ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕ ΘΕΜΑ:

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕ ΘΕΜΑ: ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ/ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΑΠΟ ΕΣΜΕΥΣΗΣ Υ ΑΤΟ ΙΑΛΥΤΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΑΠΟ ΜΙΚΡΑ ΜΟΝΟΣΤΙΒΑ ΟΙΑΚΑ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΚΤΗΣΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Υποβληθείσα στο Τμήμα Φαρμακευτικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Πανεπιστημίου Πατρών ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΤΖΑΝΕΤΟΠΟΥΛΟΣ ΠΑΤΡΑ

2 ΜΕΛΗ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ: 1. κ. Αντιµησιάρη Σοφία, καθηγήτρια Επιβλέπων καθηγητής 2. κ. Καλόσακας Γιώργος, Λέκτορας Μέλος τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής 3. κ.κλεπετσάνης Παύλος, επίκουρος καθηγητής Μέλος τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής 2

3 Αφιερώνεται Στους Γονείς µου 3

4 Πίνακας συντµήσεων Σύντµηση Αγγλική ονοµασία Ελληνική απόδοση PC Phosphatidylcholine Φωσφατιδυλοχολίνη CHOL Cholesterol Χοληστερόλη DSPE-PEG 2000 Distearoyl-sn-Glycero- Phosphoethanolamine Polyethylenglycol Πολυαιθυλενογλυκόλη PBS Phosphate Buffered Saline Ρυθµιστικό δ/µα φωσφορικών FBS Fetal Bovine Serum Ορρός βοοειδούς EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid - DSPC Distearoylο Glycerophosphocholine ιστεαροϋλο-φωσφατιδυλοχολίνη SUV Small Unilamellar Vesicles Μικρά µονοστοιβαδιακά λιποσώµατα LUV Large Unilamellar Vesicles Μεγάλα Μονοστοιβαδιακά Σωµατίδια MLV Multilamellar Vesicles Πολυστοιβαδιακά Σωµατίδια OLV Oligo-Lamellar Vesicles Ολιγοστοιβαδιακά Σωµατίδια MMV Μultivesicular Vesicles Πολυδιαµερισµατικά Σωµατίδια 4

5 Περιεχόµενα Πρόλογος...11 Περίληψη Abstract Θεωρητικό µέρος Λιποσώµατα Λιποσώµατα (Γενικά) Φωσφολιπίδια (A) Χοληστερόλη-(B) Φωσφατιδυλοχολίνη (PC)- (Γ) Πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) Θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης (T M ) Ταξινόµηση λιποσωµάτων Συµβατικά (ή conventional) λιπίδια Ευαίσθητα σε ph λιποσώµατα Στερεοχηµικά σταθεροποιηµένα λιποσώµατα Μικρά µονοστοιβαδιακά λιποσώµατα (SUV) Μεγάλα µονοστοιβαδιακά λιποσώµατα (LUV) Σταθερότητα λιποσωµάτων Φυσική σταθερότητα Χηµική σταθερότητα Χαρακτηρισµός λιποσωµάτων- οµικές ιδιαιτερότητες Μέτρηση µεγέθους λιποσωµάτων Προσδιορισµός ποσοστού εγκλωβισµένου φαρµάκου σε λιποσώµατα Μέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Μηχανική διασπορά Ακίδα υπερήχων Εξώθηση µέσω φίλτρων Χρήση Μικρογαλακτωµατοποιητή Εξώθηση σε θάλαµο εφαρµογής µεγάλης πίεσης υναµικό επιφάνειας λιποσωµάτων( Ζ-δυναµικό) Ειδικοί δείκτες που χρησιµοποιούνται για µελέτες 5

6 σταθερότητας φαρµακοτεχνικών µορφών σε λιποσώµατα Καλσείνη οµή και ιδιότητες της καλσείνης Τα µόριο της καλσείνης και ο ρόλος του ως µόριο-πρότυπο µικρού υδατοδιαλυτού φαρµάκου Εφαρµογές της καλσείνης Μηχανισµοί και κινητικές αποδέσµευσης φαρµάκου Μαθηµατικά µοντέλα που χρησιµοποιούνται σε µελέτες απελευθέρωσης φαρµάκων Μοντέλα διάχυσης (Diffusion Models) A 1 ος Νόµος του FICK B 2 ος Νόµος του FICK Κινητική µηδενικής τάξης (Zero Order Kinetic) Κινητική πρώτης τάξης (First Order Kinetic) Πρότυπο Higuchi Πρότυπο Peppas-Korsmeyer Πρότυπο Hixon-Crowell Πρότυπο Weibull Η επίδραση του χρόνου υστέρησης (lag time) στην εκτίµηση φαρµακοκινητικών παραµέτρων Τυχαίοι αριθµοί Προσοµοιώσεις Monte Carlo σε Fortran Πειραµατικό µέρος Οργανολογία-Συσκευές..., Αντιδραστήρια Παρασκευή λιποσωµάτων Παρασκευή διαλύµατος καλσείνης-μέτρηση οσµωτικότητας καλσείνης.,, Παρασκευή ισότονου ρυθµιστικού διαλύµατος (PBS) ιάσπαση λιποσωµάτων µε Triton X

7 2.2.5 Προσδιορισµός συγκέντρωσης λιπιδίου Μεθοδολογία Παρασκευή MLV λιποσωµάτων σε διαφορετικές συστάσεις λιπιδίων Ελάττωση του µεγέθους και των στοιβάδων των λιποσωµάτων-παρασκευή λιποσωµάτων-suv Μέτρηση- ιαχωρισµός ελεύθερης και εγκλωβισµένης καλσείνης από λιποσώµατα Μέτρηση συνολικού λιπιδίου Μέτρηση µεγέθους και ζ-δυναµικού λιποσωµάτων Μέτρηση ακεραιότητας λιποσωµάτων (Integrity) Προγραµµατισµός σε Fortran Μέθοδος προσαρµογής ελαχίστων τετραγώνων σε γραµµικό σύστηµα (LSF) Μέθοδος προσαρµογής ελαχίστων τετραγώνων σε εκθετικό σύστηµα (LSF) ιπλή Εκθετική συνάρτηση Η συνάρτηση βήµατος (step function) Ο ρόλος της ελεύθερης ενέργειας στο σύστηµα Μορφοποίηση της Ε συνάρτησης Κατασκευή Γενικευµένης Ε συνάρτησης Μοντελοποίηση - Κατασκευή του αλγορίθµου σε προγραµµατιστικό περιβάλλον FORTRAN Συνδυασμός Weibull-Heaviside step function, µελέτη συσχέτισης θεωρητικού-πειραµατικού Release των λιποσωµάτων Μοντελοποίηση Κατασκευή του αντίστοιχου αλγορίθµου των Weibull- Step function σε προγραµµατιστικό περιβάλλον Fortran O χρόνος υστέρησης (lag time) φαρµακευτική θεώρηση-υπολογιστική εφαρµογή Εφαρµογή της τεχνικής Monte Carlo στην εύρεση των SD των παραµέτρων των E και Weibull σε προγραµµατιστικό περιβάλλον Fortran Αποτελέσµατα Μελέτη της σταθερότητας διαφορετικών τύπων και σύστασης λιποσωµάτων µε ή χωρίς την προσθήκη PEG, υπολογισµός του Latency, Retention και Release αυτών Αποτελέσµατα µέτρησης λιποσωµάτων z-size, PDI, ζ-δυναµικού και συνολικού λιπιδίου

8 3.3 Επίδραση του ποσοστού της χοληστερόλης και της πολυαιθυλενογλυκόλης στο µέγεθος των λιποσωµάτων SUV SUV λιποσώµατα χωρίς επικάλυψη πολυµερούς (PEG)-Μέτρηση ποσοστού έσµευσης%, Συγκράτησης% και Αποδέσµευσης% έσµευση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC έσµευση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 4: έσµευση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2: έσµευση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 1: Συγκράτηση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC Συγκράτηση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 4: Συγκράτηση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2: Συγκράτηση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 1: Απελευθέρωση καλσεΐνης από λιπίδιο PC Control Απελευθέρωση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 4: Απελευθέρωση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2: Απελευθέρωση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 1: SUV λιποσώµατα µε επικάλυψη πολυµερούς (PEG)-Μέτρηση ποσοστού έσµευσης%, Συγκράτησης% και Απελευθέρωση% έσµευση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 2M% έσµευση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 4M% έσµευση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 6M% έσµευση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 8M% Συγκράτηση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 2M% Συγκράτηση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 4M% Συγκράτηση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 6M% Συγκράτηση καλσεΐνης σε λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 8M% Απελευθέρωση καλσεΐνης από λιποσώµατα PC:CHOL 2:1+ PEG 2M% Απελευθέρωση καλσεΐνης από λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 4M% Απελευθέρωση καλσεΐνης από λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 6M%

9 Απελευθέρωση καλσεΐνης από λιποσώµατα PC:CHOL 2:1 + PEG 8M% Eπεξεργασία πειραµατικών και θεωρητικών τιµών Απελευθέρωσης καλσεΐνης σε Fortran µε εφαρµογή της ιπλής Εκθετικής συνάρτησης (Double Exponential function) και της συνάρτησης Βήµατος (Step function) Λιποσώµατα SUV χωρίς προσθήκη πολυµερούς (PEG) Λιποσώµατα SUV µε προσθήκη πολυµερούς (PEG) Σύνοψη Eπεξεργασία πειραµατικών και θεωρητικών τιµών Απελευθέρωσης καλσεΐνης σε Fortran µε εφαρµογή της τεχνικής MC για την ιπλή Εκθετική συνάρτησης (Double Exponential function) και την συνάρτηση Βήµατος (Step function) Λιποσώµατα SUV χωρίς προσθήκη πολυµερούς (PEG) Λιποσώµατα SUV µε προσθήκη πολυµερούς (PEG) Εξάρτηση των παραµέτρων K s, K off, G και t 0 από το ποσοστό της χοληστερόλης και της πολυαιθυλενογλυκόλης στις διάφορες λιποσωµικές συστάσεις κατά την επεξεργασία των δεδοµένων µε την τεχνική MC για την εξαγωγή των SD αυτών Λιποσώµατα SUV χωρίς προσθήκη πολυµερούς (PEG) Λιποσώµατα SUV µε προσθήκη πολυµερούς (PEG) Eπεξεργασία πειραµατικών και θεωρητικών τιµών Απελευθέρωσης καλσεΐνης σε Fortran µε εφαρµογή των Weibull συνάρτησης Βήµατος (Step function) Λιποσώµατα SUV χωρίς προσθήκη πολυµερούς (PEG) Λιποσώµατα SUV µε προσθήκη πολυµερούς (PEG) Σύνοψη Επεξεργασία πειραµατικών και θεωρητικών τιµών του Release σε Fortran µε εφαρµογή της τεχνικής MC γι την συνάρτηση Weibull και της συνάρτησης Βήµατος (Step function) Λιποσώµατα SUV χωρίς προσθήκη πολυµερούς (PEG) Λιποσώµατα SUV µε προσθήκη πολυµερούς (PEG) Εξάρτηση των παραµέτρων a, b και t 0 από το ποσοστό της χοληστερόλης και της πολυαιθυλενογλυκόλης στις διάφορες λιποσωµικές συστάσεις κατά την επεξεργασία των δεδοµένων µε την τεχνική MC για την εξαγωγή των SD αυτών Λιποσώµατα SUV χωρίς προσθήκη πολυµερούς (PEG) Λιποσώµατα SUV µε προσθήκη πολυµερούς (PEG) Συζήτηση

10 4.1 Σχετικά µε το ρόλο της χοληστερόλης σε συστήµατα λιποσωµάτων Σχετικά µε το ρόλο της πολυαιθυλενογλυκόλης ως πολυµερική επικάλυψη σε συστήµατα λιποσωµάτων Σχετικά µε την επίδραση της χοληστερόλης στο µέγεθος των λιποσωµάτων Σχετικά µε το ρόλο της παραµέτρου b της συνάρτησης Weibull Φυσική σηµασία Η σηµασία του χρόνου υστέρησης (t lag ) στις λιποσωµικές δοµές PC:CHOL 2:1 & 1: Συµπεράσµατα Βιβλιογραφία Παράρτηµα Α

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρµακευτικής Τεχνολογίας του τµήµατος Φαρµακευτικής της Σχολής επιστηµών Υγείας του Πανεπιστηµίου Πατρών υπό την επίβλεψη της καθηγήτριας κας Σ. Αντιµησιάρη την οποία θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά για την συνεργασία µας. Παράλληλα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Γ. Καλόσακα για την πολύτιµη βοήθειά του στην ολοκλήρωση της παρούσας διπλωµατικής εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τους συναδέλφους µου για τη συµπαράστασή τους και το εξαιρετικό κλίµα του εργαστηρίου. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς µου τόσο για την ηθική όσο και για την οικονοµική τους συµπαράσταση καθ όλη τη διάρκεια του µεταπτυχιακού προγράµµατος. 11

12 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η καλσείνη (calcein) γνωστή και µε την αγγλική ορολογία Fluorexon/Fluorescein είναι µια µικρού µοριακού βάρους υδατοδιαλυτή ουσία και χρησιµοποιείται ως µόριο- πρότυπο µικρού υδατοδιαλυτού φαρµάκου, σε πλήθος εφαρµογών τόσο στο τοµέα της φαρµακευτικής όσο και στο τοµέα της χηµείας. Η χρησιµότητα της έγκειται στο γεγονός ότι παρουσιάζει φθορισµό που αποσβένειται σε υψηλές συγκεντρώσεις(100mm) και της εύκολης παρακολούθησης της αποδέσµευσής της από σωµατιδιακά συστήµατα χορήγησης φαρµάκων. Τα λιποσώµατα είναι καθορισµένα λιπιδικά κυστίδια µε µέγεθος που κυµαίνεται µεταξύ 0,05-5µm και βρίσκονται εδώ και πολλά χρόνια στο επίκεντρο του ερευνητικού ενδιαφέροντος, ως φορείς φαρµάκων και βιοδραστικών ενώσεων καθώς και για την βελτίωση της απόδοσής τους στους οργανισµούς. Τα λιποσώµατα µελετώνται για την απόδοση βιολογικά δραστικών ουσιών κυρίως για τους εξής λόγους: 1. την αδυναµία αυτών των ουσιών να επιτύχουν την επιθυµητή συγκέντρωση στην επιθυµητή περιοχή, 2. την κυτταροτοξικότητά τους και 3. προβλήµατα που σχετίζονται µε τη χορήγησή τους (για παράδειγµα χαµηλή διαλυτότητά τους σε κατάλληλο φορέα). Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι, η µαθηµατική µοντελοποίηση και η µελέτη της κινητικής αποδέσµευσης των µορίων της καλσείνης, που λειτουργούν ως µόρια- πρότυπου υδατοδιαλυτού φαρµάκου, σε συστήµατα λιποσωµάτων τα οποία παρασκευάστηκαν σε διαφορετικές λιπιδικές συστάσεις µε την επίδραση της χοληστερόλης και της πολυαιθυλενογλυκόλης να καθορίζουν τις φυσικοχηµικές τους ιδιότητες και τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των µορίων της καλσείνης. Ειδικότερα, παρασκευάστηκαν λιποσώµατα SUV µε την µέθοδο του λεπτού υµενίου, στα οποία εγκλωβίστηκε καλσείνη σε υψηλή συγκέντρωση (100mM) µε χρήση ακίδας υπερήχων για περίπου 15 λεπτά, σε συστάσεις (PC, PC/Chol 4:1, 2:1 και 1:1 mole/mole) καθώς και (PC/Chol/PEG 2:1:0.04, 2:1:0.08, 2:1:0.16 και 2:1:0.32 mole/mole/mole). Η µελέτη των φυσικοχηµικών χαρακτηριστικών των συστηµάτων αυτών όπως είναι η µέση υδροδυναµική διάµετρος, η πολυδιασπορά και το ζ-δυναµικό τους, πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση DLS (Dynamic Light Scattering Nano-ZS Malvern UK) στους 25 C. Ο προσδιορισµός της ποσοστιαίας απελευθέρωσης της καλσείνης (% Cumulative calcein release) έγινε µετά από επώαση των δειγµάτων στους 37 C µέσα σε διάστηµα 32h, υπολογίζοντας το ποσοστό συγκράτησης της καλσείνης (Latency %) σε καθορισµένα χρονικά διαστήµατα µε µέτρηση του φθορισµού (FL) της ουσίας. Στη συνέχεια τα αποτελέσµατα αποδόθηκαν αναλυτικά σε διαγράµµατα LATENCY% και RETENTION% σε συνάρτηση µε το χρόνο µε σκοπό να δηµιουργηθεί ένα 12

13 ολοκληρωµένο προφίλ για κάθε λιποσωµική δοµή. Τέλος κατασκευάστηκαν διαγράµµατα RELEASE% σε συνάρτηση µε το χρόνο. Όπως αναµενόταν η διπλοστοιβάδα των PEGλιποσωµάτων είναι πιο σταθερή σε σχέση µε την διπλοστοιβάδα των λιποσωµάτων χωρίς PEG µε αποτέλεσµα την ελάττωση της διαπερατότητας της λιπιδικής µεµβράνης. Η ίδια υπόθεση έγινε και στην περίπτωση που στα λιποσώµατα προστέθηκε χοληστερόλη, όπου η αύξηση της συγκέντρωσης της χοληστερόλης οδήγησε σε αύξηση της ακεραιότητας της διπλοστοιβάδας τους. Τέλος µια εξίσωση-πρότυπο τριών παραµέτρων κατασκευάστηκε και τροποποιήθηκε κατάλληλα έτσι ώστε να περιγράψει µε ακρίβεια τα πειραµατικά αποτελέσµατα. Οι παράµετροι K on, K off περιγράφουν την σύνδεση και την αποσύνδεση των µορίων της καλσείνης από τη λιποσωµική δοµή και σε συνδυασµό µε την παράµετρο K s καθορίζουν την απελευθέρωση των µορίων της. Στη συνέχεια χρησιµοποιήθηκε η συνάρτηση Weibull, µια σαφώς απλούστερη συνάρτηση σε σχέση µε την συνάρτηση τριών παραµέτρων που χρησιµοποιήσαµε αρχικά, έτσι ώστε να καθοριστεί ενδελεχώς ο ρόλος της διάχυσης στα συστήµατα λιποσωµάτων που παρασκευάσαµε. Επόµενο βήµα ήταν η επεξεργασία των δύο αυτών συναρτήσεων µε την τεχνική Monte Carlo, ώστε να εξαχθεί µια εκτίµηση για την τυπική απόκλιση των παραµέτρων των συναρτήσεων. Τα αποτελέσµατα υπέδειξαν την ιδανικότερη τεχνική/µέθοδο προσαρµογής που θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί για κάθε λιποσωµική δοµή που παρασκευάσαµε. 13

14 ABSTRACT Calcein also known as Fluorexon/Fluorescein is a water-soluble substance with low molecular weight. Calcein used as a model-molecule of highly water-soluble drugs in a wide range of applications in pharmaceutics and chemistry. It s usefulness is due to the fact that fluorescence self-quenches in high concentrations and so it s release from liposome systems could monitor with ease. Liposomes are vesicles with particle size from 0.05 to 5µm. Liposome structures are at the heart of scientific interest for many years, as they are used as widely in drug delivery systems and have enhanced their performance in biota. Studies in liposomes, focused on the performance of bio-active substances for the following reasons: 1. Weakness of them to achieve the appropriate concentration in the appropriate area. 2. High cytotoxicity and 3. Problems that appears during their administration (f.i. low solubility). The objective of the current study, is to mathematically model and study the release kinetics of calcein molecules (that work as a hydrophilic drug model) from liposome structures with different compositions when cholesterol and polyethylene-glycol determines physicochemical properties and retentions of calcein molecules. Specifically, SUV-liposomes prepared with the thin-film hydration method which encapsulate calcein molecules of high concentration (100mM), were used. Their size was decreased by applying probe sonication for 15min. Phosphatidylcholine (PC), Cholesterol (Chol) and polyethelene-glycol 2000 (PEG) were used in different concentrations (PC, PC/Chol 4:1, 2:1 and 1:1 mole/mole) and (PC/Chol/PEG 2:1:0.04, 2:1:0.08, 2:1:0.16 and 2:1:0.32 mole/mole/mole). Study of vesicle physicochemical characteristics such as z-size, pdi and z- potential, was carried out by DLS (Nano-ZS Malvern UK) at 25 C. Determination of the percentage of Cumulative calcein release taking place during incubation of vesicles at 37 C for up to 32h. Fluorescence Intensity (FL) measurements were performed to estimate the restraint percentage of calcein molecules. Subsequently, final results were attributed to analytical plots (LATENCY % AND RETENTION % with time), in order to create a completed profile for every liposome structure. Finally, results summarized into release curves dependent on time. As expected, the lipid bilayer of PEGylated liposomes was more stable than bilayer of liposomes without PEG coating and as a result the permeability of the later formulation decreased. This was also the case when Chol was included in the liposome membrane; vesicle integrity increased with increasing Chol concentration. 14

15 A model three-parameter equation was used and modified in appropriately in order to describe the experimental results with accuracy. Parameters Kon, Koff (rate constants of association and disassociation, respectively) and Ks were used to describe the cumulative release of calcein over time, for each formulation study. Subsequently, we use Weibull function, clearly a simpler function in relation to the threeparameters function used initially, in order to determine thoroughly the role of diffusion systems liposome preparations. Next step was the processing of these two functions with Monte Carlo technique in order to extract an estimation of the Standard Deviation (SD) of the parameters of the functions. Results indicated the ideal technique/method of fitting, that could be used for each liposomal structure prepared. 15

16 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 16

17 1.1 Λιποσώματα Λιποσώματα (γενικά) Τα λιποσώµατα είναι σφαιρικά σωµατίδια αποτελούµενα από ενυδατωµένες διπλοστοιβάδες φωσφολιπιδίων (βλ. εικόνα 1) οι οποίες σχηµατίζονται αυθόρµητα, κατά τη διασπορά λιπιδίων στο νερό. Λόγω της δοµής τους, της χηµικής σύστασης, του κολλοειδούς σχήµατος, και της ευκολίας παρασκευής τους, είναι ιδιαίτερα χρήσιµα «οχήµατα» σε ποικίλες εφαρµογές και κυρίως ως συστήµατα χορήγησης φαρµάκων. Χαρακτηριστική ιδιότητα των λιποσωµάτων είναι το κολλοειδές τους µέγεθος που κυµαίνεται µεταξύ 0,05-5µm και παρουσιάζει αξιοσηµείωτη οµοιόµορφη κατανοµή. Εξαιτίας του αµφίφιλου χαρακτήρα τους αποτελούν εξαιρετικά συστήµατα διαλυτοποίησης µεγάλου εύρους φαρµάκων. Οι φυσικοχηµικές τους ιδιότητες, τους επιτρέπουν την αλληλεπίδραση τους µε κύτταρα και βιολογικές µεµβράνες και επειδή αποτελούνται από ενώσεις χηµικής προέλευσης είναι µητοξικά βιοαποικοδοµήσιµα συστήµατα και έτσι δεν προκαλούν ανοσολογικές αντιδράσεις. Τα λιποσώµατα λόγω του αµφίφιλου χαρακτήρα τους µπορούν να χρησιµοποιηθούν τόσο ως φορείς λιπόφιλων όσο και υδρόφιλων φαρµάκων. Ανάλογα µε τη διαλυτότητα και τα χαρακτηριστικά της κατανοµής της (partitioning), τα µόρια της δραστικής ουσίας εντοπίζονται σε διαφορετικά σηµεία του κυστιδίου των λιποσωµάτων και έχουν διαφορετική παγίδευση και ιδιότητες απελευθέρωσης. Οι ισχυρά λιπόφιλες ουσίες παγιδεύονται σχεδόν αποκλειστικά στη λιπιδική διπλοστοιβάδα των λιποσωµάτων για το λόγο ότι είναι ελάχιστα διαλυτές στο νερό, έτσι προβλήµατα που σχετίζονται µε την απώλεια της εγκλωβισµένης ουσίας στο υδατικό περιβάλλον των λιποσωµάτων κατά την αποθήκευση, είναι αµελητέα. Εικόνα 1.1 Σφαιρική δοµή λιποσώµατος 17

18 1.1.2 Φωσφολιπίδια Τα Φωσφολιπίδια είναι οργανικές ενώσεις που µαζί µε τα ουδέτερα λίπη και τα στεροειδή, αποτελούν τις βασικές κατηγορίες των λιπιδίων. Η δοµή των περισσότερο διαδεδοµένων φωσφολιπιδίων αποτελείται από 1 µόριο γλυκερόλης, 2 µόρια λιπαρών οξέων ένα µόριο φωσφορικού οξέος και ένα πολικό µόριο (π.χ. η λεκιθίνη που ως πολικό µόριο φέρει αζωτούχο βάση, τη χολίνη) (βλ. Σχήµα 2). Τα φωσφολιπίδια αποτελούν το δοµικό υλικό της κυτταρικής µεµβράνης και η χηµική συµπεριφορά τους καθορίζει τη γενικότερη κυτταρική λειτουργία. Αποτελούνται από µια υδρόφιλη και µια υδρόφοβη περιοχή, την «κεφαλή» του µορίου και την «ουρά» του µορίου αντίστοιχα. Έτσι λοιπόν κατά τη διασπορά φωσφολιπιδίων σε υδατικό διάλυµα η «κεφαλή» τους αλληλεπιδρά µε τα µόρια του νερού ενώ η «ουρά» τους αποµακρύνεται. Επειδή όµως τα κύτταρα αφενός µεν περιέχουν υδατικό περιβάλλον και αφετέρου βρίσκονται τα ίδια (εξωτερικά) µέσα σε υδατικό επίσης περιβάλλον (το µεσοκυττάριο υγρό), τα φωσφολιπίδια που συγκροτούν την πλασµατική µεµβράνη, δηµιουργούν εκ της συµπεριφοράς τους αυτής µία διπλοστοιβάδα, της οποίας οι µεν υδρόφιλες κεφαλές (των φωσφολιπιδίων) στρέφονται προς το εσωκυττάριο και εξωκυττάριο περιβάλλον, αµφότερα υδατικά, οι δε ουρές των µορίων τους αλληλοπροσεγγίζονται στενά, κρυπτόµενες έτσι, στο εσωτερικό της διπλοστοιβάδας, µε στόχο να δηµιουργούν µια σταθερή δοµή. Εικόνα 1.2 οµή φωσφολιπιδίου (παραποµπή: University of Florida Agricultural and Biological Engineering, Web site of David P. Chynoweth MSPH, PhD). Η σταθερή αυτή δοµή των λιποσωµάτων οφείλεται σε δυνάµεις που αναπτύσσονται στην επιφάνεια της διπλοστοιβάδας τους και είναι οι εξής: 18

19 1. Μεταξύ των λιπιδίων αλληλεπιδράσεις, όπως: υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στις πολικές οµάδες και αλληλεπιδράσεις Van der Waals ανάµεσα στις υδρογονανθρακικές αλυσίδες και 2. Τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ λιπιδίων και νερού (υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις, υδρόφοβη επίδραση) (A) Χοληστερόλη Η χοληστερόλη είναι κηρώδης στερόλη που βρίσκεται στη µεµβράνη των κυττάρων όλων των ιστών του σώµατος καθώς και στο πλάσµα του αίµατος όλων των ζωικών οργανισµών, ενώ µικρότερες ποσότητες χοληστερόλης απαντώνται και στις µεµβράνες των φυτών. Οι βασικές ιδιότητες και τα φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά του τροποποιηµένου αυτού στεροειδούς φαίνονται στον πίνακα 1. Πίνακας 1.1 Ιδιότητες της χοληστερόλης ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΤΥΠΟΣ/ΤΥΠΟΣ ΚΑΤΑ IUPAC C 27H 46O / (3β)-cholest-5-en-3-ol ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ (g/mol) ΕΜΦΑΝΙΣΗ (Μορφή) Λευκή κρυσταλλική σκόνη ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ (g/cm 3 ) ΣΗΜΕΙΟ ΤΗΞΗΣ ( C) 148 ΣΗΜΕΙΟ ΒΡΑΣΜΟΥ ( C) 360 ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΝΕΡΟ (mg/l -30 C) ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ Είναι διαλυτή σε ακετόνη, χλωροφόρμιο, αιθανόλη, αιθέρα, μεθανόλη κ.α. Επιπροσθέτως η χοληστερόλη αποτελεί πρόδροµο της βιοσύνθεσης των στεροειδών ορµονών, των χολικών οξέων και της βιταµίνης D. Οι υδροξυλοµάδες της χοληστερόλης αλληλεπιδρούν µε την πολική κεφαλή των µεµβρανών των φωσφολιπιδίων καθώς τα ογκώδη στεροειδή στις υδρογονανθρακικές αλυσίδες ενσωµατώνονται στην µεµβράνη σε παράλληλη διάταξη µε τις µη πολικές περιοχές τους. Έτσι µέσω της αλληλεπίδρασης των φωσφολιπιδίων των αλυσίδων των λιπαρών οξέων, η χοληστερόλη αυξάνει την ανθεκτικότητα της µεµβράνης και συντελεί στη µείωση της ρευστότητάς της. Για το λόγο αυτό η χοληστερόλη χρησιµοποιείται ευρύτατα για την παρασκευή λιποσωµάτων µε σκοπό τη βελτίωση των χαρακτηριστικών της διπλοστοιβάδας τους. Εκτός της µείωσης της ρευστότητας της 19

20 διπλοστοιβάδας, µειώνει την διαπερατότητα των ευδιάλυτων στο νερό µορίων δια µέσου της µεµβράνης και βελτιώνει τη σταθερότητα της µεµβράνης παρουσία βιολογικών υγρών (π.χ. αίµα). Απουσία χοληστερόλης τα λιποσώµατα έχουν την τάση να αλληλεπιδρούν µε πρωτεϊνες του αίµατος όπως η αλβουµίνη, η m- τρασφερίνη και η µακροσφαιρίνη. Οι πρωτεϊνες αυτές τείνουν να αποσταθεροποιούν τη µεµβράνη των λιποσωµάτων και µειώνουν τη χρησιµότητά τους ως µεταφορείς φαρµάκων. Η χοληστερόλη φαίνεται να µειώνει τέτοιου τύπου αλληλεπιδράσεις µε την ενσωµάτωσή της στη διπλοστοιβάδα, µε την υδροξυλοµάδα στο ύψος του καρβονυλίου της ανθρακικής αλυσίδας και το υπόλοιπο τµήµα της παράλληλα στα άτοµα άνθρακα της αλυσίδας των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων. Στη παρακάτω εικόνα φαίνεται η δοµή της χοληστερόλης (µε απαρίθµηση των 27-C της). Εικόνα 1.3 Η χηµική δοµή της χοληστερόλης Η χοληστερόλη αποτελεί βασικό δοµικό στοιχείο των λιποσωµάτων επίσης για τους εξής λόγους: A. Η παρουσία χοληστερόλης στη µεµβράνη των λιποσωµάτων οδηγεί σε σηµαντική αύξηση (ή µείωση) της σειράς προσανατολισµού των υδρογονανθρακικών αλυσίδων πάνω (ή κάτω) από τη θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης και µείωση της γωνίας κλίσης της φωσφολιπιδικής αλυσίδας στη ρευστή φάση. B. Η χοληστερόλη µεταβάλλει τη θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης των λιποσωµικών µεµβρανών, ανάλογα µε την κατάσταση του λιπιδίου. Συγκεκριµένα, όταν το λιπίδιο βρίσκεται σε θερµοκρασίες υψηλότερες από την θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης, η χοληστερόλη συµβάλλει στη µείωση της ελευθερίας των ανθρακικών αλυσίδων και τη συµπύκνωση τελικά της µεµβράνης και µείωση της ρευστότητάς της. Αντίθετα, χαµηλότερα από την θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης, η απόσταση µεταξύ των φωσφολιπιδίων αυξάνεται, η οργάνωση των πολικών κεφαλών εξασθενεί και η ρευστότητα της µεµβράνης αυξάνει. 20

21 (B) Φωσφατιδυλχολίνη (PC) Οι φωσφατιδυλχολίνες ανήκουν σε µια κατηγορία φωσφολιπιδίων όπου στην πολική κεφαλή τους ενσωµατώνονται χολίνες (δηλ. υδατοδιαλυτά θρεπτικά συστατικά). Αποτελούν βασικό συστατικό των βιολογικών µεµβρανών και µπορούν εύκολα να αποµονωθούν από άµεσα διαθέσιµες πηγές όπως είναι ο κρόκος αυγού και τα φασόλια σόγιας, από τα οποία µπορούν να εκχυλιστούν είτε µηχανικά είτε χηµικά µε χρήση εξανίου (C 6 H 14 ). Ανήκουν επίσης στις οµάδες των λεκιθίνων που ανιχνεύονται τόσο σε ζωικούς όσο και σε φυτικούς ιστούς. Οι φωσφατιδυλχολίνες, αποτελούνται από πολικές κεφαλές χολίνων και γλυκεροφωσφορικών οξέων και από δύο αλυσίδες λιπαρών οξέων, µια κορεσµένη και µία ακόρεστη (βλ. εικόνα 4). Η φωσφολιπάση-d καταλύει την υδρόλυση των φωσφατιδυλχολινών για να σχηµατιστεί φωσφατιδικό οξύ (phosphatidic acid PA) που έχει ως αποτέλεσµα τη απελευθέρωση της χολίνης, από την πολική κεφαλή του µορίου, στο κυτταρόπλασµα. Οι φωσφατιδυλχολίνες χρησιµοποιούνται αρκετά χρόνια ως δοµικά στοιχεία των λιποσωµάτων. Τα λιποσώµατα που χρησιµοποιούνται ως φορείς φαρµάκων µπορούν να εγχυθούν στη συστηµατική κυκλοφορία µε την µορφή ενέσιµου διαλύµατος. Σηµαντικό µειονέκτηµα στη µέθοδο αυτή χορήγησης είναι ότι οι λιποσωµικές µορφές µπορούν να παραµείνουν στη κυκλοφορία του αίµατος για πολύ µικρό χρονικό διάστηµα (από µερικά λεπτά έως κάποιες ώρες) ανάλογα και µε την δοµή του λιποσώµατος. Το πρόβληµα αυτό µπορεί να αντιµετωπιστεί µε την παρασκευή λιποσωµάτων από φωσφατιδυλχολίνη, που επικαλύπτεται µε υδρόφιλα πολυµερή (π.χ. PEG) αυξάνοντας έτσι το χρόνο παραµονής τους στη συστηµική κυκλοφορία σε τουλάχιστον µερικές εβδοµάδες. Η συγκεκριµένη µέθοδος παρασκευής λιποσωµάτων µε επικάλυψη PEG χρησιµοποιείται ευρύτατα σε τοµείς όπως η ελεγχόµενη χορήγηση φαρµάκων καθώς επίσης και στην κοσµητική αφού παρουσιάζει εξαιρετικές ιδιότητες σε φαρµακευτικές αλοιφές για δερµατική χορήγηση. Εικόνα 1.4 Η χηµική δοµή της φωσφατιδυλχολίνης 21

22 (Γ) Πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) Η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), είναι γνωστή και ως οξείδιο του πολυαιθυλενίου (PEO) ή πολυοξυαιθυλένιο (POE) και η ονοµασία της εξαρτάται από τη µοριακή µάζα του µονοµερούς. Αποτελείται από χηµικές ενώσεις πολυαιθέρα και είναι εξαιρετικά χρήσιµη σε µεγάλο εύρος εφαρµογών από τη βιοµηχανική παραγωγή έως και την φαρµακευτική και την ιατρική. Η παραγωγή της πολυαιθυλενογλυκόλης οφείλεται στην αλληλεπίδραση του οξειδίου του αιθυλενίου µε το νερό και την αιθυλενογλυκόλη (είτε µε ολιγοµερή αιθυλενογλυκόλης). Οι αλληλεπιδράσεις αυτές καταλύονται µε την παρουσία όξινων ή βασικών καταλυτών. Τα ολιγοµερή της αιθυλενογλυκόλης προτιµώνται σε σχέση µε το νερό καθώς επιτρέπουν την ανάπτυξη πολυµερών µε χαµηλή πολυδιασπορά (pdi). Το µήκος της αλυσίδας των πολυµερών εξαρτάται από την αναλογία µεταξύ των αντιδραστηρίων παρασκευής. Οι βασικές της ιδιότητες φαίνονται στον πίνακα 2. Πίνακας 1.2 Χαρακτηριστικά πολυαιθυλενογλυκόλης. ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΤΥΠΟΣ C 2nH 4n+2O n-1 ΜΟΡΙΑΚΗΜΑΖΑ Εξαρτάται από την μοριακή μάζα του μονομερούς ΣΗΜΕΙΟ ΑΝΑΦΛΕΞΗΣ ( C) Διαλυτότητα Διαλύεται σε νερό, μεθανόλη, αιθανόλη, ακετονιτρίλιο, διχλωρομεθάνιο κ.α. Οι σπουδαιότερες χρήσεις της πολυαιθυλενογλυκόλης συνοψίζονται παρακάτω: 1. Η πολυαιθυλενογλυκόλη µαζί µε τη προσθήκη κατάλληλων ηλεκτρολυτών χρησιµοποιέιται για την παρασκευή σκευασµάτων (όπως το FORTRANS), το οποίο χρησιµοποιείται προς εκκένωση του παχέως εντέρου πριν από ενδοσκοπικές ή ακτινολογικές εξετάσεις (ιατρική- φαρµακευτική εφαρµογή). 2. Λόγω των χαµηλών επιπέδων τοξικότητας χρησιµοποιείται ευρύτατα ως λιπαντική επίστρωση σε υδατικό και µη υδατικό περιβάλλον (χηµική εφαρµογή). 3. Χρησιµοποιείται συχνά ως ιζηµατοποιητής σε πλασµίδια του DNA καθώς και σε τεχνικές κρυστάλλωσης πρωτεϊνών (βιολογική εφαρµογή). 4. Αποτελεί την βάση πολλών κρεµών σώµατος, συχνά σε συνδυασµό µε γλυκερίνη (εµπορική εφαρµογή). 22

23 5. Επίσης, έχει χρησιµοποιηθεί σε µονωτές πυλών κατά την κατασκευή ηλεκτρικών, διπλού στρώµατος, transistor µε σκοπό τη αύξηση της υπεραγωγιµότητας των µονωτών (βιοµηχανική εφαρµογή) Θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης (Τ m): Oι µεµβράνες των φωσφολιπιδίων εµφανίζονται σε διαφορετικές φάσεις, όταν βρίσκονται σε διαφορετικές θερµοκρασίες. Η µετάβαση από τη µία φάση στην άλλη µπορεί να διαπιστωθεί µε φυσικές µεθόδους κατά την αύξηση της θερµοκρασίας. Η πλέον διαδεδοµένη τεχνική για τον προσδιορισµό της θερµοκρασίας µετάπτωσης είναι η θερµιδοµετρία Οι πιο συχνά παρατηρούµενες αλλαγές φάσης συµβαίνουν στην υψηλότερη θερµοκρασία (βλ. εικόνα 5), στην οποία η µεµβράνη αποδιατάσσεται από την οργανωµένη µορφή της γέλης (gel) ή του στερεού (solid) και µεταβαίνει σε υγρή - κρυσταλλική δοµή κατά την οποία οι βαθµοί ελευθερίας των µορίων είναι περισσότεροι. Γενικά αύξηση του µήκους της λιπαρής αλυσίδας ή αύξηση του κορεσµού της αλυσίδας αυξάνει την Tm. Η θερµοκρασία µετάπτωσης για τα φωσφολιπίδια που προέρχονται από το κρόκο αυγού ποικίλλει µεταξύ -15 C ( υψηλό βαθµό ακορεστότητας) και πάνω από 50 C για πλήρη κεκορεσµένα φωσφολιπίδια (όπως π.χ. είναι η διστεαροϋλογλυκεροφωσφατιδυλοχολίνη (DSPC) µε Τ m = 60 C). Εικόνα 1.5 Η µεταβολή που υφίσταται η φάση γέλης των υδρογονανθράκων κατά την αύξηση της θερµοκρασίας. 23

24 1.1.5 Ταξινόμηση των λιποσωμάτων. Τα λιποσώµατα ταξινοµούνται, µε βάση τη σύστασή τους και το µηχανισµό της απόδοσης της εγκλεισµένης ουσίας εντός του κυττάρου, τον αριθµό των διπλοστοιβάδων τους ή το µέγεθός τους. Με βάση τη σύσταση τους και τον µηχανισµό απόδοσης διακρίνονται σε: 1) συµβατικά (conventional) λιπίδια (CL) 2) ευαίσθητα σε ph λιποσώµατα 3) κατιονικά λιποσώµατα 4) ανοσολιποσώµατα και 5) στερεοχηµικά σταθεροποιηµένα λιποσώµατα (Stealth) Σύµφωνα µε τον αριθµό των διπλοστοιβάδων τους διακρίνονται σε µονοστοιβαδιακά ή πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα. Τα πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα είναι δύο τύπων, τα απλά πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα και τα πολυδιαµερισµατικά. Τέλος µε βάση το µέγεθός τους διακρίνονται σε λιποσώµατα όπως φαίνονται παρακάτω στον πίνακα 3: Πίνακας 1.3 Ταξινόµηση λιποσωµάτων µε βάση το µέγεθος τους. 24

25 Συμβατικά (ή conventional) λιπίδια (CL): Μπορούν να οριστούν ως τα λιποσώµατα τα οποία συντίθενται αποκλείστηκα µόνο από φωσφολιπίδια (ουδέτερα ή αρνητικά φορτισµένα) ή/και χοληστερόλη. Οι τελευταίες έρευνες σε λιποσώµατα, τα οποία χρησιµοποιούνται ως δεξαµενές µεταφοράς φαρµάκων, απασχόλησαν κυρίως αυτή την κατηγορία λιποσωµικών µορφών. Τα συµβατικά λιποσώµατα (βλ. εικόνα 6) ανήκουν στην οικογένεια των φυσαλιδωδών δοµών (σ.σ. λιπιδικές διπλοστοιβάδες που περιβάλλουν υδατικά τµήµατα). ιαφέρουν ευρύτατα ως προς τις φυσικοχηµικές τους ιδιότητες δηλαδή ως προς το µέγεθος, τη λιπιδική σύσταση τους, το επιφανειακό τους φορτίο και ως προς τη ρευστότητα της µεµβράνης τους. Ωστόσο, ο κατάλληλος χειρισµός των ιδιοτήτων αυτών αποτελεί ένα πολύτιµο εργαλείο στην τροποποίηση της in vivo συµπεριφοράς των συµβατικών λιποσωµάτων (π.χ. σταθερότητα, κατανοµή κ.τ.λ.). Τα συµβατικά λιποσώµατα χαρακτηρίζονται από σχετικά σύντοµη χρονική παραµονή στην κυκλοφορία του αίµατος λόγω της γρήγορης αναγνώρισης τους από τα µακροφάγα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος. Η επιτυχηµένη χρήση συµβατικών λιποσωµάτων έχει αναφερθεί σε πληθώρα εφαρµογών όπως είναι η µεταφορά αντιµικροβιακών παραγόντων σε µολυσµένα µακροφάγα, καθώς και η µεταφορά και η ενσωµάτωση αντιγόνων σε αυτά. Υδρόφοβη βιοδραστική ένωση Υδατικό δ/µα Υδρόφιλη βιοδραστική ένωση Υδρόφιλη «κεφαλή» Υδρόφοβη «ουρά» Εικόνα 1.6 οµή συµβατικού λιποσώµατος και κατανοµή υδρόφοβης και υδρόφιλης βιοδραστικής ένωσης σε υδατικό διάλυµα. 25

26 Ευαίσθητα σε ph λιποσώματα: Είναι λιποσώµατα (βλ. εικόνα 7) τα οποία αποσταθεροποιούνται σε ήπια όξινο ph (περίπου 6.0) και είναι ιδιαίτερα χρήσιµα στη µεταφορά υδατοδιαλυτών φαρµάκων στο κυτταρόπλασµα (Roux et al., 2004). Ωστόσο η in vivo χρήση τους είναι περιορισµένη λόγω της ταχύτατης απορρόφησης τους από τη συστηµατική κυκλοφορία από το δικτυοενδοθηλιακό σύστηµα. Η προσθήκη πολυαιθυλενογλυκόλης παρατείνει το χρόνο παραµονής των λιποσωµάτων στη συστηµική κυκλοφορία µέσω της στερεοχηµικής σταθεροποίησης των λιπιδίων. Έχει βρεθεί ότι η προσθήκη PEG-PE στην µεµβράνη λιποσωµάτων ευαίσθητα στο ph, τα οποία αποτελούνται από CHEMS (Cholesteryl Hemisuccinate) και DOPE αυξάνουν τη στερεοχηµική σταθερότητα των κυστιδίων. Αυτό το είδος λιποσωµάτων συντίθεται από φωσφατιδυλο-αιθανολαµίνης (PE) µε ένα όξινο φωσφολιπίδιο. Η πιο µελετηµένη οµάδα αυτής της κατηγορίας περιέχει µη-κορεσµένη φωσφατιδυλοαιθανολαµίνη συνδεδεµένη µε µερικώς όξινα αµφίφυλα µόρια, όπως ολεικό οξύ ή χοληστεροληλεκτρικό (Ellens et al., 1984). Τα λιποσώµατα χρησιµοποιήθηκαν επιτυχώς για την µεταφορά νουκλεικών οξέων (Shi G et al., 2002), (Mizone T et al., 2002). ενδόσωµα Χαµηλή τιµή του ph Πυρήνας Εικόνα 1.7 Κυτταροπλασµατική στόχευση µέσω ευαίσθητων στο ph πολυµερικά τροποποιηµένων λιποσωµάτων. 26

27 Στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα (Stealth liposomes): Τα στερεοχηµικά σταθεροποιηµένα λιποσώµατα είναι λιποσώµατα επιστρωµένα µε µόρια πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Τα µόρια της PEG διαδραµατίζουν σπουδαίο ρόλο καθώς είναι αυτά που µειώνουν το ρυθµό πρόσληψης των λιποσωµικών δοµών από τα µακροφάγα, που έχει ως αποτέλεσµα παρατεταµένη διάρκεια παραµονής των λιποσωµάτων στη συστηµατική κυκλοφορία. Ως εκ τούτου, παρέχουν επαρκή χρόνο για την αποµάκρυνση των δοµών από τη συστηµατική κυκλοφορία, µέσω της διαρροής του ενδοθηλίου. Τα λιποσώµατα αυτά συντίθενται από φυσικώς προερχόµενες πηγές φωσφολιπιδίων µε µικτές λιπιδικές αλυσίδες επικαλυµµένες και σταθεροποιηµένες από πολυµερή πολυαιθυλενογλυκόλης (π.χ. δραστικές ουσίες όπως αυτές που περιέχονται σε σκευάσµατα όπως το DOXIL ή το CAEXYL έχουν εγκλωβιστεί σε PEG-λιποσώµατα). Πολυµερή που χρησιµοποιούνται για την παρασκευή λιποσωµάτων stealth είναι: Φυσικά πολυµερή: -Polyhydroxyethyl l-asparagines coated -PEG coated -H-PG-PEG coated -DOPE coated Βιοσυµβατά συνθετικά πολυµερή: -Polyvynil-pyrolidone -Polyanyline -Polyacrilamide -Poly (2-methyl 2-oxazoline) Ιδιαίτερη αναφορά γίνεται στη διαδικασία PEGylation. Η διαδικασία αυτή αποτελεί τη µέθοδο παρασκευής των PEG λιποσωµάτων (βλ. εικόνα 8). Σε πειράµατα in vivo έχει παρατηρηθεί ότι η αύξηση της PEG από 4 έως 10% αυξάνει και τη διάρκεια παραµονής των λιποσωµάτων στη συστηµατική κυκλοφορία του αίµατος από λεπτά. Τα PEGλιποσώµατα λοιπόν αναφέρονται στη βιβλιογραφία και ως «µυστικά» ή stealth καθώς και ως «στερεοχηµικά σταθερά» ή sterically stabilized. επικάλυψη πολυµερούς πολυαιθυλενογλυκόλης υδάτινη στοιβάδα λιποσωµική διπλοστοιβάδα Εικόνα 1.8 Εικόνα στερεοχηµικά σταθερού λιποσώµατος. 27

28 Ο πρώτος όρος αναφέρεται στην ικανότητα που έχουν τα λιποσώµατα αυτά να αναγνωρίζονται δύσκολα από τα µακροφάγα κύτταρα του οργανισµού, ενώ ο δεύτερος όρος αναφέρεται στο µηχανισµό στερικής σταθερότητας που είναι υπεύθυνος για την επαγωγή περισσότερου χρόνου κυκλοφορίας (π.χ. χρόνος ηµίσειας ζωής σε ανθρώπινο οργανισµό περίπου 48 ώρες). Η στερική σταθερότητα είναι αποτέλεσµα της τοπικής επιφάνειας υψηλών συγκεντρώσεων σε υδρογονωµένες οµάδες PEG, οι οποίες δηµιουργούν στερική παρεµπόδιση κατά τη διάρκεια αλληλεπιδράσεων µε µοριακά και κυτταρικά συστατικά του βιολογικού περιβάλλοντος (Shi G et al., 2002) Μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα SUV: Τα λιποσώµατα αυτής της κατηγορίας µπορούν να παρασκευαστούν µε την ανάµιξη µιας διασποράς φωσφολιπιδίων στο νερό µε τη χρήση υπερήχων στους 60 C (Saunders et al,1962). Συνήθως τα SUV παρασκευάζονται από τα MLV µε υπερήχηση ή µε ένα όργανο που µειώνει το µέγεθος των MLV. Η υπερήχηση πραγµατοποιείται µε λουτρό υπερήχων (bath sonicator) ή µε ακίδα υπερήχων (probe sonicator). Ένα πρόβληµα που σχετίζεται µε την ακίδα υπερήχων είναι τα υπολείµµατα τιτανίου (Ti) που αποµένουν στη διασπορά των λιποσωµάτων. Το λουτρό υπερήχων από την πλευρά του έχει το πλεονέκτηµα ότι η θερµοκρασία του προϊόντος µπορεί να ελεγχθεί µε τον έλεγχο της θερµοκρασίας του νερού του λουτρού. Η µετατροπή των MLV σε SUV (βλ. σύγκριση µεγέθους εικ. 9) µπορεί να γίνει και µε το πέρασµα των MLV από ένα στενό στόµιο υπό υψηλή πίεση (Hamilton et al 1980). Είναι χαρακτηριστικό ότι χρειάζονται πολλαπλά περάσµατα διαµέσου της συσκευής σε υψηλή πίεση psi στους 4 C προκειµένου να προκύψουν σωµατίδια οµοιόµορφου µεγέθους. Με τη µέθοδο αυτή επιτυγχάνονται σωµατίδια µεγέθους 0,3 0,5µm. Τριχοειδή αγγεία πνεύμονα Αιμοπετάλια Ερυθρά αιμοσφαίρια 25 nm διάμετρος SUV 2500 nm διάμετρος LUV Συγκριση μεγέθους SUV και LUV λιποσωμάτων και ακτίνα βιολογικών δομών στον άξονα y Εικόνα 1.9 Τυπικό διάγραµµα που απεικονίζει το µέγεθος ενός SUV λιποσώµατος σε σύγκριση µε ένα LUV λιπόσωµα. 28

29 Τα SUV µπορούν να παρασκευαστούν και µε τη µέθοδο της έγχυσης αιθανόλης (ethanol injection) ή µε τη µέθοδο έγχυσης αιθέρα (ether injection). Στην πρώτη µέθοδο τα διαλυµένα σε διαιθυλαιθέρα λιπίδια ενώνονται αργά σε θερµό νερό (Deamer and Bangham, 1976) και στη συνέχεια ο αιθέρας αποµακρύνεται από το παρασκευάσµα µε την εφαρµογή ατµού. Η έγχυση αιθανόλης αποτελεί µια εναλλακτική µέθοδο παρασκευής SUV (Batzri and Κοrn,1973). Στη µέθοδο αυτή διαλυµένα σε αιθανόλη λιπίδια εγχύονται γρήγορα σε υδατικό µέσο µε αποτέλεσµα τον αυθόρµητο σχηµατισµό SUV. Η αποµάκρυνση των υπολειµµάτων αιθανόλης από το παρασκευάσµα µπορεί να δηµιουργήσει προβλήµατα, καθώς η αιθανόλη σχηµατίζει αζεοτροπικό µίγµα µε το νερό και είναι δύσκολο να αποµακρυνθεί µε την εφαρµογή ατµού ή µε άλλες τεχνικές απόσταξης Μεγάλα μονοστοιβαδιακά λιποσώματα (LUV) Τα λιποσώµατα αυτά έχουν διάµετρο περίπου 100 nm και είναι µονοστοιβαδιακά. Ανάλογα µε το επιθυµητό µέγεθος, τα LUVs µπορούν να παρασκευαστούν µε διαφόρους τρόπους, όπως (α) η αποµάκρυνση απορρυπαντικού, (β) η έγχυση αιθανολικού διαλύµατος φωσφολιπιδίων, (γ) η εξάτµιση διαλύτη και (δ) η έγχυση αιθερικού διαλύµατος φωσφολιπιδίων. (α) Απομάκρυνση απορρυπαντικού: Τα απορρυπαντικά στην κρίσιµη µικκυλιακή συγκέντρωση έχουν χρησιµοποιηθεί για να διαλυτοποιήσουν λιπίδια. Καθώς το απορρυπαντικό αφαιρείται, τα µικκύλια γίνονται σταδιακά πλουσιότερα σε φωσφολιπίδιο και συνδυάζεται τελικά ώστε να διαµορφώσει LUVs. Τα απορρυπαντικά αφαιρούνται µε dialysis (Kagawa and Rocker, 1971 Milsmann et al, 1978 Alpes et al, 1986). Τα πλεονεκτήµατα από την µέθοδο αυτή είναι άριστη επαναληψιµότητα και η δυνατότητα παραγωγής πληθυσµών λιποσωµάτων που είναι οµοιογενείς στο µέγεθος. Το κύριο µειονέκτηµα της µεθόδου είναι η διατήρηση ιχνών απορρυπαντικού µέσα στα λιποσώµατα. Η εµπορική συσκευή LIPOPREP (Diachema AG, Ελβετία) που είναι µια έκδοση συστήµατος dialysis είναι διαθέσιµη για την αφαίρεση των απορρυπαντικών. Άλλες τεχνικές έχουν χρησιµοποιηθεί για την αφαίρεση των απορρυπαντικών: (α) µε τη χρησιµοποίηση της χρωµατογραφίας πηκτωµάτων που περιλαµβάνει µια στήλη Sephadex g 25 (Enoch και Suitt Matter, 1979), (β) µε την προσρόφηση ή τη δέσµευση Triton Χ 100 (απορρυπαντικό) στις Bio beads SM2 (Gerristen et al, 1978). (γ) από τη σύνδεση octyl glucoside (απορρυπαντικό) σε Amberlite XAD 2 beads (Philippot et Al, 1985). 29

30 (β) Έγχυση αιθανολικού διαλύματος φωσφολιπιδίων: Ένα διάλυµα λιπιδίων σε αιθανόλη εγχέεται γρήγορα σε περίσσεια ρυθµιστικού. Τα MLVs διαµορφώνονται αµέσως. Τα µειονεκτήµατα της µεθόδου είναι ότι ο πληθυσµός είναι ετερογενής ( nm), τα λιποσώµατα είναι πολύ αραιά, είναι δύσκολο να αφαιρεθεί όλη η αιθανόλη επειδή διαµορφώνει αζεοτροπικό σύστηµα µε το ύδωρ και τη πιθανότητα διάφορων βιολογικά ενεργών µακροµορίων να αδρανοποιηθούν παρουσία ακόµη και ελάχιστων συγκεντρώσεων αιθανόλης (Batzri and Korn, 1973). (γ) Μέθοδος εξάτμισης διαλύτη: Πρώτα σχηµατίζεται ένα νερό σε έλαιο γαλάκτωµα από σύντοµο sonication ενός συστήµατος δύο φάσεων που περιέχει τα φωσφολιπίδια στον οργανικό διαλύτη (διαιθυλαιθέρας ή ισοπροπυλαιθερας ή µίγµα ισοπροπύλο αιθέρας και χλωροφόρµιο) και υδατικό ρυθµιστικό διάλυµα. Οι οργανικοί διαλύτες εξατµίζονται υπό µειωµένη πίεση, µε συνέπεια το σχηµατισµό ενός ιξώδους πηκτώµατος. Τα λιποσώµατα διαµορφώνονται όταν ο υπόλοιπος διαλύτης αφαιρείται από τη συνεχή εξάτµιση κάτω από µειωµένη πίεση. Με αυτήν την µέθοδο µπορεί να ληφθεί υψηλή αποδοτικότητα εγκλωβισµού µέχρι 65% σε ένα µέσο χαµηλής ιοντικής δύναµης, παραδείγµατος χάριν 0,01 M NaCl. Η µέθοδος έχει χρησιµοποιηθεί για τον εγκλωβισµό µικρών, µεγάλων και µακροµόριων. Το κύριο µειονέκτηµα της µεθόδου είναι η έκθεση των υλικών που εγκλωβίζονται στους οργανικούς διαλύτες και σε µικρά διαστήµατα υπερήχησης. Αυτές οι συνθήκες µπορούν ενδεχοµένως να οδηγήσουν στην αλλοίωση µερικών πρωτεϊνών ή θραύση των ελικών DNA (Szoka and Papahadjopoulos, 1978). Λαµβάνεται µια ετερογενούς µεγέθους διασπορά µεµβρανών µ' αυτό τον τρόπο. Η τροποποιηµένη αντίστροφη µέθοδος εξάτµισης φάσης παρουσιάστηκε από τους Handa et al (1987) και το κύριο πλεονέκτηµα της µεθόδου είναι ότι τα λιποσώµατα είχαν υψηλή αποδοτικότητα εγκλωβισµού (περίπου 80%).Η µέθοδος εξάτµισης Szoka and Papahadjopoulos (1978) έχει τροποποιηθεί επίσης να εγκλωβίζει τα πλασµίδια χωρίς καταστροφή των ελικών DNA (Haga and Yogi, 1989). Στο παρακάτω σχήµα (σχ.1.1) φαίνεται η ταξινόµηση των λιποσωµάτων, όπως γίνεται µε βάση τον τρόπο που παρασκευάζονται: 30

31 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΒΑΣΕΙ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΤΟΥΣ MLV (Multi Lamellar Vesicles) OLV (Oligo-Lamellar Vesicles) UV-Unilamellar Vesicles MVV-Multi Vesicular Vesicles LUV -Large Unilamellar Vesicles SUV -Small Unilamellar Vesicles Σχήμα 1.1 Ταξινόμηση λιποσωμάτων βάσει της μεθόδου παρασκευής τους Σταθερότητα λιποσωμάτων: Κατά την παρασκευή λιποσωµάτων παρατηρούνται ετερογενείς δοµές ως προς το µέγεθος των λιποσωµικών µορφών µε αποτέλεσµα να αναπτύσσονται προβλήµατα φυσικής και χηµικής σταθερότητας. Κατά την αποθήκευση τους τα λιποσώµατα παρουσιάζουν µεταβολές στην κατανοµή µεγέθους τους, ενώ τείνουν να συσσωµατώνονται και να σχηµατίζουν δοµές µε µεγαλύτερο µέγεθος. Η συσσωµάτωση και η αποικοδόµηση των λιποσωµάτων κατά την αποθήκευσή τους δηµιουργούν σηµαντικά προβλήµατα στην απελευθέρωση του φαρµάκου από αυτά. Από χηµικής πλευράς, τα λιποσώµατα αντιδρούν µε την εκάστοτε εγκλωβισµένη δραστική ουσία παρουσιάζοντας έτσι προβλήµατα χηµικής αποσταθεροποίησης. Επίσης είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε οξειδωτικές και υδρολυτικές αντιδράσεις. Άλλοι παράγοντες που πρέπει να λαµβάνονται υπόψη πριν από το ξεκίνηµα µιας µελέτης σταθερότητας είναι οι συνθήκες παρασκευής των λιποσωµάτων, αλλά και περιβαλλοντικοί παράγοντες που ενδεχοµένως να επηρεάσουν τη σταθερότητα του παρασκευάσµατος. Στις συνθήκες παρασκευής των λιποσωµάτων περιλαµβάνονται το ph, το είδος του ρυθµιστικού διαλύµατος, η ιονική ισχύς και το σύστηµα διαλυτών. Για παράδειγµα λιποσώµατα που παρασκευάζονται από διστεαροϋλοφωσφατίδυλοχολίνη (DSPC) παρουσιάζουν τη βέλτιστη δυνατότητα παρασκευής στους 70 C σε ph 6,5 (Frokjaer et al, 1982). Η επίδραση των 31

32 περιβαλλοντικών παραγόντων όπως η θερµοκρασία, το φως, το οξυγόνο και διάφορων µεταλλικών ιόντων από την άλλη πλευρά µπορεί να προκαλέσει χηµικές ή φυσικές αντιδράσεις. Οι αντιδράσεις αυτές περιλαµβάνουν αλλαγές στο µέγεθος των σωµατιδίων, οξείδωση και υδρόλυση των λιπιδίων Φυσική σταθερότητα: Η σύντηξη των λιποσωµάτων και η διαρροή των εγκλωβισµένων σ αυτά ουσιών, µπορεί να οφείλεται σε κάποια ελαττώµατα στη τοποθέτηση των λιπιδίων της µεµβράνης, τα οποία προκαλούνται κατά τη διάρκεια της παρασκευής τους. Αυτό µπορεί να αποφευχθεί µε τη διαδικασία του annealing, η οποία αποτελεί την επώαση των λιποσωµάτων σε θερµοκρασία µεγαλύτερη από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου για χρονικό διάστηµα διάρκειας 1 ώρας. Με τον τρόπο αυτό εξισορροπούνται οι διαφορές της πυκνότητας των λιπιδίων κατά την τοποθέτηση τους στις µεµβράνες. Η συσσωµάτωση και καθίζηση ουδέτερων λιποσωµάτων οφείλεται σε ανάπτυξη δυνάµεων Van der Waals που είναι ισχυρότερες στην περίπτωση των λιποσωµάτων µεγάλου µεγέθους. Ο απλούστερος τρόπος για την παρεµπόδιση τέτοιων φαινοµένων είναι µε τη χρησιµοποίηση στη λιπιδική σύσταση µικρής ποσότητας φορτισµένου λιπιδίου (π.χ. 10% φωσφατιδυλογλυκερόλη). Το φαινόµενο της σύντηξης είναι σύνηθες στα SUV τα οποία τείνουν να µειώσουν τις δυνάµεις που αναπτύσσονται λόγω της µεγάλης κυρτότητας της µεµβράνης τους. Παρατηρείται µάλιστα σε θερµοκρασίες πολύ κοντά στην (Tc) του λιπιδίου και έτσι ενδείκνυται η φύλαξή τους σε θερµοκρασίες χαµηλότερες αυτής ή και η προσθήκη κατάλληλης ποσότητας χοληστερόλης η οποία καταργεί την επίδραση της θερµοκρασίας µετάβασης του λιπιδίου. Η διαπερατότητα των λιποσωµικών µεµβρανών εξαρτάται κατά πολύ από τη λιπιδική τους σύσταση και τα χαρακτηριστικά της εγκλωβισµένης ουσίας. Γενικά η λιποσωµική µεµβράνη είναι σταθερότερη όταν είναι άκαµπτη, δηλαδή όταν αποτελείται από περισσότερα κορεσµένα λιπίδια και µεγάλη ποσότητα χοληστερόλης Χημική σταθερότητα: Το βασικό συστατικό των λιποσωµάτων, το λιπίδιο προέρχεται από φυσικές ή συνθετικές πηγές φωσφολιπιδίων. Τα φωσφολιπίδια τα οποία περιέχουν µη κορεσµένα λιπαρά οξέα είναι γνωστό ότι υφίστανται συχνά οξείδωση. Τα προϊόντα της αντίδρασης αυτής µπορεί να προκαλέσουν αλλαγές στη διαπερατότητα της διπλοστοιβάδας των λιποσωµάτων. Έχει βρεθεί ότι η υπεροξείδωση και η υδρόλυση των λιπιδίων είναι βασική αιτία για την αποικοδόµηση των λιποσωµάτων. Η οξειδωτική αποικοδόµηση των λιποσωµάτων µπορεί να 32

33 αποφευχθεί µε την προστασία των λιπιδικών παρασκευασµάτων από το φως, µε την προσθήκη αντιοξειδωτικών όπως η τοκοφερόλη, µε την προσθήκη EDTA για την αποµάκρυνση βαρέων µετάλλων ή µε την παρασκευή των λιποσωµάτων σε περιβάλλον αζώτου ή αργού. Επίσης η υδρόλυση των λιπιδίων οδηγεί στο σχηµατισµό λυσοφωσφατιδυλοχολίνης, η παρουσία της οποίας αυξάνει τη διαπερατότητα των λιποσωµάτων. Γι αυτό πρέπει η συγκέντρωση της να διατηρείται σε χαµηλά επίπεδα. Τρόποι αύξησης της φυσικής και της χημικής σταθερότητας των λιποσωμάτων. 1. Ένας τρόπος είναι να αποφύγουµε τη χρήση ακόρεστων φωσφολιπιδίων διότι τα ακόρεστα φωσφολιπίδια υπόκεινται σε υπεροξείδωση. Αν χρησιµοποιήσουµε ακόρεστα φωσφολιπίδια θα πρέπει να προσεχθούν τα εξής: - Κατά την διαδικασία παρασκευής και αποθήκευσης είναι ιδιαίτερα σηµαντικό να αποφευχθεί η εκτεταµένη έκθεση στο οξυγόνο της ατµόσφαιρας. - Προσθήκη τοκοφερολών ή άλλων αντιοξειδωτικών. - Περιορισµός της έκθεσης των λιποσωµάτων στο φώς κατά τη διάρκεια της παρασκευής και της αποθήκευσης. 2. Άµεση αποθήκευση των λιποσωµάτων στην ψύξη (4 C) µετά την παρασκευή. 3. Ποτέ αποθήκευση στην κατάψυξη. 4. Χρήση ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών (buffer) για την ρύθµιση του ph σε κατά την παρασκευή και αποθήκευση για την αποφυγή υδρόλυσης. 5. Τα περισσότερα ρυθµιστικά δ/τα ενισχύουν την υδρόλυση γι αυτό χρειάζεται προσοχή στην ελαχιστοποίηση της συγκέντρωσης στο διάλυµα. 6. Προσθήκη αιθυλενοδιαµινοτετραοξικού οξέος (EDTA) για να εξασφαλιστεί η αποµάκρυνση των πολυσθενών κατιόντων. Η παρουσία πολυσθενών κατιόντων µπορεί να προκαλέσει συσσωµάτωση και αποσταθεροποίηση της διπλοστοιβάδας των λιποσωµάτων. 7. Έλεγχος της θερµοκρασίας και επιλογή των κατάλληλων λιπιδίων, έτσι ώστε να αποφευχθεί η µετάβαση φάσης των λιπιδίων κατά την αποθήκευσή τους. 8. Παρακολούθηση της κατάστασης συσσωµάτωσης των λιποσωµάτων και ρύθµιση της λιπιδικής σύστασης ή/και της λιπιδικής σύνθεσης. 9. Ενσωµάτωση χοληστερόλης σε λιποσώµατα µπορούν να µειώσουν τις αποσταθεροποιητικές αντιδράσεις των προϊόντων υδρόλυσης. 33

34 1.1.7 Χαρακτηρισμός λιποσωμάτων Δομικές ιδιαιτερότητες: Ο χαρακτηρισµός των λιποσωµάτων, τόσο µετά την παρασκευή του όσο και κατά την αποθήκευσή τους, είναι απαραίτητος προκειµένου να εξασφαλιστεί ο έλεγχος της ποιότητας του προϊόντος. Οι µέθοδοι που χρησιµοποιούνται για τον χαρακτηρισµό πρέπει να είναι σχετικά φτηνές, γρήγορες και επαναλήψιµες Μέτρηση μεγέθους λιποσωμάτων: Το µέσο µέγεθος και η κατανοµή του µεγέθους των λιποσωµάτων αποτελούν ιδιαίτερα σηµαντικές παραµέτρους όταν τα λιποσώµατα προορίζονται για θεραπευτική χρήση και ιδιαίτερα όταν χορηγούνται παρεντερικά ή µε εισπνοή. Για τον προσδιορισµό του µεγέθους των λιποσωµάτων υπάρχει µια ποικιλία τεχνικών που διαφέρουν µεταξύ τους τόσο στην πολυπλοκότητα όσο και στις βασικές αρχές τους. Για την µέτρηση του µεγέθους των λιποσωµάτων χρησιµοποιούνται οι ακόλουθες τεχνικές: A. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (Scanning Electron Microscopy, SEM): Στην τεχνική αυτή µία λεπτή δέσµη ηλεκτρονίων µέσης ενέργειας από ένα λεπτό σύρµα βολφραµίου εστιάζεται µε σύστηµα µαγνητικών φακών σε µια επιφάνεια διαµέτρου 5-15 nm σε θάλαµο υπό κενό. Η δέσµη ηλεκτρονίων σαρώνει το προς παρατήρηση δείγµα σε µια σειρά µέχρι και 1000 διαδοχικών παράλληλων σαρώσεων. Οι ηλεκτρονικές αυτές σαρώσεις αλληλεπιδρούν µε το δείγµα και παράγουν διάφορα σήµατα, όπως δευτεροταγής εκποµπή ηλεκτρονίων (Secondary Electron Emission, SEE), οπίσθια σκέδαση ηλεκτρονίων (Back Scattered Electrons, BSE), ακτίνες Χ. Τα σήµατα ενισχύονται και εµφανίζονται σε οθόνη σωλήνα καθοδικών ακτινών όπου και φωτογραφίζονται. B. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία ιερχόµενης έσµης, (Transmission Electron Microscopy, TEM): είναι µια ακόµα τεχνική που χρησιµοποιείται για την παρατήρηση των λιποσωµάτων. Στην περίπτωση αυτή το δείγµα µεταφέρεται σε ένα διαφανές πλαστικό υπόστρωµα ή φιλµ άνθρακα (πάχους nm) το οποίο είναι τοποθετηµένο σε δίκτυο χαλκού. Το δείγµα σκεδάζει ηλεκτρόνια εκτός πεδίου παρατήρησης και η τελική εικόνα γίνεται ορατή σε φθορίζουσα οθόνη. Το ποσό σκέδασης ηλεκτρονίων εξαρτάται από το πάχος και τον ατοµικό αριθµό των ατόµων του µείγµατος. Με την τεχνική αυτή τα σωµατίδια φαίνονται διάχυτα φωτισµένα και έτσι µπορεί να µετρηθεί το µέγεθος και η συσσωµάτωσή τους, αλλά υπάρχει περιορισµένη ένδειξη του βάθους. 34

35 C. Τεχνική Παγωµένης Κατάτµησης (Freeze fracture technique): στην τεχνική αυτή είναι δυνατή η παρατήρηση των στοιβάδων και των εσωτερικών µορφολογικών χαρακτηριστικών τους (Fluck D.J et al., 1969). D. cryo EM(cryo-Electron Microscopy): τεχνική µε υψηλή ποιότητα αποτελεσµάτων (Dubochet J. et al., 1996). Εικόνα 1.10 Οπτικοποίηση ανθρώπινων ριβοσωµάτων µε cem Προσδιορισμός του ποσοστού του εγκλωβισμένου φαρμάκου σε λιποσώματα: Ο βαθµός εγκλωβισµού ενός φαρµάκου στα λιποσώµατα µπορεί να προσδιοριστεί µε τεχνικές χρωµατογραφίας στήλης ή µε άλλες τεχνικές. Το λιποσωµικό παρασκευάσµα είναι ένα µίγµα κλασµάτων εγκλωβισµένου και µη εγκλωβισµένου φαρµάκου. Το κλάσµα του µη εγκλωβισµένου φαρµάκου αναφέρεται ως ελεύθερο φάρµακο. Στην πλειοψηφία των τεχνικών ο διαχωρισµός του ελεύθερου από το εγκλωβισµένο φάρµακο για τον προσδιορισµό του ελεύθερου φαρµάκου αποτελεί το πρώτο πειραµατικό βήµα. Στη συνέχεια στο κλάσµα που περιέχει το εγκλωβισµένο φάρµακο προστίθενται ένα απορρυπαντικό προκειµένου να σπάσουν τα λιποσώµατα και το φάρµακο να απελευθερωθεί στο υδατικό µέσο. Το ελεύθερο πλέον φάρµακο προσδιορίζεται µε την κατάλληλη τεχνική. Το ποσοστό του εγκλωβισµένου φαρµάκου στα λιποσώµατα µπορεί επίσης να προσδιοριστεί από τον παγιδευµένο όγκο εντός του λιποσώµατος ανά βάρος λιπιδίου. Έτσι το ποσοστό του παγιδευµένου όγκου εκφράζεται ως ο παγιδευµένος όγκος / λιπίδιο και ποικίλει από 0,5µl/µmol για MLV και SUV συστήµατα µέχρι 30 µl/µmol για συστήµατα LUV. Ο παγιδευµένος όγκος υπολογίζεται µε διασπορά του λιπιδίου σε υδατικό µέσο το οποίο περιέχει ένα ραδιενεργό στοιχείο π.χ 22 Να ή Η, το οποίο δεν διαπερνά αµέσως τη διπλοστοιβάδα. Εναλλακτικά η καλσεΐνη µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον προσδιορισµό του παγιδευµένου εντός των λιποσωµάτων νερού ανά mol φωσφολιπιδίων. 35

36 1.1.8 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωμάτων: Στο παρακάτω σχήµα αναφέρονται οι διάφορες µεθοδολογίες παρασκευής λιποσωµάτων. Από αυτές θα περιγραφούν µόνο αυτές όπου χρησιµοποιήθηκαν στη παρούσα µελέτη ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΑΘΗΤΙΚΗΣ ΦΟΡΤΩΣΗΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΕΝΕΡΓΗΤΙΚΗΣ ΦΟΡΤΩΣΗΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΔΙΑΣΠΟΡΑΣ ΜΕΘΟΔΟΟΙ ΑΠΟΜΑΚΡΥΝΣΗΣ ΑΠΟΡΡΙΠΑΝΤΙΚΟ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΣΠΟΡΑΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΥΔΑΤΙΚΟΥ ΔΙΑΛΥΤΗ Μικρογαλακτωματοποιη τή Χρήση ακίδας υπερήχων. Γαλλική μέθοδος πίεσης κυττάρων. Εξώθηση μεμβράνης. Ανασύσταση αποξηραμένων κυστιδίων. Διαπίδυση (Dialysis). Χρωματογραφία στήλης. Αραίωση (ή Dilution). Έγχυση αιθανόλης. Έγχυση αιθέρα. Έγχυση διπλού γαλακτώματος. Αντίστροφης φάσης εξατμιζόμενα κυστίδια. Σταθερά πολυστοιβαδιακά Σχήµα 1.2 Μέθοδοι παρασκευής λιποσωµάτων Μηχανική διασπορά: Η τεχνική αυτή βασίζεται στο σχηµατισµό λεπτού υµενίου-λιπιδίου (thin lipid-film) µετά από εξάτµιση οργανικού ή οργανικών διαλυτών, στους οποίους έχει προηγουµένως διαλυθεί το λιπίδιο. Για να αποµακρυνθούν τα τελευταία ίχνη διαλύτη και για να αποφευχθεί η χηµική αποικοδόµηση του λιπιδίου π.χ. οξείδωση, το εσωτερικό της σφαιρικής φιάλης στο οποίο 36

37 σχηµατίζεται το λεπτό υµένιο, εκτίθεται σε ρεύµα αζώτου. Η ενυδάτωση (hydration) του υµενίου που ακολουθεί πραγµατοποιείται µε νερό ή µε ρυθµιστικό διάλυµα ή µε διάλυµα της προς εγκλωβισµό δραστικής ουσίας. Το στάδιο αυτό, όπως και το στάδιο της εξάτµισης των διαλυτών, πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασίες υψηλότερες της θερµοκρασίας µετάβασης φάσης του χρησιµοποιούµενου λιπιδίου. Προς τούτο το διάλυµα που προορίζεται για την ενυδάτωση έχει προθερµανθεί σε αυτή τη θερµοκρασία και η προσθήκη αυτού στη σφαιρική φιάλη γίνεται εντός υδατόλουτρου. Με µηχανική ανάδευση της φιάλης (vortex) το υµένιο αποκολλάται από τα τοιχώµατά της, οπότε λαµβάνεται µία θολερή διασπορά µε πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα µεγάλου µεγέθους MLV. Η µείωση του µεγέθους των MLV λιποσωµάτων και η δηµιουργία οµογενούς σε αναφορά µε το µέγεθος πληθυσµού, υλοποιείται µε τη χρήση κυρίως λουτρού υπερήχων (bath sonicator), αλλά και διαφόρων άλλων τεχνικών, όπως εξώθηση µέσω φίλτρων ή µεµβρανών (extrusion), µικρoγαλακτωµατοποίηση (microemulcification). Στο τελευταίο στάδιο πραγµατοποιείται η διαδικασία της ανόπτησης (annealing), κατά την οποία τα λιποσώµατα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο και πάντα σε θερµοκρασία υψηλότερη αυτής της µετάπτωσης του λιπιδίου, όπου παραµένουν για µία περίπου ώρα ώστε να ολοκληρωθεί και να οµαλοποιηθεί η µορφοποίηση της δοµής τους. Η διάµετρος των λιποσωµάτων που λαµβάνονται µε τη µέθοδο αυτή κυµαίνεται από 5 έως 6 µm κ.ά.. MLVs µε υψηλή αποδοτικότητα εγκλωβισµού µπορεί να προετοιµαστούν µε την ενυδάτωση του λιπιδίου παρουσία ενός µη αναµίξιµου οργανικού διαλύτη (πετρελαϊκός αιθέρας, διαιθυλικός αιθέρας). Το περιεχόµενο γαλακτωµατοποιείται µε υπέρηχους. Ο οργανικός διαλύτης αφαιρείται µε τη διαβίβαση ενός ρεύµατος αερίου αζώτου πάνω από το µίγµα. Τα MLVs διαµορφώνονται αµέσως στην υδάτινη φάση µετά από την αφαίρεση του οργανικού διαλύτη. Το κύριο µειονέκτηµα αυτής της µεθόδου είναι έκθεση των υλικών που τοποθετούνται σε κάψα στον οργανικό διαλύτη και υπερήχους Ακίδα υπερήχων: Κατά την παρασκευή λιποσωµάτων στο εργαστήριο αρχικά παρασκευάζεται συνήθως µια διασπορά πολυστοιβαδιακών MLV λιποσωµάτων. Η χρήση της ακίδας υπερήχων (probe sonication, εικ.11) στοχεύει στην µείωση των στοιβάδων των αρχικών διασπορών και κατ επέκταση στην µείωση της διαµέτρου τους, έτσι ώστε να παρασκευασθούν λιποσώµατα SUV. Λόγω της µεγάλης δύναµης τριβής που αναπτύσσεται µεταξύ της ακίδας και της λιποσωµικής διασποράς αποδεσµεύονται ρινίσµατα τιτανίου. Για την αποµάκρυνση του ιζήµατος ακολουθεί φυγοκέντριση του δείγµατος στις 15000rpm για περίπου 10min έτσι ώστε τα ρινίσµατα τιτανίου να εµφανιστούν ως ίζηµα στη βάση του δείγµατος και έπειτα να αποµακρυνθούν µε ευκολία από το δείγµα. 37

38 Εικόνα 1.11 Ακίδα υπερήχων Εξώθηση μέσω φίλτρων: Στα λιποσώµατα αυτού του τύπου η µείωση µεγέθους επιτυγχάνεται µε τη χρήση φίλτρων των οποίων οι πόροι έχουν συγκεκριµένη διάµετρο. Η µέθοδος παρουσιάζει το πλεονέκτηµα ότι παρέχει επαναλήψιµα αποτελέσµατα, ενώ το λιπίδιο δεν υφίσταται κάποια σηµαντική µεταβολή. Επιπλέον µπορεί να διπλασιαστεί το ποσοστό εγκλωβισµού διαφόρων ουσιών. Η εξώθηση µέσω φίλτρων διαµέτρου 0,2 µm οδηγεί σε εξαιρετικά οµοιογενείς πληθυσµούς λιποσωµάτων διαµέτρου 270 nm (Olson F.et al., 1979) Χρήση Μικρογαλακτωματοποιητή: Για την παρασκευή λιποσωµάτων µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν γαλακτωµατοποιητές (Mayhew E. et al., 1984). Οι µικρογαλακτωµατοποιητές είναι συσκευές που αντλούν το ρευστό, στην προκειµένη περίπτωση τα λιποσώµατα, µε πολύ υψηλές πιέσεις µέχρι και (10000 p.s.i., bar) µέσα από φίλτρα διαµέτρου 5µm. Στη συνέχεια διαπερνούν το µίγµα χωρισµένο σε δύο τµήµατα µε πολύ µεγάλη ταχύτητα, από µικρά κανάλια που αναµιγνύουν τα δύο ρεύµατα υπό ορθή γωνία παρέχοντας µε τον τρόπο αυτό πολύ µεγάλη ενέργεια. Τα λιπίδια εισάγονται στο µικρογαλακτωµατοποιητή µε τη µορφή εναιωρήµατος µεγάλων λιποσωµάτων MLV ή µε τη µορφή µη ενυδατωµένου λιπιδίου εντός υδατικού µέσου. Με την τεχνική αυτή παρασκευάζονται µικρά MLV λιποσώµατα µε καλή κατανοµή µεγέθους nm (micro emulsification liposomes, MEL). 38

39 Εξώθηση σε θάλαμο εφαρμογής μεγάλης πίεσης: Η τεχνική περιλαµβάνει την εισαγωγή προσχηµατισµένων µεγάλων λιποσωµάτων σε θάλαµο υπό µεγάλη πίεση ( p.s.i.), και αποδίδει οµοιογενείς µονο- ή ολιγοστοιβαδιακές λιποσωµικές διασπορές ενδιάµεσων µεγεθών (30 80 nm σε διάµετρο ανάλογα µε την εφαρµοζόµενη πίεση) (Barenholtz Y. et al., 1979). Τα λιποσώµατα που λαµβάνονται µε τη µέθοδο αυτή χρησιµοποιούνται για τη µεταφορά ευαίσθητων µακροµορίων και είναι πιο σταθερά από τα κατεργασµένα µε υπέρηχους λιποσώµατα Δυναμικό επιφάνειας λιποσωμάτων( Ζ-δυναμικό): Το ζ-δυναµικό (ή z-potential στην α.ο.) είναι ένας επιστηµονικός όρος ο οποίος χρησιµοποιείται για την µελέτη του ηλεκτροκινητικού δυναµικού των κολλοειδών συστηµάτων. Θεωρητικά το ζ-δυναµικό είναι το ηλεκτρικό δυναµικό που χαρακτηρίζει την εξωτερική επιφάνεια της διπλοστοιβάδας. Το εύρος τιµών του ζ-δυναµικού, στο οποίο οι λιποσωµικές δοµές είναι σταθερές κυµαίνεται για τιµές µικρότερες από -25 και τιµές µεγαλύτερες +25mV και είναι µια αυθαίρετη κλίµακα η οποία διαχωρίζει τις «χαµηλά» φορτισµένες επιφάνειες από τις «υψηλά» φορτισµένες επιφάνειες. Κολλοειδή µε υψηλό ζ- δυναµικό (θετικό ή αρνητικό) εµφανίζουν αυξηµένη ηλεκτρική σταθερότητα σε σχέση µε κολλοειδή µε χαµηλό ζ-δυναµικό που τείνουν να σχηµατίζουν θρόµβους είτα να υφίστανται συσσωµάτωση. Στην εικόνα 12 φαίνεται η φορτισµένη επιφάνεια ενός λιποσώµατος και η εξάρτηση του ζ- δυναµικού και του δυναµικού επιφανείας. Οι ιδιότητες των λιποσωµάτων εξαρτώνται ή επηρεάζονται σηµαντικά από την παρουσία φορτίου στην επιφάνειά τους, το οποίο επηρεάζει την κατανοµή ιόντων στο µέσο διασποράς Οι σηµαντικότεροι µηχανισµοί απόκτησης επιφανειακού ηλεκτρικού φορτίου από το µέσο διασποράς είναι ο ιονισµός, η προσρόφηση ιόντων και η διάλυση ιόντων από το κρυσταλλικό πλέγµα. Ιόντα αντίθετου φορτίου έλκονται από τη φορτισµένη επιφάνεια, ενώ οµώνυµα ιόντα απωθούνται από αυτή. Σχηµατίζεται ηλεκτρική διπλοστοιβάδα λόγω θερµικής κίνησης και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, η οποία επεξηγεί τα ηλεκτροκινητικά φαινόµενα που εµφανίζονται στις λιποσωµικές µορφές. Ονοµάζονται ηλεκτροκινητικά επειδή η επιβολή εξωτερικού δυναµικού σε λιποσωµικές παρασκευές προκαλεί κίνηση. Η ηλεκτροφόρηση προκαλεί την κίνηση φορτισµένων σωµατιδίων µέσα σε στάσιµο υγρό υπό την επίδραση εξωτερικά εφαρµοζόµενης διαφοράς δυναµικού. Η κίνηση αυτή µετράται µε Φασµατοσκοπία Συσχέτισης Φωτονίων (Photon Correlation Spectroscopy PCS). Από τις µετρούµενες κινητικότητες, δύο παράµετροι που χαρακτηρίζουν τις ηλεκτρικές ιδιότητες των λιποσωµάτων, µπορούν να υπολογισθούν: το ηλεκτρικό δυναµικό (ζ-potential) και η πυκνότητα του επιφανειακού φορτίου (surface charge density). 39

40 Εικόνα 1.12 Κατανοµή φορτίου στην επιφάνεια ενός λιποσώµατος. To ζ-δυναµικό σχετίζεται µε το δυναµικό επιφάνειας των σωµατιδίων και επηρεάζει µεγάλο φάσµα ιδιοτήτων των κολλοειδών συστηµάτων όπως τη σταθερότητά τους, την αλληλεπίδρασή τους µε ηλεκτρολύτες και φάρµακα, καθώς και τις ρεολογικές ιδιότητες των εναιωρηµάτων τους Ειδικοί δείκτεςπου χρησιμοποιούνται για μελέτες σταθερότητας φαρμακοτεχνικών μορφών σε λιποσώματα: είκτες που µπορούν εύκολα να µετρηθούν, µπορεί να είναι χρήσιµοι στα αρχικά στάδια εξέλιξης ενός λιποσωµικού προϊόντος. Ειδικοί δείκτες είναι κατάλληλοι για τη µελέτη σταθερότητας λιποσωµικών φαρµακοτεχνικών µορφών (χωρίς τη βιοδραστική ένωση) ή κατά την ανάπτυξη µιας φαρµακοτεχνικής µορφής για γρήγορη απελευθέρωση ενός φαρµάκου µε αλλαγή στη θερµοκρασία ή το ph. Ένας ιδανικός δείκτης θα πρέπει να έχει πολύ µεγάλη διαλυτότητα στο νερό για να διαχωρίζεται εύκολα από τα λιποσώµατα. Ο δείκτης δεν πρέπει να διαπεράσει τις λιποσωµικές µεµβράνες ή να αλληλεπιδρά µε τις µεµβράνες, κάτι το οποίο θα µπορούσε να οδηγήσει σε αλλαγές στις ιδιότητες τις µεµβράνης. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν και ραδιενεργοί δείκτες, αλλά είναι ακριβοί και επικίνδυνοι. Παρακάτω αναφέρονται µερικοί ειδικοί δείκτες που είναι διαθέσιµοι: 1. Arsenazo III 2.Ενζυµικοί δείκτες 40

41 Αλκαλική φωσφατάση (AP) Horseradish peroxidase (HRP) Οξειδάση γλυκόζης (GOX) 3. είκτες που φέρουν φθορίζοντες οµάδες Σουλφοροδαµίνη Καρβοξυ-φλουοροσκείνη (CF) (βλ. εικόνα 13) Εικόνα Carboxyfluorescein 1.2 Καλσείνη: Δομή και ιδιότητες της καλσείνης: Η καλσείνη (Calcein) είναι µια φθορίζουσα ουσία που φθορίζει όταν διεγερθεί στα 485nm (εκπέµπει στα 515nm). Χαρακτηριστική ιδιότητα της καλσείνης είναι ότι εµφανίζει το φαινόµενο του φθορισµού σε συγκεντρώσεις µικρότερες απο 100mM και σε υψηλότερη ο φθορισµός αποσβένειται (δηλαδή αν το διεγερμένο μόριο συγκρουστεί με άλλο μόριο, που βρίσκεται σε χαμηλότερο ενεργειακό επίπεδο, τότε η ενέργεια μπορεί να μεταφερθεί σε αυτό το μόριο χωρίς εκπομπή ακτινοβολίας. Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως απόσβεση φθορισμού).. Έχει χρησιµοποιηθεί ως συµπλοκοµετρικός δείκτης για την τιτλοδότηση ιόντων ασβεστίου µε EDTA και για τον φθορισµοµετρικό προσδιορισµό του ασβεστίου. Η καλσεΐνη χρησιµοποιείται ως δείκτης από το Είναι αποτελεσµατικός δείκτης και υπερτερεί των ραδιοϊσοτόπων στο χρησιµοποιούµενο εξοπλισµό για τον προσδιορισµό του, καθώς και στο ότι είναι ακίνδυνη ουσία και φθηνή. Είναι διαλυτή στο νερό ( ιαλυτότητα: 100 mg/2ml 1 M KOH σε 100 ml νερού) και εµφανίζεται σε πορτοκαλί κρυστάλλους. Το διάλυµα καλσεΐνης εκπέµπει ένα κίτρινο-πράσινο φθορισµό σε όξινες συνθήκες, όµως δε φθορίζει σε αλκαλικές συνθήκες. Εντούτοις, η καλσεΐνη φθορίζει παρουσία µεταλλοϊόντων όπως Al, Ba, Ca, Cu, Mg and Zn σε αλκαλικές συνθήκες και χρησιµοποιείται για το φθορισµοµετρικό προσδιορισµό τους κατά την τιτλοδότηση µε EDTA. Ο φθορισµός της καλσεΐνης εξαρτάται από το ph. Οι ιδιότητες της καλσείνης φαίνονται στον πίνακα 1.5: 41

42 Πίνακας 1.5 Χαρακτηριστικές ιδιότητες της καλσείνης. ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΤΥΠΟΣ C 30H 26N 2O 13 ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ g/mol ΣΗΜΕΙΟ ΤΗΞΕΩΣ ΣΗΜΕΙΟ ΒΡΑΣΜΟΥ DECOMPOSES Η καλσείνη ως πρότυπο υδατοδιαλυτού φαρμάκου: Η καλσείνη εδώ και αρκετά χρόνια χρησιµοποιείται ως µόριο-πρότυπο υδατοδιαλυτού φαρµάκου σε µεγάλο εύρος εργαστηριακών πειραµάτων λόγω της φθορίζουσας ιδιότητας της σε συγκεντρώσεις µικρότερες των 100mM, της ευκολίας στην παρασκευή της, καθώς και του χαµηλού της κόστους. καλσείνη Δ/μα καλσεΐνης EDTA Εφαρμογές της καλσείνης: Η καλσείνη-αμ(aceto-methoxy) είναι ένα παράγωγο της καλσείνης, το οποίο χρησιµοποιείται ευρύτατα στον τοµέα της βιολογίας καθώς µπορεί να µεταφερθεί µέσω των κυτταρικών µεµβρανών, καθιστώντας την έτσι εξαιρετικά χρήσιµη για την κατανόηση της βιωσιµότητας των κυττάρων και στην βραχυπρόθεσµη σήµανση τους. Ύστερα από τη µεταφορά της στο κύτταρο, ενδοκυτταρικές εστεράσες µετατοπίζουν το ΑΜ-group το µόριο 42

43 της καλσείνης (βλ. εικόνα 14) παγιδεύεται στο εσωτερικό του κυττάρου, δίνοντας έτσι ένα εξαιρετικά ισχυρό φθορισµό. Η καλσείνη-αμ χρησιµοποιείται επίσης για την ανίχνευση των αλληλεπιδράσεων, φαρµάκου-πρωτεϊνών (ABC-Transporters, ATP-binding). Η φθορίζουσα ιδιότητα της την καθιστά επιπλέον ως «πρότυπο» για την ανίχνευση των αλληλεπιδράσεων φαρµάκου-φαρµάκου και µπορεί να καθορίσει την συνοχή ενός φαρµάκου σε ένα κύτταρο κατά την διενέργεια πειραµάτων in vitro. Εικόνα 1.14 Το µόριο της καλσείνης Η καλσείνη σήµερα σπάνια χρησιµοποιείται ως δείκτης Ca 2+ ή Mg 2+ λόγω του ότι η ευαισθησία στον φθορισµό των ιόντων αυτών εµφανίζεται µόνο σε ισχυρά αλκαλικό ph και έτσι δεν είναι εύκολη η µέτρηση τους σε κύτταρα. Ο φθορισµός της καλσείνης αποσβένειται ισχυρά από ιόντα Co 2+, Ni 2+ και Cu 2+ και αισθητά από ιόντα Fe 2+ και Mn 2+ σε φυσιολογικό ph. Η απόκριση αυτή που παρουσιάζει ο φθορισµός, µπορεί να αξιοποιηθεί για την ανίχνευση της µετάπτωσης της διαπερατότητας των µιτοχονδριακών πόρων. Η καλσείνη χρησιµοποιείται επίσης για εντοπισµό κυττάρων καθώς και για µελέτες ενδοκυττάρωσης. 43

44 1.3 Μηχανισμοί και κινητικές αποδέσμευσης φαρμάκου: Μηχανισµοί αποδέσµευσης φαρµάκου από συστήµατα χορήγησης Στο παρακάτω σχήµα φαίνονται οι διάφοροι µηχανισµοι απελευθέρωσης φαρµάκων από συστήµατα χορήγησης: Drug release mechanisms Dissolution controlled system Diffusion controlled system Water Penetration controlled system Chemical controlled system Hydrogel Encapsulation Reservoir Swelling control Erodible Controlled Systems Matrix Matrix Osmotically control Drug covalently link to polymer Σχήµα 1.4 Μηχανισµοί αποδέσµευσης φαρµάκων, από φορείς χορήγησής τους. - Συστήµατα ελεγχόµενης διαλυτοποίησης: Στο σύστηµα αυτό, το βασικό στάδιο του ελέγχου του ρυθµού αποδέσµευσης είναι η διαλυτοποίηση. Η βιοδραστική ένωση ενσωµατώνεται αργά σε διαλύτη ή διαβρώσιµη µήτρα ή επικαλύπτεται από επιφάνεια που παρουσιάζει αργή διαλυτοποίηση. Το σύστηµα ελέγχου διαλυτοποίησης υφίσταται σε δύο µορφές: A. ιαλυτοποίηση µε ενκαψακίωση(encapsulation): Τα τεµαχίδια του φαρµάκου επικαλύπτονται ή εγκλωβίζονται µε τεχνικές µικροενθυλάκωσης χρησιµοποιώντας υλικά µε χαµηλή διαλυτότητα όπως είναι κυτταρίνη, πολυαιθυλενογλυκόλη, πολυµεθακρυλικοί εστέρες, κεριά κ.α. Ο ρυθµός διαλυτοποίησης εξαρτάται από τη διαλυτότητα και το πάχος της επικάλυψης. 44

45 B. Μήτρας(Matrix): Πρώτες ύλες για την παρασκευή των συστηµάτων αυτών είναι διάφορα είδη κεριών όπως είναι η κηρήθρα και το υδρογονωµένο καστορέλαιο, τα οποία ελέγχουν τη διάλυση της φαρµακοµορφής, ελέγχοντας το ρυθµό διαλυτοποίησης του υγρού που εισέρχεται στη µήτρα µεταβάλλοντας το ρυθµό προσρόφησης του πορώδους. - Συστήµατα ελεγχόµενης διάχυσης: Τα συστήµατα αυτά χαρακτηρίζονται από την εξάρτηση του ρυθµού απελευθέρωσης του φαρµάκου κατά τη διάχυση του σε αδρανή νερό. Υπάρχουν δύο τύποι συστηµάτων ελεγχόµενης διάχυσης: A. Συστήµατα διάχυσης δεξαµενής (Reservoir): Ένα τέτοιο σύστηµα απεικονίζεται στην παρακάτω εικόνα. Το σύστηµα αποτελείται από µια δεξαµενή η οποία επικαλύπτεται από βιοσυµβατό πολυµερές. Στο εσωτερικό της δεξαµενής είναι εγκλωβισµένα τα µόρια της δραστικής ουσίας (σε χρόνο t=0). Μετά από χρόνο t η αλληλεπίδραση του πολυµερούς µε το υγρό έκλουσης οδηγεί στην ελεγχόµενη αποδέσµευση των φαρµακοµορίων. B. Σύστηµα διάχυσης µήτρας: Εικόνα 1.15 Σύστηµα δεξαµενής Εικόνα 1.16 Σύστημα διάχυσης δεξαμενής και σύστημα διάχυσης μήτρας. 45

46 - Συστήµατα ελεγχόµενης διείσδυσης νερού: Στα συστήµατα ελεγχόµενης διείσδυσης νερού, ο ρυθµός απελευθέρωσης της δραστικής ουσίας εξαρτάται από την ικανότητα του νερού να εισέρχεται στο σύστηµα. ιακρίνονται σε δύο επιµέρους κατηγορίες: A. Συστήµατα ελέγχου διόγκωσης: Τα συστήµατα αυτά είναι αρχικά στεγνά, και όταν τοποθετηθούν στο σώµα απορροφούν νερό ή άλλα βιολογικά υγρά µε αποτέλεσµα την διόγκωσή τους. Η διόγκωση που προκαλείται στο σύστηµα αυξάνει την περιεκτικότητα του υδατικού διαλύτη εντός του σκευάσµατος, καθώς και το µέγεθος του πλέγµατος του πολυµερούς, επιτρέποντας έτσι τη διάχυση του φαρµάκου µέσω του διογκωµένου δικτύου, στο εξωτερικό περιβάλλον. B. Ωσµωτικά ελεγχόµενα συστήµατα απελευθέρωσης: Σε συστήµατα αυτού του τύπου, τα ωσµωτικά ενεργοποιούν τη βιοδραστική ένωση ή συνδυασµό ωσµωτικά ανενεργού φαρµάκου και NaCl περικλείεται εντός ηµι-περατής µεµβράνης από βιοσυµβατό πολυµερές (π.χ. οξικός εστέρας κυτταρίνης). Εικόνα 1.17 Ωσµωτικό σύστηµα - Συστήµατα χηµικά ελεγχόµενης αποδέσµευσης: Τα συστήµατα αυτά µεταβάλλουν την χηµική τους δοµή κατά την έκθεση τους σε βιολογικά υγρά. Στον τύπο αυτό των συστηµάτων παρατηρείται υποβάθµιση του πολυµερούς, ως αποτέλεσµα της υδρόλυσης, σε µικρότερα τµήµατα. ιακρίνονται δύο είδη: 46

47 A. Συστήµατα διάβρωσης: B. Σύστηµα αλυσίδας: Αποτελείται από γραµµικά ή οµο-συµπολυµερή τα οποία συνδέονται µε τα µόρια της δραστικής ουσίας. Τα φαρµακοµόρια απελευθερώνονται από το πολυµερές µε υδρόλυση είτε µε ενζυµική αποικοδόµηση των δεσµών τους. Κατά την εφαρµογή τέτοιων συστηµάτων επιτυγχάνεται κινητική µηδενικής τάξης οδηγώντας έτσι σε διάσπαση των δεσµών των µορίων. - Υδρογέλες: Τα συστήµατα αυτά είναι διογκωµένες τρισδιάστατες δοµές ύδατος συγκείµενα µε υδρόφιλα πολυµερή. Τα συστήµατα αυτά καθίστανται δυσδιάλυτα λόγω των φυσικών και χηµικών δεσµών που αναπτύσσουν. Οι φυσικοί δεσµοί αποτελούνται από κρυσταλλίτες, δεσµούς-h και δυνάµεις van der Waals. Οι δεσµοί αυτοί είναι υπεύθυνοι για την φυσική και χηµική ακεραιότητα της δοµής, παρέχοντας έτσι την απαιτούµενη προστασία σε ασταθή φάρµακα, πρωτεΐνες και πεπτίδια. Κινητικές αποδέσµευσης φαρµάκων Μαθηματικά μοντέλα που χρησιμοποιούνται σε μελέτες απελευθέρωσης φαρμάκων: Υπάρχει ένας µεγάλος αριθµός µαθηµατικών µοντέλων, τα οποία περιγράφουν την απελευθέρωση ενός φαρµάκου από διάφορα συστήµατα δοσολογίας. Λόγω ποιοτικών και ποσοτικών τροποποιήσεων που µπορεί να υποστεί ένα σύστηµα, παρατηρούνται διαφοροποιήσεις, τόσο στην απελευθέρωση της δραστικής ουσίας, όσο και στην απόδοση των in vivo πειραµάτων. Μια εξαιρετικά επιθυµητή εξέλιξη, είναι η ανάπτυξη κατάλληλων «εργαλείων», τα οποία βοηθούν στην ανάπτυξη του προϊόντος και ταυτόχρονα ελαττώνουν την αναγκαιότητα περαιτέρω βιολογικών µελετών. Από αυτή την άποψη, η χρήση δεδοµένων (από in vitro πειράµατα) διαλυτοποίησης φαρµάκων, µε σκοπό την in vivo πρόβλεψη της βιο- 47

48 απόδοσης αυτών, µπορεί να συσχετισθεί µε την ορθολογική ανάπτυξη ελεγχόµενων συστηµάτων αποδέσµευσης. Οι µέθοδοι προσέγγισης που χρησιµοποιούνται για την έρευνα της κινητικής απελευθέρωσης φαρµάκων από συστήµατα ελεγχόµενης αποδέσµευσης µπορεί να χωρισθούν σε τρείς κατηγορίες: A. Στατιστικές µέθοδοι (Statistical methods): (exploratory data analysis method, repeated measures design, multivariate approach [MANOVA: multivariate analysis of variance]. B. ***Μέθοδοι που εξαρτώνται από το πρότυπο (Model dependent methods): (Zero order, first order, Higuchi, Korsmeyer-Peppas model, Hixson Crowell, Baker- Lonsdale model, Weibull model). C. Μέθοδοι ανεξάρτητοι από το πρότυπο (Model independent methods): (difference factor, similarity factor). ***Στην παρούσα εργασία θα αναλυθούν οι µέθοδοι της κατηγορίας Β «Model dependent methods». DRUG RELEASE KINETICS MODELS ZERO- ORDER RELEASE MODEL FIRST- ORDER RELEASE MODEL HIXSON- CROWELL RELEASE MODEL HIGUCHI RELEASE MODEL KORSEME YER- PEPPAS RELEASE MODEL WEIBULL (function) RELEASE MODEL Σχήµα 1.5 Μαθηµατικά µοντέλα µελέτης κινητικής αποδέσµευσης. 48

49 Μοντέλα διάχυσης (Diffusion Models): ιάχυση είναι η φυσική τάση των µορίων να κινούνται από µια περιοχή όπου βρίσκονται σε µεγαλύτερη συγκέντρωση σε µια άλλη µε µικρότερη συγκέντρωση. Όταν το σύστηµα είναι αποµονωµένο τότε η διάχυση συνεχίζεται µέχρι την εξίσωση των συγκεντρώσεων στις δύο πλευρές της µεµβράνης. Η κίνηση προκύπτει από την κινητική ενέργεια των µορίων και δεν απαιτείται επιπλέον προσφορά ενέργειας. Η συµπεριφορά της µεµβράνης είναι «παθητική», σα να αδιαφορεί στο πέρασµα των µορίων. Το φαινόµενο της διάχυσης περιγράφεται µαθηµατικά από τους νόµους του Fick. Ο ρυθµός µε τον οποίο επιτυγχάνεται η εξίσωση των συγκεντρώσεων στις δύο πλευρές της µεµβράνης, εξαρτάται από διάφορους παράγοντες σύµφωνα µε το νόµο του Fick: = (1) όπου k = σταθερά διάχυσης, A = επιφάνεια διάχυσης, C 1 = συγκέντρωση έξω από τη µεµβράνη, C 2 = συγκέντρωση µέσα από τη µεµβράνη, d = πάχος µεµβράνης. Η σταθερά k εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά της µεµβράνης, µοριακό βάρος, λιποδιαλυτότητα, στερεοχηµεία, pka του φαρµάκου. Για µια συγκεκριµένη βιοδραστική ένωση, ο ρυθµός διάχυσης εξαρτάται αποκλειστικά από τη βαθµίδωση της συγκέντρωσης στις δύο πλευρές της µεµβράνης. Πολικά ουδέτερα µόρια (π.χ. µαννιτόλη) καθώς και ιονικές ενώσεις δεν µπορούν να περάσουν ή περνούν µε δυσκολία τις βιολογικές µεµβράνες, σε σύγκριση µε λιπόφιλες ενώσεις. Η εξίσωση των συγκεντρώσεων στις δύο πλευρές της µεµβράνης επιτυγχάνεται ταχύτερα µε φάρµακα που περνούν εύκολα τις βιολογικές µεµβράνες και ιδιαίτερα όταν το διάλυµα του φαρµάκου έρχεται σε επαφή µε µεγάλη περιοχή της επιφάνειας της µεµβράνης. Γενικά όσο µεγαλύτερος είναι ο συντελεστής κατανοµής τόσο µεγαλύτερη είναι η συγγένεια για τη λιποειδή µεµβράνη και τόσο µεγαλύτερος είναι ο ρυθµός διάχυσης του φαρµάκου (συντελεστής κατανοµής οκτανόλης/νερού). Μεγάλη λιποδιαλυτότητα σχετίζεται µε µόρια που έχουν ισχυρές ηλεκτραρνητικές οµάδες (C-O, C-S, C-Cl), ενώ η υδατοδιαλυτότητα σχετίζεται µε ενώσεις στις οποίες οι ηλεκτραρνητικοί υποκαταστάτες είναι ενωµένοι µε υδρογόνο (C-O-H) και µπορούν να σχηµατίσουν δεσµούς υδρογόνου µε τα µόρια του νερού. - Ροή αίµατος Η ροή του αίµατος διασφαλίζει τη συνεχή απορρόφηση του φαρµάκου αποµακρύνοντας τη βιοδραστική ένωση µόλις περάσει τη µεµβράνη (π.χ. εντερικό τοίχωµα). Η διαφορά των συγκεντρώσεων στις δύο πλευρές της µεµβράνης παραµένει µεγάλη. Για πολύ λιπόφιλα 49

50 φάρµακα η διάβαση της µεµβράνης είναι τόσο ταχεία που εξισώνονται οι συγκεντρώσεις στον τόπο απορρόφησης και το αίµα και η όλη διαδικασία απορρόφησης εξαρτάται από τη ροή του αίµατος και όχι από τη διαπερατότητα του φαρµάκου διαµέσου της µεµβράνης (π.χ. αιθανόλη). Αντίθετα η απορρόφηση πολικών φαρµάκων εξαρτάται από το ρυθµό διάχυσης και όχι από τη ροή του αίµατος (π.χ. ριµπιτόλη). Η απορρόφηση των φαρµάκων από το µυϊκό και υποδόριο ιστό εξαρτάται κυρίως από τη ροή του αίµατος γιατί ο ρυθµός διάχυσης είναι αρκετά µεγάλος. Το τοίχωµα των τριχοειδών είναι αρκετά χαλαρό και επιτρέπει την ταχεία διάβαση όλων των µορίων ιονισµένων ή µη µε µοριακό βάρος µέχρι 5000 (π.χ. νεοµυκίνη). Η παθητική διάχυση σε οµογενές µέσο υπακούει στους δύο νόµους του Fick A 1 ος Νόμος του FICK: Ο πρώτος νόµος του FICK αφορά τη ροή διάχυσης σε συνάρτηση µε την συγκέντρωση (µε την παραδοχή της σταθερής κατάστασης). Η υπόθεση βασίζεται στο ότι η διάχυση πηγαίνει από περιοχές υψηλής συγκέντρωσης σε περιοχές χαµηλής συγκέντρωσης και είναι ευθέως ανάλογη µε την κλίση της συγκέντρωση (χωρική παράγωγος). Η µαθηµατική έκφραση του νόµου συνοψίζεται στην παρακάτω εξίσωση: όπου: = (2) J = ροή διάχυσης (mol/m 2.sec), µετρά την ποσότητα της ουσίας που ρέει σε µια µικρή επιφάνεια σε µικρό χρονικό διάστηµα. D = συντελεστής διάχυσης (m 2 /sec). Φ = (για πρότυπα µίγµατα) συγκέντρωση σε διαστάσεις (mol/m 3 ) x = η θέση. X 50

51 Β 2 ος Νόμος του FICK: Η χρονική µεταβολή της συγκέντρωσης, σε κάθε σηµείο του διαλύµατος, είναι ανάλογη της χωρικής µεταβολής της βαθµίδας της συγκέντρωσης, σύµφωνα µε τη σχέση: όµως: = (3) = = (4) Το εκφράζει το ρυθµό µεταβολής της συγκέντρωσης σε ένα σηµείο, ενώ το εκφράζει τη χωρική µεταβολή της ροής. Το άλλο µέρος της ισότητας προκύπτει από απλή αντικατάσταση µε τον πρώτο νόµο του Fick. Κάθε σηµείο του χώρου µπορεί να έχει µια διαφορετική ροή. Ο ρυθµός µεταβολής της συγκέντρωσης είναι ανάλογος της διαφοράς της ροής από το ένα µέρος του χώρου σε ένα άλλο µέρος του χώρου. Το µείον εκφράζει ότι, όταν υπάρχει ροή τέτοια που αποσπά ύλη από ένα σηµείο, τότε η συγκέντρωση της ύλης σε αυτό το σηµείο µειώνεται, ενώ αντίστροφα όταν η ροή προσθέτει ύλη σε ένα σηµείο, τότε η συγκέντρωση αυξάνεται Κινητική μηδενικής τάξης (Zero Order Kinetic): Σε περίπτωση που δηµιουργήσουµε κάποιο θεραπευτικό σύστηµα που να παρέχει το ίδιο ποσοστό βιοδραστικής ένωσης σε κάθε µονάδα χρόνου, τότε η βιοδραστική ένωση αυτή θα απορροφάται µε σταθερό ρυθµό, ανεξάρτητο από τις µεταβολές συγκέντρωσής του τοπικά, διότι η συγκέντρωση θα είναι σταθερή. Κατά συνέπεια, µετά την αρχική άνοδο της συγκέντρωσης του φαρµάκου στο αίµα, αυτή θα σταθεροποιηθεί σε ένα επίπεδο και θα εξαρτάται µόνο από τον ρυθµό µε τον οποίο θα παρέχεται το φάρµακο από το σύστηµα. Με τον τρόπο αυτό απαλείφονται οι διακυµάνσεις του φαρµάκου στο αίµα και οι τυχόν ανεπιθύµητες ενέργειες που µπορεί να προκύψουν από αυτές. Η κινητική αυτή ονοµάζεται κινητική µηδενικής τάξης και εφαρµόζεται στα διαδερµικά και στα oros συστήµατα φαρµάκων. Σε αυτές τις περιπτώσεις µάλιστα µπορεί να ρυθµιστεί η συγκέντρωση του φαρµάκου στο πλάσµα στο ιδανικό θεραπευτικό επίπεδο για µεγάλα χρονικά διαστήµατα ή και συνεχώς. Στην κινητική µηδενικής τάξης η ταχύτητα µεταφοράς του φαρµάκου είναι σταθερή. Η κινητική µηδενικής τάξης εφαρµόζεται και κατά την αποβολή των φαρµάκων και 51

52 εκφράζεται ως σταθερή ποσότητα φαρµάκου που αποβάλλεται στη µονάδα του χρόνου, όταν οι µεταβολικές οδοί του συγκεκριµένου φαρµάκου βρίσκονται στα όριά τους. Αυτό συµβαίνει µε µεγάλες δόσεις φαρµάκων (zero order elimination). Τμήμα της καμπύλης που ακολουθεί κινητική Μηδενικής τάξης Χρόνος (ώρες) Εικόνα 1.18 Τυπικό διάγραµµα συστήµατος που ακολουθεί κινητική µηδενικής τάξης. Μας δείχνει την εξάρτηση της συγκέντρωσης του φαρµάκου στο σύστηµα (σε mg/l) από το χρόνο (πηγή: Nonlinear pharmacokinetic models PHAR7633). Μαθηµατική θεώρηση: Η διάλυση ενός φαρµάκου σε συστήµατα χορήγησης όπου παρατηρείται «αργή» απελευθέρωση της δραστικής ουσίας και τα µόρια του φαρµάκου δεν δηµιουργούν συσσωµατώµατα, µπορεί να περιγραφεί από την εξίσωση:! ="! (5) όπου: Q 0 = η αρχική ποσότητα του φαρµάκου στο διάλυµα (συνήθως Q 0 =0). Q t = η ποσότητα του φαρµάκου που έχει διαλυθεί σε χρόνο t. K 0 = η σταθερά που εκφράζει την κινητική µηδενικής τάξης (mg/h). Η παραπάνω εξίσωση µπορεί να εφαρµοστεί για την περιγραφή της διάλυσης δραστικών ουσιών από διάφορα συστήµατα χορήγησης (π.χ. διαδερµικά συστήµατα, ωσµωτικά συστήµατα κ.τ.λ.). 52

53 Κινητική πρώτης τάξης (First Order Kinetic): Τα περισσότερα φάρµακα απορροφώνται από τον εντερικό βλεννογόνο µε βάση τις αρχές της παθητικής διάχυσης και σε ρυθµό ανάλογο της συγκέντρωσής τους στην περιοχή. Όσο µεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση τοπικά τόσο µεγαλύτερη είναι η απορρόφηση. Επειδή µάλιστα η συγκέντρωση τοπικά εξαρτάται από την αρχική δόση, λογικό είναι η απορρόφηση να µειώνεται όσο περνά ο χρόνος. Λέγεται ότι µια βιοδραστική ένωση ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης, όταν απορροφάται ανάλογα µε την συγκέντρωσή του τοπικά στο έντερο µε αποτέλεσµα αρχικά τα επίπεδα να ανέρχονται, να φτάνουν την µέγιστη δυνατή πλασµατική συγκέντρωση και µετά βαθµιαία να κατέρχονται ακολουθώντας εκθετική µορφή καµπύλης µέχρι την επόµενη δόση. Για να συµβεί αυτό η βιοδραστική ένωση δεν πρέπει να µεταβολίζεται τοπικά, ούτε να απορροφάται µε ενεργητικό τρόπο. Τα φάρµακα που απορροφώνται σύµφωνα µε την κινητική πρώτης τάξης χαρακτηρίζονται από υψηλές συγκεντρώσεις στο αίµα που ακολουθούνται από χαµηλές συγκεντρώσεις στο αίµα. Το ιδανικό θεραπευτικό επίπεδο καλύπτεται για µικρό χρονικό διάστηµα. Στην κινητική πρώτης τάξης ή γραµµική κινητική, η ταχύτητα µεταφοράς του φαρµάκου είναι ευθέως ανάλογη των συγκεντρώσεων ή των διαφορών συγκεντρώσεων µεταξύ των διαµερισµάτων του σώµατος. Για περισσότερη ευκολία η κινητική πρώτης τάξης αφορά ένα διαµέρισµα του σώµατος. To ίδιο συµβαίνει και κατά την αποβολή των φαρµάκων. Κινητική 1ης τάξης κατά την αποβολή είναι η ποσότητα ενός φαρµάκου που αποβάλλεται από το σώµα στη µονάδα του χρόνου και είναι ανάλογη της ποσότητας του φαρµάκου στον οργανισµό. Τα περισσότερα φάρµακα αποβάλλονται µε αυτό τον τρόπο. Μοντέλα που υπακούν σε κινητική πρώτης τάξης έχουν χρησιµοποιηθεί ευρύτατα σε µελέτες απορρόφησης και απελευθέρωσης διαφόρων δραστικών ουσιών. Ωστόσο η σύλληψη του µηχανισµού τέτοιων συστηµάτων ακόµα και σε θεωρητική βάση αποτελεί και σήµερα µεγάλη πρόκληση. Η απελευθέρωση ενός φαρµάκου από σύστηµα που υπακούει σε κινητική πρώτης τάξης δίνεται από την εξίσωση: όπου: = " (6) K = σταθερά που εκφράζει την κινητική πρώτης τάξης (time -1 ). C = η συγκέντρωση του φαρµάκου στο σύστηµα σε χρόνο t. 53

54 Η παραπάνω εξίσωση µπορεί να γραφεί και µε τη µορφή: #$% #$%! = ".'!' (7) Οι παραπάνω εξισώσεις µπορούν να χρησιµοποιηθούν στην περιγραφή της διάλυσης δραστικών ουσιών από φαρµακευτικά συστήµατα χορήγησης, τα οποία µπορούν να εγκλωβίσουν υδατοδιαλυτά µόρια φαρµάκων σε πορώδεις µήτρες. ZERO ORDER KINETICS Vs FIRST ORDER KINETICS Συγκέντρωση φαρμάκου Σύστημα απελευθέρωσης που ακολουθεί κινητική Πρώτης τάξης (First Order). «Η ποσότητα του φαρμάκου που απελευθερώνεται ανά μονάδα χρόνου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του φαρμάκου» Σύστημα απελευθέρωσης που ακολουθεί κινητική Μηδενικής τάξης (Zero Order). «Σταθερή ποσότητα φαρμάκου απελευθερώνεται ανά μονάδα χρόνου» Χρόνος Εικόνα 1.19 Σύγκριση κινητικής πρώτης τάξης και κινητικής µηδενικής τάξης Πρότυπο Higuchi: Το πρώτο µαθηµατικό πρότυπο που χρησιµοποιήθηκε για να περιγράψει την απελευθέρωση φαρµάκου από σύστηµα µήτρας προτάθηκε το 1961 από τον T.Higuchi. Αρχικά το πρότυπο εφαρµόστηκε για συστήµατα µε επίπεδες επιφάνειες. Αργότερα το πρότυπο τροποποιήθηκε και επεκτάθηκε έτσι ώστε να εξυπηρετεί στην περιγραφή συστηµάτων µε διαφορετική γεωµετρία, χαρακτηριστικά µήτρας καθώς και πορώδεις δοµές. Το πρότυπο Higuchi βασίζεται στην υπόθεση ότι: 54

55 1. Η αρχική συγκέντρωση του φαρµάκου στη µήτρα είναι κατά πολύ υψηλότερη από την διαλυτότητα του φαρµάκου. 2. Η διάχυση του φαρµάκου αναλύεται σε συστήµατα µίας διάστασης. 3. Τα µόρια της δραστικής ουσίας είναι πολύ µικρότερα από το πάχος της µεµβράνης του συστήµατος. 4. Η διόγκωση της µήτρας και η διαλυτότητα της είναι αµελητέες. 5. Η διάχυση στο σύστηµα είναι σταθερή. 6. Οι ιδανικές συνθήκες επιτυγχάνονται πάντα στο εξωτερικό περιβάλλον (ή περιβάλλον της αποδέσµευσης. Κατά συνέπεια η µαθηµατική έκφραση του πρότυπου δίνεται από την εξίσωση: όπου: ( = =) * + + (8) Q = η ποσότητα του φαρµάκου που αποδεσµεύεται από το σύστηµα σε χρόνο t ανά µονάδα επιφάνειας Α. C = η αρχική συγκέντρωση του φαρµάκου στο σύστηµα. C S = η διαλυτότητα του φαρµάκου στη µήτρα. D= ο συντελεστής διάχυσης των φαρµακοµορίων στην επιφάνεια της µήτρας. Η παραπάνω εξίσωση έχει ισχύ καθ όλη τη διάρκεια της χορήγησης της βιοδραστικής ένωσης, έως την χρονική στιγµή όπου η βιοδραστική ένωση θα έχει απελευθερωθεί πλήρως από το σύστηµα της µήτρας. Για την µελέτη της διαλυτοποίησης ενός ετερογενούς επίπεδου συστήµατος µήτρας, στο οποίο η συγκέντρωση του φαρµάκου στη µήτρα είναι µικρότερη από τη διαλυτότητα και η αποδέσµευση του φαρµάκου υφίσταται δια µέσω των πόρων του συστήµατος της µήτρας, χρησιµοποιείται η παρακάτω εξίσωση: όπου: ( = =, (9) τ = η κάµψη που υφίσταται η µήτρα. δ = το πορώδες της µήτρας. Η παραπάνω σχέση χρησιµοποιείται για την περιγραφή της διάλυσης δραστικών ουσιών σε τροποποιηµένα φαρµακευτικά συστήµατα ελεγχόµενης αποδέσµευσης, όπως π.χ. διαδερµικά συστήµατα και δισκία µε υδατοδιαλυτή δραστική ουσία. 55

56 Η γενίκευση του πρότυπου οδηγεί στην απλοποιηµένη µορφή της εξίσωσης Higuchi: όπου: =" / (10) Q = η συνολική ποσότητα του φαρµάκου που έχει αποδεσµευτεί από το σύστηµα. Κ Η = η σταθερά Higuchi. t = ο χρόνος (σε h). Το πρότυπο Higuchi υποθέτει ότι η αποδέσµευση ενός φαρµάκου από ένα σύστηµα είναι αποτέλεσµα της διάχυσης. Συγκέντρωση Εικόνα 1.20 Σχηµατική απεικόνιση του πρότυπου Higuchi Πρότυπο Peppas-Korsmeyer: Ο Korsmeyer (et.al. 1983) εξήγαγε µια απλή σχέση, η οποία περιγράφει την αποδέσµευση µιας δραστικής ουσίας από ένα πολυµερικό σύστηµα. Για την κατανόηση του µηχανισµού αποδέσµευσης του φαρµάκου το 60% των δεδοµένων της απελευθέρωσης του φαρµάκου τοποθετήθηκε στην εξίσωση Peppas-Korsmeyer (Power Law): όπου: =" 3 (11) M t / M = είναι το κλάσµα που δίνει την απελευθέρωση του φαρµάκου σε χρόνο t. K = σταθερά ρυθµού απελευθέρωσης. n = σταθερά που εκφράζει τη γεωµετρία του συστήµατος (πίνακας 1.5). 56

57 Πίνακας 1.5 Τιµές της παραµέτρου n της εξίσωσης Peppas-Korsmeyer[22]. Εκθέτης απελευθέρωσης (n) Μηχανισµός µεταφοράς φαρµάκου Ρυθµός µεταβολής σε συνάρτηση του χρόνου 0.5 Fickian διάχυση t < n < 0.89 Non-Fickian διακίνηση t n Περίπτωση τύπου ΙΙ διακίνησης Απελευθέρωση µηδενικής τάξης n=1 Μεγαλύτερο απο 0.89 Ειδική περίπτωση τύπου ΙΙ διακίνηση t n-1 Η εξίσωση αυτή παρουσιάζει δύο ξεχωριστές φυσικές έννοιες σε δύο ειδικές περιπτώσεις για n=0.5 (απελευθέρωση φαρµάκου µε ελεγχόµενη διάχυση) και n=1. Για 0.5<n<1 η σταθερά n µπορεί να θεωρηθεί ως δείκτης της υπέρθεσης των δύο φαινοµένων Πρότυπο Hixon-Crowell: Οι Hixon και Crowell το 1931 αναγνώρισαν ότι τα σωµατίδια που βρίσκονται εντός µιας συγκεκριµένης περιοχής ενός συστήµατος χορήγησης είναι ανάλογα της κυβικής ρίζας του όγκου τους, σύµφωνα µε την εξίσωση: όπου: ' *4! ' *4 =" (12) W 0 = η αρχική ποσότητα του φαρµάκου που βρίσκεται µέσα στο σύστηµα. W t = η ποσότητα του φαρµάκου στο σύστηµα µετά από χρόνο t. K = σταθερά ενσωµάτωσης (εκφράζει τη σχέση µεταξύ όγκου-επιφάνειας). Η εξίσωση περιγράφει την αποδέσµευση δραστικών ουσίων από συστήµατα στα οποία παρατηρούνται µεταβολές τόσο στην επιφάνεια όσο και στη διάµετρο των µορίων των 57

58 συστηµάτων αυτών. Για την µελέτη της κινητικής αποδέσµευσης, αντλούνται δεδοµένα από in vitro µελέτες αποδέσµευσης και σχεδιάζονται ως η κυβική ρίζα του ποσοστού του φαρµάκου που παραµένει εγκλωβισµένο µέσα στη µήτρα του συστήµατος σε συνάρτηση του χρόνου. Στην εικόνα 1.21 παρατηρούµε την καµπύλη απελευθέρωσης της θεοφυλλίνης (από ταµπλέτα 270mg) σε συνάρτηση µε το χρόνο, όπως περιγράφηκε από το µοντέλο Hixson- Crowell. Απελευθέρωση θεοφυλλίνης (%) Χρόνος (ώρες) Εικόνα 1.21 Καµπύλη απελευθέρωσης θεοφυλλίνης (πρότυπου Hixon-Crowell) Πρότυπο Weibull: Μία γενική εµπειρική εξίσωση περιγράφηκε από τον Weibull το Η εξίσωση Weibull τροποποιήθηκε επαρκώς και προσαρµόστηκε κατάλληλα σε µηχανισµούς αποδέσµευσης/διάλυσης (Langenbucher, 1972). Η εξίσωση αυτή µπορεί να εφαρµοστεί και να επεξηγήσει επιτυχώς ένα µεγάλο εύρος καµπυλών διάλυσης (Goldsmith et al., 1978 Romero et al., 1991, Vudathala and Rogers, 1992). Όταν η εξίσωση εφαρµόζεται σε συστήµατα (µήτρας) κατά το στάδιο της αποδέσµευσης του φαρµάκου, εκφράζει το κλάσµα του φαρµάκου που απελευθερώνεται από το σύστηµα σε συνάρτηση µε το χρόνο: όπου: a = η παράµετρος κλίµακας = (13) b = η παράµετρος σχήµατος, η οποία χαρακτηρίζει την καµπύλη (εκθετική, σιγµοειδής ή παραβολοειδής). 58

59 Το πρότυπο αυτό δηµιουργήθηκε για την µελέτη αποδέσµευσης φαρµάκων όταν ο µηχανισµός είναι η διάχυση και εφαρµόζεται τόσο σε ευκλείδεια συστήµατα (µήτρες) όσο και σε συστήµατα fractals (Kosmidis et al., 2003a). Πρόσφατα αναπτύχθηκε η φυσική σηµασία που χαρακτηρίζει τις σταθερές της εξίσωσης a και b. Η σταθερά b είναι ένας δείκτης ο οποίος χαρακτηρίζει το µηχανισµό µεταφοράς του φαρµάκου δια µέσω των πολυµερικών µητρών (Papahadjopoulos et al., 2006). Η τιµή της σταθεράς a είναι άρρηκτα συνδεδεµένη µε την επιφάνεια της µήτρας του εκάστοτε συστήµατος (Kosmidis et al., 2003b). Το πρότυπο Weibull είναι ένα εµπειρικό πρότυπο (Paulo Costa et al., 2001) και έτσι δεν διακατέχεται από κάποιο θεµελιώδη νόµο της κινητικής. Για το λόγο αυτό έχει δεχθεί πλήθος κριτικών και αµφισβητήσεων. Κάποιες από αυτές συνοψίζονται παρακάτω: Μπορεί απλά να περιγράψει την κινητική ενός συστήµατος, όµως δεν έχει την ικανότητα να αναλύσει ενδελεχώς τις κινητικές ιδιότητες της διαλυτοποίησης µιας δραστικής ουσίας. εν υπάρχει καµία ενιαία παράµετρος που σχετίζεται µε το ενδογενή ρυθµό διάλυσης του φαρµάκου. Έχει περιορισµένη χρήση τόσο σε in vivo όσο και σε in vitro µελέτες. Παράγοντας διαμόρφωσης σχήματος της καμπύλης της εξίσωσης Weibull Εικόνα 1.22 Η µορφή της καµπύλης Weibull για διάφορες τιµές της σταθεράς β. Στην εικόνα 1.22 παρατηρούµε την διαµόρφωση του σχήµατος της καµπύλης της συνάρτησης Weibull υπό την µεταβολή της παραµέτρου b. Για παράδειγµα, όταν η τιµή της παραµέτρου b=1 αναπαριστά µια εκθετική κατανοµή, όταν b=2 παρατηρούµε µια κατανοµή Raleigh, ενώ για τιµές b=3 ή µεγαλύτερες παρατηρούµε µια σχεδόν κανονική κατανοµή. 59

60 1.4 Επίδραση του χρόνου υστέρησης (lag time) στην εκτίμηση των παραμέτρων φαρμακοκινητικών μοντέλων: Ο χρόνος υστέρησης σε φαρµακοκινητικές µελέτες αναφέρεται στο πεπερασµένο χρόνο που απαιτείται έτσι ώστε η βιοδραστική ένωση να µεταβεί στη συστηµατική κυκλοφορία ακολουθώντας εξωαγγειακή χορήγηση. Ο χρόνος υστέρησης είναι ο αντικατοπτρισµός των διαδικασιών που συνδέονται µε τη φάση απορρόφησης µιας φαρµακοµορφής (όπως π.χ. η διαλυτοποίηση ή η απελευθέρωση ενός φαρµάκου) από συστήµατα µεταφοράς φαρµάκων στις επιφάνειες προς απορρόφηση. Η αδυναµία του καθορισµού του χρόνου υστέρησης σε ένα σύστηµα µπορεί να οδηγήσει σε ακατάλληλες ή λανθασµένες εκτιµήσεις των παραµέτρων ενός συστήµατος µοντελοποίησης. Γενικότερα ο χρόνος υστέρησης (lag timet lag ) αναφέρεται ως η χρονική καθυστέρηση µεταξύ της φαρµακευτικής χορήγησης και της εµφάνισης/εντοπισµού αυτής στα βιολογικά υγρά (π.χ. αίµα, ούρα). Ο χρόνος υστέρησης µπορεί να οφείλεται σε καθυστερηµένη απελευθέρωση των φαρµακοµορίων ενός σκευάσµατος λόγω ιδιοµορφιών που µπορεί µα εµφανιστούν κατά την παρασκευή ενός συστήµατος ελεγχόµενης χορήγησης. Τυπικά, µακράς διάρκειας χρόνοι υστέρησης παρατηρούνται συχνά σε εντεροδιαλυτές ταµπλέτες φαρµάκων, οι οποίες καθυστερούν κατά την γαστρική κένωση. Ο χρόνος υστέρησης αντανακλάται βασικά σε µια φάση υστέρησης που εµφανίζεται σε αρκετές µικροδιαδικασίες κατά την φάση απορρόφησης συστηµάτων ελεγχόµενης χορήγησης, όπως είναι: 1. ιάλυση και διασπορά. 2. ιαλυτοποίηση και απελευθέρωση φαρµάκων. 3. «Μετανάστευση» των φαρµακοµορίων στην επιφάνεια απορρόφησης. Οι φαρµακοκινητικές µελέτες περιλαµβάνουν τον µαθηµατικό χαρακτηρισµό διαδικασιών όπως: 1. Η Απορρόφηση (absorption). 2. Η ιάλυση (dissolution). 3. Η Κατανοµή (distribution). 4. Η Απέκκριση (excretion). 5. Η Βιοµετατροπή (biotransformation). Η εµφάνιση του χρόνου υστέρησης (lag time) σε µια πειραµατική διαδικασία παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον κατά την χρονικά καθυστερηµένη εκτέλεση των παραπάνω διαδικασιών, λόγω φαρµακοτεχνικών ιδιοµορφιών ή/και οργανικών λειτουργιών. 60

61 Στην παρακάτω εικόνα (εικ.23) παρατηρείται η διαφοροποίηση της κινητικής αποδέσµευσης ενός αντιισταµινικού φαρµάκου µετά το χρόνο υστέρησης (lag time) ενός παλµικού συστήµατος ελεγχόµενης χορήγησης: Απελευθέρωση φαρμάκου Χρόνος υστέρησης Χρόνος Εικόνα 1.23 Κινητική αποδέσμευσης αντιισταμινικής δραστικής ουσίας κατά την παρέλευση του χρόνου υστέρησης (lag time). A: Πρότυπη σιγμοειδής αποδέσμευση, Β & C: Καθυστερημένη αποδέσμευση μετά τον αρχικό χρόνο υστέρησης (Πηγή: Pharma tutor). 1.5 Τυχαίοι αριθμοί Προσομοίωση Monte Carlo σε Fortran: Τυχαίοι αριθμοί: Στην παράγραφο αυτή θα προσπαθήσουµε να επεξηγήσουµε τις βασικές αρχές που διέπουν την τεχνική Monte Carlo καθώς και τη λειτουργία αυτής στο περιβάλλον προγραµµατισµού της Fortran. Οι τυχαίοι αριθµοί παίζουν πολύ σηµαντικό ρόλο τόσο στην επίλυση επιστηµονικών προβληµάτων, όσο και σε γενικότερου ενδιαφέροντος εφαρµογές (π.χ. τυχερά παιχνίδια). Υπάρχουν δύο ειδών επιστηµονικά προβλήµατα που µπορούν να επιλυθούν µε τη χρήση των τυχαίων αριθµών: 1. Αυτά που από τη φύση τους εµπεριέχουν το στοιχείο της τυχαιότητας (π.χ. η εκποµπή ηλεκτρονίων από κατάλληλα θερµαινόµενο µέταλλο εντός ηλεκτρικού πεδίου). 2. Και αυτά που είναι πιο συµφέρον να εντοπιστούν µέσω τυχαίας δειγµατοληψίας αντί πλήρους (π.χ. η κίνηση Brown). Επίσης οι τυχαίοι αριθµοί είναι πάντοτε χρήσιµοι στη προσοµοίωση φαινοµένων που δεν περιλαµβάνουν πειραµατικά δεδοµένα ή είναι πολύ ακριβή ή επικίνδυνη η διαδικασία καταγραφής τους. Το βασικό πρόβληµα που παρουσιάζεται κατά την εφαρµογή τέτοιων 61

62 µεθόδων είναι η παραγωγή πραγµατικά τυχαίων αριθµών. Αυτό µπορεί να γίνει µόνο εάν οι αριθµοί παράγονται από ένα πραγµατικά τυχαίο φαινόµενο. Ένα τέτοιο σύνολο τυχαίων αριθµών, µπορεί να παραχθεί µε τον ακόλουθο τρόπο: χρησιµοποιώντας ένα πολύ ευαίσθητο ανιχνευτή ιονισµού αερίου µετράµε τη ραδιενεργή διάσπαση (radioactive decay) των σωµατιδίων α που εκπέµπει το ραδιενεργό 235 U. Η εκποµπή αυτή λαµβάνει χώρα σε εντελώς τυχαίες χρονικές στιγµές, οι οποίες καταγράφονται και στη συνέχεια µετατρέπονται σε αριθµούς. Τότε έχει πλέον παραχθεί και καταγραφεί ένα σύνολο πραγµατικά τυχαίων αριθµών το οποίο µπορεί να χρησιµοποιηθεί στη συνέχεια σε µεγάλο πλήθος εφαρµογών. Φυσικά η εφαρµογή τέτοιων µεθόδων είναι σχεδόν αδύνατο να ακολουθηθεί σε κάθε περίπτωση που χρειαζόµαστε τυχαίους αριθµούς. Συνήθως χρησιµοποιούµε κάποιο αλγόριθµο παραγωγής τυχαίων αριθµών, οι οποίοι βέβαια είναι ψευδοτυχαίοι µιας και σχετίζονται µεταξύ τους µέσω του αλγορίθµου. Η µέθοδος κατασκευής ψευδοτυχαίων αριθµών, συνίσταται στην εύρεση µιας συνάρτησης, που να απεικονίζει µε τυχαίο τρόπο το σύνολο των ακεραίων στον εαυτό του και στη συνέχεια σε κάποιο υποσύνολό του IⱤ. Αρχικά οι απεικονίσεις αυτές επιλέγονται χωρίς κάποιο θεωρητικό υπόβαθρο (απλώς ήταν όσο το δυνατό πιο πολύπλοκες), εξασφαλίζοντας µε τον τρόπο αυτό την τυχαιότητα της απεικόνισης. Η πιο συνηθισµένη τέτοια συνάρτηση, η οποία παράγει µια ακολουθία τυχαίων αριθµών x 1,x 2,..,x n είναι της µορφής: 9 :;< ==9 : +?@ABC όπου οι a,b,c είναι αυθαίρετες ακέραιοι παράµετροι, οι αριθµοί x i είναι πραγµατικοί και ανήκουν στο πεδίο ορισµού (0,1). Η µέθοδος αυτή βασίζεται στην απρόβλεπτη συµπεριφορά της συνάρτησης mod για πολύ µεγάλους αριθµούς. Προσομοίωση Monte Carlo σε Fortran: Η Fortran 90/95 έχει ενσωµατώσει µια γεννήτρια ψευδοτυχαίων αριθµών, που είναι πολύ πιο αξιόπιστη από την απλή εξίσωση που παρουσιάστηκε παραπάνω, στην εγγενή συνάρτηση RANDOM_NUMBER, απλοποιώντας κατά πολύ τη δουλειά του χρήστη. Όπως είπαµε οι τυχαίοι αριθµοί είναι πολύ χρήσιµοι στη προσοµοίωση φαινοµένων όπου η µέθοδος φέρει τη γενική ονοµασία Monte Carlo. 62

63 2.ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΈΡΟΣ 63

64 2.1 Οργανολογία-Συσκευές: Τα όργανα και οι συσκευές που χρησιµοποιήθηκαν κατά την πειραµατική διαδικασία είναι: A. Ακίδα υπερήχων (Probe Sonicator Sonics - Vibra Cell) B. Φυγόκεντρος ( Biofuge 28 RS, HERAEUS SEPATECH) C. Λουτρό υπερήχων (Branson, Bransonic ultrasonic 2510): D. Φθορισµόµετρο (Shimadzu, RF-5301 PC) E. Περιστρεφόµενος εξατµιστήρας (Rotary Evaporator- BUCHI RE 111) F. Μαγνητικός αναδευτήρας (IKAMAG RH JANKE & KUNKEL) G. Μηχανικός Αναδευτήρας Vortex(A-100 Micrel) H. Οσµόµετρο (Osmometer Loser Micro Digital Osmometer mod 200 plus Camlab): I. Zetasizer (Malvern nano ZS, Malvern Instrument UK): J. Φαρµακευτικός ζυγός (Hellamco Mettler Toledo) K. ph-μετρο (WTW, ph 5220 L. Φασµατοφωτόµετρο, Spectrophotometer UV-Vis (Shimadzu UV-mini 1240) 64

65 2.2 Αντιδραστήρια Παρασκευή διαλυμάτων (stock) λιπιδίων: Για την Παρασκευή των λιποσωµάτων χρησιµοποιήθηκαν τα εξής αντιδραστήρια: 1. ιάλυµα φωσφατιδυλοχολίνης (PC) συγκέντρωσης 20 mg/ml. 2. ιάλυµα χοληστερόλης (Chol) συγκέντρωσης 10 mg/ml. 3. ιάλυµα πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG) συγκέντρωσης 10 mg/ml. Το διάλυµα της φωσφατιδυλοχολίνης παρασκευάστηκε µε προσθήκη φωσφατιδυλοχολίνης αυγού (egg-pc) σε µείγµα χλωροφορµίου-µεθανόλης αναλογίας 2:1 (βλ. εικόνα 2.1) µε την αρχική συγκέντρωση να ρυθµίζεται στα 20 mg/ml (ζυγίστηκαν 200mg PC τα οποία προστέθηκαν σε ογκοµετρική φιάλη που περιείχε διάλυµα CHCl 3 -MeOH µε τελικό όγκο 10ml). Το διάλυµα της χοληστερόλης παρασκευάστηκε µε προσθήκη χοληστερόλης στο ίδιο ακριβώς µείγµα διαλυτών και η συγκέντρωση της ρυθµίστηκε στα 10mg/ml (ζυγίστηκαν 100mg χοληστερόλης ακολουθώντας την ίδια διαδικασία µε αυτή της PC). Τέλος η πολυαιθυλενογλυκόλη παρασκευάστηκε µε προσθήκη σκόνης DSPE-PEG 2000 (1,2- διστεαροϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφοαιθανολαµίνη-ν-φολικού(πολυαιθυλενογλυκόλη)-2000) στον ίδιο ακριβώς διαλύτη µε την συγκέντρωσή της να ρυθµίζεται στα 10 mg/ml Παρασκευή διαλύματος καλσεϊνης - Μέτρηση οσμωτικότητας καλσεϊνης: Για την παρασκευή διαλύµατος καλσείνης τελικής συγκέντρωσης 0.1Μ χρησιµοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντιδραστήρια: Καλσεΐνη (calcein stock SIGMA-ALDRICH) ζυγίστηκαν 1.245g σε σκόνη. Αιθυλενοδιαµινοτετραοξικό οξύ (EDTA-SERVA) g. Ισότονο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (PBS). Αναλυτικά η διαδικασία παρασκευής του διαλύµατος: Αρχικά σε ποτήρι ζέσεως τοποθετούµε τις επί µέρους ουσίες στη µάζα που µετρήθηκαν µε ταυτόχρονη προσθήκη 6ml ρυθµιστικού διαλύµατος PBS (ph = 7.4). Στη συνέχεια στο ποτήρι τοποθετείται µαγνήτης, εφαρµόζεται σε θερµαινόµενο µαγνητικό αναδευτήρα και ξεκινά η προσθήκη καυστικού νατρίου (NaOH) συγκέντρωσης 6Ν (υπό αραίωση) έτσι ώστε να επιτευχθεί το επιθυµητό ph του διαλύµατος (προσοχή: προτείνεται η χρήση σταγόνων αραιωµένου καυστικού νατρίου καθώς πυκνό καυστικό νάτριο µπορεί να προκαλέσει απότοµη αύξηση του ph. Σε αυτή την περίπτωση προσθέτουµε σταγόνες υδροχλωρικού οξέως (HCL) σε συγκέντρωση 6Ν έτσι ώστε να µειώσουµε το ph στα επιθυµητά επίπεδα. Η 65

66 λανθασµένη ή βιαστική προσθήκη των δύο βάσεων µπορεί να οδηγήσει σε αναγκαστική προσθήκη µεγάλων ποσοτήτων αυτών και κατ επέκταση σε ανεπιθύµητες τιµές στην οσµωτικότητα του διαλύµατος). Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται στο δηλαδή σε τιµές ph κοντά σε αυτές του buffer. Εν συνεχεία αφού το διάλυµα έχει διαλυθεί, τοποθετούµε το διάλυµα σε ογκοµετρική φιάλη των 10ml και προσθέτουµε απεσταγµένο νερό (dd-h 2 O) µέχρι τον όγκο αυτό. Καθ όλη τη διάρκεια της διαδικασίας ελέγχουµε τακτικά το ph. Τέλος το διάλυµα καλσεϊνης προστίθεται σε φιάλη των 20ml και τοποθετείται στο ψυγείο µε περιτύλιξη αλουµινόχαρτου έτσι ώστε να αποφευχθεί η έκθεση του στο φώς y = x - 2 5, R ^ 2 = Απορρόφηση (nm) Absorption (nm) C o n c e n t r a t io n ( n g ) Συγκέντρωση (ng) ιάγραµµα 2.1 Πρότυπη καµπύλη καλσείνης Οσμομέτρηση της καλσείνης: Η µέτρηση της οσµωτικότητας της καλσείνης έγινε στον αυτόµατο οσµωµετρητή (MOD 200 PLUS). Η διαδικασία της οσµωµέτρησης ξεκινά µε την προσθήκη σε ependorf 100µl των ακολούθων: 1. dd-h 2 O 2. χλωριούχο νάτριο (150Mm) 3. ισότονο ρυθµιστικό διάλυµα PBS 4. δείγµα του διαλύµατος της καλσείνης Τα παραπάνω διαλύµατα τοποθετήθηκαν κατά σειρά στον οσµωµετρητή δίνοντας αντίστοιχα τις ακόλουθες ενδείξεις σε mo (miliosmol): dd-h 2 O 300mO, NaCl 326mO, PBS(pH= 7.4) 312mO, Calcein 337mO Παρασκευή ισότονου ρυθμιστικού διαλύματος (PBS): Για την παρασκευή του ισότονου ρυθµιστικού διαλύµατος PBS τελικού όγκου 2lt χρειάστηκαν τα εξής: Χλωριούχο κάλιο (KCl): g 66

67 ιβασικό φωσφορικό νάτριο (Na 2 HPO 4 ): g Χλωριούχο νάτριο (NaCl): 16g Φωσφορικό κάλιο (KH 2 PO 4 ): g Νατραζίδιο (NaN 3 ): g Στη συνέχεια τα συστατικά τοποθετούνται σε κωνική φιάλη των 2000ml και συµπληρώνουµε µε απιονισµένο νερό έως τον όγκο αυτό. Τοποθετούµε την φιάλη στον µαγνητικό αναδευτήρα και αφήνουµε το διάλυµα να αναδυθεί έως ότου τα συστατικά του διαλυθούν εντελώς. Με την προσθήκη σταγόνων πυκνού διαλύµατος υδροχλωρικού οξέος (HCl) ρυθµίζουµε το ph του διαλύµατος στο 7.4. Τέλος το διάλυµα από την κωνική φιάλη µεταφέρεται στο δοχείο και τοποθετείται στο ψυγείο στους 4 C Διάσπαση λιποσωμάτων με Triton X-100: Eίναι ένα µη ιονικό επιφανειοδραστικό το οποίο έχει µια υδρόφιλη αλυσίδα πολυαιθυλενοξειδίου (κατά µέσο όρο έχει 9.5 µονάδες οξειδίου του αιθυλενίου) και έναν αρωµατικό υδρογονάνθρακα. Για την διάσπαση των λιποσωµάτων χρησιµοποιήθηκε διάλυµα απορρυπαντικού Triton X-100 τελικής συγκέντρωσης 10% το οποίο παρασκευάστηκε µε αναλόγια 10:1 κατά την διάλυση 3ml Triton X-100 (SIGMA) σε 27ml PBS (ph 7.4). Λόγω της έντονα παχύρευστης δοµής του το διάλυµα τοποθετήθηκε για ανακίνηση αρκετές ώρες ώστε να υγροποιηθεί πλήρως Προσδιορισμός συγκέντρωσης λιπιδίου: Για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης του λιπιδίου χρησιµοποιήθηκαν: 1. Χλωροφόρµιο (CHCl 3 ) (MERCK). 2. ιάλυµα Stewart, (που αποτελείται από: 27.03g FeCl 3 6 H 2 O (Iron (III) chloride Hexahydrate) (MERCK). 30.4g NH SCN (Ammonium thiocyanate) (MERCK). Τα παραπάνω ζυγίζονται και µεταφέρονται σε ογκοµετρική φιάλη του 1lt, ακολουθεί προσθήκη 1lt απεσταγµένου νερού και το µίγµα τοποθετείται σε µαγνητικό αναδευτήρα). Το τελικό διάλυµα αποθηκεύεται σε ογκοµετρική φιάλη και διανέµεται σε εύχρηστα φιαλίδια. 2.3 Μεθοδολογία: Παρασκευή MLV λιποσωμάτων σε διαφορετικές συστάσεις λιπιδίων: Για την παρασκευή των MLV (βλ. εικόνα 2.1 τρόπος παρασκευής λιποσωµάτων), ο αντίστοιχος όγκος διαλύµατος του επιθυµητού κάθε φορά λιπιδίου (PC), καθώς και ο 67

68 απαιτούµενος όγκος διαλύµατος χοληστερόλης και πολυαιθυλενογλυκόλης, στην περίπτωση παρασκευής λιποσωµάτων που περιέχουν και χοληστερόλη ή/και PEG στη µεµβράνη τους µεταφέρονται σε σφαιρική φιάλη των 50ml µε ταυτόχρονη προσθήκη 3-4ml χλωροφορµίου. Οι όγκοι των διαλυµάτων των λιπιδίων και του διαλύµατος χοληστερόλης/peg που χρησιµοποιούνται κάθε φορά υπολογίζονται, ώστε η τελική συγκέντρωση των λιποσωµάτων που παρασκευάζονται να είναι 5mg/ml. Η µέθοδος που χρησιµοποιείται για την παρασκευή των MLV λιποσωµάτων είναι η µέθοδος ενυδάτωσης λεπτού υµενίου ή thin film hydration method, η οποία παρουσιάζεται σχηµατικά στην παρακάτω εικόνα: Εικόνα 2.1 Σχηµατική αναπαράσταση της παρασκευής λιποσωµάτων MLV. Όπως φαίνεται και στην εικόνα 2.1, η σφαιρική φιάλη εφαρµόζεται σε περιστρεφόµενο εξατµιστήρα υπό κενό για την αποµάκρυνση των οργανικών διαλυτών σε θερµοκρασία υψηλότερη από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου (για το PC, η θερµοκρασία µετάπτωσης φάσης του λιπιδίου βρίσκεται λίγο πάνω από τους 40 C), που χρησιµοποιείται κάθε φορά. Η διαδικασία αυτή ολοκληρώνεται µε το σχηµατισµό ενός λεπτού υµενίου στα τοιχώµατα της φιάλης. Έπειτα η φιάλη τοποθετείται σε ρεύµα αζώτου για περίπου 5min έτσι ώστε να αποµακρυνθούν τυχόν ίχνη διαλύτη, αλλά και για την αποφυγή χηµικής αποικοδόµησης του λιπιδίου. Στη συνέχεια το λεπτό υµένιο ενυδατώνεται µε 1ml διαλύµατος καλσείνης (ph=7,4) προκειµένου η τελευταία να εγκλωβιστεί στα λιποσώµατα. Μετά την προσθήκη του διαλύµατος καλσεΐνης η φιάλη αναδεύεται µηχανικά (vortex) µέχρι το υµένιο να αποκολληθεί από τα τοιχώµατα της φιάλης. Τελικά σχηµατίζεται µια θολερή διασπορά πολυστοιβαδιακών λιποσωµάτων µεγάλου µεγέθους. Θα πρέπει να σηµειώσουµε ότι κατά την χρήση του Vortex η αποκόλληση του λεπτού υµενίου ήταν αρκετά χρονοβόρα για το λόγο αυτό χρησιµοποιήσαµε το λουτρό υπερήχων (σ.σ. µε ιδιαίτερη προσοχή ώστε να µη σπάσει η φιάλη). Έτσι στην περίπτωση αυτή η διαδικασία της αποκόλλησης εκτός από τη µηχανική ανάδευση περιλαµβάνει και την τοποθέτηση της φιάλης σε υδατόλουτρο υπερήχων του οποίου η θερµοκρασία ρυθµίστηκε σε υψηλότερη θερµοκρασία από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου. 68

69 2.3.2 Ελάττωση του μεγέθους και των στοιβάδων των λιποσωμάτωνπαρασκευή λιποσωμάτων-suv: Στην παρούσα µελέτη παρασκευάστηκαν οι λιποσωµικές σειρές που παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας- 2.1 Λιπιδικές συστάσεις SUV λιποσωµάτων. A/A LIPIDS COMPOSITIONS MOLAR RATIO OF INGRIDIENTS PC CHOLE- STEROL METHOXY- PEG PC PC/CHOL(4:1) PC/CHOL(2:1) PC/CHOL(1:1) PC/CHOL (2:1) + PEG2000 (2M %) 65,5 32,5 2 6 PC/CHOL (2:1) +PEG2000 (4M %) PC/CHOL (2:1) +PEG2000 (6M %) PC/CHOL (2:1) +PEG2000 (8M %) 61,5 30,5 8 Για την παρασκευή των λιποσωµάτων αυτών ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία όπως και για την παρασκευή των MLV, µε τη διαφορά ότι µετά το σχηµατισµό του υµενίου, την ενυδάτωσή του και την παρασκευή της λιποσωµικής διασποράς, τα λιποσώµατα τοποθετούνται σε ακίδα υπερήχων (sonication probe) για τη µείωση του µεγέθους τους για περίπου 15min ώστε να λάβουµε διασπορές µε διάµετρο µικρότερη ή κοντά στα 100nm (σ.σ. µέγεθος λιποσωµάτων SUV). Η µείωση του µεγέθους και ο σχηµατισµός SUV λιποσωµάτων πρακτικά γίνονται αντιληπτά, όταν η διασπορά γίνει διαυγής. Συγκεκριµένα η λιποσωµική διασπορά τοποθετείται σε πλαστικό φιαλίδιο (falcon) µε διάµετρο µεγαλύτερη από αυτήν της ακίδας και η ακίδα βυθίζεται στο φιαλίδιο, ώστε το κατώτερο σηµείο της να είναι λίγο πιο πάνω από το κέντρο καµπυλότητας του πυθµένα του φιαλιδίου. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε η ακίδα να µην έρχεται σε επαφή µε τα τοιχώµατα του φιαλιδίου γιατί στην αντίθετη περίπτωση υπάρχει µεγάλος κίνδυνος να σπάσει το φιαλίδιο. Τέλος επειδή κατά τη διαδικασία αυτή παράγεται µεγάλο ποσό θερµότητας το φιαλίδιο που περιέχει τη λιποσωµική διασπορά βυθίζεται σε ένα ποτήρι ζέσεως το οποίο περιέχει κρύο νερό. Η διασπορά που περιέχει τα SUV φυγοκεντρείται για 15-20min λεπτά σε στροφές/min προκειµένου να αποµακρυνθούν πολυστοιβαδιακά λιποσώµατα που έχουν τυχόν αποµείνει στη διασπορά, καθώς και ρινίσµατα τιτανίου (εµφανίζονται ως σκούρο ίζηµα στο ependorf στο οποίο βρίσκεται το δείγµα µας, βλ. εικόνα 2.2) που υπάρχουν στο δείγµα µας λόγω επαφής της διασποράς µε τη µεταλλική ακίδα. Έτσι αφαιρούµε προσεκτικά το υπερκείµενο ώστε να αποµονώσουµε τελικά µόνο τη λιποσωµική διασπορά των SUV. 69

70 Εικόνα 2.2 Ίζηµα ρινισµάτων Ti µετά την χρήση της ακίδας υπερήχων Μέτρηση-Διαχωρισμός ελεύθερης και εγκλωβισμένης καλσείνης από λιποσώματα: Το επόµενο στάδιο στην παρασκευή των λιποσωµάτων SUV, περιλαµβάνει την αφαίρεση της ελεύθερης καλσείνης και το διαχωρισµό της από τα λιποσώµατα. Λόγω του µικρού τους µεγέθους ο καθαρισµός των λιποσωµάτων αυτής της κατηγορίας δεν µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε επαναλαµβανόµενες φυγοκεντρίσεις ώστε τελικά να επιτευχθεί η αφαίρεση της υπερκείµενης φάσης. Έτσι η αποµάκρυνση της ελεύθερης καλσεΐνης έγινε µε υγρή χρωµατογραφία στήλης. Στην περίπτωσή µας χρησιµοποιήθηκε στήλη Sephadex G-50. Συγκεκριµένα µεταφέρεται στη στήλη 1ml λιποσωµικού κλάσµατος το οποίο κατόπιν αραιώνεται µε 1ml ρυθµιστικού διαλύµατος PBS (ph=7,4). Το ύψος του πολυµερούς Sephadex G-50 ρυθµίζεται όσο το δυνατό υψηλότερα στη στήλη µας έτσι ώστε να επιτύχουµε την µεγίστη απόδοση της διαχωριστικής της ικανότητας. Τα λιποσώµατα λόγω του ότι είναι µεγαλύτερα σε µέγεθος από το µόριο της καλσεΐνης διέρχονται από τη στήλη δίχως να επιβραδυνθούν και κατά συνέπεια εκλούονται πρώτα. Τα «καθαρά» λιποσώµατα µε την εγκλωβισµένη καλσείνη συλλέγονται σε δοκιµαστικούς σωλήνες. Η διαδικασία αυτή της συλλογής λαµβάνει τέλος όταν στο υπερκείµενο των δειγµάτων που συλλέγουµε στους σωλήνες εµφανιστεί η χαρακτηριστική πράσινη απόχρωση της καλσείνης. Στη συνέχεια τα επιµέρους δείγµατα ενώνονται για τον σχηµατισµό του τελικού δείγµατος. Τελικά τα λιποσώµατα τοποθετούνται σε υδατόλουτρο σε θερµοκρασία υψηλότερη από τη θερµοκρασία µετάπτωσης του λιπιδίου για µια περίπου ώρα για να ηρεµήσουν και να τακτοποιήσουν τη δοµή τους. Πρόκειται για τη διαδικασία της ωρίµανσης (annealing) Μέτρηση συνολικού λιπιδίου: Επόµενο στάδιο είναι ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης του λιπιδίου στα λιποσώµατα. Ο υπολογισµός αυτός πραγµατοποιήθηκε µε τη µέθοδο Stewart (Anal.Biochemica, 1980). Σύµφωνα µε τη µέθοδο αυτή κατά σειρά σε 2 ml χλωροφορµίου, προστίθενται 20 µl λιποσωµάτων και 2 ml αντιδραστηρίου σιδηροκυανιούχων, ακολουθεί εκχύλιση που επιτυγχάνεται µε έντονη µηχανική ανάδευση (vortex) για 1min και στη συνέχεια το δείγµα 70

71 αφήνεται σε ηρεµία για περίπου 10min έτσι ώστε να επέλθει ο διαχωρισµός των δύο φάσεων. Η υδατική φάση αποµακρύνεται µε αντλία κενού, ενώ η χλωροφορµική στοιβάδα τοποθετείται σε κατάλληλη κυψελίδα και φωτοµετρείται στα 485 nm. Από τις τιµές απορρόφησης που καταγράφονται προσδιορίζεται η συγκέντρωση του λιπιδίου µε τη βοήθεια της πρότυπης καµπύλης αναφοράς λιπιδίου που κατασκευάζεται ως εξής: Αρχικά παρασκευάζεται µητρικό διάλυµα PC συγκέντρωσης 0,1 mg/ml. Στη συνέχεια σε 7 δοκιµαστικούς σωλήνες µεταφέρονται αντίστοιχα 0, 100, 200, 400, 600, 800 και 1000 µl µητρικού διαλύµατος PC και προστίθεται 2 ml χλωροφορµίου και 2 ml διαλύµατος Stewart. Ακολουθεί µηχανική ανάδευση, αποµάκρυνση της υδατικής φάσης που διαχωρίζεται και φωτοµέτρηση στα 485 nm. Έτσι προκύπτει καµπύλη αναφοράς γραµµική στην περιοχή από 0-1 µg λιπιδίου. Πρόκειται για ευθεία της µορφής y = α + βx, όπου y η απορρόφηση σε 485nm της χλωροφορµικής στοιβάδας και x η ποσότητα σε µg του λιπιδίου που περιέχεται στο προς µέτρηση δείγµα. Στο παρακάτω σχήµα απεικονίζεται µια πρότυπη καµπύλη αναφοράς λιπιδίου σε χλωροφόρµιο κατά Stewart µε y = x C a lib ra tio n c u rv e 1,0 Απορρόφηση (485nm) Absorption (485nm) 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Συγκέντρωση L ip id c o n c e λιπιδίου n tra tio n (ng) (ìg ) ιάγραµµα 2.2 Καµπύλη αναφοράς Stewart. 2.4 Μέτρηση μεγέθους και ζ-δυναμικού λιποσωμάτων: Η µέτρηση του µεγέθους των σωµατιδίων και του ζ-δυναµικού των λιποσωµάτων έγινε µε χρήση της συσκευής Zetasizer (Malvern nano ZS, Malvern Instrument UK) εφοδιασµένο µε πηγή ακτινοβολίας laser He/Ne 25 mw. Αναλυτικά, η διαδικασία µέτρησης του µεγέθους (zsize) και του ζ-δυναµικού των λιποσωµάτων (z-potential) ξεκινά µε την προσθήκη σε ependorf δείγµατος των λιποσωµάτων που παρασκευάστηκαν µε την τελική συγκέντρωση να ρυθµίζεται στα 0.2mg/ml (µε αραίωση του αρχικού δείγµατος µε buffer) και τον τελικό όγκο του διαλύµατος να συµπληρώνεται µε PBS έως 1ml. H λιποσωµική διασπορά µετρείται αµέσως και προσδιορίζονται η µέση υδροδυναµική διάµετρος των λιποσωµάτων d(nm), οι 71

72 κατανοµές µεγέθους( peak όπως αναφέρονται και στη συσκευή) και τέλος µετρείται το ζ- δυναµικό και η πολυδιασπορά(pdi). Στις ρυθµίσεις του οργάνου ως δείκτης διαθλάσεως (Refractive Index R.I.), λαµβάνεται ο δείκτης διαθλάσεως του νερού R.I. = 1,330. Η προσπίπτουσα δέσµη φωτός ρυθµίζεται υπό γωνία 173, ενώ οι µετρήσεις λαµβάνουν χώρα στους 25 C. Μία τυπική αναφορά αποτελεσµάτων µέτρησης µεγέθους φαίνεται στην παρακάτω εικόνα, στην οποία συνοψίζονται: 1. Λεπτοµέρειες για την µέτρηση του δείγµατος (sample details). 2. Οι εντολές που δόθηκαν αρχικά για τη ρύθµιση του συστήµατος (system). 3. Αποτελέσµατα (Results). Αναφορά της ποιότητας της διασποράς και των µετρήσεων που έγιναν. Εικόνα 2.3 Τυπική αναφορά αποτελεσµάτων µέτρησης µεγέθους νανοσωµατιδίων. 2.5 Μέτρηση ακεραιότητας λιποσωμάτων (Integrity): Η µελέτη της ακεραιότητας των λιποσωµάτων ξεκινά µε ανάµιξη του δείγµατος σε ισότονο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (PBS) µε ph=7.4. Στη συνέχεια πραγµατοποιείται ανάµιξη του αρχικού δείγµατος και σε ορρό βοοειδούς (FBS) (προσοχή απαιτείται στην απόψυξη του ορρού καθώς θα πρέπει να υγροποιηθεί πλήρως και η θερµοκρασία του να βρίσκεται κοντά στην θερµοκρασία επώασης των δειγµάτων. Έτσι η τελική συγκέντρωση του δείγµατος ρυθµίζεται στα 3mg/ml. Η παραπάνω διαδικασίες επαναλήφθηκαν 2φορές η κάθε µια έτσι ώστε να εξάγουµε όσο το δυνατόν πιο αξιόπιστο αποτέλεσµα. Το επόµενο βήµα είναι η 72

73 επώαση των δειγµάτων στους 37 C και τελικά ο υπολογισµός του φθορισµού της καλσείνης στα ακόλουθα χρονικά διαστήµατα: 0,1,2,4,6,10,24,26,28,30,32 (σε ώρες) Στις 0h το δείγµα λαµβάνεται πριν από την εισαγωγή του στον επωαστή. Έτσι σε πρώτο στάδιο λαµβάνονται από κάθε δοκιµαστικό σωλήνα 10µl δείγµατος τα οποία µεταφέρονται σε νέο δοκιµαστικό σωλήνα που περιέχει 4mL PBS (ph=7,4). Ακολουθεί ανάδευση (σε vortex) των επί µέρους δοκιµαστικών σωλήνων για περίπου ένα λεπτό. Στη συνέχεια το διάλυµα µεταφέρεται σε κατάλληλη κυψελίδα για να ακολουθήσει η µέτρηση του φθορισµού της καλσείνης (στο FL). Οι τιµές που λαµβάνονται στην περίπτωση αυτή αντιστοιχούν στην ποσότητα της καλσεΐνης που έχει διαφύγει στο λιπόσωµα. Κατά το δεύτερο στάδιο προστίθενται σε κάθε δοκιµαστικό σωλήνα 0.4ml Triton X-100. Ακολουθει πολύ καλή ανάδευση (>1min σε vortex). Στη συνέχεια µετράται ο φθορισµός του δείγµατος µετά την προσθήκη του απορρυπαντικού. Το απορρυπαντικό διασπά τη λιποσωµική µεµβράνη, οπότε η καλσεΐνη που είχε εγκλωβιστεί στο λιπόσωµα απελευθερώνεται στο διάλυµα. Το ποσοστό συγκράτησης (% latency) της καλσεΐνης προσδιορίζεται από την ακόλουθη εξίσωση: %EFGHIJK= 1.1 (M N.O. M P.O. ) 1.1 M N.O. 100 όπου: F AT και F BT οι τιµές φθορισµού κάθε δείγµατος πριν και µετά την προσθήκη του Τriton X-100 αντίστοιχα. Για τον προσδιορισµό του ποσοστού της καλσεΐνης που παραµένει στα λιποσώµατα (% retention), θεωρούµε ότι το % latency την χρονική στιγµή t=0 αντιστοιχεί σε retention 100%. Η τιµή του %retention υπολογίστηκε µε βάση την τιµή του %latency της καλσείνης σύµφωνα µε τη σχέση: %RHGHIGSTI= %E UPV %E WPV όπου: %L PBS και το %L FBS είναι η ποσοστιαία µεταβολή της δέσµευσης (%latency) της καλσείνης στο λιπόσωµα στην περίπτωση του buffer και του ορρού αντίστοιχα. Τέλος για τον υπολογισµό του ποσοστού απελευθέρωσης (%release) της καλσείνης από το λιπόσωµα (πειραµατικά) εφαρµόστηκε η παρακάτω εξίσωση: %RHEHFXH=100 %RHGHIGSTI Η τιµή αυτή του release αντιστοιχεί στη πειραµατική τιµή της απελευθέρωσης της καλσείνης από την λιποσωµική µορφή. 73

74 2.6 Προγραμματισμός σε Fortran: Το περιβάλλον προγραµµατισµού που χρησιµοποιήθηκε για την µοντελοποίηση της κινητικής αποδέσµευσης των µορίων της καλσείνης από τα SUV λιποσώµατα είναι αυτό του µεταγλωττιστή GNU Fortran της γλώσσας προγραµµατισµού Fortran 95/2003/2008 (βλ. εικόνα 2.4) του ολοκληρωµένου περιβάλλοντος ανάπτυξης Code::Blocks για Windows. Το πρόγραµµα της Fortran επιλέχθηκε λόγω της ευκολίας και των δυνατοτήτων που παρέχει αυτή η γλώσσα προγραµµατισµού στην επίλυση υπολογιστικών προβληµάτων (σ.σ. µεγάλο εύρος υπολογιστικών µεθόδων και µαθηµατικών τεχνικών) καθώς και λόγω της σχετικής ταχύτητας στην επεξεργασία του µεγάλου όγκου των αποτελεσµάτων. Για την ποσοτική έκφραση των αποτελεσµάτων το πρόγραµµα της Fortran συνδυάστηκε µε το πρόγραµµα Excel 2010 καθώς και το OriginPro 6.0. Εικόνα 2.4 Προγραµµατιστικό περιβάλλον Fortran Code::Blocks Μέθοδος προσαρμογής ελαχίστων τετραγώνων σε γραμμικό σύστημα (LSF): Αρχικά µελετήθηκε η µέθοδος προσαρµογής ελαχίστων τετραγώνων σε µια διάσταση. Το πρώτο στάδιο περιελάµβανε την µαθηµατική επίλυση των εξισώσεων που διέπουν ένα µονοδιάστατο γραµµικό σύστηµα. Υποθέσαµε αρχικά την εξίσωση της ευθείας: Y(9)=Z==9+? (1) Στη συνέχεια υποθέτουµε τα σηµεία της ευθείας (1): 74

75 (x 1, y 1 ), (x 2, y 2 ).,(x n,y n ) Το σφάλµα στην περίπτωση ενός µονοδιάστατου συστήµατος (π.χ. γραµµική ευθεία) δίνεται από την εξίσωση της µεθόδου προσαρµογής ελαχίστων τετραγώνων, δηλαδή: [(=,?)= a :{Y(9 : ) Z : )}` (2) Έτσι για να µπορέσουµε να επιτύχουµε την καλύτερη δυνατή προσαρµογή (best fit), θα πρέπει το παραπάνω σφάλµα να είναι ελάχιστο, δηλαδή θα πρέπει: και επίσης: b[ b= =0 b[ b? =0 η εξίσωση (2) µε αντικατάσταση της εξίσωσης (1) µπορεί να γραφεί και ως εξής: έτσι παραγωγίζοντας ως προς α έχουμε: a a [(=,?)=c{=9 : +? Z : }` : b[ bd = b bd (c{=9 :+? Z : }`)=c b bd (=9 :+? Z : )`= :ef a a a :ef =2=c9 :`+2?c9 : 2cZ : 9 : =0 :ef :ef a :ef a b[ b? =0 =c9 :+i?=cz : :ef Από τις δύο τελευταίες εξισώσεις συµπεραίνουµε ότι: a :ef a a l i c9 : o :ef a a p? l cz : k n = q= :ef a k c9 : c9 :` cz : 9 : j j :ef :ef m :ef o n m 75

76 Κατά την επίλυση της παραπάνω εξίσωσης πινάκων εξάγουµε τα παρακάτω αποτελέσµατα τα οποία συνοψίζονται σε δύο επί µέρους µεταβλητές που χαρακτηρίζουν την κλίση και την τεταγµένη επί την αρχή της εξίσωσης της ευθείας, οι οποίες καλούνται slope (α) και intercept (b) αντίστοιχα και εκφράζονται µε τις ακόλουθες εξισώσεις: a d= i :ef 9 :Z : :ef9 : :efz : a a ` i 9 :` ( 9 : ) :ef a :ef?= a Z a a a :ef : :ef9 :` :ef 9 : :efz : 9 : a a ` i 9 :` ( 9 : ) :ef Τη µαθηµατική επίλυση του παραπάνω προβλήµατος διαδέχτηκε η κατασκευή του αντίστοιχου αλγορίθµου σε Fortran επιβεβαιώνοντας έτσι τα αποτελέσµατα της γραφικής επίλυσης της εξίσωσης. Ο αλγόριθµος παρουσιάζεται παρακάτω: :ef a Εικόνα 2.5 Πρόγραµµα υλοποίησης της προσαρµογής (fitting) στην εξίσωση ευθείας Μέθοδος προσαρμογής ελαχίστων τετραγώνων σε εκθετικό σύστημα(lsf): Αρχικά µελετήθηκε η µέθοδος προσαρµογής ελαχίστων τετραγώνων σε εκθετικές εξισώσεις. Το πρώτο στάδιο περιελάµβανε την µαθηµατική επίλυση των εξισώσεων που διέπουν ένα εκθετικό σύστηµα. Υποθέσαµε αρχικά µια τυχαία εκθετική συνάρτηση της µορφής: Z=Y(9)=Fr Ps (1) παίρνουµε το λογάριθµο και στα δύο µέλη της εξίσωσης (1): lnz=lnf+v9 76

77 και στη συνέχεια την εξίσωση που µας δίνει η µέθοδος των ελαχίστων τετραγώνων για την εύρεση της καλύτερης δυνατής προσαρµογής (best fitting), η οποία είναι: a w`=z : c(lnz : A v9 : ` :ef Θεωρήσαµε ότι για ένα συγκεκριµένο σύνολο δεδοµένων η µεταβλητή X 2, θα είναι ανεξάρτητη από τις µεταβλητές x i και y ι (λόγω του ότι οι µεταβλητές αυτές έχουν καθορισµένες τιµές), αλλά θα εξαρτώνται εξολοκλήρου από τους συντελεστές τη εκθετικής συνάρτησης (1), δηλαδή τα A και B. Εφαρµόζοντας στη συνέχεια την εξίσωση (1) στην εξίσωση (2), εξάγαµε τις δύο παρακάτω εξισώσεις: a a a =cz : +?c9 : Z : =Z : clnz : :ef :ef :e< a a a =c9 : Z : +?c9 :`Z : :ef :ef :e< =Z : c9 : Z : lnz : a a a { c9: c9 z : Z : { cz: lnz z :e< :e< z = z : a a? ƒ= z :e< a z z zc9 : Z : c9 :`Z : zc9 : Z : lnz : y y:e< :e< Οι εξισώσεις αυτές αναδιαµορφώνονται λύνοντας ως προς α και b: :e< == :ef a 9 :` a :e< a :ef a :e< a :e< ` Z : Z : lnz : 9 : Z : 9 : Z : lnz : a :e< a :e< Z : 9 :`Z : 9 : Z : a?= a :ef Z : :e< 9 : Z : lnz : :e< 9 : Z : :e< 9 : Z : lnz : a Z : a a ` 9 :`Z : 9 : Z : :e< :e< a :e< a 77

78 2.7 Διπλή Εκθετική συνάρτηση: Για την περιγραφή-µοντελοποίηση της κινητικής αποδέσµευσης των µορίων της καλσείνης που βρίσκονται εγκλωβισµένα µέσα στα SUV λιποσώµατα, µε διάταξη όπως αυτή που φαίνεται και στο παρακάτω σχήµα, αναπτύχθηκαν δύο επί µέρους µέθοδοι: δοµή λιποσωµάτων SUV απελευθέρωση µορίων καλσεΐνης κατανοµή των µορίων της καλσεΐνης στο εσωτερικό των suv λιποσωµάτων Εικόνα 2.6 Σχηµατική αναπαράσταση εγκλωβισµού και απελευθέρωσης των µορίων της καλσείνης από τα λιποσώµατα SUV. Μέθοδος 1: η πρώτη µέθοδος υποθέτει τη γρήγορη διάσπαση των µορίων της καλσείνης από την αλληλεπίδρασή τους µε τα λιπίδια της διπλοστοιβάδας του λιποσώµατος. Ως εκ τούτου τα περισσότερα από τα µόρια της καλσείνης είναι αρχικά ελεύθερα και το προφίλ της κινητικής απελευθέρωσης εξαρτάται αποκλειστικά από τη διάχυση και την διάδοση της θερµότητας του συστήµατος. Έχουµε: όπου: f =1r Μ τ = η ποσότητα της καλσείνης που βρίσκεται στο λιπόσωµα σε χρόνο t. M 0 = η αρχική ποσότητα της καλσεΐνης που βρίσκεται εγκλωβισµένη στο λιπόσωµα. K S = είναι µια παράµετρος η οποία εκφράζει ότι η αύξηση του εµβαδού επιφανείας ενός SUV λιποσώµατος σε σχέση µε τον όγκο του (λόγος Α/V) ενισχύει την απελευθέρωση της καλσείνης από το λιπόσωµα. 78

79 Μέθοδος 2: κατά τη δεύτερη µέθοδο έχουµε ταχύτατη διαδικασία διάχυσης/συναγωγής (diffusion/convection) και αργή διαδικασία σύνδεσης/αποσύνδεσης (association/disassociate) τέτοια ώστε K S >>K on και K S >>K off (όπου: K on = K association και K off =K disassociation ). Από τη θεώρηση αυτή προκύπτει η ιπλή εκθετική εξίσωση τριών παραµέτρων που περιγράφει τη συµπεριφορά των µορίων της καλσείνης και την αλληλεπίδρασή αυτών µε το σύστηµα µεταφοράς τους (λιποσώµατα SUV) [46]: 1 1! = " $(( " $3 5 " Ž + ( 5 " $(( ) " $3 +" $(( " $3 +" $(( Ks=1, Koff=1, Kon/Koff=1 with t Εικόνα 2.7 Τρισδιάστατη απεικόνιση της ιπλής Εκθετικής συνάρτησης. Οι τρείς παράµετροι της εξίσωσης καθορίζουν την απελευθέρωση (release) των µορίων καλσεϊνης σε συνάρτηση µε το χρόνο Η συνάρτηση βήματος (step function): Η συνάρτηση βήµατος, ή συνάρτηση Heaviside, Θ(t), ορίζεται ως: ˆ( )=Š 0, <0 1, 0 79