπιδίου που συμμετέχει στη δομή των σωματιδίων.η επιλογή του τύπου λιποσωμάτων που θα χρησιμοποιηθεί για συγκεκριμένηεφαρμογή εξαρτάται εν μέρει από το είδος της ουσίας που πρόκειται να εγκλωβιστεί αλλά και από την επιθυμητή συμπεριφορά του λιποσώματος μετά την παρασκευήτου. 35

36 Εικόνα 12 : Συνήθεις μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων. MLV (πολυστοιβαδιακά), MVV(πολυκυστιαδιακά), REV (αντίστροφης φάσης), SPLV (σταθερά πολυστοιβαδιακά), SUV (μικρά μονοστοιβαδιακά), ULV (μονοστοιβαδιακά) Multilamellar λιποσώματα (MLV) Μηχανική διασπορά Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηματισμό λεπτού υμενίου (film) κατά την εξάτμιση οργανικού ή οργανικών διαλυτών, στους οποίους έχει προηγουμένως διαλυθεί το λιπίδιο. Για να απομακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χημικά αποικοδόμηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο σχηματίζεται το λεπτό υμένιο, εκτίθεται σε ρεύμα αζώτου για πέντε λεπτά. Η ενυδάτωση (hydration) του υμενίου που ακολουθεί πραγματοποιείται με νερό ή με ρυθμιστικό διάλυμα ή με διάλυμα της προς εγκλωβισμό δραστικής 36

37 ουσίας.το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτμισης των διαλυτών, πραγματοποιο ύνται σε θερμοκρασίες υψηλότερες της θερμοκρασίας μετάβασης φάσης του χρησιμοποιούμενου λιπιδίου.προς τούτο το διάλυμα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερμανθεί σε αυτή τη θερμοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. Με μηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υμένιο αποκολλάται από τα τοιχώματά της, οπότε λαμβάνεται μία θολερή διασπορά με πολυστοιβαδιακά λιποσώματα μεγάλου μεγέθους MLV. Η μείωση του μεγέθους των MLV λιποσωμάτων και η δημιουργία ομογενούς σε αναφορά με το μέγεθος πληθυσμού, υλοποιείται με τη χρήση κυρίως λουτρού υπερήχων (bath sonicator), αλλά και διαφόρων άλλων τεχνικών, όπως εξώθηση μέσω φίλτρων ή μεμβρανών (extrusion), μικρoγαλακτωματοποίηση(microemulcification). Στο τελευταίο στάδιο πραγματοποιείται η διαδικασία της (annealing), κατά την οποία τα λιποσώματα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο και πάντα σε θερμοκρασία υψηλότερη αυτής της μετάπτωσης του λιπιδίου, όπου παραμένουν για μία περίπου ώρα ώστε να ολοκληρωθεί και να ομαλοποιηθεί η μορφοποίηση της δομής τους. Η διάμετρος των λιποσωμάτων που λαμβάνονται με τη μέθοδο αυτή κυμαίνεται α πό 5 έως 6 μm κ.ά. MLVs με υψηλή αποδοτικότητα εγκλωβισμού μπορεί να προετοιμαστούν με την ενυδάτωση του λιπιδίου παρουσία ενός μη αναμίξιμου οργανικού διαλύτη (πετρελαϊκός αιθέρας, διαιθυλικός αιθέρας). Το περιεχόμενο γαλακτωματοποιείται με υπέρηχους. Ο οργανικός διαλύτης αφαιρείται με τη διαβίβαση ενός ρεύματος αερίου αζώτου πάνω από το μίγμα. Τα MLVs διαμορφώνονται αμέσως στην υδάτινη φάση μετά από την αφαίρεση του οργανικού διαλύτη. Το κύριο μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι έκθεση των υλικών που τοποθετούνταισε κάψα στον οργανικό διαλύτη και υπέρηχους Μέθοδος σφαιριδίων διαλύτη 37

38 Μια μέθοδος για την προετοιμασία MLVs ομοιογενούς κατανομής μεγέθους προτάθηκε από τον Kim et Al (1985). Η διαδικασία περιελάμβανε τη διασκόρπιση στο διάλυμα ύδατος μικρών σφαιριδίων του πτητικού υδροφοβικού διαλύτη στον οποίο τα λιπίδια ήταν διαλυμένα. Τα MLVs διαμορφώνονται όταν γίνεται ελεγχόμενη εξάτμιση του οργανικού διαλύτη σε ένα ύδατολουτρό Μικρά λιποσώματα Unilamellar (SUV) Sanitation method Εδώ MLVs εκτίθονται σε υπέρηχους είτε με ένα sonicator υδατόλουτρου είτε με χρήση ακίδας υπερήχων κάτω από αδρανή ατμόσφαιρα. Τα κύρια μειονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι ο πολύ χαμηλός εσωτερικός όγκος/αποδοτικότητα εγκλωβισμού,ενδεχόμενη αποσύνθεσ ης των φωσφολιπιδίωνκαι των ενώσεων που πρόκειται να εγκλωβιστούν, αποκλεισμός των μεγάλων μορίων, μόλυνση από το μέταλλο από την ακίδα και ταυτόχρονη παρουσία MLV με SUV. ι ezden and Hasirci (1991) προετοίμασαν λιποσώματα επικαλυμμένα μεπολυμερή μ' αυτό τον τρόπο Γαλλική μέθοδος πίεσης κυττάρων Η μέθοδος περιλαμβάνει την εξώθηση MLV σε PSI σε 4 C μέσω ενός μικρού στο μίου. Η μέθοδος έχει διάφορα πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τη μέθοδο υπερήχων. Η μέθοδος είναι απλή γρήγορη, επαναλήψιμη και περιλαμβάνει τον προσεκτικό χειρισμό των ασταθών υλικών (6). Τα προκύπτοντα λιποσώματα είναι κάπως μεγαλύτερα από τα υπερηχημένα SUVs. Τα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι 38

39 ότι ηθερμοκρασία είναι δύσκολο να επιτευχθεί και οι όγκοι που εφαρμόζεται είναι σχετικά μικροί (περίπου 50 ml μέγιστο). Μια νέα μέθοδος για την προετοιμασία SUV προτάθηκε από τους Lasic et Al (1987). Τοποθέτησαν φωσφατιδυλοχολίνη αυγού που αναμίχθηκε με 1,5 %w/v του δεκαεξυλικού βρωμίδιου του τετραμεθυλαμμωνίου (απορρυπαντικό) σε CHCI3/MeH σε διάφορες βάσεις όπως παραδείγματος χάριν silica gel, zeolite Χ, zeolite ZSM5. Μετά από την αφαίρεση της οργανικής φάσης, το σύστημα επανακαταβυθίσθηκε με ανάδευση ή ανακίνηση σε απεσταγμένο νερό ή 5 mmnacl. Υπήρξε κάποια απώλεια από το φωσφολιπίδιο (περίπου 10 20%) που οφείλεται στην προσρόφηση στις πλάκες. Η απώλεια ήταν 70% και 95% στην περίπτωση του πηκτώματος πυριτίου και zeolite ZSMS αντίστοιχα. Ένας ομοιογενής πληθυσμός λιποσωμάτων με μέση διάμετρο 21,5 nm λήφθηκε όταν zeolite Χ (μέγεθος μορίων 0,4 mm.) χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα Μεγάλα λιποσώματα Unilamellar (LUV) Έχουν υψηλούς εσωτερικούς όγκους/ αποδοτικότητα εγκλωβισμού και είναι τώρα αρκ ετά χρησιμοποιημένα για τον εγκλωβισμό φαρμάκων και μακρομορίων Μέθοδοι εγχύσεως διαλύτη Μέθοδος έγχυσης αιθέρα Ένα διάλυμα λιπιδίων σε διαιθυλικό αιθέρα σε μίγμα αιθέρα/μεθανόλης εγχέεται αργά ένα υδατικό διάλυμα του υλικού που πρόκειται να εγκλωβιστεί στους C ή κάτω από μειωμένη πίεση.η στην συνέχεια εξάτμιση τουαιθέρα υπό κενό οδηγεί στο σχηματισμό λιποσώματων. Τα κύρια μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ότι ο 39

40 πληθυσμός είναι ετερογενής ( nm) και η έκθεση των ενώσεων που πρόκειται να εγκλωβιστούν στους οργανικούς διαλύτες ή/και σε υψηλή θερμοκρασία (7) Μέθοδος έγχυσης αιθανόλης Ένα διάλυμα λιπιδίων σε αιθανόλη εγχέεται γρήγορα σε περίσσεια ρυθμιστικού. Τα MLVs διαμορφώνονται αμέσως. Τα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ότι ο πληθυσμός είναι ετερογενής ( nm), τα λιποσώματα είναι πολύ αραιά, είναι δύσκολο να αφαιρεθεί όλη η αιθανόλη επειδή διαμορφώνει αζεοτροπικό σύστημα με το ύδωρ και τη πιθανότητα διάφορων βιολογικά ενεργών μακρομόριων να αδρανοποιηθούν παρουσία ακόμη και ελάχιστων συγκεντρώσεων αιθανόλης (8) Μέθοδοι αφαίρεσης απορρυπαντικών Τα απορρυπαντικά στην κρίσιμη μικκυλιακή συγκέντρωση έχουν χρησιμοποιηθεί για να διαλυτοποιήσουν λιπίδια. Καθώς το απορρυπαντικό αφαιρείται, τα μικκύλια γίνονται σταδιακά πλουσιότερα σε φωσφολιπίδιο και συνδυάζεται τελικά ώστε να διαμορφώσει LUVs.Τα απορρυπαντικά αφαιρούνται μεdialysis. Τα πλεονεκτήματα από την μέθοδο αυτή είναι άριστη επαναληψιμότητα και η δυνατότητα παραγωγής πληθυσμών λιποσωμάτων που είναι ομοιογενείς στο μέγεθος. Το κύριο μειονέκτημα της μεθόδου είναι η διατήρηση ιχνών απορρυπαντικού μέσα στα λιποσώματα. Ηεμπορική συσκευή LIPPREP που είναι μια έκδοση συστήματος διάλυσης είναι διαθέσιμη για την αφαίρεση των απορρυπαντικών. Άλλες τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί για την αφαίρεση των απορρυπαντικών: (α) με τη χρησιμοποίηση της χρωματογραφίας πηκτωμάτων που περιλαμβάνει μια στήλη Sephadex g 25 (Enoch και Suitt Matter, 1979), (β) με την 40

41 προσρόφηση ή τη δέσμευση Triton Χ 100 (απορρυπαντικό) στις Bio beadssm2 (Gerristenet al, 1978). (γ) από τη σύνδεση octyl glucosid (απορρυπαντικό)σεamberlite XAD 2 beads (Philippot et Al, 1985) Μέθοδος εξάτμισης ανάστροφης φάσης Πρώτα σχηματίζεται ένα νερό σε έλαιο γαλάκτωμα από συντομο sonication ενός συστήματος δύο φάσεων που περιέχει τα φωσφολιπιδία στον οργανικό διαλύτη (διαιθυλαιθέρας ή ισοπροπυλαιθερας ή μίγμα ισοπροπύλο αιθέρας και χλωροφόρμιο) και υδατικό ρυθμιστικό διάλυμα. Οι οργανικοί διαλύτες εξατμίζονται υπό μειωμένη πίεση, με συνέπεια το σχηματισμό ενός ιξώδους πηκτώματος. Τα λιποσώματα διαμορφώνονται όταν ο υπόλοιπος διαλύτης αφαιρείται από τη συνεχή εξάτμιση κάτω από μειωμένη πίεση. Με αυτήν την μέθοδο μπορεί να ληφθεί υψηλή αποδοτικότητα εγκλωβισμού μέχρι 65% σε ένα μέσο χαμηλής ιοντικής δύναμης, παραδείγματος χάριν 0,01 M NaCl. Η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για τον εγκλωβισμό μικρών, μεγάλων και μακρομόριων. Το κύριο μειονέκτημα της μεθόδου είναι η έκθεση των υλικών που εγκλωβίζονται στους οργανικούς διαλύτες και σε μικρά διαστήματα υπερήχησης. Αυτές οι συνθήκεςμπορούν ενδεχομένως να οδηγήσουν στην αλλοίωση μερικών πρωτεϊνών ή θραύσητωνελικώνdna (9). Λαμβάνεται μια ετερογενούς μεγέθους διασπορά μεμβρανών μ' αυτό τον τρόπο. Η τροποποιημένη αντίστροφη μέθοδος εξάτμισης φάσης παρουσιάστηκε από τους Handa et al (1987) και το κύριο πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι τα λιποσώματα είχαν υψηλή αποδοτικότητα εγκλωβισμού (περίπου 80%). Η μέθοδος εξάτμισης Szoka and Papahadjopoulos (1978) έχει τροποποιηθεί επίσης να εγκλωβίζει τα πλασμίδια χωρίς καταστροφή των ελικών DNA. 41

42 Προκλητή από ασβέστιο μέθοδος σύντηξης Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται για να προετοιμάσει LUV από όξινα φωσφολιπίδια. Η διαδικασία είναι με βάση την παρατήρηση ότι η προσθήκη ασβεστίου σε SUV προκαλεί την σύντηξη και οδηγεί σε σχηματισμό των πολυστοιβαδιακών δομών στη σπειροειδή διαμόρφωση (κύλινδροιcochleate). προσθήκη EDTA στην προετοιμασία αυτών έχει ως αποτελέσματ α το σχηματισμόluvs (Papahadjopoulos and Vail, 1978). Το κύριο πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι μακρομόρια μπορεί να εγκλωβιστούν υπό ήπιες συνθήκες. Τα προκύπτοντα λιποσώματα είναι κατά ένα μεγάλο μέρος μονοστοιβαδιακά, αν και μιας ετερογενούς σειράςμεγεθών. Το κύριο μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι LUVs μπορούν να ληφθούν μόνο από όξινα φωσφολιπίδια Μέθοδος Microfluidization Οι Mayhew et al (1984) πρότειναν μια τεχνική microfluidization /μικρογαλακτωματοποίησης / ομογενοποίησης για την μεγάλης κλίμακας κατασκευή λιποσωμάτων. Η μείωση του μεγέθους μπορεί να επιτευχθεί με την ανακύκλωση του δείγματος. Η διαδικασία είναι επαναληψιμη και παράγει λιποσώματα με καλό εγκλωβισμό υδάτινης φάσης. Οι Riaz and Weiner (1995) παρασκεύασαν λιποσώματα που αποτελούνται από το λέκιθο αυγών, χοληστερόλη και άλας φωσφατιδυλοσερινης εγκεφάλου (57:33:10) μ ' αυτό τον τρόπο. Πρώτα MLV προετοιμάστηκε από αυτούς περνώντας μέσω ενός Microluidizer (Microlluidics Corporation, Newton, MA, ΗΠΑ) με εισροή 40 PSI πίεση αέρα. Η σειρά μεγέθους ήταν NM μετά από 25 επαναλήψεις. Στο Microluidizer, η αλληλεπίδραση των ρευστών στρωμάτων πραγματοποιείται σε υψηλές ταχύτητες 42

43 (πιέσεις) σε ακριβώς καθορισμένα μικροκανάλια που είναι παρόντα σε μια αίθουσα αλληλεπίδρασης.στην αίθουσα η πίεση φθάνει μέχρι PSI που αυτό μπορεί να επιφέρει μερική αποσύνθεση των λιπιδίων Εξώθηση υπο άζωτο μέσω polycarboriate φίλτρων LUVs μπορούν να παρασκευασθούν διαπερνώντας MLV υπό συνθήκες αζώτου μέσω φίλτρωνπολυανθρακικών μεμβρανών. Οι μεμβράνες που παρασκευάζονται μ' αυτό τον τρόπο έχουν στενή κατανομή μεγέθους. Η εξώθηση γίνεται σε μέτριες πιέσεις ( PSI). Μια ειδική συσκευή για φίλτρα απαιτείται. Τέτοιες συσκευές είναι διαθέσιμες εμπορικά με εμπορικές ονομασίες όπως LUVET και EXTRUDER και είναι εξοπλισμένοι με έναν μηχανισμό επανακυκλοφορίας που επιτρέπει την πολλαπλάσια εξώθηση με λίγη δυσκολία (10). Μικρές ποσότητες λιποσωμάτων (περίπου 10 ml) μπορούν να προετοιμαστούν εύκολα με τη βοήθεια ενός εμπορικού εξωθητή Στιγμιαίος σχηματισμός ομοιογενών LUV Οι Lasic et Al (1988) ανέφεραν μια μέθοδο για τον στιγμιαίο σχηματισμό σχετικά ομοιογενών LUV από μια απλή τεχνική. Ο σχηματισμός πολυστοιβαδιακών λιποσώματων αποτρέπεται με την πρόκληση ενός φορτίου επιφάνειας (+ ve) στην διπλοστοιβάδα ενώ το μέγεθος των μεμβρανών ελέγχεται από την τοπογραφία της επιφάνειας υποστήριξης στην οποία το υμένιο φωσφολιπιδίων διαμορφώθηκε. Τοποθέτησαν mg λεκιθίνης διαλυμένη με 3ml CHCl3 / MeH σε ένα ειδικά διαμορφωμένο υπόστρωμα πυριτίου 2 ιντσών. Αυτό το υπόστρωμα τοποθετήθη 43

44 κε στο κατώτατο σημείο μιας Εrlenmeyer φιάλης. Αφότου ξηράνθηκε ολονυκτίς σε 102Torr(περίπου 1 Pa), το υμένιο επανακαταβυθίστηκε με ελαφριά ανακίνηση σε 1 2 ml.ύδατος.τα λιποσώματα διαμορφώθηκαν αμέσως. Η μόλυνση από τα λιποσώματα με μεγάλες δομές όπως MLVs, γιγαντιαίες μεμβράνες και μόριαφωσφολιπίδιων, αποκλείστηκε από ενισχυμένη με βίντεο μικροσκόπηση αντίθεσης φάσης Αφυδατωμένα Ενυδατωμένα Σωματίδια (DRV) Η μέθοδος αυτή έχει αναπτυχθεί από τους C. Kirby and G.Gregoriadis, το 1984.Κατά την τεχνική αυτή, πραγματοποιείται λυοφιλοποίηση (freeze drying) διασποράς άδειων SUV λιποσωμάτων παρουσία διαλύματος της προς εγκλωβισμό ουσίας. Εδώ, σε αντίθεση με την κλασική παρασκευή μέσω εξάτμισης του διαλύτη όπου τα μόρια του λιπιδίου είναι σε τυχαία κατανομή, το λιπίδιο το οποίοβρίσκεταιστα κενά SUV είναι πολύ καλά οργανωμένο στη δομή της μεμβράνης.έτσι, κατά την προσθήκη του υδατικού μέσου σχηματίζονται λιποσώματα με υψηλή ικανότητα εγκλωβισμού και διάμετρο από 400 nm μέχρι μερικά μm. Μερικά από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι: η απλότητα στη χρήση, οι ήπιες συνθήκες που χρησιμοποιούνται (σημαντικές για ευαίσθητα μόρια), και ηυψηλή ικανότητα εγκλωβισμού για μεγάλη ποικιλία ουσιών. Η απλότητα της μεθόδου καθιστά ιδιαίτερα δυνατή την διαδικασία scaleup προκειμένου για εφαρμογή στη φαρμακευτικη βιομηχανία. Η πιθανότητα διακοπής της διαδικασίας μετά το στάδιο της αφυδάτωσης και η αποθήκευση κάτω από ειδικές συνθήκες αποτελεί ένα επιπλέον πλεονέκτημα. Σε αντίθεση με τη διασπορά ενός στεγνού λιπιδικού υμενίου, η ανασύσταση τουλυοφιλοποιημένουπροϊόντος είναι εξαιρετικά ταχεία.η DRV μέθοδος διαφέρει από τις περισσότερες άλλες μεθόδους υψηλής ικανότητας εγκλωβισμού στο ότι παράγεται μεγάλη αναλογία ολιγο και πολύ-στοιβαδιακών λιποσωμάτων. Η ύπαρξη λιποσωμάτων με πολλές στοιβάδες έχει το πλεονέκτημα ότι μειώνει το ρυθμό απώλειας της εγκλωβισμένηςουσίας παρουσία του πλάσματος. Ο κύριος 44

45 περιορισμός της μεθόδου, ο οποίος είναι κοινός και σε άλλες μεθόδους που παράγουν μεγάλα λιποσώματα είναι το γεγονός ότι τα DRV λιποσώματα τείνουν να παρουσιάζουν ετερογένεια όσον αφορά το μέγεθος. Η ομοιογένεια στο μέγεθος μπορεί να μη θεωρείται απαραίτητη για φαρμακευτικούς σκοπούς, αλλά είναι σημαντική για την επαναληψιμότητα πειραμάτων.tα DRV μπορούν να μετατραπούν σε πιο ομοιογενείς παρασκευές αν χρειαστεί, χρησιμοποιώντας συνδυασμό φίλτρων και διαπίδυσης Μέθοδος Freeze Thaw Η προηγούμενη DRV μέθοδος είναι παραλλαγή μίας άλλης παρόμοιας που αναπτύχθηκε νωρίτερα από τους Pick, Kasahara and Hinckle, 1981, κατά την οποία το προς εγκλωβισμό υλικό εισάγεται στα λιποσώματα επίσης μετά το σχηματισμό τους. Σε αυτή την περίπτωση ακολουθείται μία πορεία επαναλαμβανόμενης ψύξης απόψυξης για τη διάρρηξη των SUV λιποσωμάτων, κατά τη διάρκεια της οποίαςη διαλυμένη ουσία εξισορροπείται μεταξύ εσωτερικού και εσωτερικού, ενώ τα λιποσώματα συντήκονται και αυξάνουν αξιοσημείωτα σε μέγεθος. Έτσι επιτυγχάνονται ποσοστά εγκλωβισμού μέχρι και 30%. Τα λιποσώματα που παράγονται με τη μέθοδο αυτή παρουσιάζουν σημαντικά μειονεκτήματα σε σύγκριση με τα DRV λιποσώματα. Το κυριότερο είναι ότι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ουδέτερα λιπίδια και ειδικά το PC, γιατί πιθανώς η παρουσία φορτίου απαιτείται για το σχηματισμό των κρυστάλλων κατά τη διαδικασία της ψύξης, που βοηθούν στη συνέχεια την πορεία θραύση / σύντηξη. Για παρόμοιους λόγους η σακχαρόζη, δισθενή μεταλλικά ιόντα (που μπορούν να εξουδετερώνουντο επιφανειακό φορτίο) και υψηλής ιονικής ισχύος διαλύματα αλάτων δεν μπορούν να εγκλωβιστούν αποτελεσματικά. Ωστόσο, η μέθοδος είναι πολύ απλή, ταχεία,ήπια και καταλήγει σε μεγάλα μονοστοιβαδιακά σωματίδια, χρήσιμα για τη μελέτη φαινομένων μεταφοράς μέσω μεμβρανών. 45

46 1.7.4 Γιγαντιαία λιποσώματα Η διαδικασία για το σχηματισμό των γιγαντιαίων λιποσωμάτων περιλαμβάνει το dialysis, ενός διαλύματος μεθανόλης της φωσφατιδυλοχολίνης παρουσία του απορρυπαντικου methylglucoside ενάντια σε ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει μέχρι 1M NaCl. Τα λιποσωμάτα ποικίλουν στη διάμετρο από 10 έως 100 mm. Μια μέθοδος για το σχηματισμό των γιγαντιαίων ενιαίων πεταλωδών λιποσωμάτων με μέγεθος ανάμεσα σε 10 έως 20 mm με την αφαίρεση του νατρίουtrichloroacetate με dialysis πα ρουσιάστηκε από τους ku and MacDonald (1983) Λιποσώματα Multivesicular (α) Ο σχηματισμός των πολύ διαμερισματικών λιποσωμάτων έχει αναφερθείαπό τον Kim et al (1983). Το νερό σε έλαιο γαλάκτωμα μετατράπηκε σε σφαιρίδια οργανικών διαλυτών από προσθήκη του γαλακτώματος σε διαλύτη. Η εξάτμιση του οργανικού διαλύτη οδήγησε στον σχηματισμό των πολυδιαμερισματικών μεμβρανών. Η διάμετρος των λιποσωμάτων κυμαίνεται από 5,6 έως 29 pm.τα υλικά που μπορούν να εγκλωβιστούν περιλαμβάνουν τη γλυκόζη, EDTA, ανθρώπινο DNA. Αυτά τα λιποσώματαέχουν την πολύ υψηλή αποδοτικότητα ενθυλάκωσης (μέχρι 89%). (β)οι Cullis et Al (1987) διαπίστωσαν ότι όταν MLV υποβλήθηκαν σε πέντε κύκλους επαναλαμβανόμενης ψύξης στο υγρό άζωτο ακολουθούμενος με απόψυξη σε θερμό ύδωρ, λιποσώματα υψηλής αποδοτικότητας εγκλωβισμού (μέχρι 88%) θα μπορούσαν να ληφθούν. 46

47 1.8 Τεχνικές καθαρισμού λιποσωμάτων Συνήθως είναι απαραίτητος ο διαχωρισμός της ελεύθερης ουσίας από την ουσία που έχει εγκλωβιστεί στα λιποσώματα. Ο διαχωρισμός αυτός επιτυγχάνεται με την χρήση μεθόδων που περιγράφονται παρακάτω Διαπίδυση ισορροπίας (dialysis) Κατά τη διαδικασία της διαπίδυσης η λιποσωμική διασπορά τοποθετείται σεένα δοχείο και ο πυθμένας ή τα τοιχώματα του δοχείου αποτελούνται από μεμβράνεςδιαπίδυσης. Το δοχείο τοποθετείται με τη σειρά του σε ένα μεγαλύτερο δοχείο που περιέχει καθαρό διαλύτη. Κατά τη διαπίδυση, τα ιόντα του ηλεκτρολύτη και άλλες διαλυτές ουσίες μικρού μοριακού βάρους εξέρχονται από τους πόρους της μεμβράνης, ενώ τα λιποσώματα λόγω μεγέθους, δεν μπορούν να εξέλθουν Φυγοκέντρηση (centrifugation) Η πυκνότητα των διπλοστοιβάδων από φωσφατιδυλοχολίνη έχει αναφερθεί οτι είναι ίση με 1,0135 g*ml-1 (11). Η τιμή αυτή αυξάνει ελαφρά (1,0142 g*ml-1) με την προσθήκη χοληστερόλης σε ποσοστό 50% και αναμένεται μεγαλύτερη για κορεσμένα λιπίδια, κυρίως κάτω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης.επίσης η παρουσία πρωτεϊνών στις μεμβράνες οδηγεί σε αισθητή αύξηση της πυκνότητας. Έτσι λιποσωμικές μεμβράνες διεσπαρμένες σε νερό ή ρυθμιστικό διάλυμα καθιζάνουν υπό την επίδραση της βαρύτητας. Έχει υπολογιστεί ότι μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (SUV) από φωσφατιδυλοχολίνη (PC) έχουν συντελεστή καταβύθισης S (sedimentationcoefficient) 2,6 S στο νερό, ενώ το μέγεθος αυτό αυξάνει σε 5,2 S με την προσθήκη μεγάλων ποσών χοληστερόλης (12). Έτσι ανάλογα με τη σύσταση της διπλοστοιβάδας, μικρά μονοστοιβαδιακα λιποσώματα μπορούν αν καταβυθιστούν στα g μετά από ώρες σε μια υπερφυγόκεντρο. Τα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα 47

48 καταβυθίζονταιευκολότερα (στα g ή λιγότερο ανάλογα με το μέγεθος, για 1h περίπου). Στην περίπτωση που εγκλωβίζεται μέσα στα λιποσώματα ουσία με υψηλή συγκέντρωση ήμε υψηλό μοριακό βάρος σε συγκέντρωση ισοτονική με ρυθμιστικό διάλυμα, ηπυκνότητα του μέσου πλησιάζει ή υπερβαίνει αυτή των λιπιδίων, με αποτέλεσμα η καταβύθιση να είναι αδύνατη. Το πρόβλημα αυτό μπορεί να ξεπεραστεί με αραίωσητων λιποσωμάτων σε ένα μέσο με χαμηλότερη πυκνότητα έτσι ώστε τα λιποσώματα να είναι βαρύτερα από αυτό Χρωματογραφία γέλης (gelchromatography) Στην υγρή χρωματογραφία αποκλεισμού μοριακών μεγεθών τα μόρια των συστατικών ενός μίγματος, μετακινούνται με τη βοήθεια μιας υγρής κινητής φάσης μέσα στο πορώδες δίκτυο στατικής φάσης και διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος τους. Το δικτυωτό πλέγμα της στατικής φάσης λειτουργεί σαν μοριακό κόσκινο, επιτρέποντας την είσοδο στο εσωτερικό του μόνο σε μόρια και ιόντα που είναι μικρότερα από το μέγεθος των πόρων του. Ουσίες μεγαλύτερου μεγέθους αποκλείονται από το να εισέλθουν στο δίκτυο και εκλούονται πρώτες παρασυρόμενες από την κινητή φάση. Οι υπόλοιπες ουσίες, ανάλογα με το μέγεθος τους κατανέμονται λιγότερο ή περισσότερο στη στατική φάση και εκλούονται κατά σειράμεγέθους. Ως στατικές φάσεις χρησιμοποιούνται κυρίως υδρόφιλες πηκτές απόδιακλαδισμένα πολυμερή δεξτράνης (SephadexG), αγαρόζης (SepharoseB) ή πολυακρυλαμιδίου (Bio-Gel-P). Ειδικά πολυμερή δεξτράνης σχηματίζουν μετά από αλκυλίωση των υδροξυλομάδων τους υδρόφοβες γέλες με οργανικούς διαλύτες (SephadexLH). Όσον αφορά στα λιποσώματα, οι πλέον διαδεδομένες γέλες για το διαχωρισμό της ελεύθερης από την εγκλωβισμένη ουσία είναι οι SephadexG (κυρίως G-50 και G-25). 48

49 1.9 Φυσικές ιδιότητες λιποσωμάτων Οι φυσικές ιδιότητες των λιποσωμάτων μας βοηθούν να χαρακτηρίσουμε την συμπεριφορά τους. Οι ιδιότητες που μελετώνται κυρίως είναι: I. Το μέγεθος και η κατανομή αυτού II. Το επιφανειακό φορτίο 1.9.1Μέτρηση μεγέθους Η πιο ακριβής μέθοδο για την μέτρηση του μεγέθους των λιποσωμάτων είναι η ηλεκτρονική μικροσκοπία,αφού επιτρέπει την μελέτη καθενός ξεχωριστά των λιποσωμάτων και ακριβείς πληροφορίες για την κατανομή των μεγεθών σε ολόκληρο τον πληθυσμό των λιποσωμάτων. Παρόλα αυτά είναι χρονοβόρα μέθοδος και απαιτεί εξοπλισμό που δεν είναι εύκολα προσβάσιμος. Εν αντιθέσει η φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων(pcs) αποτελεί μια πολύ γρήγορη και απλή τεχνική αλλά έχει το μειονέκτημα ότι μετρά τον μέσο όρο μεγέθους του συνολικού πληθυσμού των λιποσωμάτων. Βέβαια, εάν δεν είναι απαραίτητη η ακριβής γνώση του μεγέθους, μια πιο απλή μέθοδος αποτελεί ηχρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους. Από τις τεχνικές ηλεκτρονικής μικροσκοπίας χρησιμοποιείται κατά κύριο λόγο η ηλεκτρονική μικροσκοπία διερχόμενης δέσμης(tem). Στην περίπτωση αυτή το δείγμα μεταφέρεται σε ένα διαφανές πλαστικό υπόστρωμα ή μεμβράνη άνθρακα (πάχους nm) το οποίο είναι τοποθετημένο σε δίκτυο χαλκού. Το δείγμα σκεδάζει ηλεκτρόνια εκτός πεδίου παρατήρησης και η τελική εικόνα γίνεται ορατή σε φθορίζουσα οθόνη. Το ποσοστό σκέδασης ηλεκτρονίων εξαρτάται από το πάχος και τον ατομικό αριθμό των ατόμων του μείγματος. Με την τεχνική αυτή τα σωματίδια φαίνονται διάχυτα φωτισμένα και έτσι μπορεί να μετρηθεί το μέγεθος και η 49

50 συσσωμάτωσή τους, αλλά υπάρχει περιορισμένη ένδειξη του βάθους. Άλλη συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος αποτελεί η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM ). Αυτή είναι μία μέθοδος που απεικονίζει την επιφάνεια των δειγμάτωνσαρώνοντας το δείγμα με μια υψηλής ενέργειας δέσμη ηλεκτρονίων. Τα ηλεκτρόνιααλληλεπιδρούν με τα άτομα που αποτελούν το δείγμα παράγοντας τα σήματα που περιέχουν πληροφορίες για την επιφάνεια του δείγματος όπως την τοπογραφία, την σύσταση και άλλες ιδιότητες, όπως την ηλεκτρική αγωγιμότητα. Οι τύποι σημάτων που παράγονται από τα SEM περιλαμβάνουν δευτερεύοντα ηλεκτρόνια, οπισθοσκεδασμένα ηλεκτρόνια (EBS), χαρακτηριστικές ακτίνες X, κ.α. Τα σήματα προκύπτουν από τις αλληλεπιδράσεις της δέσμης ηλεκτρονίων με τα άτομα στην ή κοντά στην επιφάνεια του δείγματος. Στον πιο κοινό ή τυποποιημένο τρόπο ανίχνευσης, την απεικόνιση δευτερευόντων ηλεκτρονίων ή το SEI, τα SEM μπορούν να παραγάγουν πολύ υψηλής ευκρίνειας εικόνες μιας επιφάνειας δειγμάτων, που αποκαλύπτει λεπτομέρειες μεγέθους μικρότερου από 1 έως 5nm. Λόγω της πολύ στενής δέσμης ηλεκτρονίων, τα μικρογραφήματα SEM έχουν έναν μεγάλο βάθος που παράγει μια χαρακτηριστική τρισδιάστατη εμφάνιση χρήσιμη για την κατανόηση της επιφανειακής δομής ενός δείγματος. Άλλη μέθοδος που χρησιμοποιείται επίσης είναι η Freeze etch που στην ουσία αποτελεί μια μέθοδο προετοιμασίας ιδιαίτερα χρήσιμη για τις μεμβράνες λιπιδίων. Ο ιστός ή τα κύτταρα παγώνονται γρήγορα, και κατόπιν τέμνονται απλά με σπάσιμο ή με τη χρήση μικροτόμου ενώ διατηρείται σε θερμοκρασία υγρού αζώτου. Η κρύα σπασμένηεπιφάνεια (μερικές φορές "χαραγμένη" με την αύξηση της θερμοκρασίας στους περίπου -100 C για αρκετά λεπτά) σκιάζεται έπειτα με εξατμισμένο λευκόχρυσο ή χρυσό σε μια μέση γωνία 45 σε έναν υψηλού κενού εξατμιστήρα. Μια δεύτερη στρώση άνθρακα, εξατμισμένη καθέτως στο μέσο επίπεδο επιφάνειας τοποθετείταισυχνά για να βελτιώσει τη σταθερότητα του επιστρώματος του αντιγράφου. Το δείγμα επιστρέφεται σε θερμοκρασία δωματίου και πίεση, κατόπιν το εξαιρετικάεύθραυστο "προ σκιασμένο" μεταλλικό αντίγραφο της τετμημένης επιφάνειας 50

51 απελευθερώνεται από το ελλοχεύον βιολογικό υλικό με οξέα, η με διάλυση μευποχλωριώδη άλατα είτε με απορρυπαντικό SDS. Το αντίγραφο πλένεται λεπτομερώς από τις υπόλοιπες χημικές ουσίες, τοποθετείταιπροσεκτικά επάνω σε λεπτά πλέγματα, ξηραίνεται και μελετάται με TEM Επιφανειακό φορτίο Οι ηλεκτρικές ιδιότητες της επιφάνειας των λιποσωμάτων μπορούν να μελετηθούν με ηλεκτροφόρηση κατά την οποία προκαλείται κίνηση των λιποσωμάτων μέσα σε στάσιμο υγρό υπό την επίδραση εξωτερικά εφαρμοζόμενης διαφοράς δυναμικού. Η κίνηση αυτή μετριέται με Φασματοσκοπία Συσχέτισης Φωτονίων (Photon Correlation Spectroscopy, PCS) και βασίζεται στη μετατόπιση Doppler που προκαλείται από την πρόσπτωση μονοχρωματικής ακτινοβολίας (laser He Ne, 5 mw, 63 3 nm) στα κινούμενα σωματίδια. Γενικά δύο παράμετροι που χαρακτηρίζουν την επιφάνεια των λιποσωμάτων μπορούν να υπολογισθούν από τις μετρούμενες κινητικότητες είναι το δυναμικό επιφάνειας, ζ δυναμικό (ζ potential) και η πυκνότητα επιφανειακού φορτίου σ (surface charge density).ηεξίσωσηhelmholtz Smoluchowski (13) που ακολουθεί δίνει την τιμή του ζ δυναμικού, ζ=un/eε όπου u (cm/sec) η ταχύτηταμετακίνησης του λιποσώματος στο σωλήνα τουκελιού ηλεκτροφόρησης, n (dyne sec/cm 2) το ιξώδες το υ μέσου, ε η διηλεκτρική σταθεράτουμέσου και Ε (V/cm) η ένταση του εφαρμοζόμενου δυναμικού. Το ζ δυναμικό σχετίζεται με το δυναμικό επιφάνειας των σωματιδίων και επηρεάζει μεγάλο φάσμα ιδιοτήτων των κολλοειδών συστημάτων όπως τη σταθερότητά τους, την αλληλεπίδρασή τους με ηλεκτρολύτες και φάρμακα καθώς και τις ρεολογικές ιδιότητες των εναιωρημάτων. Η τιμή του ζ-δυναμικού είναι μία καλή ένδειξη για την εκτίμηση σταθερότητας των κολλοειδών διασπορών. Είναι γενικά 51

52 αποδεκτό ότι λιποσωμικές διασπορές με μεγάλο θετικό ή αρνητικό ζ δυναμικό εμφανίζουν απωστικές δυνάμεις που εμποδίζουν τη συσσώρευση, πήξη, συσσωμάτωση και κατακρήμνιση των σωματιδίων τους. Η φύση και η πυκνότητα του επιφανειακού φορτίου είναι επίσης πολύ σημαντικοί παράμετροι που επηρεάζουν τη συμπεριφορά των λιποσωμάτων. Και οι δύο παράμετροι μπορούν να μεταβληθούν με την αλλαγή της λιπιδικής σύστασης των λιποσωμάτων. Η έλλειψη φορτίου επιφάνειας μπορεί να μειώσει τη φυσική σταθερότητα των SUV, αυξάνοντας τη συσσωμάτωσή τους. Επιπλέον τα ουδέτερα λιποσώματα δεν αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα, ενώ μεγάλο επιφανειακό φορτίο προάγει σημαντικά αλληλεπιδράσεις τέτοιου είδους Μεταβολική πορεία των λιποσωμάτων στον οργανισμό Συμβατικά Λιποσώματα Τα λιποσώματα προστατεύουν τα εγκλωβισμένα μόρια από αποσύνθεση καιμπορούν παθητικά να στοχεύσουν ιστούς ή όργανα που έχουν ασυνεχές ενδοθήλιο,όπως το συκώτι, ο σπλήνας, και ο μυελός των οστών. Στην ενδοφλέβια χορήγηση, τα λιποσώματα συλλαμβάνονται γρήγορα από το μονοπύρηνο σύστημα φαγοκύτταρων(mps) και αφαιρούνται από την κυκλοφορία του αίματος (Scherphof 1985). Αυτή ησυμπεριφορά έχει χρησιμοποιηθεί για την αποτελεσματική χορήγηση αντιπαρασιτικών και αντιμικροβιακών βιοδραστικών ουσιών για μολύνσεις που εντοπίζονται στο μονοπύρηνο φαγοκυτταρικό σύστημα. Εντούτοις, όταν είναι η περιοχή στόχευσης είναι μετά από το MPS,ηαποδοτική λήψη των λιποσωμάτων από τα μακροφάγα, και η κατά συνέπεια αφαίρεση τους από την κυκλοφορία, είναι ένα από τα κύρια μειονεκτήματα για τηνπιθανή χρήση των λιποσωμάτων ως συστήματα παράδοσης βιοδραστικών ουσιών.η σύνδεση των πρωτεϊνών του ορού (οψονίνες) είναι το πρώτο σήμα για τηναφαίρεση των λιποσωμάτων: το MPS δεν αναγνωρίζει τα ίδια τα 52

53 λιποσώματα αλλά,μάλλον, αναγνωρίζουν τις οψονίνες, που είναι συνδεδεμένες στην επιφάνεια τωνλιποσωμάτων. Ένας περιορισμένος αριθμός πιθανών πρωτεϊνών που έχουνεπιπτώσεις στη μοίρα των λιποσώματων έχει προσδιοριστεί, π.χ., ανοσοσφαιρίνες(patel 1992), β-2-γλυκοπρωτείνη, και β-2-macroglobulin. Συμπληρωματικά συστήματα περιλαμβάνουν ένα άλλο σημαντικό σύστημα ικανό να αναγνωρίσει ταλιποσώματα. Αυτό το σύστημα ενεργεί ξεκινώντας την λύση των μεμβρανών καιενισχύοντας την πρόσληψη από τα κύτταρα του MPS (μονοκύτταρα, μακροφάγα).η αστάθεια των λιποσωμάτων στο πλάσμα οφείλεται στην αλληλεπίδρασητους με τις υψηλής (HDL) και χαμηλής (LDL) πυκνότητας λιποπρωτεΐνες κάτι πουέχει ως αποτέλεσμα την γρήγορη απελευθέρωση της εγκλωβισμένης βιοδραστικήςουσίας στο πλάσμα. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των λιποσωμάτων, όπως το επιφανειακό φορτίο, η υδροφοβικότητα, το μέγεθος, η ρευστότητα, και η διευθέτηση των στοιβάδων τωνλιπιδίων, επηρεάζει τη σταθερότητά τους και τον τύπο πρωτεϊνών που τα δεσμεύουν (Chonnetal 1992, jaetal 1996). ι πρώτες προσπάθειες για να υπερνικηθούν ταπροβλήματα αυτά, στράφηκαν στα συστατικά της λιπιδικής μεμβράνης προκειμένουνα τροποποιηθεί η ρευστότητα των στοιβάδων. Οι Damen et Al (2005) κατέδειξανότι η ενσωμάτωση της χοληστερόλης (CHL), προκαλώντας το αυξανόμενοπακετάρισμα των φωσφολιπιδίων στην στοιβάδα, μειώνει τη μεταφορά τωνφωσφολιπιδίων από τις HDL. Ο Senior (1982) κατέδειξε ότι τα λιποσώματα απόφωσφατιδυλοχολινη (PC) με κορεσμένα λιπαρά οξέα (με υψηλή θερμοκρασίαμετάπτωσης) ή από σφιγγομυελίνη (SM) είναι σταθερότερα στο αίμα απόλιποσώματα που προετοιμάζονται από PC με ακόρεστα λιπαρά οξέα.διάφορες προσεγγίσεις έχουν λάβει επίσης υπόψη το μέγεθος και το φορτίοτων λιποσωμάτων, ώστε να μειωθεί η πρόσληψη από το MPS. Γενικά, τα μεγαλύτερα λιποσώματα αποβάλλονται από το αίμα γρηγορότερα από τα μικρότερα (17). Τα SUV έχουν χρόνο ημιζωής μεγαλύτερο από τα πολυστοιβαδιακά λιποσώματα (MLVs) ( nm). Αυτό φανερώνει ότι τα φαγοκύτταρα μπορούν να διακρίνουν τα μεγέθη των ξένων μορίων. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, είναι εμφανές ότι η σύνδεση των οψονινών 53

54 στα λιποσώματα εξαρτάται από το μέγεθός των λιποσωμάτων, και αυτό κατά συνέπεια δείχνει ότι η ενισχυμένη πρόσληψη των λιποσωμάτων από το MPS καθώς και από το ήπαρ είναι εξαρτώμενη από το μέγεθος Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας Η χρήση κορεσμένων φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης στα λιποσωμικάσυστήματα παράδοσης βιοδραστικών ουσιών δεν μπορεί πλήρως να υπερνικήσει την σύνδεσή τους με τις οψονίνες, και την συνεπώς μειωμένη λήψη λόγω του MPS. Επιπλέον, τα SUVs έχουν το μειονέκτημα του χαμηλού εγκλωβισμού υδατικού όγκου, και η χρήση φορτισμένων λιποσωμάτων μπορεί να είναι τοξική. Αρκετές διαφορετικές στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί για να ξεπεραστούν αυτές οι δυσκολίες με την τοποθέτηση στην επιφάνεια των λιποσωμάτων αδρανών χημικά μορίων για ναδιαμορφωθεί ένα στερεοχημικό εμπόδιο. Η πρώτη στρατηγική που μελετήθηκε ήταν η προετοιμασία λιποσωμάτων πουμιμούνται την μεμβράνη των ερυθροκυττάρων σε αυτήν την περίπτωση η επιφάνεια λιποσωμάτων τροποποιήθηκε με γαγγλιοζίτες και παράγωγα του σιαλικού οξέος,όπως το monosialoganglioside (GM1). Τo επόμενο βήμα ήταν να αυξηθεί η υδροφιλικότητα της επιφάνειας με τηχρήση υδρόφιλων πολυμερών. Ο μηχανισμός με τον οποίο η σταθεροποίηση των λιποσωμάτων αυξάνει τη μακροζωία τους στην κυκλοφορία είναι εκτενώς συζητημένος (Drummond et al 1999). Η βασική ιδέα είναι ότι ένα υδρόφιλο πολυμερές ή γλυκολιπίδιο, όπως το PEG ή το GM1, που έχει μια εύκαμπτη αλυσίδα που καταλαμβάνει το διάστημα αμέσωςμετά την επιφάνεια των λιποσωμάτων (periliposomal layer), τείνει να αποκλείσειάλλα μακρομόρια από αυτό το διάστημα. Συνεπώς, η πρόσβαση και η δέσμευση τωνοψονινών του ορού του αίματος στην επιφάνεια των λιποσωμάτων εμποδίζεται, καιέτσι οι αλληλεπιδράσεις των μακρόφαγων του MPS με τέτοια λιποσώματα είναι μειωμένη. Μεταξύ των διαφορετικών πολυμερών που ερευνώνται στην προσπάθεια για να βελτιώσουν το χρόνο κυκλοφορίας αίματος των λιποσωμάτων, η πολύ- αιθυλενογλυκόλη (PEG) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως. Μπορεί να ενσωματωθεί στην λιποσωμική επιφάνεια με 54

55 πολλούς διαφορετικούς τρόπους, αλλά η ευρύτατα χρησιμοποιημένη μέθοδος αυτή τη στιγμή είναι η σύνδεση του πολυμερούς στην μεμβράνη μέσω ενός διασυνδεμένου λιπιδίου (π.χ.,peg distearoylphosphatidylethanolamine[ DSPE ] (Allen et al ) Μακροχρόνια σταθερότητα λιποσωμάτων με τη μέθοδο της Λυοφιλοποίησης (Freeze-drying / lyophilization) Τα τελευταία χρόνια, η επίτευξη μακρόχρονης σταθερότητας των βιολογικώνσυστημάτων έχει αποτελέσει στόχο τόσο της βιομηχανίας τροφίμων όσο και των φαρμακευτικών και βιοϊατρικών βιομηχανιών. Η αποφυγή της αναγκαιότητας για κατάψυξη οδηγεί σε δραστική μείωση του κόστους παραγωγής και αποθήκευσης. Η ξήρανση των λιποσωμάτων έχει αποδειχθεί ότι μιμείται τις βιολογικέςμεμβράνες υπό συνθήκες χαμηλού περιεχομένου σε ύδωρ καθώς επίσης και ως μια μέθοδος βελτίωσης της σταθερότητας των λιποσωμάτων που χρησιμοποιούνται ως φορείς φαρμάκων. Στις περισσότερες φαρμακευτικές μελέτες, η λυοφιλοποίηση χρησιμοποιείται λόγω του ότι το προϊόν που λαμβάνεται είναι πορώδες και μπορεί να ανασυσταθεί εύκολα. H λυοφιλοποίηση αποτελεί μέθοδο ξήρανσης κατά την οποία η υγρασία που περιέχεται σε ένα υλικό μετατρέπεται σε πάγο (στερεό) ο οποίος στη συνέχεια απομακρύνεται με εξάχνωση. Συνοπτικά, η λυοφιλοποίηση περιλαμβάνει τα εξής στάδια: I. Κατάψυξη του υλικού (-10 έως 40οC) II. Ελάττωση της πίεσης κάτω από το τριπλό σημείο του νερού ( μ) III. Προσεκτική θέρμανση του υλικού (παροχή λανθάνουσας θερμότητας εξάχνωσης του πάγου) IV. Συνεχή απομάκρυνση των υδρατμών που παράγονται (ώστε να διατηρείται θετική διαφορά πίεσης των υδρατμών στην επιφάνεια από τη μερική πίεση των υδρατμών στο 55

56 περιβάλλον του υλικού: Αυτή η διαφορά πίεσης είναι η κινητήρια δύναμη της εξάχνωσης) Ένας λυοφιλοποιητής αποτελείται από τα ακόλουθα τμήματα: Θάλαμο για κατάψυξη-εξάχνωση Πηγή κενού (συνήθως αντλία ελαίου) Πηγή θερμότητας Σύστημα απομάκρυνσης υδρατμών Μεταξύ των υλικών τα οποία λυοφιλοποιούνται προκειμένου να διατηρηθούν είναι ο ορός αίματος, το πλάσμα, τα εμβόλια, οι ορμόνες, τα αντιβιοτικά και τα λιποσώματα. Συγκεκριμένα, η λυοφιλοποίηση έχει προταθεί ως η ιδανική τεχνική προκειμένου για μακρόχρονη αποθήκευση λιποσωμάτων. Ένα από τα προβλήματα που παρουσιάζεται είναι ότι τα λιποσώματα μπορεί να καταστραφούν σωματιδιακά στα στάδια κατάψυξης ή/και αφυδάτωσης.προκειμένου να γίνει αντιληπτό πώς εμφανίζεται αυτή η ζημιά και πώς μπορεί να ελαχιστοποιηθεί, είναι απαραίτητο να περιγράψουμε ολόκληρη τη διαδικασία τη λυοφιλοποίησης. Κατ αρχήν, η κατάψυξη ενός δείγματος που πρόκειται να αφυδατωθεί στη συνέχεια δε διαφέρει από την κατάψυξη δείγματος που πρόκειται να αποθηκευτεί σε χαμηλή θερμοκρασία. Ωστόσο, πρέπει να ελεγχθούν διάφορες παράμετροι κατά τηνκατάψυξη ώστε να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου ο οποίος προκαλεί προβλήματαστη διαδικασία αφυδάτωσης. Το λυοφιλοποιημένο προϊόν είναι πορώδες στερεό ίδιου όγκου με το αρχικό προϊόν. Οι πόροι δημιουργούνται από τα κενά που αφήνει ο πάγος και από τη διέλευση των υδρατμών από τη μεσεπιφάνειακατεψυχθέντος-ξηρανθέντος προϊόντος.επίσης, εμφανίζει ευθρυπτότητα και υγροσκοπικότητα. Το λυοφιλοποιημένο προϊόν επαναδιαλύεται ή επαναιωρείται εύκολα με την προσθήκη νερού με μια διαδικασίαπου καλείται ανασύσταση. 56

57 2. Νόσος Αλτζχάιμερ (Αlzheimer) Αβ πεπτίδια 2.1 Αιματεγκεφαλικός Φραγμός (ΑΕΦ) Ο εγκέφαλος είναι καλά προστατευμένος και δυναμικά ρυθμισμένος για να παρέχει ένα καταφύγιογια το κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ). Υπάρχουν αρκετά μονοπάτια που επιτρέπουν την είσοδοστο εγκεφαλικού παρέγχυμα, τα δύο πιο σημαντικά είναι η κυκλοφορία του αίματος και τουεγκεφαλονωτιαίο υγρού (ENY).Η κύρια λειτουργία του ΑΕΦ είναι η προστασία του εγκεφάλου από τις μεταβολές των επιπέδων των ιόντων, των αμινοξέων, των πεπτιδίων και άλλων ουσιών στο αίμα, διαφυλάσσοντας έτσι τηνομαλή λειτουργία των νευρώνων. Ο ΑΕΦ εντοπίζεται στα εγκεφαλικά τριχοειδή αγγεία και αποτελείτο ενδιάμεσο μεταξύ του αίματος και του εγκεφαλικού ιστού.ένα χαρακτηριστικό του ΑΕΦ είναι η χαμηλή και επιλεκτική διαπερατότητα του, η οποία αποδίδεται στα μοναδικά βιολογικά του χαρακτηριστικά π.χ την παρουσία του σφιχτών συνδέσεων μεταξύ γειτονικών ενδοθηλιακών κυττάρων ή την έκφραση των διαφόρων μεταφορέων.αυτά τα χαρακτηριστικά προσδίδουν στον ΑΕΦ τις πολλαπλές λειτουργίες του, όπως το ότι αποτελεί ένα φυσικό εμπόδιο ( TJ ), ένα φράγμα μεταφοράς ( P-gp ), ένα μεταβολικό ή ενζυμικόφράγμα (στο κυτταρόπλασμα των ενδοθηλιακών κυττάρων πριν από τη διείσδυση του εγκεφάλουεντοπίζονται ένζυμα αποικοδόμησης ( εξω- και ενδο- ένζυμα), καθώς και ένα ανοσολογικό εμπόδιο (16). 2.2 Νόσος Αλτζχάιμερ (Αlzheimer) Η Νόσος Alzheimer (ΝΑ) είναι η πιο συχνή αιτία νευροεκφυλιστικής άνοιας στους ηλικιωμένους, και χαρακτηρίζεται από προοδευτική εξασθένηση της γνωστικής ικανότητας και από τη χαρακτηριστική παθολογία της. Ο AloisAlzheimer ήταν ο πρώτος που ανέφερε την περίπτωση της νευροεκφυλιστικής άνοιας με τα ιστολογικά ευρήματα 57

58 των γεροντικών πλακών και νευροϊνιδιακώνδομών. Η νόσος διαιρείται σε δύο κατηγορίες βάση της ηλικίας έναρξης της. Η ΝΑ πρώιμης-μορφής (earlyonsetfamilialalzheimer sdisease, FAD) είναι εξαιρετικά σπάνια, αποτελώντας μόνο το 2 % όλων των περιπτώσεων. Εμφανίζεται στις ηλικίες μεταξύ 30 και 60 ετών, με τις περισσότερες από τις μισές και πλέον περιπτώσεις των ασθενών να έχουν γενετική προδιάθεση. Η όψιμη μορφή της ΝΑ (late-onsetalzheimer sdisease, LAD) αποτελεί την πιο κοινή μορφή της νόσου, έχει κάποια γενετική προδιάθεση, αλλά φέρει διάφορους πολυμορφισμούςγονιδίων, μερικοί εκ των οποίων δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί, και οι οποίοι, είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό, αυξάνουν την πιθανότητα εμφάνισης της νόσου. Η γενετική προδιάθεση της όψιμης μορφής της ΝΑ υποστηρίζεται από τη διαπίστωση ότι η ηλικία έναρξης της νόσου είναι σαφώς πιο μεταβλητή για τα μηπανομοιότυπα δίδυμα (ετεροζυγωτικά) απ ότι για τα πανομοιότυπα δίδυμα (ομοζυγωτικά), υποδηλώνοντας έτσι ότι το γενετικό υπόβαθρο μπορεί να επηρεάσει έντονα την ηλικία έναρξης της νόσου. Οι γενετικοί παράγοντες που προδιαθέτουν στην ΝΑ είναι δύσκολο να προσδιοριστούν επειδή η κληρονομικότητά τους δεν προσδίδει το φαινότυπο της νόσου, απλά διαμορφώνει την ηλικία έναρξης της. Επειδή δεν υπάρχει σήμερα θεραπεία για την ΝΑ, η πρόκληση για το εγγύς 3 μέλλον θα είναι η ανάπτυξη νέων θεραπειών και θεραπευτικών στόχων για την πρόληψη και τη θεραπεία της ασθένειας, καθώς επίσης και νέων διαγνωστικών τεχνικών για την έγκαιρη και αξιόπιστη διάγνωσή της Χαρακτηριστικά της Νόσου Alzheimer Οι βάσεις για τη σημερινή κατανόηση της ΝΑ τέθηκαν τα τέλη της δεκαετίας του '60 με αρχές του'70, όταν ερευνητές στην προσπάθεια τους να συσχετίσουν τις διαταραχές «συμπεριφοράς» πουπαρατήρησαν σε ασθενείς, με καθοριστικά ιστολογικά παθολογικά ευρήματα, εξέτασαν τους εγκεφάλους τους. Πολλοί ερευνητές πιστεύουν ότι το κρίσιμο στηνπαθολογία της ασθένειας είναι η απώλεια των συνάψεων, σε συνδυασμό με τη συρρίκνωση τωννευρώνων. Τα νευροπαθολογοανατομικά 58

59 χαρακτηριστικά της ασθένειας είναι οι νευριτικές πλάκεςκαι οι νευροϊνιδιακές αλλοιώσεις, αν και αυτές οι βλάβες μπορούν να υπάρχουν και σε άλλες νευροεκφυλιστικές διαταραχές και σε κλινικά φυσιολογικά άτομα. Στη ΝΑπαρατηρείται σημαντική νευρωνική απώλεια, που υπερέχει στις στιβάδες του εγκεφαλικού φλοιού,κυρίως του μετωπιαίου και κροταφικού και ιδιαιτέρως στον ενδορινικό φλοιό, όπου εμφανίζεταινωρίς στην πορεία εξέλιξης της νόσου. Διάφοροι αιτιολογικοί παράγοντες έχουν προταθεί για τωνεκφυλισμό των νευρώνων όπως οι γεροντικές ή νευριτικές πλάκες, η δυσχωρική αγγειοπάθειακαι η κόκκοι-κενοτοπιώδης εκφύλιση.μία από τις πιο σημαντικές και μελετημένες αλλοιώσεις είναι οι Νευριτικές Πλάκες και η εμπλοκή της Αβ πρωτεΐνης στην ΝΑ η οποία εξετάζεται στη παρούσα εργασία. 2.3Αβ πεπτίδια και νευριτικές πλάκες Σχηματισμός Αβ πεπτιδίων Οι πλάκες αμυλοειδούς (Αβ) αποτελούνται συνήθως από πεπτίδια με αμινοξέα. Αυτά τα πεπτίδια είναι πρωτεολυτικά θραύσματα που λαμβάνονται με τη δράση των ενζύμων β και γσεκρετασών (μεμβρανικά ένζυμα) στην πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς (ΑΡΡ). Οι ΑΡΡπρωτείνες μπορούν να υποβληθούν σε μια ποικιλία από πρωτεολυτικές διασπάσεις πουδιεξάγονται από τα ένζυμα ή σύμπλοκα ενζύμων με δράση α-, β- και γ-σεκρετάσης που οδηγούνστο σχηματισμό μεγάλων διαλυτών θραυσμάτων και μεμβρανικών C-τερματικών θραυσμάτων. Τοαμυλοειδογενές μονοπάτι ξεκινά με την πέψημε β-σεκρετάση και στη συνέχεια με γ-σεκρετάση παράγοντας το β διαλυτό κλάσμαapp (sappβ), ένα τοξικό Αβ πεπτίδιο και έναενδοκυτταρικό κλάσμα (ΑΙCD). Το αμυλοειδές βπεπτίδιο είτε αποικοδομείται είτε συσσωρεύεται δημιουργώντας τις πλάκεςαμυλοειδούς. 59

60 Εικόνα 13:Ένα μοντέλο που δείχνει την ακολουθία συναρμολόγησης και τις πιθανές δομές των Αβ-42 μονομερών, ολιγομερών με χαμήλο μοριακό βάρος, ολιγομερών με υψηλό μοριακό βάρος, πρωτοϊνίδια / ινίδια(απο I. A. Mastrangelo, M. Ahmed, T. Sato2, W. Liu, C. Wang, P. Hough and S.. Smith J. Mol. Biol, Vol. 358, p. 106, 2006.) Τα τελευταία χρόνια έχουν μελετηθεί αρκετά νανοσωματιδιακά συστήματα προκειμένου να επιτευχθεί αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας και της ικανότητας των διαφόρων θεραπευτικώνπαραγόντων στη ΝΑ. Οι δύο κύριες πηγές της νευροτοξικότητας στη ΝΑ είναι τα Αβ ολιγομερή καιοι ελεύθερες ρίζες. Κάποιες προσεγγίσεις βασισμένες στη νανοτεχνολογία στοχεύουν στηνπροστασία των νευρώνων από τα τοξικά Αβ είδη είτε μέσω της παρεμπόδισης σχηματισμούολιγομερών ή/και της συσσώρευσης των Αβ ολιγομερών. Άλλες προσεγγίσεις στοχεύουν στην προστασία των νευρώνων από το οξειδωτικό στρες των ελεύθερων ριζών. Διάφοροι τύποι πολυμερικών νανοσωματιδίων στοχεύουν στα Αβ πεπτίδια είτε άμεσα με αναστολή στη συσσωμάτωσής τους είτε έμμεσα μέσω της νευροπροστατευτικής τους δράσης. 60

61 3. Μέθοδοι σύνθεσης 2-βενζοθειαζολυλ-παραγώγων Τα 2-βενζοθειαζολυλ-παράγωγα είναι σηµαντικά συστατικά φαρµάκων και παρουσιάζουν μεγάλο φαρμακευτικό και βιολογικό ενδιαφέρον.παράγωγα των 2- βενζοθειαζολυλ-ενώσεων παρουσιάζουν υψηλή συγγένεια για τα Aβ πεπτίδια και έχει δειχθεί ότι εμπλέκονται κατά τη συσσωμάτωση των Aβ αμυλοειδών,προκαλώντας παρεμπόδιση της συσσωμάτωσής τους ή/και αναστολή αυτής, γεγονός στο οποίο βασίζεται και η παρούσα έρευνα. (19) ιάφορες μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για τη σύνθεση 2-βενζοθειαζολυλ-ενώσεων σε διάλυµα. Παραδείγματα αυτών φαίνονται στηνεικόνα14, όπου παρουσιάζονται τρείς διαφορετικές μέθοδοι σύνθεσης υποκατεστηµένων 2-αµινο-βενζοθειαζολίων. Εικόνα14:Μέθοδοι σύνθεσης υποκατεστηµένων 2-αµινο-βενζοθειαζολίων Η μέθοδος Α πρόκειται για µία αντίδραση σε ένα βήµα, της ανιλίνης 1 µε Br2 και ισοθειοκυανίδιο, το οποίο σχηματίζεται από KSCN σε οξικό οξύ. Συντίθενται έτσι τα προϊόντα 3 σε μέτριες αποδόσεις. 61

62 Ένας άλλος κλασικός τρόπος σύνθεσης βενζοθειαζολυλ-παραγώγων είναι η κυκλοποίηση φαινυλθειουριών 2 µ ε Br2 σε χλωροφόρµιο (Σχήµα 1, Μέθοδος Β ), προς τα αντίστοιχα 2-αµινο-βενζοθειαζόλια ιωδο-ανιλίνες κυκλοποιούνται προς τα αντίστοιχα 2-αµινο-βενζοθειαζόλια µε αντίδραση αυτών µε θειουρία και Ni(Et3P)4 (Μέθοδος Γ) 3. Η περισσότερο χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τη σύνθεση 2-βενζοθειαζολίων 7 είναι η μέθοδος Α τηςεικόνας Οι Ν-ακυλo-ανιλίνες 5 μετατρέπονται στις αντίστοιχες Ν- θειοακυλo-ανιλίνες 6 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lawesson s σε εξαµεθυλφωσφοαµίδιο (HMPA) ή χλωροβενζόλιο. Στη συνέχεια ακολουθεί οξείδωση του 6 στο 2-βενζοθειαζόλιο 7 (σύνθεση Jacobsen) 4,5,6,7. Εναλλακτικά Ν-ακυλ-2-αλογονοανιλίνες 8 μετατρέπονται στις αντίστοιχες Ν-θειοακυλ-2-αλογονο- ανιλίνες 9 οι οποίες στη συνέχεια κυκλοποιούνται µε NaH σε Ν-µεθυλπυρολιδόνη (NMP) (Μέθοδος Β) 7,8,9. Στη μέθοδο Γ επεξεργασία 2-αµινοθειοφαινόλης 10 µε τα οξέα 11α, νιτρίλια 11b και εστέρες 11c σε πυροφωσφορικό οξύ (PPA) στους C, οδηγεί στη σύνθεση των αντίστοιχων 2-βενζοθειαζολίων 7,10,11. Όταν η αµινοθειόλη 10 ή το 11 περιέχουν ευαίσθητες σε ισχυρά οξέα οµάδες, χρησιμοποιείται πυροφωσφορικός εστέρας (PPE) για την κυκλοποίηση και το σχηματισμό του 2- βενζοθειαζολίου 7. (18) 62

63 Εικόνα 15:Μέθοδοι σύνθεσης υποκατεστηµένων 2-βενζοθειαζολίων Σύζευξη δις-2-αµινοθειοφαινόλης µε ακυλο χλωρίδια και αναγωγή του προϊόντος 14 που προκύπτει µε SnCl2.2H2, οδηγεί στο σχηµατισµό του 7 (Μέθοδος ). 6,12,13 Η αντίδραση αλδεϋδών µε τη 2-αµινοθειοφαινόλη 10 (Μέθοδος Ε), παρουσία οξειδωτικών µέσων 14 ή οξικού οξέως και ισχυρή θέρµανση, 15 οδηγεί στο σχηµατισµό των 2-βενζοθειαζολίων 7. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η σύνθεση νέων λιπιδικών 2-βενζοθειαζολυλπαραγώγων και η ενσωμάτωσή τους σε λιποσώματα (λιπιδική διπλοστοιβάδα), με τελικό στόχο την παρασκευή λιποσωμάτων τα οποία φέρουν την2-βενζοθειαζολυλομάδα στην επιφάνειά τους.τα νέα αυτά λιποσώματα, πρόκειται, σε επόμενο στάδιο, να μελετηθούν ως προς την αλληλεπίδρασή τους με Aβ αμυλοειδή πεπτίδια (για τα 63

64 οποία έχει δειχθεί ότι η συσσωμάτωσή τους προς διµερή, τριµερή, ολιγοµερή νηµατίδια και ινώδες συσσωµατώµαταεμπλέκεται στην ανάπτυξη της νόσου Αλτσχάιμερ) και θα διερευνηθεί η δράση τους ως προς την καθυστέρησης της συσσωμάτωσης των Αβ πεπτιδίων(ή ακόμα και η αποσσυσωμάτωσήτους). ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 4.1 Λιποσώματα Συσκευέςκαιόργανα 1. ΑκίδαΥπερήχων (Probe Sonicator, Sonics Vibra Cell) 2. Ηλεκτρονικόςζυγόςακριβείας (MettlerAE 166, Deltarange) 3. ΛουτρόΥπερήχων (Branson, Bransonic ultrasonic 2510) 4. Μαγνητικόςαναδευτήρας (IKAMAGRH JANKE &KUNKEL) 5. Μηχανικός αναδευτήρας - vortex (A-100 Micrel) 6. ΠεριστρεφόμενοςEξατμιστήρας RotaryEvaporator (BÜCHI RE 111) 7. ph-μετρο (WTW, ph 522) 8. Συσκευήλυοφιλοποίησης (FREEZE DRYER LABCNC 4.5) 9. Yδατόλουτρο ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας (JULAB, FS 18) 10. Φασματοφωτόμετρο - Spectrophotometer UV-VIS (Shimadzu UV 1205) 11. Φυγόκεντρος (Biofuge 28 RS, HERAEUS SEPATECH) 12. Zeta-sizer δυναμικήσκέδασηφωτός (Malvern Nano-Zs, Malvern Instrument,UK) Υλικά Λιπίδια σε μορφή σκόνης: 64

65 1. Χοληστερόλη (CHL): (Lipoid) 2. Διπαλμιτοϋλογλυκεροφωσφοχολίνη(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphocholine DPPC) (AvantiPolarLipids) Διαλύματα αυτών των λιπιδίων προετοιμάστηκαν με διάλυσή τους σεχλωροφόρμιο:μεθανόλη 8/1 κατ όγκο στις ανάλογες τελικές συγκεντρώσεις. Ταδιαλύματα όσο και οι κόνεις των λιπιδίων φυλάσσονται στην κατάψυξη στους -20οC Διαλύματα Ισότονο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) ph 7.4 Ζυγίζονται 8g NaCl, 0,2g KCl, 1,44g Na2HP4(άνυδρο), 0,24g KH2P4 και 0,2g NaN3 και μεταφέρονται σε 1L απεσταγμένο νερό. Στην συνέχεια ρυθμίζεται το ph σε 7.4 με στάγδηνπροσθήκη NaH ή HCl και συμπληρώνουμε με απεσταγμένο νερό έως τα 1L. Τέλοςρυθμίζουμε την ωσμωτικότητα. Το PBS που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή και τον καθαρισμό των λιποσωμάτων περιείχε νατραζίδιο (NaN3). 65

66 4.2 Οργανική σύνθεση ΜΕΡΟΣΑ Σύνθεση της3-benzyl-sn-glycerol. 1. NaH DCM/H2/TFA H H H 2. Br Σχήμα 1: Σύνθεση της3-benzyl-sn-glycerol. Ζυγίζονται 1,271grNaH(53 mmol)και τοποθετούνται σε σφαιρική φιάλη. Σε αυτά προστίθενται 90mlTHF και 5 gr (37,8 mmol) 1,2--isopropylidene-sn-glycerolκαι το μίγμα αναδεύεται για 30 λεπτά σε rt. Ακολουθεί η προσθήκη 5,4 ml (45,4 mmol) βενζυλοβρωμιδίου(σε 3 δόσεις ανά 30 λεπτά). Η αντίδραση αφήνεται overnight σε θερμοκρασία δωματίου και την επομένη προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης 40 ml 10% Na2C3. Ακολουθεί ανάδευση του μίγματος για περίπου 30 min σε rt και στη συνέχεια το μίγμα της αντίδρασης εκχυλίζεται σε Et2. Η οργανική φάση παραλαμβάνεται και πλένεται με 3xH2. Στη συνέχεια, παραλαμβάνεται η οργανική φάση, η οποία συμπυκνώνεται μέχρι λάδι και ακολουθεί απευθείας υδρόλυση του προϊόντος με 20ml DCM/H2/TFA (10:1:2). Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύεται για 1/2 ώρα σε rt και ακολουθεί εκχύλιση του μίγματος της αντίδρασης σε Hex και 10% Na2C3. Παραλαμβάνεται η υδατική φάση η οποία πλένεται με 2xHex. Στη συνέχεια προστίθεται EtAc και η υδατική φάση κορένεται με στερεό NaCl (ή brine) οπότε και παρατηρείται μεταφορά το προϊόντος από την υδατική φάση στην οργανική φάση. Η οργανική φάση παραλαμβάνεται, στεγνώνεται με MgS4, και ακολουθεί συμπύκνωση 66

67 του διηθήματος. Το προϊόν παραλαμβάνεται σε μορφή λαδιού και ξηραίνεται σε MgS4 μέχρι σταθερού βάρους (6.49 gr).απόδοση: 94% H H 1H-NMR (CDCL3): (5H, m, Ar), 4.54 (2H, s, H4), (1H, m, H2), (2H, 2dd, H1, H1 ), (2H, 2dd, H3, Η3 ) Σύνθεσητου3-benzyl-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol H H H DIC/DMAP Σχήμα 2 :Σύνθεση του 3-benzyl-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol Ζυγίζονται gr ( mmol) palmiticacid και3.26 mg(26.72 mmol) DMAP και διαλύονται σε 15mlDCM(απαιτείται επιπλέον η προσθήκη 4mlDMFκαι ελαφριά θέρμανση). Στο διάλυμα προστίθενται4,18 mldic (26.72 mmol) και το μίγμα αναδεύεται για 5 λεπτά σε rt. Στη συνέχεια προστίθενται τα 2.108gr (11.568mmol) 3- benzyl-sn-glycerolκαι το μίγμα της αντίδρασης αναδεύεται overnight σε rt. Την επομένη απομακρύνεται μέσω διήθησης η καταβυθισμένη 1,3-διισοπροπυλo-ουρία. Το ίζημα (1,3-διισοπροπυλo-ουρία) πλένεται με 2xDCM, παραλαμβάνεται και εκχυλίζεται με10% citricacid. Η οργανική φάση παραλαμβάνεται και πλένεται με 3xH2. Στη συνέχεια 67

68 στεγνώνεται με MgS4 και ακολουθεί συμπύκνωσβ μέχρι ελαίου. Το προϊόν παραλαμβάνεται κατόπιν κρυστάλλωσης, πλύσεων και ανακρυστάλλωσής του σε άνυδρη EtH. Ακολουθεί ξήρανσή του σε MgS4 μέχρι σταθερού βάρους.ελήφθησαν 6.1grπροϊόντος.Απόδοση: 80 % ' 1 2' 3' 3 4' 5' 5 6' 7' 7 8' 9' , 17' 11' 13' 15' 16' ' 12' 14' CH H-NMR (CDCL3): (5H, m, Ar), (1H, m, H18), (2H, 2d, H20), (2H, 2dd, H17,17 ), (2H, d, H19), (4H, 2t, H15,15 ), (4H, m, H14,14 ), (53H, s, H2-13, H2-13 ), (6H, t, H1,1 ) Σύνθεση του 1,2-palmitoyl-sn-glycerol H 2 Pd-C H Σχήμα 3 : Σύνθεση του 1,2-palmitoyl-sn-glycerol Ζυγίζονται 2.3gr (3.49 mmol) 3-benzyl-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol και διαλύονται σε 20 ml EtAc(και λίγο MeH)και μεταφέρονται σε σφαιρική φιάλη. Στη συνέχεια προστίθενται 230 mg Pd-C (10% κ.β.) και ακολουθεί διαβίβαση Η2 και ανάδευση του μίγματος της αντίδρασης overnight.ακολουθεί απομάκρυνση του Pd-Cκαι συμπύκνωση του διαλύματος της αντίδρασης. Το προϊόν παραλαμβάνεται ως λάδι, το οποίο στερεοποιείται και παραλαμβάνεται κατόπιν διήθησης και πλύσεως με ακετόνη. Το 68

69 λευκό στερεό τοποθετείται σε ξηραντήρα μέχρι σταθερού βάρους. Ελήφθησαν: 1.79gπροϊόντος (απόδοση: 90 %) ' 1 3' 3 5' 5 7' 7 9' 9 11' 11 13' ' 16' 17, 17' 18 2' 4' 6' 8' 10' 12' 14' 19 H 1 H-NMR (CDCL3): (1H, m, H18), (2H, 2dd, H17,17 ), (2H, d, H19), (4H, 2t, H15,15 ), (4H, m, H14,14 ), (55H, s, H2-13, H2-13 ), (6H, t, H1,1 ) Σύνθεσητου1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol-3--succinic acid monoester H DMAP H Σχήμα4:Σύνθεσητου1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol-3--succinic acid monoester 69

70 Ζυγίζονται gr(10.245mmol) succunicanhydrideκαι gr (2.05 mmol)dmap και τοποθετούνται σε σφαιρική φιάλη. Διαλύονται με προσθήκη 16mlDCMκαι στη συνέχεια ακολουθεί προσθήκη gr(2.049 mmol)1,2-palmitoyl-sn-glycerol.η αντίδραση αφήνεται overnight και ακολουθεί εκχύλιση με 10% citricacid και στη συνέχεια πλύσεις της οργανικής φάσης με 3xH2. Η οργανική φάση παραλαμβάνεται, στεγνώνεται με MgS4, και ακολουθεί συμπύκνωση του διηθήματος μέχρι λάδι. Ακολουθεί κρυστάλλωση, πλύσεις και ανακρυστάλλωση του προϊόντος με άνυδρη EtH).Ελήφθησαν 1.36 gr προϊόντος (απόδοση: 96%). 1' 1 2' 2 3' 3 4' 4 5' 5 6' 6 7' 7 8' ' 11' 13' 15' 16' 18 10' 12' 14' 19, 19' 17, 17' H 1 H-NMR (CDCL3): (1H, m, H18), & (4H, 4dd,H17,17,19,19 ), (4H, m, H21, H22), (4H,2t, H15,15 ), (4H, m, H14,14 ), (53H, s, H2-13, H2-13 ), (6H, t, H1,1 ) ΜΕΡΟΣΒ Bis(2-aminophenyl) disulfide NH 2 NH 2 2 SH H 2 2 S S NH 2 Σχήμα 5: Σύνθεση τουbis(2-aminophenyl) disulfide Σε σφαιρική φιάλη ογκομετρούνται 20 ml (187 mmol)2-αμινοθειοφαινόλης και προστίθενται σταδιακά ανά 1 ml συνολικά 7ml Η2Ο2 35%. Κατά την ολοκλήρωση της προσθήκης προστίθενται 150 mlet2και εκχύλιση του μίγματος με 3xH2, 3xNaH, 3xH2.H οργανική φάση παραλαμβάνετε, στεγνώνεται με MgS4και ακολουθεί συμπύκνωση του διηθήματος, μέχρι στερεού. Το ληφθέν στερεό ανακρυσταλλώνεται 70

71 με 30 mlhex και παραλαμβάνεται με διήθηση κιτρινωπό κρυσταλλικό στερεό το οποίο ξηραίνεται μέχρι σταθερού βάρους (21.4gr). Απόδοση: 92% 1 H-NMR (CDCL3): (4H, m), (2H, d), (2H, t), (2H, ds, NH2) ΜΕΡΟΣ Γ Σύνθεση του lipid-bth CH 2 NH 2 lipid-ch CH H 2 C H + S S NH 2 1. DIC 2. NaBH 4 / AcH CH 2 CH lipid-bth H 2 C N S Σχήμα 6:Σύνθεση του lipid-bth. Αρχικά ζυγίζονται 532,07 mgr (0.78 mmol) παλμιτικού οξέως καιδιαλύονται σε 7.5 mldcm.σε αυτά προστίθενται τα μl (0.857 mmol) DICτο μίγμα της αντίδρασης αναδεύεται στους 4oCγια 15 λεπτά. Ακολουθεί η προσθήκη DMAPκαι Bis(2-aminophenyl) disulfide(διαλυμένη σε 500μlDCM)και το μίγμα της αντίδρασης αναδεύεται για επιπλέον 2ώρες στο ψυγείο και στη συνέχεια overnightσε rt. Ακολουθεί εκχύλιση τουμίγματος της αντίδρασης με 15% citricacid (x1) και H2 (x3). Παραλαμβάνεται η οργανική φάση, στεγνώνεται με Na2S4και στη συνέχεια συμπυκνώνεται έως λάδι. Το προιόν της αντίδρασης διαλύεται σε6 mlthf/meh 5:1 και στη συνέχεια 71

72 προστίθενται34mg(0.90mmol) NaBH4υπό συνεχή διαβίβαση Ν2 και το μίγμα της αναγωγής αναδεύεται σε rtγια 3 ώρες.ακολουθεί προσθήκη 515μlAcH (9.0mmol) και συνεχίζεται η ανάδευση (υπόn2) για επιπλέον 1 ώρα. Την επομένη το μίγμα της αντίδρασης συμπυκνώνεται μέχρι να γίνει λάδικαι προστίθεται σε αυτό άνυδρη EtH(περίπου 500μl) οπότε και δημιουργείται λευκό στερεό, το οποίο ανακρυσταλλώνεται με άνυδρη EtHή/και AcCN. Το τελικό λευκό προϊόν ξηραίνεται μέχρι σταθερούς βάρους. Απόδοση: 55 %. 1' 1 2' 2 3' 3 4' 4 5' 5 6' 6 7' 7 8' ' 11' 13' 15' 16' 18 10' 12' 14' 19, 19' 17, 17' N S 1 H-NMR (CDCL3): (1H, d, H-Ar), (1H, d, H-Ar), (1H, t, H-Ar), (1H, t, H-Ar), (1H, m, H18), & (4H, 4dd,H17,17,19,19 ), (2H, t, H22), (2H, t, H21), (4H,2t, H15,15 ), (4H, m, H14,14 ), (58H, s, H2-13, H2-13 ), (6H, t, H1,1 ). 13 C-NMR (CDCL3): 173.5, 173 (C16, 20), (C23), 126, 125, 122.5, 121.5, 115 (C-Ar), 69 (C18), 63, 62 (C17, 19), 34 (C15, 15 ), 32.5 (C21), 32 (C22), (C3-13, C3-13 ), 25 (C14, 14 ), 22.5 (C2, 2 ), 14 (C1, 1 ). 72

73 Σχήμα 7:ESI-MS τουlipid-bth. Θεωρητικό m/z = 409,61, Πειραματικό m/z = 278,4(Απόδοση=67,97%) 4.3 Μέθοδοι Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας(tlc) Για την παρακολούθηση της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε η χρωματογραφία λεπτήςστοιβάδας(tlc).σε αυτή τη χρωματογραφική τεχνική χρησιμοπο ιούνταιγυάλινες ή Η στατική φάσησυνήθωςείναιγέληπυριτίουήλιγότεροσυχνάοξείδιοαργιλίου,κυτταρίνηκτλ.το διάλ υμα του υπό εξέταση δείγματος τοποθετείταιυπό τη μορφή κηλίδας στην αρχή της πλάκας σε απόσταση περίπου 2 cm. Στη συνέχεια η πλάκατοποθετείται όρθια εντός θαλάμου στονοποίο έχει ήδη εισαχθεί κατάλληλο σύστημα διαλυτών σε ύψος κάτω από αυτό της κηλίδας. Οι διαλύτες πρέπει ναέχουν τοποθετηθεί εντός του θαλάμου τουλάχιστον 10 min πριν την τοποθέτηση της πλάκας ώστε να έχει κορεσθεί ο υπερκείμενος χώρος από τους ατμούς 73

74 τωνδιαλυτών. Ακολούθως ο διαλύτης αφήνεται να ανέλθει με τη βοήθεια τριχοειδών φαινομένων(περίπου min, ανάλογα μετούψος της πλάκας)μέχριτομέτωποτουδιαλύτηναφθάσειλίγαεκατοστάπριντοτέλος της πλάκας.ύστερα,η πλάκααποσύρεται και στεγνώνεται με ρεύμα αέρα. Οι διάφορες ουσίες που περιέχοντα ι στο υπό εξέταση δείγμα μετακινούνται επί της πλάκας με διαφορετική ταχύτητα ανάλογα με την πολικότητα τους και εμφανίζονταιμετημορφήδιακριτώνκηλίδων.η παρατήρηση των κηλίδωνγίνεταιμεεξέτα σηστουπεριώδεςφως(254 ή 356 nm)ή μετάαπό ψεκασμό μεειδικάαντιδραστήρια. Από τ ο χρώματων κηλίδων στο ορατό,από την απορρόφησηστο υπεριώδες και ανάλογα με το χρησιμοποιηθέναντιδραστήριομπορεί ναεξαχθούν συμπεράσματα για τηνκατηγορίατων ουσιών που παρατηρούμε(φλαβονοειδές, αλκαλοειδές, σάκχαρο κτλ). Εικόνα 16:Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας 4.4 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων 74

75 4.4.1 Μέθοδος παρασκευής πολυστοιβαδιακών λιποσωμάτων(mlv) Τα λιποσώματα μας παρασκευάστηκαν με την μέθοδο του λεπτού υμενίου Μέθοδος λεπτού υμενίου Στη μέθοδο του λεπτού υμενίου τοποθετούνται σε σφαιρική φιάλη των 50 ml τα διαλύματα των λιπιδίων. Οι οργανικοί διαλύτες απομακρύνονται με τη χρήση περιστρεφόμενου εξατμιστήρα (rotary evaporator) ενώ η θερμοκρασία στο υδατόλουτρο ρυθμίζεται ανάλογα με τη θερμοκρασία μετάπτωσης των λιπιδίων. Μετά το σχηματισμό ενός λεπτού υμενίου στα τοιχώματα της σφαιρικής φιάλης, η περίσσεια οργανικού διαλύτη απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου. Ακολουθεί ενυδάτωση του υμενίου με διάλυμα της προς εγκλωβισμό ουσίας (διάλυμα 100mM calcein, 1mM E DTA, ph=7,4). Προκειμένου να αποκολληθεί το υμένιο από τα τοιχώματα της σφαιρικής φιάλης εφαρμόζεται μηχανική ανάδευση (vortex), έτσι ώστε να ληφθεί μ ια θολερή διασπορά, στην οποία υπάρχουν πολυστοιβαδιακά λιποσώματα μεγάλου μεγέθους. Η μείωση του μεγέθους της λιποσωμικής διασποράς επιτυγχάνεται με τη χρήση λουτρού υπερήχων (bath sonicator) για 15 λεπτά. Τέλος τα λιποσώματα αφήνονται για annealing για μια περίπου ώρα σεθερμοκρασίαπάνω απότηθερμοκρασίαμετάπτωσηςτων λιπιδίω νμια διαδικασία κατά την οποία τακτοποιούν ατέλειες της μεμβράνης τους Παρασκευή μικρών μονοστοιβαδιακών λιποσωμάτων (SUV) Ταμικράμονοστοιβαδιακάλιποσώματα(SUV)παρασκευάζονται απoταμεγάλαπολυστοιβαδιακάλιποσώματα(mlv)μετηχρήσητηςακίδαςυπερήχων(probe sonicator). Ταδείγματατοποθετούνταισεσωληνάκιακαισεαυτάεφαρμόζονται υπέρηχοι για5λεπτάκαιπαραπάνωανχρειαστείμέχριναληφθείμιαδιαυγής διασπορά. Ακολουθεί φ υγοκέντρηση στις στροφές / λεπτό για 10 λεπτάγιανααπομακρυνθούνμεγάλαλιποσώματαήρινίσματατιτανίουαπότηλιποσωμική δ ιασπορά. Τα ρινίσματα αυτά αποκολλώνται λόγω 75

76 της μεγάλης δύναμηςτριβής, η οποία αναπτύσσεται ανάμεσα στην ακίδα και τη διασπο ρά, τέλoς τα δείγματα αφήνονται γιαannealing, γιαμιαπερίπουώρασεθερμοκρασίαπάν ωαπό τη θερμοκρασίαμετάπτωσης των λιπιδίων ώστε να ηρεμίσουν και νατακτοποιήσουντη δομή τους. 4.5 Χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Μέτρηση συγκέντρωσης λιπιδίου Χρησιμοποιήθηκαν: 1. Χλωροφόρμιο (CHCl 3 ) από την εταιρία χημικών MERCK. 2. Διάλυμα Stewart, που παρασκευάζεται με διάλυση: g FeCl 3 6 H2 (Iron (III) chloride hexahydrate) της Merck και 30.4 g NH4 SCN (Ammonium thiocyanate) (Merck) σε 1 L D H2 Το διάλυμα είναι σταθερό σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετούς μήνες. Πρέπει να φυλάσσεται σε σκιερό μέρος Μέθοδος Stewart H μέθοδοs Stewart χρησιμοποιείται προκειμένου να προσδιοριστεί η ακριβής συγκέντρωση του λιπιδίου στα λιποσωμικά δείγματα. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην ικανότητα των φωσφολιπιδίων να σχηματίζουν σύμπλοκο με τοσιδηροθειοκυανιούχοαμμώνιο σε οργανικό διάλυμα. Το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι η παρουσία ανόργανου φωσφόρου δεν παρεμποδίζει την ανάλυση. Η συσχέτιση των τιμών απορρόφησης με τα μ g του φωσφολιπιδίου 76

77 πραγματοποιείται με εύκολο τρόπο. Προετοιμασία των πρότυπων διαλυμάτων και των δειγμάτων : Φτιάχνουμε 10 mlδιαλύματος φωσφολιπιδίου PC (από δ/μα αρχικής συγκέντρωσης 20mg/mL) σε χλωροφόρμιο σε συγκέντρωση 0.1 mg/ml. Αναλυτική μέθοδος: i. Ετοιμάζουμε τα πρότυπα διαλύματα σε δοκιμαστικούς σωλήνες των 10mL όπως φαίνεται στον πίνακα. ii. Στη συνέχεια, ανακινούμε ισχυρά τα δείγματα με vortex επί 1min iii. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5 min στις 5000 rpm ή αφήνουμε τα δείγματα σε ηρεμία ώστε να διαχωριστούν οι φάσεις (περίπου min) iv. Αφαιρούμε προσεκτικά την υπερκείμενη υδατική φάση με τη βοήθεια αντλίας κενού και μετράμε οπτική απορρόφηση του λιπιδίου στα 485nm. Πίνακας 1 :Πρότυπα διαλύματα. Μέτρηση D: i. Ανοίγουμε το UV/VIS φασματοφωτόμετρο ii. Ρυθμίζουμε το μήκος κύματος στα 485 nm iii. Μηδενίζουμε με χλωροφόρμιο(τυφλό) iv. Μετράμε τα δείγματα ξεκινώντας από το αραιότερο στο πυκνότερο 77