ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ"

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Μελέτη του ρόλου γονιδιακών αλλαγών στο μονοπάτι παραγωγής του μονοξειδίου του αζώτου στην αύξηση των επιπέδων της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης ασθενών με β- μεσογειακή αναιμία και την ανταπόκρισή τους σε υδροξυουρία ΣΤΡΑΤΟΠΟΥΛΟΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ Βιολόγος Πάτρα, Σεπτέμβριος

2 Επιβλέπων καθηγητής Γεώργιος Π. Πατρινός Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακευτικής Βιοτεχνολογίας και Φαρμακογενωμικής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Γεώργιος Π. Πατρινός Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακευτικής Βιοτεχνολογίας και Φαρμακογενωμικής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Κωνσταντίνος Πουλάς Αναπληρωτής Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών 2

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία με τίτλο «Μελέτη του ρόλου γονιδιακών αλλαγών στο μονοπάτι παραγωγής του μονοξειδίου του αζώτου στην αύξηση των επιπέδων της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης ασθενών με β-μεσογειακή αναιμία και την ανταπόκρισή τους σε υδροξυουρία», εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης για την ολοκλήρωση του κύκλου σπουδών του Μεταπτυχιακού Προγράμματος στις Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Το εργαστηριακό κομμάτι πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας κατά τα ακαδημαϊκά έτη , υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή Δρ. Πατρινού Γεώργιου. Προσωπικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιο Πατρινό για την τιμή που μου έκανε να αποτελέσω μέλος στο εργαστήριό του, για την παρατεταμένη εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου καθ`όλη τη διάρκεια αυτής της διετίας, αλλά και τη συνεχή καθοδήγηση και τις συμβουλές του. Ευχαριστώ επίσης και τα άλλα δύο μέλη της τριμελούς επιτροπής, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Πουλά και την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου για τη συμμετοχή τους στην εξεταστική μου επιτροπή καθώς και για τη συνεργασία τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στη μεταδιδακτορικό Θεοδώρα Κατσίλα, η παρουσία της οποίας συνέβαλλε τα μέγιστα, τόσο στο πειραματικό όσο και στο ψυχολογικό κομμάτι της διεκπεραίωσης της διπλωματικής μου εργασίας. Το ίδιο οφείλω να πω και για τον μεταδιδακτορικό Εμμανουήλ Καμπούρη, του οποίου η βοήθεια και η στήριξη ήταν πολύτιμη όλο αυτό το διάστημα. Επιπροσθέτως, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συνεργάτες αλλά και πολύ καλούς μου φίλους Ηλία Μπολτσή και Μαρίνα Μπαρτσακούλια για την ηθική συμπαράσταση και τη συνεχή στήριξη σε κάθε δυσκολία και εμπόδιο που βρέθηκε στο δρόμο μου. Ακόμη, ευχαριστώ πολύ όλα τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου για το φιλικό και συνεργατικό κλίμα αυτής της διετίας και ειδικότερα τις Κατερίνα Γραβιά, Βασιλική Χονδρού, Ζωή Ζαγορίτη και Κατερίνα Κεντιστού, που χωρίς αυτές το έργο μου θα ήταν κατά πολύ δυσκολότερο. 3

4 Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην οικογένειά μου γιατί στάθηκε δίπλα μου και σε αυτή μου την προσπάθεια, όπως κάνει όλα αυτά τα χρόνια, προσφέροντας μου στήριξη, αγάπη και δύναμη σε κάθε δύσκολή μου στιγμή. Στρατόπουλος Απόστολος Πάτρα, Σεπτέμβριος

5 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ-ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ Active Chromatin Hub (ACH): Κέντρο ενεργού χρωματίνης BFU-E: Burst Forming Unit Erythroid cgmp : cyclic Guanosine MonoPhosphate (κυκλική μονοφωσφροική γουανοσίνη) Hematopoietic Stem Cell ( HSC): Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα Hemoglobin (Hb): Αιμοσφαιρίνη Hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH): Κληρονομική παραμονή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HU: Υδροξυουρία Human Fetal Osteoblasts (hfob): Ανθρώπινοι εμβρυικοί οστεοβλάστες Hypersensitive site (HS): Υπερευαίσθητη θέση Linkage Disequilibrium (LD): Ανισορροπία σύνδεσης Locus Control Region (LCR): Περιοχή τοπικού ελέγχου Quantitative Trait Loci (QTL): Ποσοτικός γονιδιακός τόπος Red blood cells (RBC) : Ερυθρά αιμοσφαίρια shrna: small hairpin RNA Sickle-cell Disease (SCD): Δρεπανοκυτταρική αναιμία Single Nucleotide Polymorphism (SNP): Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός Sp1: Specificity Protein 1 5

6 Περίληψη Οι αιμοσφαιρινοπάθειες, συμπεριλαμβανομένης της β-θαλασσαιμίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας, συγκαταλέγονται ανάμεσα στις πιο κοινές μονογονιδιακές διαταραχές παγκοσμίως, που χρήζουν αποτελεσματικής θεραπευτικής στρατηγικής. Σήμερα, η επανεργοποίηση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης φαίνεται να είναι μια ενδιαφέρουσα θεραπευτική προσέγγιση για τους ασθενείς που πάσχουν από β-τύπου αιμοσφαιρινοπάθειες. Πράγματι, διερευνώνται διάφορες φαρμακευτικές ουσίες οι οποίες έχουν βρεθεί να επανεργοποιούν παροδικά την έκφραση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης και επομένως να αυξάνουν τα επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαίνης-f (HbF), βελτιώνοντας με αυτό τον τρόπο τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών. Εντούτοις, η μόνη εγκεκριμένη από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ (FDA) φαρμακευτική ουσία παραμένει η υδροξυ-ουρία (HU), η οποία χρησιμοποιείται επιτυχώς σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Στο σημείο αυτό αξίζει να σημειωθεί πως παρατηρείται σημαντική ποικολομορφία αναφορικά με την απόκριση των ασθενών στην HU. Το πρόβλημα αυτό καλείται να διερευνήσει η επιστήμη της φαρμακογονιδιωματικής, αποσκοπώντας στην εξατομίκευση της θεραπείας. Σύμφωνα με τον Ma και τους συνεργάτες του και τη μελέτη τους το 2007, την πιο ενδελεχή μελέτη έως σήμερα, δύο γονίδια μη συνδεδεμένα με το β-γονιδιακό τόπο, τα ARG2 και NOS1 και συγκεκριμένα, οι πολυμορφισμοί rs /rs και rs αντίστοιχα, φαίνεται να σχετίζονται με την αύξηση των επιπέδων της HbF και την απόκριση των ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία σε θεραπεία με HU. Στη παρούσα μελέτη, εξετάσθηκε η πιθανή συσχέτιση των εν λόγω πολυμορφισμών με την απόκριση ασθενών που πάσχουν από β-θαλασσαιμία στην HU. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η συμμετοχή των εν λόγω γονιδίων/πολυμορφισμών στην παθογένεια της νόσου. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από φυσιολογικά άτομα, ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία, ασθενείς με β-θαλασσαιμία ανεξάρτητης μεταγγίσεων και διπλά ετερόζυγους ασθενείς (β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία) που λάμβαναν ως φαρμακευτική αγωγή HU. Η τελευταία ομάδα ασθενών διαχωρίζεται περαιτέρω σε «αποκρινόμενους» και «μη αποκρινόμενους». Η μέθοδος γονοτύπησης που χρησιμοποιήθηκε και για τους τρεις πολυμορφισμούς ήταν η PCR- ARMS. 6

7 Σύμφωνα με τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, φαίνεται πως δεν παρουσιάστηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των υπό εξέταση πολυμορφισμών και της απόκρισης των ασθενών στην HU. Παρόμοια, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά όταν οι πληθυσμοί των ασθενών συγκρίθηκαν με εκείνον των υγιών ατόμων. Ωστόσο, σε κάθε περίπτωση, απαιτείται να σημειωθεί πως το υπό εξέταση δείγμα ατόμων ήταν μικρό και μάλιστα, στην πλειοψηφία των περιπτώσεων οι πληθυσμοί δεν πληρούσαν τα κριτήρια της Hardy-Weinberg ισορροπίας. Κρίνεται, επομένως, η εν λόγω μελέτη να εμπλουτιστεί με τη συμμετοχή πολυπληθέστερων ομάδων ατόμων. 7

8 Abstract Hemoglobinopathies are amongst the most common single gene disorders worldwide, including beta-thalassemia and sickle cell disease (SCD), seeking for therapeutic intervention. The reactivation of the human gamma-globin genes is considered to be a therapeutic strategy for beta-type hemoglobinopathies patients. So far, several drugs and compounds have been found to transiently reactivate the gamma-globin levels and hence, improve the patients clinical phenotype. Nevertheless, the only drug approved by the FDA is hydroxyuria (HU) and it is mostly used for SCD patients. Noteworthy, a great variation has been observed regarding HU response among patients. Pharmacogenomics are called to shed light on this, aiming to patient stratification and personalized therapeutic approaches. According to Ma et al (2007), the most thorough study published today, two genes outside the beta-gene locus, namely ARG2 and NOS1 and in particular, their corresponding single nucleotide polymorphisms (SNPs) rs /rs and rs seem to be related with the increase of HbF levels and the HU response of SCD patients. The aim of our study was to elucidate whether there is an association of the aforementioned SNPs with the HU response in beta-thalassemia patients. Moreover, the role of the SNPs of interest in the pathogenesis of betathalassemia was investigated. For this, we analyzed blood samples of healthy donors, major beta-thalassemia patients, non-transfusion dependent beta-thalassemia patients and SCD/β-thalassemia patients who have been treated with HU. The latter have been divided further into HU responders and HU non-responders. According to our data, the SNPs of interest show no association with the HU response of beta-thalassemia patients. Moreover, our findings supported that neither of the aforementioned SNPs are involved in the pathogenesis of the disease. At this point, it is of crucial importance to mention that only a small patient population has been tested. Actually, the majority of the populations tested herein were not in the Hardy-Weinberg equilibrium. Thus, our study needs to be further enriched investigating a greater number of people. 8

9 Πίνακας περιεχομένων Κεφάλαιο Α:Εισαγωγή Α.1 Το αίμα A.2 Η Αιμοσφαιρίνη Α.2.1. H δομή της αιμοσφαιρίνης Α.2.2. Είδη αιμοσφαιρίνης Α.3. Ερυθροποίηση Α.4 Εξελικτική πορεία της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών και της σύνθεσης των μορφών αιμοσφαιρίνης A.5 Δομή και οργάνωση των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης Α.6 Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών Α.6.1 Υποκινητές-Ενισχυτές-Αποσιωπητές A Το γονίδιο HBE A HBG γονίδια A HBB γονίδιο Α HBZ και HBA2/HBA1 γονίδια A.6.2. Περιοχές ελέγχου των συμπλεγμάτων των γονιδίων των σφαιρινών (Locus Control Region- LCR ) A Περιοχή ελέγχου του συμπλέγματος των β τύπου γονιδίων(βγονιδιακού τόπου), β-lcr Α Περιοχή ελέγχου του συγκροτήματος των α τύπου γονιδίων (αγονιδιακού τόπου) Α Παράγοντες μεταγραφής που μετέχουν στην έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών A.7 Γενετικοί τροποποιητές που επιδρούν στο β-γονιδιακό τόπο Α.7.1. Cis-δραστικά στοιχεία Α.7.2 QTL-γονιδιακοί τόποι που επηρεάζουν τα επίπεδα της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF

10 A.8 Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) Α.9 Αιμοσφαιρινοπάθειες Α.9.1. Τα θαλασσαιμικά σύνδρομα Α Οι α-θαλασσαιμίες Α Οι β-θαλασσαιμίες.40 Α Η μείζων β-θαλασσαιμία Α Η ετερόζυγη ή ελάσσων β-θαλασσαιμία Α Η μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων θαλασσαιμία Α.9.2. Δρεπανοκυτταρική αναιμία Α.10 Η επανενεργοποίηση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF ως πιθανή θεραπευτική στρατηγική Α.11 NOS1 Γονίδιο Α.12 ARG2 γονίδιο Α.13 Σκοπός εργασίας Κεφάλαιο Β: Υλικά και μέθοδοι Β.1 Γενετικό υλικό Β.1.1. Δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη.53 B.2 Απομόνωση ολικού γονιδιωματικού DNA Β.3 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA σε διάλυμα B.4 Πολυμορφισμοί-στόχοι της παρούσας μελέτης Β.5 Σχεδιασμός εκκινητών (primers) B.6 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Β.7 PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System) Β.8 Αντιδραστήρια και διαδικασία της PCR Β.9 Πρωτόκολλα αντιδράσεων PCR-ARMS rs rs rs B.10 Hλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Β.11 Καθαρισμός PCR προϊόντων

11 Β.12 Αλληλούχιση (Sequencing) DNA κατά Sanger Β.13 Στατιστική επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων Β.13.1 Η ισορροπία Hardy-Weinberg Β Αμφίπλευρος ακριβής έλεγχος του Fisher Κεφάλαιο Γ:Αποτελέσματα 78 Γ.1 Ανάλυση πειραματικών δεδομένων Γ.1.1. NOS1 rs [G/A] Γ.1.2. ARG2 rs [C/A] Γ.1.3. ARG2 rs [T/C] Κεφάλαιο Δ : Συζήτηση Κεφάλαιο Ε : Βιβλιογραφία

12 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 12

13 A.1 Το αίμα Το αίμα είναι σωματικό υγρό, του οποίου η κύρια λειτουργία είναι η μεταφορά οξυγόνου, θρεπτικών ουσιών, ορμονών, βιταμινών και θερμότητας στους ιστούς, καθώς και η απομάκρυνση άχρηστων ουσιών που παράγονται κατά το μεταβολισμό, αλλά και η απομάκρυνση του διοξειδίου του άνθρακα. Επιπλέον, αποτελεί άμυνα του οργανισμού κατά των λοιμώξεων, μέσω της δράσης των λευκών αιμοσφαιρίων και των αντισωμάτων. Είναι εξαιρετικά εξειδικευμένος κυκλοφορών ιστός και αποτελείται από διάφορους τύπους κυττάρων που συγκρατούνται μέσα σε ένα υγρό μέσο, το πλάσμα. Το πλάσμα αποτελεί περίπου το 55% του συνολικού αίματος. Το ίδιο το πλάσμα αποτελείται κυριότερα από νερό, το οποίο αποτελεί το 92% της σύστασής του, πρωτεΐνες, άλατα ασβεστίου και καλίου, λίπη και σάκχαρα. Εκτός από το πλάσμα, το αίμα αποτελείται και από έμμορφα συστατικά, όπως τα λευκά αιμοσφαίρια, τα ερυθρά αιμοσφαίρια και τα αιμοπετάλια. Τα λευκά αιμοσφαίρια, ή αλλιώς λευκοκύτταρα, παράγουν αντισώματα και έχουν την ικανότητα να στοχεύουν ειδικά σε κάποια ξενοβιοτική ουσία ή μικροοργανισμό. Τα αιμοπετάλια ή θρομβοκύτταρα είναι απύρηνα, μικρά κυτταρικά θραύσματα, που συμμετέχουν στη διαδικασία της αιμόστασης. Τέλος, τα ερυθρά αιμοσφαίρια, αποτελούν κι αυτά κομμάτι του ανοσοποιητικού συστήματος, συμμετέχοντας σε λειτουργίες, όπως η μεταφορά αερίων στο σώμα (Ο 2, CO 2 ). Αποτελούν περίπου το 45% του αίματος και περιέχουν μια πρωτεΐνη, την αιμοσφαιρίνη, η οποία διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στη μεταφορά των αερίων και κυρίως, του οξυγόνου. Μέσω της αιμοσφαιρίνης, μπορεί να μεταφερθεί και το διοξείδιο του άνθρακα, το οποίο ωστόσο διαθέτει και διαφορετικούς τρόπους μεταφοράς (ενδεικτικά, δύναται να μεταφερθεί αυτούσιο, διαλυμένο στο πλάσμα, είτε με τη μορφή όξινων ανθρακικών ιόντων) (Vander et al, 2001). Η αναλογία των ερυθρών αιμοσφαιρίων προς τα λευκά αιμοσφαίρια είναι περίπου 500 προς 1. Τις τελευταίες τέσσερις δεκαετίες, η αιμοσφαιρίνη έχει αποτελέσει αντικείμενο διεξοδικής μελέτης, αποσκοπώντας στην αντιμετώπιση των αιμοσφαιρινοπαθειών ή/ και τη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών. Η αιμοσφαιρίνη μελετάται σχετικά εύκολα, δεδομένου ότι η απομόνωσή της δεν είναι πολύπλοκη, είναι η βασική πρωτεΐνη των ερυθροκυττάρων και η αιμοληψία αποτελεί διαδικασία ρουτίνας. 13

14 Α.2 Η Αιμοσφαιρίνη Α.2.1 Η δομή της αιμοσφαιρίνης Εικόνα 1. Αριστερά: Σχηματική αναπαράσταση της δομής της αιμοσφαιρίνης. Δεξιά: Η ομάδα της αίμης. Πηγή: Όταν πρωτοεμφανίστηκε η δρεπανοκυτταρική αναιμία, οι ερευνητές της εποχής προσπάθησαν να διαλευκάνουν τα αίτια της έως τότε άγνωστης ασθένειας (Herrick, 1910). Περίπου πέντε δεκαετίες αργότερα, τα πρωτοποριακά πειράματα του Max Perutz οδήγησαν στην ανακάλυψη της δομής της αιμοσφαιρίνης και των διάφορων μορφών της. Από τα πειράματα του Perutz το 1959 και ύστερα, η μοριακή μελέτη της αιμοσφαιρίνης συνεχίστηκε με πολύ γρήγορους ρυθμούς. Σήμερα γνωρίζουμε πως η ανθρώπινη αιμοσφαιρίνη (Hemoglobin, Hb) αποτελείται από τέσσερις αλυσίδες σφαιρίνης, οι οποίες είναι ανά δύο όμοιες μεταξύ τους. Οι όμοιες αλυσίδες - υπομονάδες της αιμοσφαιρίνης καλούνται ομόλογες. Σχηματίζεται ένα σφαιρικό τετραμερές μόριο, αφού οι τέσσερις αυτές αλυσίδες συνδέονται μεταξύ τους και αναδιπλώνονται. Καθεμιά από τις αλυσίδες έχει προσδεμένη σε συγκεκριμένη θέση μια προσθετική ομάδα που ονομάζεται αίμη(εικόνα 1). Η αίμη προσδένει το οξυγόνο και συμβάλλει στη μεταφορά του διαμέσου της αιμοσφαιρίνης. Επιπλέον, είναι υπεύθυνη για το χαρακτηριστικό ερυθρό χρώμα του 14

15 αίματος. Κάθε μόριο αίμης αποτελείται από ένα ιόν σιδήρου που εδράζεται στο κέντρο της πρωτοπορφυρίνης, ενός μεγάλου ετεροκυκλικού οργανικού δακτυλίου. Η πρωτοπορφυρίνη αποτελείται από τέσσερις πυρρολικούς δακτυλίους, που ενώνονται με μεθενυλικές γέφυρες, προς σχηματισμό ενός τετραπυρρολικού δακτυλίου (Patrinos & Antonarakis, 2010; Berg et al., 2001; Schechter, 2008). Το άτομο του σιδήρου της αίμης ενώνεται με τα τέσσερα πυρρολικά άτομα αζώτου και, υπό φυσιολογικές συνθήκες, βρίσκεται σε κατάσταση οξείδωσης (Fe 2+ ). Πέμπτη και έκτη θέση συναρμογής καλούνται οι θέσεις πρόσδεσης του ιόντος σιδήρου με κάθε πλευρά του επιπέδου της αίμης. Η πέμπτη θέση συναρμογής καταλαμβάνεται από τον ιμιδαζολικό δακτύλιο ενός καταλοίπου ιστιδίνης. Το μόριο του οξυγόνου προσδένεται στην έκτη θέση (Berg et al. 2001). Αφού λοιπόν κάθε μόριο αιμοσφαιρίνης αποτελείται από τέσσερις ομάδες αίμης, είναι ευκόλως αντιληπτό πως υπάρχουν και αντίστοιχες τέσσερις θέσεις πρόσδεσης για το οξυγόνο. Η δέσμευση του οξυγόνου στην αιμοσφαιρίνη είναι μια πορεία συνεργατική, διότι η δέσμευση διαδοχικών μορίων οξυγόνου διευκολύνει τη δέσμευση του επόμενου μορίου. Ως κορεσμός της αιμοσφαιρίνης σε οξυγόνο (επί τοις εκατό) ορίζεται ο λόγος του ποσού της οξυαιμοσφαιρίνης προς το ποσό της αιμοσφαιρίνης. Σύμφωνα με αυτόν τον ορισμό η καμπύλη της αποδέσμευσης της αιμοσφαιρίνης θα έπρεπε να είναι υπερβολή. Ωστόσο, από μετρήσεις με φωτομετρικές μεθόδους αποδείχθηκε ότι είναι σιγμοειδής (Berg et al., 2001), (εικόνα 2). Το ότι η καμπύλη αυτή είναι Εικόνα 2: Καμπύλη αποδέσμευσης της αιμοσφαιρίνης σιγμοειδής έχει μεγάλη σημασία από άποψη φυσιολογίας. Το ανώτερο σχεδόν οριζόντιο τμήμα της σημαίνει ότι περνώντας από τους πνεύμονες, όπου η πίεση του οξυγόνου είναι μεγάλη 100 mm Hg, η αιμοσφαιρίνη δεσμεύεται σχεδόν πλήρως (98% περίπου). Επιπλέον, ακόμα και σε παθολογικές καταστάσεις μέχρι και 60 mm Hg, ο κορεσμός θα παραμείνει σε υψηλά επίπεδα. Το σχεδόν κατακόρυφο τμήμα της καμπύλης σημαίνει ότι στους ιστούς, όπου η πίεση του οξυγόνου είναι χαμηλά, ευνοείται η αποδέσμευση του οξυγόνου από την αιμοσφαιρίνη. Διάφοροι παράγοντες 15

16 επιδρούν στην καμπύλη αυτή. Οι πιο σημαντικοί είναι το ph, η θερμοκρασία, η ηλικία και η ποιότητα της αιμοσφαιρίνης. Α.2.2. Είδη αιμοσφαιρίνης Στην αιμοσφαιρίνη τύπου Α (ΗbA), η οποία συναντάται σε ενήλικες και παιδιά, η σφαιρίνη αποτελείται από δύο αλυσίδες α και δύο αλυσίδες β, είναι δηλαδή της μορφής α 2 β 2. Στους ενήλικες, εκτός από την HbA, που είναι και η κύρια μορφή αιμοσφαιρίνης τους, συναντάται σε ποσοστό περίπου 2-3% η σφαιρίνη HbA 2 (α 2 δ 2 ), καθώς επίσης και η εμβρυική αιμοσφαιρίνη HbF (α 2 γ 2 ) σε ποσοστό περίπου 1%. Η ΗbF είναι η κύρια αιμοσφαιρίνη του εμβρύου,η οποία μετά τη γέννηση αρχίζει να αντικαθίσταται από την HbA. Στο νεογνό, αποτελεί φυσιολογικά το 80% της συνολικής αιμοσφαιρίνης. Οι μορφές της αιμοσφαιρίνης ποικίλλουν, ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο. Σε κάποιες από αυτές τις μορφές θα αναφερθούμε αργότερα στο κείμενο. 16

17 Α.3 Ερυθροποίηση Ερυθροποίηση καλείται η βιολογική διαδικασία της παραγωγής ερυθρών αιμοσφαιρίων. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια ή ερυθροκύτταρα (RBC) είναι απύρηνα κύτταρα με σχήμα αμφίκοιλου δίσκου. Το σχήμα και το μικρό τους μέγεθος (διάμετρος 7μm) προσδίδουν σε αυτά μια υψηλή αναλογία επιφάνειας προς όγκο, έτσι ώστε το οξυγόνο, αλλά και το διοξείδιο του άνθρακα να μπορούν να διαχέονται γρήγορα προς και από το εσωτερικό του κυττάρου. Ο αριθμός των RBC είναι κατά μέσο όρο: /μl αίματος στους άνδρες και /μl αίματος στις γυναίκες. Τα ερυθροκύτταρα παράγονται στον ερυθρό μυελό των οστών. Στους ενήλικες, αυτός βρίσκεται στα οστά του κρανίου, στα οστά της ωμικής ζώνης, στους σπονδύλους, στις πλευρές, στα οστά της λεκάνης και στις άνω επιφύσεις του βραχιονίου και του μηριαίου οστού. Στα παιδιά, όλος ο μυελός των οστών είναι ερυθρός, δηλαδή και αυτός που βρίσκεται μέσα στα μακρά οστά των άνω και κάτω άκρων και που στον ενήλικα αποτελεί τον ωχρό ή λιπώδη ιστό. Στον ερυθρό μυελό των οστών παράγονται, επίσης, τα αιμοπετάλια και τα περισσότερα των λευκών αιμοσφαιρίων. Η παραγωγή όλων των έμμορφων στοιχείων του αίματος που γίνεται στον ερυθρό μυελό των οστών, ξεκινά από ένα αρχέγονο πολυδύναμο κύτταρο (εικόνα 3). Εικόνα 3:Διάγραμμα σταδίων αιμοποίησης Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (Hematopoietic Stem Cells - HSC) παράγουν προγονικά κύτταρα, που με τη σειρά τους μπορούν να αναπτύξουν σε 17

18 κυτταροκαλλιέργειες, μονάδες «εκρηκτικής αύξησης» ερυθροειδών κυττάρων (Burst Forming Unit - Erythroid, BFU - E). Αυτά τα κύτταρα ανιχνεύονται στο λεκιθικό ασκό και κατά την 5 η εβδομάδα στο ήπαρ. Από την 7 η έως και την 25 η εβδομάδα της κυοφορίας, αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα συναντώνται αποκλειστικά στο ήπαρ. Στη συνέχεια, όπως προαναφέρθηκε, κύριο σημείο ερυθροποίησης είναι ο μυελός των οστών. Το αρχέγονο κύτταρο της σειράς των ερυθρών αιμοσφαιρίων είναι η προερυθροβλάστη, η οποία μετά από προοδευτική ωρίμανση και διαδοχικές μιτωτικές διαιρέσεις καταλήγει στα ώριμα ερυθρά αιμοσφαίρια. Τα κύτταρα αυτά κατά την εξέλιξή τους εμπλουτίζονται με αιμοσφαιρίνη, ενώ στα τελευταία στάδια ο πυρήνας αρχίζει να μικραίνει και τελικά, αποβάλλεται από το κύτταρο. Τα νέα ερυθροκύτταρα στο μυελό των οστών περιέχουν εντούτοις λίγα ριβοσώματα και γι αυτό παρουσιάζουν μια δικτυωτή μορφή, όταν επεξεργάζονται με ειδικές χρωστικές, στοιχείο που τους προσδίδει το όνομα δικτυοερυθροκύτταρα. Σε 2-3 ημέρες χάνουν αυτό το δίκτυο και μεταπίπτουν σε κοινά ερυθρά αιμοσφαίρια (εικόνα 4). Προερυθροβλάστη (προμονοβλάστη) Βασεόφιλη ερυθροβλάστη (πρώιμη νορμοβλάστη) Πολυχρωματόφιλη ερυθροβλάστη (ενδιάμεση νορμοβλάστη) Ορθοχρωματική ερυθροβλάστη (όψιμη νορμοβλάστη) Δικτυοερυθροκύτταρο Ώριμο ερυθρό αιμοσφαίριο Εικόνα 4: Αναπτυξιακά στάδια διαφοροποίησης ερυθροκυττάρων 18

19 Τα ερυθρά αιμοσφαίρια δεν έχουν πυρήνες και οργανίδια. Έτσι, δεν μπορούν ούτε να αναπαραχθούν, ούτε να διατηρήσουν τη φυσιολογική τους δομή για πολύ χρόνο. Η μέση διάρκεια ζωής ενός ερυθροκυττάρου είναι περίπου 120 ημέρες. Κυρίαρχο ρόλο στην ερυθροποίηση παίζει η ερυθροποιητίνη, ορμόνη που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των ώριμων ερυθροκυττάρων. Η ερυθροποιητίνη είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που ενεργοποιεί την παραγωγή του mrna για το σχηματισμό της σφαιρίνης, η οποία με τη σειρά της αποτελεί το πρωτεϊνικό συστατικό του μορίου της αιμοσφαιρίνης. Στους ενήλικες, η ερυθροποιητίνη παράγεται στους νεφρούς, ενώ στα έμβρυα στο ήπαρ. Για να επιτευχθεί η ορθή ωρίμανση των ερυθρών αιμοσφαιρίων, χρειάζεται τόσο η βιταμίνη 12 (Β12), όσο και το φολλικό οξύ. Απουσία των δύο προαναφερθεισών βιταμινών, έχουμε εμφάνιση δικτυοερυθροκυτταροπενίας, λόγω της αποτυχημένης ωρίμανσης κατά την ερυθροποίηση. Τα ώριμα ερυθροκύτταρα παράγουν κυρίως HbA. Ωστόσο, υπάρχει κι ένας υποπληθυσμός ερυθροκυττάρων, στους οποίους δεν ολοκληρώνεται η μετάβαση από την εμβρυική HbF στην αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων, την HbA. Αυτό το υποσύνολο ερυθροκυττάρων δεν είναι άλλο από τα F-κύτταρα (Boyer et al., 1975 ; Wood et al., 1975), (εικόνα 5). Εικόνα 5: Διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων προς ερυθροκύτταρα και F-κύτταρα, που περιέχουν εμβρυική αιμοσφαιρίνη (Patrinos GP 2010) 19

20 A.4 Εξελικτική πορεία της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών και της σύνθεσης των μορφών αιμοσφαιρίνης Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της αιμοσφαιρίνης αποτελεί η σύνθεσή της υπό διαφορετικές μορφές, ανάλογα με τα διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης. Επιπροσθέτως, κάθε φορά αλλάζει και ο αιμοποιητικός ιστός από τον οποίο παράγονται οι εν λόγω διαφορετικές αυτές μορφές. Η αλλαγή στην έκφραση των διαφόρων γονιδίων των σφαιρινών κατά την ανάπτυξη καλείται και «μεταστροφή σφαιρινών». Οι βασικές θέσεις που λαμβάνει χώρα η ερυθροποίηση κατά τη διάρκεια της εμβρυικής ζωής είναι αρχικά ο λεκιθικός σάκος, εν συνεχεία το ήπαρ και τελικά, ο σπλήνας. Εξαιρουμένης της HbA, υπάρχουν ακόμα πέντε είδη φυσιολογικών αιμοσφαιρινών παρόμοιας δομής με αυτήν της ΗbA, δηλαδή τετραμερούς δομής. Καθεμιά αποτελείται από δύο αλυσίδες α-σφαιρίνης ή τύπου α-σφαιρίνης (α-like) και δύο αλυσίδες μη α (non - a) (Nussbaum et al, 2007). Εικόνα 6: Τύποι αιμοσφαιρίνης κατά τα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια ενός ανθρώπου (πηγή: Patrinos & Antonarakis, 2010) Κατά το εμβρυικό στάδιο (embryonic, εικόνα 6), οι τύποι αιμοσφαιρινών που εμφανίζονται είναι η Gower 1 (ε 2 ζ 2 ), η Gower 2 (α 2 ε 2 ) και η Portland (γ 2 ζ 2 ). Οι ε και ζ αλυσίδες, οι οποίες παράγονται στο λεκιθικό σάκο, εξαφανίζονται μετά τη 10 η εβδομάδα της εμβρυικής ζωής (Wood 1976). Εν συνεχεία, όλοι οι προαναφερόμενοι τύποι αιμοσφαιρίνης αντικαθίστανται από την εμβρυική αιμοσφαιρίνη HbF (α 2 γ 2 ). Σε έμβρυο ηλικίας 37 ημερών έχει βρεθεί πως η Gower 1 αντιπροσωπεύει το 42% επί του συνολικού ποσοστού της αιμοσφαιρίνης, η Gower 2 το 24% και η ΗbF το 34%. Η εμβρυική αιμοσφαιρίνη HbF αρχίζει να γίνεται κυρίαρχη από την 8 η εβδομάδα της 20

21 κύησης και φθάνει σε ποσοστό μεγαλύτερο από 90% στο τέλος της ενδομήτριας ζωής. Ο ρυθμός σύνθεσης των αλυσίδων β είναι χαμηλός ανάμεσα στην 8 η και την 34 η εβδομάδα της κύησης, με αποτέλεσμα η HbA να αποτελεί μόνο το 5-10% των αιμοσφαιρινών του νεογέννητου. Μετά την 34 η εβδομάδα,ο ρυθμός σύνθεσης της αλυσίδας γ μειώνεται, ενώ αντίθετα της β αυξάνεται (εικόνα 7). Επιπλέον, η σύνθεση της αλυσίδας δ αρχίζει λίγο πριν τη γέννηση και η HbA 2 φθάνει σε κανονικά επίπεδα τέσσερις περίπου μήνες μετά τη γέννηση. Στους ενήλικες επομένως, κυρίαρχο τύπο αποτελεί η HbA με ποσοστό 97%, ενώ οι ΗbA 2 και ΗbF λαμβάνουν ποσοστό 2,5% και 0,5%, αντίστοιχα (Wood, 1976; Stamatoyannopoulos & Grosveld, 2001; Τριανταφυλλίδης & Κουβατσή, 2009). Εικόνα 7: Αναπτυξιακό διάγραμμα έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών στον άνθρωπο, όπου απεικονίζεται η θέση και τα επίπεδα έκφρασης του κάθε γονιδίου κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων της ανάπτυξής του. (πηγή: Schechter, 2008) A.5 Δομή και οργάνωση των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης Η αλληλουχία των αμινοξέων σε κάθε σφαιρινική αλυσίδα καθορίζεται από το αντίστοιχο γονίδιο. Τα γονίδια της σφαιρίνης στον άνθρωπο διατάσσονται σε πολυγονιδιακά συμπλέγματα (multigene clusters), τα οποία με τη σειρά τους απαντώνται στα γονίδια των θηλαστικών και αποτελούν έναν κοινό τρόπο οργάνωσης. Αναφορικά με τα γονίδια των σφαιρινών, πιο συγκεκριμένα, υπάρχει ο α- και ο β-γονιδιακός τόπος. 21

22 Εικόνα 8: Το σύμπλεγμα των γονιδίων της α-σφαιρίνης (Patrinos GP 2010) Όπως διακρίνεται στην παραπάνω εικόνα, το σύμπλεγμα των γονιδίων της α- σφαιρίνης εδράζεται στο 16 ο χρωμόσωμα. Πιο συγκεκριμένα, το γονίδιο της α- σφαιρίνης υπάρχει σε δύο αντίγραφα, τα HBA1 και HBA2, τα οποία αφού μεταφραστούν καταλήγουν σε ένα πανομοιότυπο πρωτεϊνικό προϊόν. Αυτό που αξίζει να σημειώσουμε στην εικόνα 8 είναι το γεγονός πως το γονίδιο της εμβρυικής σφαιρίνης ζ, το HBZ, βρίσκεται στον ίδιο γονιδιακό τόπο. Επιπλέον, στο 16 ο χρωμόσωμα εδράζονται και τα αντίστοιχα ψευδογονίδια των γονιδίων στα οποία προαναφερθήκαμε. Τα ψευδογονίδια αυτά είναι τα ΗΒΖΡ, ΗΒΑΡ2 και ΗΒΑΡ1. Τέλος, βλέπουμε και την ύπαρξη ενός άλλου, αδιευκρίνιστης ακόμα λειτουργίας, γονιδίου, του HBQ1 ή αλλιώς θ-γονιδίου (Marks et al., 1986 ). Εικόνα 9: Σχεδιάγραμμα του συμπλέγματος γονιδίων της β-σφαιρίνης (Patrinos GP 2010) Το σύμπλεγμα των γονιδίων της β - σφαιρίνης εδράζεται στο χρωμόσωμα 11 (εικόνα 9). Σε αυτό, παρατηρούμε τα εξής γονίδια (κατά σειρά): αυτό της εμβρυονικής ε- σφαιρίνης (ΗΒΕ), δύο γονίδια της εμβρυικής γ-σφαιρίνης (Gγ- (HBG2)) και (Αγ- (HBG2)), το ψευδογονίδιο της β-σφαιρίνης (ΗΒΒΡ), ένα αντίγραφο του γονιδίου της δ-σφαιρίνης και, τελικά, το γονίδιο της β-σφαιρίνης (ΗΒΒ). Και στους δύο γενετικούς τόπους, εκτός από τα μεταγραφόμενα γονίδια με τις εγγύς ρυθμιστικές τους αλληλουχίες, περιλαμβάνονται και οι ρυθμιστικές περιοχές κατά το 5 άκρο τους, οι οποίες συνιστούν τις περιοχές ελέγχου του γονιδιακού τόπου (locus control regions, LCRs). Οι περιοχές LCR, γενικώς, είναι πολύ ισχυρά γενετικά ρυθμιστικά στοιχεία η περιοχή LCR των β-σφαιρινών διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο 22

23 στη ρύθμιση της δομής της χρωματίνης του γενετικού τόπου και της μεταγραφής των β-σφαιρινικών γονιδίων. Η περιοχή LCR μονώνει (insulates) το σύμπλεγμα από τη γειτονική ανενεργή χρωματίνη και αποτελεί τον κύριο ενισχυτή (enhancer) του σφαιρινικού συμπλέγματος είναι δε αυτή, που καθορίζει την έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων, αποκλειστικά, σε κύτταρα ερυθροειδικής προέλευσης (Li et al 1999). Στο σύμπλεγμα των β-σφαιρινών, η περιοχή LCR αποτελείται από πέντε περιοχές ευαίσθητες σε κατάτμηση από την DNAse Ι (HS, hypersensitive sites), που βρίσκονται 6-22kb άνω (προς το 5 ) του γονιδίου ε (εικόνα 4). Κάθε μια από τις πέντε περιοχές HS απαρτίζεται από μια κεντρική (core) αλληλουχία, μήκους περίπου 250 νουκλεοτιδίων, που είναι κατάμεστη από συγκεκριμένες αλληλουχίες τις οποίες αναγνωρίζουν και στις οποίες συνδέονται γενικοί και ερυθροειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες. Επιπλέον, κάθε HS ασκεί μια συγκεκριμένη δράση. Για παράδειγμα, η περιοχή HS3 στον άνθρωπο δρα σαν ενεργοποιητής της έκφρασης των γονιδίων ε και γ (Navas et al 1998), ενώ η περιοχή HS5 χρησιμεύει ως περιοχή σύνδεσης με τον πυρηνικό ιστό (scaffold attachment region, SAR) και έχει δράση μονωτή (Bell et al 2001, Li et al 2002). Στο σύμπλεγμα των α-σφαιρινών, η αντίστοιχη περιοχή LCR είναι η HS40, σε απόσταση 40kb κατά το 5 του γονιδίου ζ, και λειτουργικά μοιάζει περισσότερο με κλασσικό ενισχυτή. Η έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων υφίσταται πολύπλοκη ρύθμιση. Ειδικότερα, οι γενετικοί τόποι των σφαιρινών του ανθρώπου και των ευκαρυωτικών οργανισμών, αποτελούν το κομψότερο ίσως μοντέλο γονιδιακής έκφρασης, το οποίο αφενός έχει μελετηθεί περισσότερο από κάθε άλλο, αφετέρου κρατά ακόμα πολλά μυστικά του κρυμμένα. Α.6 Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών Η έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών ρυθμίζεται, κυρίως, στο επίπεδο της μεταγραφής. Η μεταγραφή ελέγχεται μέσω της συνισταμένης των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ρυθμιστικών αλληλουχιών που βρίσκονται τοποθετημένες γραμμικά στο μόριο του DNA (cis acting elements) και παραγόντων μεταγραφής (trans acting elements). Οι ρυθμιστικές αλληλουχίες εντοπίζονται στις εξής περιοχές: 23

24 Περιοχές 20 kb αριστερά του γονιδίου ΗΒΕ (β-lcr) και 40 kb αριστερά του ΗΒΖ (α-lcr), που περιέχουν πέντε και μία - αντίστοιχα - υπερευαίσθητες θέσεις στη δράση του ενζύμου DNAάση Ι Περιοχή ή περιοχές των ενισχυτών, που βρίσκονται δεξιά των γονιδίων ΗΒΒ και HBG1 Περιοχή ή περιοχές των αποσιωπητών των γονιδίων HBG1 και ΗΒΕ Περιοχές των υποκινητών που εκτείνονται σε απόσταση bp αριστερά από το σημείο έναρξης της μεταγραφής (cap site) του γονιδίου που ελέγχουν Οι μεταγραφικοί παράγοντες είναι ερυθροειδικοί, χρονοειδικοί και γενικοί. Η έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών επηρεάζεται από τη μεθυλίωση περιοχών με αλληλουχίες GpC. Τα ποσοστά έκφρασης των γονιδίων που έπονται των περιοχών αυτών είναι αντιστρόφως ανάλογα της έντασης της μεθυλίωσης των κυτοσινών των αλληλουχιών GpC. Άλλος ένας μηχανισμός που μετέχει στη μεταγραφή των σφαιρινικών γονιδίων, προετοιμάζοντας τη χρωματινική ίνα για τη διαδικασία της μεταγραφής, είναι η ακετυλίωση των ιστονών. Α.6.1 Υποκινητές-Ενισχυτές-Αποσιωπητές Η οργάνωση των υποκινητών των σφαιρινικών γονιδίων ακολουθεί το γενικό πρότυπο των ευκαρυωτικών υποκινητών, με τις συντηρητικές αλληλουχίες του κουτιού "TATA" σε απόσταση 25 bp-30 bp αριστερά από το σημείο έναρξης της μεταγραφής (θέση cap), του κουτιού "CCAAT", bp αριστερά από τη θέση cap και του κουτιού "CACC", 90 bp-150 bp αριστερά από τη θέση cap. Τα τμήματα των υποκινητών περιέχουν αλληλουχίες για την πρόσδεση των παραγόντων μεταγραφής. A Το γονίδιο HBE Ο υποκινητής του γονιδίου ΗΒΕ είναι οργανωμένος, σύμφωνα με το παραπάνω πρότυπο και περιλαμβάνει ακόμη μία περιοχή αρνητικής δράσης, η οποία βρίσκεται μεταξύ των νουκλεοτιδίων -467 bp και -182 bp. Η τελευταία περιέχει αλληλουχίες πρόσδεσης του αρνητικού μεταγραφικού παράγοντα ΥΥΙ. 24

25 A HBG γονίδια Οι υποκινητές των εμβρυϊκών γονιδίων φέρουν διπλό το κουτί "CCAAT". Δεξιά (3') του γονιδίου ΗΒG1 και σε απόσταση 400 bp από την αλληλουχία του poly(a) βρίσκεται μία περιοχή μήκους 750 bp, που αρχικά είχε χαρακτηρισθεί ως ενισχυτής. Σήμερα πιστεύεται ότι αποτελεί περιοχή προσκόλλησης, επαφής του DNA στον πυρηνικό σκελετό (Nuclear Matrix attachment Region/ Scaffold attachment region). Η περιοχή αυτή περιέχει, επίσης, θέσεις για την πρόσδεση των παραγόντων GATA-1, SATB-1, καθώς και άλλων γενικών παραγόντων, όπως οι ΑΡ-2, CBP-1, Sp1. Η περιοχή αυτή μπορεί να: διαχωρίζει το μεταγραφικά ενεργό γονίδιο HBB στο ενήλικο στάδιο από τα αποσιωπημένα εμβρυϊκά γονίδια και να συμμετέχει ως ενισχυτής (περιέχει GATA-1 θέση) σε αλληλεπίδραση με τους υποκινητές των HBG γονιδίων A HBB γονίδιο Στον υποκινητή του γονιδίου ΗΒΒ παρατηρείται το ίδιο πρότυπο οργάνωσης με αυτό των HBG, εντούτοις στο ΗΒΒ γονίδιο διπλασιάζεται το κουτί "CACC". Οι νουκλεοτιδικές αντικαταστάσεις στον υποκινητή του γονιδίου ΗΒΒ οδηγούν στη μειωμένη έκφρασή του, σε αντίθεση με τις αντικαταστάσεις των υποκινητών των γονιδίων ΗΒG, οι οποίες οδηγούν σε αύξηση της έκφρασης των γονιδίων ΗΒG στο ενήλικο στάδιο. Η περιοχή που καλύπτει το τέλος του 2 ου εσωνίου και την αρχή του 3 ου εξωνίου και εκτείνεται μεταξύ των περιοριστικών ενδονουκλεασών BamH 1, EcoR 1,αποτελεί πιθανή αλληλουχία προσκόλλησης του 11 ου χρωμοσώματος στον πυρηνικό σκελετό. Η εν λόγω περιοχή εμπεριέχει αλληλουχίες πρόσδεσης των παραγόντων GATA-1,Oct- 1 και SATB-1. Δεξιά (3') του γονιδίου ΗΒΒ και σε απόσταση 2.2 Kb από τη θέση cap του γονιδίου έχει βρεθεί μια περιοχή μήκους 250 bp περίπου, που διαδραματίζει ρόλο ενισχυτή. Αλλη μία περιοχή, που έχει χαρακτηρισθεί ως πιθανός ενισχυτής για την έκφραση του 25

26 γονιδίου της β-σφαιρίνης σε πειράματα παροδικής διαμόλυνσης της κυτταρικής σειράς MEL, έχει εντοπιστεί σε απόσταση 1Kb αριστερά του γονιδίου HBD. Α HBZ και HBA2/HBA1 γονίδια Μολονότι τα γονίδια ΗΒΖ και ΗΒΑ2/ΗΒΑ1 δε βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα με το σύμπλεγμα του β-γονιδιακού τόπου, ωστόσο έχουν αρκετά κοινά χαρακτηριστικά. Οι υποκινητές των γονιδίων ΗΒΑ2/ΗΒΑ1 και οι κωδικές τους περιοχές είναι σχεδόν ταυτόσημες. Το ΗΒΖ γονίδιο από την άλλη, διαθέτει την κλασική δομή στη θέση του υποκινητή με τις αλληλουχίες CACCC, CCAAT και TATA να διευθετούνται με κατεύθυνση 5 3 (Patrinos & Antonarakis, 2010). A.6.2. Περιοχές ελέγχου των συμπλεγμάτων των γονιδίων των σφαιρινών (Locus Control Region- LCR ) A Περιοχή ελέγχου του συμπλέγματος των β τύπου γονιδίων(βγονιδιακού τόπου), β-lcr H β-lcr αντιπροσωπεύει μια ισχυρή ρυθμιστική αλληλουχία στην έκφραση των γονιδίων του β-γονιδιακού τόπου. Βρίσκεται αριστερά του γονιδίου HBE, διάσπαρτη στην περιοχή από -6 έως -20 kb. Αποτελείται από 5 θέσεις υπερευαίσθητες στη δράση του ενζύμου μικροκοκκική νουκλεάση, που συμβολίζονται ως HS1,HS2,HS3,HS4 και HS5 (Hypersensitive Site - υπερευαίσθητη θέση), (εικόνα 10). Ο πυρήνας κάθε θέσης έχει μήκος ζεύγη βάσεων και περιέχει αλληλουχίες πρόσδεσης παραγόντων μεταγραφής, όπως ο Sp1, o NF E2, o GATA-1 και διάφοροι άλλοι. Τα επίπεδα των παραγόντων ποικίλλουν ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο. Η σημασία της LCR στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης φαίνεται σε περιπτώσεις θαλασσαιμιών Αγγλικού και Ολλανδικού τύπου. Εκεί, παρατηρούνται μεγάλες ελλείψεις γενετικού υλικού, που αφήνουν ακέραιο το β-γονίδιο, αλλά απομακρύνουν το αριστερό τμήμα της ομάδας των β-τύπου γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης και της β-lcr περιοχής. Σαν αποτέλεσμα, οι ελλείψεις αυτές προκάλεσαν τη μεταγραφική αδράνεια του β-γονιδίου. 26

27 Η λειτουργική σημασία της περιοχής β-lcr προσδιορίστηκε, όταν χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της έκφρασης των ανθρώπινων σφαιρινικών γονιδίων σε διαγονιδιακούς μύες. Απουσία της β-lcr, τα επίπεδα έκφρασης των παραπάνω γονιδίων ήταν πολύ χαμηλά και εξαρτώνταν από τη θέση ενσωμάτωσης της κατασκευής στο γονιδίωμα του μύα. Παρουσία της, αντιθέτως, τα ανθρώπινα γονίδια των σφαιρινών β-τύπου εκφράστηκαν σε επίπεδα συγκρίσιμα με αυτά των ενδογενών σφαιρινικών γονιδίων του μύα και ανεξάρτητα από τη θέση της ενσωμάτωσης. Σύμφωνα με πειράματα έκφρασης των β-τύπου γονιδίων του ανθρώπου σε διαγονιδιακούς μύες, η β-lcr περιοχή προσφέρει: Ειδικότητα ως προς τον ιστό έκφρασης (έκφραση στα κύτταρα της ερυθράς σειράς) Ειδικότητα ως προς το αναπτυξιακό στάδιο έκφρασης (έκφραση του γονιδίου HBE στο λεκιθικό ασκό, έκφραση των HBG γονιδίων στο εμβρυικό ήπαρ και του HBB στο μυελό των οστών Δυνατότητα έκφρασης των συνδεδεμένων με αυτή γονιδίων, ανεξάρτητα από τη θέση ενσωμάτωσής τους στο γονιδίωμα του μύα Επιπρόσθετα, η LCR συμμετέχει στην έναρξη της αντιγραφής του DNA της περιοχής. Για τη λειτουργικότητα των επιμέρους θέσεων της περιοχής, προέκυψαν οι κάτωθι αναφερόμενες ενδείξεις μετά από πειράματα σε διαγονιδιακούς μύες: H Hypersensitive Site 1 (ΗS1) παρουσιάζει μετρίας ποσότητας διεγέρση στην έκφραση των γονιδίων του β-γονιδιακού τόπου του ανθρώπου, όταν τα τελευταία είναι συνδεδεμένα με αυτή Οι HS2 και HS4 ενισχύουν την έκφραση των παραπάνω γονιδίων Η ΗS3 είναι ο πυρήνας της LCR περιοχής έχοντας τη δυνατότητα ανοίγματος της χρωματίνης. Επιπρόσθετα, ενεργοποιεί τη χρωματίνη απομακρύνοντας τα νουκλεοσώματα και προσφέροντας τις αλληλουχίες του DNA για την πρόσδεση των κατάλληλων μεταγραφικών παραγόντων. Η ΗS5 συμβάλλει στην απομόνωση του συμπλέγματος από το υπόλοιπο χρωμόσωμα, με αποτέλεσμα να διευκολύνει τη δράση της LCR. 27

28 Εικόνα 10:Παράσταση του συμπλέγματος των β τύπου γονιδίων. Διακρίνονται οι 5 υπερευαίσθητες θέσεις (HS) της LCR. Οι κυρίαρχες απόψεις για το μηχανισμό δράσης της LCR είναι δύο. Η πρώτη υποστηρίζει πως οι υπερευαίσθητες θέσεις αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και συγκροτούν ένα σύμπλεγμα (holocomplex), που αλληλεπιδρά επιλεκτικά με τους υποκινητές των ενεργών γονιδίων στα αντίστοιχα αναπτυξιακά στάδια. Στον αντίποδα, οι θέσεις που τη συνιστούν παρουσιάζουν επιλεκτική αλληλεπίδραση με τα γονίδια των διαφόρων αναπτυξιακών σταδίων. Πιο συγκεκριμένα, η HS2 αλληλεπιδρά με τον υποκινητή του πρωτοεμβρυικού γονιδίου HBE στο αντίστοιχο στάδιο, η ΗS3 αλληλεπιδρά, κυρίως, με τα εμβρυικά γονίδια στο εμβρυικό στάδιο ανάπτυξης, ενώ η ΗS4 αλληλεπιδρά με τα γονίδια του ενηλίκου στο στάδιο της ενήλικης ζωής. Πιθανή έλλειψη μιας HS από την περιοχή LCR οδηγεί σε διαταραχή της φυσιολογικής αλληλεπίδρασης ανάμεσα στην LCR και τα γονίδια. Αυτή η διαταραχή εμποδίζει τη δράση της LCR στο διασκελισμό των αρνητικών φαινομένων, που υπαγορεύονται από τη θέση ενσωμάτωσης στο γονιδίωμα. Η ελλιπής περιοχή LCR δεν μπορεί να «ανοίξει» τη χρωματινική ίνα, μετατρέποντας την ετεροχρωματίνη σε ευχρωματίνη. Συμπερασματικά, η μέγιστη θετική δράση της LCR περιοχής στην έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών επιτυγχάνεται, όταν το σύνολο των επιμέρους θέσεων βρίσκεται σε συνεργασία. Α Περιοχή ελέγχου του συγκροτήματος των α τύπου γονιδίων (αγονιδιακού τόπου) Η ιστοειδική και αναπτυξιακά ελεγχόμενη έκφραση των α-τύπου γονιδίων συνηγορεί για την ύπαρξη μιας ρυθμιστικής περιοχής ελέγχου. Η μεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων α-τύπου, χωρίς ισχυρές ρυθμιστικές αλληλουχίες σε ερυθροκυτταρικές καλλιέργειες και διαγονιδιακούς μύες, είναι περιορισμένη. 28

29 Οταν, όμως, στα γονίδια αυτά προσαρτηθούν τμήματα της περιοχής ελέγχου των β- τύπου γονιδίων (β-lcr), τότε η έκφραση των γονιδίων αυξάνεται σημαντικά. Από συστηματικές μελέτες έχει βρεθεί ότι ο έλεγχος των α-τύπου γονιδίων πραγματοποιείται από μία περιοχή που βρίσκεται 40 Kb αριστερά του γονιδίου ζ με ισχυρό ερυθροειδικό και ενισχυτικό ρόλο και συμβολίζεται ως HS-40. Α Παράγοντες μεταγραφής που μετέχουν στην έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών Ο παράγοντας GATA-1 έχει δομή δακτύλων ψευδαργύρου και αναγνωρίζει τη νουκλεοτιδική αλληλουχία (T/A)GATA(A/G). Ανήκει στην οικογένεια «GATA». Η ονομασία του προκύπτει από το συντηρρημένο «πυρήνα» GATA της αλληλουχίας που αναγνωρίζει. Ο GATA-1, αρχικά, είχε χαρακτηρισθεί ως ερυθροειδικός παράγοντας, κατόπιν, όμως, ανιχνεύθηκε και σε άλλα είδη κυττάρων, όπως τα πολυδύναμα αιμοποιητικά, τα μεγακαρυωκύτταρα, τα μαστικά, τα ενδοθηλιακά και άλλα. Ο GATA- 1 ανεξάρτητα από την ευρύτητα της παρουσίας του, αποτελεί έναν ουσιαστικό ερυθροποιητικό παράγοντα, γεγονός που καταδεικνύεται άλλωστε και από την αθρόα παρουσία του στις περιοχές των υποκινητών, ενισχυτών των ερυθροειδικών γονιδίων και στις περιοχές ελέγχου (LCR) των α- και β-γονιδιακών συμπλεγμάτων. Η αρχική ονομασία του GATA-1 ήταν NFE1. Ο NFE2 (Nuclear Factor Erythroid 2), έχει δομή «φερμουάρ» λευκίνης και η συντηρημένη αλληλουχία που αναγνωρίζει είναι (T/C)GCTGA(C/G)TCA(T/C). Στην παραπάνω θέση πρόσδεσης περιέχεται η TGAGTCA, που αποτελεί αλληλουχία πρόσδεσης του γενικού παράγοντα ΑΡ1 (Activating Protein 1). Ο NFE2 είχε, αρχικά, θεωρηθεί ερυθροειδικός παράγοντας, αλλά σήμερα γνωρίζουμε ότι εκφράζεται, όπως ο GATA-1, σε πολυδύναμα αιμοποιητικά κύτταρα, μεγακαρυωκύπαρα και άλλα. Οι θέσεις πρόσδεσης των GATA-1 και NFE2 γειτνιάζουν. Το γεγονός αυτό συνηγορεί στην αλληλεπίδραση των δύο παραγόντων, με αποτέλεσμα τη μέγιστη έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών στα ερυθροειδικά κύτταρα. Σε in vitro πειράματα, ο παράγοντας NFE2 φαίνεται να μετέχει στην απομάκρυνση των νουκλεοσωμάτων από τη θέση HS2, ευνοώντας έτσι την πρόσδεση του παράγοντα GATA-1. 29

30 Ο παράγοντας EKLF (Erythroid Krüppel Like Factor) έχει δομή δακτύλων ψευδαργύρου και προσδένεται στο εννιαμερές "CCACACCCT", που περιλαμβάνει το κουτί «CACCC» του β-γονιδίου των σφαιρινών. Θεωρείται ότι μετέχει στη μεταστροφή των αιμοσφαιρινών από το εμβρυϊκό στο ενήλικο στάδιο, παρουσιάζοντας ισχυρή επιλεκτική αλληλεπίδραση με τον υποκινητή του β-γονιδίου. Ερυθροειδικοί παράγοντες θεωρούνται επίσης ο NFE3, που προσδένεται κοντά στο απώτερο κουτί «CCAAT» των γ-γονιδίων και ο SSP, που προσδένεται αριστερά του κουτιού «TATA» των γ-γονιδίων. Ο SSP αποτελεί παράγοντα ειδικό ως προς το αναπτυξιακό στάδιο δράσης. Τέλος, οι Spi, Oct-1, CDP, CP 1 και YY1 απαντώνται σε διάφορες θέσεις μέσα στους υποκινητές των σφαιρινικών γονιδίων και αντιπροσωπεύουν γενικούς παράγοντες μεταγραφής. A.7 Γενετικοί τροποποιητές που επιδρούν στο β-γονιδιακό τόπο Δύο ειδών γονιδιακοί τόποι επιδρούν στην έκφραση των γονιδίων της β-σφαιρίνης: οι συνδεδεμένοι (linked) ή οι μη συνδεδεμένοι με το β-γονιδιακό τόπο. Στους συνδεδεμένους συγκαταλέγονται τα cis-δραστικά στοιχεία, που αποτελούν αλληλουχίες DNA, με ειδικότητα στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων, που εντοπίζονται στο ίδιο μόριο DNA (χρωμόσωμα). Α.7.1. cis-δραστικά στοιχεία Σήμερα, έχει παρατηρηθεί συσχέτιση μεταξύ κάποιων ελλείψεων κοντά στο β- σφαιρινικό γονίδιο και διάφορων μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs), με υψηλά επίπεδα HBF σε καταστάσεις, όπως η δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD), αλλά και η β-θαλασσαιμία (Thein 2008). Στο σημείο αυτό, απαιτείται να σημειωθεί πως οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί περιγράφονται εκτενώς, αργότερα στο κείμενο. Οι πολυμορφισμοί αυτοί συντελούν στο σύνδρομο HPFH(Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin(Κληρονομική Παραμονή Εμβρυικής Αιμοσφαιρίνης), στο οποίο 30

31 συνεχίζει η παραγωγή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης (HbF) στην ενήλικη ζωή, με αποτέλεσμα να μην πραγματοποιείται η μετάβαση προς την έκφραση της HbA. Η γενετικά καθορισμένη παραμονή της έκφρασης της HbF έχει εξομαλυντική δράση στη δρεπανοκυτταρική αναιμία και τη β-θαλασσαιμία, οι οποίες είναι και οι πιο κοινές μονογονιδιακές νόσοι σε παγκόσμια κλίμακα. Το σύνδρομο HPFH εμφανίζεται, κυρίως, σε πληθυσμούς ελληνικούς και αφρικανικούς. Ένας από τους πολυμορφισμούς που αξίζει να αναφερθεί είναι μια αντικατάσταση C>T στη θέση ανοδικά του Gγ-γονιδίου, στην περιοχή του υποκινητή του Gγ-σφαιρινικού γονίδιου, που δημιουργεί μια περιοριστική θέση για την περιοριστική ενδονουκλεάση XmnI. Αυτό το SNP έχει συσχετιστεί με υψηλή έκφραση HbF σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία και β-θαλασσαιμία. Ειδικότερα, βρέθηκε ότι το αλληλόμορφο Τ στη θέση -158 σχετίζεται με 3-11 φορές αυξημένα επίπεδα της HbF ανά Gγ-γονίδιο, που είναι μια τάξη μεγέθους μικρότερη από τη συσχέτιση που έχει βρεθεί για την αντικατάσταση -202 G>C με την HbF για τους Gγ-β+ - HPFH ασθενείς (Gilman and Huisman 1985, Labie et al. 1985). Τα cis-δραστικά στοιχεία στο γονιδιακό τόπο της β-σφαιρίνης εξηγούν σε ποσοστό μικρότερο του 25% τη μεταβλητότητα στα επίπεδα της HbF, ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό της διακύμανσης οφείλεται σε παράγοντες που δεν είναι συνδεδεμένοι με το γονιδιακό τόπο της β-σφαιρίνης. Έτσι, οι μεταλλάξεις στην περιοχή του υποκινητή, που είναι σπάνιες, δεν μπορούν να εξηγήσουν την ευρεία διακύμανση που υπάρχει στο γενικό πληθυσμό με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Μελέτες που στοχεύουν στην ταυτοποίηση των ρυθμιστών της παραγωγής της HbF, που διεξήχθησαν σε άτομα με ετεροκυτταρική κληρονομική παραμονή της HbF (HPFH), δηλαδή άτομα με αυξημένα επίπεδα HbF, άνισα κατανεμημένα μεταξύ των F-κυττάρων, πρότειναν την απουσία σύνδεσης μεταξύ του καθοριστικού παράγοντα των επιπέδων της HbF και του συμπλέγματος γονιδίων β-σφαιρίνης. Αργότερα, αναζητώντας τα γενετικά στοιχεία που συνδέονται με τα αυξημένα επίπεδα HbF σε υγιείς ενήλικες, αρκετές cis-δραστικές παραλλαγές επί του συμπλέγματος των γονιδίων της β-σφαιρίνης θεωρήθηκαν λιγότερο σημαντικές, ενώ έγιναν γνωστές περιοχές μη συνδεδεμένες προς το γενετικό τόπο της β-σφαιρίνης (trans-δραστικά στοιχεία), όπως «γονιδιακοί τόποι ποσοτικών γνωρισμάτων» (Quantitative Trait Loci - QTL) στα χρωμοσώματα Xp22, 6q23, 8q και 2p16.1(Thein 2008). Στο γεγονός αυτό 31

32 συνέβαλε, τόσο η βελτιωμένη γνώση για το ανθρώπινο γονιδίωμα, όσο και η ανάπτυξη νέων εργαλείων γονιδιωματικής. Α.7.2 QTL-γονιδιακοί τόποι που επηρεάζουν τα επίπεδα της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF Έπειτα από μελέτες συσχέτισης της γονιδιωματικής κλίμακας της HbF και των F- κυττάρων, προσδιορίστηκαν τρεις κύριοι γονιδιακοί τόποι και αποδείχτηκε ότι επηρεάζουν τα επίπεδα της HbF (Thein 2011). Τέτοιους τόπους αποτελούν α) μια περιοχή εσωτερικά του γονιδίου BCL11A στο χρωμόσωμα 2, β) μια διαγονιδιακή περιοχή μεταξύ των γονιδίων HBSIL1 και MYB στο χρωμόσωμα 6 και γ) κάποιοι πολυμορφισμοί στο β-γονιδιακό τόπο του χρωμοσώματος 1 (Sankaran and Orkin 2013). Τα επίπεδα της πρωτεΐνης BCL11A συσχετίζονται με το αναπτυξιακό στάδιο της έκφρασης της HbF. Σε ώριμα ερυθροκύτταρα και πρώιμα ερυθροειδικά κύτταρα, στα οποία ανιχνεύονται υψηλά επίπεδα έκφρασης της γ-σφαιρίνης παρατηρήθηκε χαμηλή ή ακόμη και μηδενική έκφραση της BCL11A ισoμορφής πλήρους μήκους. Από αυτό το γεγονός εξάγεται το συμπέρασμα πως η συγκεκριμένη πρωτεΐνη δρα ως καταστολέας των γονιδίων της γ-σφαιρίνης. Για να εξακριβωθεί η κατασταλτική δράση της πρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή ερυθροειδικά προγονικά ενήλικα κύτταρα, τα οποία αναστάλθηκε η λειτουργία του γονιδίου BCL11A (knockdown). Επιπροσθέτως, αποδείχθηκε πως η BCL11A αλληλεπιδρά άμεσα με τη χρωματίνη του ανθρώπινου β-γονιδιακού τόπου στα προγονικά ερυθροειδικά κύτταρα και λειτουργεί ως μέρος του συμπλέγματος με τον μεταγραφικό παράγοντα GATA1 και του συμπλέγματος καταστολής της χρωματίνης, γνωστό ως NuRD. Ο μεταγραφικός παράγοντας SOX6 αλληλεπιδρά με την BCL11A για την αποσιώπηση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης στους ανθρώπους και προσδένεται στον εγγύ υποκινητή των γονιδίων αυτών. Ο ακριβής μηχανισμός, με τον οποίο η BCL11A αποσιωπά την έκφραση των γ-σφαιρινών, παραμένει ασαφής. Σύμφωνα με μια πρόσφατη μελέτη, το γεγονός αυτό μπορεί να επιτυγχάνεται μέσω αμφότερων αλληλεπιδράσεων με μεταγραφικούς παράγοντες, όπως ο SOX6, οι οποίοι δεσμεύουν τη χρωματίνη στους εγγύς γ-σφαιρινικούς υποκινητές, καθώς και μέσω μακροπρόσθεσμων αλληλεπιδράσεων σε μια ποικιλία περιοχών σε ολόκληρο το β- γονιδιακό τόπο. 32

33 Δύο επόμενες μελέτες, χρησιμοποιώντας ανεξάρτητες, αλλά συμπληρωματικές προσεγγίσεις, κατέληξαν στο συμπέρασμα πως η έκφραση της BCL11A φαίνεται να ελέγχεται από τον ερυθροειδικό μεταγραφικό παράγοντα KLF1. Παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων έκφρασης της HbF σε μύα που έφερε το υπομορφικό αλληλόμορφο του γονιδίου KLF1 και επίμονη έκφραση του γονιδίου της γ-σφαιρίνης σε διαγονιδιακούς μύες που έφεραν στο γονιδίωμα τους τον ανθρώπινο β-γονιδιακό τόπο. Στη συνέχεια, οι επιστήμονες χρησιμοποιώντας shrna (small hairpin RNA), ήλεγξαν εάν η ρύθμιση αυτή θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί και σε πρόδρομα ερυθροειδικά κύτταρα. Τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης της γ-σφαιρίνης, που τελικά ανιχνεύθηκαν σε αυτά τα κύτταρα, μπορεί να οφείλονται, είτε σε άμεση αλληλεπίδραση του παράγοντα KLF1 με το β-γονιδιακό τόπο, είτε σε έμμεση αλληλεπίδραση αυτού με το γονίδιο BCL11A. Η έμμεση αλληλεπίδραση ελέγχθηκε μέσω αναστολής της λειτουργίας του γονιδίου KLF1 (knockdown), όπου παρατηρήθηκε και μειωμένη έκφραση του BCL11Α. Συμπερασματικά, ο μεταγραφικός παράγοντας KLF1 απεδείχθη πως ασκεί θετική ρύθμιση στην έκφραση του BCL11Α (Zhou et al. 2010). Ταυτόχρονα, οι Borg και συνεργάτες( Borg et al. 2010) εξέτασαν τη γενετική βάση μιας συνδεδεμένης μορφής HPFH, που προέκυψε από μια μη ερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο γονίδιο KLF1 στην οικογένεια που εξετάστηκε. Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν πρόδρομα ερυθροειδικά κύτταρα ασθενών με HPFH και υγιών μαρτύρων και έδειξαν πως τα υψηλά επίπεδα HbF οφείλονταν κατά μέρος στην αποσιωπητική δράση του παράγοντα KLF1 στο γονίδιο BCL11A (Borg et al. 2010). Πιο πρόσφατες μελέτες προτείνουν πως σπάνιοι πολυμορφισμοί στο γονίδιο KLF1, πράγματι, σχετίζονται με την αύξηση των επιπέδων της HbF, αλλά αυτό δεν φαίνεται να συμβαίνει πάντα ή με το ίδιο εύρος, ακόμα και σε περιπτώσεις παρόμοιων μεταλλάξεων. Η βάση αυτών των πολυμορφισμών παραμένει ακόμα ανεξερεύνητη και είναι ιδιαίτερα σημαντικό να γίνουν κατανοητοί οι μηχανισμοί με τους οποίους ο KLF1 δρα άμεσα η έμμεσα επηρεάζοντας την έκφραση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF (Gallienne et al. 2012). Όσον αφορά τη διαγονιδιακή περιοχή μεταξύ των γονιδίων HBS1L και MYB, φαίνεται να υπάρχουν παραλλαγές που έχουν δραματική επίδραση στα επίπεδα της HbF στον άνθρωπο. Η κατανόηση του μηχανισμού δράσης με τον οποίο αυτές οι παραλλαγές οδηγούν στην τροποποίηση των επιπέδων HbF είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθώς οι γενετικές παραλλαγές σε αυτό το γενετικό τόπο, φαίνεται να έχουν μεγαλύτερη 33

34 επίδραση στη νοσηρότητα των β-αιμοσφαιρινοπαθειών, συγκριτικά με τις παραλλαγές που βρίσκονται στο γενετικό τόπο του BCL11A. Αυτή η περιοχή περιλαμβάνει μια πλειάδα ρυθμιστικών στοιχείων, που έχουν προταθεί πως διαδραματίζουν έναν πιθανά σημαντικό ρόλο στην έκφραση της ρύθμισης του MYB στα πρόδρομα ερυθροειδικά κύτταρα. (εικόνα 11). Παρόλο που η υπερέκφραση του HBS1L δε φάνηκε να επηρεάζει την έκφραση της γ- σφαιρίνης σε Κ562 ερυθρολευχαιμικά κύτταρα, η υπερέκφραση του MYB φάνηκε να επηρεάζει τα επίπεδα της γ-σφαιρίνης που παράγονται εκεί (Jiang et al. 2006). Η άμεση αναστολή της λειτουργίας του γονιδίου MYB (knockdown) σε πρωτογενή πρόδρομα ερυθροειδή κύτταρα ενήλικα οδήγησε σε δραματική αύξηση της έκφρασης της γ-σφαιρίνης(sankaran and Nathan 2010). Η αύξηση αυτή μπορεί να οφείλεται είτε στην επίδραση του MYB στην κινητική της ερυθροποίησης, είτε στην άμεση επίδραση του MYB μέσα στο β-γονιδιακό τόπο. Σήμερα, ο μηχανισμός ρύθμισης των επιπέδων της HbF από το γονίδιο MYB παραμένει αδιευκρίνιστος (Higgs and Wood 2008). Εικόνα 11: Η μετάβαση από την εμβρυική (HbF) στην ενήλικη αιμοσφαιρίνη και η ρύθμιση αυτής από διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες 34

35 A.8 Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί είναι μικρές σημειακές αλλαγές στην αλληλουχία του DNA (εικόνα 12). Πρόκειται για συνήθη φαινόμενα και υπάρχουν φυσιολογικά στο DNA κάθε ατόμου. Υπολογίζεται πως υπάρχουν περίπου 10 εκατομμύρια SNPs στο σύνολο του ανθρώπινου γονιδιώματος. Οι περισσότεροι από αυτούς τους πολυμορφισμούς δεν επηρεάζουν άμεσα την υγεία ή την ανάπτυξη ενός οργανισμού, ορισμένοι από αυτούς, όμως, έχουν αποδειχθεί σημαντικοί για τη διερεύνηση της ανθρώπινης υγείας. Ένας ή περισσότεροι SNPs μπορεί να καθορίζουν μια σειρά από χαρακτηριστικά, όπως την απόκριση σε μια φαρμακευτική αγωγή, τις πιθανότητες εκδήλωσης συγκεκριμένων ασθενειών, την ευαισθησία απέναντι σε εξωγενείς περιβαλλοντικούς παράγοντες (ξενοβιοτικά) και την επιρρέπειά μας σε μολύνσεις. Η χαρτογράφηση των γονιδίων του β-γονιδιακού τόπου με τη μέθοδο των περιοριστικών ενδονουκλεασών οδήγησε στην ταυτοποίηση πολυάριθμων μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών μεταξύ διαφορετικών ατόμων. Οι απλότυποι (συνδυασμός πολυμορφισμών στο ίδιο χρωμόσωμα που συγκληρονομούνται) συνιστούν πολύτιμα διαγνωστικά εργαλεία και μόνο μερικά από αυτά μπορούν να βρεθούν σε διαφορετικές εθνικότητες. Αρχικά, οι Kan και Dozy ανέφεραν μια πολυμορφική αλληλουχία DNA, γειτονικά του ανθρώπινου ΗΒΒ γονιδίου, που σχετιζόταν με τη μετάλλαξη της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Ακολούθως, 17 μονονουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις ανιχνεύθηκαν στο β-γονιδιακό τόπο (διαγονιαδιακά) και στο γονίδιο ΗΒΒ (ενδογονιδιακά) (Patrinos GP 2010). Αυτές συμβολίζονται, είτε με το πρόσημο «+», όταν είναι παρούσες, είτε με το πρόσημο «-», όταν είναι απούσες μεταξύ των διαφορετικών ατόμων. Οι περισσότερες από τις πολυμορφικές θέσεις είναι αρχαίας προελεύσεως, αφού ανιχνεύονται σε όλες τις εθνολογικές ομάδες, αλλά οι συχνότητες τους διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των διαφορετικών πληθυσμών και εθνικοτήτων. Ένα αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό των SNPs στο β-γονιδιακό τόπο είναι ότι βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης. Με τον όρο ανισορροπία σύνδεσης εννοούμε ότι η συχνότητα συνεμφάνισης κάποιων πολυμορφισμών δεν ακολουθεί την αναμενόμενη συχνότητα. 35

36 Υπάρχει, δηλαδή, διαφορά σε αυτό που θεωρητικά υπολογίζεται και σε αυτό που παρατηρείται. Πρόσφατα δεδομένα προτείνουν ότι οι SNPs που βρίσκονται εντός του β-γονιδιακού τόπου απαρτίζονται από δύο διακριτές ομάδες ανισορροπίας σύνδεσης, με την μία να εκτείνεται από την LCR περιοχή μέχρι το γονίδιο HBD και την άλλη να περιλαμβάνει το ΗΒΒ γονίδιο (Chakravarti et al., 1984). Ανεξάρτητα από το κυρίως πλαίσιο του απλοτύπου, ένας μικρός αριθμός SNPs, είτε μέσα στο πλαίσιο του απλοτύπου, είτε ανεξάρτητα, έχει ανιχνευθεί σε διαφορετικές ρυθμιστικές περιοχές μέσα στο β-γονιδιακό τόπο (Patrinos & Antonarakis, 2010). Όταν οι SNPs συμβαίνουν μέσα σε ένα γονίδιο ή σε μια ρυθμιστική περιοχή κοντά σε ένα γονίδιο, μπορεί να έχουν μια πιο άμεση συμμετοχή σε ασθένειες, επηρεάζοντας τη λειτουργία του εν λόγω γονιδίου. Έτσι, αυτοί οι πολυμορφισμοί έχουν συσχετισθεί με διαφορετικές μεταλλάξεις του HBD και του ΗΒΒ γονιδίου και περιστασιακά, με φαινοτύπους διαφορετικής κλινικής εικόνας σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία (Patrinos & Antonarakis, 2010). Εικόνα 12:Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός G>A 36

37 Α.9 Αιμοσφαιρινοπάθειες Α.9.1. Τα θαλασσαιμικά σύνδρομα Τα θαλασσαιμικά σύνδρομα είναι μία ετερογενής ομάδα κληρονομικών νοσημάτων, τα οποία οφείλονται σε βλάβες των γονιδίων που κωδικοποιούν τη σύνθεση των πεπτιδικών αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης (α και β). Η πλειοψηφία των κληρονομούμενων ανωμαλιών της αιμοσφαιρίνης και οι δομικές ανωμαλίες είναι - στις περισσότερες περιπτώσεις - αποτέλεσμα μεταλλάξεων στα γονίδια τα οποία κωδικοποιούν τις διαφορετικές αλύσους των σφαιρινών. Το σύνολο αυτών των νοσημάτων αναφέρονται συνήθως ως αιμοσφαιρινοπάθειες, θαλασσαιμίες ή Μεσογειακά Σύνδρομα, λόγω του αρχικού εντοπισμού τους σε περιοχές που περιβρέχονται από τη Μεσόγειο Θάλασσα. Η παρατήρηση αυτή δεν είναι πλέον ακριβής, δεδομένου ότι η διασπορά των θαλασσαιμιών ακολουθεί συγκεκριμένη γεωγραφική εξάπλωση στη λεγόμενη θαλασσαιμική ζώνη «Thalassaemia belt» (εικόνα 13). Εικόνα 13: Γεωγραφική κατανομή (εκτός Β. και Ν. Αμερικής) των θαλασσαιμικών συνδρόμων. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες ταξινομούνται, είτε βάσει ποσοτικών ελλείψεων (ελαττωμένη παραγωγή σφαιρινικών πεπτιδικών αλυσίδων), είτε βάσει ποιοτικών (δομικών) αλλοιώσεων των σφαιρινικών πεπτιδικών αλυσίδων. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν 37

38 τα θαλασσαιμικά σύνδρομα, οι α- και β-θαλασσαιμίες, ενώ στη δεύτερη ανήκουν τα δρεπανοκυτταρικά σύνδρομα. Η κλασσική ταξινόμηση βασίζεται στην εκτίμηση της βαρύτητας της νόσου, διακρίνοντας μείζονες (major) μορφές με πλήρη συμπτωματολογία, όπου οι ασθενείς εξαρτώνται από μεταγγίσεις αίματος και ελάσσονες (minor) μορφές, χωρίς ιδιαίτερα συμπτώματα, οι οποίες μπορούν να διαγνωστούν αιματολογικά. Η μείζων μορφή οφείλεται σε ομοζυγωτία μιάς σημειακής μετάλλαξης ή αποτελεί συγκληρονόμηση δύο διαφορετικών ετερόζυγων μορφών β- θαλασσαιμίας ως αποτέλεσμα της δράσης ενός μεταλλαγμένου γονιδίου που κληρονομήθηκε ως πρωτεύων χαρακτήρας. Άλλη μορφή είναι η ενδιάμεση θαλασσαιμία. Σε αυτή την ομάδα, περιγράφονται περιπτώσεις οι οποίες είναι ενδιάμεσης κλινικής βαρύτητας. Οι θαλασσαιμίες ταξινομούνται ανάλογα με τα γενετικά τους χαρακτηριστικά σε σχέση με τις αντίστοιχες σφαιρίνες, η σύνθεση των οποίων υπολείπεται(εικόνα 14). Σύμφωνα με αυτή την ταξινόμηση, υπάρχουν θαλασσαιμίες τύπων α, β, γ, δβ, δ και εγδβ. Επίσης, υπάρχει μία κατηγορία θαλασσαιμιών, της εμβρυϊκής παραμονής της HbF (HPFH: hereditary persistence of fetal hemoglobin) λόγω: α) Απώλειας τμήματος του β-γονιδίου ή παρουσίας σημειακής μετάλλαξης, παρεμποδίζεται η έκφραση των γ-γονιδίων, με αποτέλεσμα να παράγεται ποσότητα HbF στην ενήλικη ζωή (είτε σε ομόζυγο ή ετερόζυγο μορφή) β) Λόγω ασύμμετρης αντιπαράθεσης των ομόλογων χρωμοσωμάτων κατά την μείωση, ο χιασμός των μη ομόλογων περιοχών του DNA οδηγεί στη δημιουργία υβριδικού γονιδίου υπεύθυνου για την παραγωγή της Hb Lepore (α2 δβ). Εικόνα 14: Γενετική ταξινόμηση των α- και β-θαλασσαιμιών 38

39 Σύμφωνα με τον Weatherall, κάθε ομάδα μπορεί να υποδιαιρεθεί σε υπο-ομάδες, των οποίων κοινό χαρακτηριστικό είναι η μη ισορροπημένη σύνθεση των αλυσίδων. Αυτό είναι το κομβικό σημείο θεώρησης των θαλασσαιμιών και έχει ως αποτέλεσμα: α) Την ενδομυελική καταστροφή ερυθροκυττάρων β) Την υποχρωμία και τις μορφολογικές αλλοιώσεις των ερυθροκυττάρων και γ) Την αιμόλυση Στις ακόλουθες ενότητες, περιγράφονται ενδελεχώς οι α- και β- θαλασσαιμίες Α Οι α-θαλασσαιμίες Οι α-αλυσίδες παράγονται στη διάρκεια της εμβρυϊκής ζωής και της ζωής του ενήλικα. Έτσι, η α-θαλασσαιμία εμφανίζεται κατά την εμβρυϊκή και μεταεμβρυϊκή ζωή. Σε αντίθεση με την β-θαλασσαιμία (που περιγράφεται σε ακόλουθη ενότητα), στην α- θαλασσαιμία παρατηρείται πλεόνασμα γ- και β- αλυσίδων, οι οποίες σχηματίζουν διαλυτά ομοτετραμερή γ4 (Hb Bart s) ή β4 (Ηb H). Οι α-θαλασσαιμίες χαρακτηρίζονται από ανεπαρκή ή πλήρη έλλειψη παραγωγής της α- αλυσίδας. Υπάρχουν τέσσερα γονίδια, δύο σε κάθε χρωμόσωμα 16 (α1 και α2 ) και ο φυσιολογικός απλότυπος είναι: αα/αα. Στα περισσότερα περιστατικά α- θαλασσαιμίας παρατηρούνται ελλείψεις γονιδίων και σπανιότερα μεταλλάξεις. Ανάλογα με την έκταση των ελλείψεων, οι α-θαλασσαιμίες διακρίνονται σε: 1. α 0 όταν υπάρχει έλλειψη των δύο α-γονιδίων στο ίδιο χρωμόσωμα (--/αα) 2. α + όταν υπάρχει έλλειψη ενός εκ των δύο α-γονιδίων ( -α/αα) Όταν λόγω μετάλλαξης, ένα εκ των δύο α-γονιδίων αδρανοποιηθεί, τότε ο γονότυπος γράφεται ως α Τ α/αα και έχουμε ανεπαρκή παραγωγή α-αλυσίδων (ο εκθέτης Τ υποδηλώνει ότι το γονίδιο έχει υποστεί μετάλλαξη). Έτσι, οι όροι α 0 και α + - θαλασσαιμία, περιγράφουν έναν α-σφαιρινικό απλότυπο και την κατάσταση των δύο συζευγμένων α-γονιδίων σε κάθε χρωμόσωμα. Στην α 0 μορφή δεν υπάρχει παραγωγή α-αλυσίδων και στην α + μορφή υπάρχει μερική παραγωγή, συνήθως ενός μόνο α- γονιδίου (locus). Τόσο η α +, όσο και η α 0 -θαλασσαιμία, μπορούν να εκδηλωθούν με την ετερόζυγη μορφή (-α/αα ή --/αα αντίστοιχα) ή την ομόζυγη μορφή (-α/-α ή --/--) ή ακόμα και με διπλή ετεροζυγωτική μορφή (--/-α), δηλαδή την HbΗ. Στην α + -θαλασσαιμία, συχνά, παρατηρείται έλλειψη ορισμένου μήκους της αλυσίδας, η οποία επηρεάζει και τα δύο α-γονίδια. Η έλλειψη αυτή είναι κοινή στους 39

40 μεσογειακούς πληθυσμούς, γνωστή ως (MED), περιγράφεται ώς (-- MED ) και είναι διαφορετική από εκείνη της Νότιο-Ανατολικής Ασίας (SEA), γνωστής ως (-- SEA ). Ομοίως, υπάρχουν και άλλοι δύο τύποι α + -θαλασσαιμίας, οι οποίοι οφείλονται σε ελλείψεις βάσεων σε ένα α-γονίδιο μήκους 3,7 και 4,2 Kb DNA και χαρακτηρίζουν τις μορφές α 3,7 ή α 4,2. Η έλλειψη ( ΜΕD ) περιλαμβάνει και τα δύο α-γονίδια (α 0 ), ενώ η έλλειψη 20,5 Kb (-α 20,5 ) περιλαμβάνει όλα τα ψευδογονίδια, όλο το α 2 και μέρος του α 1 γονιδίου (α + ). Σπανιότερα, η έλλειψη 4,2 Kb (-α 4,2 ) περιλαμβάνει όλο το α 2 γονίδιο και μέρος του α 1 γονιδίου (α+). Αυτές οι ελλείψεις δημιουργούνται διότι τα σφαιρινικά γονίδια έχουν ενσωματώσει δύο ομόλογες διπλασιασμένες περιοχές, οι αλληλουχίες των οποίων διατηρήθηκαν κατά την διάρκεια της εξέλιξης, μέσω διατήρησης των γονιδίων, αλλά και φαινομένων άνισου επιχιασμού. Άλλες ελλείψεις είναι εκείνες οι οποίες μεταβάλλουν την έκφραση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου HS-40 και αναφέρονται ως έλλειψη (αα RA ). Στον ελληνικό πληθυσμό, οι συχνότερα απαντώμενες μοριακές βλάβες είναι η έλλειψη 3,7 Kb (-α 3,7 ), η οποία περιλαμβάνει μέρος του α 1 και μέρος του α 2 γονιδίου, με σύγχρονο σχηματισμό ενός υβριδικού γονιδίου α 1 α 2 (α + ). Α Οι β-θαλασσαιμίες Καθώς η σύνθεση των β-αλυσίδων ενεργοποιείται μετά τη γέννηση, η β-θαλασσαιμία δεν εκφράζεται κατά τη διάρκεια της ενδομήτριας ζωής, παρά μόνο, όταν μειώνεται η σύνθεση της HbF και κατά την διάρκεια του πρώτου χρόνου μετά τη γέννηση. Οι β- θαλασσαιμίες είναι μία ξεχωριστή ομάδα κληρονομικών νοσημάτων, που οφείλονται σε ελαττωμένη σύνθεση της β-αλυσίδας, λόγω μεταλλάξεων του β-σφαιρινικού συμπλέγματος. Συνήθως οφείλονται σε σημειακές μεταλλάξεις μέσα ή κοντά στο β- γονίδιο, είτε σε ελλείψεις αλληλουχιών λειτουργικών περιοχών οι οποίες ελέγχουν το β-γονίδιο. Επειδή κάθε άτομο έχει δύο β-αλληλόμορφα γονίδια, υπάρχουν ετερόζυγες και ομόζυγες μορφές, όπως επίσης και συνδυασμένες μορφές ετεροζυγωτίας, στις οποίες το άτομο έχει δύο διαφορετικά μεταλλαγμένα β-γονίδια και επομένως, κανένα φυσιολογικό. Οι μεταλλάξεις αυτές οδηγούν σε διαταραχές στη σύνθεση των β-αλυσίδων, όπου ανάλογα με την αύξηση παραγωγής β-αλυσίδων έχουμε τις εξής μορφές: 1. (β 0 ) : όταν υπάρχει πλήρης έλλειψη παραγωγής β-αλυσίδων 2. (β + ) : όταν υπάρχει μερική παραγωγή β-αλυσίδων 40

41 Εάν το β 0 θαλασσαιμικό γονίδιο εκφράζεται σε ομοζυγωτία (β 0 β 0 ), τότε δεν υπάρχει καθόλου παραγωγή β-αλυσίδων και επομένως, δεν παράγεται καθόλου η HbA (α 2 β 2 ), με συνέπεια,τη βαρύτατη κλινική εικόνα. Τα β + θαλασσαιμικά γονίδια είναι πολλά και εκφράζονται με ποικίλο βαθμό παραγωγής β-αλυσίδων και διαφορετικό βαθμό βαρύτητας στην κλινική εικόνα. Εάν το β + γονίδιο βρίσκεται σε ομοζυγωτία (β + β + ), τότε η παραγωγή β-αλυσίδων είναι μειωμένη και παράγεται HbA, έστω και ελαττωμένη, με συνέπεια η κλινική εικόνα να ποικίλει από μέτρια έως βαριά. Κεντρικό, επίσης, σημείο στην παθολογία της β-θαλασσαιμίας, είναι η περίσσεια των α-αλυσίδων και η βλάβη (αιμολυτική αναιμία) που αυτές προκαλούν λόγω συσσώρευσης κατά τις διάφορες φάσεις της ερυθροποίησης. Η β-θαλασσαιμία είναι νόσος με μεγάλη διασπορά παγκοσμίως,σε όλες τις μορφές, με ποικίλες κλινικές εκδηλώσεις. Α Η μείζων β-θαλασσαιμία Πρόκειται για την ομόζυγη έκφραση της νόσου (β 0 β 0 ) ή (β + β + ) ή συνδυασμένη ετεροζυγωτία (β 0 β + ). Συχνά, αναφέρεται και ως αναιμία του Cooley και προσδιορίζεται ως γενετική ανωμαλία της β-σφαιρινικής σύνθεσης. Οι κλινικές εκδηλώσεις της νόσου στο 60% των περιπτώσεων εμφανίζονται εντός του πρώτου έτους, όταν η σύνθεση της γ-αλυσίδας περιορίζεται και αντικαθίσταται από τη β-αλυσίδα. Εμφανίζεται έντονη ωχρότητα με «λεμονοειδή» απόχρωση, λόγω αναιμίας και ίκτερου, αξιόλογη ηπατοσπληνομεγαλία και υστέρηση στην ανάπτυξη, λόγω της χρόνιας ιστικής υποξίας, αλλά με φυσιολογική ανάπτυξη της νοημοσύνης. Δίχως θεραπεία, τα παιδιά με β 0 ομοζυγωτία, συνήθως επιβιώνουν έως το 3ο-4ο έτος της ζωής τους, ενώ παιδιά με β+ ομοζυγωτία, επιβιώνουν δίχως θεραπεία συχνά και μέχρι την έναρξη της εφηβείας. Η παθολογία της νόσου χαρακτηρίζεται από: α) Μη αποτελεσματική ερυθροποίηση και ελάττωση του χρόνου επιβίωσης των ερυθροκυττάρων 41

42 β) Αυξημένη ερυθροποίηση, τόσο σε ενδομυελικές, όσο και σε εξωμυελικές περιοχές. Η μη αποτελεσματική ερυθροποίηση και η ελαττωμένη επιβίωση των ερυθροκυττάρων οδηγεί σε χρόνια αιμολυτική αναιμία, ίκτερο και συχνή εμφάνιση χολολιθίασης. Η αναιμία οδηγεί σε χρόνια ιστική υποξία και υπολειπόμενη σωματική ανάπτυξη, ενώ λόγω της αιμόλυσης αυξάνονται σημαντικά τα επίπεδα του σιδήρου και ο κίνδυνος εναπόθεσής του σε ευαίσθητα όργανα, όπως το ήπαρ και η καρδιά. Η αυξημένη ερυθροποίηση στον μυελό των οστών, ιδιαίτερα του κρανίου και του προσώπου με χαρακτηριστική προβολή του μετώπου, προκαλεί την παραμόρφωση των οστών του προσώπου και τη διαταραχή της θέσης και έκφυσης των οδόντων. Η αυξημένη ενδομυελική ερυθροποίηση οδηγεί, επίσης, σε αύξηση του εύρους της διπλόης του κρανίου και τη συνολική παραμόρφωση της κεφαλής. Γενικότερα, λόγω της πίεσης που προκαλείται από την αυξημένη ενδομυελική ερυθροποίηση, παρατηρούνται οστικά άλγη και σπανιότερα κατάγματα, λόγω λέπτυνσης του οστικού φλοιού και οστεοπόρωσης. Η εξωμυελική ερυθροποίηση συνεπάγεται σημαντική ηπατομεγαλία και σπληνομεγαλία. Η προοδευτική διόγκωση του σπλήνα συχνά οδηγεί σε υπερσπληνισμό (αναιμία, θρομβοπενία, λευκοπενία), με αποτέλεσμα επιδείνωση της αναιμίας και ευαισθησία σε λοιμώξεις, λόγω της ουδετεροπενίας. Οι συγκεκριμένοι ασθενείς χρειάζονται πολλές μεταγγίσεις και αποσιδηρώσεις για να αποφευχθούν οι επιπλοκές της υπερφόρτωσης των οργάνων/ιστών (μυοκάρδιο) με σίδηρο. Λόγω της σημαντικής αύξησης της επιβίωσης ως συνέπεια της καλής υποστηρικτικής αγωγής, στα παραπάνω ζητήματα προστίθενται και τυχόν ψυχοσυναισθηματικές διαταραχές της εφηβείας, καθώς και ενδεχόμενες ανωμαλίες του ενδοκρινικού συστήματος (υποθυροειδισμός, νεανικός διαβήτης, υποπαραθυροεϊδισμός). Στη μείζονα β-θαλασσαιμία παρατηρείται μερική ή πλήρης έλλειψη β-αλυσίδων. Στην (β 0 β 0 ) μορφή, το σύνολο της αμοσφαιρίνης είναι η HbF (100%). Στη μείζονα θαλασσαιμία της μορφής β 0 β + ή β + β +, η HbF είναι ιδιαίτερα αυξημένη και το υπόλοιπο είναι HbA και HbA2. H HbA2 μπορεί να είναι ελαττωμένη ή φυσιολογική. 42

43 Α Η ετερόζυγη ή ελάσσων β-θαλασσαιμία Η ετερόζυγη β-θαλασσαιμία είναι γνωστή και ως στίγμα της Μεσογειακής αναιμίας, ή ελάσσων β-θαλασσαιμία. Οι κυριότερες μορφές της συνδέονται με αυξημένες τιμές της HbA2 και φυσιολογικές ή ελαφρώς αυξημένες τιμές HbF. Υπάρχουν και σπάνιες μορφές με ασυνήθιστα αυξημένες τιμές HbA2 και HbF. Άλλες μορφές της χαρακτηρίζονται από φυσιολογικά επίπεδα HbA2 και HbF, σε σχέση με μορφολογικά αιματολογικά ευρήματα, τα οποία είτε είναι τυπικά στίγματος β- θαλασσαιμίας, είτε φυσιολογικά ή σχεδόν φυσιολογικά. Η πλειοψηφία των ετεροζυγωτών παρουσιάζει μέτρια αναιμία με ερυθροκυτταρικές ανωμαλίες, υψηλές τιμές HbA2 (>3,5%) και φυσιολογικές ή ελαφρά αυξημένες τιμές της HbF και παρατηρείται μόνο σε περιπτώσεις αυξημένων αιμοποιητικών αναγκών, όπως κατά την κύηση ή μετά από υποτροπιάζουσες λοιμώξεις. Η κλινική εικόνα εξαρτάται από τον τύπο της μετάλλαξης του β-γονιδίου.ασθενείς με ετερόζυγη β + -θαλασσαιμία είναι πλήρως ασυμπτωματικοί, παρουσιάζοντας ελαφριά μικροκυττάρωση. Ασθενείς με ετερόζυγη β 0 -θαλασσαιμία παρουσιάζουν αναιμία, μικροκυττάρωση, υποχρωμία, δικτυοερυθροκυττάρωση, σπληνομεγαλία και μειωμένους μορφολογικούς δείκτες MCV, MCH, MCHC. Α Η μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων θαλασσαιμία Η μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων θαλασσαιμία αποτελεί μία ενδιάμεση κλινική κατάσταση μεταξύ ετερόζυγης και μείζονος β-θαλασσαιμίας, οφειλόμενη σε μεταλλάξεις που μπορεί να αφορούν το ένα ή και τα δύο β-γονίδια. Η βαρύτερη μορφή της νόσου συνοδεύεται από σοβαρές επιπλοκές με απαραίτητη τη μετάγγιση αίματος, οστικές παραμορφώσεις και υπολειπόμενη ανάπτυξη, ενώ η ηπιότερη εκδηλώνεται κατά παρόμοιο τρόπο με την ετερόζυγη β-θαλασσαιμία, αλλά παρουσιάζοντας βαρύτερη αναιμία και συχνά σπληνομεγαλία. Οι συγκεκριμένοι φορείς πρέπει να παρακολουθούνται τακτικά, δεδομένου ότι η συχνότητα χολολιθίασης και υπερφόρτωσης με σίδηρο είναι σχετικά μεγάλη. 43

44 Α.9.2. Δρεπανοκυτταρική αναιμία Η δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι μια ασθένεια που προκαλείται από την αντικατάσταση του γλουταμινικού οξέος από το αμινοξύ βαλίνη στο έκτο κωδικόνιο της β-σφαιρινικής αλυσίδας. Αυτή η μετάλλαξη επηρεάζει τη διαλυτότητα και την κρυστάλλωση της αιμοσφαιρίνης υπό συνθήκες υποξίας. Οι ασθενείς που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία παράγουν την αιμοσφαιρίνη HbS και χαρακτηρίζονται από έλλειψη της HbΑ. Οι μη φυσιολογικοί κρύσταλλοι αιμοσφαιρινών παραμορφώνουν την κυτταρική μεμβράνη του ερυθρού κυττάρου και της δίνουν το χαρακτηριστικό δρεπανοειδές σχήμα. Κάποια από αυτά τα κύτταρα παραμένουν δρεπανοειδή και καταστρέφονται πρόωρα. Τα δρεπανοειδή κύτταρα αυξάνουν το ιξώδες του αίματος και εμποδίζουν την κανονική κυκλοφορία αυτού στα μικρά αιμοφόρα αγγεία. Η επακόλουθη υποξία οδηγεί σε περισσότερη δρεπάνωση, με ένα φαύλο κύκλο στασιμότητας και χαρακτηριστικών επεισοδίων δρεπανοκυτταρικών κρίσεων με κοιλιακούς και μυοσκελετικούς πόνους. Έπειτα από αρκετά χρόνια, παρατηρείται νέκρωση των φτωχά αιματωμένων ιστών, όπως ο σπλήνας, οδηγώντας το όργανο αυτό σε ατροφία (Serjeant, 1993). Οι ετεροζυγώτες με δρεπανοκυτταρική αναιμία έχουν περίπου 25-40% HbS στο αίμα τους και είναι κλινικά φυσιολογικοί. Τα ερυθρά τους κύτταρα περιλαμβάνουν HbS και HbΑ, αλλά έχουν φυσιολογική διάρκεια ζωής. Η δρεπάνωση παρατηρείται μόνο υπό συνθήκες σοβαρής υποξίας, όπως για παράδειγμα σε ατμοσφαιρικές συνθήκες πάνω από μέτρα (Sears, 1978). Όταν η HbF συνυπάρχει με την HbS σε ένα ερυθρό κύτταρο, μειώνει την έκταση της δρεπάνωσης (Eaton and Hofrichter, 1995). Η HbF μειώνει την κρυστάλλωση της HbS, τόσο, ώστε οι ασθενείς που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία και έχουν υψηλά επίπεδα HbF να έχουν λιγότερα ή ακόμα και μηδαμινά συμπτώματα της ασθένειας. Γενικά, παρατηρείται μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών της HbF και της σοβαρότητας των συμπτωμάτων της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Επομένως, οποιοσδήποτε χειρισμός θα οδηγούσε σε αύξηση της παραγωγής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης θα βοηθούσε στην κλινική βελτίωση της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Ακόμη, συνύπαρξη της α-θαλασσαιμίας σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία συσχετίζεται με ηπιότερη αναιμία και αυξημένα επίπεδα επιβίωσης. 44

45 Περιέργως, υπάρχουν αρκετοί γενετικοί παράγοντες που διαμορφώνουν το φαινότυπο της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας (Steinberg, 2005). Η HbF παίζει κυρίαρχο ρόλο γενετικού τροποποιητή στην ασθένεια αυτή. Α.10 Η επανενεργοποίηση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF ως πιθανή θεραπευτική στρατηγική Η φαρμακογονιδιωματική έχει ως στόχο να προσδιορίσει το πώς το γενετικό υπόβαθρο ενός ασθενή επηρεάζει την ανταπόκρισή του σε ένα φάρμακο ή την πιθανότητα να αναπτύξει παρενέργειες. Πιο συγκεκριμένα, συσχετίζει την έκφραση γονιδίων ή τις γενετικές παραλλαγές γονιδίων με την αποτελεσματικότητα και την τοξικότητα, κατόπιν χορήγησης του φαρμάκου. Η εφαρμογή της φαρμακογονιδιωματικής στις αιμοσφαιρινοπάθειες β-τύπου είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα, λόγω των πολύ περιορισμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Η επανενεργοποίηση των γονιδίων της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης HbF μπορεί να εξυπηρετήσει τη θεραπεία των β-θαλασσαιμικών ασθενών. Ένα πρόωρο σημάδι αυτής της υπόθεσης προήλθε από το σύνδρομο HPFH. Άτομα με HPFH χαρακτηρίζονται από υψηλά ποσοστά HbF (10-30%), ακόμα και ως ενήλικοι. Το σύνδρομο HPFH μπορεί να προκληθεί από απαλοιφές στο β-γονιδιακό τόπο. Υπάρχουν δύο μηχανισμοί που μπορεί να ευθύνονται για τη μεταβολή των επιπέδων έκφρασης της γ-σφαιρίνης, λόγω απαλοιφών που προκαλούν το HPFH. Συγκεκριμένες απαλοιφές μπορεί να οδηγήσουν σε παράθεση του μακρινού ενισχυτή δίπλα από τα γονίδια που κωδικοποιούν τη γ-σφαιρίνη. Εναλλακτικά, αυτές οι απαλοιφές μπορεί να προκαλέσουν αφαίρεση της σιωπηλής αλληλουχίας των γονιδίων της γ-σφαιρίνης. Άλλες απαλοιφές, που οδηγούν στο συγκεκριμένο σύνδρομο, οδηγούν σε απομάκρυνση των γονιδίων της δ- και β-σφαιρίνης (Banan, 2013; Sankaran & Nathan, 2010). Μελέτες οδήγησαν στο συμπέρασμα πως η επανενεργοποίηση της έκφρασης της γ-σφαιρίνης σε επίπεδα αντίστοιχα με αυτά που παρατηρούνται κατά το σύνδρομο HPFH μπορεί να εξυπηρετήσουν ως θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία ασθενών που πάσχουν από β-θαλασσαιμία (Atweh et al., 2003; Banan, 2013; Testa, 2009). 45

46 Διακεκριμένα παραδείγματα για την ενεργοποίηση της έκφρασης των γονιδίων της γ- σφαιρίνης αποτελούν το βουτυρικό νάτριο (αναστολέας αποακετυλάσης ιστόνης), η 5 αζακυτιδίνη (αναστολέας μεθυλ-τρανσφεράσης) και η υδροξυουρία (HU, αναστολέας αντιγραφής του DNA). Η HU είναι ένας χημειοθεραπευτικός παράγοντας που αρχικά χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία ασθενών με μυελοϋπερπλαστικές ασθένειες. Τη δεκαετία του 80, ανακαλύφθηκε ότι η HU μπορεί να επάγει την έκφραση της HbF σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Πολλές επακόλουθες μελέτες είχαν ως αποτέλεσμα την έγκριση της HU από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (Food and Drug Administration, FDA) (Banan, 2013). Πράγματι, η HU είναι ο μόνος εγκεκριμένος παράγοντας που χρησιμοποιείται για να ενισχύσει τη σύνθεση της HbF με αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα έναντι της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Παρόλη τη χρήση της, ο μηχανισμός δράσης με τον οποίο η υδροξυουρία επάγει τη σύνθεση της HbF παραμένει ασαφής. Η HU είναι κυτταροτοξική και αναστέλει την ριβονουκλεϊκή ρεδουκτάση, η οποία επεμβαίνει στη σύνθεση του DNA στους διαιρούμενους όψιμους ερυθρoειδικούς προγόνους. Αυτό οδηγεί σε μια παροδική διακοπή της ερυθροποίησης, ενισχύοντας την πρόωρη δέσμευση των πρώιμων προγονικών κυττάρων, που βρίσκονται ακόμη κάτω από το πρόγραμμα παραγωγής της HbF (Pace & Zein, 2006). Η HU έχει κάποια οφέλη τα οποία την έχουν καταστήσει φάρμακο ευρείας χρήσης. Συγκεκριμένα, μπορεί να λαμβάνεται από το στόμα, έχει μικρό κόστος και θεωρείται σχετικά ασφαλής, σε σύγκριση με άλλους φαρμακευτικούς παράγοντες που έχουν προταθεί κατά καιρούς. Παρόλο που η HU έχει αποδειχθεί εξαιρετικά αποτελεσματική, μειώνοντας τη συχνότητα των επώδυνων κρίσεων στη δρεπανοκυτταρική αναιμία, μέσω αυξήσης των επιπέδων της HbF, η αποτελεσματικότητά της σε ασθενείς με β- θαλασσαιμία είναι λιγότερο πειστική. Το μέλλον της HU φαίνεται πιο ελπιδοφόρο στα ενδιάμεσα θαλασσαιμικά σύνδρομα, στα οποία μπορούν να διατηρηθούν παρατεταμένες μέτριες αυξήσεις της HbF (Patrinos & Antonarakis, 2010). Εντούτοις, μελέτες προτείνουν πως η μακροχρόνια θεραπεία με HU σε ασθενείς που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία μπορεί να οδηγήσει σε λευχαιμία, σε μειωμένη σπερματογένεση και σε έλκη στα κάτω άκρα. Επίσης, μπορεί να προκαλέσει σωματικές μεταλλάξεις σε παιδιά που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία. Τέλος, η χρήση του φαρμάκου αυτού σε β-θαλασσαιμικούς ασθενείς μπορεί να προκαλέσει δυσμενείς παρενέργειες στις οποίες περιλαμβάνονται ο πονοκέφαλος, η υπέρχρωση, η ναυτία και η ζαλάδα (Banan, 2013). 46

47 Η ανταπόκριση της HbF στην θεραπεία με HU ποικίλει, ιδιαίτερα στη β-θαλασσαιμία με περίπου το 25% των ασθενών να είναι κακοί ή και μη ανταποκριτές (Pace et al., 2006). Επομένως, η δυνατότητα πρόβλεψης της ανταπόκρισης ενός ασθενή στην HU ή/και άλλων φαρμάκων που χρησιμοποιούνται για τον ίδιο σκοπό, θα βοηθούσε στην επιλογή των ασθενών που μπορούν να λάβουν την εν λόγω θεραπεία και στη μείωση των φαινομένων τοξικότητας από μια μη βοηθητική κλιμάκωση της δόσης. Για να πραγματοποιηθεί όμως αυτό, θα πρέπει να γίνουν κατανοητοί οι λόγοι για τους οποίους η HU δρα σε ορισμένες μόνο περιπτώσεις. Μελέτες δείχνουν ότι γενετικές παραλλαγές, οι οποίες πιστεύεται ότι μπορούν να επηρεάζουν την ανταπόκριση του ασθενή στην HU βρίσκονται σε γονίδια που ρυθμίζουν την έκφραση της HbF, τον μεταβολισμό της HU και τον πολλαπλασιασμό των ερυθροειδικών προγονικών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, πολλές μελέτες έχουν αποκαλύψει ποικίλους SNPs που μπορεί να συνδέονται ή όχι με το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης και έχουν την ικανότητα να επηρεάζουν όχι μόνο την έκφραση της HbF, αλλά επίσης και την σοβαρότητα της ασθένειας (Gravia et al., 2014). Το 2007, ο Ma και οι συνεργάτες του ανέλυσαν 320 πολυμορφισμούς σε 29 υποψήφια γονίδια σε ένα σύνολο 137 ασθενών, που έπασχαν από δρεπανοκυτταρική αναιμία και τους είχε χορηγηθεί HU για τουλάχιστον δύο χρόνια. Ύστερα από στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων τους, κατέληξαν σε μία ομάδα 17 SNPs, που σχετίζονται σημαντικά με την αύξηση του ποσοστού της HbF (%) και σε μία ομάδα 20 SNPs που σχετίζονται σημαντικά με την μεταβολή ανά μονάδα όγκου της HbF (g/dl). (πίνακας 1). Όσον αφορά στην πρώτη περίπτωση, ο πολυμορφισμός rs , ο οποίος εδράζεται στο γονίδιο FLT1, φαίνεται να σχετίζεται στατιστικά σημαντικά με τη μεταβολή των επιπέδων της HbF και η συσχέτιση αυτή ήταν η πιο σημαντική μεταξύ των μελετώμενων πολυμορφισμών. Στην περίπτωση της μεταβολής ανά μονάδα όγκου, ο πολυμορφισμός που φάνηκε να σχετίζεται σημαντικότερα είναι ο rs , ο οποίος εδράζεται στο γονίδιο ARG2. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το συγκεκριμένο γονίδιο συμμετέχει στον μεταβολισμό της HU (Ma et al., 2007). Παρόλο που η φαρμακο-επαγόμενη αύξηση των επιπέδων της HbF έχει καταδειχθεί ως μια θεραπευτική μέθοδος για ασθενείς με αιμοσφαρινοπάθειες, δεν μπορεί να διορθώσει per se τα πολυάριθμα περιστατικά που διέπουν την παθοφυσιολογία αυτής της ομάδας διαταραχών. Επιπρόσθετα, θα πρέπει να έχουμε κατά νου ότι δεν υπάρχει 47

48 ευθεία συσχέτιση μεταξύ της αύξησης της HbF και των κλινικών βελτιώσεων σε αυτούς τους ασθενείς. Επομένως, ο προσδιορισμός των φαινοτυπικών δεικτών για την κατηγοριοποίηση των «ανταποκρινόμενων» και των «μη ανταποκρινόμενων» ομάδων ασθενών στα πλαίσια φαρμακογενετικών μελετών δεν πρέπει να σχετίζεται μόνο με την αύξηση της HbF, ιδιαίτερα στην περίπτωση της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Η αύξηση της HbF είναι μόνο ένα μικρό μέρος των πολύπλοκων κλινικών φαινοτύπων που διέπουν την θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών με τη χρήση υδροξυουρίας ή οποιουδήποτε άλλου φαρμάκου (Patrinos & Grosveld., 2007). HbF(%) HbF (g/dl) ΓΟΝΙΔΙΟ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ SNP ΓΟΝΙΔΙΟ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ SNP HAO2 1 rs HAO2 1 rs MAP3K5 6 rs PDE7B 6 rs MAP3K5 6 rs PDE7B 6 rs TOX 8 rs PDE7B 6 rs TOX 8 rs PDE7B 6 rs TOX 8 rs PDE7B 6 rs TOX 8 rs TOX 8 rs TOX 8 rs TOX 8 rs NOS1 12 rs TOX 8 rs NOS1 12 rs TOX 8 rs FLT1 13 rs TOX 8 rs FLT1 13 rs NOS1 12 rs FLT1 13 rs NOS1 12 rs ARG2 14 rs FLT1 13 rs ARG2 14 rs FLT1 13 rs NOS2A 17 rs FLT1 13 rs NOS2A 17 rs FLT1 13 rs FLT1 13 rs ARG2 14 rs ARG2 14 rs Πίνακας 1: Συγκεντρωτικός πίνακας των πολυμορφισμών που έδειξαν συσχέτιση με τη μεταβολή των επιπέδων της HbF από την μελέτη των Μa etal(ma et al. 2007). Με έντονα γράμματα, είναι σημασμένοι οι πολυμορφισμοί που μελετούνται στην παρούσα διπλωματική εργασία. 48

49 Α.11 NOS1 Γονίδιο Το μονοξείδιο του αζώτου (NO) προσδένεται και ενεργοποιεί την διαλυτή γουανυλική κυκλάση, sgc (soluble guanylate cyclase), που αυξάνει την παραγωγή της cgmp (Cyclic Guanosine Monophosphate - κυκλικής μονοφωσφορικής γουανοσίνης ). Σε μελέτη με ερυθρολευχαιμικά κύτταρα K562 και ανθρώπινους πρόδρομους ερυθροβλάστες, χρησιμοποιήθηκε στις κυτταροκαλλιέργειες S-νιτροκυστεΐνη (CysNO), ένας δότης μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) και βρέθηκε παρόμοια δοσο- και χρόνο-εξαρτώμενη επαγωγή του γ-σφαιρινικού mrna και της HbF πρωτεΐνης, όπως είχε παρατηρηθεί και με την χρήση HU. Συνεπώς και η HU και το CysNO αύξησαν τα επίπεδα της cgmp. Αντίθετα, οι αναστολείς της γουανυλικής κυκλάσης (ODQ, NS 2028, και LY 83,538), εξαφάνισαν την έκφραση της γ-σφαιρίνης που είχε επαχθεί από την HU και από το CysNO. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι υπάρχει ένας μηχανισμός επαγωγής της HbF από το ΝΟ. Υπάρχουν αρκετοί μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζονται από την σηματοδοτική οδό NO/cGMP, οι οποίοι ενδέχεται να συμμετέχουν στη διαφορική έκφραση της αιμοσφαιρίνης. Η ενισχυτική δράση και η επαγωγή στην περιοχή του υποκινητή της γ-σφαιρίνης εξαρτώνται από τη συνεργιστική δράση των πρωτεΐνών που προσδένονται στην πρωτεΐνη AP-1, μια ετεροδιμερή πρωτεΐνη που αποτελείται από τις υπομονάδες c-fos και c-jun. Η οδός «ΝΟ-γουανυλική κυκλάση-cgmp» είναι γνωστό πως αυξάνει τα επίπεδα των c-fos και c-jun mrna και επάγει την πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 στο DNA. Η κυτταρική δραστηριότητα της AP-1 ρυθμίζεται, επίσης, από την φωσφορυλίωση των c-fos και c-jun από τις κινάσες MAPK. Αυτές ενεργοποιούνται με τη φωσφορυλίωση των ανοδικών MAPKK και MAPKKK. Έχει αναφερθεί αυξημένη φωσφορυλίωση της p38 MAPK σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα και άλλους κυτταρικούς τύπους από το ΝΟ και τη cgmp. Επίσης, το μοτίβο CCACCC του παράγοντα Sp1 έχει αναφερθεί ως κρίσιμο για την υψηλή δραστηριότητα του γ-σφαιρινικού υποδοχέα. Έχει, τέλος, αναφερθεί ότι το ΝΟ αυξάνει την δραστηριότητα του υποκινητή του γονιδίου TNF-α στοχεύοντας στην Sp1 περιοχή πρόσδεσης. Επομένως, το ΝΟ θα μπορούσε να επιδρά στην έκφραση της γ-σφαιρίνης μέσω του Sp1 ή άλλων σχετικών μεταγραφικών παραγόντων, όπως και μέσω του AP-1 (Cokic et al., 2003). 49

50 Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η cgmp δρά ως ενδοκυττάριος δεύτερος αγγελιοφόρος, ενεργοποιώντας την εξαρτώμενη από τη cgmp πρωτεΐνική κινάση (PKG). Έτσι, αποδείχτηκε ότι το sgc-pkg μονοπάτι συμμετέχει, τουλάχιστον μερικώς, στη ρύθμιση της έκφρασης του γ-σφαιρινικού γονιδίου σε ερυθρολευχαιμικά κύτταρα και σε πρόδρομους ερυθροβλάστες, αφού η αυξημένη έκφραση του γ-σφαιρινικού γονιδίου από το βουτυρικό ή την αιμίνη ανεστάλη, μέσω της παρεμπόδισης της δραστηριότητας της sgc ή της PKG (Ikuta et al., 2001). Σήμερα, οι SNPs rs , rs και rs στο γονίδιο της NOSI (12q24.2-q24.31, νευρωνική συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου-no) έχουν συσχετιστεί με την απόκριση της HbF στην HU με συνεπαγόμενη αύξηση του ποσοστού της πρώτης (Ma et al., 2007) (Patrinos and Grosveld, 2008). Α.12 ARG2 γονίδιο Το γονίδιο ARG2 κωδικοποιεί την πρωτεϊνη αργινάση, τύπου 2. Η αργινάση καταλύει την υδρόλυση της αργινίνης σε ορνιθίνη και ουρία. Στα θηλαστικά, υπάρχουν τουλάχιστον δύο ισομορφές της αργινάσης (τύποι 1 και 2), που διαφέρουν στη διανομή του ιστού, στον υποκυτταρικό εντοπισμό τους, την ανοσολογική δραστικότητα και τη φυσιολογική λειτουργία τους. Η ισομορφή τύπου 2, η οποία κωδικοποιείται από το προαναφερθέν γονίδιο, εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια και εκφράζεται σε εξω-ηπατικούς ιστούς, ιδιαίτερα στον νεφρό. Ο φυσιολογικός ρόλος αυτής της ισοφορμής δεν έχει γίνει πλήρως κατανοητός. Σημαντική συσχέτιση με την ανταπόκριση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF στην HU βρέθηκε, επίσης, με SNPs σε εσώνια των γονιδίων της αργινάσης τύπου 2, ARG2, επί του χρωμοσώματος 6. Η μεταβολή των απόλυτων επιπέδων της HbF συσχετίστηκε ιδιαίτερα σημαντικά με το SNP rs στο γονίδιο ARG2 (p-value=0,0013). Μικρότερη συσχέτιση υπήρξε και με το rs (p-value= 0,0037). 50

51 Α.13 Σκοπός της εργασίας Πολλαπλές μελέτες και πειράματα έχουν καταδείξει πως με την αύξηση των επιπέδων της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF στον άνθρωπο, μετριάζεται η βαρύτητα των διαταραχών που σχετίζονται με τη β-σφαιρίνη. Το συμπέρασμα αυτό αφορά, κυρίως, τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων για ασθένειες, όπως η β-θαλασσαιμία και η δρεπανοκυτταρική αναιμία. Οι δυο προαναφερθείσες ασθένειες προβληματίζουν σε παγκόσμια κλίμακα, με αποτέλεσμα οι ερευνητές να έχουν στρέψει το ενδιαφέρον τους στην αναζήτηση και ανάπτυξη θεραπευτικών προσεγγίσεων για την καταπολέμησή τους. Ιδιαίτερη βάση έχει δοθεί στην κατανόηση των ρυθμιστικών μηχανισμών της μετάβασης από την εμβρυική αιμοσφαιρίνη HbF στην ενήλικη αιμοσφαιρίνη HbA, με απώτερο σκοπό την αναζήτηση στόχων για την ανάπτυξη φαρμακευτικών παραγόντων που θα οδηγήσουν στην επαγωγή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF (Sankaran et al. 2011). Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της συσχέτισης των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών εντός των γονιδίων NOS1 (rs ) και ARG2 (συγκεκριμένα, οι rs και rs ) με την αύξηση των επιπέδων της HbF στον ελληνικό πληθυσμό. Οι προαναφερθέντες πολυμορφισμοί, παράλληλα, θα αξιολογηθούν ως φαρμακογονιδιωματικοί δείκτες της απόκρισης στη θεραπεία με HU (συσχέτιση με τη μεταβλητότητα των επιπέδων της HbF) σε ασθενείς που πάσχουν από β-θαλασσαιμία. 51

52 Β.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 52

53 Β.1 Γενετικό υλικό Β.1.1. Δείγματα DNA που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη Σε αυτή τη μελέτη συμπεριλήφθησαν τέσσερις διαφορετικές ομάδες ατόμων: 1. Ασθενείς με Μείζονα β-θαλασσαιμία (β-thalassemia major) 2. Ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων θαλασσαιμία (β-thalassemia intermedia) 3. Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία και β-θαλασσαιμία που λαμβάνουν αγωγή HU (SCD/β-thalassemia compound heterozygote) 4. Φυσιολογικά άτομα, μη-αναιμικά (δείγματα αναφοράς) (nonthalassemic/controls) Τα δείγματα αυτά παρελήφθησαν από το Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών. Αναλυτικότερα, στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 80 δείγματα β- thalassemia major, 11 δείγματα μη εξαρτώμενης μεταγγίσεων θαλασσαιμίας και 80 δείγματα control. Οι ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων θαλασσαιμία χαρακτηρίζονται από μακρά επιβίωση, με τα επίπεδα της συνολικής αιμοσφαιρίνης στο αίμα τους να κυμαίνονται από 7,7 μέχρι 11,2 g/dl, χωρίς τη βοήθεια τακτικών μεταγγίσεων αίματος ή ακόμη και χωρίς καθόλου μεταγγίσεις. Αυτός είναι άλλωστε και ο λόγος για τον οποίο είναι αρκετά δύσκολο να γίνουν διαθέσιμα προς μελέτη δείγματα από τέτοιους ασθενείς. Στους συγκεκριμένους ασθενείς που αναλύθηκαν τα αυξημένα επίπεδα HbF που τους χαρακτηρίζουν (22-98%) έχει αποκλειστεί η πιθανότητα μεταλλάξεων, που οδηγούν είτε σε α-θαλασσαιμία, είτε στο σύνδρομο HPFH (Papachatzopoulou et al. 2006). Αντίθετα, οι ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία χαρακτηρίζονται από βαριά αναιμία και για την επιβίωση τους κρίνονται απαραίτητες οι μεταγγίσεις ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Τόσο οι ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία, όσο και οι ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων θαλασσαιμία φέρουν μεταλλάξεις στο γονίδιο HBB και στα δύο αλληλόμορφά του.όλα τα δείγματα προήλθαν από άτομα με ελληνική ιθαγένεια. Επίσης αναλύθηκαν και 37 δείγματα SCD/ β-thalassemia ετερόζυγων που βρίσκονται υπό αγωγή HU. Στην συγκεκριμένη ομάδα ασθενών, όλα τα δείγματα κατηγοριοποιήθηκαν, σύμφωνα με την ανταπόκριση αυτών στην αγωγή. Στις 53

54 περιπτώσεις, όπου τα επίπεδα της HbF είναι πάνω από 20%, ο ασθενής θεωρείται «ανταποκρινόμενος» (responder), ενώ σε αντίθετη περίπτωση θεωρείται «μηανταποκρινόμενος» (non-responder). Ο διαχωρισμός αυτός πραγματοποιήθηκε κατ αυτόν τον τρόπο προκειμένου η ανάλυση να βασιστεί σε αυστηρά κριτήρια κατηγοριοποίησης των ασθενών. Στην παρούσα μελέτη, επιπρόσθετα, χρησιμοποιήθηκαν κάποια δείγματα φυσιολογικών, μη αναιμικών ατόμων αποκλειστικά για την ανάπτυξη και τυποποίηση της μεθόδου προς διερεύνηση των υπό μελέτη πολυμορφισμών, διαφορετικά από τα υπόλοιπα δείγματα αναφοράς. Σε αυτά εφαρμόστηκε απλή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR polymerase chain reaction) και κατόπιν για τη γονοτύπησή τους, έλαβε χώρα ο καθαρισμός των δειγμάτων και η αλληλούχιση κατά Sanger. Στις τέσσερις κατηγορίες δειγμάτων που αναφέρθηκαν στην αρχή του υποκεφαλαίου, εφαρμόστηκε η PCR-ARMS (Αmplification-Refractory Mutation System), διαδικασία στην οποία η γονοτύπηση γίνεται ακριβώς μετά την ηλεκτροφόρηση, χωρίς να χρειάζεται να ακολουθήσει καθαρισμός και αλληλούχιση κατά Sanger. Ακολούθως, θα γίνει εκτενής αναφορά σε όλες τις πειραματικές διαδικασίες που πραγματοποιήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, με μοναδική υποσημείωση πως ο καθαρισμός και αλληλούχιση κατά Sanger χρησιμοποιήθηκαν μόνο για την ανάπτυξη και τυποποίηση της αναλυτικής μας μεθόδου B.2 Απομόνωση ολικού γονιδιωματικού DNA Η απομόνωση του ολικού γονιδιώματος από το αίμα πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προτυποποιημένου συστήματος QIAamp Blood Midi Kit (Spin Protocol). Συγκεκριμένα, απομονώθηκε γονιδιωματικό DNA από 1 ml περιφερικού ολικού αίματος στο οποίο έχει προστεθεί αντιπηκτικό EDTA. Ο μηχανισμός με τον οποίο πραγματοποιείται η απομόνωση του DNA βασίζεται στην πρόσδεση των νουκλεικών οξέων σε στήλη χαλαζία, σε περιβάλλον υψηλής ιοντικής ισχύος και χαμηλού ph που δημιουργείται από την προσθήκη χαοτροπικού παράγοντα, ενώ η έκλουσή του γίνεται με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (TE) σε ph 8.3. Τα στάδια τα οποία ακολουθήθηκαν για την απομόνωση του DNA είναι τα εξής: 1. Πρόσθεση 200 μl του αντιδραστηρίου «QIAGEN protease» σε σωλήνα φυγοκέντρησης χωρητικότητας 15 ml 54

55 2. Ανάμειξη 1 ml δείγματος αίματος με 1 ml PBS (Phosphate Buffered Saline) και ανάδευση στο σωλήνα 3. Πρόσθεση 2,4 ml διαλύματος AL (διάλυμα λύσης) και ανάδευση για 1 λεπτό 4. Επώαση του μείγματος στο υδατόλουτρο για 10 λεπτά στους 70 ο C 5. Πρόσθεση 2 ml αιθανόλης (καθαρότητας %) στο μείγμα και ακολουθεί ανάδευση 6. Μεταφορά της μισής ποσότητας του δείγματος στην QIAmp midi spin στήλη (τοποθετημένη σε σωλήνα φυγοκέντρησης 15 ml). Φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στα 1850 g σε θερμοκρασία δωματίου (25 ο C) 7. Απόρριψη του διηθήματος και τοποθέτηση της υπόλοιπης μισής ποσότητας του μείγματος στη στήλη και επανάληψη της φυγοκέντρησης του βήματος 6 8. Προσθήκη διαλύματος 2 ml AW1 (διάλυμα πλύσης) στη στήλη και φυγοκέντρηση στα 4500 g για 1 λεπτό 9. Προσθήκη 2 ml AW2 (διάλυμα πλύσης) διάλυμα πλύσης στη στήλη και φυγοκέντρηση στα 4500 g για 15 λεπτά 10. Τοποθέτηση της QIAmp midi spin στήλης σε ένα καθαρό σωλήνα φυγοκέντρησης χωρητικότητας 15 ml 11. Πρόσθεση 300 μl διαλύματος έκλουσης ΑΕ και επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα 4500 g 12. Επανάληψη του βήματος 11 για αύξηση της τελικής συγκέντρωσης DNA 13. Συλλογή του διηθήματος που περιέχει το απομονωμένο γονιδιωματικό DNA και αποθήκευση αυτού στους -20 ο C Β.3 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA σε διάλυμα Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των δειγμάτων DNA έγινε με τη χρήση της συσκευής NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer. Η συγκεκριμένη συσκευή είναι ένα φασματοφωτόμετρο πλήρους φάσματος που μετράει τη συγκέντρωση των νουκλεϊκών οξέων ή πρωτεϊνών σε ένα διάλυμα. 55

56 Τα πλεονεκτήματα αυτής της συσκευής είναι τα εξής: 1. Η ταχύτητα πραγματοποίησης των μετρήσεων 2. Η μικρή ποσότητα δείγματος που απαιτείται για τη μέτρηση (1 μl) 3. Η ικανότητα μέτρησης πολύ πυκνών διαλυμάτων (μέχρι 3700 ng/ μl) 4. Η αποφυγή χρήσης κυψελίδων 5. Ο αυτόματος υπολογισμός των τιμών 260/280 nm και 260/230 nm Όσον αφορά τη χρήση του, το αρχικό βήμα είναι ο μηδενισμός της συσκευής με τη χρήση του διαλύματος έκλουσης του DNA. Στη συνέχεια, τοποθετείται μια σταγόνα DNA του δείγματος, όγκου 1μl, στην ειδική βάση όταν ο βραχίονας είναι ανοιχτός. Όταν ο βραχίονας κλείνει, το δείγμα σχηματίζει μια στήλη. Ο βραχίονας αυτόματα μετακινείται προς τα κάτω και υπολογίζει τη συγκέντρωση του δείγματος με τη βοήθεια οπτικών ινών. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων, καταγράφονται αυτόματα στον υπολογιστή που βρίσκεται σε σύνδεση με τη συσκευή(εικόνα 15). Η φωτομέτρηση του δείγματος DNA πραγματοποιείται σε μήκος κύματος ίσο με 260 nm και αυτόματα υπολογίζεται η συγκέντρωση του DNA. Ταυτόχρονα πραγματοποιείται και μέτρηση σε μήκος κύματος 280 nm, ώστε να ελεγχθεί η περιεκτικότητα του δείγματος σε πρωτεΐνες. Ο λόγος της τιμής της οπτικής απορρόφησης (O.D.) στα 260 nm προς την τιμή της οπτικής απορρόφησης στα 280 nm εκφράζει την καθαρότητα του δείγματος DNA. Το καθαρό DNA δίνει λόγο 1,8-2,0. Στην περίπτωση που ο λόγος έχει τιμή μικρότερη του 1,8, τότε συμπεραίνουμε πως στο δείγμα μας υπάρχουν προσμίξεις πρωτεΐνης και ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA δεν θεωρείται ακριβής. Όσον αφορά το λόγο 260/230 nm, χρησιμοποιείται ως μια δεύτερη παράμετρος για τον έλεγχο της καθαρότητας του δείγματος DNA. Η τιμή του λόγου αυτού για ένα καθαρό δείγμα DNA είναι συνήθως υψηλότερη από την αντίστοιχη τιμή του λόγου 260/280 nm. Οι αναμενόμενες τιμές του κυμαίνονται συνήθως μεταξύ 2,0-2,2. Στις περιπτώσεις που η τιμή είναι αισθητά χαμηλότερη, αυτό μπορεί να υποδεικνύει την παρουσία οργανικών προσμίξεων που απορροφούν στα 230 nm. 56

57 Εικόνα 155: Τυπικό διάγραμμα φάσματος νουκλεϊκών οξέων B.4 Πολυμορφισμοί-στόχοι της παρούσας μελέτης Οι πολυμορφισμοί που μελετήθηκαν ως γενετικοί δείκτες στην παρούσα εργασία εντοπίζονται στα γονίδια NOS1(εικόνα 16) και ARG2 (εικόνα 17), που εδράζονται στα χρωμοσώματα 12 και 14 αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε ο πολυμορφισμός rs του γονιδίου NOS1 και οι πολυμορφισμοί rs και rs του γονιδίου ARG2. (πίνακας 2). Εικόνα 16: Περιοχή εντοπισμού του γονιδίου NOS1 στο χρωμόσωμα 12. Εικόνα 17:Περιοχή εντοπισμού του γονιδίου ARG2 στο χρωμόσωμα

58 Η επιλογή των συγκεκριμένων γονιδίων, καθώς και των συγκεκριμένων πολυμορφισμών, στηρίχθηκε στην πιο εκτενή έως και σήμερα μελέτη του Ma και των συνεργατών του (2007). Συγκεκριμένα, στην εν λόγω μελέτη διερευνήθηκαν 29 γονίδια τα οποία εμπλέκονται στο μεταβολισμό της HU, καθώς και στον πολλαπλασιασμό των προγονικών ερυθροκυττάρων, ενώ επίσης βρίσκονται σε γενετικούς τόπους που είχε προηγουμένως βρεθεί ότι έχουν κάποια σύνδεση με τα επίπεδα της HbF. Οι πολυμορφισμοί που εξετάστηκαν ήταν συνολικά 320 και η μελέτη αφορούσε 137 ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία, οι οποίοι ακολούθησαν θεραπευτική αγωγή με HU. Σκοπός της προαναφερθείσας ερευνητικής ομάδας ήταν να εξετάσει αν υπάρχει σύνδεση μεταξύ των πολυμορφισμών αυτών και της αλλαγής στα επίπεδα της HbF μετά από δυο χρόνια χορήγησης HU. Η παραπάνω μελέτη ανέδειξε ότι όντως κάποια από αυτά τα γονίδια και τους πολυμορφισμούς σχετίζονται με την «ανταπόκριση» της HbF στην HU. Μεταξύ των γονιδίων αυτών ήταν και τα NOS1 και ARG2 και οι πολυμορφισμοί σε αυτά τα γονίδια που αποτελούν αντικείμενο μελέτης της παρούσας εργασίας (Πίνακας 2). Μάλιστα, η μεταβολή των απόλυτων επιπέδων της HbF συσχετίστηκε ιδιαίτερα σημαντικά με το SNP rs στο γονίδιο ARG2. Μικρότερη συσχέτιση υπήρξε και με το rs Πίνακας 2: Οι υπό μελέτη πολυμορφισμοί της παρούσας εργασίας, τα γονίδια στα οποία εδρεύουν, η νουκλεοτιδική αλλαγή και η θέση τους αντίστοιχα. Γονιδιο SNP Αλλαγή Θέση NOS1 rs G>A 12: ARG2 rs C>A 14: ARG2 rs T>C 14: Αξίζει να σημειωθεί ότι η μελέτη του Ma και των συνεργατών του πραγματοποιήθηκε σε ασθενείς αφρικο-αμερικανικής καταγωγής με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Εμείς θελήσαμε να μελετήσουμε τα ίδιο γονίδιο και τους αντίστοιχους πολυμορφισμούς στον ελληνικό πληθυσμό. 58

59 B.5 Σχεδιασμός εκκινητών (primers) Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για το σχεδιασμό των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τις αναλύσεις μας είναι η εξής: 1. Εντοπισμός της θέσης των υπό μελέτη πολυμορφισμών, μέσω της βάσης δεδομένων Ensembl, όπου και δίνεται μέρος της αλληλουχίας που περιβάλλει τον εκάστοτε πολυμορφισμό. 2. Σχεδιασμός των εκκινητών με χρήση του προγράμματος Primer 3 με βάση την αλληλουχία από το Ensembl. Το Primer 3 μας δίνει τη δυνατότητα να μπορούμε να ελέγξουμε κάποιες βασικές παραμέτρους κατά τη διάρκεια του σχεδιασμού, όπως για παράδειγμα η θερμοκρασία τήξης (Tm) των εκκινητών και η ποσοστιαία σύσταση τους σε βάσεις γουανίνης και κυτοσίνης (GC content). Οι Tm των εκκινητών πρέπει να είναι παρόμοιες και μεταξύ ο C ώστε να υβριδοποιούνται καλά επάνω στο DNA στόχο. Επίσης, η περιεκτικότητα σε GC πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 40-60%, ώστε να είναι ισχυρός και σταθερός ο υβριδισμός των εκκινητών (πίνακας 3). 3. Χρήση του προγράμματος BLAST. Το πρόγραμμα αυτό εξετάζει κατά πόσο οι εκκινητές που έχουν σχεδιαστεί από το βήμα 2 είναι ειδικοί μόνο για την αλληλουχίαστόχο του ανθρώπινου γονιδιώματος στην οποία στοχεύει το εν λόγω πείραμα. Σε περίπτωση που οι εκκινητές έχουν ομολογία σε περισσότερες από μία περιοχές ο καθένας, υπάρχει περίπτωση η αντίδραση PCR να αποδώσει και μη ειδικά προϊόντα. 4. Έλεγχος της συμπληρωματικότητας των εκκινητών μεταξύ τους αλλά και της αυτοσυμπληρωματικότητας (self-somplentarity), χρησιμοποιώντας το υπολογιστικό πρόγραμμα DNAMAN. Ο έλεγχος αυτός πραγματοποιείται γιατί είναι σημαντικό να αποκλειστούν όλα τα ενδεχόμενα διμερών εκκινητών (primer dimer) που θα στερήσει από την PCR αντίδραση την απαραίτητη ποσότητα εκκινητών για σωστή απόδοση. 5. Πρόβλεψη του υβριδισμού και της τήξης των νουκλεικών οξέων με το πρόγραμμα DINAMELT. Το συγκεκριμένο πρόγραμμα χρησιμοποιείται για την πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής (αναδίπλωσης) της αλληλουχίας του PCR προϊόντος που οριοθετείται από τις αλληλουχίες των εκκινητών. Είναι βασική προϋπόθεση να μην σχηματίζονται βρόγχοι και άλλες αναδιπλώσεις στα άκρα της αλληλουχίας, δηλαδή στις περιοχές πρόσδεσης των εκκινητών καθώς αυτό θα παρεμποδίζει την εξέλιξη της PCR αντίδρασης. 59

60 Πίνακας 3: Συνοπτικός πίνακας των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Αναγράφονται οι αλληλουχίες των εκκινητών, το μέγεθος του PCR προϊόντος και η θερμοκρασία τήξης (Τm) του κάθε εκκινητή ξεχωριστά. SNP Αλληλουχία εκκινητών Μέγεθος T m προϊόντος (bp) rs GAACTGCGAAGGACTAATACTGAAG GAACTGCGAAGGACTAATACTGAAA (ευθείς 1 και 2) GACTCCATGGGAGCAGAGAT 59 (αντίστροφος) rs GAATGCAGTTTGGCTAGTGC GAATGCAGTTTGGCTAGTGA (ευθείς 1 και 2) ATTTTTAGGAAGCCCCTTGC 59 (αντίστροφος) rs ATTTTGCCAACAAGCAGG (ευθύς) AGCAACCCTGGAAGAACA AGCAACCCTGGAAGAACG (αντίστροφοι 1 και 2) 56 Β.6 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Για την ανάλυση των πολυμορφισμών προς διερεύνηση, χρησιμοποιήθηκε ως κύρια πειραματική μέθοδος η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Η μέθοδος αυτή περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Kary Mullis (Mullis et al., 1992), εργασία για την οποία τιμήθηκε με βραβείο Νόμπελ ένα χρόνο αργότερα. Η PCR είναι μια μέθοδος με την οποία μπορούμε να πολλαπλασιάσουμε εκθετικά μόρια DNA με τη βοήθεια μια θερμοανθεκτικής DNA πολυμεράσης, όπως αυτή του Τhermus aquaticus (Taq). Αυτό απαιτεί τη χρήση ενός ζεύγους ολιγονουκλεοτιδίων, τους εκκινητές. Σε ένα δίκλωνο μόριο DNA-στόχο, ο ένας εκκινητής θα υβριδοποιηθεί στον έναν κλώνο και ο δεύτερος εκκινητής στον άλλο κλώνο. Έτσι, ορίζεται η περιοχή που θα πολλαπλασιαστεί. Οι υβριδοποιημένοι εκκινητές λειτουργούν ως υπόστρωμα για την DNA πολυμεράση, η οποία θα τους επιμηκύνει προσθέτοντας 60

61 ελεύθερα δεοξυνουκλεοτίδια με αποτέλεσμα τη δημιουργία συμπληρωματικών κλώνων. Έτσι, η διαδικασία της PCR περιλαμβάνει τρία βασικά στάδια: (εικόνα 18) 1. Αποδιάταξη του DNA-στόχου στους ο C (denaturation) 2. Πρόσδεση (υβριδισμός) των εκκινητών (annealing) στις συμπληρωματικές τους ακολουθίες σε συγκεκριμένη θερμοκρασία η οποία εξαρτάται από το μήκος και την αλληλουχία των εκκινητών και ορίζεται κατά το σχεδιασμό των εκκινητών 3. Επιμήκυνση των συνδεδεμένων εκκινητών στους 72 ο C σχηματίζοντας έτσι τους νέους θυγατρικούς κλώνους DNA (elongation) Τα βήματα αυτά επαναλαμβάνονται για κύκλους και τα μόρια που παρήχθησαν, για παράδειγμα στον πρώτο κύκλο, χρησιμεύουν ως στόχοι για το δεύτερο κ.ο.κ. Εφόσον η αύξηση του αριθμού των κλώνων είναι εκθετική, θεωρητικά ο τελικός αριθμός των προϊόντων θα ισούται με 2 ν, όπου ν ο αριθμός των κύκλων. Στην πραγματικότητα όμως η απόδοση είναι μικρότερη. Η διαδικασία της PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν αυτόματο θερμικό κυκλοποιητή (Biorad MJ Mini Personal Thermal Cycler). Εικόνα 18: Τα τρία βασικά στάδια μιας αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) 61

62 Β.7 PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System) Το σύστημα ARMS, που έχει περιγραφεί και ως «αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ειδική για αλληλόμορφο» (ASP-allele-specific) και «αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για την ενίσχυση ειδικών αλληλομόρφων» (PASA-PCR amplification of specific alleles), αποτελεί μέθοδο που βασίζεται στην PCR για την ανίχνευση μεταλλαγών μιας βάσης (Bakanay et al., 2005) και χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη για τη γονοτύπηση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNP). Η τεχνική διαθέτει την ικανότητα διάκρισης χαμηλών επιπέδων της μεταλλαγμένης αλληλουχίας σε υπόβαθρο με υψηλό θόρυβο από τη φυσιολογική αλληλουχία DNA (Higgs et al., 2012). Ένα ολιγονουκλεοτίδιο λειτουργεί ως εκκινητής για την PCR, μόνο όταν υβριδοποιείται στην επιλεγμένη DNA αλληλουχία στόχο του. Η παρουσία της ειδικής αλληλουχίας-στόχου σε ένα δείγμα DNA αποκαλύπτεται ταχέως και απλά με οπτικοποίηση του προϊόντος με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Ενδεικτικά, για την ανίχνευση του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού (G>C), o ειδικός για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο εκκινητής είναι συμπληρωματικός με την αλληλουχία-στόχο, με το 3 τελικό νουκλεοτίδιό του (G) να είναι συμπληρωματικό με τη σημειακή μεταλλαγή (C). Όμως, το 3 νουκλεοτίδιο αυτού του εκκινητή σχηματίζει μια αναντιστοιχία (G-G) με τη φυσιολογική αλληλουχία-στόχο που περιλαμβάνει το αλληλόμορφο του αγρίου τύπου (G). Στην περίπτωση αυτή, παρεμποδίζεται η σύνθεση του προϊόντος πολυμερισμού. Για την ενίσχυση της ειδικότητας του εκκινητή, δημιουργείται μια εσκεμμένη αναντιστοιχία με την αλληλουχία στόχο, αλλάζοντας την αλληλουχία του εκκινητή στο δεύτερο, τρίτο, ή ακόμα και τέταρτο νουκλεοτίδιο από το 3 άκρο του. Έτσι, για την διεξαγωγή μιας PCR-ARMS αντίδρασης σχεδιάζονται τρείς εκκινητές, ένας αντίστροφος και δύο διαφορετικοί ευθείς ή ένας ευθύς και δύο διαφορετικοί αντίστροφοι, ταυτόσημοι μεταξύ τους με μόνη διαφορά το 3 τελικό νουκλεοτίδιό τους, που είναι συμπληρωματικό με ένα εκ των δύο αλληλομόρφων του SNP που εξετάζεται. Όσον αφορά την προετοιμασία της PCR, ετοιμάζονται δύο διαφορετικά μίγματα, με μόνη τους διαφορά τον ευθύ εκκινητή. Για κάθε λοιπόν δείγμα γονιδιωματικού DNA πραγματοποιείται η αντίδραση PCR δύο φορές, προκειμένου να διαπιστωθεί για ποιο εκ των δύο αλληλομόρφων θα παραχθεί προϊόν PCR. 62

63 Μια επιπλέον παραλλαγή της PCR-ARMS αποτελεί η «PCR-tetra-ARMS». Σε αυτή απαιτούνται για κάθε PCR αντίδραση τέσσερις εκκινητές, ένα ζευγάρι εσωτερικών ειδικών για τα αλληλόμορφα (AS-allele-specific) εκκινητών και ένα ζευγάρι εξωτερικών βασικών εκκινητών. Κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR δημιουργείται ένα μόνο μίγμα αντιδραστηρίων στο οποίο προστίθενται και οι τέσσερις εκκινητές. Για καθένα από τα δύο αλληλόμορφα του SNP υπό μελέτη παράγονται διαφορετικά PCR προϊόντα, τα οποία σχηματίζονται πάντα με τη βοήθεια ενός εκ των δύο εσωτερικών εκκινητών και ενός εκ των εξωτερικών βασικών εκκινητών. Οι εξωτερικοί εκκινητές έχουν σχεδιαστεί έτσι, ώστε τα μοριακά βάρη των δύο αλληλομόρφων που παράγονται να διαφέρουν σε μέγεθος και να είναι δυνατή η ανάλυση και ο διαχωρισμός τους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Και στην tetra-arms PCR εισάγεται σκοπίμως μια αναντιστοιχία στην τρίτη θέση από το 3 άκρο καθενός από τους δύο εσωτερικούς εκκινητές για αύξηση της ειδικότητας για το αλληλόμορφο-στόχος (Ye et al., 2001), (εικόνα 19). Και η PCR-ARMS, όπως και η tetra-pcr-arms δεν συντελούν απλώς, όπως η συμβατική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), στον πολυμερισμό μιας δεδομένης αλληλουχίας, αλλά αποτελούν μεθόδους άμεσης γονοτύπησης, σε συνδυασμό πάντα με την ηλεκτροφόρηση πηκώματος αγαρόζης ή πολυακρυλαμίδης. Εικόνα 19: Σχηματική αναπαράσταση σχεδιασμού εκκινητών για την tetra-primer PCR-ARMS 63

64 Β.8 Αντιδραστήρια και διαδικασία της PCR Για την PCR χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα KAPA2G Fast HotStart ReadyMix (KAPABIOSYSTEMS, MA,USA). Τα KAPA2G Fast HotStart ReadyMix Kits έχουν σχεδιαστεί για ταχεία PCR υψηλής απόδοσης, στην οποία ο ολικός χρόνος αντίδρασης μειώνεται κατά 20-70% σε σχέση με αυτόν των συμβατικών PCR. Το έτοιμο αυτό μείγμα περιλαμβάνει όλα τα αντιδραστήρια για την ταχεία PCR, εκτός από τους εκκινητές και το υπόστρωμα. Έτσι, περιλαμβάνει την Taq KAPA2G Fast HotStart DNA πολυμεράση, το KAPA2G Fast HotStart PCR (Buffer) ρυθμιστικό διάλυμα, dntp (0.2mM κάθε dntp στη συγκεκριμένη αντίδραση) και MgCl2 (σε συγκέντρωση 1.5 mm). Στο συγκεκριμένο αντιδραστήριο (hot start) το ένζυμο συνδυάζεται με ένα αντίσωμα το οποίο απενεργοποιεί το ένζυμο έως το πρώτο βήμα αποδιάταξης. Αυτό εξαλείφει τα μη ειδικά προϊόντα πολυμερισμού που προκύπτουν από μη ειδικές αλληλεπιδράσεις των εκκινητών (non-specific-priming events) κατά την ανάμειξη των αντιδραστηρίων, αυξάνοντας έτσι την συνολική απόδοση και ειδικότητα της αντίδρασης. Oσον αφορά στα σωληνάρια της PCR αντίδρασης (PCR tubes) χρησιμοποιήθηκαν strips 8 θέσεων όγκου 2 ml το καθένα (Kisker Biotech GmbH & Co., Steinfurt). Για την ετοιμασία της PCR αντίδρασης χρησιμοποιήθηκαν αποκλειστικά ακρορύγχια με φίλτρο (filter tips) της εταιρίας Greiner (Greiner Bio-One GmbH, Germany), με σκοπό την αποφυγή των επιμολύνσεων. Γενικότερα, δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή ώστε η προετοιμασία των αντιδράσεων να πραγματοποιηθεί σε στείρες συνθήκες προς αποφυγή επιμολύνσεων από ξένο DNΑ. 64

65 Β.9 Πρωτόκολλα αντιδράσεων PCR-ARMS Και για τους τρεις πολυμορφισμούς που εξετάστηκαν, εκτελέστηκε PCR-ARMS αντίδραση, δηλαδή ετοιμάστηκαν δύο διαφορετικά μίγματα PCR-αντίδρασης. Και τα δύο περιελάμβαναν τα ίδια αντιδραστήρια εκτός από τους εκκινητές, όπου συνδυάζονταν ανά δύο, στο ένα μίγμα ευθύς εκκινητής για το ένα αλληλόμορφο και στο άλλο μίγμα ευθύς εκκινητής για το δεύτερο αλληλόμορφο, με τον αντίστροφο εκκινητή να περιλαμβάνεται και στα δύο μίγματα. Αυτό συνέβη για τους δύο από τους τρεις υπό εξέταση πολυμορφισμούς(τον rs και τον rs ), ενώ στον τρίτο (rs ) χρησιμοποιήθηκαν δύο αντίστροφοι εκκινητές και ένας ευθύς, κοινός και για τα δύο μίγματα της PCR-αντίδρασης. (α) rs Το σύνολο των αντιδραστηρίων PCR παρατίτεθεται ακολούθως (Πίνακας 4) Πίνακας 4: Σύνολο αντιδραστηρίων PCR-ARMS για τον rs Αντιδραστήριο Αρχική συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση Ογκος (μl) H 2 O (PCR-grade) - - 9,5 KAPA2G Fast ,5 HotStart ReadyMix Ευθύς εκκινητής G αλληλομόρφου (Primer F G ) 10μΜ 0,4μΜ 1 Ευθύς εκκινητής A 10μΜ 0,4μΜ 1 αλληλομόρφου (Primer F A ) Αντίστροφος 10μΜ 0,4μΜ 1 εκκινητής (Primer R, Reverse Primer) DNA-στόχος 50ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος αντίδρασης Αναλυτικά, οι συνθήκες της αντίδρασης PCR παρατίθενται ακολούθως (Πίνακας 5) 65

66 Πίνακας 5: Συνθήκες αντίδρασης PCR για τον rs Βήμα Θερμοκρασία Χρόνος 1 ο : Ενεργοποίηση του ενζύμου 95 ο C 2 min 2 ο :Αποδιάταξη 95 ο C 15 sec 3 ο : Υβριδοποίηση 67 ο C 15 sec 4 ο : Επιμήκυνση 72 ο C 1 sec 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 39 φορές 6 ο : Τελική επιμήκυνση 72 ο C 30 sec 7 ο : Συντήρηση 4 ο C (β) rs Το σύνολο των αντιδραστηρίων PCR παρατίθεται ακολούθως (Πίνακας 6 ) Πίνακας 6: Σύνολο αντιδραστηρίων PCR-ARMS για τον rs Αντιδραστήριο Αρχική συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση Ογκος (μl) H 2 O (PCR-grade) KAPA2G Fast ,5 HotStart ReadyMix Ευθύς εκκινητής A αλληλομόρφου (Primer F A ) 10μΜ 0,5μΜ 1,25 Ευθύς εκκινητής C 10μΜ 0,5μΜ 1,25 αλληλομόρφου (Primer F C ) Αντίστροφος 10μΜ 0,5μΜ 1,25 εκκινητής (Primer R, Reverse Primer) DNA-στόχος 50ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος αντίδρασης Αναλυτικά, οι συνθήκες της αντίδρασης PCR παρατίθενται ακολούθως (Πίνακας 7) Πίνακας 7: Συνθήκες αντίδρασης PCR για τον rs Βήμα Θερμοκρασία Χρόνος 1 ο : Ενεργοποίηση του ενζύμου 95 ο C 2 min 2 ο :Αποδιάταξη 95 ο C 15 sec 3 ο : Υβριδοποίηση 64 ο C 15 sec 4 ο : Επιμήκυνση 72 ο C 1 sec 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 39 φορές 6 ο : Τελική επιμήκυνση 72 ο C 30 sec 7 ο : Συντήρηση 4 ο C 66

67 (γ) rs Το σύνολο των αντιδραστηρίων PCR παρατίτεθεται ακολούθως (Πίνακας 8) Πίνακας 8: Σύνολο αντιδραστηρίων PCR-ARMS για τον rs Αντιδραστήριο Αρχική συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση Ογκος (μl) H 2 O (PCR-grade) KAPA2G Fast ,5 HotStart ReadyMix Αντίστροφος εκκινητής C αλληλομόρφου (Primer R C ) 10μΜ 0,5μΜ 1,25 Αντίστροφος 10μΜ 0,5μΜ 1,25 εκκινητής Τ αλληλομόρφου (Primer R T ) Ευθύς 10μΜ 0,5μΜ 1,25 εκκινητής(primer F, Forward Primer) DNA-στόχος 50ng/μl 50 ng/αντίδραση 1 Τελικός όγκος αντίδρασης Αναλυτικά, οι συνθήκες της αντίδρασης PCR παρατίθενται ακολούθως (Πίνακας 9) Πίνακας 9: Συνθήκες αντίδρασης PCR για τον rs Βήμα Θερμοκρασία Χρόνος 1 ο : Ενεργοποίηση του ενζύμου 95 ο C 2 min 2 ο :Αποδιάταξη 95 ο C 15 sec 3 ο : Υβριδοποίηση 63 ο C 15 sec 4 ο : Επιμήκυνση 72 ο C 1 sec 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 39 φορές 6 ο : Τελική επιμήκυνση 72 ο C 30 sec 7 ο : Συντήρηση 4 ο C 67

68 B.10 Hλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού, χαρακτηρισμού και απομόνωσης τμημάτων DNA. Η μέθοδος αυτή είναι απλή, γρήγορη στην εφαρμογή της και αρκετά ευαίσθητη στο διαχωρισμό των τμημάτων DNA. Η ηλεκτροφόρηση είναι μια διαδικασία κατά την οποία το αρνητικά φορτισμένο μόριο του DNA κινείται μέσα σε ένα πορώδες πήκτωμα υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Για το διαχωρισμό μικρών τμημάτων DNA που διαφέρουν κατα λίγα νουκλεοτίδια προτιμάται η χρήση πηκτωμάτων ενός άλλου πολυμερούς, της πολυακρυλαμίδης. Καθώς μετακινούνται τα διαφορετικά μόρια DNA σχηματίζουν χαρακτηριστικές ζώνες σε διαφορετικές (ανάλογα με το μέγεθός τους) περιοχές του πηκτώματος. Οι ζώνες γίνονται ορατές με προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου στο πήκτωμα και έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Το βρωμιούχο αιθίδιο ενσωματώνεται στις αύλακες του δίκλωνου μορίου DNA και φθορίζει όταν διεγείρεται με UV, δηλαδή απορροφά στο υπεριώδες και εκπέμπει στο ορατό. Η κινητικότητα του DNA σε ένα πήκτωμα αγαρόζης εξαρτάται απο τους παρακάτω παράγοντες: 1. Το μέγεθος του μορίου DNA. Η κινητικότητα των μορίων είναι αντιστρόφως ανάλογη με το μέγεθος των μορίων 2. Τη διαμόρφωση της δομής των μορίων του DNA. Στις περιπτώσεις που ηλεκτροφορείται υπερελικωμένο DNA, κυκλικό DNA με εγκοπές ή γραμμικό DNA παρατηρείται διαφορετική κινητικότητα των μορίων, ακόμα και αν αυτά έχουν το ίδιο μέγεθος 3. Τη συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα. 4. Την παρεχόμενη τάση του ηλεκτρικού ρεύματος. Σε χαμηλές τάσεις η κινητικότητα των μορίων είναι ανάλογη της τάσης που εφαρμόζεται. Αντίθετα σε αυξημένη τάση παρατηρείται μείωση της ικανότητας διαχωρισμού των μεγαλύτερων σε μέγεθος τμημάτων DNA 5. Την κατεύθυνση του ηλεκτρικού πεδίου. Παροδικές αλλάγες στην κατεύθυνση του ηλεκτρικού πεδίου χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό μεγάλων τμημάτων DNA με μέγεθος απο kb σε μήκος 6. Την σύσταση των βάσεων του τμήματος του DNA 7. Τα χημικά που παρεμβάλλονται στη δομή του DNA, όπως το βρωμιούχο αιθίδιο, μειώνοντας έτσι την κινητικότητα του 68

69 8. Τη σύσταση του διαλύματος ηλεκτροφόρησης Για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης γίνεται χρήση των παρακάτω αντιδραστηρίων: 1. Ρυθμιστικό Διάλυμα TAE (1 ) Σύσταση (50 ): 242 g Tris 100 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) Αποσταγμένο H 2 O (dd H 2 O) έως τελικού όγκου 1000 ml 2. Αγαρόζη της εταιρείας BioRad (Molecular Biology Agarose) (Bio-Rad Laboratories, Inc.) 3. Βρωμιούχο αιθίδιο (10 mg/ml) Για τη διαδικασία της ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιούνται: 1. Ρυθμιστικό διάλυμα TAE (1 ) 2. Διάλυμα φόρτωσης/ Gel Loading Buffer (6 ) της εταιρείας NEB 3. Μάρτυρας μεγεθών σταθερού βήματος 50bp DNA (Ladder) της εταιρείας NEB Το πήκτωμα της αγαρόζης μπορεί να έχει διαφορετική περιεκτικότητα σε αγαρόζη, ανάλογα με το σκοπό της χρήσης του. Γενικά, για την ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων χρησιμοποιείται πήκτωμα 1% w/v (κυρίως για προϊόντα μεγαλύτερου μεγέθους όπως bp). Σε περίπτωση προϊόντων μικρότερου μεγέθους ή για την ηλεκτροφόρηση προϊόντων κατάτμησης με περιοριστικές ενδονουκλεάσες, προτιμάται πήκτωμα υψηλότερης περιεκτικότητας σε αγαρόζη, για παράδειγμα 2% w/v, για καλύτερο διαχωρισμό των προϊόντων. 69

70 Β.11 Καθαρισμός PCR προϊόντων Τα προϊόντα της PCR προορίζονται για αλληλούχιση (sequencing) κατά Sanger. Πριν όμως την αλληλούχιση των προϊόντων, είναι απαραίτητο αυτά να καθαριστούν από τα υπολείμματα εκκινητών, ελεύθερων δεοξυνουκλεοτιδίων και ρυθμιστικού διαλύματος, προκειμένου τα αποτελέσματα να έχουν όσο το δυνατόν πιο μειωμένο θόρυβο υποβάθρου και ως εκ τούτου, να είναι αξιόπιστα. Για τον καθαρισμό των προϊόντων, στη παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit από τη MACHEREY-NAGEL, γερμανικής προέλευσης. Η διαδικασία καθαρισμού που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: 1. Προσθήκη Η 2 Ο στα δείγματα μέχρι τελικού όγκου 50 μl 2. Προσθήκη διαλύματος πρόσδεσης Binding Buffer σε αναλογία 1:1 και ανάδευση 3. Μεταφορά του μείγματος σε στήλη (spin column, μια για κάθε δείγμα) και επώαση για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 4. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε ταχύτητα rpm και απόρριψη του διηθήματος 5. Προσθήκη 500μl διαλύματος πλύσης Wash Buffer στη στήλη. Πριν τη χρήση του Wash Buffer θα πρέπει αυτό να έχει αραιωθεί με αιθανόλη σύμφωνα με τις οδηγίες του παρασκευαστή 6. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε ταχύτητα rpm και απόρριψη του διηθήματος 7. Επανάληψη των βημάτων 5 και 6 8. Φυγοκέντρηση για 3 λεπτά και στη συνέχεια πάλι φυγοκέντρηση για 1 λεπτό με ανοιχτό το καπάκι της στήλης προκειμένου να εξατμιστεί πιθανό υπόλοιπο αιθανόλης 9. Μεταφορά της στήλης σε καθαρό 1,5 ml eppendorf tube 10. Προσθήκη 30μl διαλύματος έκλουσης (Elution Buffer) στη στήλη και επώαση για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 11. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε ταχύτητα rpm 12. Παραλαβή του καθαρού προϊόντος και αποθήκευσή του στους -20 ο C 70

71 Β.12 Αλληλούχιση (Sequencing) DNA κατά Sanger Η αλληλούχιση αποτελεί μέθοδο καθορισμού της σειράς των νουκλεοτιδικών βάσεων αδενίνης, γουανίνης, κυτοσίνης και θυμίνης σε ένα μόριο DNA. Η μεγάλη ταχύτητα και πιστότητα με την οποία επιτελείται η μέθοδος αλληλούχισης σήμερα, έχει αποδειχθεί καθοριστικός παράγοντας στην ανάλυση του ανθρώπινου γονιδιώματος. Η μέθοδος αλληλούχισης που ακολουθήθηκε στην παρούσα μελέτη είναι η ενζυμική μέθοδος κατά Sanger (Sanger et al. 1977, Perutz et al. 1968) ή διαφορετικά η μέθοδος «τερματισμού της επιμήκυνσης αλυσίδας» (chain termination). Η βασική αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στη χρήση τριφωσφορικών 2,3 διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddntp) ως μόρια τερματισμού της DNA αλληλουχίας. Για την εφαρμογή της μεθόδου απαιτείται ένα μονόκλωνο DNA υπόστρωμα, ένας DNAεκκινητής, μια DNA-πολυμεράση, φυσιολογικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntp) και τριφωσφορικά 2,3 - διδεοξυνουκλεοτίδια, τα οποία τερματίζουν την επιμήκυνση του DNA-κλώνου. Τα ddntp είναι επισημασμένα με φθορίζουσες ομάδες, ώστε να καταστεί δυνατή η ανίχνευση σε αυτόματους αναλυτές αλληλούχισης. Στο παρελθόν, κάθε δείγμα DNA που επρόκειτο να αλληλουχηθεί διαχωριζόταν σε πέντε ξεχωριστές αντιδράσεις που περιείχαν: 1. Φυσιολογικά τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (datp,dgtp,dctp,dttp) 2. DNA πολυμεράση (Taq) 3. DNA στόχο 4. Εκκινητές (μόνο forward ή reverse) 5. Κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα Σε κάθε μία από τις πέντε αυτές αντιδράσεις γινόταν προσθήκη ενός μόνο τριφωσφορικού 2,3 διδεοξυνουκλεοτιδίου (ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp). Επειδή τα τροποποιημένα αυτά νουκλεοτίδια δεν διαθέτουν την 3 -OH ομάδα που απαιτείται για τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ δύο νουκλεοτιδίων, προκαλείται άμεσος τερματισμός της επιμήκυνσης της DNA αλυσίδας, με αποτέλεσμα να προκύπτουν τμήματα DNA ποικίλου μήκους. Στη συνέχεια, τα νεοσυντιθέμενα και επισημασμένα DNA τμήματα αποδιατάσσονταν με εφαρμογή θερμότητας και διαχωρίζονταν, ανάλογα με το μέγεθός τους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης-ουρίας, με αποτέλεσμα τα προϊόντα κάθε αντίδρασης να διακρίνονταν σε ένα απο τα τέσσερα ξεχωριστά φρεάτια. Οι ζώνες οπτικοποιούνταν 71

72 με εφαρμογή υπεριώδους ακτινοβολίας ή αυτοραδιογραφίας (ανάλογα με τον τρόπο που είχαν επισημανθεί τα ddntps) και η αλληλουχία DNA προσδιοριζόταν από την εικόνα του πηκτώματος. Στη δική μας μελέτη, η αλληλουχίση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του αυτόματου γενετικού αναλυτή 3130XL ABI Prism (Applied Biosystems, USA). Στη συγκεκριμένη περίπτωση, εκτός από τα συμβατικά νουκλεοτίδια προστίθεται στο μίγμα τα διδεόξυ ανάλογά τους (τριφωσφορικά 2',3' διδεόξυ-νουκλεοτίδια- ddntps), τα οποία δεν έχουν 3'-OH και είναι σημασμένα με τέσσερις διαφορετικές φθορίζουσες ουσίες: R6G, TAMRA,ROX, R110, καθεμιά από τις οποίες εκπέμπει σε διαφορετικό μήκος κύματος κι έτσι, είναι δυνατή η ταυτοποίηση του τελευταίου νουκλεοτιδίου κάθε νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Η σύνθεση της αλυσίδας DNA γίνεται με σχηματισμό τριφωσφορικών δεσμών. Στην περίπτωση που στο μόριο συνδέονται διδεοξυνουκλεοτίδια η επέκταση της αλυσίδας σταματάει ελλείψει της 3'-OH ομάδας, η οποία είναι απαραίτητη για το σχηματισμό του φωσφοδιεστερικού δεσμού και έτσι, σχηματίζονται μόρια που διαφέρουν σε μέγεθος κατά ένα νουκλεοτίδιο. Τα σημασμένα μόρια που παράγονται τοποθετούνται στον αυτόματο αναλυτή και διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε ειδικό τριχοειδές πήκτωμα. Τα σημασμένα τμήματα του DNA ανιχνεύονται από μια διάταξη laser αισθητήρων και τα δεδομένα αποθηκεύονται για να αναλυθούν. Για την αντίδραση της ανάγνωσης της αλληλουχίας απαιτούνται 50 ng καθαρισμένου προϊόντος της PCR, τα οποία αναμειγνύονται με το έτοιμο μίγμα αντίδρασης Big Dye Termination Ready Reaction Mix, version 3.1 (AppliedBiosystems, USA), το οποίο περιέχει Taq πολυμεράση, dntps και ddntps. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε τελικό όγκο 10μl παρουσία του ρυθμιστικού διαλύματος αλληλούχισης (sequencing buffer: Tris-HCl 200 mm, MgCl2 10 mm, ph 9) με την προσθήκη του εκκινητή που έχει τη μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε κυτοσίνη και γουανίνη (Πίνακας 10). 72

73 Πίνακας 10 : Πρωτόκολλο αντιδραστηρίων της διαδικασίας αλληλούχισης ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΟ ΟΓΚΟΣ (μl) ΤΕΛΙΚΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ READY REACTION MIX v ΕΚΚΙΝΗΤΗΣ μΜ PCR ΠΡΟΪΟΝ x 50ng H 2 O 7.15-x (7.15-x) μl Η αντίδραση πραγματοποιείται στο θερμικό κυκλοποιητή βάσει του παρακάτω πρωτοκόλλου (Πίνακας 11 ) Πίνακας 11 : Πρωτόκολλο της διαδικασίας της PCR ΒΗΜΑ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΧΡΟΝΟΣ 1 Ο 96 Ο C 1 min 2 Ο 96 Ο C 10 sec 3 Ο 50 Ο C 5 sec 4 Ο 60 Ο C 4 min 5 ο : Επανάληψη των βημάτων 2-4 για 24 φορές 6 Ο 4 Ο C Μετά το τέλος των αντιδράσεων ακολουθεί καθαρισμός των προϊόντων της αντίδρασης αλληλούχισης από τα περίσσεια διδεόξυ-νουκλεοτίδια που δεν έχουν ενσωματωθεί, με στήλες Sephadex G-50. Για την πλήρωση της στήλης, επιστοιβάζουμε 1ml διογκωμένου Sephadex G-50 (σε διάλυμα ΤΕ) σε στήλες που έχουν τοποθετηθεί εντός σωληναρίων 2 ml τύπου eppendorf και φυγοκεντρούμε στα g για 2 λεπτά. Απορρίπτουμε το έκλουσμα και μεταφέρουμε την πακεταρισμένη στήλη Sephadex G-50 σε νέο αποστειρωμένο σωληνάριο 1,5 ml τύπου eppendorf, όπου επιστοιβάζουμε το συνολικό όγκο της αντίδρασης. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 2 λεπτά. Ο καθαρισμός βασίζεται στη μοριακή διήθηση, κατά την οποία τα μικρότερα σε μέγεθος μόρια (σημασμένα ddntps) εκλούονται αργότερα από τη στήλη, καθώς δεσμεύονται στις οπές του πορώδους υλικού, ενώ τα μεγαλύτερα εκλούονται γρηγορότερα. To καθαρισμένο προϊόν αναμειγνύεται σε 15μl απιονισμένο φορμαμίδιο (Applied Biosystems, USA), αποδιατάσσεται με επώαση στους 95 C για 5 λεπτά και 73

74 τελικά, τοποθετείται σε κατάλληλη υποδοχή του αυτόματου γενετικού αναλυτή για την ανάγνωση της αλληλουχίας του DNA. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, που ονομάζεται πολυμερές POP-6 (Applied Biosystems, USA), εντός τριχοειδούς σωλήνα μήκους 47cm και διαμέτρου 50μm. Τα μόρια κατά την έξοδό τους από το τριχοειδές διέρχονται από δέσμη laser, ώστε να διεγερθούν οι φθορίζουσες ουσίες, ενώ το μήκος κύματος της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας φθορισμού ανιχνεύεται από ειδική καταγραφική συσκευή (CCD camera). Το αποτέλεσμα της διαδικασίας είναι το χρωματογράφημα, το οποίο αποτελείται από τις διαδοχικές βάσεις του τμήματος DNA, οι οποίες εμφανίζονται με τέσσερα διαφορετικά χρώματα.(εικόνα 20). Εικόνα 160: Χαρακτηριστική εικόνα χρωματογραφήματος, με κάθε βάση του DNA να απεικονίζεται και με διαφορετικό χρώμα. Β.13 Στατιστική επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων Η στατιστική ανάλυση μας βοηθά να αξιολογήσουμε τις σχέσεις μεταξύ των μεταβλητών και την αξιοπιστία των πειραματικών μας δεδομένων. Στην παρούσα μελέτη, η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή ποικίλων στατιστικών δοκιμασιών, κατάλληλων ως προς το ερώτημα που τίθεται κάθε φορά. Ως πρώτο μέλημα κατά τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων μας, απαιτείται να διερευνηθεί αν οι υπό μελέτη πληθυσμοί μας για τον γενετικό τόπο που μας ενδαφέρει βρίσκονται σε ισορροπία Hardy Weinberg. Είναι σημαντικό να 74

75 επικρατούν συνθήκες τυχαίας διασταύρωσης (random mating), αναφορικά με τον υπό μελέτη γενετικό τόπο, διαφορετικά ας πούμε απλοϊκά πως τα δεδομένα μας και η απορρέουσα στατιστική ανάλυση θα είναι «μεροληπτική» (biased). Για το σκοπό αυτό, εφαρμόστηκε η δοκιμασία «chi square goodness of fit». Μόνο στην περίπτωση ικανοποίησης της ισορροπίας Hardy Weinberg, έπεται συνέχεια στη στατιστική ανάλυση των δεδομένων μας, εφαρμόζοντας τον αμφίπλευρο ακριβή έλεγχο του Fisher (two tailed Fisher s exact test), βάσει του μεγέθους των πληθυσμών μας. Η εν λόγω δοκιμασία θεωρείται «δοκιμασία ακρίβειας», διότι η σημαντικότητα της απόκλισης από τη «μηδενική υπόθεση» μπορεί να υπολογιστεί με ακρίβεια. Β.13.1.Η ισορροπία Hardy-Weinberg Σύμφωνα με τη διατύπωση αυτού του νόμου, σε σχετικά μεγάλους πληθυσμούς όπου δεν υπάρχει ουσιαστικά μετανάστευση, τα ζευγαρώματα θα γίνονται τυχαία απουσία επιλογής και μεταλλαγής και οι συχνότητες των γονιδίων θα παραμένουν οι ίδιες. Η ποικιλομορφία θα μπορούσε να διατηρηθεί κατά τη διάρκεια των γενεών. Ο νόμος αυτός ήταν στην ουσία μια προσπάθεια του μαθηματικού G. Harold Hardy να αποδείξει την παραπάνω θεωρία που πρότειναν γιατροί και βιολόγοι στην αρχή του 19 ου αιώνα και αποτελέι μια προσπάθεια να συνδυαστούν η θεωρία της εξέλιξης του Δαρβίνου, η κληρονομικότητα κατά Mendel και οι σύγχρονες παρατηρήσεις για την εξέλιξη. Στις περιπτώσεις που εξετάζουμε την ισορροπία Hardy-Weinberg ακολουθούμε την εξής διαδικασία. Οι γονοτυπικές συχνότητες κατανέμονται ανάλογα με τις συχνότητες των αλληλομόρφων στον πληθυσμό και παραμένουν σταθερές από γενεά σε γενεά. Έτσι, εάν p είναι η συχνότητα ενός αλληλομόρφου και q η συχνότητα του άλλου, τότε οι συχνότητες των τριών γονοτύπων δίνονται από το ανάπτυγμα του διωνύμου (p+q) 2 = p 2 + 2pq + q 2, όπου p 2 : η συχνότητα εμφάνισης του ενός ομοζυγώτη, 2pq: η συχνότητα εμφάνισης του ετεροζυγώτη και q 2 : η συχνότητα εμφάνισης του έτερου ομοζυγώτη. Ο πληθυσμός p 2 : 2pq : q 2 θεωρείται ότι βρίσκεται σε ισορροπία. Η ισχύς του νόμου ελέγχθηκε με το στατιστικό τεστ Chi square Goodness of fit test. Για την εφαρμογή του παραπάνω τεστ είναι απαραίτητος ο υπολογισμός του chi-square ή c 2 ή κριτήριο χ 2. 75

76 Η διερεύνηση της ισχύος του νόμου πραγματοποιήθηκε με τη σύγκριση των παρατηρούμενων γονοτυπικών συχνοτήτων σε σχέση με τις αναμενόμενες υπό τις συνθήκες της ισορροπίας Hardy Weinberg. Το κριτήριο χ 2 μας επέτρεψε να εκτιμήσουμε την απόκλιση ανάμεσα στις θεωρητικά αναμενόμενες συχνότητες και στις παρατηρούμενες. Εν γένει, το κριτήριο χ 2 εκφράζεται από την εξίσωση: χ 2 = Σ(Π-Α) 2 Α όπου Π είναι οι παρατηρούμενες τιμές και Α οι θεωρητικώς αναμενόμενες τιμές. Η τιμή χ2 δίνει για συγκεκριμένους βαθμούς ελευθερίας Β.Ε. (οι οποίοι εκφράζουν κατά πόσους τρόπους μπορεί να μεταβληθεί ένα σύστημα) την πιθανότητα (P) συμφωνίας των θεωρητικά αναμενόμενων τιμών με τις τιμές που παρατηρήθηκαν. Στην παρούσα εργασία, ως επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε το 5% (όρια εμπιστοσύνης 95%). Πιθανότητα μεγαλύτερη του επιπέδου σημαντικότητας σημαίνει συμφωνία, δηλαδή στην πράξη, τα αποτελέσματά μας δεν παρουσιάζουν στατιστικώς σημαντική διαφορά (η μηδενική υπόθεση είναι αποδεκτή - ο πληθυσμός για τον συγκεκριμένο γενετικό τόπο είναι σε ισορροπία Hardy Weinberg). Αντίθετα, όταν η τιμή P που υπολογίζουμε είναι μικρότερη του επιπέδου σημαντικότητας 0,05, αυτό σημαίνει πως υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των θεωρητικών και πραγματικών τιμών (η μηδενική υπόθεση δεν γίνεται αποδεκτή). Αναφορικά με τον υπολογισμό των βαθμών ελευθερίας (d.f), αυτοί δίδονται από τη μαθηματική σχέση: d.f = k 1 m όπου k: ο αριθμός των τάξεων και m: ο αριθμός των ανεξάρτητων μεταβλητών. Για ένα σύστημα δυο αλληλομόρφων υπάρχουν τρεις τάξεις και μια ανεξάρτητη μεταβλητή και συνεπώς, έχουμε έναν βαθμό ελευθερίας. Η τιμή του κριτηρίου χ 2 προκύπτει από το άθροισμα των επιμέρους τετραγώνων για κάθε τάξη, δηλαδή κάθε γονότυπο. Με βάση τον ακόλουθο μερικό πίνακα του κριτηρίου χ 2 για τις κριτικές τιμές (upper tail), η κριτική τιμή που θα καθορίσει την αποδοχή ή την απόρριψη της μηδενικής μας υπόθεσης είναι ίση του

77 Β Αμφίπλευρος ακριβής έλεγχος του Fisher Ο αμφίπλευρος ακριβής έλεγχο του Fisher είναι ένας μη παραμετρικός έλεγχος, ανεξαρτησίας και ομοιογένειας. Χρησιμοποιείται για την ανάλυση διακριτών δεδομένων, όταν τα δυο ανεξάρτητα δείγματα έχουν μικρό μέγεθος. Tα αποτελέσµατα αυτών των δειγµάτων αντιστοιχούν στη µια από τις δύο τυχαίες κατηγορίες και κάθε στοιχείο αυτών είναι δυνατό να έχει το ένα από τα δύο χαρακτηριστικά. Έστω n 1, n 2 δυο ανεξάρτητα τυχαία δείγµατα µε N = n 1 + n 2. Ο έλεγχος δεν εξετάζει µόνο την παρατηρούµενη περίπτωση, αλλά υπολογίζει την πιθανότητα πιο ακραίων περιπτώσεων µε τα ίδια περιθώρια αθροίσµατα. Έτσι, η τιμή p υπολογίζεται µε το άθροισµα των πιθανοτήτων όλων των ακραίων περιπτώσεων και του δοσµένου πίνακα (στην παρούσα ανάλυση, της μορφής 3 x 2): Ο εν λόγω έλεγχος είναι ιδανικός στις περιπτώσεις που στον πίνακα ενδεχοµένων έχουµε πολύ µικρά µεγέθη(δηλαδή έχω αριθµό µικρότερο του 5). Με τη χρήση του λαµβάνουµε μια πιο ακριβή τιμή p, αν και χαρακτηρίζεται από πιο πολύπλοκους υπολογισμούς, συγκριτικά με το κριτήριο χ 2 (το οποίο καταλήγει σε μια µόνο προσεγγιστική τιμή p). Οι υπολογισμοί έγιναν κάνοντας χρήση της πλατφόρμας in-silico.net ( 77

Διαταραχές των αιμοσφαιρινών Συνηθέστερη μονογονιδιακή διαταραχή στους ανθρώπους Το 5% του πληθυσμού είναι φορείς γονιδίων για κλινικώς σημαντικές

Διαταραχές των αιμοσφαιρινών Συνηθέστερη μονογονιδιακή διαταραχή στους ανθρώπους Το 5% του πληθυσμού είναι φορείς γονιδίων για κλινικώς σημαντικές 1 Διαταραχές των αιμοσφαιρινών Συνηθέστερη μονογονιδιακή διαταραχή στους ανθρώπους Το 5% του πληθυσμού είναι φορείς γονιδίων για κλινικώς σημαντικές διαταραχές της αιμοσφαιρίνης 2 Αποτελείται από δύο α

Διαβάστε περισσότερα

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ. Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 23 Φεβρουαρίου 2016

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ. Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 23 Φεβρουαρίου 2016 ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΣΦΑΙΡΙΝΙΚΩΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 23 Φεβρουαρίου 2016 ομή της αιμοσφαιρίνης Α του ανθρώπου γονιδιακοί τόποι ευθύνονται

Διαβάστε περισσότερα

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ. Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 15 Μαρτίου 2017

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ. Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 15 Μαρτίου 2017 ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: ΟΜΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΣΦΑΙΡΙΝΙΚΩΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΘΑΛΑΣΑΙΜΙΕΣ Α. ΠΑΠΑΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 15 Μαρτίου 2017 ομή της αιμοσφαιρίνης Α του ανθρώπου γονιδιακοί τόποι ευθύνονται για

Διαβάστε περισσότερα

Εισαγωγή. Οι β-θαλασσαιμίες αποτελούν μία ετερογενή ομάδα κληρονομικών νοσημάτων που χαρακτηρίζονται από μειωμένη σύνθεση των β-αλυσίδων της αιμοσφαιρ

Εισαγωγή. Οι β-θαλασσαιμίες αποτελούν μία ετερογενή ομάδα κληρονομικών νοσημάτων που χαρακτηρίζονται από μειωμένη σύνθεση των β-αλυσίδων της αιμοσφαιρ 03 εδbοτχ 155 Εισαγωγή. Οι β-θαλασσαιμίες αποτελούν μία ετερογενή ομάδα κληρονομικών νοσημάτων που χαρακτηρίζονται από μειωμένη σύνθεση των β-αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης. Στην ομόζυγη κατάσταση προκαλούν

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ. 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1 o

ΒΙΟΛΟΓΙΑ. 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1 o ΘΕΜΑ 1 o Γ ΛΥΚΕΙΟΥ-ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ 1 ο ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ Α. Γιατί τα βακτήρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν «εργοστάσια παραγωγής ανθρώπινων πρωτεϊνών»; Β. Σε ένα βακτήριο εισάγεται με τη μέθοδο του ανασυνδυασμένου

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΑΛΛΑΓΩΝ ΣΤΑ ΓΟΝΙΔΙΑ NOS1 ΚΑΙ ASS1 ΣΤΗΝ ΑΥΞΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΗΣ ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΕΛΛΗΝΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ β-μεσογειακη ΑΝΑΙΜΙΑ ΚΑΙ ΤΗΝ

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 16-2-2014 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. (Μονάδες 25)

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 16-2-2014 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε κύκλο το γράμμα που αντιστοιχεί στη σωστή απάντηση. (Μονάδες 25) ΤΣΙΜΙΣΚΗ &ΚΑΡΟΛΟΥ ΝΤΗΛ ΓΩΝΙΑ THΛ: 270727 222594 ΑΡΤΑΚΗΣ 12 - Κ. ΤΟΥΜΠΑ THΛ: 919113 949422 ΕΠΩΝΥΜΟ:... ΟΝΟΜΑ:... ΤΜΗΜΑ:... ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ:... ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ 16-2-2014 ΘΕΜΑ 1 ο Α. Να βάλετε σε

Διαβάστε περισσότερα

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ (ΑΜΦ) ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: Hb, είναι τετραμερής πρωτείνη. ΜΕΤΑΠΤΩΣΗ ΑΠΟ Τ <=> R

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ (ΑΜΦ) ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: Hb, είναι τετραμερής πρωτείνη. ΜΕΤΑΠΤΩΣΗ ΑΠΟ Τ <=> R ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ (ΑΜΦ) ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ: Hb, είναι τετραμερής πρωτείνη. ΜΕΤΑΠΤΩΣΗ ΑΠΟ Τ R ΔΕΟΞΥΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ ΟΞΥΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ (Σταθερότητα, χαμηλή συγγένεια για Ο2Εύκαμπτη, υψηλή συγγένεια για Ο2) Λόγο των

Διαβάστε περισσότερα

«β-μεσογειακή αναιμία: το πιο συχνό μονογονιδιακό νόσημα στη χώρα μας»

«β-μεσογειακή αναιμία: το πιο συχνό μονογονιδιακό νόσημα στη χώρα μας» Εργαστήριο Κυτταρογενετικής ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος» «β-μεσογειακή αναιμία: το πιο συχνό μονογονιδιακό νόσημα στη χώρα μας» Ζαχάκη Σοφία - Ουρανία Βιολόγος, MSc, PhD β μεσογειακή αναιμία Η θαλασσαιμία ή νόσος

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 18 ΙΟΥΝΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. γ Α3. δ Α4. β Α5. α 2 β 5 γ 6 δ 1 ε 3 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

Διαβάστε περισσότερα

Αιμοσφαιρίνες. Αιμοσφαιρίνη Συμβολισμός Σύσταση A HbA α 2 β 2 F HbF α 2 γ 2 A 2 HbA 2 α 2 δ 2 s. Σύγκριση γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων

Αιμοσφαιρίνες. Αιμοσφαιρίνη Συμβολισμός Σύσταση A HbA α 2 β 2 F HbF α 2 γ 2 A 2 HbA 2 α 2 δ 2 s. Σύγκριση γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων A. ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ Αιμοσφαιρίνες Αιμοσφαιρίνη Συμβολισμός Σύσταση A HbA α 2 β 2 F HbF α 2 γ 2 A 2 HbA 2 α 2 δ 2 S HbS s α 2 β 2 Σύγκριση γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων ΓΟΝΙΔΙΑΚΕΣ Αλλαγή σε αζωτούχες

Διαβάστε περισσότερα

Νικολακοπούλου Κωνσταντίνα Κάτσα Ελένη-Μαρία Δάσκου Μαρία. β-θαλασσαιμία

Νικολακοπούλου Κωνσταντίνα Κάτσα Ελένη-Μαρία Δάσκου Μαρία. β-θαλασσαιμία Νικολακοπούλου Κωνσταντίνα Κάτσα Ελένη-Μαρία Δάσκου Μαρία β-θαλασσαιμία Θάλασσα + αίμα = θαλασσαιμία Εισαγωγή Η πιο κοινή γενετική νόσος που κληρονομείται Mενδελικά ~ 1 : 100.000 παγκοσμίως ~ 1 : 10.000

Διαβάστε περισσότερα

ΔΙΑΤΡΙΒΗ. για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

ΔΙΑΤΡΙΒΗ. για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΤΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Φαρμακογονιδιωματική και λειτουργική μελέτη

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διευθυντής: Καθ. Ν. Βαμβακόπουλος «ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΗΣ ΠΑΡΑΜΟΝΗΣ ΕΜΒΡΥΪΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ

Διαβάστε περισσότερα

ΒΑΣΙΛΙΚΗ XONΔΡΟΥ. Βιολόγος, MSc

ΒΑΣΙΛΙΚΗ XONΔΡΟΥ. Βιολόγος, MSc ΒΑΣΙΛΙΚΗ XONΔΡΟΥ Βιολόγος, MSc «ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΦΟΡΙΚΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΥΠΟΓΡΑΦΗΣ ΤΡΙΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΙΣΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΟΝΤΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΤΩΝ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΩΝ β-τυπου»

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛAΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΠΑΝΕΛΛAΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛAΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 16-06-2017 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α. φωσφορική ομάδα (Ι) E. υδροξύλιο (II) Β. mrna

Διαβάστε περισσότερα

αμινοξύ. Η αλλαγή αυτή έχει ελάχιστη επίδραση στη στερεοδιάταξη και τη λειτουργικότητα της πρωτεϊνης. Επιβλαβής

αμινοξύ. Η αλλαγή αυτή έχει ελάχιστη επίδραση στη στερεοδιάταξη και τη λειτουργικότητα της πρωτεϊνης. Επιβλαβής Κεφάλαιο 6: ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ -ΘΕΩΡΙΑ- Μεταλλάξεις είναι οι αλλαγές που συμβαίνουν στο γενετικό υλικό ενός οργανισμού, τόσο σε γονιδιακό επίπεδο (γονιδιακές μεταλλάξεις) όσο και σε χρωμοσωμικό επίπεδο (χρωμοσωμικές

Διαβάστε περισσότερα

Φάσμα& Group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι.

Φάσμα& Group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. σύγχρονο Φάσμα& Group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. μαθητικό φροντιστήριο 1. 25ης Μαρτίου 111 ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗ 50.27.990 50.20.990 2. 25ης Μαρτίου 74 Π. ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗΣ 50.50.658 50.60.845 3. Γραβιάς 85 ΚΗΠΟΥΠΟΛΗ

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο 1. Με ποιο μηχανισμό αντιγράφεται το DNA σύμφωνα με τους Watson και Crick; 2. Ένα κύτταρο που περιέχει ένα μόνο χρωμόσωμα τοποθετείται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει ραδιενεργό

Διαβάστε περισσότερα

ΑΡΧΗ 1ης ΣΕΛΙΔΑΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΑΞΗ / ΤΜΗΜΑ : Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΠΕΡΙΟΔΟΥ : ΜΑΪΟΥ 2019 ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙΔΩΝ : 7

ΑΡΧΗ 1ης ΣΕΛΙΔΑΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΑΞΗ / ΤΜΗΜΑ : Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΠΕΡΙΟΔΟΥ : ΜΑΪΟΥ 2019 ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙΔΩΝ : 7 ΑΡΧΗ 1ης ΣΕΛΙΔΑΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΑΞΗ / ΤΜΗΜΑ : Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΠΕΡΙΟΔΟΥ : ΜΑΪΟΥ 2019 ΣΥΝΟΛΟ ΣΕΛΙΔΩΝ : 7 Θέμα 1 (Θ.κ. κεφ. 1,2,4,5,6,7,8,9) Για τις ημιτελείς προτάσεις 1 έως και 5, να

Διαβάστε περισσότερα

ΠΩΣ ΕΠΙΔΡΑ Η ΑΣΚΗΣΗ ΣΤΑ ΔΙΑΦΟΡΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ

ΠΩΣ ΕΠΙΔΡΑ Η ΑΣΚΗΣΗ ΣΤΑ ΔΙΑΦΟΡΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΠΩΣ ΕΠΙΔΡΑ Η ΑΣΚΗΣΗ ΣΤΑ ΔΙΑΦΟΡΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ Η άσκηση, επιφέρει ευεργετικά αποτελέσματα στα διάφορα συστήματα του οργανισμού. Τα αποτελέσματα αυτά ενδέχεται να είναι παροδικά ή μόνιμα ανάλογα

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Β2. Η εικόνα αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το mrna αρχίζει να μεταφράζεται σε πρωτεΐνη πριν ακόμη

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Β2. Η εικόνα αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το mrna αρχίζει να μεταφράζεται σε πρωτεΐνη πριν ακόμη ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΚΑΙ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΕΠΑΛ (ΟΜΑΔΑ Β ) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 6 ΙΟΥΝΙΟΥ 207 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5.

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ-ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΣΗΜΕΡΑ

ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ-ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΣΗΜΕΡΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ Η μεσογειακή αναιμία ή θαλασσαιμία είναι κληρονομική αυτοσωμική υπολειπόμενη νόσος η οποία εντοπίζεται κυρίως στην περιοχή της Μεσογείου Θάλασσας. Στη Μεσογειακή αναιμία η γονιδιακή

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΩΝ 2017 ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Ι Α, ΙΙ Ε, ΙΙΙ ΣΤ, ΙV Β, V Ζ, VII Γ, VII Δ Β2. Η εικόνα 1 αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό κύτταρο. Στους προκαρυωτικούς

Διαβάστε περισσότερα

www.epignosi.edu.gr ΘΕΜΑ Α

www.epignosi.edu.gr ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στην κόλλα σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1 έως 5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή τη φράση, η οποία συμπληρώνει σωστά την ημιτελή πρόταση.

Διαβάστε περισσότερα

Φάσμα group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι.

Φάσμα group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. σύγχρονο Φάσμα group προπαρασκευή για Α.Ε.Ι. & Τ.Ε.Ι. µαθητικό φροντιστήριο Γραβιάς 85 ΚΗΠΟΥΠΟΛΗ 50.51.557 50.56.296 25ης Μαρτίου 74 ΠΛ.ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗΣ 50.50.658 50.60.845 25ης Μαρτίου 111 ΠΕΤΡΟΥΠΟΛΗ 50.27.990

Διαβάστε περισσότερα

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ Καθώς η επιστημονική γνώση και κατανόηση αναπτύσσονται, ο μελλοντικός σχεδιασμός βιοτεχνολογικών προϊόντων περιορίζεται μόνο από τη φαντασία μας Βιοτεχνολογία

Διαβάστε περισσότερα

Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 22 : Η ενεργοποίηση της µεταγραφής

Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 22 : Η ενεργοποίηση της µεταγραφής Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 22 : Η ενεργοποίηση της µεταγραφής Εικόνα 22.1 Η γονιδιακή έκφραση ελέγχεται κυρίως κατά την έναρξη της µεταγραφής και σπάνια στα επόµενα στάδια της γονιδιακής έκφρασης, παρόλο που ο έλεγχος

Διαβάστε περισσότερα

Η χρήση γονιδιωματικών δεικτών για την πρόγνωση της βαρύτητας των συμπτωμάτων της β-μεσογειακής αναιμίας

Η χρήση γονιδιωματικών δεικτών για την πρόγνωση της βαρύτητας των συμπτωμάτων της β-μεσογειακής αναιμίας ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΒΙΟΙΑΤΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Η χρήση γονιδιωματικών δεικτών για την πρόγνωση της βαρύτητας

Διαβάστε περισσότερα

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους;

1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; ΘΩΜΑΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ. 2. Ποιες είναι οι κατηγορίες γονιδίων με κριτήριο το προϊόν της μεταγραφής τους; Βιολογία Γ Ενιαίου Λυκείου / Θετική Κατεύθυνση κεφαλαιο 2ο: αντιγραφη, εκφραση και ρυθμιση τησ ΓενετικηΣ ΠληροφοριαΣ 1. Πού πραγματοποιούνται η αντιγραφή και η μεταγραφή; Ευκαρυωτικά κύτταρα: στον πυρήνα,

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2010

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2010 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2010 ΘΕΜΑ Α 1. δ 2. β 3. α 4. β 5. γ ΘΕΜΑ Β 1. Σελ. 17 σχολ. Βιβλίου: Το γενετικό υλικό ενός κυττάρου αποτελεί το γονιδίωμά του όπως είναι τα

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ 27 Μαΐου 2016 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλαδικών Εξετάσεων Ημερησίων Γενικών Λυκείων (Νέο & Παλιό Σύστημα) ΘΕΜΑ Γ Γ.1 Ο χαρακτήρας της ομάδας αίματος στον άνθρωπο

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α I Β IV Γ VI

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΤΕΤΑΡΤΗ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ:

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ: ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: 16 / 06 / 2017 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑΤΩΝ Θέμα Α Α1: δ Α2:

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ / Γ ΙΑΤΡ ΓΘΕΤ 2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 20/03/2016 ΘΕΜΑ Α

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ / Γ ΙΑΤΡ ΓΘΕΤ 2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 20/03/2016 ΘΕΜΑ Α ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ / Γ ΙΑΤΡ ΓΘΕΤ 2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 20/03/2016 ΘΕΜΑ Α 1. α 2. δ 3. γ 4. δ 5. γ. ΘΕΜΑ Β 1. Τα αντισώματα αποτελούν το πιο αποτελεσματικό φυσικό φάρμακο για την αντιμετώπιση

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA

Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA Κεφάλαιο 4: Ανασυνδυασμένο DNA 1. Η ανάπτυξη της γενετικής μηχανικής επέτρεψε: α. την κατανόηση των μηχανισμών αντιγραφής του γενετικού υλικού β. την απομόνωση των πλασμιδίων από τα βακτήρια γ. την πραγματοποίηση

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ Ο.Ε.Φ.Ε. 2004 ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ Ο.Ε.Φ.Ε. 2004 ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ Ο.Ε.Φ.Ε. 2004 ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να επιλέξετε την ορθή πρόταση: ΘΕΜΑΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1. Το κωδικόνιο του mrna που κωδικοποιεί το αµινοξύ µεθειονίνη είναι α. 5 GUA

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 4 Ο, 7 Ο, 8 Ο, 9 Ο ΚΕΦΑΛΑΙΩΝ

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 4 Ο, 7 Ο, 8 Ο, 9 Ο ΚΕΦΑΛΑΙΩΝ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 4 Ο, 7 Ο, 8 Ο, 9 Ο ΚΕΦΑΛΑΙΩΝ 1. Η μεταφορά ανθρώπινου γονιδίου σε βακτήριο δίνει διαφορετικό προϊόν μεταγραφής και μετάφρασης, ενώ σε μύκητες μεταγράφεται κανονικά αλλά το προϊόν μετάφρασης εμφανίζει

Διαβάστε περισσότερα

Χρωμοσώματα και ανθρώπινο γονιδίωμα Πεφάνη Δάφνη

Χρωμοσώματα και ανθρώπινο γονιδίωμα Πεφάνη Δάφνη Χρωμοσώματα και ανθρώπινο γονιδίωμα Πεφάνη Δάφνη 12.02.2019 Νουκλεoτίδια-Δομικοί λίθοι του DNA H διπλή έλικα του DNAχωροπληρωτικό μοντέλο To ευκαρυωτικό DNA οργανώνεται σε χρωμοσώματα Τα χρωμοσώματα περιέχουν

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου

Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου Βιολογία Ο.Π. Θετικών Σπουδών Γ' Λυκείου ΘΕΜΑ Α Α1. Η αναλογία Α+G/T+C στο γενετικό υλικό ενός ιού είναι ίση με 2/3. Ο ιός μπορεί να είναι: α. ο φάγος λ. β. ο ιός της πολιομυελίτιδας. γ. φορέας κλωνοποίησης

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ: ΤΜΗΜΑ: ΘΕΜΑ 1 Ο. 3. Το DNA των μιτοχονδρίων έχει μεγαλύτερο μήκος από αυτό των χλωροπλαστών.

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ: ΤΜΗΜΑ: ΘΕΜΑ 1 Ο. 3. Το DNA των μιτοχονδρίων έχει μεγαλύτερο μήκος από αυτό των χλωροπλαστών. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ: ΤΜΗΜΑ: ΘΕΜΑ 1 Ο Α. Να γράψετε τον αριθμό της καθεμιάς από τις παρακάτω προτάσεις 1-5 και δίπλα του τη λέξη Σωστό, αν η πρόταση είναι σωστή, ή Λάθος, αν η πρόταση

Διαβάστε περισσότερα

Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ÏÅÖÅ

Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ÏÅÖÅ 1 Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΜΑ 1 ο 1 γ 2 δ 3 β 4 α 5 γ ΘΕΜΑ 2 ο ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ Μονάδες 25 (5Χ5) Α. ιαγονιδιακά ζώα ονοµάζονται εκείνα στα οποία το γενετικό τους υλικό έχει τροποποιηθεί µε την

Διαβάστε περισσότερα

Αιμοσφαιρίνη και αιμοσφαιρινοπάθειες

Αιμοσφαιρίνη και αιμοσφαιρινοπάθειες Αιμοσφαιρίνη και αιμοσφαιρινοπάθειες Αιμοσφαιρίνη Η ανθρώπινη αιμοσφαιρίνη μπορεί να μελετηθεί ευκολότερα από οποιαδήποτε άλλη πρωτεΐνη του ανθρώπου. Παράδειγμα για: ομή και λειτουργία πρωτεϊνών, ομή και

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΑΕΡΙΩΝ ΠΡΟΣ ΚΑΙ ΑΠΟ ΤΟΥΣ ΣΤΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΑΕΡΙΩΝ ΠΡΟΣ ΚΑΙ ΑΠΟ ΤΟΥΣ ΣΤΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΑΕΡΙΩΝ ΠΡΟΣ ΚΑΙ ΑΠΟ ΤΟΥΣ ΣΤΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ Μεταφορά οξυγόνου (Ο 2 ) από τον αέρα μέσω κυψελίδων στο αίμα και ιστούς Μεταφορά διοξειδίου άνθρακα (CO 2 ) από ιστούς σε κυψελίδες Οι κλίσεις των μερικών

Διαβάστε περισσότερα

Δοµή και ιδιότητες του DNA σε επίπεδο χρωµατίνηςνουκλεοσώµατος. 09/04/ Μοριακή Βιολογία Κεφ. 1 Καθηγητής Δρ. Κ. Ε. Βοργιάς

Δοµή και ιδιότητες του DNA σε επίπεδο χρωµατίνηςνουκλεοσώµατος. 09/04/ Μοριακή Βιολογία Κεφ. 1 Καθηγητής Δρ. Κ. Ε. Βοργιάς Δοµή και ιδιότητες του DNA σε επίπεδο χρωµατίνηςνουκλεοσώµατος 09/04/2014 1 09/04/2014 2 Η καθαρά δοµική εικόνα της χρωµατίνης µας παρέχει µόνο µια στατική περιγραφή της. Δυναµική εικόνα της χρωµατίνης

Διαβάστε περισσότερα

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ ΜΕΣΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ ΗΡΑΚΛΕΙΤΟΣ ΚΩΛΕΤΤΗ

ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ ΜΕΣΗΣ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗΣ ΗΡΑΚΛΕΙΤΟΣ ΚΩΛΕΤΤΗ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 ΙΟΥΝΙΟΥ 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Ε Ν Δ Ε Ι Κ Τ Ι Κ Ε Σ Α Π Α Ν Τ Η Σ Ε Ι Σ Θ Ε Μ Α Τ Ω Ν ΘΕΜΑ Α Α1-δ Α2-δ Α3-β

Διαβάστε περισσότερα

Γονιδιωματική. G. Patrinos

Γονιδιωματική. G. Patrinos Γονιδιωματική Η μεταγονιδιωματική εποχή... Σημαντικότερα επιτεύγματα POST GENOME ERA Ολοκλήρωση της αποκρυπτογράφησης της αλληλουχίας των γονιδιωμάτων πολλών οργανισμών. Προτύπωση μεθοδολογιών για προσδιορισμό

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕ 2017 ΑΠΑΝΣΗΕΙ ΣΟ ΜΑΘΗΜΑ ΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΑΝΑΣΟΛΙΜΟΤ

ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕ 2017 ΑΠΑΝΣΗΕΙ ΣΟ ΜΑΘΗΜΑ ΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΑΝΑΣΟΛΙΜΟΤ ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΕ 2017 ΑΠΑΝΣΗΕΙ ΣΟ ΜΑΘΗΜΑ ΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΑΝΑΣΟΛΙΜΟΤ 16/06/2017 ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: ΑΝΔΡΙΑΝΗ ΠΑΡΑΧΗ ΘΕΜΑ Α A1. Δ Α2. Δ Α3. Β Α4. Γ Α5.Α ΘΕΜΑ Β Β1) I A II E III Σ IV Β V Ζ VI Γ VII Δ Β2) ε προκαρυωτικό γιατί

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου Κεφάλαιο: Κεφάλαια 1,2,4 Ονοματεπώνυμο Μαθητή: Ημερομηνία: 08/12/2018 Επιδιωκόμενος Στόχος: 75/100

Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου Κεφάλαιο: Κεφάλαια 1,2,4 Ονοματεπώνυμο Μαθητή: Ημερομηνία: 08/12/2018 Επιδιωκόμενος Στόχος: 75/100 Μάθημα/Τάξη: Βιολογία Προσανατολισμού Γ Λυκείου Κεφάλαιο: Κεφάλαια 1,2,4 Ονοματεπώνυμο Μαθητή: Ημερομηνία: 08/12/2018 Επιδιωκόμενος Στόχος: 75/100 ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στο τετράδιο σας τον αριθμό καθεμιάς

Διαβάστε περισσότερα

Διαγώνισμα Βιολογίας στα Κεφάλαια 1 έως 4 ΚΥΡΙΑΚΗ 7 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2014

Διαγώνισμα Βιολογίας στα Κεφάλαια 1 έως 4 ΚΥΡΙΑΚΗ 7 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2014 Διαγώνισμα Βιολογίας στα Κεφάλαια 1 έως 4 ΚΥΡΙΑΚΗ 7 ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΥ 2014 ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. β Α3. β Α4. β Α5. β ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ B B1. Ο όρος γονιδιακή έκφραση αναφέρεται συνήθως σε όλη τη διαδικασία με την οποία

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ 1ο Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1 έως 5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή τη φράση, η οποία

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΟΜΑΔΑΣ ΥΓΕΙΑΣ & ΖΩΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΟΜΑΔΑΣ ΥΓΕΙΑΣ & ΖΩΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΟΜΑΔΑΣ ΥΓΕΙΑΣ & ΖΩΗΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α. I, Β. IV, Γ. VI, Δ. VII, Ε. ΙΙ, ΣΤ. III, Ζ. V Β2. Αντιστοιχεί σε προκαρυωτικό οργανισμό. Στους προκαρυωτικούς

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 7,8,9

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 7,8,9 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΛΥΚΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΜΑΚΕΔΟΝΙΑΣ ΖΑΡΦΤΖΙΑΝ Μ. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΑ 7,8,9 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ - ΑΣΚΗΣΕΙΣ 1. Διαφορές κλειστής και συνεχούς καλλιέργειας (θρεπτικά, απομάκρυνση, φάσεις μικροοργανισμών)

Διαβάστε περισσότερα

Εξέλιξη και ανθρώπινος πολιτισμός: Η ρύθμιση του γονιδίου της λακτάσης

Εξέλιξη και ανθρώπινος πολιτισμός: Η ρύθμιση του γονιδίου της λακτάσης Εξέλιξη και ανθρώπινος πολιτισμός: Η ρύθμιση του γονιδίου της λακτάσης Η διατήρηση του ενζύμου της λακτάσης στους ενήλικες είναι ένα παράδειγμα πρόσφατης εξέλιξης στον άνθρωπο. Μας δείχνει επίσης πώς μεταλλαγές

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΛΥΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΛΥΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΕΣ ΛΥΣΕΙΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Α. 1. β 2. β 3. γ 4. β Β. Ζύμωση: Διαδικασία ανάπτυξης μικροοργανισμών σε υγρό θρεπτικό υλικό κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες Υβριδοποίηση:

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOY 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΘΕΜΑ Β Β1. Α I Β IV Γ VI

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2107 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΑ ΘΕΜΑΤΑ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ 2107 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ Α5. α ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ Β Β1. Ι: κωδική αλυσίδα (Δ) ΙΙ: μεταγραφόμενη αλυσίδα (Γ) ΙΙΙ: αμινομάδα (ΣΤ) ΙV: mrna (Β) V: RNA πολυμεράση (Ζ) VI: φωσφορική

Διαβάστε περισσότερα

φροντιστήρια Απαντήσεις Βιολογίας Γ λυκείου Προσανατολισμός Θετικών Σπουδών

φροντιστήρια   Απαντήσεις Βιολογίας Γ λυκείου Προσανατολισμός Θετικών Σπουδών Απαντήσεις Βιολογίας Γ λυκείου Προσανατολισμός Θετικών Σπουδών Θέμα Α Α1. α. 2 β. 1 γ. 4 δ. 1 ε. 2 Θέμα Β Β1. α. 1-Γ, 2-Γ, 3-Β, 4-Β, 5-Α, 6-B, 7-Α β. 1. Σύμπλοκο έναρξης πρωτεϊνοσύνθεσης: Το σύμπλοκο που

Διαβάστε περισσότερα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ν. ΜΑΓΝΗΣΙΑΣ ( Ε.Κ.Φ.Ε ) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Θέμα: ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΜΟΝΙΜΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ ΑΙΜΑΤΟΣ (άσκηση 4 του εργαστηριακού οδηγού) Μέσος χρόνος πειράματος:

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. α Α3. δ Α4. β Α5. α

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. α Α3. δ Α4. β Α5. α ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. α Α3. δ Α4. β Α5. α 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΤΕΤΑΡΤΗ 5 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2012 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ:

Διαβάστε περισσότερα

ιαγονιδιακή τεχνολογία G. Patrinos

ιαγονιδιακή τεχνολογία G. Patrinos ιαγονιδιακή τεχνολογία Αντίστροφη γενετική Οργανισμός Γονιδίωμα ιαγονίδιο Γονίδιο Forward genetics Επαγόμενη Οργανισμός μεταλλαξογένεση Μεταλλαγμένος οργανισμός Εύρεση και μελέτη του υπεύθυνου γονιδίου

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 10 ΤΟ ΟΠΕΡΟΝΙΟ (σελ )

Κεφάλαιο 10 ΤΟ ΟΠΕΡΟΝΙΟ (σελ ) Κεφάλαιο 10 ΤΟ ΟΠΕΡΟΝΙΟ (σελ. 387-417) Ένα ρυθμιστικό γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που δρα σε μια θέση-στόχο πάνω στο DNA και ρυθμίζει την έκφραση ενός άλλου γονιδίου. Στον αρνητικό έλεγχο, μία trans-δραστική

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2.

ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. γ Α3. α Α4. β Α5. β ΘΕΜΑ B B1. B2. ΘΕΜΑ Α Α1. γ (το πριμόσωμα) Α2. γ (οι υποκινητές και οι μεταγραφικοί παράγοντες κάθε γονιδίου) Α3. α (μεταφέρει ένα συγκεκριμένο αμινοξύ στο ριβόσωμα) Α4. β (αποδιάταξη των δύο συμπληρωματικών αλυσίδων)

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Κυριακή 9 Μαρτίου 2014

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Κυριακή 9 Μαρτίου 2014 ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΟ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ Κυριακή 9 Μαρτίου 2014 ΘΕΜΑ Α Α1. β, Α2. δ, Α3. γ, Α4. δ, Α5. γ. ΘΕΜΑ Β Β1. Σχολικό βιβλίο σελ. 90-91: «Το παράδειγμα της δρεπανοκυτταρικής

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΙΑΓΩΝΙΣΜΑ Θέµα 1 ο 1. Τα άτοµα που είναι ετερόζυγα για τη β-θαλασσαιµία: α. Εµφανίζουν ήπια αναιµία β. Έχουν ευαισθησία στην ελονοσία γ. Συνθέτουν µεγάλη ποσότητα HbF δ.

Διαβάστε περισσότερα

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Περετσή Χριστίνα Πιτσικάλη Παναγιώτα

ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Περετσή Χριστίνα Πιτσικάλη Παναγιώτα Εργασία στη Βιολογία ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Περετσή Χριστίνα Πιτσικάλη Παναγιώτα ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΤΟΥ DNA Η ροή της πληροφορίας για το σχηματισμό των πρωτεϊνών, προϋποθέτει τη μεταφορά της από το DNA στο RNA (ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ).

Διαβάστε περισσότερα

Ποιες είναι οι ομοιότητες και οι διαφορές μεταξύ της αντιγραφής και της

Ποιες είναι οι ομοιότητες και οι διαφορές μεταξύ της αντιγραφής και της ΚΕΦ. 2 ο ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΡΙΣΕΩΣ Ποιες είναι οι ομοιότητες και οι διαφορές μεταξύ της αντιγραφής και της μεταγραφής; Διαφορές Αντιγραφή Μεταγραφή 1. Διατηρείται και μεταβιβάζεται η 1. Μεταβιβάζεται η γενετική

Διαβάστε περισσότερα

ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2018

ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2018 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΠΟΥ ΥΠΗΡΕΤΟΥΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2018 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. δ

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΑΛΛΑΓΩΝ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ASS1 ΚΑΙ NOS2A ΣΤΗΝ ΑΥΞΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΗΣ ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΕΛΛΗΝΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ Β-ΜΕΣΟΓΕΙΑΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Απαντήσεις στα θέματα των Εισαγωγικών Εξετάσεων τέκνων Ελλήνων του Εξωτερικού και τέκνων Ελλήνων Υπαλλήλων στο εξωτερικό 2013 ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. β Α3. δ Α4. α Α5. δ ΘΕΜΑ Β Β1.

Διαβάστε περισσότερα

Β1. Β2. ΘΕΜΑ 2ο 1. 2.

Β1. Β2. ΘΕΜΑ 2ο 1. 2. 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 20 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2002 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: BΙΟΛΟΓΙΑ (ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ) ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ 1ο Α1.

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο. 1. γ 2. γ 3. δ 4. α 5. β

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο. 1. γ 2. γ 3. δ 4. α 5. β ΑΠΟΛΥΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΑΙ ΠΑΝΕΛΛΑ ΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΕΠΑΛ (ΟΜΑ Α Β ) ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 22 ΜΑΪΟΥ 2009 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ 1ο 1. γ 2. γ 3.

Διαβάστε περισσότερα

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ)

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ) ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ) «Οι σύγχρονες τεχνικές βιο-ανάλυσης στην υγεία, τη γεωργία, το περιβάλλον και τη διατροφή» Η κυκλοφορία του αίματος και

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΜΑ 1ο Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις 1 έως 5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή τη φράση, η οποία

Διαβάστε περισσότερα

Εισαγωγή στη Γενετική και στη Γονιδιωματική Τι είναι η κληρονομικότητα, και πώς μεταβιβάζεται η πληροφορία από γενιά σε γενιά;

Εισαγωγή στη Γενετική και στη Γονιδιωματική Τι είναι η κληρονομικότητα, και πώς μεταβιβάζεται η πληροφορία από γενιά σε γενιά; ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΘΡΩΠΟΛΟΓΙΑ 12 26/10/2016 Κεφάλαιο 3 Α μέρος Εισαγωγή στη Γενετική και στη Γονιδιωματική Τι είναι η κληρονομικότητα, και πώς μεταβιβάζεται η πληροφορία από γενιά σε γενιά; Ποια είναι η δομή

Διαβάστε περισσότερα

Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Θετικής Κατεύθυνσης των Εσπερινών Γενικών Λυκείων.

Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Θετικής Κατεύθυνσης των Εσπερινών Γενικών Λυκείων. Αθήνα, 27/05/2016 ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΕΝΩΣΗ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Θετικής Κατεύθυνσης των Εσπερινών Γενικών Λυκείων. Η Επιτροπή Παιδείας

Διαβάστε περισσότερα

Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ÏÅÖÅ

Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ÏÅÖÅ 1 Γ' ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΜΑ 1 ο Α. 1 - Γ 2 - Β 3-4 - Γ 5 - Β. 1 - Σ 2 - Λ 3 - Λ 4 - Λ 5 - Σ ΘΕΜΑ 2 ο ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ 1. Κάθε είδος αντισώµατος που αναγνωρίζει έναν αντιγονικό καθοριστή παράγεται

Διαβάστε περισσότερα

Προτεινόμενες λύσεις ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 16/6/17

Προτεινόμενες λύσεις ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 16/6/17 Πανελλήνιες 2017 Προτεινόμενες λύσεις ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ 16/6/17 ΘΕΜΑ Α Α1. δ Α2. δ Α3. β Α4. γ ΘΕΜΑ Β Β1. Ι-Α ΙΙ-Ε ΙΙΙ-ΣΤ ΙV-Β V-Ζ VI-Γ VII-Δ Β2. Η εικόνα 1 αντιστοιχεί σε Προκαρυωτικό κύτταρο.

Διαβάστε περισσότερα

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων

Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων. Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014. Απαντήσεις Θεμάτων Πανελλήνιες Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων Εξεταζόμενο Μάθημα: Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης, Ημ/νία: 04 Ιουνίου 2014 Απαντήσεις Θεμάτων ΘΕΜΑ Α A1. Τα πλασμίδια είναι: δ. κυκλικά δίκλωνα μόρια DNA

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ // Γ γ ΙΑΤΡ λυκείου Γ ΘΕΤ2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 29/12/

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ // Γ γ ΙΑΤΡ λυκείου Γ ΘΕΤ2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 29/12/ ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ // Γ γ ΙΑΤΡ λυκείου Γ ΘΕΤ2 ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 29/12/2015 29 12 2016 ΘΕΜΑ 1 ο Επιλέξτε τη σωστή απάντηση που συμπληρώνει τις παρακάτω προτάσεις: 1. Η περιοριστική

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦ. 6 ο ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦ. 6 ο ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΚΕΦ. 6 ο ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ Μεταλλάξεις είναι οι αλλαγές στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων που συμβαίνουν στο γενετικό υλικό ενός οργανισμού τόσο σε γονιδιακό επίπεδο (γονιδιακές μεταλλάξεις)

Διαβάστε περισσότερα

Θετικών Σπουδών. Ενδεικτικές απαντήσεις θεμάτων

Θετικών Σπουδών. Ενδεικτικές απαντήσεις θεμάτων Πανελλαδικές Εξετάσεις Ημερήσιων Γενικών Λυκείων Εξεταζόμενο μάθημα: Βιολογία Προσανατολισμού Θετικών Σπουδών Παρασκευή, 16 Ιουνίου 2017 Ενδεικτικές απαντήσεις θεμάτων Θέμα Α Α1. α) 3 CAT 5 β) 3 TAC 5

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς προτάσεις Α1 έως Α5 και δίπλα το γράμμα που αντιστοιχεί στη λέξη ή φράση, η οποία συμπληρώνει σωστά

Διαβάστε περισσότερα

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΘΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 26/01/2014

ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΘΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 26/01/2014 ΜΑΘΗΜΑ / ΤΑΞΗ : ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΣΕΙΡΑ: ΘΕΡΙΝΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: 26/01/2014 ΘΕΜΑ 1 Ο Να επιλέξετε την φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: 1. Αλλαγές στην ποσότητα

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ 1 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΕΜΠΤΗ 11 ΙΟΥΝΙΟΥ 2015 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. α Α4. γ Α5. δ ΘΕΜΑ Β Β1.

Διαβάστε περισσότερα

Βιολογία ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ B

Βιολογία ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ B Βιολογία προσανατολισμού Α. 1. β 2. γ 3. δ 4. γ 5. δ ΘΕΜΑ Α B1. 4,1,2,6,8,3,5,7 ΘΕΜΑ B B2. Σχολικό βιβλίο σελ. 103 Η γενετική καθοδήγηση είναι.υγιών απογόνων. Σχολικό βιβλίο σελ. 103 Παρ ότι γενετική καθοδήγηση

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. β 3. α 4. α 5. β

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. β 3. α 4. α 5. β ΘΕΜΑ 1ο 1. β 2. β 3. α 4. α 5. β 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΤΡΙΤΗ 21 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2004 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: BΙΟΛΟΓΙΑ (ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ)

Διαβάστε περισσότερα

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ

ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ ΙΑΤΡΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ (ΕΚΠΑ) ΚΑΤΑΤΑΚΤΗΡΙΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΚ.ΕΤΟΥΣ 2015-2016 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΧΗΜΕΙΑ 1)Πώς το φαινόμενο Bohr επηρεάζει την πρόσδεση οξυγόνου στην αιμοσφαιρίνη; Που συνδέονται τα ιόντα

Διαβάστε περισσότερα

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 23 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ

ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 23 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ 1 ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΕΣ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Δ ΤΑΞΗΣ ΕΣΠΕΡΙΝΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΔΕΥΤΕΡΑ 23 ΙΟΥΝΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ ΘΕΜΑ Α Α1. γ Α2. β Α3. γ Α4. δ Α5. α ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Β Β1. Σχολικό

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOΥ 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOΥ 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 IOYNIOΥ 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθμό καθεμιάς από τις παρακάτω ημιτελείς

Διαβάστε περισσότερα

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ, ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ EIKONA 2.1 Ημισυντηρητικός μηχανισμός αντιγραφής του DNA 1. Να γράψετε τα ένζυμα που (α) προκαλούν ξετύλιγμα των αλυσίδων του αρχικού (μητρικού μορίου) DNA και (β) συνθέτουν τις νέες αλυσίδες του DNA.

Διαβάστε περισσότερα

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΣΧΟΛΙΚΟ ΕΓΧΕΙΡΙΔΙΟ

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΣΧΟΛΙΚΟ ΕΓΧΕΙΡΙΔΙΟ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΣΧΟΛΙΚΟ ΕΓΧΕΙΡΙΔΙΟ ΤΡΟΠΟΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΥΝΕΠΕΙΕΣ ΕΙΔΟΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ Οικογενή υπερχοληστερολαιμία Αυτοσωμική επικρατής κληρονομικότητα Σχετίζεται με αυξημένο

Διαβάστε περισσότερα

Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις:

Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΟΜΑΔΑΣ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ 04/11/2018 Νότα Λαζαράκη Αλέξανδρος Παπαγιαννακόπουλος ΘΕΜΑ Α Να επιλέξετε τη φράση που συμπληρώνει ορθά κάθε μία από τις ακόλουθες προτάσεις: Α1. Σε ένα

Διαβάστε περισσότερα

ΟΜΟΣΠΟΝ ΙΑ ΕΚΠΑΙ ΕΥΤΙΚΩΝ ΦΡΟΝΤΙΣΤΩΝ ΕΛΛΑ ΟΣ (Ο.Ε.Φ.Ε.) ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ 2013 ÁÍÅËÉÎÇ

ΟΜΟΣΠΟΝ ΙΑ ΕΚΠΑΙ ΕΥΤΙΚΩΝ ΦΡΟΝΤΙΣΤΩΝ ΕΛΛΑ ΟΣ (Ο.Ε.Φ.Ε.) ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ 2013 ÁÍÅËÉÎÇ ΤΑΞΗ: ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΜΑΘΗΜΑ: Γ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Ηµεροµηνία: Κυριακή 28 Απριλίου 2013 ιάρκεια Εξέτασης: 3 ώρες ΕΚΦΩΝΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Να γράψετε στο τετράδιό σας τον αριθµό καθεµιάς από τις παρακάτω

Διαβάστε περισσότερα

Κεφάλαιο 6: Μεταλλάξεις

Κεφάλαιο 6: Μεταλλάξεις Κεφάλαιο 6: Μεταλλάξεις ΕΛΕΓΧΟΣ ΓΝΩΣΕΩΝ 1. Τι ονομάζονται μεταλλάξεις και ποια τα κυριότερα είδη τους; 2. Ποιες οι διαφορές μεταξύ γονιδιακών και χρωμοσωμικών μεταλλάξεων; 3. Οι μεταλλάξεις στα σωματικά

Διαβάστε περισσότερα

ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Β ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Α1. β. Α2. γ. Α3. δ. Α4. γ. Α5. β Β1. 5, 4, 2, 1, 3. Β2. Τα δομικά μέρη του οπερονίου της λακτόζης είναι κατά σειρά τα εξής:

ΘΕΜΑ Α ΘΕΜΑ Β ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. Α1. β. Α2. γ. Α3. δ. Α4. γ. Α5. β Β1. 5, 4, 2, 1, 3. Β2. Τα δομικά μέρη του οπερονίου της λακτόζης είναι κατά σειρά τα εξής: ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΔΕΥΤΕΡΑ 10 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2014 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΘΕΜΑ Α Α1. β Α2. γ Α3. δ Α4. γ Α5. β ΘΕΜΑ

Διαβάστε περισσότερα

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο 1. γ 2. γ 3. β 4. α 5. δ

ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ. ΘΕΜΑ 1ο 1. γ 2. γ 3. β 4. α 5. δ ΘΕΜΑ 1ο 1. γ 2. γ 3. β 4. α 5. δ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΕΚΝΩΝ ΕΛΛΗΝΩΝ ΥΠΑΛΛΗΛΩΝ ΣΤΟ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟ ΤΕΤΑΡΤΗ 9 ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΥ 2009 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ: ΒΙΟΛΟΓΙΑ

Διαβάστε περισσότερα

Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Θετικής Κατεύθυνσης των Εσπερινών Γενικών Λυκείων.

Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Θετικής Κατεύθυνσης των Εσπερινών Γενικών Λυκείων. Αθήνα, 27/05/2016 ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΑ ΕΝΩΣΗ ΒΙΟΕΠΙΣΤΗΜΟΝΩΝ Σας αποστέλλουμε τις προτεινόμενες απαντήσεις που αφορούν τα θέματα της Βιολογίας Θετικής Κατεύθυνσης των Εσπερινών Γενικών Λυκείων. Η Επιτροπή Παιδείας

Διαβάστε περισσότερα

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 ΙΟΥΝΙΟΥ 2017

ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 ΙΟΥΝΙΟΥ 2017 Σ ε λ ί δ α 1 ΠΑΝΕΛΛΑΔΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Γ ΤΑΞΗΣ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ 16 ΙΟΥΝΙΟΥ 2017 ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΟ ΜΑΘΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΣΑΝΑΤΟΛΙΣΜΟΥ ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: ΛΑΜΠΡΙΝΗ ΓΑΒΡΙΗΛ ΘΕΜΑ Α Α1.

Διαβάστε περισσότερα