Λειτουργική γονιδιωµατική ΜΠΣ2. Γρ. Αµούτζιας

Transcript

1 Λειτουργική γονιδιωµατική ΜΠΣ2 Γρ. Αµούτζιας

2 Λειτ. Γονιδιωµατική Λειτουργική γονιδιωµατική: Τι είναι Προσπαθεί να κατανοήσει τις λειτουργίες των βιολογικών µορίων, σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώµατος. Γίνονται µετρήσεις για το σύνολο των γονιδίων, σε µια συγκεκριµένη στιγµή ή κατάσταση. Αρχικά, οι µετρήσεις γίνονταν για ένα βιοµόριο. Σήµερα µελετάµε την συµπεριφορά ολόκληρου του συστήµατος. Η µελέτη της µεταγραφής του συνόλου των γονιδίων ονοµάζεται µεταγραφωµατική ή transcriptomics.

3 Λειτ. Γονιδιωµατική Transcriptomics Expressed sequence tags (ESTs) Serial analysis of gene expression (SAGE) Μικροσυστοιχίες (microarrays) RNA-seq (whole transcriptome shotgun sequencing)

4 mrna abundance ratios versus protein-abundance ratios. Griffin T J et al. Mol Cell Proteomics 2002;1:

5 Λειτ. Γονιδιωµατική Expressed sequence tags (ESTs)

6 Λειτ. Γονιδιωµατική Expressed sequence tags (ESTs) To cdna κλωνοποιείται σε φορείς (vectors) και δηµιουργείται µια βιβλιοθήκη. Από την βιβλιοθήκη, επιλέγονται τυχαία κλώνοι για αλληλούχιση. Η αλληλούχιση ξεκινάει είτε από το 5 ή το 3 άκρο του cdna. Τα παραγώµενα ESTs έχουν µήκος νουκλεοτίδια.

7 Λειτ. Γονιδιωµατική Expressed sequence tags (ESTs) Η συχνότητα των διαφόρων ESTs που αντιστοιχούν σε ένα γονίδιο αντικατοπτρίζει σε κάποιο βαθµό το επίπεδο της µεταγραφής του γονιδίου. Χαµηλά εκφρασµένα γονίδια συνήθως δεν ανιχνεύονται µε την µέθοδο των ESTs. Κυρίως ανιχνεύονται υψηλά εκφρασµένα γονίδια. Οι ακολουθίες των ESTs είναι χαµηλής ποιότητας και µπορεί να εµπεριέχουν λάθη (λάθος νουκλεοτίδια, µετακίνηση αναγνωστικού πλαισίου, λάθος κωδικόνια τερµατισµού, χιµαιρικοί κλώνοι). Αν και τα επιµέρους ESTs µπορεί να εµπεριέχουν λάθη, µια συλλογή από αλληλο-επικαλυπτόµενα ESTs επιτρέπει την διόρθωση λαθών και ίσως και την ανακατασκευή της ακολουθίας ολόκληρου του cdna. Παρ όλα τα προβλήµατα, τα ESTs χρησιµοποιούνται συχνά, λόγω της ευκολίας που δηµιουργούνται οι βιβλιοθήκες σε διάφορες συνθήκες. Επιτρέπουν την ανίχνευση νέων γονιδίων.

8 Λειτ. Γονιδιωµατική Expressed sequence tags (ESTs) Κατάθεση των δεδοµένων στην ΒΔ: NCBI: dbest (1992)

9 Λειτ. Γονιδιωµατική Expressed sequence tags (ESTs) Οι ακολουθίες: φιλτράρονται. Οµαδοποιούνται και τυχόν λάθη διορθώνονται -> EST contigs. Εντοπίζονται οι περιοχές που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη µε αλγόριθµους πρόβλεψης γονιδίων. Η προβλεπόµενη πρωτεΐνη επιτρέπει την αναζήτηση οµολόγων σε ΒΔ και την πρόβλεψη της λειτουργίας. Αν είναι διαθέσιµο το γονιδίωµα, τότε τα ESTs βοηθούν στην ανίχνευση γονιδίων και στον καθορισµό των ορίων µεταξύ ιντρονίων-εξονίων.

10 Λειτ. Γονιδιωµατική Expressed sequence tags (ESTs) Unigene Κάθε οµάδα ESTs είναι αλληλοεπικαλυπτόµενα ESTs που αντιπροσωπεύουν ένα συγκεκριµµένο γονίδιο

11 Unigene Λειτ. Γονιδιωµατική

12 Unigene Λειτ. Γονιδιωµατική

13 Unigene Λειτ. Γονιδιωµατική

14 Unigene Λειτ. Γονιδιωµατική

15 Λειτ. Γονιδιωµατική Unigene Οι βιβλιοθήκες είναι οργανωµένες στο library browser

16 Λειτ. Γονιδιωµατική Digital differential display Συγκρίνει οµάδες βιβλιοθηκών ESTs µεταξύ τους και βρίσκει ποιά γονίδια είναι περισσότερο εκφρασµένα στην κάθε µια από τις βιβλιοθήκες. Η σύγκριση γίνεται µε Fisher s exact test. Για να γίνουν οι συγκρίσεις, θα πρέπει ο αριθµός των ESTs που αντιστοιχούν σε ένα γονίδιο, για την κάθε βιβλιοθήκη, να ξεπερνάει ένα κατώφλι, αλλιώς δεν µπορούν να φανούν οι διαφορές. Οι συγκρίσεις µπορούν να αποκαλύψουν γονίδια που παίζουν σηµαντικό ρόλο σε κάποιο ιστό ή περιβαλλοντική κατάσταση ή ασθένεια.

17 Digital differential display Λειτ. Γονιδιωµατική

18 Microarrays

19 Microarrays Chips ή αντικειµενοφόροι πλάκες που µετράνε την γονιδιακή έκφραση (και όχι µόνο). Δεν µετράνε απόλυτες τιµές συγκεντρώσεων µεταγραφηµάτων. Μετράνε σχετικές αλλαγές. Για µια συνθήκη, πόσο πιο αυξηµένη ή µειωµένη είναι η έκφραση ενός γονιδίου, σε σχέση µε µια άλλη συνθήκη. Π.χ. Πόσο πιο αυξηµένη/µειωµένη είναι η έκφραση ενός γονιδίου Α µετά από άσκηση (control: αµέσως πριν την άσκηση). Δεν µπορούµε να συγκρίνουµε το γονίδιο Α µε το γονίδιο Β Στο Chip υπάρχουν για το κάθε µεταγράφηµα: cdnas ολόκληρου του µεταγραφώµατος (spotting) (PCR) ολιγοµερή (τα λεγόµενα oligo-probes), µε µήκος βάσεις. Spotting In situ synthesis

20 Σχετικές διαφορές relative measurement 2 COLORS (Cy5 / Cy3) absolute measurement 1 COLOR ( Cy3 )

21 Σχετικές διαφορές intensity Highly expressed genes, highly differentially expressed Low expressed, genes slightly differentially expressed gene a gene b gene c

22 Πρόγονοι των microarrays Southern blot (DNA - DNA) (Ed Southern) Ελέγχει για την παρουσία µιας συγκεκριµένης DNA ακολουθίας σε ένα δείγµα

23 Όλιγο-Μικροσυστοιχίες (oligo-microarrays) Chip στο οποίο υπάρχουν DNA ολιγοµερή (τα λεγόµενα probes), µε µήκος βάσεις που αντιπροσωπεύουν το γονιδίωµα ενός οργανισµού. Περισσότερα από ένα διαφορετικά probes µπορεί να υπάρχουν για ένα γονίδιο. Πάνω σε αυτά τα probes υβριδίζονται τα συµπληρωµατικά τους cdnas. Το κάθε cdna είναι συνδεδεµένο µε φθορίζουσα χρωστική. Κάθε κηλίδα (spot) στο chip αντιστοιχεί σε ένα συγκεκριµµένο είδος probes. Η ένταση της φθορίζουσας χρωστικής υποδηλώνει την ένταση µε την οποία εκφράζεται το mrna για τον αντίστοιχο probe.

24 Τι µπορούν να ελέγξουν Έκφραση mrna. Έκφραση micro-rna. CGH (comparative genomic hybridization). SNPs. DNA µεθυλίωση. ChIP-on-chip.

25 Τα βήµατα

26 Μικροσυστοιχίες (microarrays) Με δύο χρώµατα (πράσινο/κόκκινο) Το ένα χρώµα είναι για µια συγκεκριµµένη συνθήκη και το άλλο χρώµα για µια άλλη (συνήθως control). Εξάγεται το ολικό RNA για την κάθε συνθήκη. Ελέγχεται η ποσότητα και ποιότητα του RNA. Γίνεται σήµανση του κάθε δείγµατος RNA µε συγκεκριµµένη χρωστική (π.χ. Cy5:red - Cy3:green). Τα 2 δείγµατα αναµιγνύονται και το µίγµα υπόκειται σε υβριδισµό πάνω στο chip. Μετριέται η ένταση της κάθε µιας από τις 2 χρωστικές, για κάθε κηλίδα. Υπολογίζεται ο λόγος των εντάσεων των 2 χρωστικών, στην κάθε κηλίδα.

27 Μικροσυστοιχίες

28 Μικροσυστοιχίες (microarrays) Αν το γονίδιο εκφράζεται περισσότερο στην Α συνθήκη (κόκκινη χρωστική) από ότι στην control (πράσινη χρωστική), τότε ο λόγος συνθήκη_α/control (κόκκινη/πράσινη) θα είναι λ>1, αλλιώς σε αντίθετη περίπτωση 0<λ<1. Αν το γονίδιο εκφράζεται µε διπλάσια ένταση στην συνθήκη Α, σε σχέση µε την συνθήκη control, τότε ο λόγος θα είναι λ=2. Αν το γονίδιο εκφράζεται µε τη µισή ένταση στην συνθήκη Α, σε σχέση µε την συνθήκη control, τότε ο λόγος θα είναι λ=0.5. Μετατρέποντας τους λόγους σε log 2, έχουµε: λ=2 -> log 2 λ=1 λ=0.5 -> log 2 λ=-1 Με την κανονικοποίηση σε log 2 τα δεδοµένα γίνονται συµµετρικά.

29 Μικροσυστοιχίες (microarrays) Πότε θεωρούµε ότι ένα γονίδιο υπερ/υπό-εκφράζεται σε µια συγκεκριµµένη συνθήκη. Log 2 λ > 1 ή Log 2 λ < -1 (διπλάσια/υποδιπλάσια έκφραση σε σχέση µε τη συνθήκη control). Με στατιστικές µεθόδους (t-test, ANOVA).

30 microarrays Κατανοµή των σηµάτων. Μετατροπή - κανονικοποίηση των σηµάτων. Λόγος των 2 σηµάτων Ένταση συνολικού σήµατος

31 Οµαδοποίηση γονιδίων µε την ίδια συµπεριφορά. Χρειαζόµαστε αρκετά σηµεία (διαφορετικές συνθήκες ή χρονικές στιγµές) Με µεθόδους αποστάσεων, όπου οι µετρήσεις ενός γονιδίου για διαφορετικές συνθήκες αποτελούν ένα διάνυσµα. Υπολογίζουµε αποστάσεις µεταξύ διαφορετικών διανυσµάτων (γονιδίων). Ευκλείδια απόσταση Συντελεστής συσχέτισης Pearson (Pearson correlation coefficient). Δηµιουργείται πίνακας αποστάσεων µεταξύ των γονιδίων. Το αντίστοιχο µπορεί να γίνει και για να οµαδοποιήσουµε κοινές συνθήκες.

32 Μικροσυστοιχίες

33 Μήκος των probes Affymetrix: 25mer Agilent: 60mer Illumina: 50mer Όσο µεγαλύτερο το probe, τόσο πιο ευαίσθητο (µπορεί να ανιχνεύσει targets σε µικρότερες συγκεντρώσεις). Όµως, µεγαλύτερο probe µπορεί και να ανεχτεί περισσότερους πολυµορφισµούς (ή mismatches).

34 Υβριδισµός των probes

35 Probes & chips

36 Σχεδιασµός των probes Θα πρέπει η ακολουθία τους να είναι µοναδική ώστε να αντικατοπτρίζει την έκφραση για το γονίδιο που σχεδιάστηκαν. Όλοι οι probes θα πρέπει να έχουν παρόµοια Tm (βέλτιστη θερµοκρασία υβριδισµού). Τα probes δεν θα πρέπει να σχηµατίζουν δευτεροταγείς δοµές που τα εµποδίζουν να υβριδιστούν µε τον στόχο.

37 spots

38 Array Spotting Με βελόνες (pins) (απώθεση έτοιµων cdnas ή oligos ). Με inkjet (Agilent: spin-off της Hewlett-Packard) (in situ synthesized oligos)

39 spotting pin quality decline after delivery of 5x105 spots after delivery of 3x105 spots H. Sueltmann DKFZ/MGA

40 Inkjet printing - Agilent

41 Φωτολιθογραφία - Affymetrix Youtube: Affymetrix: downloads/student_manual_activities/activity3/ activity3_manufacturing_background.pdf

42 Φωτολιθογραφία

43 Φωτολιθογραφία

44 Φωτολιθογραφία

45 Φωτολιθογραφία

46 Φωτολιθογραφία

47 Feature

48 Agilent chips

49 Agilent chips 244k 1M k 400k 44k 180k 15k 60k LEGACY HD

50 Agilent platform Φούρνος υβριδισµού Laser Scanner

51 Affymetrix Arrays/strips/plates

52 Affymetrix platform

53 Affymetrix platforms

54 Έλεγχος Ποσότητας/Ποιότητας ολικού RNA Nanodrop (φωτόµετρο που χρησιµοποιεί ελάχιστο όγκο δείγµατος - 1λ) για ακριβής ποσοστικοποίηση. A260 nm -> νουκλεοτίδια, RNA, ssdna, dsdna A280 nm -> πρωτεΐνες, φαινόλες κ.α. A230 nm -> EDTA, φαινόλες, υδατάνθρακες. Α260/Α280 nm ~ /230 nm ~ 2-2.2

55 Έλεγχος Ποσότητας/Ποιότητας ολικού RNA Agilent 2100 Bioanalyzer για έλεγχο ποιότητας του RNA (τυχόν αποδόµιση). (~ ) Ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδή Λόγος 28S/18S rrna 2:1 RNA integrity number (RIN)

56 Έλεγχος Ποσότητας/Ποιότητας ολικού RNA

57 Υβριδισµός Όλα τα probes υβριδίζονται στην ίδια θερµοκρασία. Όµως, όλα τα probes δεν έχουν την ίδια βέλτιστη θερµοκρασία υβριδισµού. Άρα, υπάρχουν προβλήµατα για επιµέρους probes Φούρνος υβριδισµού του Affymetrix GeneAtlas

58 Υβριδισµός

59 Laser scanning Agilent autofocus

60 Μέτρηση σήµατος στα spots

61 Συνένωση των σηµάτων

62 Ποιότητα των spots

63 Microarray Quality control

64 Ανάλυση προβληµατικών Spots

65 Υπολογισµός & αφαίρεση θορύβου υποβάθρου

66 Παράγοντες που επηρεάζουν τα microarrays Περιβαλλοντικοί Όζον Υγρασία Υπεριώδης ακτινοβολία Στατικός ηλεκτρισµός Μόλυνση της ατµόσφαιρας (οξειδωτικοί παράγοντες). Σκόνη (µπορεί να επηρεάσει τις µετρήσεις του Laser) Πούδρα από τα γάντια. Ενδογενείς Πρόβληµα σε κάποιο βήµα των χηµικών αντιδράσεων. Ο τύπος του ιστού. Dye swap για να αποκλείσουµε παράγοντες που πιθανών επηρεάσαν το πείραµα

67 Microarrays & Ozone Η χρωστική Cy5(red) είναι συνήθως πιο ασταθής σε σχέση µε τη χρωστική Cy3(green). Το όζον µπορεί να προκαλέσει περισσότερη αστάθεια της Cy5. Σε ένα πείραµα που το control χρωµατίστηκε µε Cy5 και το δείγµα µε Cy3, αν υποθέσουµε ότι το όζον προκάλεσε την αποδόµιση του Cy5, τότε περιµένουµε να δούµε (από λάθος) τα γονίδια του δείγµατος να: A) υπερεκφράζονται σε σχέση µε το control? B) υποεκφράζονται σε σχέση µε το control?

68 Microarrays & ozone

69 Microarrays & ozone

70 Ανάλυση δεδοµένων

71 Μετατροπή έντασης σήµατος σε log2

72 Μετατροπή έντασης σήµατος σε log2

73 Μετατροπή έντασης σήµατος σε log2

74 Κανονικοποίηση δεδοµένων Η κανονικοποίηση προσπαθεί να ελαχιστοποιήσει/εξαλείψει τον πειραματικό συστηματικό θόρυβο/διακύμανση, ώστε να αποκαλυφθούν οι διαφορές που έχουν βιολογική βάση.a Η κανονικοποίηση αυτού του είδους δεν πρέπει να συγχέεται με την κανονικοποίηση στις κανονικές κατανομές.a

75 Πηγές Πειραματικών συστηματικών λαθώνa Διακυμάνσεις μεταξύ πειραματικών επαναλήψεωνa SlidesA Συνθήκες υβριδισμούa ScanningA Διαφορετικοί άνθρωποι μπορεί να δουλεύουν με διαφορετικά slides A ΧρωστικέςA Το φως και η ζέστη μπορεί να επηρεάσουν με διαφορετικό τρόπο την αποτελεσματικότητα ενσωμάτωσης της κάθε χρωστικής.a Διαφορές στην συνολική ποσότητα επισημασμένου cdna μεταξύ των δύο καναλιών/χρωστικών.a

76 Slide 1 Cy3 Cy5 Slide 2 Cy3 Cy5 maximum Q3=75 th percentile median Q1=25 th percentile minimum

77 Κανονικοποίηση κλίµακας Scale normalization Data after Median Centering and Scale Normalizing

78 Συστηµατικό λάθος στην χρώση Στο παράδειγµα, η πράσινη χρωστική δεν δουλεύει σωστά για µεγάλες τιµές έντασης Slide 1 Log Signal Means after Median Centering and Scaling All Channels M vs. A Plot of the Logged, Centered, and Scaled Slide 1 Data Log Red M = Log Red - Log Green Log Green A = (Log Green + Log Red) / 2

79 Κανονικοποίηση µε Lowess Lowess για κανονικοποίηση συστηµατικών λαθών που σχετίζονται µε την ένταση της χρωστικής LOcally WEighted polynomial regression. (2002. Nucleic Acids Research, 30, 4 e15)

80 Gene expression normalization Transcriptional amplification Normalization and Interpretation of Expression Data. : Cell, Volume 151, Issue 3, Pages Revisiting Global Gene Expression Analysis

81 Κατάθεση των δεδοµένων MIAME (minimum information about a microarray experiment) (αναπτύχθηκε στο EBI). Πληροφορίες σχετικά µε το πως έγινε το πείραµα, τι πλατφόρµα/ συνθήκες χρησιµοποιήθηκαν. Πολλά περιοδικά απαιτούν πριν την δηµοσίευση να έχουν κατατεθεί τα πειραµατικά δεδοµένα σε µια Β.Δ. µε ελεύθερη πρόσβαση. Βάσεις δεδοµένων ArrayExpress (EBI) Gene expression omnibus (GEO) (USA) Center for information biology gene expression database (CIBEX) (Ιαπωνία)

82 mrna abundance ratios versus protein-abundance ratios. Griffin T J et al. Mol Cell Proteomics 2002;1:

83 Οντολογίες Ελεγχόµενο λεξιλόγιο για την περιγραφή των ιδιοτήτων των γονιδίων και των πρωτεϊνών. Περιγράφουν: Μοριακές λειτουργίες του βιοµορίου (1 ή περισσότερες). Βιολογικές διαδικασίες στις οποίες εµπλέκεται το βιοµόριο (1 ή περισσότερες). Κυτταρικό διαµέρισµα στο οποίο συναντάται το βιοµόριο (1 ή περισσότερα).

84 Gene ontology

85 Οντολογίες: Η δοµή τους Δείχνει τις σχέσεις µεταξύ των διαφορετικών όρων. Ένας όρος µπορεί να αποτελεί πιο εξειδικευµένη περιγραφή ενός άλλου όρου. Είναι κατευθυνόµενα ακυκλικά γραφήµατα (DAG). Παρόµοια µε ιεραρχίες. Η διαφορά είναι ότι ένας κόµβος-απόγονος µπορεί να έχει περισσότερους από έναν προγόνους.

86 Οντολογίες: Η δοµή τους Θεωρούµε ότι αν σε ένα βιοµόριο αντιστοιχεί ένα όρος-οντολογία, τότε σε αυτό το βιοµόριο ανήκουν και όλοι οι πρόγονοι του όρου-οντολογίας.

87 Gene ontology

88 Gene ontology

89 Gene ontology

90 Gene ontology

91 Οντολογίες: στατιστική ανάλυση Παράδειγµα: 1 γονιδίωµα µε γονίδια γονίδια εµπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο (GO_term: cell-cycle). (10% του γονιδιώµατος). Αν επιλέξουµε τυχαία έναν αριθµό Χ γονιδίων, θα περιµέναµε (από τύχη) περίπου το 10% (µε κάποιες διακυµάνσεις) να έχουν τον όρο κυτταρικός κύκλος. Η τυχαία διακύµανση εξαρτάται από τον αριθµό των γονιδίων. Έστω ότι µε τα microarrays σε ένα πείραµα βρήκαµε ότι Χ αριθµός γονιδίων υπερεκφράζονται. Σε αυτό τον Χ αριθµό, βρήκαµε ότι 20% των γονιδίων ανήκουν στον κυτταρικό κύκλο. Αυτή η απόκλιση (20% παρατηρούµενο - 10% αναµενόµενο) είναι στα όρια των τυχαίων διακυµάνσεων, ή είναι στατιστικά σηµαντική? Στατιστικά σηµαντική, σηµαίνει ότι τα υπερεκφρασµένα γονίδια είναι εµπλουτισµένα για την κατηγορία κυτταρικός κύκλος. Δηλαδή, ο κυτταρικός κύκλος εµπλέκεται στην διαδικασία που µελετάµε.

92 Οντολογίες: στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση γίνεται µε το υπεργεωµετρικό τεστ. Παίρνουµε ένα p-value. Αν p-value < 0.05, τότε είναι στατιστικά σηµαντικό. Αν στις οντολογίες µας είχαµε 100 όρους, θα επαναλαµβάναµε τα παραπάνω τεστς για τον κάθε όρο. Όµως, όσο περισσότερα τεστ κάνουµε για το πείραµά µας, τόσο αυξάνει ή πιθανότητα να βρούµε κάτι στατιστικά σηµαντικό (p-value < 0.05) καθαρά από λάθος. Άρα, πρέπει να λάβουµε υπόψην µας πόσα τεστ διενεργούµε και να διορθώσουµε τα p-values (multiple testing correction). False discovery rate (Benjamini-Hochberger) Bonferroni correction

93 Μοριακά µονοπάτια και πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις Οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν µεταξύ τους και δηµιουργούν σύµπλοκα Πρόσκαιρα (π.χ. Μεταγωγή σήµατος/κινάσες) Σταθερά Τα σύµπλοκα µπορεί να είναι διµερή ή πολυµερή. Οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις εξελίσονται, µέσω των γονιδιακών διπλασιασµών και των µεταλλάξεων στις επιφάνειες αλληλεπίδρασης. Οι πρωτεΐνες δηµιουργούν δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, όπου οι κόµβοι συµβολίζουν τις πρωτεΐνες και οι συνδέσεις τις αλληλεπιδράσεις.

94 Εξέλιξη των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων

95 Cytoscape Εργαλείο για την απεικόνιση µοριακών µονοπατιών και πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων.

96

97 Σύγκλιση στο µοριακό επίπεδο Δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων Amoutzias et al., EMBO reports 2004

98 Σύγκλιση στο µοριακό επίπεδο Δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων Amoutzias et al., EMBO reports 2004

99 Σύγκλιση στο µοριακό επίπεδο Δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων Amoutzias et al., EMBO reports 2004

100 In vitro διαγνωστικά τεστ που βασίζονται σε µικροσυστοιχίες

101 FDA: In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays (IVDMIAs) FDA s In Vitro Diagnostic Product Database Some IVDMIAs are laboratory-developed tests (LDTs). LDTs are tests that are developed by a single clinical laboratory for use only in that laboratory. GuidanceDocuments/ucm htm IVDMIAs raise significant issues of safety and effectiveness. These types of tests are developed based on observed correlations between multivariate data and clinical outcome, such that the clinical validity of the claims is not transparent to patients, laboratorians, and clinicians who order these tests. Additionally, IVDMIAs frequently have a high risk intended use. FDA is concerned that patients are relying upon IVDMIAs with high risk intended uses to make critical healthcare decisions when FDA has not ensured that the IVDMIA has been clinically validated and the healthcare practitioners are unable to clinically validate the test themselves. Therefore, there is a need for FDA to regulate these devices to ensure that the IVDMIA is safe and effective for its intended use.

102 Mammaprint - Tissue of origin MammaPrint. The first IVDMIA, the MammaPrint system, made by Agendia Inc., is a qualitative IVD test service performed in a single lab outside the United States using a 70-gene expression profile of fresh frozen breast cancer tissue samples to assess a breast cancer patient ユ s risk for distant metastasis. FDA approved MammaPrint in February 2007 under de novo classification procedures. Tissue of Origin Test In July 2008, the Tissue of Origin Test, made by Pathwork Diagnostics, was cleared. This microarray RNA profiling test is to be used on clinical, formalinfixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue to aid in the classification of the origin of the tumor tissue. In June 2010 a second clearance introduced a different specimen and specimen-preparation method, and the algorithm for analysis of the expression data to create a diagnostics report and interpretation. The test uses microarray technology by Affymetrix Inc. and advanced analytics to measure the gene-expression patterns of challenging tumors, including metastatic, poorly differentiated, and undifferentiated cancer. It is intended to measure the degree of similarity between the RNA expression patterns in a patient s tumor tissue with the RNA expression patterns in a database of fifteen known tumor types.

103 Καρκίνοι αγνώστου προελεύσεως Σε κάποιες περιπτώσεις εµφάνισης/επανεµφάνισης καρκίνου είναι άγνωστη η πρωταρχική πηγή (ιστός), ακόµα και µετά από µια σειρά διαγνωστικών τεστ/βιοψία. Αυτό δεν επιτρέπει να χρησιµοποιηθεί ένα κατάλληλο θεραπευτικό σχήµα. Οι µικροσυστοιχίες επιτρέπουν να δηµιουργηθεί το προφίλ γονιδιακής έκφρασης του συγκεκριµένου καρκίνου και να συγκριθεί µε το προφίλ καρκίνων γνωστής προέλευσης.

104 Καρκίνοι αγνώστου προελεύσεως Δηµιουργείται µια βάση από δεδοµένα µεταγραφωµικής (από άλλες βάσεις δεδοµένων και βιβλιογραφία). Τα δεδοµένα είναι από γνωστούς καρκίνους, κανονικούς ιστούς, και από άλλες ασθένειες. Τα δεδοµένα φιλτράρονται, κανονικοποιούνται. Στη συνέχεια γίνεται σύγκριση.

105 Καρκίνοι αγνώστου προελεύσεως Classification of unknown primary tumors with a data-driven method based on a large microarray reference database Kalle A Ojala, Sami K Kilpinen and Olli P Kallioniemi

106 IVDMIA - FDA /ucm htm The MammaPrint is the first cleared in vitro diagnostic multivariate index assay (IVDMIA) device /ucm htm FDA Clears Test that Helps Identify Type of Cancer in Tumor Sample The Pathwork Tissue of Origin test compares the genetic material of a patient's tumor with genetic information on malignant tumor types stored in a database.it uses a microarray technology to analyze thousands of pieces of genetic material at one time. The test considers 15 common malignant tumor types, including bladder, breast, and colorectal tumors.

107 Εφαρµογές στην τοξικολογία/ τοξικογενωµική Μέτρηση της γονιδιακής έκφρασης µετά από έκθεση σε τοξικό παράγοντα µπορεί να δείξει τον µοριακό µηχανισµό δράσης του παράγοντα. Μπορεί να αποτελέσει µοναδική µοριακή υπογραφή του συγκεκριµένου τοξικού παράγοντα, για µελλοντική ανίχνευσή του. Οµαδοποίηση τοξικών παραγόντων µε κοινή δράση, µε βάση την οµοιότητα των µοριακών προφιλ τους

108 Μοριακό προφίλ τοξικότητας Ηπατοκύτταρα αρουραίων εκτέθηκαν σε 15 γνωστές ηπατο-τοξίνες. Για την κάθε µία, δηµιουργήθηκε το µοριακό προφίλ γονιδιακής έκφρασης (ποιά γονίδια υπερ/υπο-εκφράστηκαν). Τοξίνες µε παρόµοιο µηχανισµό δράσης είχαν παρόµοια (όχι όµως ακριβώς ίδια) προφίλ γονιδιακής έκφρασης και οµαδοποιούνταν.

109 Μοριακό προφίλ τοξικότητας

110 Μοριακό προφίλ τοξικότητας Hierarchical cluster analysis showed a close association in gene expressional responses between aroclor 1254 and 3- methylcholanthrene.

111 Β.Δ. Που έχει αποτελέσµατα 624 τοξικολογικών εξετάσεων (οριζόντιος άξονας) για διάφορες χηµικές ουσίες (κάθετος άξονας). ToxCastDB

112 Micro-RNAs Μικρά RNAs που ρυθµίζουν (κυρίως καταστέλουν) την µεταγραφή των mrnas Αποδόµιση του mrna. Αναστολή της µεταγραφής του mrna. Μέγεθος ~ 22 nt. ~1000 στον άνθρωπο. Ρυθµίζουν πολλά mrnas (30%-100%). Ένα mi-rna -> στοχεύει πολλά mrnas. Πολλά mi-rnas -> στοχεύουν το ίδιο mrna (hunting pack). Έχουν εξειδικευµένο προφίλ έκφρασης για τον κάθε ιστό (και καρκίνο) (συνήθως σχετίζονται µε συγκεκριµένες αναπτυξιακές διαδικασίες). Μπορούν να λειτουργήσουν ως διαγνωστικοί ή προγνωστικοί µοριακοί δείκτες.

113 Toxicology Applications

114 Τοξική δράση acetaminophen Acetaminophen: Είναι αναλγητικό/αντιπυρετικό Έλεγχος µε microarrays αν τα mi-rna µπορούν να καταδείξουν την ηπατική καταστροφή µετά από χορήγηση φαρµάκου (acetaminophen overdose). Σε κατάσταση υπερχορήγησης, τα µεταβολικά µονοπάτια που καταβολίζουν το φάρµακο είναι σε κορεσµό. Το πλεονάζον φάρµακο υπόκειται σε καταβολισµό από ένζυµα των P450 -> NAPQI (N-acetyl-p-benzoquinone imine) (τοξικό). NAPQI εξουδετερώνεται από ενδοκυτταρική γλουταθιόνη (GSH). Ότι NAPQI περισσεύει, προκαλεί ηπατική καταστροφή. Σε περίπτωση υπερβολικής δόσης acetaminophen (-> υπερβολικό NAPQI), χορηγούµε N-acetylcysteine (NAC) -> ενδοκυτταρικό GSH.

115 Μέτρηση της τοξικής δράσης του acetaminophen Η τοξικότητα δεν εµφανίζεται αµέσως. Χρειάζεται γρήγορη και αξιόπιστη µέτρηση της τοξικότητας µε αιµατολογικό έλεγχο (ορό). Μέτρηση της αµινοτρανσφεράσης του ορού (κλασσική µέθοδος). Βρήκαν mi-rnas που εκφράζονται σηµαντικά στο ήπαρ. Παρακολουθήσαν την έκφρασή τους στο ήπαρ µετά τη χορήγηση acetaminophen και επίσης παρακολούθησαν την ανίχνευσή τους στον ορό (λόγω πιθανής ηπατικής κυτταρικής καταστροφής).

116 Toxicology Applications Selected mirna shows opposite changes between liver and plasma samples based on microarray results. Wang K et al. PNAS 2009;106:

117 Τα mi-rnas αποδείχθηκαν πιο αξιόπιστοι και πιο γρήγοροι δείκτες ηπατικής καταστροφής Wang K et al. PNAS 2009;106: