ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΜΕ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΑΠΟΠΤΩΤΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ. (ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΣΕ ΕΠΙΜΥΕΣ) ΔΡΟΣΟΣ ΑΡ.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ - ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΑΝΩΓΕΙΑΝΑΚΙΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΜΕ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΑΠΟΠΤΩΤΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ. (ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΣΕ ΕΠΙΜΥΕΣ) ΔΡΟΣΟΣ ΑΡ. ΤΣΑΒΛΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΣΟΛΩΝ ΜΠΟΥΝΤΖΙΟΥΚΑΣ, ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΥΤΣΟΝΙΚΟΛΑΣ, ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΣΠΑΝΔΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΣΟΛΩΝ ΜΠΟΥΤΖΙΟΥΚΑΣ, ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΥΤΣΟΝΙΚΟΛΑΣ, ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΣΠΑΝΔΟΥ, ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΑΝΩΓΕΙΑΝΑΚΙΣ, ΝΕΣΤΩΡ ΑΓΚΟΜΑΧΑΛΕΛΗΣ, ΚΟΚΚΩΝΑ ΚΟΥΖΗ - ΚΟΛΙΑΚΟΥ, ΙΩΑΝΝΗΣ ΛΙΑΓΚΟΥΡΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, αρθρ και ν. 1268/82, αρθρ.50 8) 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Β. ΝΤΟΜΠΡΟΣ 3

4 4

5 Στους γονείς μου, που δεν μου στέρησαν ποτέ τίποτα Στη γυναίκα μου Άννα, και στα παιδιά μου Στέλλα, Αριστείδη και Νικολέττα, που με στερήθηκαν πολύ χωρίς να φταίνε σε τίποτα 5

6 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΔΙΑΜΕΣΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΟΥ 23 ΧΩΡΟΥ 2.1 Γενικό Μέρος Κύτταρα του διάμεσου πνευμονικού χώρου 23 α) Δομικά κύτταρα 23 β) Μεταναστευτικά κύτταρα Εξωκυττάρια ουσία 25 α) Θεμέλια ουσία 25 β) Ινιδικές πρωτεΐνες 26 γ) Βασικές μεμβράνες ΠΑΘΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΔΙΑΜΕΣΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΟΥ ΧΩΡΟΥ Νοσήματα συνδετικού ιστού Παθήσεις από χρήση ή υπέρχρηση φαρμάκων Πρωτοπαθείς παθήσεις Ιδιοπαθείς διάμεσες πνευμονίες Επαγγελματικές και περιβαλλοντολογικές παθήσεις ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ Επιπολασμός και επίπτωση Φύλο και ηλικία Γεωγραφική και Φυλετική κατανομή Θνησιμοτητα ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΤΗΣ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ Φλεγμονή και ίνωση Το επιθήλιο και ο ρόλος του στην ίνωση Επούλωση Πηκτικός μηχανισμός και επιθήλιο Μεσολαβητικές ουσίες και επιθήλιο Κυτταρικός θάνατος 52 α) Νέκρωση 52 β) Απόπτωση Ο ρόλος των κυτταροκινών Th-1 και Th-2 56 α) Γενικά 56 β) Κυτταροκίνες και πνευμονική ίνωση Αγγειογένεση Εξωκυττάρια ουσία και ιστική αναδόμηση 62 7

8 6.7 Ινοβλαστικές εστίες - Μυοϊνοβλάστες Πνευμονική ίνωση και κληρονομικότητα Συμπέρασμα ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ Γενικά Φάρμακα Κορτικοστεροειδή Ανοσοκατασταλτικά Σπανιότερες θεραπείες ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΙ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Οξειδωτικό stress 75 α) Γενικά 75 β) Οξειδωτικό stress και πνευμονική ίνωση Ενδογενή αντιοξειδωτικά και εξουδετερωτές ελευθέρωνριζών Ελεύθερες ρίζες οξυγόνου Μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) Αντιοξειδωτικά και αναστολείς του ΝΟ Αυξητικοί και κυτταροπροστατευτικοί παράγοντες ΕΡΥΘΡΟΠΟΙΗΤΙΝΗ (EPO) Δομή και λειτουργία Κυτταροπροστατευτικός ρόλος της ερυθροποιητίνης Αντιαποπτωτική δράση Αντιφλεγμονώδης δράση Αντιοξειδωτική δράση ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΟΝΤΕΛΟ ΜΠΛΕΟΜΥΚΙΝΗΣ Μπλεομυκίνη (BLM) Πειραματικό μοντέλο 94 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα Χορηγούμενες ουσίες 101 α) Μπλεομυκίνη 101 β) Ερυθροποιητίνη Πειραματικό Πρωτόκολλο Ομάδες πειραματοζώων Μοντέλο πνευμονικής ίνωσης Παρατήρηση πειραματοζώων (1 η έως 14 η ημέρα) Αιμοληψία- Μέτρηση αιματοκρίτη Μέτρηση επιπέδων EPO στον ορό του αίματος Ιστολογική Ανάλυση Λήψη και Παρασκευή πνευμονικών ιστών Ιστοχημική χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης Ανοσοϊστοχημεία Μεθοδολογία Στατιστικής Ανάλυσης 112 8

9 2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Βάρος Σώματος (ΒΣ) Αιματοκρίτης (Ht) Επίπεδα EPO στον ορό αίματος Ιστοχημική χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης Ανοσοϊστοχημική χρώση κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) Ανοσοϊστοχημική χρώση επαγώγιμης συνθάσης του οξειδίου του 136 αζώτου (i-nos) 2.7 Ανοσοϊστοχημική χρώση μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (MMP-9) Ανοσοϊστοχημική χρώση υποδοχέα της ερυθροποιητίνης (EPO-R) Ανοσοϊστοχημική χρώση κυττοχρώματος-c(cyt-c) ΣΥΖΗΤΗΣΗ 165 Πειραματικό μοντέλο μπλεομυκίνης 165 Βάρος Σώματος 170 Αιματοκρίτης και επίπεδα EPO στον ορό του αίματος 171 Ανοσοϊστοχημική χρώση COX Ανοσοϊστοχημική χρώση i-nos 179 Ανοσοϊστοχημική χρώση MMP Ανοσοϊστοχημική χρώση EPO-R 186 Ανοσοϊστοχημική χρώση cyt-c ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 197 SUMMARY 201 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 205 9

10 10

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η πνευμονική ίνωση (Pulmonary Fibrosis) είναι το τελικό στάδιο μιας ετερογενούς ομάδος δυσλειτουργιών και χρόνιων φλεγμονωδών πνευμονικών παθήσεων, αγνώστου αιτιολογίας. Κατατάσσεται στις διάχυτες παθήσεις του πνευμονικού παρεγχύματος και χαρακτηρίζεται από υπερβολική εναπόθεση εξωκυττάριων πρωτεϊνών στο διάμεσο πνευμονικό χώρο και από βλάβες και μεταβολή της κυτταρικής σύνθεσης του κυψελιδικού χώρου με υπερβολική εναπόθεση κολλαγόνου (1). Πρόκειται για μία νόσο με επιπολασμό περίπου 15 άτομα / πληθυσμού, η οποία χαρακτηρίζεται κλινικά από προοδευτικά επιδεινούμενη δύσπνοια, στην εύκολη κόπωση ή και την ακινησία, συνδυάζεται με ξηρό βήχα και σαν τελικό στάδιο έχει την αναπνευστική ανεπάρκεια τύπου Ι (υποξυγοναιμία) ή τύπου II (υποξυγοναιμία και υπερκαπνία). Ο έλεγχος της αναπνευστικής λειτουργίας αποκαλύπτει διαταραχή περιοριστικού τύπου με ελαττωμένη TLC (Total Lung Capacity) και FVC (Forced Vital Capacity) (1). Ο ασθενής με πνευμονική ίνωση προσεγγίζεται διαγνωστικά, εκτός από τον έλεγχο της αναπνευστικής λειτουργίας με σπιρομέτρηση, στην οποία καταγράφεται και η ικανότητα διάχυσης, με ακτινογραφία θώρακα, η οποία εμφανίζει δικτυωτή ή δικτυοοζώδη εικόνα του πνευμονικού παρεγχύματος κυρίως στις βάσεις και ελάττωση του όγκου των πνευμόνων και με αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας HRCT (High Resolution Computerised Tomography), που αποκαλύπτει δικτυωτές σκιάσεις στην περιφέρεια με εικόνα θολής υάλου (ground glass), βρογχεκτασίες εξ έλξεως και εικόνα μελισσοκηρήθρας. Τέλος, κατά τη διαγνωστική διερεύνηση μπορεί να διενεργηθεί τόσο βρογχοσκόπηση και βρογχοκυψελιδική έκπλυση όσο και βιοψία των πνευμόνων. Η μέση ηλικία διάγνωσης είναι τα 66 έτη και η πρόγνωση της νόσου είναι κακή, με επιβίωση, από τη στιγμή της διάγνωσης τα 3 έως 4 έτη και πενταετή επιβίωση 20-40% (2). Η αιτιολογία της πνευμονικής ίνωσης είναι άγνωστη. Για την εμφάνισή της ενοχοποιούνται πολλοί παράγοντες, γενετικοί, περιβαλλοντολογικοί, λοιμώδεις, διάφορα φάρμακα και το κάπνισμα. Στους λοιμώδεις παράγοντες ανήκουν η λεγεωνέλλα και άτυπα μικρόβια, όπως το μυκόπλασμα, πολλοί ιοί, όπως οι ιοί της γρίπης, ο ιός της ηπατίτιδας C, οι ερπητοϊοί όπως ο ιός 11

12 Epstein-Barr (EBV). Φάρμακα που συνδέονται με σημαντικές επιδράσεις στον πνεύμονα και οδηγούν σε ίνωση και περιορισμό της λειτουργίας του, είναι τα αντικαταθλιπτικά, αντιβιοτικά, αντιεπιληπτικά, μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη, β-αποκλειστές και κυτταροστατικά. Περίπου το 4% ασθενών στους οποίους χορηγείται για οποιοδήποτε λόγο ένα τέτοιο φάρμακο αναπτύσσουν ίνωση και πνευμονίτιδα, που όμως είναι λιγότερο εκτεταμένη και περισσότερο αναστρέψιμη από αυτήν της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης (Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF) (3). Φτωχή παραμένει επίσης και η γνώση γύρω από την παθοφυσιολογία της πνευμονικής ίνωσης. Στη διεθνή βιβλιογραφία αναφέρονται πολλά στοιχεία τόσο από μελέτες σε ανθρώπους όσο και από πειράματα σε ζώα γύρω από τους πιθανούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς της νόσου, όμως καμία μελέτη δεν καταλήγει σε σαφές και ξεκάθαρο συμπέρασμα για το ποιοι είναι οι πραγματικά υπεύθυνοι παράγοντες που πυροδοτούν την έναρξη των παθολογοανατομικών αλλοιώσεων και συντηρούν μία μη αναστρέψιμη βλάβη στο διάμεσο πνευμονικό χώρο. Όλοι πάντως οι ερευνητές καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι η πνευμονική ίνωση έχει μία πολυπαραγοντική παθοφυσιολογία, που καθιστά ακόμη δυσκολότερη την αντιμετώπισή της, η οποία πρέπει να είναι πολύπλευρη και εξαιρετικά εξειδικευμένη για κάθε ασθενή (1,5-9). Η πνευμονική ίνωση ακόμα και σήμερα αντιστέκεται στη θεραπεία και προκαλεί το ενδιαφέρον όχι μόνο με τον τρόπο με τον οποίο προκύπτει αλλά και με τα προβλήματα τα οποία επιφέρει στους ασθενείς. Τα κορτικοστεροειδή και τα κυτταροστατικά, τα οποία αποτελούν την κύρια θεραπευτική αντιμετώπιση προς το παρόν, βελτιώνουν την πνευμονική λειτουργία μόνο στο 30% των πασχόντων (1,3). Έτσι, καθίσταται απαραίτητη η περαιτέρω έρευνα γύρω από νέες θεραπευτικές μεθόδους και φάρμακα, τα οποία θα βοηθούσαν στην αναστολή της εξέλιξης της νόσου. Κατάλληλα για το σκοπό αυτό θεωρούνται φάρμακα με πολλαπλές δράσεις και έχουν ως στόχο την προσέγγιση από διαφορετικές οδούς της παθοφυσιολογίας της πνευμονικής ίνωσης. Σκοπός της μελέτης αυτής είναι η διερεύνηση του πιθανού προστατευτικού ρόλου ενός τέτοιου παράγοντα, της ερυθροποιητίνης (erythropoietin, EPO), η οποία διαθέτει αντιφλεγμονώδη, αντιοξειδωτική και 12

13 αντιαποπτωτική δράση. Το πειραματικό μοντέλο το οποίο χρησιμοποιήθηκε είναι της ενδοτραχειακής χορήγησης μπλεομυκίνης (bleomycin BLM) σε επίμυες, για την πρόκληση πνευμονικής ίνωσης, και στη συνέχεια η ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση EPO. Η παρούσα μελέτη αποτελείται από το γενικό και το ειδικό μέρος. Το γενικό μέρος περιλαμβάνει τον ορισμό της πνευμονικής ίνωσης, την περιγραφή του διάμεσου πνευμονικού ιστού και των κυριοτέρων παθήσεών του, καθώς και την κατάταξη αυτών, την επιδημιολογία, την παθογένεια και τη θεραπεία πνευμονικής ίνωσης που εφαρμόζεται σήμερα, τους οξειδωτικούς και αντιοξειδωτικούς παράγοντες οι οποίοι δρουν στον πνεύμονα, και τέλος περιγράφεται λεπτομερώς η πολυδιάστατη δράση της ερυθροποιητίνης στο πειραματικό μοντέλο της μπλεομυκίνης που χρησιμοποιήθηκε. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται και στην παθογένεια της νόσου με ανάλυση των βασικών χαρακτηριστικών της. Στο ειδικό μέρος περιγράφονται τα χαρακτηριστικά των επίμυων που εξετάστηκαν, τα υλικά και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν, τα αποτελέσματα και η στατιστική ανάλυσή τους. Ακολουθούν η συζήτηση των ευρημάτων και η σύγκρισή τους με τα δεδομένα της διεθνούς βιβλιογραφίας, τα συμπεράσματα, η περίληψη της διατριβής στην ελληνική και αγγλική γλώσσα και τέλος η βιβλιογραφία. Η διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Πειραματικής Φυσιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης και η μέτρηση των επιπέδων της EPO στον ορό αίματος με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας (chemiluminescence) έγινε στο Ανοσολογικό Εργαστήριο του Νοσοκομείου «ΠΑΠΑΓΕΩΡΓΙΟΥ» της Θεσσαλονίκης. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την Ομότιμη Καθηγήτρια Φυσιολογίας κ. Ολυμπία Γκίμπα Τζιαμπίρη, τέως Διευθύντρια του Εργαστηρίου Πειραματικής Φυσιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ, που με τίμησε με την εμπιστοσύνη της και μου ανέθεσε αυτή τη διατριβή. Από την πρώτη στιγμή πίστεψε στις δυνάμεις μου και με ώθησε να αναλάβω και να διεκπεραιώσω αυτήν την πειραματική μελέτη, παρέχοντας μου κάθε δυνατή βοήθεια τόσο σε επιστημονικό, όσο και σε τεχνικό επίπεδο. Πάντοτε ενδιαφερόταν και πρόσεχε την πορεία των πειραμάτων, αξιολογούσε τα 13

14 αποτελέσματα και έδινε λύση στα προβλήματα που αντιμετώπιζα. Δεν θα ξεχάσω ποτέ ότι μου έδωσε αυτήν την ευκαιρία και με στήριξε μέχρι τέλους. Ιδιαίτερα ευχαριστώ το νυν Διευθυντή του Εργαστηρίου Πειραματικής Φυσιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ, Καθηγητή κ. Γεώργιο Ανωγειανάκι, μέλος της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, που συνέχισε να δείχνει εμπιστοσύνη στο πρόσωπό μου και στήριξε τη διατριβή αυτή. Μου παραχώρησε το πειραματικό χειρουργείο στο εργαστήριο οποιαδήποτε μέρα και ώρα και ήταν πάντα έτοιμος να με προμηθεύσει με υλικοτεχνικό εξοπλισμό. Ήταν πάντα παρών και πρόθυμος να με συμβουλεύσει, να με διορθώσει και να σταθεί με αληθινό ενδιαφέρον δίπλα μου όποτε είχα ανάγκη. Θερμότατα ευχαριστώ τον επιβλέποντα της διδακτορικής διατριβής Καθηγητή Φυσιολογίας κ. Σόλωνα Μπουντζιούκα για τη συνεχή καθοδήγηση, την αμέριστη υποστήριξη, τις συμβουλές, τη συμπαράσταση και το ενδιαφέρον του σε όλα τα στάδια εκπόνησης αυτής της μελέτης. Από την αρχή ήταν ένθερμος υποστηρικτής του συγκεκριμένου θέματος και άγρυπνος φρουρός για τη σωστή πορεία της διατριβής. Τον ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, την ενθάρρυνση και τις παροτρύνσεις του, τη μετάδοση γνώσεων μέχρι και την τελευταία στιγμή, καθώς και για την τελική διόρθωση του κειμένου. Η μεγάλη εμπειρία του ήταν για μένα ανεξάντλητη πηγή γνώσης και η θητεία μου κοντά του είτε ως φοιτητής, είτε αργότερα ως υποψήφιος διδάκτωρ, ήταν ένα μεγάλο σχολείο. Οφείλω να ευχαριστήσω θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Φυσιολογίας κ. Δημήτριο Κουτσονικόλα, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, που μου προσέφερε τη συνεχή στήριξη και συμπαράστασή του. Ήταν πάντα διαθέσιμος να παράσχει κάθε δυνατή βοήθεια και να με συμβουλεύσει σε όλη αυτήν την κοπιαστική πορεία της εργαστηριακής έρευνας. Διόρθωσε το τελικό κείμενο, επεσήμανε τις ατέλειες και τις παραλείψεις μου και με οδήγησε να μάθω μέσα από τα λάθη μου. Με τη μεγάλη κλινική του εμπειρία συνδύασε το πειραματικό αυτό πόνημα με κλινικά δεδομένα και συνέβαλε στο να οδηγηθούμε σε πολύ χρήσιμα συμπεράσματα σχετικά με τους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς της υπό εξέταση νόσου. Η συμμετοχή του ήταν συνεχής και οι παρεμβάσεις του καθοριστικές. Ευχαριστώ θερμότατα την Επίκουρη Καθηγήτρια Φυσιολογίας κ. Ευαγγελία Σπάνδου, μέλος της συμβουλευτικής τριμελούς επιτροπής, που 14

15 στάθηκε διπλά μου με τις πολύτιμες συμβουλές της καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής. Με βοήθησε να αναπτύξουμε το πειραματικό μοντέλο της μπλεομυκίνης διαθέτοντάς μου απεριόριστο χρόνο από την προσωπική και οικογενειακή της ζωή, έδειξε υπομονή και κατανόηση και με εισήγαγε στην επιστημονική σκέψη δίνοντας μου μοναδικές ευκαιρίες για έρευνα και μελέτη της βιβλιογραφίας. Της είμαι ευγνώμων για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, την τελική διόρθωση του κειμένου, τις υποδείξεις, τη διακριτικότητα και την ευγένειά της. Θεωρώ μεγάλη μου υποχρέωσή να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Καρδιολογίας-Πνευμονολογίας κ. Νέστορα Αγκομαχαλελή, μέλος της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, ο οποίος με τις συνεχείς παραινέσεις και συμβουλές του, την παροχή πληροφοριών και γνώσεων και την πατρική αγάπη με την οποία με περιέβαλε, όχι μόνο κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής αλλά και κατά την άσκησή μου στην ειδικότητα της Πνευμονολογίας στην Πνευμονολογική Κλινική του Α.Π.Θ, βοήθησε ουσιαστικά στο να φέρω σε πέρας τόσο το θεωρητικό όσο και το πειραματικό μέρος αυτής της μελέτης. Το ενδιαφέρον και η προσήλωσή του για τη διεκπεραίωσή της ήταν συγκινητικό. Του οφείλω πολλά. Ευχαριστώ την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ιστολογίας κ. Κοκκώνα Κουζή-Κολιάκου, μέλος της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, για την παροχή των εξειδικευμένων γνώσεών της στις χρώσεις της ανοσοϊστοχημείας, την ερμηνεία και κατάταξη των ιστολογικών ευρημάτων, τη λήψη φωτογραφιών με το μικροσκόπιο και τις εύστοχες επισημάνσεις της κατά την τελική διόρθωση του κειμένου. Της είμαι ευγνώμων γιατί από την πρώτη στιγμή με στήριξε, με εμπιστεύθηκε και στάθηκε ουσιαστική αρωγός στην εκπόνηση της διατριβής με την επιστημονική της κατάρτιση, τη φιλική συμπεριφορά και την αμέριστη ψυχολογική υποστήριξη που μου παρείχε αφειδώς. Ευχαριστώ επίσης θερμά τον Επίκουρο Καθηγητή Φυσιολογίας κ. Ιωάννη Λιαγκούρη, μέλος της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, για τις νουθεσίες και επισημάνσεις του, τις συμβουλές και το ενδιαφέρον του από την αρχή ως το τέλος της διατριβής. Οι παρατηρήσεις και οι σκέψεις του ήταν πάντα πολύτιμοι βοηθοί στην ολοκλήρωση του πονήματος αυτού. 15

16 Ιδιαίτερα ευχαριστώ την Δρα Μικροβιολογίας, Διευθύντρια του Ανοσολογικού Εργαστηρίου του Νοσοκομείου «ΠΑΠΑΓΕΩΡΓΙΟΥ» της Θεσσαλονίκης, κ. Αικατερίνη Παυλίτου- Τσιόντση, για τη δυνατότητα που μου έδωσε να μετρήσω, με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας, τα επίπεδα της EPO στον ορό του αίματος των υπό μελέτη επίμυων. Η καθοδήγηση και η προσφορά της ήταν πάρα πολύ σημαντικές. Επίσης ευχαριστώ την Τεχνολόγο Ιατρικών Εργαστηρίων κ. Μαρίνα Μακρή και την Παρασκευάστρια κ. Ελένη Κανελλίδου για το χρόνο και τον κόπο τους να προετοιμάσουμε τα προς μέτρηση δείγματα, να τα μετρήσουμε στον αναλυτή και να καταγράψουμε τις τελικές τιμές της EPO. Θα ήταν παράλειψη αν δεν ευχαριστούσα την Παρασκευάστρια του Παθολογοανατομικού Εργαστηρίου του ίδιου Νοσοκομείου, κ. Βασιλική Δημητρούση για τις πολύτιμες συμβουλές της γύρω από τη λήψη των ιστολογικών παρασκευασμάτων και το χρόνο της να μου εξηγήσει και να μου δείξει όλη τη διαδικασία μονιμοποίησης και χρώσης των ιστών. Ευχαριστώ θερμότατα τη Δρα Βιολογίας κ. Γεωργία Κοκαράκη για την πολυτιμότατη βοήθειά της τόσο σε θεωρητικό όσο και σε πρακτικό επίπεδο για την προετοιμασία των ιστών, την λήψη των παθολογοανατομικών τομών, την πραγματοποίηση των χρώσεων αιματοξυλίνης εωσίνης και των χρώσεων ανοσοϊστοχημείας. Οι εξειδικευμένες γνώσεις, ο επαγγελματισμός και η πρωτόγνωρη ικανότητά της στο χειρισμό του εργαστηριακού εξοπλισμού σε συνδυασμό με την μεγάλη προθυμία και καλοσύνη της συνετέλεσαν στο να προχωρήσει ταχύτερα η μελέτη. Χωρίς εκείνη τίποτα δεν θα μπορούσε να έχει ολοκληρωθεί. Της είμαι ευγνώμων. Θα ήταν άτοπο να μην ευχαριστήσω από βάθους καρδίας τους συναδέλφους Ιατρούς, διδάκτορες Φυσιολογίας, κ. Ηλιάνα Παπαδοπούλου και κ. Φίλιππο Καραλή για την αμέριστη συμπαράσταση και βοήθεια τους στα πλαίσια του τεχνικού μέρους της διατριβής. Ήταν πάντα εκεί για να με συμβουλεύσουν, να μου δείξουν και να με βοηθήσουν σε ό,τι χρειαζόμουν. Επίσης, ευχαριστώ θερμά το συνάδελφο ιατρό, υποψήφιο διδάκτορα Φυσιολογίας, κ. Θωμά Γεωργίου, ο οποίος ήταν συνεχώς παρών στο εργαστήριο και με τις τεχνικές του γνώσεις, την όρεξη και το χιούμορ του έδωσε πραγματική ώθηση στην παρούσα διατριβή. Οφείλω να ευχαριστήσω, 16

17 επίσης, τον παιδικό μου φίλο γραφίστα, κ. Δημήτριο Παπαγιαννόπουλο που επιμελήθηκε με πολύ μεράκι τις εικόνες και τα στατιστικά γραφήματα. Αισθάνομαι την ανάγκη να εκφράσω, ξεχωριστά, τις βαθύτατες ευχαριστίες μου στη συνάδελφο Ιατρό Εργασίας κ. Αφροδίτη Παπαδοπούλου που έπαιξε έναν πάρα πολύ σημαντικό ρόλο σε μια κρίσιμη καμπή της μελέτης. Ξενυχτούσε πολλές φορές μαζί μου στο εργαστήριο, συμμετείχε ενεργά στα πειράματα, μελετούσε μαζί μου τη βιβλιογραφία και κυρίως με στήριζε ψυχολογικά με το πηγαίο χιούμορ της. Χωρίς τη βοήθειά της τη δεδομένη στιγμή, μπορεί να μην είχε ολοκληρωθεί αυτό το πόνημα. Τέλος, είμαι ευγνώμων στην οικογένειά μου, που υπέμεινε την απουσία μου και συμπαραστάθηκε στην αγωνία μου. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τη σύζυγό μου Άννα Τζουμάκα, Παιδίατρο, που εκτός από ηθική υποστήριξη, μου παρείχε και επιστημονική βοήθεια συμβουλεύοντας με, «σκαλίζοντας» μαζί μου τη βιβλιογραφία και διορθώνοντας το τελικό κείμενο. 17

18 18

19 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 19

20 20

21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 o Ορισμός Πνευμονικής Ίνωσης Η πνευμονική ίνωση είναι μια ειδική μορφή διάμεσης πνευμονοπάθειας άγνωστης αιτιολογίας με πολύ κακή πρόγνωση. Εντοπίζεται μόνο στον πνεύμονα και ελαττώνει την ολική του χωρητικότητα με την εναπόθεση ινωτικών στοιχείων στο υγιές παρέγχυμα, οδηγώντας σταδιακά στο θάνατο, αφού προηγηθεί αναπνευστική ανεπάρκεια τύπου Ι ή ΙΙ (1). Την κατατάσσουν στις παθήσεις του διάμεσου πνευμονικού χώρου (Interstitial Lung Diseases- ILDs), παρόλο που πολλές παθήσεις αυτού του χώρου προσβάλλουν επιπλέον τον αυλό και το τοίχωμα των μικρών αεροφόρων οδών (κυψελιδικοί πόροι, αναπνευστικά και τελικά βρογχιόλια) καθώς και τα αγγεία (4,5,6). Για το λόγο αυτό τελευταία χρησιμοποιείται περισσότερο για την περιγραφή της ο όρος «Διάχυτες Παθήσεις του Πνευμονικού Παρεγχύματος» (Diffuse Parenchymal Lung Diseases- DPLDs). Σήμερα, χρησιμοποιείται κυρίως ο όρος «Συνήθης Διάμεση Πνευμονία» (Usual Interstitial Pneumonia-UIP) καθώς και άλλα ονόματα, όπως κρυπτογενής ινοποιός κυψελιδίτιδα (Cryptogenic Fibrosing Alveolitis- CFA) και νόσος των Hamman και Rich. Οι Διάχυτες παθήσεις του πνευμονικού παρεγχύματος, DPLDs, κατατάσσονται από πλευράς αιτιολογίας ως εξής: (4,5,7,8) Γνωστής αιτιολογίας (από φάρμακα ή περιβαλλοντολογικούς παράγοντες) Ιδιοπαθείς διάμεσες πνευμονίες : 1) ιδιοπαθής διάμεση πνευμονία (Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF), 2α) Μη Ειδική Διάμεση Πνευμονία (Non Specific Interstitial Pneumonia, NSIP), 2β) Οξεία Διάμεση Πνευμονία (Acute Interstitial Pneumonia, AIP), 2γ) Αποφολιδωτική Διάμεση Πνευμονία (Desquamative Interstitial Pneumonia, DIP), 2δ) Λεμφοειδής Διάμεση Πνευμονία (Lymphoid Interstitial Pneumonia, LIP), 2ε) Κρυπτογενής Οργανοποιός Πνευμονία (Cryptogenic Organising Pneumonia, COP), 2στ) Αναπνευστική Βρογχιολίτιδα με συνοδό Διάμεση Πνευμονία (Respiratory 21

22 Bronchiolitis associated Interstitial Lung Disease, RB-ILD). Κοκκιωματώδεις νόσοι (σαρκοείδωση) Σπάνιες (εωσινόφιλο κοκκίωμα) 22

23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 o Ανατομική και Ιστολογία του Διάμεσου Πνευμονικού Χώρου 2.1 Γενικό μέρος Ο διάμεσος πνευμονικός χώρος αποτελείται από συνδετικό ιστό που βρίσκεται μεταξύ του μεσοθηλίου του υπεζωκότα, του επιθηλίου των αεραγωγών και του ενδοθηλίου των αγγείων. Περιλαμβάνει το συνδετικό ιστό ανάμεσα στις κυψελίδες (κυψελιδικός διάμεσος χώρος), τον περιαγγειακό διάμεσο ιστό και το σπλαγχνικό υπεζωκοτικό ιστό (7). Σχηματίζεται από δύο ειδών κύτταρα, τα δομικά και τα μεταναστευτικά, και από εξωκυττάρια ουσία. Τα δομικά, που προέρχονται από το μεσέγχυμα, παράγουν την εξωκυττάρια ουσία και τα μεταναστευτικά, που είναι ανοσοδραστικά και φλεγμονώδη, παράγονται στο μυελό των οστών, μεταφέρονται με την κυκλοφορία στον πνεύμονα και αποτελούν μέρος του αμυντικού του συστήματος (5,7). Ο διάμεσος πνευμονικός ιστός χρησιμεύει ως στηρικτικό μέσο για τον πνεύμονα τόσο για το παρέγχυμα όσο και για το κυψελιδικό επιθήλιο και τα κυψελιδικά τριχοειδή. Εκτείνεται από τις πύλες μέχρι τον υπεζωκότα, είναι ενιαίος και το μεγαλύτερο μέρος του περιβάλλει τα μεγάλα αγγεία και τους αεραγωγούς, ενώ στο επίπεδο των κυψελίδων επιτρέπει την ανταλλαγή αερίων χάρη στη λεπτή υφή του (9). 2.2 Κύτταρα του διάμεσου πνευμονικού χώρου α) Δομικά κύτταρα : Συνδέονται με την παραγωγή και τη διατήρηση της εξωκυττάριας ουσίας, την ανανέωση και αποκατάστασή της σε περίπτωση βλάβης, τη ρύθμιση της λειτουργίας του συνδετικού ιστού και τη ρύθμιση του εύρους των αεραγωγών και των αγγείων του πνευμονικού παρεγχύματος. Διακρίνονται στους ινοβλάστες, τους μυοϊνοβλάστες, τα περικύτταρα και τις λείες μυικές ίνες (5,9). Αναλυτικά: Ινοβλάστες. Αποτελούν τη μεγαλύτερη κατηγορία των κυττάρων του διάμεσου πνευμονικού ιστού. Είναι ατρακτοειδή κύτταρα με αποφυάδες και ο 23

24 επιμήκης άξονάς τους είναι παράλληλος με τις ίνες κολλαγόνου. Συνθέτουν την εξωκυττάρια ουσία και το κυτταρόπλασμά τους έχει πολλά μιτοχόνδρια, εκκριτικά κυστίδια και κοκκώδες ενδοπλασματικό δίκτυο. Αυτή η συνθετική τους λειτουργία είναι υπεύθυνη για τη μεταβολική τους δραστηριότητα (5,9). Μυοϊνοβλάστες. Κύτταρα λίγα σε αριθμό, σχεδόν ίδια μορφολογικά με τους ινοβλάστες, τα οποία όμως διαθέτουν και συσταλτικές ιδιότητες λόγω των ινιδίων ακτίνης που περιέχουν (10). Χάρη στα ινίδια αυτά, δρουν στο κυψελιδικό επιθήλιο αλλά και το τριχοειδικό ενδοθήλιο, ρυθμίζοντας με τον τρόπο αυτό το εύρος των τριχοειδών και την ικανότητα του διάμεσου ιστού προς διάταση. Όταν υπάρχει βλάβη, πληθαίνουν, συμμετέχουν στην παραγωγή κολλαγόνου και προκαλούν συρρίκνωση και βελτίωση της κατάστασης του ουλώδους ιστού που έχει σχηματιστεί (9,10). Περικύτταρα. Είναι ατρακτοειδή κύτταρα, που εντοπίζονται γύρω από τα τριχοειδή και έχουν συσταλτικές ιδιότητες (9). Λείες μυικές ίνες. Κύτταρα με ατρακτοειδές σχήμα, το κυτταρόπλασμα των οποίων καταλαμβάνεται από ινίδια ακτίνης και μυοσίνης. Εντοπίζονται στο τοίχωμα των αγγείων και των αεραγωγών και ρυθμίζουν το εύρος αυτών (5,9). β) Μεταναστευτικά κύτταρα : Πρόκειται για κύτταρα του αίματος που μεταφέρονται με τη συστηματική κυκλοφορία από το μυελό των οστών στο συνδετικό ιστό του πνεύμονα για να ενισχύσουν την άμυνά του. Στα κύτταρα αυτά περιλαμβάνονται: μακροφάγα, λεμφοκύτταρα, εωσινόφιλα, σιτευτικά βασεόφιλα και ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα (7). 1. Μακροφάγα. Αποτελούν κύριο αμυντικό μηχανισμό του διάμεσου ιστού και είναι τα πολυπληθέστερα. Περιέχουν στο κυτταρόπλασμά τους πολλά λυσοσωμάτια και εκκρίνουν διάφορες κυτταροκίνες. Αμύνονται απέναντι σε μικρόβια με φαγοκυττάρωση, μεταφέρουν αντιγόνα στους επιχώριους λεμφαδένες, απομακρύνουν κυτταρικά ράκη και συνεργαζόμενα με τα δενδριτικά κύτταρα και τα κύτταρα Langerhans, παρουσιάζουν τα αντιγόνα στα Τ- λεμφοκύτταρα (9). 24

25 2. Λεμφοκύτταρα. Βρίσκονται μεμονωμένα στο τοίχωμα των κυψελίδων και κατά ομάδες στους αεραγωγούς. Στο 95% είναι Τ-λεμφοκύτταρα με σχέση CD4/CD8: 1,5-2,1, όμοια δηλαδή με αυτή του αίματος. Τα Β-λεμφοκύτταρα είναι ελάχιστα κι έχουν την ικανότητα τόσο να διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα όσο και να παραγάγουν ανοσοσφαιρίνες (9). 3. Σιτευτικά κύτταρα (mast cells). Στα πολλά βασεόφιλα κοκκία τους συναντώνται: ηπαρίνη, ισταμίνη, λευκοτριένια κά. Εντοπίζονται κυρίως γύρω από τα αγγεία και στον υπεζωκότα (9). 4. Εωσινόφιλα. Έχουν δίλοβο πυρήνα και εωσινόφιλα κοκκία με λυτικά ένζυμα, ενώ στην επιφάνειά τους φέρουν υποδοχείς για την ανοσοσφαιρίνη IgE (9). 5. Ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα. Φυσιολογικά δεν ανευρίσκονται στους ιστούς παρά μόνο μετά από κάποιο χημειοτακτικό ερέθισμα, οπότε και εξαγγειώνονται. Έχουν πολύλοβο πυρήνα, ουδετερόφιλα κοκκία με λυτικά ένζυμα και φαγοκυτταρικές ιδιότητες (9). 2.3 Εξωκυττάρια ουσία Η κατασκευή του πνεύμονα δεν είναι δυνατόν να υποστηρίξει τη λειτουργία του αν δεν τηρούνται κάποιες πολύ σημαντικές προϋποθέσεις. Σημαντικό ρόλο σε αυτό παίζει η εξωκυττάρια ουσία του διάμεσου ιστού, η οποία διασφαλίζει το μικρό πάχος των κυψελιδικών διαφραγμάτων για την ικανοποιητική ανταλλαγή των αερίων, τη σταθερότητα για να υποστηρίζουν το επιθήλιο και τα τριχοειδή και την ελαστικότητα ώστε να αντεπεξέρχονται στις μεταβολές του όγκου του πνεύμονα κατά τις αναπνευστικές κινήσεις. Η εξωκυττάρια ουσία αποτελείται από τη θεμέλια ουσία, τις ινιδικές πρωτεΐνες και τις βασικές μεμβράνες, παράγεται δε από τα κύτταρα του διάμεσου ιστού και κυρίως τους ινοβλάστες (9). Θεμέλια ουσία Είναι ο κύριος όγκος της εξωκυττάριας ουσίας και αποτελείται από : 1. Γλυκοζαμινογλυκάνες : Σχηματίζονται από αλυσίδες πολυσακχαριτών, μη διακλαδιζόμενες, οι οποίες αποτελούνται από επαναλαμβανόμενους δισακχαρίτες. Συνδέονται με πρωτεΐνες και σχηματίζουν τις πρωτεογλυκάνες. 25

26 Οι γλυκοζαμινογλυκάνες διακρίνονται σε τέσσερις ομάδες: α)την ομάδα της θειικής χονδροϊτίνης και θειικής δερματάνης, β) την ομάδα της ηπαράνης και θειικής ηπαράνης, γ) την ομάδα της θειικής κερατίνης και δ) την ομάδα του υαλουρονικού οξέος (9). Το υαλουρονικό οξύ, σε αντίθεση με τις άλλες γλυκοζαμινογλυκάνες, δεν περιέχει στο μόριό του θειικές ομάδες και δε συνδέεται με πρωτεΐνες. Αντίθετα, συνδέεται με πρωτεογλυκάνες, κι έτσι σχηματίζονται μεγάλα μόρια, τα οποία αποτελούν και το μεγαλύτερο όγκο του συνδετικού ιστού γύρω από τους αεραγωγούς και τα αγγεία. Το υαλουρονικό οξύ προσδίδει στους ιστούς αυξημένο ιξώδες, δυσχεραίνοντας με αυτόν τον τρόπο τη δίοδο μικροβίων, συμμετέχει στη ρύθμιση της διακίνησης του ύδατος, την προσκόλληση των κυττάρων, και τέλος, τη μετανάστευση και την ενεργοποίηση των μακροφάγων. Εντοπίζεται κυρίως στον εξωτερικό χιτώνα των αγγείων και στο χώρο μεταξύ αγγείων και αεραγωγών (5,7,9). 2. Πρωτεογλυκάνες : Είναι μία μεγάλη ομάδα μακρομορίων, που αποτελούνται από ένα πρωτεϊνικό κορμό και γλυκοζαμινογλυκάνες. Οι πρωτεογλυκάνες αποτελούν το στηρικτικό υπόστρωμα του διάμεσου ιστού και συμμετέχουν στη διακίνηση του ύδατος και την απορρόφηση των πιέσεων, καθορίζοντας έτσι την ευενδοτότητα (complience) του πνεύμονα. Παράλληλα, αποτελούν σημαντικό δομικό και λειτουργικό στοιχείο των βασικών μεμβρανών (9). 3. Μη ινιδικές δομικές πρωτεΐνες : Διευκολύνουν τη σύνδεση των στοιχείων του συνδετικού ιστού. Οι κυριότερες είναι η λαμινίνη (laminin), η εντακτίνη (entactin) και η τενασκίνη (tenascin) (9). Ινιδικές πρωτεΐνες α) Κολλαγόνο : Η πρωτεϊνική αυτή ομάδα αποτελεί το 15-20% του ξηρού βάρους του πνεύμονα. Η δομική του μονάδα είναι η τριπλή έλικα του τροποκολλαγόνου. Τα μόρια του τροποκολλαγόνου συνδέονται μεταξύ τους στον εξωκυττάριο χώρο και σχηματίζουν μικροϊνίδια, τα οποία στη συνέχεια συνδέονται μεταξύ τους και δημιουργούν τους διάφορους τύπους του κολλαγόνου. Ο βασικός ρόλος του κολλαγόνου είναι η ενίσχυση της αντοχής των ιστών έναντι εκτατικών δυνάμεων. Οι τύποι που συναντώνται συχνότερα 26

27 είναι το κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙΙ, των οποίων οι ίνες σχηματίζουν δεσμίδες. Οι δεσμίδες αυτές είναι μακριές, ισχυρές και ανελαστκές και συμμετέχουν ενεργά στη διαδικασία της επούλωσης. Τα κολλαγόνα τύπου V, VI και XII οργανώνονται σε λεπτές ίνες στην επιφάνεια του κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ. Το κολλαγόνο τύπου IV είναι το βασικό δομικό συστατικό των βασικών μεμβρανών και σε αντίθεση με τους άλλους τύπους, που παράγονται από τους ινοβλάστες, παράγεται από τα επιθηλιακά κύτταρα. Το κολλαγόνο τύπου IV δεν οργανώνεται σε ίνες, αλλά παραμένει με τη μορφή μικροϊνιδίων (9). β) Ελαστικές ίνες : Πρόκειται για μη διαλυτά, υδρόφοβα μόρια, που συνδέονται σχηματίζοντας δίκτυα και ευθύνονται για την ικανότητα του διάμεσου ιστού να επανέρχεται στο αρχικό του σχήμα μετά από παραμόρφωση. Παράγονται από τους ινοβλάστες κατά την εμβρυϊκή και νεογνική περίοδο, ενώ αν καταστραφούν αργότερα, αντικαθίστανται από κολλαγόνες ίνες (9). γ) Φιμπρονεκτίνη : Είναι γλυκοπρωτεΐνη που σχηματίζει ινίδια, τα οποία αποτελούν δομικό στοιχείο της εξωκυττάριας ουσίας του συνδετικού ιστού. Προσκολλάται σε ειδικούς κυτταρικούς υποδοχείς και σε πλήθος εξωκυττάριων μακρομορίων. Έτσι, δρα ως μεσολαβητική πρωτεΐνη και διευκολύνει την προσκόλληση των κυττάρων στην εξωκυττάρια ουσία. Παράλληλα επηρεάζει τη μετανάστευση, την αύξηση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων καθώς και τη φαγοκυττάρωση (9). Βασικές μεμβράνες Οι βασικές μεμβράνες είναι ειδικά σημεία επαφής του συνδετικού ιστού με το επιθήλιο. Αποτελούνται από κολλαγόνο τύπου IV, πρωτεογλυκάνη της θειϊκής ηπαράνης, λαμινίνη και εντακτίνη, που παράγονται από τα επιθηλιακά κύτταρα και από φιμπρονεκτίνη, η οποία παράγεται στο ήπαρ. Το κολλαγόνο είναι το κύριο συστατικό της βασικής μεμβράνης και βρίσκεται σε μορφή μικροϊνιδίων, που συμπλέκονται μεταξύ τους και σχηματίζουν ένα τρισδιάστατο δίκτυο. Τα υπόλοιπα δομικά στοιχεία συνδέονται με το δίκτυο αυτό μόνο σε ορισμένες θέσεις ενώ συγχρόνως έχουν θέσεις σύνδεσης της βασικής μεμβράνης με το επιθήλιο και τον υποκείμενο συνδετικό ιστό (9). Η βασική μεμβράνη έχει σαν προορισμό να στηρίζει και να καθορίζει τη θέση του επιθηλίου, και άρα την αρχιτεκτονική του πνεύμονα. Επίσης, παίζει 27

28 ρόλο στη λειτουργικότητα των κυψελιδικών διαφραγμάτων (9,11). Αποτελεί θέση ελεγχόμενης διαπερατότητας, επειδή δεν επιτρέπει τη δίοδο σε μεγάλα και αρνητικώς φορτισμένα μόρια (9). Η βασική μεμβράνη, τέλος, ελέγχει την οργάνωση των κυττάρων του επιθηλίου και συμμετέχει στην επούλωσή του σε περίπτωση βλάβης ή τραυματισμού (9,11). 28

29 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 o Παθήσεις του Διάμεσου Πνευμονικού Χώρου Οι διάχυτες παθήσεις του πνευμονικού παρεγχύματος αριθμούν περί τις 200 νοσολογικές οντότητες, οι οποίες συναντώνται σε πάρα πολλές παθήσεις (12). Παρά τη μεγάλη ποικιλία στην αιτιολογία τους, οι διάχυτες παθήσεις του πνευμονικού παρεγχύματος εμφανίζονται συνήθως με κοινή συμπτωματολογία, ενώ πολύ συχνά, διαφορετικές κλινικές οντότητες εμφανίζονται με παρόμοιες ιστολογικές εικόνες (13). Σύμφωνα με τις θέσεις ομοφωνίας της American Thoracic Society (ATS) και της European Respiratory Society (ERS) του 2002, για την κατάταξη των Ιδιοπαθών Διάμεσων Πνευμονιών (8), οι διάχυτες παθήσεις του πνευμονικού παρεγχύματος διακρίνονται τελικά σε: 1. Παθήσεις γνωστής αιτιολογίας (επαγγελματικές νόσοι, πνευμονοπάθειες από φάρμακα, νόσοι συνδετικού ιστού), 2. Κοκκιωματώδεις πνευμονοπάθειες (π.χ. σαρκοείδωση), 3. Σπάνιες, σαφώς καθορισμένες πνευμονοπάθειες (όπως λεμφαγγειολειομυομάτωση, εωσινόφιλο κοκκίωμα, εωσινοφιλική πνευμονία) και 4. Ιδιοπαθείς διάμεσες πνευμονίες. Η τελευταία αυτή κατηγορία περιλαμβάνει ένα σύνολο κλινικών και ιστολογικών οντοτήτων, που διαφοροποιούνται μεταξύ τους αρκετά, ώστε να θεωρούνται διαφορετικές νοσολογικές οντότητες. Αυτές είναι η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (Ιdiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF), η αποφολιδωτική διάμεση πνευμονία (Desquamative Interstitial Pneumonia, DIP), η κρυπτογενής οργανοποιός πνευμονία (Cryptogenic Organising Pneumonia, COP), η οξεία διάμεση πνευμονία (Acute Interstitial Pneumonia, AIP), η μη ειδική διάμεση πνευμονία (Non Specific Interstitial Pneumonia, NSIP), η λεμφοειδής διάμεση πνευμονία (Lymphoid Interstitial Pneumonia, LIP) και η αναπνευστική βρογχιολίτιδα με συνοδό διάμεση πνευμονοπάθεια (Respiratory Bronchiolitis associated Interstitial Lung Disease, RB-ILD). Τα αίτια των διάχυτων παθήσεων του πνευμονικού παρεγχύματος αναφέρονται αναλυτικότερα, ως εξής: (5,13). 29

30 3.1 Νοσήματα Συνδετικού Ιστού Αγκυλοποιητική Σπονδυλίτιδα, Μικτή Νόσος Συνδετικού Ιστού, Πολυομυοσίτιδα-Δερματομυοσίτιδα, Ρευματοειδής Αρθρίτιδα, Σκληρόδερμα, Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος. 3.2 Παθήσεις από χρήση ή υπέρχρηση φαρμάκων Αντιφλεγμονώδη (πενικιλλαμίνη, χρυσός), Αντιβιοτικά (σουλφασαλαζίνη, φουραντοΐνη), Αντιαρρυθμικά (αμιοδαρόνη, προπανολόλη, τοκαϊνίδη), Αντιεπιληπτικά, Nαρκωτικά, Βιταμίνες (L-Τρυπτοφάνη), Ακτινοθεραπευτικά, Παρακουάτ, Τοξικότητα από Οξυγόνο, Χημειοθεραπευτικά (μπλεομυκίνη, αζαθειοπρίνη, ΒCNU, βουσουλφάνη, κυκλοφωσφαμίδη, μεθοτρεξάτη, μιτομυκίνη C, προκαρβαζίνη, χλωραμβουκίλη). 3.3 Πρωτοπαθείς Παθήσεις Αμυλοείδωση, Αναπνευστική Βρογχιολίτιδα, AIDS ARDS Bρογχοκυψελιδικό Καρκίνωμα, Εωσινόφιλο κοκκίωμα Εωσινοφιλική Πνευμονία, Κυψελιδική Πρωτεΐνωση, Κυψελιδική Μικρολιθίαση, Λιποειδής Πνευμονία, Λεμφαγγειακή Καρκινωμάτωση, Λεμφαγγειολειομυομάτωση, Μεταστατική Ασβεστοποίηση, Μεταμόσχευση Μυελού, Μεταφλεγμονώδης Διάμεση Πνευμονία, Νευροϊνωμάτωση, Νόσος Gaucher, Nόσος Niemann- Pick, Πνευμονικές Αγγειίτιδες, Πνευμονικό Λέμφωμα, Σαρκοείδωση, Σύνδρομα Ενδοκυψελιδικής Αιμορραγίας, Σύνδρομο Hermansky-Pudlak, Tuberous Sclerosis. 3.4 Ιδιοπαθείς Διάμεσες Πνευμονίες Αποφολιδωτική Διάμεση Πνευμονία, Aναπνευστική Βρογχιολίτιδα με συνοδό Διάμεση Πνευμονοπάθεια, Ιδιοπαθής Πνευμονική Ίνωση, Κρυπτογενής Οργανοποιός Πνευμονία, Λεμφοειδής Διάμεση Πνευμονία, Μη Ειδική Διάμεση Πνευμονία, Οξεία Διάμεση Πνευμονία. 3.5 Επαγγελματικές και Περιβαλλοντικές Παθήσεις Αμιάντωση, Ανθράκωση, Βηρυλλίωση, Ίνωση από οξείδια αλουμινίου, Κασσιτέρωση, Πνευμονοκονίαση από βαρέα μέταλλα, Πνευμονοκονίαση από 30

31 τάλκ, Πυριτίαση, Σιδήρωση, Πνευμονοπάθεια από Υπερευαισθησία, Πνεύμονας αγρότη, Πνεύμονας εκτροφέα πτηνών κ.α. 31

32 32

33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ιστορική Αναδρομή Η πρώτη καταγραφή των ιδιοπαθών παθήσεων του διάμεσου πνευμονικού χώρου έγινε το 1935 από τους Hamman και Rich, οι οποίοι παρουσίασαν 4 ασθενείς με διάχυτη διάμεση νόσο των πνευμόνων, αγνώστου αιτιολογίας, οι οποίοι κατέληξαν μέσα σε λίγες εβδομάδες (14). Η νόσος ονομάστηκε "κεραυνοβόλος διάχυτη διάμεση νόσος των πνευμόνων". Από τότε ο όρος "σύνδρομο Hamman-Rich" χρησιμοποιείται πολλές φορές για να περιγράψει οποιαδήποτε πάθηση του διάμεσου χώρου, παρά το γεγονός ότι στη μεγάλη τους πλειοψηφία οι παθήσεις αυτές δεν χαρακτηρίζονται από την οξεία εισβολή και εξέλιξη της νόσου στους ασθενείς των Hamman και Rich, αλλά έχουν αργή και ύπουλη εμφάνιση (5,14). Αργότερα, το 1969, οι Liebow και Carrington (15) περιέγραψαν, με βάση συγκεκριμένα κριτήρια, πέντε διαφορετικούς ιστολογικούς τύπους ιδιοπαθών διάμεσων πνευμονιών: α) τη συνήθη διάμεση πνευμονία (Usual Interstitial Pneumonia,UIP), β) την αποφρακτική βρογχιολίτιδα με διάμεση πνευμονία (Bronchiolitis obliterans with Interstitial Pneumonia, BIP), γ) την αποφολιδωτική διάμεση πνευμονία (Desquamative Interstitial Pneumonia, DIP), δ) τη λεμφοειδή διάμεση πνευμονία (Lymphoid Interstitial Pneumonia, LIP) και ε) τη γιγαντοκυτταρική διάμεση πνευμονία (Giant cell Interstitial Pneumonia, GIP). Η κατάταξη αυτή και η χρησιμότητά της αμφισβητήθηκε έντονα από πολλούς άλλους ερευνητές, με βάση το κριτήριο ότι τα ιστολογικά ευρήματα των ιδιοπαθών διάμεσων πνευμονιών είναι μη ειδικά και ότι η κλινική τους συμπτωματολογία είναι πολλές φορές κοινή. Οι ερευνητές αυτοί θεωρούσαν ότι όλες αυτές οι ιδιοπαθείς παθήσεις που κατέληγαν σε ίνωση, ανήκαν στην ίδια κλινική οντότητα για την οποία επικράτησε στις ΗΠΑ ο όρος ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF), ενώ στη Μ. Βρετανία χρησιμοποιήθηκε ο όρος κρυπτογενής ινοποιός κυψελιδίτιδα (Cryptogenic Fibrosing Alveolitis, CFΑ). Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα χρησιμοποιήθηκε για να υποστηρίξει την άποψη αυτή, καθώς θεωρήθηκε ότι όλες οι μορφές κυψελιδίτιδας καταλήγουν σε ίνωση (16). 33

34 Τελικά, αποδείχθηκε ότι οι Liebow και Carrington δίκαια διαχώρισαν τις ιδιοπαθείς διάμεσες πνευμονίες. Η τότε BIP, που τώρα είναι γνωστή ως αποφρακτική βρογχιολίτιδα με οργανωμένη πνευμονία ή ως κρυπτογενής οργανοποιός πνευμονία (Bronchiolitis Obliterans Organising Pneumonia, BOOP ή Cryptogenic Organising Pneumonia, COP), είναι μία διακριτή οντότητα, που απαντάται μάλιστα αρκετά συχνά στην κλινική πράξη. Η LIP είναι επίσης χωριστή πάθηση, που έχει συνδεθεί με λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα και με το Σύνδρομο Επίκτητης Ανοσοανεπάρκειας (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS), ενώ για τη GIP έχει αποδειχθεί ότι οφείλεται σε βαρέα μέταλλα (17). Τόσο οι Muller και Colby, (18) όσο και οι Katzenstein και Myers συμφώνησαν με τους Liebow και Carrington ως προς το ότι οι ιδιοπαθείς διάμεσες παθήσεις είναι διακριτές οντότητες και παρουσίασαν τις δικές τους κατατάξεις το Τόσο οι Muller και Colby, όσο και οι Katzenstein και Myers διατήρησαν τις UIP και DIP ως ξεχωριστούς τύπους διάμεσων πνευμονιών. Παράλληλα όμως δεν συμπεριέλαβαν στις κατατάξεις τους τις GIP και LIP με το σκεπτικό ότι η μεν GIP ανήκει στις πνευμονοκονιάσεις, η δε LIP στις λεμφοϋπερπλαστικές παθήσεις. Επίσης στην κατάταξη της Katzenstein δεν περιλαμβάνεται και η BIP (που σήμερα ονομάζεται BOOP ή COP) με την αιτιολογία ότι σε αυτή η προσβολή αφορά περισσότερο τον αυλό και λιγότερο το διάμεσο πνευμονικό χώρο. Αντίθετα και στις δύο κατατάξεις προστέθηκαν δύο νέες οντότητες, η οξεία διάμεση πνευμονία (Acute Interstitial Pneumonia, AIP) και η μη ειδική διάμεση πνευμονία (Non Specific Interstitial Pneumonia, NSIP). Στις νέες κατατάξεις για το διαχωρισμό των παθήσεων αυτών χρησιμοποιήθηκαν παθολογοανατομικά κριτήρια, τα οποία όμως έχουν ακτινολογικά και κλινικά ισοδύναμα. Δηλαδή οι διαφορές, για παράδειγμα, της UIP από την NSIP δεν περιορίζονται στα ιστολογικά παρασκευάσματα, αλλά επεκτείνονται στις ακτινολογικές τους εικόνες, στην κλινική τους πορεία και στην απάντησή τους στην θεραπεία (19). Έτσι λοιπόν, όπως αναφέρθηκε επιγραμματικά στο προηγούμενο κεφάλαιο, η American Thoracic Society και η European Respiratory Society, το 2002, (8) πρότειναν μία τελική κατάταξη με σειρά συχνότητας: IPF, NSIP, COP, AIP, RB-ILD, DIP, LIP. Προκειμένου να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ των ιστολογικών και κλινικών όρων, που έχουν χρησιμοποιηθεί για τις 34

35 οντότητες αυτές, στη νέα αυτή κατάταξη ορίσθηκε ένα σύνολο ιστολογικών προτύπων, που αποτελούν τη βάση για την τελική κλινική, ακτινολογική και παθολογοανατομική διάγνωση (Clinico-Radiologic-Pathologic diagnosis, CRP diagnosis) (19). Καθώς τα παθολογοανατομικά πρότυπα (patterns) επιτρέπουν ένα καλύτερο διαχωρισμό των οντοτήτων αυτών σε σχέση με τα ακτινολογικά, παρέχουν και μία πρώτη βάση για την κατάταξή τους. Ωστόσο η τελική CRP διάγνωση, συμπεριλαμβανομένου και του αν πρόκειται για μία ιδιοπαθή ή δευτεροπαθή κατάσταση, μπορεί να τεθεί μόνο μετά από συσχέτιση των παθολογοανατομικών ευρημάτων με τα ακτινολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά (5,8). Oι κατατάξεις των Liebow και Carrington, των Muller και Colby και των Katzenstein και Myers παρατίθενται συγκριτικά στον πίνακα 1 (15,17,18). Πίνακας 1 : Συγκριτική κατάταξη των ιδιοπαθών διάμεσων πνευμονιών (5,8) Liebow και Carrington (1969) Συνήθης Διάμεση Πνευμονία (UIP) Αποφολιδωτική Διάμεση Πνευμονία (DIP) Αποφρακτική Βρογχιολίτιδα με Διάμεση Πνευμονία (BIP) Λεμφοειδής Διάμεση Πνευμονία (LIP) Γιγαντοκυτταρική Διάμεση Πνευμονία (GIP) Katzenstein και Myers (1997) Συνήθης Διάμεση Πνευμονία (UIP) Αποφολιδωτική Διάμεση Πνευμονία (DIP)/ Αναπνευστική Βρογχιολίτιδα με συνοδό Διάμεση Πνευμονοπάθεια (RB-ILD) Οξεία Διάμεση Πνευμονία (AIP) Μη Ειδική Διάμεση Πνευμονία (NSIP) Muller και Colby (1997) Συνήθης Διάμεση Πνευμονία (UIP) Αποφολιδωτική Διάμεση Πνευμονία (DIP) Αποφρακτική Βρογχιολίτιδα με Οργανωμένη Πνευμονία (BOOP) Οξεία Διάμεση Πνευμονία (AIP) Μη Ειδική Διάμεση Πνευμονία (NSIP) 35

36 36

37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 o Επιδημιολογία της Πνευμονικής Ίνωσης 5.1 Επιπολασμός και επίπτωση Ο επιπολασμός της IPF υπολογίστηκε το 1984 σε 3 με 5 περιπτώσεις ανά (5,16), ενώ άλλες μελέτες το 1994 υπολογίζουν 6 περιπτώσεις ανά (20). Τέλος, σε μία μελέτη, για το σύνολο των ιδιοπαθών διάμεσων πνευμονοπαθειών στο New Mexico των ΗΠΑ, ο επιπολασμός της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης ανέρχεται σε 20,2 περιπτώσεις ανά για τους άντρες και 13,2 περιπτώσεις για τις γυναίκες, ενώ η επίπτωση σε 10,7 και 7,4/ /έτος αντίστοιχα (5,21). Παράλληλα, μία μελέτη του 2002 στην Φινλανδία υπολογίζει τον επιπολασμό της νόσου σε 16 με 18 περιπτώσεις ανά (5,22). Παρατηρείται δηλαδή μια αυξητική τάση που δεν μπορεί εύκολα να εξηγηθεί και αν προσπαθήσει κάποιος να ερευνήσει περαιτέρω θα πρέπει να λάβει σοβαρά υπόψη του τόσο τη γήρανση του πληθυσμού και τη βελτίωση των απεικονιστικών μεθόδων, όσο και τις διαφορές στα κριτήρια που χρησιμοποιούνται στις διάφορες μελέτες, που είναι αρκετά σημαντικές. 5.2 Φύλο και ηλικία Συνήθως αναφέρεται ότι η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση είναι συχνότερη στους άνδρες απ' ό,τι στις γυναίκες (21,23). Αυτό φαίνεται να αναιρείται στην παραπάνω μελέτη της Φινλανδίας, κατά την οποία δεν παρατηρείται διαφορά στον επιπολασμό της νόσου μεταξύ των δύο φύλων. Οι ασθενείς με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση είναι συνήθως ηλικίας ετών, με μέση ηλικία κατά τη διάγνωση τα 66 χρόνια (20), αν και σε μία πολύ πρόσφατη μελέτη σε σύνολο 86 ασθενών αναφέρεται πολύ μεγαλύτερη μέση ηλικία κατά τη διάγνωση (80 έτη) (24). Είναι αξιοσημείωτο ότι τόσο ο επιπολασμός όσο και η επίπτωση αυξάνουν με την ηλικία. Χαρακτηριστικά, ενώ στην ηλικία των ο επιπολασμός στους άντρες είναι 8,7/ και στις γυναίκες 8,1/ , σε ηλικίες άνω των 75 ανέρχεται σε 174,7/ για τους άντρες και 73,2/ για τις γυναίκες (5,21,22). Όσον αφορά την 37

38 επίπτωση, στην ηλικία των είναι 2,2/ /έτος για τους άντρες και 4/ /έτος για τις γυναίκες, ενώ σε ηλικίες άνω των 75 ανέρχεται σε 101,9/ /έτος για τους άντρες και 57/ /έτος για τις γυναίκες (21,22). 5.3 Γεωγραφική και φυλετική κατανομή Η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση δεν παρουσιάζει κάποια συγκεκριμένη παγκόσμια κατανομή. Μια μελέτη όμως (25), λαμβάνοντας υπόψη την ηλικία, έκανε τη διαπίστωση ότι προσβάλλονται περισσότερο οι δυτικές και νοτιοανατολικές πολιτείες των ΗΠΑ από ό,τι οι μεσοδυτικές και βορειοανατολικές πολιτείες. Άλλη μελέτη στη Βρετανία (26), απέδειξε ότι η πνευμονική ίνωση είναι συχνότερη στις βιομηχανικές περιοχές απ ό,τι στην υπόλοιπη χώρα. Όσον αφορά τις φυλές, η συχνότητα της νόσου, λαμβάνοντας υπόψη την ηλικία, ήταν μεγαλύτερη στους λευκούς (25). 5.4 Θνησιμότητα Η θνησιμότητα από την ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση ανά πληθυσμού υπολογίζεται σε 3,3 για τους άντρες και σε 2,5 για τις γυναίκες (5,23). Σύμφωνα με μια άλλη μελέτη η θνησιμότητα λαμβάνοντας υπόψη την ηλικία αυξήθηκε για τους άντρες από το 4,8/ το 1979 στο 5,09/ το 1991, ενώ οι αντίστοιχοι δείκτες για τις γυναίκες ήταν 2,14 και 2,72 (25). Θεωρείται βέβαιο ότι η θνησιμότητα από τη νόσο αυξάνεται με την ηλικία ενώ για ορισμένους ερευνητές είναι υψηλότερη στο ανδρικό φύλο (25,27). Η μέση επιβίωση από τη στιγμή της διάγνωσης κυμαίνεται από 28 μήνες ως 5 χρόνια (28,29), ενώ σύμφωνα με μία μελέτη, που αφορούσε 86 περιπτώσεις ιστολογικά επιβεβαιωμένης ιδιοπαθούς διάμεσης ίνωσης, είναι 3,5 έτη (24). Σύμφωνα με αυτή τη μελέτη, 20% των ασθενών κατέληξαν από σοβαρή αναπνευστική ανεπάρκεια, 10,5% από την εξέλιξη της νόσου, 23,3% από βακτηριακή πνευμονία και 17,4% από καρκίνο του πνεύμονα (24). Πρέπει να διευκρινιστεί ότι η χρήση των πιστοποιητικών θανάτου δεν μπορεί να αποτελέσει ασφαλές κριτήριο για την εκτίμηση της θνησιμότητας 38

39 από τη νόσο, διότι παρέχουν ανακριβή και αμφίβολα στοιχεία (21), μιας και δεν αποδίδονται στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση παρά μόνο οι μισοί θάνατοι που οφείλονται σε αυτήν (5, 26,30). 39

40 40

41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 o Παθογένεια Της Πνευμονικής Ίνωσης 6.1 Φλεγμονή και Ίνωση Διάφορες μελέτες θεωρούν ότι όλες οι πνευμονικές ινώσεις έχουν έναν κοινό παθογενετικό μηχανισμό, ανεξάρτητα από το αίτιό τους (31). Η θεωρία που κυριάρχησε για την παθογένεια της πνευμονικής ίνωσης κατά τις δεκαετίες ήταν αυτή της φλεγμονώδους ίνωσης (inflammatory fibrosis), σύμφωνα με την οποία ένα άγνωστο αίτιο επιδρά στον πνεύμονα και ξεκινά μία χρόνια φλεγμονώδης διαδικασία. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση κυττάρων φλεγμονής και την απελευθέρωση μεσολαβητικών ουσιών που οδηγούν με τη σειρά τους στην ενεργοποίηση μεσεγχυματικών κυττάρων και την αυξημένη παραγωγή και εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας (32,33). Το τελικό αποτέλεσμα είναι ο σχηματισμός ουλής και η ίνωση του παρεγχύματος. Σημαντικό ρόλο για τη στήριξη αυτής της θεωρίας έπαιξε το γεγονός ότι στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με IPF υπάρχουν μεγάλοι αριθμοί φλεγμονωδών κυττάρων (δηλαδή εωσινόφιλων και ουδετερόφιλων) σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα (5,34,35). Έτσι λοιπόν, αξιολογώντας το βασικό ρόλο της φλεγμονής στην παθογένεια της ίνωσης, άρχισε να ενδιαφέρει τους ερευνητές η ανακάλυψη και ο προσδιορισμός ενός παράγοντα, ο οποίος θα σταματούσε τη φλεγμονή και άρα θα οδηγούσε και στην απάλειψη της ίνωσης (33). Η παρουσία και η πρώιμη απάντηση προφλεγμονωδών παραγόντων και η επίμονη παρουσία τους μπορεί να λειτουργήσει ως μεσολαβητής στην ίνωση. Η ιντερλευκίνη-1 (IL-1), είναι η πιο σημαντική φλεγμονογόνος κυτταροκίνη. Αρχικά γνωστή ως ενεργοποιητικός παράγοντας των λεμφοκυττάρων, διαφοροποιητικός παράγοντας των Β κυττάρων ή ενδογενές πυρετογόνο (139), η ομάδα μορίων της IL-1 συμμετέχει σε αρκετές βιολογικές διεργασίες του οργανισμού, όπως: καρδιαγγειακές, νευροενδοκρινικές, πυρετός, γονιδιακή έκφραση, απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων, απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών (γλουταμικού, γ-αμινοβουτυρικού), 41

42 μεταβολές στην ευαισθησία των υποδοχέων NMDA (N-μεθυλο-D-ασπαρτικό), κυρίως έναντι αυτών των νευροδιαβιβαστών, καθώς και παραγωγή i-nos, κυτταροκινών, προσταγλανδινών, νευροπεπτιδίων και του β-αμυλοειδούς (140). Αποτελείται από δύο αγωνιστές (IL-1 α και IL-1 β), τρία εναλασσομένως ενωμένα m-rna που κωδικοποιούν τρεις ανταγωνιστές των υποδοχέων ιντερλευκίνης-1( IL-1ra ) και δύο υποδοχείς (τύπου Ι και τύπου ΙΙ). Ένας από τους IL-1ra εκκρίνεται ενώ οι άλλοι δύο είναι ενδοκυττάριοι και φαίνεται να απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια κυτταρικής βλάβης ή απόπτωσης (57). Επιπλέον, η παρουσία των δύο υποδοχέων δηλώνει ακόμα μεγαλύτερη πολυπλοκότητα καθώς ο τύπου-ι υποδοχέας σχετίζεται με σύζευξη μηνυμάτων, ενώ ο τύπου-ιι δεν κάνει σύζευξη αλλά λειτουργεί κυρίως ως υποδοχέας «δόλωμα». Η ισορροπία έκφρασης των αγωνιστών, ανταγωνιστών και υποδοχέων τελικά προσδιορίζει τη βιολογία και δράση της ιντερλευκίνης-1 κι επηρεάζει τον τρόπο με τον οποίο κατανοούμε το ρόλο της στην πνευμονική ίνωση (57,58). Τα δύο ισομερή της IL-1 (IL-1α και IL-1β) και ο ενδογενής ανταγωνιστής του υποδοχέα της (receptor antagonist IL-1ra) είναι μαζί με τον TNF-α από τις πιο μελετημένες κυτταροκίνες σε μοντέλα πνευμονικής ίνωσης. Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός μελετών που δείχνει τον τρόπο με τον οποίο η ιντερλευκίνη-1 προάγει την πνευμονική ίνωση (57,58,59) : 1. Προάγει τη φλεγμονή μέσω συσσώρευσης λευκοκυττάρων (παράδειγμα η προσκόλληση μορίων και χημειοκινών) 2. Προκαλεί την έναρξη έκφρασης ινοβλαστών προκολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ, γλυκοζαμινογλυκανών και ινικής. 3. Προκαλεί την έκφραση ινοβλαστών μέσω του εξ αιμοπεταλίων προερχόμενου αναπτυξιακού παράγοντα (PDGF). 4. Εμμέσως μεσολαβεί στην ινοβλάστωση. Υπάρχουν, όμως, και μελέτες, οι οποίες αμφισβητούν τη θεωρία της ίνωσης μετά από φλεγμονή. Στηρίζονται σε δεδομένα, που προκύπτουν από πειραματική έρευνα, ότι η ιντερλευκίνη-1 εμποδίζει την ίνωση, μέσω των ανταγωνιστών που μεσολαβούν στην παραγωγή ιστικών κολλαγενασών και προσταγλανδίνης Ε 2 (PGE 2 ) (60). Αυτό σημαίνει ότι η IL 1 μπορεί να συμμετέχει στην αναστολή της αύξησης του εξωκυττάριου υποστρώματος (60). Εδώ θα πρέπει να 42

43 αναφερθεί ότι η IL-1 α που προέρχεται από τα κυψελιδικά πνευμονοκύτταρα τύπου ΙΙ εμποδίζει την ινοβλάστωση μέσω ενός μηχανισμού που σχετίζεται με την παραγωγή προσταγλανδίνης Ε 2 από τους ινοβλάστες (60). Επιπλέον, ένας μεγάλος αριθμός χρόνιων ινοβλαστικών δυσλειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης και της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης, έχει αποδειχθεί ότι έχουν αυξημένη έκφραση IL-1ra σε τέτοια επίπεδα που εμποδίζουν τη δράση των αγωνιστών ιντερλευκίνης-1. Η έλλειψη ιντερλευκίνης-1 στο εξωκυττάριο υπόστρωμα κατά την παρουσία υψηλού TGF-β θα οδηγούσε σε αυξημένη εναπόθεση εξωκυττάριου υποστρώματος (60,61). Επίσης, φαίνεται πως η φλεγμονή δεν αποτελεί βασικό ιστοπαθολογικό εύρημα της συνήθους διάμεσης πνευμονίας (usual interstitial pneumonia, UIP) και υπάρχουν ελάχιστες ενδείξεις ότι είναι περισσότερο έντονη στα αρχικά στάδια της νόσου. Μελετώντας πολλούς ασθενείς με UIP έγινε αντιληπτό ότι φλεγμονή παρατηρείται συνήθως στις περιοχές εναπόθεσης κολλαγόνου και αλλοιώσεων τύπου μελισσοκηρήθρας, αλλά σπάνια προσβάλλει μόνη της τα μεσοκυψελιδικά διαφράγματα (6). Επίσης, αρκετές διάμεσες πνευμονοπάθειες, στις οποίες η φλεγμονή αποτελεί κυρίαρχο στοιχείο κατά τα αρχικά στάδια, όπως η πνευμονοπάθεια από υπερευαισθησία, συχνά δεν καταλήγουν σε ίνωση (31). Επιπλέον, σύμφωνα με μελέτες που έγιναν σε ζώα, η αναδόμηση (remodeling) του πνευμονικού παρεγχύματος μπορεί να συμβεί είτε ως επακόλουθο φλεγμονής (36), είτε ανεξάρτητα από αυτή (37). Εδώ επισημαίνεται ο ρόλος του μετατρεπτικού αυξητικού παράγοντα-β (transforming growth factor-β/tgf-β), ο οποίος φυσιολογικά συμμετέχει στo σχηματισμό των κυψελίδων, τη ρύθμιση των διαδικασιών επούλωσης και την ανοσιακή απάντηση (38). Συγχρόνως αποτελεί σημαντικό συστατικό του ινώδους ιστού στην IPF, καθώς σχετίζεται με τη διαφοροποίηση των μυοϊνοβλαστών (39,62). Η ενεργοποίηση του TGF-β δημιουργεί συνθήκες ίνωσης ανεξάρτητα από την παρουσία φλεγμονής (38,39,40,62). Ένα άλλο στοιχείο, το οποίο θέτει σε αμφισβήτηση τη θεωρία της φλεγμονώδους ίνωσης είναι η απουσία συσχέτισης διαφόρων δεικτών φλεγμονής του πνεύμονα με το στάδιο και την πρόγνωση της νόσου (41,42). Αν θεωρηθεί ότι η κυψελιδίτιδα οδηγεί σε ίνωση, τότε θα έπρεπε οι μέθοδοι 43

44 εκτίμησης της φλεγμονής να μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για την εκτίμηση της βαρύτητας της νόσου. Ωστόσο έχει αποδειχθεί ότι η αναλογία και ο αριθμός των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, το σπινθηρογράφημα με γάλλιο και τα κυκλοφορούντα ανοσοσυμπλέγματα έχουν μικρή αξία στην εκτίμηση της πρόγνωσης της IPF (43,44,45). Επίσης, διαπιστώνεται ότι, σε αντίθεση με άλλες διάμεσες πνευμονοπάθειες, στην IPF η απεικόνιση θολής υάλου σε αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας (HRCT), όταν συνδέεται με δικτυωτές σκιάσεις και βρογχεκτασίες εξ έλξεως, αντιστοιχεί συνήθως σε ίνωση (5,46,47,63). Η μη ανταπόκριση των ασθενών με IPF στα αντιφλεγμονώδη φάρμακα έρχεται σε αντίθεση με τη θεωρία της ίνωσης μετά από φλεγμονή (48,49). Η πορεία της IPF είναι προοδευτική και ο ασθενής καταλήγει παρά την αντιφλεγμονώδη θεραπεία. Η χορήγηση κορτικοστεροειδών ήταν το επόμενο θεραπευτικό βήμα και ορισμένες μελέτες έδειξαν ευνοϊκή ανταπόκριση ασθενών με IPF σε αυτά. Ωστόσο, στις περισσότερες μελέτες η διάγνωση της IPF δεν έχει γίνει με βιοψία πνεύμονα και σε αρκετές περιπτώσεις συμπεριλαμβάνονται στις μελέτες και άλλες διάμεσες πνευμονοπάθειες, όπως NSIP ή COP (50,51). Έτσι λοιπόν, με βάση όσα αναφέρθηκαν η ανάπτυξη διάχυτης πνευμονικής ίνωσης μπορεί να προκύψει με δύο τρόπους: 1) ακολουθώντας τη φλεγμονώδη οδό, που απαντάται σχεδόν σε όλες τις ιδιοπαθείς διάμεσες πνευμονοπάθειες, πλην της IPF, και κατά την οποία υπάρχει μία αρχική φάση κυψελιδίτιδας η οποία ακολουθείται από την ανάπτυξη ίνωσης και 2) με την οδό των επιθηλιακών κυττάρων και των ινοβλαστών (epithelial/fibroblast route) που απαντάται στην IPF (5,52). 6.2 Το επιθήλιο και ο ρόλος του στην ίνωση Επούλωση Η επούλωση των ιστών μπορεί να διακριθεί σε δύο κατηγορίες οι οποίες ακολουθούν διαφορετική πορεία μέχρι την ολοκλήρωσή τους: α) τη φυσιολογική επούλωση και β) την παθολογική επούλωση. Αναλυτικά : 44

45 Η φυσιολογική επούλωση ακολουθεί την παρακάτω διαδρομή (31): 1) επιθηλιακή βλάβη 2) δημιουργία θρόμβου 3) συσσώρευση κι ενεργοποίηση ουδετεροφίλων και μονοκυττάρων 4) μετανάστευση, πολλαπλασιασμός των ινοβλαστών και φαινοτυπική αλλαγή τους σε μυοϊνοβλάστες 5) αγγειογένεση 6) εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας 7) απόπτωση μυοϊνοβλαστών, μερική επαναρρόφηση εξωκυττάριας ουσίας, μετανάστευση επιθηλιακών κυττάρων, επανεπιθηλιοποίηση 8) ιστική επούλωση Η φυσιολογική επούλωση που ακολουθεί μία βλάβη στον πνεύμονα καταλήγει σε ταχεία επιδιόρθωση του ιστού και αποκατάσταση της λειτουργίας του. Παρά το γεγονός ότι αποτελεί μία σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ χυμικών, κυτταρικών παραγόντων κι εξωκυττάριου υποστρώματος, αυτή η διαδικασία παρουσιάζεται με μία αλληλουχία γεγονότων τα οποία πολλές φορές αλληλοκαλύπτονται, όπως είναι η πήξη, η φλεγμονή, ο σχηματισμός κοκκιωματώδους ιστού και η επαναφορά της αλληλοσύνδεσης των φυσιολογικών κυττάρων του παρεγχύματος. Σε αντίθεση με αυτή τη φυσιολογική διαδικασία, η παραμονή χρόνιας φλεγμονής στη διάμεση πνευμονία επιτείνει την ινοβλάστωση και την εναπόθεση εξωκυττάριου υποστρώματος, γεγονός που δηλώνει ακανόνιστη και υπερβολική επούλωση του ιστού (56). Παθολογική επούλωση Τα επιθηλιακά κύτταρα τύπου ΙΙ αποτελούν προγονικά κύτταρα, που έχουν την ικανότητα της φυσιολογικής αναγέννησης του επιθηλίου μετά τον τραυματισμό του (64,65). Όταν όμως ο πολλαπλασιασμός τους καθυστερεί λίγες μέρες, φαίνεται πως και άλλοι μηχανισμοί υπεισέρχονται στην άμεση επούλωση του επιθηλίου, όπως η μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων. Οι αλλαγές αυτές προκαλούν τη διατάραξη της ακεραιότητάς του και την παρουσία διαταραγμένων φαινοτύπων των επιθηλιακών κυττάρων αποτελώντας τη λεγόμενη παθολογική επούλωση (65). 45

46 Σύμφωνα, λοιπόν, με τη δεύτερη θεωρία, η ίνωση είναι το αποτέλεσμα της βλάβης του κυψελιδικού επιθηλίου και της παθολογικής επούλωσής του. Στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση η επούλωση διαταράσσεται λόγω ανεπαρκούς επανεπιθηλιοποίησης και διαταραχών των μυοϊνοβλαστών. Tα κύτταρα τα οποία παίζουν τον προεξάρχοντα ρόλο σε αυτή τη διαδικασία είναι δύο: τα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα και οι ινοβλάστες. Στην IPF παρατηρούνται κυβοειδή κύτταρα (υπερπλασία των πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ), μεγάλα και επιμηκυσμένα επιθηλιακά κύτταρα (πιθανώς μεταβατικά στάδια μεταξύ πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ και Ι), περιοχές απόπτωσης επιθηλιακών κυττάρων και περιοχές που καλύπτονται από βρογχιολιδικό επιθήλιο (honeycomb lesions) (52). Συγχρόνως παρατηρείται μία αλλοίωση της ικανότητας των πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ να διορθώσουν τη βλάβη του επιθηλίου. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με τη διάσπαση της βασικής μεμβράνης, βοηθά τη μετανάστευση των ινοβλαστών στους κυψελιδικούς χώρους και την ενδοκυψελιδική εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας (66). Οι περιοχές στις οποίες λαμβάνει χώρα η βλάβη και η επούλωση του επιθηλίου είναι και τα σημεία του πολλαπλασιασμού των ινοβλαστών, οι γνωστές δηλαδή εστίες ινοβλαστών (fibroblast foci), οι οποίες χαρακτηρίζουν το παθολογοανατομικό παρασκεύασμα της ίνωσης (5,6,69). Φαίνεται πως η βλάβη και η ενεργοποίηση του κυψελιδικού επιθηλίου επάγει τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, καθώς και τη φαινοτυπική τους διαφοροποίηση σε μυοϊνοβλάστες. Οι μυοϊνοβλάστες με τη σειρά τους επάγουν την απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων και αναστέλλουν τη φυσιολογική επιδιόρθωση του επιθηλίου, διατηρώντας έτσι την επιθηλιακή βλάβη. Παράλληλα η αυξημένη παραγωγή και εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας από τους ενεργοποιημένους ινοβλάστες και μυοϊνοβλάστες οδηγεί στην καταστροφή των κυψελιδοτριχοειδικών μονάδων και το σχηματισμό κυστικών χώρων, οι οποίοι περιβάλλονται από πυκνό στρώμα συνδετικού ιστού (μελισσοκηρήθρα) (31,52). Η ινωτική απάντηση στον τραυματισμό του επιθηλίου μπορεί να τροποποιηθεί από διάφορους παράγοντες, όπως το γενετικό υπόστρωμα του ασθενούς, η ισορροπία Th1/Th2 λεμφοκυττάρων και το περιβάλλον (κάπνισμα, ιογενείς λοιμώξεις κ.α.) (53). 46

47 6.2.2 Πηκτικός μηχανισμός και επιθήλιο Η ιστική βλάβη προκαλεί ρήξη των αγγείων και εξαγγείωση των συστατικών του αίματος στο σημείο του τραυματισμού (67). Έτσι, παράγεται το αρχικό και προσωρινό υπόβαθρο, πάνω στο οποίο θα ξεκινήσει η διαδικασία της επούλωσης. Οι επαγωγείς και οι αναστολείς της πήξης ρυθμίζουν το ποσό της ινικής που υπάρχει κάθε στιγμή στο σημείο της βλάβης (67). Τα επιθηλιακά κύτταρα, προκειμένου να μεταναστεύσουν στην απογυμνωμένη επιφάνεια, πρέπει να διέλθουν μέσα από αυτό το στρώμα της ινικής (68,69). Είναι, λοιπόν, φανερό ότι αν τραυματιστεί το κυψελιδικό επιθήλιο η οργανωμένη και αποτελεσματική αποδόμηση του στρώματος της ινικής είναι απαραίτητη για την αποκατάσταση της φυσιολογικής αρχιτεκτονικής του πνευμονικού παρεγχύματος (65,67). Η ισορροπία μεταξύ των προπηκτικών, ινωδολυτικών και αντιινωδολυτικών παραγόντων θα καθορίσει τελικά, αν το στρώμα της ινικής θα παραμείνει και θα οργανωθεί ή θα υποστραφεί και θα λυθεί (65). Πολλές μελέτες που αφορούν σε βρογχοκυψελιδικά εκπλύματα ασθενών, υποστηρίζουν ότι στην IPF υπάρχει αυξημένη προπηκτική και αντιινωδολυτική δραστηριότητα (70), στην οποία φαίνεται πως βασικό ρόλο παίζει το κυψελιδικό επιθήλιο, μέσω της παραγωγής του ιστικού παράγοντα (tissue factor/tf) και των αναστολέων του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου - 1 και -2 (plasminogen activator inhibitor-1,-2/ PAI-1, PAI-2) (70-73). Ο TF είναι μια πρωτεΐνη, η οποία ξεκινά το μηχανισμό της πήξης όταν συνδέεται με τον παράγοντα πήξης VIIa με αποτέλεσμα το σχηματισμό θρομβίνης και ινικής (70). Σε ανοσοϊστοχημικές μελέτες ασθενών με IPF, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του TF στα μακροφάγα και τα κυψελιδικά κύτταρα στις περιοχές των ινοβλαστικών εστιών (73). Σύμφωνα με νεότερα δεδομένα φαίνεται πως ο TF εκτός από τοπικό επαγωγέα της πήξης αποτελεί και επαγωγέα της προσκόλλησης και της μετανάστευσής των επιθηλιακών κυττάρων από το αναπνευστικό επιθήλιο προς το σημείο της βλάβης (74). Το ινωδολυτικό σύστημα είναι ενεργό κατά τη διαδικασία της επούλωσης προκειμένου να διευκολύνει τη μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων. Ο ενεργοποιητής του πλασμινογόνου upa (urokinase plasminogen activator), ιδίως όταν συνδέεται με τον ειδικό υποδοχέα του upa-r, προάγει την παραγωγή πλασμίνης και με αυτόν τον τρόπο την ινωδόλυση (75). Τα 47

48 κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα παράγουν τον upa και εκφράζουν τον υποδοχέα του, upa-r (76). Στην IPF παράγουν αυξημένα ποσά των αναστολέων του upa, PAI-1 και PAI-2 (72,73). Προκύπτει μάλιστα ότι ο ΡΑΙ-1 προάγεται από τον μετατρεπτικό αυξητικό παράγοντα-β (transforming growth factor-β /TGF-β) που είναι ένας γνωστός ινωτικός παράγοντας (40). Το αποτέλεσμα της αυξημένης αυτής προπηκτικής και αντιινωδολυτικής δραστηριότητας που παρατηρείται στην IPF είναι η παρεμπόδιση της κίνησης των κυττάρων διαμέσου της εξωκυττάριας ουσίας, με αποτέλεσμα τη διαταραχή της επούλωσης (31). Σε μια μελέτη των Eitzman et al σε επίμυες (77), η σημασία των διαταραχών αυτών στην παθογένεια της ίνωσης φάνηκε από το γεγονός ότι επίμυες που υπερεξέφραζαν τον PAI-1 ανέπτυξαν σημαντικά περισσότερη ίνωση από τα φυσιολογικά μετά από έκθεση σε μπλεομυκίνη. Από την άλλη μεριά, επίμυες που δεν εξέφραζαν τον PAI-1 συμπεριφέρθηκαν φυσιολογικά (77). Επίσης, σε επίμυες χωρίς το γονίδιο του πλασμινογόνου η διαδικασία της επανεπιθηλιοποίησης ήταν σχεδόν καταργημένη (78). Μετά τη βλάβη, οι προσπάθειες που γίνονται για αποκατάσταση της ενότητας-συνέχειας και λειτουργίας του ιστού είναι σημαντικές και μπορεί να επηρεάσουν την υποκείμενη προδιάθεση για ίνωση. Η πήξη είναι ένα φαινόμενο, το οποίο αρχίζει νωρίς κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής επιδιόρθωσης, και το οποίο είναι σημαντικό για την ανάπτυξη του πρωτογενούς υποστρώματος και την έναρξη ανάπτυξης κοκκιωματώδους ιστού. Η αρρύθμιστη πήξη και επίμονη εναπόθεση ινικής είναι ένας από τους μηχανισμούς προαγωγής της πνευμονικής ίνωσης (67,68) Μεσολαβητικές ουσίες και επιθήλιο Σύγχρονες μελέτες υποστηρίζουν με αποδείξεις ότι η συμμετοχή του επιθηλίου στη δημιουργία ίνωσης είναι μεγαλύτερη από ό,τι είχε αρχικά θεωρηθεί. Στην IPF τα επιθηλιακά κύτταρα παράγουν ορισμένες κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες που προάγουν τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών καθώς και τη συσσώρευση εξωκυττάριας ουσίας (31). Διάφορες μελέτες με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους και in situ υβριδισμό έδειξαν ότι στους πνεύμονες ασθενών με IPF τα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα είναι ο κύριος τόπος σύνθεσης του αυξητικού παράγοντα 48

49 των αιμοπεταλίων (platelet-derived growth factor /PDGF), του μετατρεπτικού αυξητικού παράγοντα-β (transforming growth factor-β/tgf-β), του παράγοντα νέκρωσης των όγκων-α (tumor necrosis factor-α /TNF-α), του αυξητικού παράγοντα του συνδετικού ιστού (connective tissue growth factor/ CTGF) και της ενδοθολίνης-1 (endotheline-1, ET-1) (79,80). Επιπλέον υπάρχουν ενδείξεις ότι το κυψελιδικό επιθήλιο στην IPF συμβάλλει στη δημιουργία ενός δικτύου κυτταροκινών, οι οποίες χαρακτηρίζουν την ανοσία τύπου Τh-2 (66). Ο TGF-β, ο οποίος ανευρίσκεται και στα κυψελιδικά μακροφάγα (81,82), είναι ο κύριος μεσολαβητής για την ανάπτυξη πνευμονικής ίνωσης σε πειραματικά μοντέλα (83). Η ανάπτυξη της ίνωσης μέσω του TGF-β μπορεί να συμβεί ανεξάρτητα από την παρουσία φλεγμονής, και ο TGF-β αυξάνει την έκφραση της α-ακτίνης των λείων μυικών ινών σε φυσιολογικούς πνευμονικούς ινοβλάστες (84,115), εμποδίζει την απόπτωση των μυοϊνοβλαστών (85) και αυξάνει την απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων (86). Τέλος, ο TGF-β επάγει τον ΡΑΙ-1, αναστέλλοντας με αυτόν τον τρόπο την ινωδόλυση (69). Η πιρφεριδόνη, ένας νέος θεραπευτικός παράγοντας για την IPF, που βρίσκεται υπό αξιολόγηση, εμποδίζει in vitro τη σύνθεση κολλαγόνου που επάγεται από τον TGF-β (87) και in vivo την έκφραση του γονιδίου που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση του TGF-β και του αυξητικού παράγοντα των αιμοπεταλίων PDGF (platelet-derived growth factor) (5,88,116). Άλλος παράγοντας που παίζει σημαντικό ρόλο στο φαινόμενο της ίνωσης είναι ο παράγοντας νέκρωσης όγκου, TNF-α, ο οποίος αλληλεπιδρά με έναν από τους υποδοχείς του, τον pρ55, οδηγώντας σε απόπτωση (91). Παράλληλα όμως, μπορεί να δράσει με τον αντίθετο τρόπο έχοντας αντιφλεγμονώδη και αντιαποπτωτικά αποτελέσματα μέσω του πυρηνικού παράγοντα-κβ (Nuclear Factor-κB, NF-κB) (123). Αυτό σημαίνει ότι ο TNF-α μπορεί να έχει διττό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου (92). Ο NF-κΒ παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της φλεγμονώδους απάντησης. Είναι ένας κρίσιμος μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων του TNF-α και της IL-1β στα μακροφάγα και στα μονοκύτταρα. Πρόκειται για ένα ετεροδιμερές μόριο που συντίθεται από δύο ομάδες (p65 και p50). Αναγνωρίστηκε ως πυρηνικός παράγοντας των Β 49

50 κυττάρων και πήρε το όνομα του από την ικανότητά του να συνδέεται με το γονίδιο της κ-ελαφράς αλύσου ανοσοσφαιρινών. Από τότε εντοπίστηκε σε πολλά είδη κυττάρων και βρέθηκε ότι μπορεί να ενεργοποιηθεί από μια πλειάδα ερεθισμάτων, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, οι κυτταροκίνες, βακτηριακά ή ιικά παράγωγα κ.ά (123,137,138). Σε κατάσταση ηρεμίας ο NFκΒ εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα σε μια ανενεργή μορφή, συνδεδεμένος με μια ανασταλτική πρωτεΐνη γνωστή ως IκΒ. Τα διάφορα εξωγενή βλαβερά ερεθίσματα οδηγούν στη φωσφορυλίωση της IκΒ και μετέπειτα στην πρωτεολυτική διάσπασή της με τη βοήθεια ειδικού ενζύμου (κινάση, IKK). Με αυτό τον τρόπο ενεργοποιείται ο NF-κΒ, ο οποίος στη συνέχεια μεταναστεύει στον πυρήνα του κυττάρου και συνδέεται σε συγκεκριμένες θέσεις (κb περιοχές), όπου μπορεί να πυροδοτήσει τη γονιδιακή έκφραση φλεγμονωδών παραγόντων. Πολλά γονίδια που εμπλέκονται στη φλεγμονή, όπως αυτά για τον TNF-α, το ICAM-1 (διακυτταρικά μόρια προσκόλλησης-1), την COX-2 (κυκλοοξυγενάση), την i-nos (επαγώγιμη συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου) και την IL-6, περιέχουν λειτουργικές κb περιοχές (137,138). Έτσι, γονιδιακά προϊόντα, τα οποία ρυθμίζονται από τον NF-Κβ, μπορούν επίσης να ρυθμίσουν την παραγωγή του ίδιου του NF-κΒ, όπως για παράδειγμα οι προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες TNF-α και η IL-1β (137). Αυτή η ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα από αυξημένα επίπεδα m-rna του TNF- α έχει αποδειχθεί πειραματικά σε επίμυες (241,301). Πολλές μελέτες έγιναν σχετικά με τη δράση του TNF-α στην ίνωση. Όπως ακριβώς η ιντερλευκίνη έτσι κι αυτός μπορεί να επάγει την ίνωση μέσω συσσώρευσης λευκοκυττάρων και επίτασης της φλεγμονής. Προκαλεί την έναρξη έκφρασης των ινοβλαστών του προκολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ, γλυκοζαμινογλυκανών και ινικής καθώς επίσης και την έκφραση ινοβλαστών του PDGF και τέλος, εμμέσως μπορεί να μεσολαβήσει στην ινοβλάστωση (91). Ταυτόχρονα όμως, υπάρχουν πειραματικές αποδείξεις ότι είναι δυνατόν ο παράγοντας αυτός να εμποδίζει την ίνωση προκαλώντας αύξηση της παραγωγής ινικών κολλαγενασών και προσταγλανδίνης Ε 2. Μία μελέτη σε επίμυες έδειξε ότι αυτοί προστατεύονται από την ίνωση με σιλικόνη, διότι ο TNF-α μεταβάλλει την κολλαγενάση του διάμεσου πνευμονικού χώρου 50

51 (μεταλλοπρωτεϊνάση ΜΜΡ13) και αναστέλλει την έκφραση της ιστικής μεταλλοπρωτεϊνάσης (ΤΙΜΡ-1). Κάτω από αυτές τις συνθήκες το εξωκυττάριο υπόστρωμα υφίσταται ταχύτερη διάσπαση λόγω μειωμένων επιπέδων ΤΙΜΡ- 1. Αυτή η μελέτη, λοιπόν, έρχεται σε αντίθεση με κάποιες προγενέστερες που ισχυρίζονταν ότι η υπερέκκριση TNF-α στον πνεύμονα οδηγεί σε πνευμονική ίνωση (93). Ενώ λοιπόν η IL-1 και ο TNF-α είναι καθοριστικές κυτταροκίνες της πρώιμης απάντησης στην δραστηριότητα των ινοβλαστών, πρέπει να αναφερθεί κι ένας ακόμη παράγοντας της κινητοποίησής τους, ο CD40. Οι ινοβλάστες του πνευμονικού επιθηλίου εκφράζουν αυτόν τον υποδοχέα, ο οποίος όταν διεγερθεί από το CD154, που προέρχεται από λευκοκύτταρα, αιμοπετάλια και μαστοκύτταρα, ενεργοποιείται προς παραγωγή μιας ποικιλίας παραγόντων, όπως προσταγλανδίνη Ε 2, ιντερλευκίνη-1 και ιντερλευκίνη-8. Αυτή η δράση παρουσιάζει ομοιότητες με αυτή της IL-1 και του TNF-α και φαίνεται ότι λαμβάνει χώρα μέσω της μετατόπισης του πυρηνικού παράγοντα NF-κΒ και της ενεργοποίησης, έτσι, των γονιδίων των υπεύθυνων για την έκφραση φλεγμονωδών παραγόντων. (94). Τα ευρήματα αυτά που αφορούν στο σύστημα CD40-CD40, στην ιντερλευκίνη-1 και στον TNF-α μπορεί να αποτελούν ουσιαστικά στοιχεία για την έναρξη και τη διαιώνιση της χρόνιας πνευμονικής φλεγμονής και ίνωσης με όλες τις καταστρεπτικές συνέπειες στο πνευμονικό παρέγχυμα και στη συνέχεια στη ζωή του ασθενούς. Η χορήγηση αντίtnf-α για τη θεραπεία της IPF αποτελεί θέμα έρευνας με αρκετά ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Γίνονται κλινικές μελέτες που στοχεύουν στην αναστολή της δράσης του TNF-α με την παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασής του με τον υποδοχέα του pp55. Έτσι, αίρεται η απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων κι επομένως περιορίζεται η ανάπτυξη φλεγμονής και πνευμονικής ίνωσης (89). Η ενδοθηλίνη-1, εκτός από τον αγγειοσυσπαστική της δράση, φαίνεται ότι διεγείρει επίσης τη χημειοταξία και τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών καθώς και τη σύνθεση κολλαγόνου, ενώ η υπερέκφρασή της σε πειραματόζωα οδηγεί στην ανάπτυξη πνευμονικής ίνωσης (90,124). Όλες οι παραπάνω μεσολαβητικές ουσίες έχουν ιδιότητες αναγνώρισης, αποκατάστασης, μετακίνησης και επιδιόρθωσης. 51

52 Στον τομέα της αναγνώρισης, ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχει αποδείξει τη σημασία της πρώιμης απάντησης προφλεγμονωδών παραγόντων όπως είναι οι TNF-α, IL-1 και το σύστημα CD40-CD40 και του ρόλου τους στην έναρξη της φλεγμονής. Πολλά έχουν γραφτεί επίσης για την συγκέντρωση των λευκοκυττάρων που σχετίζεται με την έκφραση και τη λειτουργία των χημειοκινών. Σε επίπεδο αποκατάστασης, οι βιολογικές ιδιότητες των παραπάνω στοιχείων μπορεί να σχετίζονται και με άλλους παράγοντες, όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, που όχι μόνο ρυθμίζουν το σχηματισμό του εξωκυττάριου υποστρώματος αλλά μπορεί να είναι υπεύθυνες και για τους ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια αυτών των κυττάρων (89,92). Άλλες έρευνες τόνισαν τη σημασία της ιδιότητας μετακίνησης αυτών των παραγόντων που έγκειται στο να βοηθούν ουσιαστικά τον ξενιστή να εκριζώσει τον εκλυτικό παράγοντα (90). Επίσης, σημαντικός είναι ο ρόλος παραγόντων που εμπλέκονται στη λύση της φλεγμονής και στην ανασχηματιστική φάση της επιδιόρθωσης του ιστού. Παρόλα αυτά, στην περίπτωση της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης και σε άλλες χρόνιες ινοβλαστικές ανωμαλίες η επιδιόρθωση δεν ρυθμίζεται καλώς στο σύνολό της και αποτυγχάνει να αποκαταστήσει τη φυσιολογική αρχιτεκτονική του πνευμονικού ιστού. 6.3 Κυτταρικός θάνατος Έχουν περιγραφεί δύο τύποι κυτταρικού θανάτου στον πνεύμονα: η νέκρωση και η απόπτωση. Σημαντικό ρόλο στο να καθοριστεί αν το είδος του κυτταρικού θανάτου θα είναι νέκρωση ή απόπτωση παίζει: α) το τοπικό περιβάλλον στο πνευμονικό επιθήλιο (βρογχικό ή κυψελιδικό επιθήλιο και διάμεσος χώρος), το οποίο ποικίλει στις διάφορες παθήσεις του πνευμονικού ιστού, β) το στάδιο ανάπτυξης και ωριμότητας του κυττάρου, καθώς και γ) κάποιες αδιευκρίνιστες ακόμα διαφορές μεταξύ των κυττάρων οι οποίες αφορούν σε γενετικές ανωμαλίες και μεταβολικές ή οξειδοαναγωγικές διαταραχές (192). α) Η νέκρωση χαρακτηρίζεται από οίδημα του κυττάρου, άμεση και 52

53 αθρόα εισροή ιόντων Ca ++, αποδιοργάνωση και ρήξη των μεμβρανών, απελευθέρωση του ενδοκυττάριου περιεχομένου και ως επακόλουθο ανάπτυξη φλεγμονωδών διεργασιών και φαγοκυττάρωσης. Είναι το αποτέλεσμα τραυματικών αιτίων θανάτου, όπως μηχανική βλάβη, έκθεση σε τοξικές χημικές ουσίες ή ισχαιμία στα πλαίσια χρόνιας ή οξείας πνευμονικής θρομβοεμβολικής νόσου κ.ά. (95). β) Η απόπτωση, η οποία αποτελεί μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, χαρακτηρίζεται από συμπύκνωση της χρωματίνης, συρρίκνωση του κυττάρου, σχετική σταθερότητα της δομής της μεμβράνης και έχει ως στόχο τη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των ιστών και την ελαχιστοποίηση της φλεγμονής με την απομάκρυνση των προσβεβλημένωνπασχόντων κυττάρων (96). Στην πνευμονική ίνωση λαμβάνει χώρα ο δεύτερος τύπος κυτταρικού θανάτου και γι αυτό, στα πλαίσια αυτής της διατριβής, θα επιμείνουμε στους μηχανισμούς πρόκλησης, την πορεία και το αποτέλεσμα της απόπτωσης στα επιθηλιακά κύτταρα ενός ινωτικού πνεύμονα. Η απόπτωση εμπλέκεται στην παθοφυσιολογία της πνευμονικής ίνωσης με δύο τρόπους. Από τη μία μεριά, η ίνωση μπορεί να προκληθεί από μία δυσλειτουργία του μηχανισμού της απόπτωσης. Δηλαδή, για να συμβεί η επιδιόρθωση του πνεύμονα μετά από μία οξεία βλάβη, όπως είναι η χορήγηση μπλεομυκίνης, απαιτείται η εξαφάνιση των υπερπλαστικών μεσεγχυματικών και φλεγμονωδών κυττάρων από τον κυψελιδικό χώρο ή τα κυψελιδικά τοιχώματα (305). Η αποτυχία να απομακρυνθούν τα ανεπιθύμητα κύτταρα με την απόπτωση θα παρατείνει τη φλεγμονή λόγω της απελευθέρωσης τοξικών παραγόντων από αυτά. Από την άλλη μεριά, η ίδια η υπερβολική απόπτωση, η οποία πιθανώς οφείλεται σε γονιδιακή ανωμαλία και υπερέκφραση του συστήματος Fas-FasL, μπορεί να προκαλέσει βλάβη διότι οδηγεί στην πέραν του φυσιολογικού καταστροφή κυττάρων (305). Για τη διεργασία του αποπτωτικού θανάτου απαιτείται η ενεργοποίηση συγκεκριμένων "γονιδίων κυτταρικού θανάτου" (π.χ. ced-3, bax, JNK. p38), νέα πρωτεϊνική σύνθεση και ενεργοποίηση ειδικών ενζύμων (κασπάσες), που βρίσκονται σε ανενεργή μορφή στο κύτταρο (188), με αποτέλεσμα μια σειρά από βιοχημικές αλλαγές, μεταξύ των οποίων είναι η αποδόμηση του DNA σε 53

54 συγκεκριμένα σημεία, ώστε να σχηματίζονται χαρακτηριστικά ολιγονουκλεοσωματίδια (107,108). Οι βιοχημικές διεργασίες που λαμβάνουν χώρα κατά την απόπτωση εμφανίζουν άμεση συσχέτιση και με τη σταδιακή αύξηση του ενδοκυττάριου Ca 2+, το σχηματισμό ελευθέρων ριζών, την i-nos, και τη λειτουργία των μιτοχονδρίων (108). Κατά την απόπτωση, η ακεραιότητα της κυτταροπλασματικής μεμβράνης διατηρείται. Κύριο ρόλο στην αποπτωτική διαδικασία παίζουν εξειδικευμένες ενδοκυττάριες πρωτεάσες, οι κασπάσες (caspases), οι οποίες υπάρχουν σε ανενεργή μορφή και ενεργοποιούνται όταν εκτίθεται το κύτταρο σε αποπτωτικά ερεθίσματα (95,98,101,291). Οι ενεργοποιημένες κασπάσες, μέσω μιας αλυσιδωτής αντίδρασης, προκαλούν τελικά την αποδιοργάνωση του DNA και την κατάτμηση του πυρήνα (188). Τα τμήματα του πυρηνικού περιεχομένου εγκυστώνονται και αποτελούν τα αποπτωτικά σωμάτια, που φαγοκυτταρώνονται τελικά από τα γειτονικά μακροφάγα. Με αυτό τον τρόπο δεν απομένει ελεύθερο χρωμοσωμιακό υλικό (95,99). Γνωστοί παράγοντες που μεσολαβούν προκειμένου να οδηγηθεί ένα κύτταρο σε απόπτωση είναι 1) τα αυξημένα επίπεδα οξειδωτικών ουσιών μέσα στα κύτταρα, 2) η βλάβη του DNA από οξειδωτικές ή άλλες ουσίες και 3) ορισμένα μόρια που ενεργοποιούν την απόπτωση, όπως ο TNF-α και ο διεγέρτης του επιφανειακού υποδοχέα απόπτωσης Fas (Fas ligand, FasL) (100,101,102, 191,291). Ο παράγοντας Fas είναι μέλος της οικογένειας των υποδοχέων του TNF-α και εκφράζεται σε διάφορα κύτταρα και ιστούς, μεταξύ των οποίων και ο πνευμονικός. Ο Fas-ligand (FasL), είναι ένα μόριο της κυτταρικής επιφάνειας, που ανήκει επίσης στην οικογένεια του TNF-α, δεσμεύεται από τον υποδοχέα του, Fas, και κινητοποιεί την εξωκυττάρια οδό της απόπτωσης. Ο FasL είναι ένα από τα σημαντικότερα μόρια που επιδρούν στα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, όπως τα CD8 + T κύτταρα και τα βοηθητικά CD4 + Τ κύτταρα (102,303). Στο ανοσοποιητικό σύστημα οι παράγοντες Fas και FasL εμπλέκονται στη διατήρηση της ανοσολογικής απάντησης σε χαμηλά επίπεδα και η όποια δυσλειτουργία του συστήματος αυτού (Fas-FasL) μπορεί να προκαλέσει υπερπλασία των λεμφοκυττάρων και κατά συνέπεια καταστροφή των ιστων (102,303,304). Σήμερα πολλές μελέτες αποδεικνύουν το βασικό ρόλο της απόπτωσης 54

55 στην παθογένεια της IPF (33,65,189,190,291). Πειραματικές μελέτες in vivo, στις οποίες χρησιμοποιείται μπλεομυκίνη για την πρόκληση ίνωσης στους πνεύμονες πειραματόζωων έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη ίνωσης μπορεί να ανασταλεί εν τη γενέσει της, αν παρεμποδισθεί η απόπτωση των κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων (102). Η παρεμπόδιση της απόπτωσης μπορεί να συντελεσθεί με διάφορους τρόπους, όπως η αναστολή της οδού Fas/Fasligand, της παραγωγής αγγειοτενσίνης και της ενεργοποίησης των κασπασών (102,191). Άλλες μελέτες in vivo έχουν επίσης δείξει ότι η απόπτωση του κυψελιδικού επιθηλίου είναι ιδιαίτερα αυξημένη στην IPF και ότι στα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα παρατηρείται αυξημένη έκφραση προαποπτωτικών πρωτεϊνών όπως η κασπάση-1, η κασπάση-3 και η πρωτεΐνη FADD (Fas-associating death domain) (103). Αυτή η αυξημένη έκφραση κασπασών είναι γνωστή ως «καταρράκτης κασπασών» και προκαλείται από τον παράγοντα Fas (103). Είναι χαρακτηριστικό ότι τα αποπτωτικά επιθηλιακά κύτταρα ανιχνεύονται κυρίως σε περιοχές παρακείμενες σε εστίες μυοϊνοβλαστών (104). Στην IPF οι ινοβλάστες παράγουν πεπτίδια αγγειοτενσίνης τα οποία προάγουν την απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων και ταυτόχρονα βρέθηκε ότι ο TGF-β και ο TNF-α προάγουν την επιθηλιακή απόπτωση (92). Ένας άλλος μηχανισμός φαίνεται ότι είναι η αυξημένη παραγωγή οξειδωτικών παραγόντων και η ελαττωμένη παραγωγή γλουταθειόνης (105,106). Παράλληλα τα επιθηλιακά κύτταρα ασθενών με IPF εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του υποδοχέα Fas, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή συμμετοχή του συστήματος Fas/Fas- ligand στην αυξημένη απόπτωση του επιθηλίου στην IPF (102,191,291). Τέλος, πρέπει να γίνει αναφορά στο πυρηνικό ένζυμο πολυ-adp-ριβόζοπολυμεράση-1 (poly ADP-ribose polymerase-1, PARP-1) που παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην πνευμονική βλάβη και έχει μελετηθεί πάρα πολύ η δράση του στον πνευμονικό ιστό, τόσο in vivo, όσο και in vitro ( ). Έχουν γίνει έρευνες σε πνευμονική φλεγμονή που προκλήθηκε κυρίως από λιποπολυσακχαρίτες (LPS), καθώς και στη χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (307) και έχει αποδειχθεί ότι επάγει τη φλεγμονή και την ίνωση βοηθώντας στην απελευθέρωση των φλεγμονωδών κυτταροκινών από τα επιθηλιακά κύτταρα ή αναστέλοντας τη δράση των κυτταροπροστατευτικών 55

56 μηχανισμών ( ). Ενεργοποιείται σε καταστάσεις "stress" και καταλύει την κατάτμηση του DNA και τη μεταφορά πολυμερών αλυσίδων γενετικού υλικού σε πυρηνικές πρωτεΐνες (180). Η in vitro ενεργοποίηση του ισοενζύμου PARP-1 φαίνεται να συσχετίζεται με τον παράγοντα που επάγει την απόπτωση (apoptosis inducing factor, AIF) στον πυρήνα και οδηγεί σε ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και απελευθέρωση κυτοχρώματος C (180). Η αυξημένη απόπτωση των κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων, που συντελείται με όλους τους παραπάνω τρόπους στην IPF ενδεχομένως να αποτελεί εν μέρει την αιτία της ανεπαρκούς επανεπιθηλιοποίησης που χαρακτηρίζει τη νόσο (65). 6.4 O ρόλος των κυτταροκινών Th-1 και Th-2 α) Γενικά Είναι αποδεδειγμένο ότι τα ώριμα Τ-λεμφοκύτταρα εκφράζουν σχεδόν πάντοτε είτε την πρωτεΐνη επιφανείας CD4, είτε την πρωτεΐνη επιφανείας CD8. Τα περισσότερα CD8 Τ λεμφοκύτταρα είναι κυτταροτοξικά (TC), ενώ τα CD4 Τ λεμφοκύτταρα, που αποτελούν το 70% του συνόλου των Τ- λεμφοκυττάρων του αίματος, είναι βοηθητικά (Τh) και προάγουν τον πολλαπλασιασμό, την ωρίμανση και την ανοσολογική λειτουργία άλλων κυτταρικών τύπων (101,241). Τα περισσότερα από τα ώριμα Τh λεμφοκύτταρα ανήκουν σε μία από δύο υποομάδες (Τh-1 και Τh-2). Το χαρακτηριστικό των υποομάδων αυτών είναι οι κυτταροκίνες που παράγουν και οι οποίες προάγουν διαφορετικούς τύπους ανοσολογικών αντιδράσεων (110,241). Επίσης η ανακάλυψη ότι οι υποομάδες των Th κυττάρων μπορούν να ταξινομηθούν με βάση το προφίλ των παραγομένων κυτταροκινών, προσέφερε ως ένα βαθμό ερμηνεία για τις χρόνιες ανοσολογικές καταστάσεις και νόσους. Οι τύπου Ι (Th-1) κυτταροκίνες περιλαμβάνουν: τις IL-2, IL-12, IL-18, την IFN-γ και τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων-β (tumor necrosis factor-β, TNF-β). Προάγουν τις αμυντικές αντιδράσεις του οργανισμού που σχετίζονται με τα μακροφάγα και άλλα φαγοκύτταρα, και αφορούν την ενδοκυττάρια καταστροφή των παθογόνων (121). 56

57 Οι τύπου ΙΙ (Th-2) κυτταροκίνες περιλαμβάνουν με τη σειρά τους τις : IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 και IL-13. Οι κυτταροκίνες αυτές αφενός δρουν ως χημειοτακτικοί παράγοντες για τα Β-λεμφοκύτταρα, τα σιτευτικά κύτταρα, τα βασεόφιλα και τα εωσινόφιλα και αφετέρου προάγουν την αύξηση και τη διαφοροποίηση των κυτταρικών αυτών τύπων στο σημείο της ανοσολογικής αντίδρασης (121). Επιπλέον, η IL-4 δρα στα Β-λεμφοκύτταρα για τη μετατροπή της τάξης των ανοσοσφαιρινών σε IgΕ, που συνδέονται στα σιτευτικά κύτταρα και τα εωσινόφιλα, γεγονός που τα καθιστά ικανά να αναγνωρίζουν και να αντιδρούν στα αντιγόνα (113). Αυτός ο τύπος ανοσολογικής απάντησης είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικός έναντι μεγάλων και πολυκυτταρικών παρασίτων (110). Η ανακάλυψη ότι οι Th-1 και Th-2 κυτταροκίνες εκφράζονται από μια ποικιλία κυττάρων και ότι οι λειτουργίες τους διαφέρουν, πιθανόν να σημαίνει ότι μια διαταραχή στην ισορροπία έκφρασης των Th-1 και Th-2 μπορεί να είναι σημαντική στο να υπαγορεύει διαφορετικές ανοσοπαθολογικές απαντήσεις. Επίσης, είναι ενδιαφέρον να τονιστεί ότι οι κυτταροκίνες που παράγονται από τα κύτταρα της κάθε υποομάδας έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν την ανάπτυξη της άλλης (110). Σε μία ανοσολογική αντίδραση μπορεί τον κυρίαρχο ρόλο να παίζει η μία ή η άλλη υποομάδα, γεγονός ιδιαίτερα ωφέλιμο επειδή έτσι δίνεται η καλύτερη απάντηση ανάλογα με τον τύπο του αντιγόνου. Η δράση των Τh-1 ή Τh-2 κυττάρων είναι εμφανής και στις επιβλαβείς για τον οργανισμό ανοσολογικές αντιδράσεις. Ειδικότερα, στις αυτοάνοσες διαταραχές, όπως το σκληρόδερμα και η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου, η βασική αντίδραση είναι τύπου Τh-1. Αντίθετα στις αλλεργικές αντιδράσεις, όπως η εποχιακή ρινίτιδα και το άσθμα, στις οποίες βασικό ρόλο παίζουν τα εωσινόφιλα, τα σιτευτικά κύτταρα και οι IgE, η ανοσολογική αντίδραση είναι τύπου Τh-2. Δεν είναι ακόμη γνωστό αν η ανάπτυξη τέτοιων διαταραχών είναι αποτέλεσμα γενετικής προδιάθεσης προς Τh-1 ή Τh-2 απάντηση (110). Πάντως, πιθανολογείται ότι συμμετέχουν τόσο γενετικοί όσο και περιβαλλοντικοί παράγοντες στην παθογένεια αυτών των διαταραχών, κι έτσι το μοντέλο των κυτταροκινών για ορισμένες νόσους είναι συχνά το σωστό και το αναμενόμενο, ενώ υπάρχουν σοβαρές παθολογικές συνέπειες αν εκφραστεί ένας λανθασμένος φαινότυπος κυτταροκινών. Αυτή η τελευταία κατάσταση μπορεί να παίξει κάποιο ρόλο σε συγκεκριμένες χρόνιες 57

58 φλεγμονώδεις νόσους, όπως η πνευμονική ίνωση, όπου στην ουσία άγνωστες αιτίες οδηγούν σε ανώμαλη ρύθμιση με χρόνια φλεγμονή, ινοβλάστωση, εναπόθεση εξωκυττάριου υποστρώματος, αγγειογένεση και τελικού σταδίου νόσο. β) Κυτταροκίνες και πνευμονική ίνωση Σύμφωνα με πρόσφατες ενδείξεις, στους πνεύμονες ασθενών με IPF η έκφραση των Τh-2 κυτταροκινών υπερτερεί έναντι των Τh-1 κυτταροκινών και ιδιαίτερα της IFN-γ (33,65). Φαίνεται ότι ενώ οι Τh-2 κυτταροκίνες ενεργοποιούν τους ινοβλάστες και επάγουν την παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας, οι Τh-1 κυτταροκίνες έχουν κατασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και την παραγωγή κολλαγόνου (65,86). Συγκεκριμένα, όσον αφορά στην IFN-γ, υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα μελετών για τη δράση της στην πνευμονική ίνωση και το ρόλο που παίζει στη θεραπεία της νόσου (33,65). Αφενός αναφέρεται ελάττωσή της στην IPF, αφετέρου έχει αποδειχθεί ότι η IFN-γ έχει έντονη δράση στην παραγωγή των πρωτεϊνών του εξωκυττάριου υποστρώματος, όπως το κολλαγόνο και η ινική (125). Βοηθάει από τη μια μεριά, τουλάχιστον in vitro, στην παραγωγή τόσο του κολλαγόνου των ινοβλαστών, όσο και των χονδροκυττάρων, και από την άλλη προκαλεί μείωση της έκφρασης του mrna των προκολλαγόνων τύπου Ι και τύπου ΙΙΙ. Ελαττώνει την αύξηση των ινοβλαστών που προκαλείται από το PDGF, αλλά συγχρόνως ενισχύει την παραγωγή του PDGF με τα κυψελιδικά μακροφάγα (33,65,111). Είναι ο ρυθμιστής της έκφρασης του γονιδίου της βασικής υπεύθυνης για την αποδόμηση του υποστρώματος μεταλλοπρωτεϊνάσης, της στρωμελυσίνης-1 (sromelysin-1) (111), όμως εμποδίζει ισχυρά την εωσινοφιλική χημειοκίνη C και ρυθμίζει την επούλωση του κυτταροπλάσματος των ινοβλαστών, μετά από βλάβη, με διαφορετικό τρόπο από ό,τι την επούλωση των κυττάρων των αγγείων (122). Η χορήγηση IFN-γ σε ζώα που έχουν ίνωση μπορεί να προκαλέσει, in vivo, ελάττωση του εξωκυττάριου υποστρώματος. Επιπλέον η χορήγησή της για ένα χρόνο σε ασθενείς που πάσχουν από συστηματική σκλήρυνση ή ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση συνδυάζεται με βελτίωση της πνευμονικής λειτουργίας και της ανταλλαγής των αερίων με ικανοποιητική PaO2 κατά την άσκηση και την ξεκούραση. Αυτές οι πληροφορίες 58

59 υποστηρίζουν τη θεωρία ότι η IFN-γ, παρά τα αντιφατικά χαρακτηριστικά της, είναι μία από τις σπουδαιότερες κυτταροκίνες, η οποία έχει ρυθμιστική δράση κατά τη διάρκεια χρόνιας φλεγμονής και ίνωσης, κυρίως όσον αφορά στην εναπόθεση κολλαγόνου (33,65,111,112). Ενώ άλλες κυτταροκίνες τύπου Ι δεν έχουν εκτιμηθεί αρκετά για το ρόλο τους στην πνευμονική ίνωση, η IL-12 και η IL-18 είναι σημαντικές για την έναρξη δράσης της IFN-γ. Έχει αποδειχθεί ότι η χορήγηση IL-12 εξασθενεί την πνευμονική ίνωση με έναν μηχανισμό, ο οποίος εξαρτάται από την IFN-γ. Η χορήγησή της σε επίμυες που είχαν ίνωση λόγω μπλεομυκίνης κατέληξε σε συγκεκριμένη δράση της IFN-γ με παράλληλη μείωση της πνευμονικής ίνωσης. Το ανασταλτικό αποτέλεσμα, το οποίο επιφέρει η δράση της IL-12, στην ίνωση, θα μπορούσε να αποφευχθεί πλήρως αν τα ζώα είχαν υποστεί προηγουμένως παθητική ανοσοποίηση με εξασθενημένα αντισώματα κατά της IFN-γ (111,112). Τα αντίθετα αποτελέσματα των κυτταροκινών Th-1 και Th-2 στην ίνωση υποστηρίζονται από μία σειρά ερευνών που δείχνουν ότι η IL-4 είναι σημαντικός μεσολαβητής της ενεργοποίησης των ινοβλαστών (113,114). Σε αντίθεση με την IFN-γ, η IL-4 μέλος της οικογένειας των Th-2 κυτταροκινών επάγει την παραγωγή εξωκυττάριου υποστρώματος προερχόμενου από τους ινοβλάστες, συμπεριλαμβανομένων και των προκολλαγόνων Ι και ΙΙΙ και της ινικής (113). Η δράση της IL-4 στους ινοβλάστες οδηγεί στην αύξηση των επιπέδων του mrna και των πρωτεϊνών του εξωκυττάριου υποστρώματος. Έχει αναγνωρισθεί ως χημειοτακτικός παράγοντας για τους ινοβλάστες και μπορεί να προκαλέσει έναρξη ινοβλάστωσης και παραγωγής κυτταροκινών. Ενδιαφέρον προκαλεί, όμως, το γεγονός ότι ο βαθμός σύνθεσης κολλαγόνου από τους ινοβλάστες λόγω δράσης της IL-4 είναι περίπου ο ίδιος με αυτόν της σύνθεσης του κολλαγόνου που παράγεται λόγω του TGF-β (115,116). Η πληροφορία αυτή υποβαθμίζει την πλειοτροπική δράση της IL-4 και οδηγεί στην κατάταξη των ινοβλαστών στην ίδια κατηγορία με τα Β κύτταρα, τα Τ κύτταρα, τα μαστικά κύτταρα και τα αιμοποιητικά αρχέγονα κύτταρα (113). Η IL-13 έχει παρόμοιες βιολογικές ιδιότητες με την IL-4 κι έχει εμπλακεί στην παθογένεια των ινοβλαστικών δυσλειτουργιών. Προκαλεί παραγωγή προκολλαγόνων τύπου Ι και ΙΙΙ που προέρχονται από τους ινοβλάστες σε παρόμοιες ποσότητες με την IL-4 και τον TGF-β (113). Επίσης η IL-13 59

60 εμποδίζει την παραγωγή μεταλλοπρωτεϊνασών MMP-1 και MMP-3 που προέρχονται από την IL-1 και αυξάνει την παραγωγή των αναστολέων τους TIMPs-1 (Tissue inhibitor of metalloproteinases) (117,118). Πρόσφατα, η IL- 13 προκάλεσε στους πνεύμονες, και συγκεκριμένα στα κύτταρα του βρογχικού επιθηλίου, υπερέκφραση του γονιδίου και κατά συνέπεια υπερέκκριση της πρωτεΐνης CCSP (Clara Cell Secretory Protein). Οι επίμυες που μελετήθηκαν λαμβάνοντας εξωγενώς IL-13 έδειξαν υπερτροφία των επιθηλιακών κυττάρων των αεραγωγών, εξαλλαγή, εναπόθεση κρυστάλλων Charcot-Leyden και ίνωση του επιθηλίου του αεραγωγού. Τα στοιχεία αυτά δείχνουν τόσο την προϊνωτική δράση της IL-13 στην ομοιόσταση του κολλαγόνου, όσο και τη διαφορετική ρύθμιση της ομοιόστασης του κολλαγόνου στις υποομάδες ινοβλαστών από την IL-13 (306). Ο πνευμονικός ιστός ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση έχει εξεταστεί για την παρουσία κυτταροκινών Th-1 και Th-2 με in situ υβριδοποίηση και ανοσοκαθήλωση πρωτεϊνών τους (119). Αν και υπάρχει ένα μοντέλο για την ύπαρξη τόσο των Th-1 ( χαρακτηρίζεται από την έκφραση IFN-γ ) όσο και Th-2 (χαρακτηρίζεται από την έκφραση IL-4 και IL-5) στον πνευμονικό ιστό ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση, η παρουσία των Th-2 κυτταροκινών επικρατεί έναντι της έκφρασης ιντερφερόνης-γ (112,119,120). Αυτό το μοντέλο μπορεί να συσχετιστεί με το δυναμικό ρόλο της χυμικής απάντησης στην παθογένεια της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης ή να συσχετίζεται με την ανικανότητα της ιντερφερόνης-γ να διαταράξει την ισορροπία ενός προϊνωτικού περιβάλλοντος που εξαρτάται από το σύστημα IL-4 και IL-13 (113,118). Αυτή τη θεωρία της ανισορροπίας μεταξύ κυτταροκινών και IFN-γ έρχεται να υποστηρίξει το εύρημα ότι τα επίπεδα της IFN-γ είναι αντιστρόφως ανάλογα με τα επίπεδα του προκολλαγόνου τύπου ΙΙΙ στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BALF) ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση. Τα επίπεδα της ιντερφερόνης-γ έχουν σχέση με ασθενείς που παρουσιάζουν επέκταση της ίνωσής τους με απόδειξη την επιδείνωση της πνευμονικής τους λειτουργίας (112). Αυτά τα ευρήματα έχουν επιβεβαιωθεί με άλλα νεότερα, ότι δηλαδή ασθενείς με IPF στους οποίους είχε αποτύχει η θεραπεία με τα συμβατικά ανοσοκατασταλτικά φάρμακα, όταν χρησιμοποιήθηκε η ιντερφερόνη-γ για ένα χρόνο απάντησαν με βελτιωμένη 60

61 πνευμονική λειτουργία και βελτιωμένη PaO2 τόσο στην ξεκούραση, όσο και την άσκηση (111). Η επικράτηση των κυτταροκινών Th-2 έναντι των Th-1 στη χρόνια φλεγμονή ινοβλάστωση της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης υποστηρίζει τη θεωρία ότι αυτές οι κυτταροκίνες είναι πιθανώς ακατάλληλες να εξαφανίσουν ολοσχερώς το υπάρχον αντιγόνο και η προαγωγή της ίνωσης από τις Th-2 κυτταροκίνες μπορεί να είναι μια ύστατη προσπάθεια να παγιδευτεί ή να εξαφανισθεί το αντιγόνο (120). 6.5 Αγγειογένεση Η αγγειογένεση είναι θεμελιώδες συστατικό της φλεγμονής και της επούλωσης τραύματος που σχετίζεται με την πνευμονική ίνωση. Παρόλα αυτά, μόνο πρόσφατα έγινε προφανές ότι η αρρύθμιστη και ανεξέλεγκτη αγγειογένεση μπορεί να λειτουργεί υποστηρικτικά προς την ινοπλασία και την εναπόθεση εξωκυττάριου υποστρώματος, που λαμβάνει χώρα στις χρόνιες ινοβλαστικές δυσλειτουργίες, όπως είναι η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (125). Υπάρχουν πολύ λίγες μελέτες για την αγγειογένεση στην IPF, σύμφωνα με τις οποίες αυτή εμπλέκεται στις αναστομώσεις της συστηματικής και της πνευμονικής κυκλοφορίας, που παρατηρούνται στις ινωτικές περιοχές (126,318). Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, μέσω της αποδόμησης της εξωκυττάριας ουσίας, ενδεχομένως ξεκινούν και προάγουν την αγγειογένεση, ενώ οι αναστολείς τους εμποδίζουν τη δημιουργία νέων αγγείων (127). Ο ρόλος της αγγειογένεσης στην IPF δεν είναι γνωστός (318). Θεωρητικά η αγγειογένεση θα μπορούσε να έχει καταστροφικές συνέπειες στην ίνωση (όπως στον καρκίνο), να μην παίζει καθόλου ρόλο ή να έχει αντιινωτική δράση (127,128). Υπάρχουν μελέτες σύμφωνα με τις οποίες στην IPF υπάρχει αυξημένη αγγειογενετική δραστηριότητα, που οφείλεται σε διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ διαφόρων προαγγειογενετικών και αντιαγγειογενετικών κυτταροκινών (129). Παράλληλα όμως άλλες μελέτες δείχνουν έλλειψη έκφρασης προαγγειογενετικών πρωτεϊνών στις ινοβλαστικές εστίες (130,131). Ορισμένοι συγγραφείς πιστεύουν ότι στα αρχικά στάδια της IPF παρατηρείται αυξημένη αγγειογένεση, ενώ στα πιο προχωρημένα στάδια υπάρχει απώλεια αγγείων (33). Σε όλες τις παραπάνω εργασίες τα αποτελέσματα γύρω από το 61

62 ρόλο της αγγειογένεσης στην πνευμονική ίνωση είναι απολύτως αντιφατικά. Άλλες υποστηρίζουν ότι η αγγειογένεση επάγει την ίνωση λόγω της αυξημένης αιμάτωσης τοπικά από τη δράση των MMPs και άλλες ότι είναι αδιάφορη ή ότι η ίνωση αναστέλλει την αγγειογένεση μέσω της αυξημένης παραγωγής και δράσης των TIMPs (127). Σε κάθε περίπτωση πάντως ο ρόλος της αγγειογένεσης στην πνευμονική ίνωση ή το αντίστροφο, πρέπει να αποτελέσει αντικείμενο πλατιάς έρευνας στο μέλλον. 6.6 Εξωκυττάρια ουσία και ιστική αναδόμηση Ο σχηματισμός του εξωκυττάριου υποστρώματος και η επαναδόμησή του είναι σημαντικά γεγονότα που συνδέονται με την παθογένεια της πνευμονικής ίνωσης. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, ανάμεσα στα κύτταρα του πνευμονικού παρεγχύματος, τις μεσολαβητικές ουσίες και την εξωκυττάρια ουσία υπάρχει συντονισμός, με αποτέλεσμα τη φυσιολογική δομή και λειτουργία του πνεύμονα. Αυτό όμως που συμβαίνει στην IPF είναι η αναίτια παθολογική ιστική αναδόμηση (remodeling), που συνίσταται σε υπερβολική εναπόθεση συνδετικού ιστού και στην επακόλουθη καταστροφή του παρεγχύματος με το σχηματισμό αλλοιώσεων τύπου μελισσοκηρήθρας (31,33). Οι μοριακοί μηχανισμοί που ευθύνονται για την παθολογική αυτή αναδόμηση δεν είναι πλήρως κατανοητοί (52). Παρόλα αυτά, είναι πιθανό ότι για την αυξημένη συσσώρευση εξωκυττάριας ουσίας που αποτελεί βασικό χαρακτηριστικό της IPF, εν μέρει υπεύθυνη είναι η ανεπαρκής αποδόμησή της (93,117). Η ρύθμιση της φυσιολογικής αποδόμησης της εξωκυττάριας ουσίας εξαρτάται από δύο ομάδες πρωτεϊνών: α) τις μεταλλοπρωτεϊνάσες του υποστρώματος (Matrix metalloproeinases, MMPs) και β) τους αναστολείς τους (Tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs) (31,33,93,117). Οι MMPs αποτελούν μια πολυγονιδιακή ομάδα εκκρινόμενων ή δεσμευμένων με την κυτταρική μεμβράνη ψευδαργυρο-εξαρτώμενων ενδοπεπτιδασών, οι οποίες είναι υπεύθυνες για τις μεταβολές στο εξωκυττάριο υπόστρωμα, τον καταβολισμό βιοενεργών πρωτεϊνών και τη διασύνδεση με τους μεμβρανικούς υποδοχείς. Τυπικά αναγνωρίζονται ως ένζυμα που εμπλέκονται στην αποδόμηση του υποστρώματος, στις 62

63 διαδικασίες αναδιαμόρφωσης των ιστών κατά τη διάρκεια αναπτυξιακών διεργασιών και της ομοιοστασίας (117). Η ομάδα των μεταλλοπρωτεϊνασών αποτελείται κυρίως από την κολλαγενάση-1 (MMP-1) και τις ζελατινάσες A και B (MMP-2 και MMP-9 αντίστοιχα), ενώ η ομάδα των αναστολέων περιλαμβάνει τους τέσσερεις TIMPs (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 και TIMP-4) (52,132). Υπάρχουν πρόσφατες ενδείξεις ότι στην IPF συντελούνται μεγάλες αλλαγές στην έκφραση και εντόπιση τόσο των MMPs, όσο και των TIMPs (52). Σύμφωνα με τις ενδείξεις αυτές παρατηρείται αύξηση όλων των παραπάνω πρωτεϊνών (52). Η εντόπιση των μορίων αυτών παίζει καθοριστικό ρόλο και είναι αξιοσημείωτο ότι ενώ η MMP-1 βρίσκεται στα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα και τα μακροφάγα, απουσιάζει από τους ινοβλάστες και την εξωκυττάρια ουσία. Αντίθετα οι αναστολείς κατανέμονται σε όλο το πνευμονικό παρέγχυμα. Ιδιαίτερα ο TIMP-2 βρίσκεται κατά κύριο λόγο στους μυοϊνοβλάστες μέσα στις ινοβλαστικές εστίες (117,132). Ο πιθανός ρόλος των ΜΜΡ είναι να προσφέρουν βοήθεια στην επανεπιθηλιοποίηση σε μια ύστατη προσπάθεια να επαναφέρουν τη βρογχοποίηση μετά από βλάβη των κυψελίδων και να μετέχουν στην επαναδόμηση του εξωκυττάριου υποστρώματος κατά τη διάρκεια ανωμαλιών που σχετίζονται με την πνευμονική ίνωση (117). Οι MMPs πέρα από το ρόλο που παίζουν στην παθογένεια της πνευμονικής ίνωσης, έχουν ενεργό δράση, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, τόσο στην ομοιόσταση του ΚΝΣ όσο και στην παθοφυσιολογία πολλών παθήσεων αυτού, όπως σε ισχαιμία, σε νευροεκφυλιστικά νοσήματα καθώς και σε φλεγμονή του νευρικού ιστού (134,135,136). 6.7 Ινοβλαστικές εστίες - Μυοϊνοβλάστες Από όσα αναφέρθηκαν παραπάνω είναι φανερό ότι το επιθήλιο συμμετέχει στην παθογένεια της ίνωσης ποικιλοτρόπως. Εκτός του ότι τα επιθηλιακά κύτταρα είναι ο τόπος της αρχικής βλάβης, το επιθήλιο συμβάλλει, μέσω των μορίων που παράγει, και στην αναστολή της ινωδόλυσης, την 63

64 προαγωγή ανοσιακής απάντησης τύπου Τh-2 και την ενεργοποίηση των ινοβλαστών (33). Οι ινοβλάστες είναι εξίσου σημαντικά κύτταρα στην παθογένεια της IPF. Φαίνεται ότι η πιο πρώιμη και ενδεχομένως η μόνη μορφολογική αλλαγή που σχετίζεται με την ανάπτυξη ίνωσης είναι η παρουσία των ινοβλαστικών εστιών (31). Οι ινοβλαστικές εστίες αποτελούν μικροσκοπικές περιοχές οξέος πνευμονικού τραύματος, στις οποίες τα επιθηλιακά κύτταρα καταστρέφονται και η βασική μεμβράνη διασπάται και καταστρέφεται κατά τόπους. Ο πολλαπλασιασμός των ινοβλαστών που ακολουθεί έχει ως στόχο την αποκατάσταση των κυψελίδων με την παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας (5,52). Φλεγμονή μπορεί να συνυπάρχει αλλά δεν αποτελεί το κυρίαρχο χαρακτηριστικό (52). Οι εστίες ινοβλαστών βρίσκονται είτε στο διάμεσο υποεπιθηλιακό χώρο είτε μέσα στις κυψελίδες, όπου στο τελικό στάδιο της ίνωσης, όταν υπάρχει λύση της βασικής μεμβράνης, μεταναστεύουν οι ινοβλάστες (6,52). Μέσα σε αυτές τις εστίες οι ινοβλάστες αλληλεπιδρούν συνεχώς με το περιβάλλον τους και διέρχονται από μια σειρά φαινοτυπικών μεταβολών. Δηλαδή, αποκτούν αρχικά ένα μεταναστευτικό φαινότυπο, μετά έναν υπερπλαστικό (proliferative) και στο τέλος ένα προϊνωτικό φαινότυπο, κατά τον οποίο τα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας παράγονται σε αφθονία (31). Οι μεταβολές αυτές, που υπάρχουν και κατά τη φυσιολογική επούλωση, φαίνεται ότι απορρυθμίζονται κατά την ίνωση. Είναι πιθανό ότι με την επίδραση κάποιου άγνωστου παράγοντα, τα επιθηλιακά κύτταρα ενεργοποιούνται και επάγουν την παραγωγή προϊνωτικών μορίων, που με τη σειρά τους δρουν σε γενετικά ελαττωματικούς ινοβλάστες, με αποτέλεσμα μια συνεχή ινωτική απάντηση (31). Οι ινοβλάστες δεν αποτελούν έναν ομοιογενή πληθυσμό (93). Οι μυοϊνοβλάστες είναι ένας μοναδικός υποπληθυσμός των ινοβλαστών, ο οποίος έχει ορισμένες ιδιότητες λείων μυικών κυττάρων, όπως η παραγωγή της α-ακτίνης των λείων μυικών ινών (α-smooth muscle actin, α-sma) (93). Οι μυοϊνοβλάστες αυξάνονται στους πνεύμονες ασθενών με IPF και αποτελούν βασικό χαρακτηριστικό των ινοβλαστικών εστιών. Πρόκειται για κύτταρα με "επιθετική" συμπεριφορά, τα οποία είναι και τα κατεξοχήν υπεύθυνα για την παραγωγή κολλαγόνου (141). Το προγονικό κύτταρο των μυοϊνοβλαστών 64

65 είναι άγνωστο. Θεωρείται ότι είναι είτε οι ινοβλάστες του διάμεσου ιστού, είτε τα λεία μυϊκά κύτταρα των κυψελιδικών πόρων (10). Ο αυξημένος αριθμός μυοϊνοβλαστών στις ινοβλαστικές εστίες στην IPF έχει πολλές επικίνδυνες επιπτώσεις, που αφορούν τη σύσπαση, την ελαττωμένη ευενδοτότητα και τη διαταραχή της αρχιτεκτονικής του πνευμονικού παρεγχύματος (385). Εκτός από την παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας και την ικανότητά τους για σύσπαση, οι μυοϊνοβλάστες παράγουν παράγοντες που συμμετέχουν στη διαδικασία απόπτωσης των επιθηλιακών κυττάρων (142). Είναι ενδιαφέρον ότι στην IPF ο ινωτικός παράγοντας TGF-β εμποδίζει την απόπτωση των μυοϊνοβλαστών, με αποτέλεσμα οι μυοϊνοβλάστες να μην αποπίπτουν όπως θα αναμενόταν, μόλις ολοκληρωθεί η αποκατάσταση, αλλά να παραμένουν (83,115,116). Ο συνδυασμός της αυξημένης απόπτωσης των επιθηλιακών κυττάρων και της ελαττωμένης απόπτωσης των μυοϊνοβλαστών είναι το "παράδοξο" της IPF (5,33). Τέλος, οι ινοβλάστες των ασθενών με IPF εκφράζουν in vitro σημαντικά μεγαλύτερες ποσότητες TIMPs από τους ινοβλάστες των φυσιολογικών ατόμων, ενώ αντίστοιχη διαφορά στην έκφραση της κολλαγενάσης-1 δεν παρατηρήθηκε (93). Η παρουσία της κολλαγενάσης-1 στο επιθήλιο δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί πλήρως, αλλά μία βάσιμη υπόθεση είναι ότι παίζει κάποιο ρόλο στη μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων (52). Όσον αφορά στις MMP-2 και MMP-9, αυτές έχουν εντοπιστεί σε πολλούς τύπους κυττάρων, μεταξύ των οποίων και οι υποεπιθηλιακοί ινοβλάστες και μυοϊνοβλάστες, γεγονός που καθιστά πιθανό το ενδεχόμενο, ότι τα μόρια αυτά συμμετέχουν στη διάσπαση της βασικής μεμβράνης (52). Η διάσπαση αυτή είναι πολύ σημαντική στην παθογένεια της IPF, καθώς συμβάλλει στην ανεπαρκή επανεπιθηλιοποίηση που παρατηρείται στη νόσο, ενώ παράλληλα διευκολύνει τη μετανάστευση ινοβλαστών και μυοϊνοβλαστών στους κυψελιδικούς αεροχώρους ευνοώντας έτσι την εμφάνιση της λεγόμενης ινοβλάστωσης (52,117,133). Η ινοβλάστωση είναι ουσιαστικής σημασίας για την πνευμονική ίνωση. Η δράση του υποδοχέα τυροσίνης και η δράση της κινάσης ΜΑΡ (Mitogen Activation Protein Kinase) είναι σπουδαίες για την έναρξη των μοριακών αντιδράσεων που οδηγούν στην ινοβλάστωση (133). Η αναστολή της δράσης της κινάσης τυροσίνης έχει σαν αποτέλεσμα την ελάττωση της 65

66 πνευμονικής ίνωσης, γεγονός το οποίο δείχνει ότι αν υπάρξει θεραπευτική επέμβαση σε αυτό το σημείο της αλυσίδας τότε μπορεί να έχουμε και θεραπευτικό αποτέλεσμα έως ένα βαθμό και στην πνευμονική ίνωση (133). 6.8 Πνευμονική ίνωση και κληρονομικότητα Η μη φυσιολογική έκφραση οποιουδήποτε αριθμού γονιδίων, που ελέγχουν την ανοσολογική απάντηση στο τραύμα, στο μεταβολισμό του κολλαγόνου και τη δραστηριότητα των ινοβλαστών, δυνητικά θα μπορούσε να οδηγήσει στην ανάπτυξη πνευμονικής ίνωσης (257). Η ύπαρξη οικογενών τύπων πνευμονικής ίνωσης υπονοεί, πιθανώς, ότι οι γενετικές ανωμαλίες μπορούν είτε να οδηγήσουν με άμεσο τρόπο στην έναρξη της διάμεσης ίνωσης, ίσως προκαλώντας αυξημένη σύνθεση πρωτεϊνών του υποστρώματος, είτε με έμμεσο τρόπο τροποποιώντας την απάντηση του ξενιστή σε ένα τραυματικό γεγονός. Επιπλέον, ένας μεγάλος αριθμός αιτιολογικών παραγόντων που ενοχοποιήθηκαν στην παθογένεια της μη οικογενούς πνευμονικής ίνωσης θα μπορούσαν να προέλθουν ή να οδηγήσουν σε γονοτυπικές μεταβολές. Στους ανθρώπους υπάρχει συχνά μια ποικιλία στις απαντήσεις προς τους προϊνωτικούς παράγοντες ακόμα και όταν ο βαθμός έκθεσης σε αυτούς είναι παρόμοιος. Το γεγονός αυτό μπορεί να αποτελεί άλλη μια προϋπόθεση για ίνωση, που θα αποκτούνταν μέσω της ανοσολογικής ευαισθητοποίησης, αλλά θα μπορούσε να κληρονομηθεί (257). Τέλος, πολλά ζώα δείχνουν διαφορετική απάντηση σε προϊνωτικούς παράγοντες και κάτω από φυσιολογικές συνθήκες είτε στερούνται, είτε υπερεκφράζουν γονίδια κυτταροκινών και άρα μπορούν ή αδυνατούν να αναπτύξουν ίνωση αντίστοιχα (257). 6.9 Συμπέρασμα Παρά την πληθώρα των μελετών που έχουν διεξαχθεί, η παθογένεια της IPF δεν είναι ακόμη επαρκώς κατανοητή. Φαίνεται όμως ότι σήμερα απομακρύνεται κανείς από την υπόθεση της φλεγμονώδους νόσου και προσανατολίζεται, με βάση τα νέα δεδομένα, στο ότι πρόκειται για μια διαταραχή της επούλωσης του επιθηλίου (abnormal wound healing) (31). Η 66

67 διαταραχή αυτή χαρακτηρίζεται από πολλαπλασιασμό και μετανάστευση μυοϊνοβλαστών και ινοβλαστών, ελαττωμένη απόπτωση μυοϊνοβλαστών, αυξημένη δραστηριότητα κυτταροκινών (TGF-β, TNF-α) που οδηγούν σε ίνωση, απουσία επαρκούς επανεπιθηλιοποίησης και ελαττωματική αναδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας (31). Πιθανόν λοιπόν, μία βλάβη του επιθηλίου ή φλεγμονή των κυψελίδων που προκαλείται από έξοδο πλάσματος και αυξημένη παρουσία μακροφάγων, να είναι η αρχική αιτία που οδηγεί σε κλινική νόσο. Η ίνωση που προκύπτει από χημειοθεραπευτικούς παράγοντες έχει ιδιαίτερα συνδεθεί με δυσπλαστικά επιθηλιακά κυψελιδικά κύτταρα χωρίς όμως κάτι τέτοιο να θεωρείται παθογνωμονικό (55). Είναι προφανές, λοιπόν, ότι όταν μιλάμε για πνευμονική ίνωση έχουμε μία τελείως θολή εικόνα της παθογένειας αυτής της διαταραχής παρά τα όσα αναφέρθηκαν. Πρόκειται για ένα μη ομοιόμορφο, ετερογενές σχέδιο εναλλασσόμενων περιοχών, στις οποίες συναντώνται: 1) εναπόθεση ινοβλαστών του εξωκυττάριου υποστρώματος, 2) φλεγμονή (εστίες ινοβλαστών), 3) κυψελίδες του πνευμονικού παρεγχύματος με απώλεια της φυσιολογικής αρχιτεκτονικής δομής τους και 4) φυσιολογικός πνευμονικός ιστός (54,55). Ο κοκκιωματώδης ιστός βρίσκεται στο υψηλότερο δυνατό σημείο παραγωγής του κατά τη διάρκεια της επαναεπιθηλιοποίησης που ακολουθεί τη βλάβη. Παρέχει τα θεμέλια για την παραγωγή επιθηλιακών κυττάρων και τη δημιουργία της βασικής μεμβράνης. Η παραγωγή του επιβεβαιώνεται με διήθηση σημασμένων μονοπύρηνων κυττάρων, αγγειογένεση και ινοβλάστωση με εναπόθεση εξωκυττάριου υποστρώματος και κάτω από κανονικές συνθήκες επούλωσης ο σχηματισμός του γίνεται προσωρινά φυσιολογικά. Αυτό εμφανίζεται συγχρόνως με επανεπιθηλιοποίηση, η οποία οδηγεί στην εγκατάσταση φυσιολογικού πνευμονικού παρεγχύματος και συγχρόνως τονίζει τη σημασία της αλληλεπίδρασης των κυττάρων διαφορετικών τύπων (66). Είναι το ίδιο σημαντικό να υποθέσουμε ότι ορισμένα μικρόβια ή ιοί αποτελούν το μηχανισμό που εμφανίζεται μετά την έναρξη της ίνωσης, λειτουργώντας ως το δεύτερο «χτύπημα», το οποίο επιδεινώνει τη χρόνια φλεγμονώδη διαδικασία-ινοβλάστωση, προωθεί την ακανόνιστη επούλωση 67

68 και τελικά οδηγεί σε προοδευτική ίνωση. Αυτό το σενάριο δεν είναι διαφορετικό από αυτό που ισχύει σε άλλες παθήσεις όπως στο σύνδρομο εξάλλειψης των βρογχιολίων στη μεταμόσχευση πνεύμονα. Παρόλα αυτά, η ακανόνιστη επούλωση στην IPF μπορεί να συσχετιστεί με επαναλαμβανόμενες επιδεινώσεις χρόνιας φλεγμονής (143), αδυναμία να υπάρξει παραγωγή κοκκιωματώδους ιστού, επίμονη αγγειογένεση, ινοβλάστωση, υπέρμετρη εναπόθεση εξωκυττάριου υποστρώματος και ακανόνιστη επαναεπιθηλιοποίηση, η οποία αποτυγχάνει να αναγκάσει τα παρεγχυματικά κύτταρα να σχηματίσουν στρώματα, γεγονός πολύ ουσιώδες για τη διατήρηση της φυσιολογικής αρχιτεκτονικής δομής του πνεύμονα (67). Με βάση τη νέα θεωρία της επιθηλιοϊνοβλαστικής νόσου, θα πρέπει να αλλάξει και η θεραπευτική στρατηγική. Η πλήρης κατανόηση της ακολουθίας των παθογενετικών μηχανισμών στην IPF και του συνόλου των παραγόντων που ρυθμίζουν την ινωτική απάντηση είναι απαραίτητη για τη βελτίωση ή την ανεύρεση νέων θεραπευτικών παραγόντων και επομένως για τη βελτίωση της ίδιας της πρόγνωσης των ασθενών (31). 68

69 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο Θεραπεία Πνευμονικής ίνωσης 7.1 Γενικά Η πορεία της IPF είναι συνεχώς επιδεινούμενη και η επιβίωση των ασθενών είναι πολύ μικρή. Νεότερες μελέτες, στις οποίες οι περιπτώσεις πνευμονικής ίνωσης που συμπεριλήφθηκαν ήταν καλύτερα τεκμηριωμένες, έδειξαν ότι η επιβίωση είναι 2 με 4 έτη και η πενταετής επιβίωση κυμαίνεται στο 30-50% (1,144,145). Η θεραπευτική προσέγγιση στην IPF έχει τη βάση της στη θεωρία ότι η φλεγμονή οδηγεί τελικά σε ίνωση και οι περισσότερες θεραπευτικές στρατηγικές ως σήμερα αποσκοπούν στην καταστολή της φλεγμονής (1,5). Παρόλα αυτά, το πλήθος των μελετών που έχουν γίνει σε αυτή την κατεύθυνση, μέχρι στιγμής, δεν υποδεικνύουν κάποια φαρμακευτική θεραπεία που αποδεδειγμένα να βελτιώνει την επιβίωση ή την ποιότητα ζωής των ασθενών με IPF. Είναι πιθανό, η πολύπλοκη και όχι πλήρως διευκρινισμένη παθογένεια της νόσου να αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την έλλειψη αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων (1). Επίσης, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι τα αποτελέσματα των μελετών που έχουν γίνει μέχρι τώρα πάνω στη θεραπεία της IPF δεν είναι μεταξύ τους συγκρίσιμα, και αυτό οφείλεται στο ότι πολλές φορές η διάγνωση είναι αμφισβητούμενη, οι ομάδες ασθενών ετερογενείς και η διάρκεια των μελετών ποικίλει. Υπάρχουν επίσης διαφορές στην οδό χορήγησης και τη δόση των φαρμάκων, στη διάρκεια της θεραπείας, στα διαστήματα κατά τα οποία γίνεται η παρακολούθηση των ασθενών και στα κριτήρια αξιολόγησης της θεραπείας (1). 7.2 Φάρμακα Τα κυριότερα φάρμακα που χορηγούνται ανήκουν στις τρεις παρακάτω κατηγορίες : 69

70 7.2.1 Κορτικοστεροειδή Το σκεπτικό για τη χορήγηση κορτικοστεροειδών είναι η καταστολή της χρόνιας κυψελιδίτιδας. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο τα κορτικοστεροειδή επιδρούν στα κύτταρα της φλεγμονής δεν είναι γνωστός. Φαίνεται ότι τα γλυκοκορτικοειδή καταστέλλουν τη μετανάστευση ουδετεροφίλων και λεμφοκυττάρων στον πνεύμονα, μειώνουν το επίπεδο των ανοσοσυμπλεγμάτων, διαφοροποιούν τη λειτουργία των μακροφάγων και επηρεάζουν την προσκόλληση των ουδετεροφίλων στο επιθήλιο (13). Παρά το γεγονός ότι τα κορτικοστεροειδή έχουν χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα στην IPF, δεν υπάρχουν ως σήμερα τυχαιοποιημένες, διπλά τυφλές μελέτες, οι οποίες να συμπεριλαμβάνουν placebo και να αξιολογούν με αυτό τον τρόπο τη χρήση και την αποτελεσματικότητά τους (146). Φαίνεται ότι περίπου το ένα τρίτο των ασθενών που λαμβάνουν κορτικοστεροειδή βελτιώνονται (1,10,147), χωρίς να είναι γνωστό γιατί ορισμένοι ασθενείς βελτιώνονται και άλλοι όχι (13). Επίσης διαπιστώνεται ότι η καλύτερη ανταπόκριση στα κορτικοστεροειδή, που επισημάνθηκε σε παλιότερες μελέτες, ίσως να οφείλεται στο ότι σε αυτές συμπεριλαμβάνονταν εκτός της IPF και άλλες καλύτερα ανταποκρινόμενες στα κορτικοστεροειδή διάμεσες πνευμονοπάθειες (48,148). Αντίθετα στις πιο πρόσφατες μελέτες που η επιλογή των περιστατικών είναι αυστηρότερη δεν προκύπτει καμία απόδειξη της αποτελεσματικότητας των κορτικοστεροειδών (148,149). Σύμφωνα με τους Douglas et al, δεν είναι ξεκάθαρο ακόμη αν η ευνοϊκή απάντηση στα κορτικοστεροειδή, είναι αποτέλεσμα της θεραπείας ή αν απλά κατά την πορεία της νόσου ο ρυθμός επιδείνωσης δεν είναι σταθερός (48). Στις διάφορες μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί ποικίλα σχήματα χορήγησης των κορτικοστεροειδών (147) και η iv χορήγηση μεθυλπρεδνιζολόνης, είτε ως αρχική θεραπεία (150) είτε σε περιόδους κατά τις οποίες η νόσος γνωρίζει εξάρσεις (151), δεν έχει αποδειχθεί ότι είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική και ωφέλιμη Ανοσοκατασταλτικά α) H αζαθειοπρίνη έχει χρησιμοποιηθεί ως θεραπεία για την IPF, κυρίως σε ασθενείς οι οποίοι δεν βελτιώθηκαν με τα κορτικοστεροειδή ή εμφάνισαν ανεπιθύμητες ενέργειες (1). Πρόκειται για μία ουσία ανάλογη των 70

71 πουρινών, που δρα μέσω της αντικατάστασής τους κατά τη σύνθεση του DNA και επηρεάζει κυρίως τα λεμφοκύτταρα καθιστώντας τα ανενεργά (13). Βιβλιογραφικά παρατηρείται ενδιαφέρον γύρω από τη δράση της αζαθειοπρίνης στη θεραπεία της IPF (152,153). Οι Raghu et al, συνέκριναν το συνδυασμό αζαθειοπρίνης και υψηλών δόσεων κορτιζόνης με τη μονοθεραπεία με κορτιζόνη και κατέληξαν στο ότι υπήρχε μια μη σημαντική τάση βελτίωσης της αναπνευστικής λειτουργίας και μία σημαντική βελτίωση στην επιβίωση (49). β) Η κυκλοφωσφαμίδη είναι ένας αλκυλοποιητικός παράγοντας, ο οποίος ενεργοποιείται στο ήπαρ, όπου και μεταβολίζεται σε διάφορες κυτταροτοξικές ουσίες (15). Δεν υπάρχει μέχρι σήμερα ικανοποιητικός αριθμός μελετών που να δείχνουν υπεροχή της κυκλοφωσφαμίδης έναντι των κορτικοστεροειδών στη θεραπεία της IPF (1). Σε μία τυχαιοποιημένη μελέτη, στην οποία συγκρίθηκε ο συνδυασμός κυκλοφωσφαμίδης και χαμηλής δόσης πρεδνιζολόνης με τις υψηλές δόσεις πρεδνιζολόνης, παρατηρήθηκε καλύτερη επιβίωση της πρώτης ομάδας στα 3 χρόνια, η οποία αποδόθηκε σε μεγάλο βαθμό στους μεγαλύτερους πνευμονικούς όγκους που είχαν στην αρχή της θεραπείας (5,154). Κάποιες άλλες επικεντρώνονται στη βελτίωση της αναπνευστικής λειτουργίας μετά τη χορήγηση κυκλοφωσφαμίδης (155,156), ενώ σύμφωνα με άλλες, βελτίωση δεν παρατηρήθηκε (157). Αρκετές μελέτες έχουν γίνει και για την iv χορήγηση ώσεων κυκλοφωσφαμίδης (158,159), αλλά είναι δύσκολο να αξιολογηθούν (147) και τα αποτελέσματά τους δεν είναι εντυπωσιακά (1) Σπανιότερες θεραπείες α) Κυκλοσπορίνη Α. Χρησιμοποείται σπανίως στην IPF κι έχει μεγάλη τοξικότητά (1). Υπάρχουν ορισμένες παλιότερες μελέτες με περιορισμένο αριθμό ασθενών, που φαίνεται πως ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία (160,161). Νεότερα δεδομένα υποστηρίζουν ότι όταν η κυκλοσπορίνη Α συγχορηγήθηκε με κορτικοστεροειδή βελτίωσε ή σταθεροποίησε την πρόγνωση στο 27% των ασθενών με IPF (162), ενώ όταν χορηγήθηκε σε εξάρσεις της νόσου παρεμπόδισε την υποτροπή της έξαρσης και αύξησε αισθητά το προσδόκιμο επιβίωσης των ασθενών (163). 71

72 β) Χλωραμβουκίλη. Έχει χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν αντί της κυκλοφωσφαμίδης. Και αυτή όμως, εξαιτίας της τοξικότητάς της και της έλλειψης στοιχειοθετημένων μελετών υπέρ της αποτελεσματικότητάς της, δεν συμπεριλαμβάνεται στην θεραπεία της IPF (1,5). γ) Κολχικίνη. Αναστέλλει το σχηματισμό του κολλαγόνου in vitro και καταστέλλει την απελευθέρωση της φιμπρονεκτίνης και του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών από τα κυψελιδικά μακροφάγα (164). Παρά το ότι δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία, φαίνεται ότι η αποτελεσματικότητα της κολχικίνης είναι παρόμοια με αυτή των κορτικοστεροειδών και οι ανεπιθύμητες ενέργειες σπανίως σοβαρές (51,165,166). Σύμφωνα με τις θέσεις ομοφωνίας, η κολχικίνη μπορεί να αποτελέσει θεραπεία πρώτης γραμμής για τους ασθενείς, οι οποίοι δεν συνεργάζονται για τη λήψη κορτιζόνης, είτε ως μονοθεραπεία, είτε σε συνδυασμό με ανοσοκατασταλτικά. δ) D-πενικιλλαμίνη. Ελάχιστα στοιχεία είναι διαθέσιμα για τη χορήγηση πενικιλλαμίνης (153,156). Σε μία μελέτη αναφέρεται ότι η χορήγηση πενικιλλαμίνης σε συνδυασμό με πρεδνιζολόνη ή σε συνδυασμό με πρεδνιζολόνη και κολχικίνη δεν υπερτερεί σε σχέση με τη χορήγηση μόνο πρεδνιζολόνης (166). Λόγω της τοξικότητας της και της έλλειψης αποδείξεων υπέρ της αποτελεσματικότητάς της, σύμφωνα με τις θέσεις ομοφωνίας, η πενικιλλαμίνη δεν έχει αξία στη θεραπεία της IPF (1). ε) Ιντερφερόνη-γ. Πολύ ελπιδοφόρα και ενθαρρυντικά αποτελέσματα έχουν αναφερθεί με τη χρήση ανοσοτροποποιητικών παραγόντων όπως η IFN-γ. Σύμφωνα με μία μελέτη (167), η IFN-γ σε συνδυασμό με πρεδνιζολόνη βελτίωσε την αναπνευστική λειτουργία των ασθενών με IPF. Άλλες όμως νεότερες μελέτες δεν υποστηρίζουν αυτή τη βελτίωση και αναφέρουν σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες (168,169). στ) Πιρφενιδόνη. Είναι ένας αντι-ινωτικός παράγοντας χωρίς σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες (170,171). Σε μία μελέτη χορηγήθηκε πιρφενιδόνη σε 54 ασθενείς που επιδεινώνονταν παρά τη συμβατική θεραπεία ή δεν μπορούσαν ή δεν ήθελαν να την λάβουν. Η επιβίωση στο ένα και τα δύο έτη ήταν 78 και 63% αντίστοιχα (172). Στη μελέτη των Nagai et al, δεν παρατηρήθηκε τέτοια επιβίωση στους ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν και οι οποίοι βρίσκονταν σε προχωρημένο στάδιο της νόσου, αλλά επιβεβαιώθηκε ότι το φάρμακο είναι καλά ανεκτό (170). 72

73 ζ) Μεθοτρεξάτη. Χρησιμοποιείται σπανιότατα λόγω της πολύ μικρής αποτελεσματικότητάς της και οι βιβλιογραφικές αναφορές για τη χρήση της στη θεραπεία της IPF είναι ελάχιστες (1,147). η) Βλαστοκύτταρα. Μία πολύ σύγχρονη και πολλά υποσχόμενη απόπειρα θεραπείας της πνευμονικής ίνωσης γίνεται με τη χρήση βλαστοκυττάρων. Οι έρευνες έχουν στραφεί στην προσπάθεια να ιαθεί η ίνωση, αλλά και πολλά νοσήματα του συνδετικού ιστού, με μοσχεύματα βλαστοκυττάρων από τον ίδιο τον οργανισμό των αρρώστων ή άλλων με τους οποίους παρουσιάζουν ιστοσυμβατότητα (321,322). Εκτός από τους παράγοντες που ήδη αναφέρθηκαν υπάρχουν πολλοί άλλοι, των οποίων η θέση στην θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών με IPF είναι ακόμη υπό συζήτηση διότι έχουν εξεταστεί μόνο σε πειραματικό επίπεδο. Τέτοιοι είναι: κάποιοι αντιοξειδωτικοί παράγοντες (λόγω του ότι στον τραυματισμό του επιθηλίου μπορεί να παίζουν μεσολαβητικό ρόλο ελεύθερες ρίζες οξυγόνου) ( ), η γλουταθειόνη, η οποία απομακρύνει τους οξειδωτικούς παράγοντες και καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών (278,288,289), αντισώματα έναντι των μορίων προσκόλλησης των λευκοκυττάρων, παράγοντες που εμποδίζουν την έκφραση και τη λειτουργία αυτών των μορίων, αναστολείς ορισμένων κυτταροκινών και λοβαστατίνη, που προάγει την απόπτωση των ινοβλαστών (172). Πρέπει επίσης, να τονιστεί, και εδώ, η σημασία του αντί-tnf-α παράγοντα στη θεραπεία της πνευμονικής ίνωσης. Με τη δράση του επιτυγχάνεται πειραματικώς άρση της απόπτωσης των επιθηλιακών κυττάρων μέσω της παρεμπόδισης της αλληλεπίδρασής του με τον υποδοχέα του pp55 και επομένως αναστολή της φλεγμονής και της ίνωσης (89). Είναι προφανές από όλα όσα αναφέρθηκαν παραπάνω, ότι τα αντικρουόμενα αποτελέσματα των μελετών που υπάρχουν για τη θεραπεία της IPF, η αδυναμία σύγκρισης μεταξύ τους και κυρίως η έλλειψη στοιχείων που να αποδεικνύουν την αποτελεσματικότητα κάποιου φαρμακευτικού παράγοντα και των ανεπιθύμητων ενεργειών του, έχουν οδηγήσει στο θεμελιώδες ερώτημα αν πρέπει τελικά να δίνεται θεραπεία στους ασθενείς ή όχι (5,48,173). Σε ορισμένες μελέτες έχει φανεί ότι η μη χορήγηση θεραπείας δε συνεπάγεται χειρότερη αναπνευστική λειτουργία ή φτωχότερη πρόγνωση σε σχέση με τη χορήγηση κάποιου θεραπευτικού παράγοντα (48,173). 73

74 Συνεπώς, η μη χορήγηση θεραπείας συμπεριλαμβάνεται στις επιλογές του γιατρού και μπορεί να επιβεβαιωθεί ότι περίπου οι μισοί ασθενείς με IPF δεν λαμβάνουν αρχικά θεραπεία (174). 74

75 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο Οξειδωτικοί και αντιοξειδωτικοί παράγοντες 8.1 Οξειδωτικό Stress α) Γενικά Ελεύθερη ρίζα είναι κάθε στοιχείο, το οποίο είναι ικανό να υπάρξει αυτόνομο (έστω και για μικρό χρονικό διάστημα) και περιέχει ένα ή περισσότερα αδέσμευτα ηλεκτρόνια. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, οι ελεύθερες ρίζες σχηματίζονται συνεχώς και εξουδετερώνονται επαρκώς από την κυτταρική αντιοξειδωτική άμυνα (175). Οι πηγές των ελευθέρων ριζών είναι: ο μιτοχονδριακός οξειδωτικός μεταβολισμός, το μονοξείδιο του αζώτου (NO), ο μεταβολισμός των φωσφολιπιδίων και οι πρωτεολυτικές αντιδράσεις. Στην πιο απλή του μορφή το οξειδωτικό stress είναι το αποτέλεσμα της διαταραχής της ισορροπίας μεταξύ της παραγωγής ελευθέρων ριζών και των ενδογενών αντιοξειδωτικών συστημάτων του οργανισμού (176). Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, μικρές συγκεντρώσεις ελευθέρων ριζών παράγονται στα κύτταρα, ως υποπροϊόν της μεταφοράς ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδρια. Η αυξημένη όμως παραγωγή τους που συμβαίνει στη φλεγμονή στον πνεύμονα συμβάλει καθοριστικά στην εξέλιξή της σε ίνωση. Πυροδοτείται ένας "καταρράκτης" μεταβολικών και βιοχημικών διεργασιών, πολλές από τις οποίες συμμετέχουν στο σχηματισμό ελευθέρων ριζών οξυγόνου (ROS) και αζώτου (RNS). Συγκεκριμένα, η αύξηση των ελευθέρων ριζών συνεπάγεται βλάβη των λιπιδίων, των πρωτεϊνών και του DNA καθώς και αδρανοποίηση βασικών κυτταρικών λειτουργιών με επακόλουθο τον κυτταρικό θάνατο (109,176). β) Οξειδωτικό stress και πνευμονική ίνωση Η παρουσία οξειδωτικού stress μπορεί να παίξει πολύ σημαντικό ρόλο 75

76 στην παθογένεια της πνευμονικής ίνωσης, με το να επηρεάσει την απόπτωση τόσο των δομικών όσο και των φλεγμονωδών κυττάρων και να μεταβάλει την ισορροπία του μικροπεριβάλλοντος των κυτταροκινών (286,292,293,319,320). Αποδείχθηκε ότι το οξειδωτικό stress οδηγεί σε βλάβη, ενεργοποίηση ή/και απόπτωση των επιθηλιακών κυψελιδικών κυττάρων, είτε άμεσα μέσω ενός μη ισορροπημένου ενδοκυττάριου οξειδοαναγωγικού ισοζυγίου, είτε έμμεσα, ενεργοποιώντας μονοπάτια ευαίσθητα στην οξειδοαναγωγική δραστηριότητα, όπως κάποιους μεταγραφικούς παράγοντες ή το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης (286,319,320). Έμμεση δράση θεωρείται και η αύξηση της μεταβολής αγγειοτενσινογόνου σε αγγειοτενσίνη ΙΙ, που μπορεί να θεωρηθεί ότι οδηγεί σε οξειδωτικό stress ικανό να προκαλέσει απόπτωση (286). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η αγγειοτενσίνη ΙΙ μπορεί να δράσει ως προφλεγμονώδης κυτταροκίνη και ότι είναι αποτελεσματική στο να ενεργοποιήσει τους ινοβλάστες μέσω της απελευθέρωσης TGF-β. Όπως η ενεργοποίηση, η διαφοροποίηση, η μεταπλασία και η απόπτωση των ινοβλαστών φαίνεται να σχετίζεται με την ισορροπία μεταξύ οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών παραγόντων, έτσι και η διατήρηση ενός υψηλού επιπέδου αναχθείσας ενδοκυττάριας γλουταθειόνης (glutathione, GSH) μπορεί να θεωρηθεί ότι δημιουργεί ένα αναγωγικό περιβάλλον μέσα στο κύτταρο, που θα προστατεύει από το οξειδωτικό stress (286,292,319). Στις περιπτώσεις που οι οξειδωτικοί παράγοντες, είτε είναι εξωγενείς, είτε είναι παραγόμενοι από φλεγμονώδη κύτταρα, αυξάνονται, ο λόγος ανάμεσα στην GSH και την οξειδωμένη γλουταθειόνη (oxidized glutathione, GSSH) μπορεί να ελαττωθεί, επηρεάζοντας έτσι μία ποικιλία από ευαίσθητες στην οξειδοαναγωγή διαδικασίες, όπως η ενεργοποίηση του NF-κβ και της πρωτεΐνης AP-1, που οδηγούν σε αύξηση της μεταγραφής ενός αριθμού γονιδίων που εμπλέκονται στη φλεγμονή ή/και την ινοβλάστωση, και συμπεριλαμβάνουν κυτταροκίνες (IL-1, TNF-α, IL-6), χημειοκίνες (IL-8), μόρια συγκόλλησης (VCAM-1, ICAM-1) και αυξητικούς παράγοντες (GM-CSF) (286,288,289). Επιπλέον, πολλές μελέτες έδειξαν ότι το οξειδωτικό stress στον πνεύμονα μπορεί να επηρεάσει την ανοσολογική απάντηση, προκαλώντας αυξημένη παραγωγή HLA-DR καθώς και έκφραση μορίων του τύπου των CD40 και CD86, προσδιορίζοντας έτσι μία μόνιμη κατάσταση ανοσολογικής 76

77 δραστηριότητας και επηρεάζοντας την ισορροπία Th-1/Th-2 με το να παρασύρει την απάντηση των Τ κυττάρων προς το φαινότυπο Th-2 (286,287). 8.2 Ενδογενή αντιοξειδωτικά και εξουδετερωτές ελευθέρων ριζών Ο ανθρώπινος οργανισμός διαθέτει ορισμένα ενδογενή αντιοξειδωτικά συστήματα για την απομάκρυνση των τοξικών υποπροϊόντων του μεταβολισμού, που μπορούν να διακριθούν σε ενζυμικά (υπεροξειδική δισμουτάση, καταλάση και υπεροξειδάση της γλουταθειόνης) και μη ενζυμικά (α-τοκοφερόλη, ασκορβικό οξύ). Η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) υπάρχει στο κυτταρόπλασμα συνδεδεμένη με ψευδάργυρο ή χαλκό, ως Cu,Zn-SOD (SOD1) και στα μιτοχόνδρια με μαγγάνιο, ως Mn-SOD (SOD2) (194). Η SOD καταλύει την αντίδραση: 2O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Μολονότι η αντίδραση αυτή είναι αυτόματη, η SOD αυξάνει το ρυθμό της κατά 109 φορές. Το υπεροξειδικό ανιόν (O - 2 ) θεωρείται σχετικά ανενεργό και ασκεί τις κυτταροτοξικές του δράσεις μόνο όταν μετατρέπεται σε περισσότερο ενεργά μόρια. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) που έχει σχηματιστεί στη συνέχεια αποτελεί κατάλληλο υπόστρωμα για τη δράση τόσο της καταλάσης, όσο και της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης με τελικό αποτέλεσμα την απομάκρυνση των τοξικών αυτών μορίων και το σχηματισμό μορίων H 2 O (176). Επίσης, είναι πολύ σημαντικό να αναφερθεί ότι αντιοξειδωτική δράση έχουν διάφορες βιταμίνες, όπως οι : C,D3, E (194). 8.3 Ελεύθερες ρίζες οξυγόνου Κατά τη σταδιακή μονοσθενή αναγωγή του οξυγόνου παράγονται το υπεροξειδικό ανιόν (O - 2 ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), η υδροξυλική ρίζα (ΟΗ - - ) και Η 2 Ο. Το O 2 και η ΟΗ - αποτελούν αληθείς ρίζες, εφόσον διαθέτουν ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Το Η 2 Ο 2 δεν είναι ρίζα, όπως ορίστηκε πιο πάνω, αλλά συμπεριλαμβάνεται σε αυτές λόγω της δραστικότητάς του (175). 77

78 Η υδροϋπεροξειδική ρίζα (HO - 2) σχηματίζεται με την πρόσληψη ενός πρωτονίου από το O - 2 με τη δράση της SOD (O 2 + H + HO - 2). Tο Η 2 Ο 2 σχηματίζεται σε υδατικό διάλυμα με την αυτόματη αντίδραση δύο O - 2, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω σχετικά με τη δράση της SOD. Η ΟΗ - σχηματίζεται από το Η 2 Ο 2 με την παρουσία δισθενούς σιδήρου (Fe 2+ ) ή άλλων μετάλλων (Τi 3+, Cu +, CO 2+ ) κατά τις αντίδρασεις Fenton και Haber-Weiss: Η ΟΗ - έχει πολύ μικρό χρόνο ζωής αλλά είναι εξαιρετικά δραστική και μπορεί να αντιδράσει σχεδόν με όλα τα μόρια (αμινοξέα, φωσφολιπίδια, πυρηνικά οξέα). Η σημαντικότερη ιδιότητά της είναι ότι σχηματίζει δευτερογενείς ρίζες, οι οποίες παρότι λιγότερο δραστικές, είναι ικανές να προκαλέσουν βλάβη στη θέση παραγωγής τους ή ακόμα και σε απομακρυσμένα σημεία (176). Η αλληλεπίδραση των ριζών οξυγόνου με άλλα συστατικά του πνευμονικού ιστού συνεπάγεται την παραγωγή πολλών άλλων ριζών. Ιδιαίτερης σημασίας είναι η αλληλεπίδραση του υπεροξειδικού ανιόντος με το μονοξείδιο του αζώτου και ο σχηματισμός υπεροξυνιτρώδους (peroxynitrite, ONOO - ) που διασπάται σχεδόν αυτόματα σε υδροξυλική ρίζα (176). 8.4 Μονοξείδιο του αζώτου ( NO ) To NO αποτελεί μία ακόμη πηγή ελευθέρων ριζών. Είναι μια υδατοδιαλυτή και λιποδιαλυτή ουσία, που σχηματίζεται με τη μεσολάβηση ειδικών ενζύμων (συνθάσες του NO) και ασκεί ποικίλες βιολογικές δράσεις, όπως αγγειοδιαστολή, αναστολή της συγκόλλησης των αιμοπεταλίων και του πολλαπλασιασμού των λείων μυϊκών ινών, ρύθμιση της νευροδιαβίβασης και επαγωγή του σχηματισμού και της επαναδιαμόρφωσης (remodelling) των ιστών. Επιπλέον, το NO ασκεί αντιμικροβιακή δράση (177). Το ΝΟ μπορεί να συναντάται ως ελεύθερη ρίζα (NO), οξειδωμένη μορφή 78

79 (ΝΟ + ) και αναχθείσα μορφή (ΝΟ - ), οι οποίες επηρεάζουν τη βιολογική του δράση. Όλες οι παραπάνω μορφές είναι δυνατό να συνυπάρχουν σε όλα τα όργανα, αλλά η ελεύθερη ρίζα θεωρείται περισσότερο πιθανό να είναι η μορφή που παράγεται κατά την επαγωγή των συνθασών του ΝΟ (386).. Ένας κύριος μηχανισμός είναι η αντίδραση του NO με το Ο - 2, οπότε και προκύπτει το κυτταροτοξικό υπεροξυνιτρώδες ανιόν (ΟΝΟΟ - ), και αυτό γιατί έχει ενοχοποιηθεί για το μηχανισμό της απόπτωσης σε πολλές κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, η δέσμευσή του δρα προστατευτικά, γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο του στην επαγώμενη από το οξειδωτικό stress απόπτωση. Μια σημαντική οδός δράσης μπορεί να είναι η ΟΟΝΟ - - μεσολαβούμενη βλάβη του DNA και η συνακόλουθη ενεργοποίηση της πολυ- ADP-ριβόζο-πολυμεράσης (PARP), ενζύμου που συμμετέχει στην κατάτμηση του DNA (178,307). Επίσης, το NO αποτελεί έναν ισχυρό αναστολέα της λειτουργίας των μιτοχονδρίων. Συνδέεται με τα μιτοχονδριακά συμπλέγματα Ι και ΙΙ και με την cis-ακοτινάση, με συνέπεια την αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και της γλυκόλυσης. Τέλος, προκαλεί αναστρέψιμη αναστολή της αναπνευστικής αλυσίδας γιατί ανταγωνίζεται το Ο 2 στη σύνδεση με την οξειδάση του κυτοχρώματος (178). Ακόμα, απαντώνται και άλλοι δυνητικά βλαπτικοί μεταβολίτες του NO, όπως η ρίζα του διοξειδίου του αζώτου (NΟ 2 ), το χλωριούχο νιτρίλιο (NO 2 Cl) και μετέπειτα το υποχλωριώδες οξύ (HOCl) που παράγεται από τη δράση της μυελοϋπεροξειδάσης στα ουδετερόφιλα (179). 8.5 Αντιοξειδωτικά και ανστολείς του ΝΟ Με βάση τη βιβλιογραφία τα αντιοξειδωτικά και οι αναστολείς του NO έχουν μελετηθεί εκτεταμένα σε πειραματικά μοντέλα που αφορούν σε οξεία πνευμονική βλάβη, όπως είναι η πνευμονική ίνωση ( ). Τέτοια είναι ορισμένα ένζυμα, όπως η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) και η καταλάση (CAT), οι οποίες είναι συζευγμένες με πολυαιθυλενογλυκόλη (για παράταση του χρόνου ημίσειας ζωής τους) (277,278), η γαλακτική δεϋδρογονάση (LDH), η γλουτοθειονική υπεροξειδάση (glutathione-peroxidase, GSH-Px) (275), αμινογουανιδίνη (283), η ερδοστεΐνη (282,283), η ακετυλοκυστεΐνη (285,289) 79

80 και άλλα (281). Άλλη ουσία με αντιοξειδωτική δράση και αρκετά θετικά αποτελέσματα στον πνευμονικό ιστό, ο οποίος υπέστη οξεία βλάβη με μπλεομυκίνη, είναι η ορμόνη μελατονίνη (276,279). Πρόκειται για μια αμίνη που σχηματίζεται σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στους ενήλικες και αποτελεί άμεσο εξουδετερωτή (scavenger) των ελευθέρων ριζών οξυγόνου (ROS) και αζώτου (RNS). Στον πνευμονικό ιστό ασκεί έντονη αντιοξειδωτική δράση (275). Σε έρευνες σε πειραματόζωα στα οποία προκλήθηκε πνευμονική ίνωση με ενδοτραχειακή χορήγηση μπλεομυκίνης μετρήθηκαν στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BALF) τα επίπεδα των οξειδωτικών ουσιών μυελοϋπεροξειδάση (myeloperoxidase, MPO) και μαλονδιαλδεΰδη (malondialdehyde, MDA) καθώς και τα επίπεδα των αντιοξειδωτικών παραγόντων SOD, GSH-Px και CAT (237,275). Αποδείχθηκε ότι η μελατονίνη από τη μία μεριά αναστέλλει τη δράση των δύο πρώτων οξειδωτικών παραγόντων και από την άλλη ενισχύει τη δράση των τριών αντιοξειδωτικών. Έχει δηλαδή διπλή ευεργετική δράση στο αναπνευστικό επιθήλιο επίμυων (237,275). 8.6 Αυξητικοί και κυτταροπροστατευτικοί παράγοντες Αυξητικοί και προστατευτικοί των ιστών παράγοντες, οι οποίοι εκφράζονται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, έστω και σε μικρές συγκεντρώσεις, έχουν χρησιμοποιηθεί σε πειραματικά πρωτόκολλα στους πνεύμονες και σε άλλα όργανα. Μεταξύ αυτών των παραγόντων αναφέρονται στη βιβλιογραφία η ερυθροποιητίνη (EPO), ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF), ο διεγερτικός παράγοντας αποικιών κοκκιοκυττάρων (granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF), ο ομοιάζων με την ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας-1 (insulin like growth factor-1, IGF-1), ο προερχόμενος από τον εγκέφαλο νευροτροφικός παράγοντας (BDNF), η νευροτροφίνη ΙΙΙ, ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών και άλλοι (181,186, ). 80

81 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο Ερυθροποιητίνη (EPO) 9.1 Δομή και λειτουργία Η ερυθροποιητίνη είναι μια γλυκοπρωτεΐνη με ΜΒ 30,4 kd. Περιέχει 165 αμινοξέα και το μόριό της αποτελείται από τέσσερις γλυκοζυλιωμένες αλύσους (τρεις Ν- και μία Ο- συνδεδεμένη), οι οποίες είναι αναγκαίες για τη βιολογική της δράση, την ημιδιάρκεια ζωής στο αίμα και την προστασία της από τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (εικόνες 1, 2). Επιπλέον, οι N- και Ο- συνδεδεμένες ολιγοσακχαριτιδικές αλυσίδες είναι απαραίτητες για την παραγωγή και έκκριση της ΕΡΟ. Η βιολογική δράση του μορίου καθορίζεται από τη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ των αμινοξέων του μορίου της, οι οποίοι περιέχουν κυστεΐνη (θέσεις 7 και 160, 29 και 33). Το γονίδιο της ερυθροποιητίνης εδράζεται στο χρωμόσωμα 7q21-22 και η παραγωγή της γίνεται στους ινοβλάστες του διάμεσου νεφρικού ιστού (ενήλικες) και στα ηπατοκύτταρα (του εμβρύου) (182). Θεωρούνταν μέχρι πρόσφατα ως μία ορμόνη υπεύθυνη για τη διευκόλυνση της μεταφοράς του οξυγόνου στους ιστούς μέσω της σύνδεσής της με τη μάζα των κυκλοφορούντων ερυθροκυττάρων. Ωστόσο, η επιστήμη της μοριακής βιολογίας έχει αποδείξει ότι η ερυθροποιητίνη είναι μέλος της οικογένειας των κυτταροκινών με σημαντική συνάφεια με τους μεσολαβητές της ανάπτυξης και της φλεγμονής (212). Η ΕΡΟ ενεργοποιείται από τον υποδοχέα της (EPO receptor, EPO-R) και αποτελεί τον κύριο αυξητικό αιμοποιητικό παράγοντα που διεγείρει την ερυθροποίηση κατά τη διάρκεια τόσο της εμβρυϊκής όσο και της νεογνικής και ενήλικης ζωής. Το ερέθισμα για την παραγωγή της EPO και την έκφραση του EPO-R δεν είναι τόσο η ποσότητα των ερυθροκυττάρων, όσο η περιεκτικότητα των ιστών σε οξυγόνο μέσω της ρύθμισης του επαγόμενου από υποξία παράγοντα 1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α), ο οποίος είναι ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής της ερυθροποιητίνης, γλυκολυτικών ενζύμων, του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και 81

82 άλλων "προστατευτικών" γονιδίων (185). Η κύρια δράση της EPO ασκείται στο μυελό των οστών για τη ρύθμιση της παραγωγής της ερυθράς σειράς. Αυτό επιτυγχάνεται με: α) αναστολή της απόπτωσης των προγονικών κυττάρων της ερυθράς σειράς, β) διέγερση του πολλαπλασιασμού τους, γ) διαφοροποίησή τους σε νορμοβλάστες (184). Εικόνα 1 : Δομή του μορίου της ερυθροποιητίνης (187) Εικόνα 2: Τρισδιάστατη απεικόνιση του μορίου της EPO (188) Ο λειτουργικός υποδοχέας της ερυθροποιητίνης (ΕΡΟ- R) στον άνθρωπο είναι μέλος μιας υπερ-οικογένειας υποδοχέων κυτταροκινών τάξεως Ι, στην οποία ανήκει και ο υποδοχέας των αυξητικών παραγόντων (GM-CSF και G CSF), της ιντερλευκίνης (IL), της αυξητικής ορμόνης (GH), της προλακτίνης και της θρομβοποιητίνης (193). Είναι ένα ομοδιμερές σύμπλεγμα, που 82

83 αποτελείται από δύο πανομοιότυπες γλυκοπρωτεϊνικές αλυσίδες των 484 αμινοξέων (193). Η κάθε μία από τις αλύσους αυτές αποτελείται: α) από ένα εξωκυττάριο τμήμα για την αρχική σύνδεση με την ερυθροποιητίνη, β) μια υδρόφοβη διαμεμβρανική υποομάδα για τη διέγερση της τυροσινικής κινάσης (Janus tyrosine kinase-2, Jak-2) με φωσφοσφορυλίωση και γ) ένα ενδοκυττάριο κυτταροπλασματικό τμήμα για τη μετάδοση του σήματος (194) (εικόνα 3). Είναι ενδιαφέρον ότι με την πρόοδο της μοριακής βιολογίας έχουν βρεθεί θέσεις παραγωγής και έκφρασης της ερυθροποιητίνης και του υποδοχέα της και σε άλλα όργανα πλην των νεφρών, όπως ΚΝΣ, πνεύμονες, ήπαρ, σπλήνας, αναπαραγωγικά όργανα, καρδιά. Στα όργανα αυτά λειτουργεί επιπλέον και ως πλειοτρόπος αυξητικός παράγοντας (186) κι έτσι θεωρείται ως ένας ενδογενής παράγοντας με αιμοποιητική μεν λειτουργία, αλλά και με περισσότερες υπό διερεύνηση δράσεις (204). Εικόνα 3: Σχηματική παράσταση σύνδεσης EPO και EPO-R (186) Όπως αναφέρθηκε, η δράση της ΕΡΟ εκφράζεται μέσω ειδικών υποδοχέων της επιφάνειας του κυττάρου οι οποίοι, εκτός από τα προγονικά ερυθροκύτταρα, ανευρίσκονται επίσης στα αγγεία και σε διάφορα όργανα. Οι θέσεις παραγωγής και έκφρασης της ερυθροποιητίνης και του υποδοχέα της αναφέρονται στον πίνακα 2 (186). 83

84 Πίνακας 2: Θέσεις παραγωγής και έκφρασης της ερυθροποιητίνης και του υποδοχέα της ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ EPO EPO Προγονικά ερυθροκύτταρα Νεφρικά κύτταρα Ενδοθηλιακά κύτταρα Λεία μυϊκά κύτταρα αγγείων Κύτταρα γαστρικού βλεννογόνου Κύτταρα Leyding Αστροκύτταρα Ήπαρ Νεφροί Σπλήνας Αναπαραγωγικά όργανα Κ.Ν.Σ Καρδιά Πνεύμονες Η ευρεία κατανομή της ερυθροποιητίνης και η εκτεταμένη έκφραση του υποδοχέα της σε τόσους πολλούς ιστούς του οργανισμού, διεγείρει τεράστιο ενδιαφέρον γύρω από τους άλλους βιολογικούς ρόλους της EPO, κυρίως της κυτταροπροστασίας μέσω της αντιαποπτωτικής, αντιφλεγμονώδους και αντιοξειδωτικής δράσης που έχει βρεθεί ότι διαθέτει (295,296). 9.2 Κυτταροπροστατευτικός ρόλος της ερυθροποιητίνης Αντιαποπτωτική δράση Η δράση αυτή επιτυγχάνεται μέσω πολλών οδών, στις οποίες αναμιγνύεται η τυροσινική κινάση-2 (Janus tyrosine kinase-2, Jak-2), η ρύθμιση αντι-αποπτωτικών γονιδίων, όπως τα Bcl-xL και Bcl-2 (194,195,201,297,298) και η απενεργοποίηση της κασπάσης-9 (185,196). Οι κυτταροπροστατευτικές ιδιότητες της EPO έχουν περιγραφεί σε πολλά μοντέλα ισχαιμίας και φλεγμονώδους τραύματος σε διάφορους ιστούς, κυρίως στο νευρικό, καρδιαγγειακό, νεφρικό και πνευμονικό ιστό (197). Προστατεύει τον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο σε καταστάσεις διεγερτιτοξικότητας (excitotoxicity) εξαιτίας υπερβολικής διέγερσης των NMDA (Ν-μεθυλο-Dασπαρτικό) ανταγωνιζόμενη τον υποδοχέα του NMDA και την απόπτωση (206). Επίσης, in vitro μελέτες έδειξαν ότι ελαττώνει κατά 50% την απόπτωση στα κύτταρα του μυοκαρδίου επίμυων που είχαν υποστεί υποξία (207) και ότι προστατεύει από την απόπτωση τα κύτταρα των νεφρικών σωληναρίων μετά 84

85 από οξύ νεφρικό τραυματισμό (208). Η ερυθροποιητίνη είναι μία ορμόνη, η οποία ελέγχει την αιμοποίηση μέσω της αποφυγής της απόπτωσης στα ερυθροκύτταρα και διατήρησης έτσι σταθερής της μάζας τους (297,298). Πρέπει να τονιστεί ότι οι αιμοποιητικές της δράσεις επάγονται μέσω του ομοδιμερούς ΕΡΟ-R, ενώ το σύμπλεγμα του υποδοχέα που επάγει τη νευροπροστασία διαφέρει όσον αφορά στη συγγένεια προς την ΕΡΟ, το μοριακό βάρος και τις συναφείς πρωτεΐνες (298). Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι κάποιος άλλος υποδοχέας, τουλάχιστον εν μέρει, είναι υπεύθυνος για τις ιστο-προστατευτικές δράσεις της ΕΡΟ. Οι μεμβρανικοί υποδοχείς της ΕΡΟ αποτελούνται από μία α-υπομονάδα (κλασικός ΕΡΟ-R που απαιτείται για την ερυθροποίηση) και μία κοινή β-υπομονάδα (bcr που δεν είναι απαραίτητη για την ερυθροποίηση). Πρόσφατα έχει διατυπωθεί η άποψη κατά την οποία ο ΕΡΟ-R και ο bcr περιλαμβάνουν έναν ιστοπροστατευτικό ετερο-ϋποδοχέα (210). Λίγα είναι γνωστά για την έκφραση και λειτουργία της EPO και του EPO-R στον πνευμονικό ιστό καθώς και για το δυναμικό ρόλο της ερυθροποιητίνης σε αποπτωτικές διαδικασίες στον πνεύμονα. Υπάρχουν, πάντως, μελέτες που περιγράφουν την ευεργετική δράση της EPO στο πνευμονικό επιθήλιο με τη συμμετοχή της στην αναστολή της απόπτωσης. Σε μία από αυτές, οι MacRedmond et al. (185), εξετάζουν ένα μοντέλο οξέος τραύματος του πνεύμονα (acute lung injury, ALI,) και για πρώτη φορά στοιχειοθετείται αντι-αποπτωτική δραστηριότητα της EPO και του EPO-R σε επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία υφίστανται απόπτωση μέσω του παράγοντα Fas (219,220). Στη συγκεκριμένη μελέτη το κυτταροπροστατευτικό αποτέλεσμα αποδίδεται στην έκφραση των παραγόντων Bcl-xL και Bax, και πιο συγκεκριμένα, στην αυξημένη έκφραση του Bcl και στη μειωμένη έκφραση του Bax. Έτσι, η χρήση της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης (recombinant human erythropoietin, rhepo) μπορεί να αποδειχθεί μια δυναμική θεραπευτική αντιμετώπιση του ALI και του ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome) με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία (185,201,218). Η απόπτωση είναι πολύ στενά συνδεδεμένη με την ισορροπία μεταξύ ενός αριθμού προ-αποπτωτικών (π.χ. Bax) και αντι-αποπτωτικών (π.χ. BclxL) μορίων, των οποίων την έκφραση μπορεί να επηρεάσει η EPO (201). Η ενεργοποίηση του υποδοχέα του Fas, μέσω της εξωγενούς οδού της 85

86 απόπτωσης και του συστήματος Fas/FasL, μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση τύπου I (εξαρτώμενη από κασπάση) ή σε απόπτωση τύπου ΙΙ (εξαρτώμενη από μιτοχόνδριο) (198,199). Η τελευταία ρυθμίζεται από μέλη της οικογένειας των Bcl-2, τα οποία διαθέτουν αντιαποπτωτική δράση (200). Σύμφωνα με αυτήν τη μελέτη, η απόπτωση στο αναπνευστικό επιθήλιο μέσω του παράγοντα Fas είναι συνδεδεμένη με αυξημένη παραγωγή της πρωτεΐνης Bax. Αυτό σημαίνει ότι: α) η ενεργοποίηση της απόπτωσης τύπου II στο αναπνευστικό επιθήλιο από τον Fas είναι πολύ σημαντική, αν και κάποιοι μηχανισμοί, που εμπλέκουν την απόπτωση τύπου Ι δεν μπορούν να αγνοηθούν, και β) η κυτταροπροστασία που ασκεί η EPO φαίνεται να οφείλεται τελικά στη μείωση της παραγωγής της πρωτεΐνης Bax (185). Πρέπει να τονιστεί επίσης, ότι τα δεδομένα είναι σχετικά περιορισμένα και σε καμία περίπτωση η αναλογία έκφρασης των Bcl-xL/Bax δεν αποτελεί το μοναδικό μηχανισμό που η EPO ασκεί κυτταροπροστασία στο αναπνευστικό επιθήλιο. Υπάρχουν κι άλλοι ακόμη άγνωστοι μηχανισμοί αντι-αποπτωτικής δράσης της ερυθροποιητίνης στους πνεύμονες, που εμφανίζονται ήδη σε άλλους ιστούς, όπως είναι η ρύθμιση άλλων πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2 (200,202), έκφραση και δραστηριότητα κασπασών και ο από πρωτεάσες ενεργοποιούμενος αποπτωτικός παράγοντας (apoptosis protease-activating factor-1, Apaf-1) (203). Η αντιαποπτωτική δράση της ερυθροποιητίνης στον πνεύμονα διερευνάται σε μία άλλη μελέτη, όπου χορηγείται rhepo σε πειραματόζωα που υφίστανται ισχαιμία και επαναιμάτωση (204). Εκτιμάται η δράση της πνευμονικής μυελοϋπεροξειδάσης (pulmonary myeloperoxidase, MPO) και της μαλονδιαλδεΰδης (malondialdehyde, MDA) και υπολογίζεται, με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους, η συγκέντρωση του TNF-α και της μεταλλοπρωτεϊνάσης MMP-9. Το συμπέρασμα, σύμφωνα με τα δεδομένα της μελέτης, είναι ότι η χορήγηση της rhepo οδηγεί σε διατήρηση της αρχιτεκτονικής δομής των πνευμονοκυττάρων και του δείκτη απόπτωσης σε χαμηλά επίπεδα. Ως δείκτης απόπτωσης στη συγκεκριμένη εργασία θεωρείται το πηλίκο των MMP-9 που εκφράστηκαν στον πνευμονικό ιστό προς τις MMP-9 που δεν εκφράστηκαν. Συγκριτικά με τα πειραματόζωα στα οποία δεν χορηγήθηκε ερυθροποιητίνη, αυτά που έλαβαν rhepo, είχαν χαμηλά επίπεδα TNF-α και MMP-9 στον ορό του αίματος και η ιστική έκφρασή τους ήταν 86

87 ελαττωμένη. Έτσι, με βάση τους συγγραφείς, η ερυθροποιητίνη προστατεύει τα πνευμονικά κύτταρα από την ισχαιμία-επαναιμάτωση ελαττώνοντας τόσο τοπικά όσο και συστηματικά την έκφραση του TNF-α και της MMP-9 επιβεβαιώνοντας την αντι-αποπτωτική δράση της (204). Μία πολύ πρόσφατη μελέτη επιβεβαιώθηκε η έκφραση του EPO-R στα βρογχικά και στα κυψελιδικά κύτταρα τύπου ΙΙ τόσο με τη μέθοδο ποσοτικής εκτίμησης Western, όσο και με ανοσοϊστοχημεία. Επιπλέον ανιχνεύθηκε η απόπτωση με τη μέθοδο TUNEL (terminal uridine deoxynucleotidyl transferase nick end- labeling) (205). Σε 14 μέρες μετά την ενδοπεριτοναϊκή έγχυση της EPO στα πειραματόζωα, τα θετικά κατά TUNEL κύτταρα ελαττώθηκαν και τα ιστολογικά ευρήματα φλεγμονής και ίνωσης ήταν λιγότερα σε σχέση με τα πειραματόζωα που δεν έλαβαν την αγωγή. Επίσης, ανιχνεύθηκε, με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους, αυξημένη έκφραση των φωσφορυλιωμένων Akt και Erk, που θεωρείται ότι επάγουν την επιβίωση που προκαλείται από την EPO. Συμπεραίνουν, λοιπόν, οι συγγραφείς ότι η έκφραση του EPO-R στο πνευμονικό επιθήλιο αναστέλλει την πνευμονίτιδα και την ίνωση σε επίμυες στους οποίους χορηγήθηκε ερυθροποιητίνη και αυτό το πόρισμά τους ενισχύεται και από τη θετική μέθοδο TUNEL (205). Γίνεται προσπάθεια να επισημανθούν θεραπευτικά διάφορα σημεία του αποπτωτικού καταρράκτη, για να διακοπεί η πορεία του και να ανασταλεί η ίνωση, με τη χρήση διαφόρων αναστολέων των κασπασών ή ρυθμιστών της οικογένειας των πρωτεϊνών Bcl-2, όμως τα αποτελέσματα δεν είναι ικανοποιητικά (213). Η EPO και ο EPO-R ίσως αποτελούν πεδίο ενδιαφέρουσας έρευνας προς την κατεύθυνση αυτή. Άλλωστε η rhepo έχει μία μακρά ιστορία ασφάλειας και αποτελεσματικότητας στη θεραπεία της αναιμίας στη χρόνια νεφρική νόσο, ενώ νεότερα δεδομένα που αφορούν στη μειωμένη επιβίωση ασθενών με καρκίνο, αναφέρουν έκφραση του EPO-R στα καρκινικά κύτταρα και κυτταροπροστατευτική δράση της EPO σε αυτά (214,215). Επίσης, σε ένα μεγάλο αριθμό εργασιών που βρίσκονται στη φάση ΙΙΙ, έχει φανεί αποτελεσματικότητα της rhepo στο εγκεφαλικό επεισόδιο και στο οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου (216,217). Όσον αφορά στον πνευμονικό ιστό, υπάρχουν περιορισμένα δεδομένα και όλα βρίσκονται σε πειραματικό επίπεδο. Η θεραπευτική αντιμετώπιση της 87

88 απόπτωσης με EPO αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο πεδίο έρευνας. Σύμφωνα με ορισμένους συγγραφείς (221), η βαριά αρρώστια περιλαμβάνει μια απορρυθμισμένη απάντηση ερυθροποιητίνης στη συστηματική και μικραγγειακή υποξία κι επομένως οδηγεί σε μειωμένη κυτταροπροστασία. Έτσι, είναι πιθανό και στην πνευμονική ίνωση, που θεωρείται από τις πιο βαριές νόσους, η περιορισμένη συστηματική παραγωγή ερυθροποιητίνης να μην είναι σε θέση από μόνη της να αναστείλει τους αποπτωτικούς μηχανισμούς που έχουν ήδη αρχίσει στο κυψελιδικό και βρογχικό αναπνευστικό επιθήλιο (221). Στις περιπτώσεις αυτές είναι πιθανώς απαραίτητη η εξωγενής συγχορήγηση ερυθροποιητίνης και αντιπηκτικών (ηπαρίνη), προκειμένου να αποφευχθούν φαινόμενα θρομβώσεως ή να χρησιμοποιηθούν νεότερα ανάλογα rhepo, που όμως απαιτούν πειραματική επιβεβαίωση ως προς την ασφάλεια τους (221). Η χρόνια χορήγηση πιθανώς να αποδειχθεί βλαβερή λόγω της αύξησης της μάζας των ερυθροκυττάρων, η οξεία όμως χορήγηση είναι ασφαλής. Επιπλέον, παράγωγα ερυθροποιητίνης που είναι κυτταροπροστατευτικά αλλά όχι ερυθροποιητικά θα αποτελούσαν ιδανικούς παράγοντες εναντίον της οξείας πνευμονικής βλάβης (205) Αντιφλεγμονώδης δράση Υπάρχουν πολλές μελέτες, οι οποίες αποδεικνύουν την αντιφλεγμονώδη δράση της EPO στον πνεύμονα, καθιστώντας την πολύ σημαντικό υποψήφιο παράγοντα στην καθυστέρηση ανάπτυξης του φλεγμονώδους περιβάλλοντος και της εξέλιξής του σε ινωτικό ( ). Όλες επικεντρώνουν το ενδιαφέρον τους στη χαρακτηριστική μείωση ή μερική αδρανοποίηση των παραγόντων φλεγμονής μετά από συστηματική χορήγηση ερυθροποιητίνης σε πειραματόζωα στα οποία έχει προκληθεί κάποιου είδους οξεία βλάβη στο πνευμονικό επιθήλιο. Χαρακτηριστικά, σε μία μελέτη σε πειραματόζωα, τα οποία υπέστησαν βλάβη του πνεύμονα με υπεροξία, παρατηρήθηκε ότι στην ομάδα των ζώων που έλαβε rhepo οι ιστολογικές αλλοιώσεις ήταν πολύ λιγότερες από αυτές που εμφάνισαν τα ζώα που δεν έλαβαν την rhepo, ενώ συγχρόνως η μέτρηση της MPO (myeloperoxidase) ως άμεσου δείκτη συγκέντρωσης 88

89 ουδετεροφίλων και ως έμμεσου δείκτη πνευμονικής βλάβης, έδειξε ελαττωμένα επίπεδα στην πρώτη ομάδα σε σχέση με τη δεύτερη. Επιπλέον, το συνολικό λεύκωμα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (brocho-alveolar fluid, BALF), ως δείκτης απώλειας από τα τριχοειδή αγγεία ήταν επίσης ελαττωμένο. Τέλος, ήταν αυξημένη, στα ζώα που δεν έλαβαν αγωγή με EPO, η έκφραση του mrna του MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) και του CINC-1 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1), τα οποία θεωρούνται ότι σχετίζονται με τη φλεγμονή στον πνεύμονα που προκαλείται από οξειδωτικό stress (222,224). Σε μία άλλη μελέτη η ενδοτοξαιμία και η υπεροξία που προκαλούνταν με ενδοτραχειακή χορήγηση λιποπολυσακχαριτών (LPS), είχε σαν αποτέλεσμα αξιοσημείωτες διαφορές ανάμεσα στην ομάδα που έλαβε αγωγή με EPO και σε αυτήν που δεν έλαβε. Δηλαδή, οι τιμές των MPO, MDA, TNF-α, IL-1β και NF-κβ, παραγόντων που επάγουν τη φλεγμονή, ήταν ελαττωμένες στα πειραματόζωα που χορηγήθηκε ερυθροποιητίνη, πράγμα που σημαίνει ότι η τελευταία εμποδίζει την υπερπαραγωγή τους και άρα αναστέλλει τη φλεγμονή (223). Τέλος, πρέπει να αναφερθεί η σχέση που υπάρχει μεταξύ φλεγμονήςερυθροποίησης-ερυθροποιητίνης (228). Στην πνευμονική ίνωση υπάρχει ένας αυξημένος αριθμός πρόωρων μορφών ερυθροβλαστών που αποτυγχάνουν να εξαπλωθούν και να διαφοροποιηθούν in vivo, με αποτέλεσμα η ερυθροποίηση να είναι αναποτελεσματική. Αυτό έχει σαν συνέπεια τα επίπεδα της αιμοσφαιρίνης να μην αυξάνονται αναλογικά με τη βαρύτητα της υποξαιμίας (228). Οι τιμές της ερυθροποιητίνης κυμαίνονται μεταξύ των φυσιολογικών ορίων σε καταστάσεις υποξαιμίας στον πνεύμονα. Αυτό το εύρημα μπορεί να αντανακλά την ανασταλτική επίδραση των φλεγμονωδών κυτταροκινών (TNF-α, IL-1) στην παραγωγή ερυθροποιητίνης λόγω υποξίας (228,229). Η σχετικά χαμηλή EPO μπορεί να συνεισφέρει στη φτωχή ερυθροποιητική απάντηση, μιας και τα επίπεδα EPO θεωρείται ότι προσδιορίζουν το ρυθμό της διαφοροποίησης των ερυθροκυττάρων μέσω της παράτασης της επιβίωσης των άωρων ερυθροβλαστών, είτε αυξάνοντας την έκφραση της Bcl-xL πρωτεΐνης (228,230), είτε περιορίζοντας τη λειτουργία του Fas-FasL συστήματος (228,231). Οι κυτταροκίνες ή οι φλεγμονώδεις εν γένει 89

90 παράγοντες μπορούν επίσης να επηρεάσουν την ισορροπία μεταξύ ερυθροποιητίνης και συστήματος Fas/FasL αυξάνοντας την ευαισθησία των άωρων ερυθροβλαστών στον Fas προκαλώντας με τον τρόπο αυτό περαιτέρω περιορισμό της ερυθροποίησης (228,231,232). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η IL-1 ανταγωνίζεται τις επιδράσεις της ερυθροποιητίνης στους τελικού σταδίου ερυθροβλάστες (228,233), ενώ κάποιοι υποστηρίζουν την ύπαρξη μιας αντιστρόφως ανάλογης σχέσης μεταξύ της μάζας των πρόδρομων ερυθροκυττάρων και της συγκέντρωσης της ερυθροποιητίνης στον ορό του αίματος (228,234) Αντιοξειδωτική δράση Λίγες μελέτες αναφέρονται αποκλειστικά στην αντιοξειδωτική δράση της ερυθροποιητίνης. Συνήθως η δράση αυτή περιγράφεται στα πλαίσια της ευεργετικής επίδρασης της EPO στην υποξία και απόπτωση στον πνευμονικό ιστό (204,294). Μία μελέτη που αναφέρεται σε εξωγενή χορήγηση ερυθροποιητίνης σε οξύ τραυματισμό του πνευμονικού ιστού λόγω οξείας παγκρεατίτιδας σε επίμυες, αποδεικνύει την αντιοξειδωτική δράση της EPO μετρώντας εκτός από IL-2, IL-6, TNF-α, όγκο πλευριτικής συλλογής, έκταση ιστολογικών αλλοιώσεων, πολυμορφοπυρήνωση και ox-ldl. Καταλήγει στο συμπέρασμα ότι η ερυθροποιητίνη, πλην της κυτταροπροστατευτικής της δράσης ως αντιαποπτωτικού και αντιφλεγμονώδους παράγοντα, μιας και σημειώνεται μια σοβαρή μείωση των προφλεγμονωδών κυτταροκινών στη συστηματική κυκλοφορία, έχει και αντιοξειδωτική δράση, αφού παρατηρείται μία πολύ μεγάλη μείωση της λιπιδικής υπεροξείδωσης που σχετίζεται με το οξειδωτικό stress (235). Μία άλλη μελέτη αναφέρεται στο σίδηρο ως πολύ σημαντικό καταλύτη των ελεύθερων ριζών οξυγόνου και της λιπιδικής υπεροξείδωσης που μπορούν να παίξουν ρόλο στην παθογένεια διαφόρων ασθενειών στην πρώιμη ηλικία (236). Όπως είναι γνωστό, στην πρώιμη νεογνική περίοδο, αυξημένες ποσότητες σιδήρου κυκλοφορούν στον εξωκυττάριο χώρο. Η υπόθεση ότι η χορήγηση EPO κινητοποιεί τον σίδηρο προς το εσωτερικό των κυττάρων προκαλώντας την αναστολή των οξειδωτικών αντιδράσεων που 90

91 αυτός καταλύει, θεωρείται πολύ σημαντικό εύρημα (294). Η μία ομάδα πειραματοζώων διατηρήθηκε σε συνθήκες περιβάλλοντος (21% συγκέντρωση οξυγόνου) και η άλλη σε συνθήκες υπεροξίας (100% συγκέντρωση οξυγόνου). Και στις δύο χορηγήθηκε rhepo (236). Μετρήθηκαν: ο σίδηρος του πλάσματος, ο κορεσμός της τρανσφερρίνης σε σίδηρο, η λιπιδική υπεροξείδωση, η μη καθιζάμενη πρωτεΐνη (nonsedimentable protein, NSP) και τα φωσφολιπίδια στο BALF. Το αποτέλεσμα ήταν η μείωση των επιπέδων του σιδήρου στο πλάσμα και η μείωση του κορεσμού της τρανσφερρίνης σε σίδηρο. Η χορήγηση EPO οδήγησε στην αύξηση της ικανότητας, τόσο του πλάσματος όσο και του BALF να αναστείλουν τη λιπιδική υπεροξείδωση και να ελαττώσουν την NSP στο BALF. Επιπλέον, η χορήγηση ερυθροποιητίνης στην ομάδα της υπεροξίας ελάττωσε την πάχυνση των κυψελίδων και την ποσότητα του πρωτεϊνικού εξιδρώματος. Έτσι λοιπόν, η rhepo κινητοποιεί το σίδηρο του ορού και μειώνει το οξειδωτικό τραύμα που εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα αυτού του μετάλλου στον οργανισμό (236). Η αντιοξειδωτική δράση της EPO έχει μελετηθεί και σε πολλούς άλλους ιστούς, κυρίως όμως στο νευρικό ιστό. Χορήγηση της ΕΡΟ τόσο in vitro όσο και in vivo παρείχε σημαντικού βαθμού νευροπροστασία απέναντι σε τοξικούς παράγοντες καθώς και σε μοντέλα ισχαιμικής-υποξικής βλάβης (238,239). Οι κυτταροπροστατευτικές ιδιότητες της ΕΡΟ δεν περιορίζονται στους νευρώνες αλλά αφορούν και τα επιθηλιακά και μικρογλοιακά κύτταρα (240). 91

92 92

93 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ο Πειραματικό Μοντέλο Μπλεομυκίνης 10.1 Μπλεομυκίνη (BLM) Η BLM ανακαλύφθηκε το 1966 από τον Ιάπωνα επιστήμονα Hamao Umezawa, ο οποίος επεσήμανε την αντικαρκινική της δραστηριότητα σε καλλιέργειες του Streptomyces Verticillus. Είναι ένα πολύ ισχυρό αντιβιοτικό φάρμακο, ευρέως γνωστό στη βιβλιογραφία ότι προκαλεί πνευμονική ίνωση τόσο σε ανθρώπους, όταν χρησιμοποιείται στα πλαίσια θεραπευτικής αγωγής κατά του καρκίνου, όσο και σε πειραματόζωα, στη διάρκεια ερευνών που αφορούν στην ίνωση (242). Ο χημικός της τύπος είναι: C 55 H 84 N 17 O 21 S 3 και το μοριακό της βάρος 1487,49 Kd (εικόνα 4). Εικόνα 4 : Δομή μορίου μπλεομυκίνης (242) Η μπλεομυκίνη ανήκει στην κατηγορία των αντιβιοτικών πεπτιδίων που έχουν αντινεοπλασματική δράση και χρησιμοποιείται στη θεραπεία του καρκίνου του όρχεος, λεμφωμάτων και καρκινωμάτων από πλακώδη κύτταρα (243,244). Επίσης χρησιμοποιείται στην πλευρόδεση και στους πελματιαίους ακροχόρδονες (242). Η BLM ενώνεται με το DNA προκαλώντας ρωγμές στη διπλή έλικα, αναστέλλοντας έτσι την περαιτέρω σύνθεση του DNA, του RNA και των πρωτεϊνών. Δρα κυρίως στη φάση G 2 του κυτταρικού κύκλου, αλλά και στις φάσεις S και M. Κάποιες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η μπλεομυκίνη αναστέλλει την ενσωμάτωση της θυμίνης (T) στην αλυσίδα του DNA και ότι η 93

94 διχοτόμηση του DNA εξαρτάται από το οξυγόνο και τα ιόντα μετάλλων, τουλάχιστον in vitro (242). Πιστεύεται ότι η μπλεομυκίνη σχηματίζει χηλικές ενώσεις με τα μεταλλικά ιόντα (πρωτίστως του σιδήρου) παράγοντας ένα ψευδοένζυμο που αντιδρά με τη σειρά του με το οξυγόνο για τη δημιουργία υπεροξειδικών και υδροξειδικών ελευθέρων ριζών, οι οποίες τελικά διασπούν το DNA (242,253). Επιπρόσθετα, αυτά τα συστήματα προκαλούν λιπιδική υπεροξείδωση και οξείδωση άλλων κυτταρικών μορίων (254). Το ελεύθερο φάρμακο και τα προϊόντα μεταβολισμού του απεκκρίνονται με τα ούρα κι έτσι εξηγούνται τα συνήθη νεφροτοξικά φαινόμενα (250). Αν και περιπτώσεις πνευμονικής τοξικότητας του φαρμάκου στον άνθρωπο έχουν περιγραφεί και σε χαμηλές δόσεις, της τάξης των 60 mg, η πνευμονική βλάβη είναι συχνότερη σε συνολικές δόσεις μεγαλύτερες των 450 mg, με τη μορφή κυρίως της διάμεσης πνευμονίτιδας και ίνωσης και λιγότερο συχνά πνευμονίτιδας εξ υπερευαισθησίας, μη-καρδιογενούς πνευμονικού οιδήματος, αποφρακτικής βρογχιολίτιδας με οργανούμενη πνευμονία (BOOP) και πλευριτικής συλλογής (245) Πειραματικό μοντέλο Το πειραματικό μοντέλο μπλεομυκίνης έχει αποδειχθεί ότι είναι ιδανικό για την πρόκληση οξείας πνευμονικής βλάβης, που ακολουθείται από ίνωση. Στις διάφορες μελέτες έχουν περιγραφεί πολλές παραλλαγές του μοντέλου, που αφορούν τόσο στη δόση της ενδοτραχειακά χορηγούμενης BLM, όσο και στον ιδανικό χρόνο μετά την έγχυσή της, που δημιουργούνται οι βλάβες (205, , , 277, 290, 302). Συνοπτικά, τα χαρακτηριστικά του μοντέλου είναι τα παρακάτω : Πρώιμη φλεγμονώδης αντίδραση στους πνεύμονες, που προκαλείται μερικώς από τα ουδετερόφιλα και τα μακροφάγα, υπερβολική ινοβλαστική μεταπλασία και εναπόθεση κολλαγόνου (μεταξύ 1 ης και 21 ης ημέρας με αποκορύφωμα τη 14 η ημέρα) (205,254,257,259) Αύξηση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και υπερέκκριση συνθάσης του οξειδίου του αζώτου (nitric oxide synthase, NOS) και πρωτεϊνών στον πνεύμονα (254, ). 94

95 Η βασική υπερπλαστική-μεταπλαστική φάση συμβαίνει την πρώτη εβδομάδα μετά την έγχυση της BLM (μεταξύ 3 ης και 5 ης μέρας) (262,270,271). Αναλυτικότερα, οι παθογενετικοί μηχανισμοί της πνευμονικής βλάβης περιλαμβάνουν την άμεση κυτταροτοξική δράση στο ενδοθήλιο των πνευμονικών τριχοειδών και στα πνευμονοκύτταρα τύπου Ι, με πρόκληση οξειδωτικών κυρίως βλαβών (άμεση δράση των ελευθέρων ριζών στο πνευμονικό επιθήλιο και ενδοθήλιο), τη συσσώρευση λευκοκυττάρων με επακόλουθη απελευθέρωση πρωτεασών (ελαστάσης, κολλαγενάσης κ.α.) και τέλος τη διέγερση ινοβλαστών με αυξημένη σύνθεση κολλαγόνου και ανάπτυξη πνευμονικής ίνωσης. Επιπλέον, είναι πιθανόν η μπλεομυκίνη να αναστέλλει μερικώς ή πλήρως την ενεργοποίηση του συστήματος των αντιπρωτεασών αυξάνοντας με τον τρόπο αυτόν τη δράση των πρωτεολυτικών ενζύμων (244,246,265,272,273,290). Στην όλη διαδικασία της τοξικής βλάβης φαίνεται ότι είναι σημαντικός ο ρόλος διάφορων παραγόντων, όπως είναι ο TGF-β, ο ΤΝF-α, η ιντερφερόνη-γ, η IL-6 κ.ά., που συμμετέχουν στη διαδικασία της ίνωσης (272,273). Πιθανή ακόμη είναι η συμμετοχή γονιδιακών διαταραχών, όπως αυτές που αφορούν στη λειτουργία της p53 σε επίπεδο κυψελιδικού επιθηλίου και σχετίζονται κυρίως με την έκφραση των πρωτεϊνών του επιφανειοδραστικού παράγοντα, καθώς και η έλλειψη ή η μειωμένη δραστηριότητα της υδρολάσης της μπλεομυκίνης, μιας πεπτιδάσης που απενεργοποιεί το φάρμακο. Υψηλές συγκεντρώσεις του ενζύμου βρίσκονται στο ήπαρ, το σπλήνα, το μυελό των οστών και το έντερο. Αντίθετα, τα επίπεδα του ενζύμου είναι χαμηλά στους πνεύμονες και το δέρμα, γεγονός το οποίο, ενδεχομένως αντικατοπτρίζει την αυξημένη ευαισθησία αυτών των οργάνων στην τοξική δράση της υδροχλωρικής μπλεομυκίνης (241, ,265,272,273,290,302) Περιγράφοντας κανείς χρονικά την πορεία των φαινομένων στο μοντέλο μπλεομυκίνης (εικόνα 5) θα έλεγε ότι μετά τη διενέργεια τραχειοστομίας και την ενδοτραχειακή έγχυση της μπλεομυκίνης στους επίμυες, αναπτύσσεται οξεία κυψελιδίτιδα τις πρώτες 2-3 μέρες. Τα πρώτα κύτταρα που κάνουν την εμφάνισή τους είναι τα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα (Polymorphonuclear Leukocytes, PMNs), τα οποία φθάνουν σε μέγιστο αριθμό την 3 η μέρα μετά την έγχυση της BLM και επανέρχονται σταδιακά σε φυσιολογικές τιμές την 28 η μέρα (265,273). Ακολουθεί φλεγμονή 95

96 του διάμεσου ιστού στις 4-12 μέρες. Η μετάβαση από τη φλεγμονώδη στην ινωτική κατάσταση γίνεται την 9 η ημέρα. Τα κύτταρα που εμφανίζονται δεύτερα σε σειρά είναι τα λεμφοκύτταρα, τα οποία φτάνουν σε μέγιστες τιμές την 7 η μέρα μετά την έγχυση της BLM. Την ίδια μέρα παρουσιάζουν πολύ αυξημένες τιμές και τα εωσινόφιλα και ξεκινάει η σύνθεση του κολλαγόνου και ο σχηματισμός ινοβλαστών ως τη 14 η μέρα μετά την έγχυση (265,269,270, ). Ο ιδανικός χρόνος για μετρήσεις του ουδετεροφιλικού φορτίου στο πειραματικό αυτό μοντέλο πνευμονικής βλάβης, δεν είναι ακόμα γνωστός. Έχει αναφερθεί ότι αυξημένος αριθμός ουδετεροφίλων στο BALF επίμυων, που έχουν υποστεί πνευμονική ίνωση με BLM, παρατηρείται την από την 1 η κιόλας ημέρα, φτάνει στο ζενίθ τη 14 η και παραμένει αυξημένη ως και την 21 η ημέρα μετά την έγχυση της μπλεομυκίνης. Κυρίως όμως μεταξύ 7 ης και 14 ης μέρας παρατηρούνται τα πιο αυξημένα επίπεδα ουδετεροφίλων και οι βλάβες από τη δράση της BLM είναι πολύ πιο έντονες κατά το χρονικό αυτό διάστημα (265, , ). Εικόνα 5: Χρονική εξέλιξη του πειραματικού μοντέλου μπλεομυκίνης (397) Τα παθολογοανατομικά ευρήματα ομοιάζουν με αυτά που ανευρίσκονται σε ανθρώπινους πνευμονικούς ιστούς, παρά το γεγονός ότι το φλεγμονώδες φορτίο είναι πολύ μεγαλύτερο στα πειραματόζωα (255), και συνίστανται κυρίως σε διάμεσο οίδημα με παράλληλη παρουσία κυψελιδικού 96

97 εξιδρώματος, καταστροφή των τύπου Ι πνευμονοκυττάρων, μεταπλασία των πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ, φλεγμονώδη πολυμορφοπυρηνική διήθηση, παραγωγή ινοβλαστών - κολλαγόνου και διάμεση ίνωση (272). Πρέπει ακόμη να αναφερθεί ότι, σε μερικές περιπτώσεις, η μπλεομυκίνη προκαλεί μια πιθανότερα αλλεργικού τύπου αντίδραση με ηωσινοφιλική διήθηση των κυψελιδικών τοιχωμάτων, ηωσινοφιλία και πυρετό (248,250). Η συγχορήγηση της μπλεομυκίνης με αυξητικούς παράγοντες των ουδετεροφίλων θεωρείται ότι αυξάνει τον κίνδυνο πνευμονικής τοξικότητας, αν και νεότερες έρευνες αμφισβητούν τα αποτελέσματα προηγούμενων μελετών (251,252). Η σημασία της αύξησης του προκολλαγόνου τύπου ΙΙΙ (sp-iii-p), δείκτη αυξημένου μεταβολισμού του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ, από τη δράση των διεγερμένων από τη μπλεομυκίνη ινοβλαστών, βρίσκεται ακόμη υπό αξιολόγηση, ενώ η παρακολούθηση των επιπέδων του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης (S-ACE) φαίνεται οτι δεν είναι αξιόπιστη (251). 97

98 98

99 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 99

100 100

101 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο Υλικό και μέθοδοι 1.1 Πειραματόζωα Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 50 ένηβοι άρρενες επίμυες της φυλής Wistar, με βάρος σώματος gr. Οι επίμυες προήλθαν από την καλλιέργεια του εργαστηρίου Πειραματικής Φυσιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Στα πειραματόζωα χορηγήθηκε τροφή και ύδωρ ad libitum. Τοποθετήθηκαν σε διαφανείς κλωβούς με οροφή από μεταλλικό πλέγμα και παρέμειναν σε ειδικά εξοπλισμένο για φωτοπερίοδο χώρο όπου εξασφαλιζόταν η εναλλαγή φωτός-σκότους με αυτόματο χρονοδιακόπτη (συνθήκες φωτοπεριόδου: 14 ώρες φως και 10 ώρες σκοτάδι), και όπου η θερμοκρασία περιβάλλοντος διατηρούνταν στους 22±2 ο C χωρίς αλλαγές στην περιβαλλοντική υγρασία. Η περίοδος του φωτός άρχιζε και τελείωνε στο διάστημα από τις 6πμ ως τις 8μμ. 1.2 Χορηγούμενες ουσίες α) Μπλεομυκίνη (BLM) Το σκεύασμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν υδροχλωρικό διάλυμα μπλεομυκίνης 15mgr/0,4 ml της εταιρίας Nippon Kayakou, Tokyo, Japan. Η συγκέντρωση του χορηγούμενου διαλύματος προσδιορίστηκε στα 7,5 mgr/kg βάρους σώματος. Ο προσδιορισμός της χορηγούμενης δόσης μπλεομυκίνης, προκειμένου να προκληθεί πνευμονική ίνωση στους υπό εξέταση επίμυες, έγινε με βάση τα δεδομένα της διεθνούς βιβλιογραφίας. Σε μεγάλο αριθμό εργασιών, που εφάρμοσαν το πειραματικό μοντέλο μπλεομυκίνης για την πρόκληση πνευμονικής βλάβης σε επίμυες της ίδιας φυλής και του αντίστοιχου σωματικού βάρους, χρησιμοποιήθηκε αυτή η δοσολογία φαρμάκου της ίδιας ή άλλης εταιρείας (205,266,270,277,282,300). 101

102 β) Ερυθροποιητίνη (EPO) Το σκεύασμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν της εταιρείας Eprex. Η δόση προσδιορίστηκε στις 2000 iu/kg βάρους σώματος (234,299). Πρέπει να τονιστεί ότι η τελική επιλογή της δοσολογίας έγινε με βάση τη βιβλιογραφία και προηγούμενα πιλοτικά πειράματα, στα οποία χορηγήθηκε η EPO σε μικρότερη δοσολογία χωρίς, όμως, να εμφανίζει κυτταροπροστατευτική δράση. Δηλαδή, δοκιμάστηκαν και άλλες δόσεις ερυθροποιητίνης (1000 iu/kg και 1500 iu/kg) αλλά απορρίφθηκαν τελικά με βάση τα μη ικανοποιητικά αποτελέσματα κυτταροπροστασίας (296,298). 1.3 Πειραματικό πρωτόκολλο Ομάδες Πειραματοζώων Οι επίμυες που χρησιμοποιήθηκαν χωρίστηκαν σε 5 ομάδες. Πειραματόζωα Ν = 50 Ομάδα 1 Ν = 10 Ομάδα 2 Ν = 10 Ομάδα 3 Ν = 10 Ομάδα 4 Ν =10 Ομάδα 5 Ν = 10 Δεν έλαβαν καμία ουσία Έλαβαν NaCl 0,9% I.t + i.p Έλαβαν μόνο BLM i.t Έλαβαν BLM it και EPO i.p Έλαβαν NaCl 0,9% i.t και EPO i.p 102

103 Ομάδα 1 (ομάδα μαρτύρων) : 10 επίμυες Στην ομάδα αυτή συμπεριλήφθησαν φυσιολογικά πειραματόζωα, στα οποία δεν έγινε ενδοτραχειακή (i.t) έγχυση μπλεομυκίνης, ούτε ενδοπεριτοναϊκή (i.p) έγχυση ερυθροποιητίνης. Ομάδα 2 (ομάδα μαρτύρων) : 10 επίμυες. Στα πειραματόζωα αυτής της ομάδας, έγινε χορήγηση φυσιολογικού ορού τόσο ενδοτραχειακά στάγδην, όσο και ενδοπεριτοναϊκά άπαξ. 103

104 Ομάδα 3 (ομάδα μπλεομυκίνης) : 10 επίμυες. Στην ομάδα αυτή πειραματοζώων χορηγήθηκε ενδοτραχειακά στάγδην και με εξαιρετικά αργό ρυθμό μόνο μπλεομυκίνη. Αυτή η ομάδα αποτελεί την ομάδα πρόκλησης της πνευμονικής βλάβης με τη μπλεομυκίνη, όπως περιγράφεται στο πειραματικό μοντέλο μπλεομυκίνης. Ομάδα 4 (ομάδα ερυθροποιητίνης) : 10 επίμυες. Στα πειραματόζωα αυτής της ομάδας χορηγήθηκε ενδοτραχειακά στάγδην μπλεομυκίνη και αμέσως μετά χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά ερυθροποιητίνη άπαξ. Η ομάδα αυτή αποτελεί την ομάδα ελέγχου του βαθμού βελτίωσης της πνευμονικής βλάβης που προκάλεσε η μπλεομυκίνη, με τη χρήση της ερυθροποιητίνης. 104

105 Ομάδα 5 (ομάδα μαρτύρων) : 10 επίμυες. Στην ομάδα αυτή χορηγήθηκε ενδοτραχειακά στάγδην φυσιολογικός ορός και στο τέλος της χορήγησής του, χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά ερυθροποιητίνη άπαξ Μοντέλο πνευμονικής ίνωσης Κατά την πρώτη ημέρα του πειράματος τα πειραματόζωα αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση ένυδρης χλωράλης 4,5% (1ml/Kg) και στη συνέχεια έγιναν, στην τράπεζα πειραμάτων, κάτω από λυχνία χειρουργείου, οι λεπτοί χειρισμοί διανοίξεως της τραχείας, αφού προηγήθηκε η αποκάλυψη και ανατομική παρασκευή της. Αναλυτικά : Με χειρουργικό νυστέρι διανοίχθηκε επιμήκως η επιδερμίδα και το χόριο (2cm περίπου) και αφαιρέθηκε το υποδόριο λίπος κατά μήκος της τομής. Έτσι, προέβαλαν η μυική περιτονία και ο πρόσθιος τραχηλικός μυς που διανοίχθηκαν επίσης με επιμήκεις τομές μέχρι να προβάλλει στο βάθος η τραχεία του πειραματοζώου. Διενεργήθηκε τραχειοτομή προσεκτικά με λεπτό νυστέρι και καθετηριάστηκε η τραχεία, μεταξύ δύο ημικρικίων, με ειδικό καθετήρα νεογνών διαμέτρου 1mm. Στη συνέχεια τοποθετήθηκε το πειραματόζωο σε κεκλιμένη θέση και ξεκίνησε το κυρίως πείραμα, που ήταν ελάχιστα διαφοροποιημένο ανάμεσα στις ομάδες μελέτης. Στην άκρη του καθετήρα της τραχειοστομίας τοποθετήθηκε η σύριγγα που περιείχε το φυσιολογικό ορό (για τις ομάδες 2 και 5) ή την μπλεομυκίνη 105

106 (για τις ομάδες 3 και 4), που έπρεπε να ληφθεί ενδοτραχειακά, και άρχισε η πολύ προσεκτική και εξαιρετικά αργή έγχυσή τους στην τραχεία και κατ επέκταση στους πνεύμονες του πειραματοζώου. Η πολύ μικρή ταχύτητα έγχυσης απέβλεπε στην αποφυγή πρόκλησης βραδυκαρδίας, καρδιακής κάμψης, πνευμονικού οιδήματος και θανάτου του πειραματοζώου. Ανάλογα με το βάρος σώματος κάθε πειραματοζώου καθορίστηκε και ο όγκος του NaCl 0,9% ή ο όγκος του διαλύματος της μπλεομυκίνης που χορηγήθηκε ενδοτραχειακά, δεδομένης πάντα της συγκέντρωσης των 7,5 mgr/kgr βάρους σώματος την οποία υποστηρίζει η διεθνής βιβλιογραφία (205,266,270,277,282,300). Μόλις ολοκληρώθηκε η ενδοτραχειακή έγχυση, έγινε συρραφή των περιτονιών και μυών του πρόσθιου τραχηλικού τοιχώματος με μεταξωτό νήμα (Mersilk 0/2) και το πείραμα ολοκληρώθηκε με την ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση φυσιολογικού ορού στην ομάδα 2 και ερυθροποιητίνης στις ομάδες 4 και 5 (σε δόση 2000 iu/kg). Μετά το πέρας των χειρισμών αυτών όλα τα πειραματόζωα τοποθετήθηκαν στα ατομικά κλουβιά τους, όπου παρέμειναν για 14 ημέρες, παρακολουθούμενα καθημερινά για τυχόν αλλαγή στη συμπεριφορά και τη δραστηριότητά τους Παρατήρηση πειραματοζώων (1 η έως 14 η ημέρα) Μετά την ολοκλήρωση του πειράματος και για τις επόμενες 14 ημέρες τα πειραματόζωα παρέμεναν στα κλουβιά τους και παρατηρούνταν η συμπεριφορά τους σε καθημερινή βάση. α. Τα πειραματόζωα της ομάδας 1 (μάρτυρες) είχαν αμετάβλητη συμπεριφορά και παρέμεναν ζωηρά και δραστήρια στη διάρκεια του 14ημέρου. β. Τα πειραματόζωα της ομάδας 2 (μάρτυρες), που έλαβαν μόνο φυσιολογικό ορό ενδοτραχειακά και ενδοπεριτοναϊκά, παρουσίασαν τα ίδια περίπου χαρακτηριστικά συμπεριφοράς με την προηγούμενη ομάδα. Δεν μεταβλήθηκε η δραστηριότητά τους από την πρώτη ως την τελευταία ημέρα, εκτός από μία μικρή ελάττωση στη σίτισή τους, και η συμπεριφορά τους ήταν απόλυτα φυσιολογική και αναμενόμενη για την ηλικία τους. γ. Τα πειραματόζωα της ομάδας 3, που έλαβαν ενδοτραχειακά την μπλεομυκίνη, παρουσίασαν μία ιδιαίτερα μειωμένη δραστηριότητα. Ήταν 106

107 νωχελικά, υποτονικά, δυσπνοούσαν, έχασαν αρκετό από το τρίχωμά τους, δεν σιτίζονταν κανονικά, παρουσίασαν απώλεια βάρους και απομονώνονταν σε μία γωνία του κλουβιού τους. δ. Τα πειραματόζωα της ομάδας 4, τα οποία εκτός από μπλεομυκίνη έλαβαν και ερυθροποιητίνη, είχαν μία πιο αυξημένη δραστηριότητα. Η όψη τους δεν ήταν πάσχουσα, αντιδρούσαν στα ερεθίσματα και σιτίζονταν καλά. Δεν παρουσίασαν απώλεια τριχώματος, διατήρησαν ή και αύξησαν το βάρος τους και η κινητικότητα και συμπεριφορά τους ήταν πιο έντονες. ε. Τα πειραματόζωα της ομάδας 5 (μάρτυρες), που έλαβαν ενδοτραχειακά φυσιολογικό ορό και ενδοπεριτοναϊκά ερυθροποιητίνη, είχαν δραστηριότητα ανάλογη με αυτήν των ζώων της ομάδας 1, δηλαδή δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή στην όλη συμπεριφορά τους στο διάστημα των 14 ημερών της παρακολούθησης Αιμοληψία Μέτρηση Αιματοκρίτη Η αιμοληψία πραγματοποιήθηκε συνολικά δύο φορές για κάθε πειραματόζωο, την 1 η μέρα και τη 14 η μέρα του πειράματος. Αμέσως μετά την αναισθητοποίηση του πειραματοζώου, παρακεντήθηκε η έξω σφαγίτιδα φλέβα, δεξιά ή αριστερά, μετά την αποκάλυψή της με διατομή του δέρματος κατά μήκος της μέσης μασχαλιαίας γραμμής (2-4mm πλαγίως του στερνοκλειδομαστοειδούς μυός) και άνωθεν της κλείδας. Το αίμα αυτό χρησιμοποιήθηκε και τις δύο φορές, για προσδιορισμό του αιματοκρίτη με τη συσκευή μέτρησης του μικροαιματοκρίτη, ενώ το υπόλοιπο μεταγγίστηκε σε φυγοκεντρικά σωληνάρια (Ependorf) του 1ml και παρέμεινε προς πήξη πριν τη φυγοκέντρησή του στις 3500 στροφές για 15 λεπτά και την παραλαβή ορού. Τα δείγματα του ορού καταψύχθηκαν και συντηρήθηκαν στους -20 ο C μέχρι τη μέτρηση των επιπέδων EPO με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας (chemiluminescence) Μέτρηση επιπέδων EPO στον ορό αίματος Τα επίπεδα της EPO στον ορό αίματος μετρήθηκαν με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας σε αναλυτή Immulite 2000 της εταιρείας SIEMENS. Η χημειοφωταύγεια κατέχει κυρίαρχη θέση ανάμεσα στις μη ραδιοϊσοτοπικές 107

108 τεχνικές ανίχνευσης. Είναι το φυσικό φαινόμενο της παραγωγής φωτεινής ακτινοβολίας από μία εξώθερμη χημική αντίδραση. Η οξειδοαναγωγική αυτή αντίδραση παρέχει την ενέργεια σε προϊόν της, ώστε αυτό να διεγερθεί. Καθώς αμέσως αποδιεγείρεται για να επιστρέψει σε σταθερή ενεργειακή κατάσταση, εκπέμπει χαρακτηριστική φωτεινή ακτινοβολία. Η αντίδραση περιγράφεται από την εξίσωση: Α + Β C* C + hν, όπου Α και Β τα αντιδρώντα και C το διεγειρόμενο προϊόν. Η ακτινοβολία που εκπέμπεται μπορεί να μετρηθεί από μία απλή μετρική συσκευή, το φωτόμετρο χημειοφωταυγειομετρίας ή λουμινόμετρο, που περιλαμβάνει μία κυψελίδα, στην οποία τοποθετείται το προς μέτρηση διάλυμα, μπροστά σε έναν ανιχνευτή-φωτοπολλαπλασιαστή και σύστημα αυτόματης χορήγησης των αντιδραστηρίων Α και Β (υπεοξειδίου του υδρογόνου και μίας βάσης), απαραίτητων για την οξειδοαναγωγική αντίδραση. Η μέθοδος αυτή, ως ιχνηθέτης (tracer), για την παραγωγή σήματος και την τελική ανίχνευση στις ανοσοαναλύσεις κάνει χρήση διαφόρων χημειοφωταυγών μορίων, όπως είναι οι κυκλικές υδραζίνες (λουμινόλη, ισολουμινόλη, αμινικά παράγωγα της ισολουμινόλης κλπ), οι εστέρες ακριδίνης, που βρίσκουν εφαρμογή στον αναλυτή Immulite 2000, διοξετάνια και άλατα του ρουθηνίου. Τα μόρια αυτά χρησιμοποιούνται ως ιχνηθέτες για την απευθείας επισήμανση του αντιγόνου ή του αντισώματος, οπότε προκύπτει ανοσοανάλυση, η οποία καλείται ανοσοχημειοφωταυγειομετρική μέθοδος δύο θέσεων (Two site Immunochemilumino Metric Assay ICMA) όπου δύο μονοκλωνικά αντισώματα, το ένα επισημασμένο με χημειοφωταυγές μόριο και το άλλο σταθεροποιημένο σε στερεή φάση παγιδεύουν την προς μέτρηση ουσία (ερυθροποιητίνη) με τη μορφή sandwich. Τα επίπεδα της EPO στον ορό του αίματος των πειραματοζώων όλων των ομάδων μετρήθηκαν τόσο την 1 η όσο και την 14 η ημέρα της πειραματικής διαδικασίας. 1.4 Ιστολογική Ανάλυση Λήψη και παρασκευή πνευμονικών ιστών Στην ιστολογική μελέτη συμπεριλήφθηκαν όλες οι ομάδες των πειραματοζώων. Πριν από τη λήψη των ιστών έγινε ενδοκαρδιακή έγχυση 108

109 (perfusion) αρχικά φωσφορικού διαλύματος 0,1 mm (PBS, ph=7.4) και στη συνέχεια μονιμοποιητικού διαλύματος παραφορμαλδεΰδης (PFA) 4% σε PBS θερμοκρασίας 4 C. Ακολούθησε η παρασκευή των πνευμόνων, οι οποίοι διατηρήθηκαν στο ίδιο μονιμοποιητικό υλικό για 24 ώρες σε θερμοκρασία 4º C και έπειτα σε PBS για ώρες στην ίδια θερμοκρασία. Το επόμενο στάδιο περιέλαβε την αφυδάτωση των ιστών με σταδιακή εμβάπτιση σε διαφόρων βαθμών αλκοόλες και τοποθέτηση σε παραφίνη. Τέλος, με τη βοήθεια μικροτόμου έγινε λήψη εγκάρσιων τομών πάχους 5 μm, οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν για την ιστοχημική χρώση εωσίνης - αιματοξυλίνης και για ανοσοϊστοχημικές χρώσεις Ιστοχημική χρώση εωσίνης-αιματοξυλίνης (Η-Ε) Στα ιστολογικά παρασκευάσματα χρησιμοποιήθηκε η χρώση αιματοξυλίνης - εωσίνης, με την οποία εντοπίστηκαν περιοχές φλεγμονής και ίνωσης, οι οποίες αξιολογήθηκαν με μορφομετρική ανάλυση Image Pro Plus Software Version 4,1 και εκτιμήθηκαν οι πνευμονικές βλάβες με σταδιοποίηση της βαρύτητας της βλάβης με τη χρήση ημιποσοτικής κλίμακας 3 διαβαθμίσεων από 0 ως 2 (205): 0 παρουσία βλάβης σε ποσοστό <25% της επιφάνειας του ιστολογικού παρασκευάσματος. 1 παρουσία βλάβης σε ποσοστό 25-50% της επιφάνειας του ιστολογικού παρασκευάσματος. 2 παρουσία βλάβης σε ποσοστό >50% της επιφάνειας του ιστολογικού παρασκευάσματος Ανοσοϊστοχημεία α) Γενικά Για την ανοσοϊστοχημεία ακολουθήθηκε η τεχνική της ανοσοϋπεροξειδάσης και του συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης (Vectastain ABC kit, Vector Labs). Το αποτέλεσμα της αντίδρασης εμφανίστηκε με τη χρήση διαμινοβενζιδίνης (DAB) ως χρωμογόνου. Η DAB πολυμερίστηκε με την παρουσία υπεροξειδάσης και H 2 O 2 σχηματίζοντας αδιάλυτο πολυμερές 109

110 που εντοπίστηκε στις θέσεις αντιγόνου-αντισώματος δίνοντας ένα καφέ χρώμα, ορατό στο κοινό μικροσκόπιο. β) Τεχνική Τα παρασκευάσματα των πνευμονικών ιστών που χρησιμοποιήθηκαν προήλθαν από πειραματόζωα όλων των ομάδων. Η επεξεργασία και διατήρηση των ιστών έγινε με τον ίδιο τρόπο που εφαρμόστηκε και στην ιστολογική ανάλυση. Στην ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήθηκαν τομές παραφίνης πάχους 5 μm, που ελήφθησαν με το μικροτόμο και που αμέσως μετά την παρασκευή τους τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες, ειδικά επεξεργασμένες για τεχνικές ανοσοϊστοχημείας. Για την εφαρμογή των τεχνικών ανοσοϊστοχημικής χρώσης χρησιμοποιήθηκε ειδικό σύστημα ανίχνευσης (Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse), που περιελάμβανε όλα τα αντιδραστήρια και χρωστικές τα οποία ήταν απαραίτητα. Αναλυτικά: Μετά την αποπαραφίνωση και σταδιακή ενυδάτωση των τομών σε διαδοχικά διαλύματα αλκοόλης ακολουθήθηκε η τεχνική της αποκάλυψης των αντιγονικών επιτόπων, που επετεύχθη με επώαση των τομών σε υψηλή θερμοκρασία (95ºC) σε ατμόλουτρο για 30 λεπτά παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού οξέος, συγκέντρωσης 0,01M και ph=6. Ακολούθως οι τομές διατηρήθηκαν σε διάλυμα H 2 O 2 1% σε μεθανόλη, με σκοπό την εξουδετέρωση της δραστικότητας της ενδογενούς υπεροξειδάσης και μετά από πλύση τους με απεσταγμένο νερό και PBS, επωάστηκαν με το προς εξέταση αντίσωμα για ώρες σε θερμοκρασία ψύξης (4ºC). Τη δεύτερη μέρα της διαδικασίας, οι τομές επωάστηκαν με ειδικό ρυθμιστικό διάλυμα που παρέχεται από τον κατασκευαστή (πολυμερές HRP) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το επόμενο στάδιο περιελάμβανε πλύσεις με PBS και η τεχνική ολοκληρώθηκε με την εμφάνιση της αντίδρασης με τη χρήση της DAB, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ακολούθως οι τομές τοποθετήθηκαν σε διάλυμα αιματοξυλίνης για να καθορισθούν τα υπόλοιπα ιστολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων (counterstaining). Τέλος, έγινε σταδιακή αφυδάτωση των τομών σε ανιούσα σειρά αλκοολών και σταθεροποίησή τους στην αντικειμενοφόρο πλάκα. 110

111 γ) Αντισώματα Τα προς μελέτη αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στα πλαίσια της ανοσοϊστοχημικής έρευνας ήταν τα εξής: Μονοκλωνικό αντίσωμα (Monoclonal anti-rabbit Antibody) έναντι της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) σε αραίωση 1:50 (Spring Bioscience) Πολυκλωνικό αντίσωμα (Polyclonal anti-rabbit Antibody) έναντι της επαγώγιμης συνθάσης του οξειδίου του αζώτου (i-nos) σε αραίωση 1:100 (Chemicon International). Πολυκλωνικό αντίσωμα (Polyclonal anti-goat antibody) έναντι της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (MMP-9) σε αραίωση 1:50 (Santa Cruz Biotechnology). Πολυκλωνικό αντίσωμα (Rabbit Monoclonal Antibody) έναντι του υποδοχέα της ερυθροποιητίνης (EPO-R) σε αραίωση 1:50 (Santa Cruz Biotechnology). Πολυκλωνικό αντίσωμα (Polyclonal anti-goat antibody) έναντι του κυτοχρώματος C (cyt C) σε αραίωση 1:100 (Santa Cruz Biotechnology). Η εκτίμηση των αποτελεσμάτων (έκφραση ενζύμου) έγινε με συνδυασμό της έντασης της χρώσης που εμφάνιζαν τα θετικά κύτταρα στα υπό μελέτη παρασκευάσματα και της έκτασης την οποία κάλυπταν αυτά στο εξεταζόμενο παρασκεύασμα. Η ένταση της χρώσης στα ιστολογικά δείγματα βαθμολογήθηκε σε κλίμακα από το 0 έως το 3, όπου 0 χαρακτηριζόταν η μηδενική έκφραση του αντισώματος, 1 η ήπια, 2 η μέτρια και 3 η έντονη παρουσία του στο εξεταζόμενο δείγμα. Αντίστοιχα, η έκταση που κάλυπτε η ανοσοϊστοχημική χρώση στα ιστολογικά παρασκευάσματα ταξινομήθηκε επίσης σε τέσσερις αντίστοιχες κατηγορίες, με κριτήριο το ποσοστό του βλεννογόνου του κάθε δείγματος στο οποίο παρατηρούνταν η υπό εξέταση πρωτεΐνη. Το τελικό αποτέλεσμα για κάθε παρασκεύασμα προέκυψε από το γινόμενο της έκτασης των θετικών (για το κάθε αντίσωμα) κυττάρων επί την ένταση της σχετικής με το αντίσωμα χρώσης (μέθοδος Soslow) (388), και με βάση αυτό το γινόμενο έγινε η τελική ταξινόμηση της έκφρασης των αντισωμάτων σε μία εκατοστιαία κλίμακα τεσσάρων κατηγοριών. 111

112 0 έκφραση σε ποσοστό 0-25% 1 έκφραση σε ποσοστό 25-50% 2 έκφραση σε ποσοστό 50-75% 3 έκφραση σε ποσοστό % 1.5 Μεθοδολογία στατιστικής ανάλυσης Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν οι μέσες τιμές και τα τυπικά σφάλματα των δεδομένων. Για τη συσχέτιση μεταξύ διατεταγμένων κατηγορικών μεταβλητών που αφορούσε στα αποτελέσματα της ιστολογικής και της ανοσοϊστοχημικής μελέτης, χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson. Για την αξιολόγηση των μετρήσεων του βάρους σώματος, του αιματοκρίτη και των επιπέδων της ΕΡΟ στον ορό του αίματος χρησιμοποιήθηκε η διαδικασία ανάλυσης διακύμανσης επαναλαμβανόμενων μετρήσεων ανά ομάδα σε βάθος χρόνου (ANOVA) και η δοκιμασία t-test ανά ζεύγη. Τιμές του p<0.05 αντιστοιχούν σε στατιστικά σημαντικές διαφορές. Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS 16.0 και το λογιστικό πακέτο MS Excel. 112

113 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Αποτελέσματα Στα πειραματόζωα όλων των ομάδων μετρήθηκαν : το βάρος σώματος, o αιματοκρίτης και τα επίπεδα της EPO στον ορό του αίματος, τόσο την πρώτη όσο και τη 14 η ημέρα του πειράματος, και διενεργήθηκαν : ιστοχημική χρώση αιματοξυλίνης - εωσίνης και ανοσοϊστοχημικές χρώσεις για την κυκλοοξυγενάση (COX-2), την επαγώγιμη συνθάση του οξειδίου του αζώτου (i-nos), τη μεταλλοπρωτεϊνάση-9 (MMP-9), τον υποδοχέα της ερυθροποιητίνης (EPO-R) και το κυτόχρωμα-c (cyt-c). 2.1 Βάρος Σώματος (ΒΣ) Στον πίνακα 3 παρατίθενται οι μέσες τιμές και η τυπική απόκλιση του ΒΣ των πειραματοζώων όλων των ομάδων σε γραμμάρια (gr) την πρώτη και την τελευταία ημέρα του πειράματος. Πίνακας 3 : Μέση τιμή (ΜΤ) και τυπική απόκλιση (ΤΑ) του βάρους (gr) των πειραματοζώων όλων των ομάδων στην αρχή και το τέλος του πειράματος. Ομάδα Ημέρα 1 η Ημέρα 14 η ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Ομάδα 1: Επίμυες που δεν έλαβαν καμία ουσία, 2: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και i.p, 3: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t, 4: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t και ερυθροποιητίνη i.p, 5: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και ερυθροποιητίνη i.p. Η στατιστική ανάλυση με one way Anova έδειξε ότι το ΒΣ των πειραματοζώων δεν εμφάνισε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 5 ομάδων ούτε την πρώτη ούτε την τελευταία ημέρα του πειράματος (p>0.05). Αντίθετα, η στατιστική ανάλυση με το paired t test έδειξε ότι σε κάθε ομάδα, 113

114 για όλες τις ομάδες πειραματοζώων, παρατηρήθηκε πολύ σημαντική μεταβολή του σωματικού βάρους μεταξύ της πρώτης και της τελευταίας ημέρας του πειράματος (p<0.001) (πίνακας 5). Σε όλες τις ομάδες, πλην της ομάδας 3, το ΒΣ αυξήθηκε, με την ομάδα 1 να παρουσιάζει τη μεγαλύτερη τιμή (325.2± ). Στην ομάδα 3 όμως, στην οποία χορηγήθηκε μόνο BLM, το σωματικό βάρος ελαττώθηκε χαρακτηριστικά, και εμφάνισε τη μικρότερη τιμή ( ± ) (σχήμα 1). Βάρος Σώματος Βάρος σώματος (gr) Ομάδες πειραματοζώων Βάρος 1 Βάρος 14 Σχήμα 1: Το ΒΣ των πειραματοζώων όλων των ομάδων την 1 η και τη 14 η ημέρα του πειράματος. Στον πίνακα 4 παρατίθεται η στατιστική επεξεργασία του περιεχομένου του πίνακα 3 για την πρώτη και την τελευταία ημέρα του πειράματος αντίστοιχα. 114

115 Πίνακας 4: Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων του πίνακα 3 (α) Ημέρα 1η Συγκρινόμενες Σημαντικότητα ομάδες 1-2 ΜΣΣ 1-3 ΜΣΣ 1-4 ΜΣΣ 1-5 ΜΣΣ 2-3 ΜΣΣ 2-4 ΜΣΣ 2-5 ΜΣΣ 3-4 ΜΣΣ 3-5 ΜΣΣ 4-5 ΜΣΣ (β) Ημέρα 14η Συγκρινόμενες Σημαντικότητα ομάδες 1-2 ΜΣΣ 1-3 p< ΜΣΣ 1-5 ΜΣΣ 2-3 p< ΜΣΣ 2-5 ΜΣΣ 3-4 p< p< ΜΣΣ Ομάδα 1: Επίμυες που δεν έλαβαν καμία ουσία, 2: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και i.p, 3: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t, 4: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t και ερυθροποιητίνη i.p, 5: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και ερυθροποιητίνη i.p. ΜΣΣ: Μη Στατιστικώς Σημαντική διαφορά (p>0.05). Πίνακας 5: Στατιστική ανάλυση ανά ομάδα μελέτης στην αρχή και το τέλος του πειράματος. Συγκρινόμενες Ομάδες Σημαντικότητα Ομάδα 1 (1 η και 14 η ημέρα) p<0.001 Ομάδα 2 (1 η και 14 η ημέρα) p<0.001 Ομάδα 3 (1 η και 14 η ημέρα) p<0.001 Ομάδα 4 (1 η και 14 η ημέρα) p<0.001 Ομάδα 5 (1 η και 14 η ημέρα) p<0.001 Ομάδα 1: Επίμυες που δεν έλαβαν καμία ουσία, 2: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και i.p, 3: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t, 4: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t και ερυθροποιητίνη i.p, 5: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και ερυθροποιητίνη i.p. 115

116 2.2 Αιματοκρίτης (Ht) Στον πίνακα 6 παρατίθενται αναλυτικά οι μέσες τιμές και η τυπική απόκλιση του αιματοκρίτη για όλες τις ομάδες πειραματοζώων την πρώτη και την τελευταία ημέρα του πειράματος. Πίνακας 6 : Μέση τιμή (ΜΤ) και τυπική απόκλιση (ΤΑ) του αιματοκρίτη των πειραματοζώων όλων των ομάδων στην αρχή και το τέλος του πειράματος Ομάδα Ημέρα 1 η Ημέρα 14 η ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Ομάδα 1: Επίμυες που δεν έλαβαν καμία ουσία, 2: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και i.p, 3: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t, 4: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t και ερυθροποιητίνη i.p, 5: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και ερυθροποιητίνη i.p. Η στατιστική μέθοδος one way ANOVA έδειξε, για τον αιματοκρίτη, ότι τόσο την πρώτη ημέρα του πειράματος όσο και την τελευταία δεν υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ όλων των ομάδων (p>0.05). Με το paired t test βρέθηκε ότι επίσης δεν υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των αρχικών και τελικών τιμών του Ht σε καμία από τις ομάδες των πειραματοζώων (p>0.05) (πίνακας 8). Η μεγαλύτερη τιμή, μετά το πείραμα, εμφανίστηκε στην ομάδα 4 ( ± ), ενώ η μικρότερη στην ομάδα 1 (47.8 ± ) (σχήμα 2). 116

117 Αιματοκρίτης Αιματοκρίτης Ht Ht 1 Ht 14 Ομάδες πειραματοζώων Σχήμα 2: Η μεταβολή του Ht των πειραματοζώων όλων των ομάδων μεταξύ 1 ης και 14 ης ημέρας του πειράματος Στον πίνακα 7 παρατίθεται η στατιστική επεξεργασία του περιεχομένου του πίνακα 6 για την πρώτη και την τελευταία ημέρα του πειράματος αντίστοιχα. Πίνακας 7: Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων του πίνακα 6 (α) Ημέρα 1η (β) Ημέρα 14η Συγκρινόμενες Σημαντικότητα Συγκρινόμενες Σημαντικότητα ομάδες ομάδες 1-2 ΜΣΣ 1-2 ΜΣΣ 1-3 ΜΣΣ 1-3 ΜΣΣ 1-4 ΜΣΣ 1-4 ΜΣΣ 1-5 ΜΣΣ 1-5 ΜΣΣ 2-3 ΜΣΣ 2-3 ΜΣΣ 2-4 ΜΣΣ 2-4 ΜΣΣ 2-5 ΜΣΣ 2-5 ΜΣΣ 3-4 ΜΣΣ 3-4 ΜΣΣ 3-5 ΜΣΣ 3-5 ΜΣΣ 4-5 ΜΣΣ 4-5 ΜΣΣ 117

118 Πίνακας 8: Στατιστική ανάλυση ανά ομάδα μελέτης στην αρχή και το τέλος του πειράματος. Συγκρινόμενες Ομάδες Σημαντικότητα Ομάδα 1 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 2 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 3 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 4 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 5 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 1: Επίμυες που δεν έλαβαν καμία ουσία, 2: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και i.p, 3: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t, 4: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t και ερυθροποιητίνη i.p, 5: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και ερυθροποιητίνη i.p. ΜΣΣ: Μη Στατιστικώς Σημαντική διαφορά (p>0.05) 2.3 Επίπεδα EPO στον ορό αίματος Στον πίνακα 9 παρατίθενται αναλυτικά οι μέσες τιμές και η τυπική απόκλιση της ερυθροποιητίνης στον ορό του αίματος για όλες τις ομάδες πειραματοζώων, σε pgr/ml, την πρώτη και την τελευταία ημέρα του πειράματος. Πίνακας 9 : Μέση τιμή (ΜΤ) και τυπική απόκλιση (ΤΑ) της EPO των πειραματοζώων όλων των ομάδων στην αρχή και το τέλος του πειράματος Ομάδα Ημέρα 1 η Ημέρα 14 η ± ± ± ± ± ± 0, ± ± ± ± Ομάδα 1: Επίμυες που δεν έλαβαν καμία ουσία, 2: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και i.p, 3: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t, 4: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t και ερυθροποιητίνη i.p, 5: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και ερυθροποιητίνη i.p. 118

119 Για τα επίπεδα της EPO, όπως προκύπτει από τη στατιστική ανάλυση με τη μέθοδο one way ANOVA, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων, τόσο την πρώτη, όσο και την τελευταία ημέρα του πειράματος (p>0.05). Με το paired t test επίσης δεν παρατηρείται σε καμία ομάδα στατιστικώς σημαντική διαφορά ανάμεσα στις αρχικές και τελικές τιμές της EPO (p>0.05) (πίνακας 11). Η μεγαλύτερη τιμή ερυθροποιητίνης στον ορό του αίματος, μετά το πείραμα, εμφανίστηκε στην ομάδα 4 ( ± ), ενώ η μικρότερη στην ομάδα 3 ( ± 0,992478) (σχήμα 3). Επίπεδα της EPO στον ορό του αίματος 8 EPO (pg/ml) Ομάδες πειραματοζώων EPO 1 EPO 14 Σχήμα 3: Η EPO στον ορό του αίματος των πειραματοζώων όλων των ομάδων την 1 η και τη 14 η ημέρα του πειράματος. Στον πίνακα 10 παρατίθεται η στατιστική επεξεργασία του περιεχομένου του πίνακα 9 για την πρώτη και την τελευταία ημέρα του πειράματος αντίστοιχα. 119

120 Πίνακας 10: Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων του πίνακα 9 (α) Ημέρα 1η (β) Ημέρα 14η Συγκρινόμενες Σημαντικότητα Συγκρινόμενες Σημαντικότητα ομάδες ομάδες 1-2 ΜΣΣ 1-2 ΜΣΣ 1-3 ΜΣΣ 1-3 ΜΣΣ 1-4 ΜΣΣ 1-4 ΜΣΣ 1-5 ΜΣΣ 1-5 ΜΣΣ 2-3 ΜΣΣ 2-3 ΜΣΣ 2-4 ΜΣΣ 2-4 ΜΣΣ 2-5 ΜΣΣ 2-5 ΜΣΣ 3-4 ΜΣΣ 3-4 ΜΣΣ 3-5 ΜΣΣ 3-5 ΜΣΣ 4-5 ΜΣΣ 4-5 ΜΣΣ Ομάδα 1: Επίμυες που δεν έλαβαν καμία ουσία, 2: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και i.p, 3: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t, 4: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t και ερυθροποιητίνη i.p, 5: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και ερυθροποιητίνη i.p. ΜΣΣ: Μη Στατιστικώς Σημαντική διαφορά (p>0.05). Πίνακας 11: Στατιστική ανάλυση ανά ομάδα μελέτης στη αρχή και το τέλος του πειράματος. Συγκρινόμενες Ομάδες Σημαντικότητα Ομάδα 1 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 2 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 3 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 4 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 5 (1 η και 14 η ημέρα) ΜΣΣ Ομάδα 1: Επίμυες που δεν έλαβαν καμία ουσία, 2: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και i.p, 3: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t, 4: Επίμυες που έλαβαν μπλεομυκίνη i.t και ερυθροποιητίνη i.p, 5: Επίμυες που έλαβαν φυσιολογικό ορό i.t και ερυθροποιητίνη i.p. ΜΣΣ: Μη Στατιστικώς Σημαντική διαφορά (p>0.05) 120

121 2.4 Ιστολογική ανάλυση Η εκτίμηση των πνευμονικών βλαβών έγινε με την ιστοχημική χρώση της αιματοξυλίνης-εωσίνης και με μορφομετρική ανάλυση (Image Pro Plus Software Version 4.1). Η σταδιοποίηση της βαρύτητας της βλάβης, ανάλογα με την εντόπιση και την έκτασή της, έγινε με τη χρήση ημιποσοτικής κλίμακας 3 διαβαθμίσεων από 0 έως 2. Στην ομάδα 1 (μάρτυρες) δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες αλλοιώσεις του πνευμονικού παρεγχύματος και του κυψελιδικού χώρου (εικόνες 6 και 7). Εικόνα 6: Φυσιολογικό πνευμονικό παρέγχυμα. Απουσία φλεγμονής και ίνωσης... Εικόνα 7: Φυσιολογική αρχιτεκτονική των κυψελίδων και του διάμεσου χώρου στα πειραματόζωα της ομάδας 1. Στις ομάδες 2 και 5 (μάρτυρες), εκτός από μία πολύ ήπια πνευμονίτιδα, που θεωρείται αναμενόμενη μετά την ενδοτραχειακή λήψη φυσιολογικού ορού, καμία άλλη βλάβη δεν παρατηρήθηκε και τα ιστολογικά παρασκευάσματα ήταν παρόμοια με αυτά της ομάδας 1. Η πνευμονίτιδα χαρακτηρίζεται από την παρουσία μικρών κοκκιωμάτων και στοιχείων ήπιας φλεγμονής (μακροφάγων κυρίως) στο διάμεσο πνευμονικό χώρο και τις κυψελίδες, που δεν είναι όμως ικανά να επηρεάσουν τη δομή του πνεύμονα. Στις δύο αυτές ομάδες η αρχιτεκτονική δομή παρέμεινε σταθερή, εμφανίστηκαν ελάχιστα λευκοκύτταρα στο διάμεσο χώρο, αλλά κυρίως δεν εμφανίστηκαν καθόλου στοιχεία ίνωσης, όπως είναι οι ινοβλάστες και το κολλαγόνο (εικόνες 8-11). 121

122 Εικόνα 8: Ελάχιστα μακροφάγα και λεμφοκύτταρα στο διάμεσο πνευμονικό χώρο της ομάδας 2 (βέλος). Εικόνα 9: Ελάχιστα μικρά κοκκιώματα στο διάμεσο χώρο της ομάδας 2 (βέλη).. Εικόνα 10: Ηπιότερη πνευμονίτιδα στην ομάδα 5 που έλαβε EPO. Εικόνα 11: Πολύ λιγότερα κοκκιώματα και μακροφάγα στην ομάδα 5. Στην ομάδα 3 (ομάδα μπλεομυκίνης), οι φλεγμονώδεις και ινωτικές αλλοιώσεις ήταν πολύ έντονες. Ο διάμεσος συνδετικός ιστός είχε έντονη διήθηση από λεμφοκύτταρα και ινοβλάστες. Εκτεταμένες περιοχές του τοιχώματος των κυψελίδων εμφάνισαν μεγάλα αθροίσματα φλεγμονώδους ιστού. Σε μερικές περιπτώσεις η διήθηση είχε τη μορφή ελύτρου γύρω από μεγαλύτερους βρόγχους ή τους κυψελωτούς πόρους. Η εκτεταμένη διήθηση του συνδετικού ιστού του παρεγχύματος του πνεύμονα ελάττωσε σε μεγάλο βαθμό την έκταση αερισμού. Η ίνωση φαίνεται ότι ξεκίνησε από τους βρόγχους, συνέχισε στα βρογχιόλια και κατέληξε στις κυψελίδες τις οποίες κυριολεκτικά παραμόρφωσε παχύνοντας τα τοιχώματά τους και γεμίζοντάς τες με πλήθος φλεγμονωδών κυττάρων και ινωτικών παραγώγων. Η διήθηση του πνεύμονα ήταν διάχυτη και αφορούσε όλη την έκταση του οπτικού πεδίου. Σε 122

123 μερικές περιπτώσεις η διήθηση εκτείνονταν και μέσα στον αυλό του βρόγχου αποφράσσοντάς τον τελείως (εικόνες 12-17). Εικόνα 12: Πλήρης κατάληψη του διάμεσου χώρου από ινοβλάστες και ίνες κολλαγόνου στα πειραματόζωα της ομάδας 3. Εικόνα 13: Ολοκληρωτική καταστροφή της αρχιτεκτονικής δομής του πνεύμονα, αθρόα συσσώρευση μακροφάγων και διάχυτη αιμορραγία. Εικόνα 14: Διάχυτη διήθηση του διάμεσου χώρου και κατάληψη των κυψελίδων από εξωκυττάρια ουσία. Εικόνα 15: Διήθηση με μορφή ελύτρου γύρω από βρόγχους (βέλη). 123

124 Εικόνα 16: Αποφραγμένος βρόγχος (βέλος) και διάχυτη ίνωση. Εικόνα 17: Διάχυτη κατάληψη του διάμεσου χώρου και καταστροφή της αρχιτεκτονικής των κυψελίδων. Στην ομάδα 4, της ερυθροποιητίνης, οι βλάβες του πνευμονικού παρεγχύματος και του κυψελιδικού χώρου ήταν περιορισμένες σε σύγκριση με την ομάδα της μπλεομυκίνης. Διακρίθηκε σημαντική βελτίωση, η οποία εκφράστηκε με την αξιοσημείωτη μείωση της επιφάνειας της ινωτικής περιοχής και της έντασης των ινωτικών φαινομένων, όπως η συσσώρευση λεμφοκυττάρων, μακροφάγων και ινοβλαστών. Παρατηρήθηκαν περιοχές με αλλοιωμένα ινωτικά και φλεγμονώδη στοιχεία, τα οποία δεν έδιναν την εικόνα θερμής και έντονης φλεγμονής ή ίνωσης στην ομάδα 4, αλλά μια πολύ πιο βελτιωμένη κατάσταση (εικόνες 18-23). Εικόνα 18: Μειωμένη έκταση φλεγμονωδών και ινωτικών φαινομένων με μικρή παρουσία μακροφάγων (βέλος) Εικόνα 19: Παρουσία ινοβλαστών και κολλαγόνου στο διάμεσο χώρο (βέλος) αλλά εμφάνιση και μεγάλου αριθμού υγιών κυψελίδων. 124

125 Εικόνα 20: Σαφής υποχώρηση της ίνωσης και αποκατάσταση του αερισμού. Εικόνα 21: Η μεγαλύτερη έκταση του οπτικού πεδίου καταλαμβάνεται πλέον από υγιή πνευμονικό ιστό στα πειραματόζωα της ομάδας 4 που έλαβαν EPO. Εικόνα 22: Το οπτικό πεδίο παρουσιάζει κατά το ένα ήμισυ βελτιωμένη εικόνα. αερισμού και κατά το άλλο αυξημένη ίνωση και αιμορραγία. Εικόνα 23: Η ίνωση παραμένει περιφερικά μόνο του αγγείου (βέλος), ενώ το υπόλοιπο παρέγχυμα εμφανίζεται φυσιολογικό, σε πειραματόζωο της ομάδας 4. Αναλυτικά, για τις 5 ομάδες μελέτης βρέθηκαν τα εξής: Ομάδα 1 (μάρτυρες): Οι βλάβες που παρατηρήθηκαν σε όλα τα πειραματόζωα ανήκαν στην κατηγορία 0 της κλίμακας εκτίμησης (ποσοστό 100%). Ομάδα 2 (μάρτυρες): Ομοίως, στην ομάδα αυτή, οι βλάβες που παρατηρήθηκαν σε όλα τα πειραματόζωα ανήκαν στην κατηγορία 0 (ποσοστό 100%). 125

126 Ομάδα 3 : Από τα πειραματόζωα αυτής της ομάδας κανένα δεν παρουσίασε βλάβες που να κατατάσσονται στην κλίμακα 0 (ποσοστό 0%), ενώ 30% παρουσίασε βλάβες κατηγορίας 1 και 70% βλάβες που κατατάσσονται στην κατηγορία 2. Ομάδα 4 : Παρατηρήθηκαν βλάβες κατηγορίας 0 στο 70% των πειραματοζώων αυτής της ομάδας, βλάβες κατηγορίας 1 στο 30%, ενώ σε κανένα δεν παρατηρήθηκαν βλάβες κατηγορίας 2 (ποσοστό 0%). Ομάδα 5 (μάρτυρες): Όλα τα πειραματόζωα παρουσίασαν αλλοιώσεις κατηγορίας 0 (ποσοστό 100%). Τα αποτελέσματα της ημιποσοτικής μεθόδου εκτίμησης των πνευμονικών βλαβών με τη χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης παρατίθενται στον πίνακα 12. Πίνακας 12: Ποσοστό (%) των πειραματοζώων ανά ομάδα μελέτης που κατατάσσεται σε κλίμακα 0-2 ανάλογα με τη βαρύτητα-έκταση των πνευμονικών αλλοιώσεων. ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΟΜΑΔΑ 1 100% 0% 0% 2 100% 0% 0% 3 0% 30% 70% 4 70% 30% 0% 5 100% 0% 0% Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, έδειξε ότι υπάρχει στατιστικά πολύ σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων με βάση τη σταδιοποίηση της πνευμονικής βλάβης (p<0.001) (σχήμα 4 α,β) 126

127 Κατάταξη όλων των ομάδων ανάλογα με την έκταση (%) της βλάβης 12 Πλήθος πειραματοζώων Ομάδα 1 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Ομάδα 4 Ομάδα 5 0 <25% 25-50% >50% Έκταση (%) της ιστολογικής βλάβης (α) (β) Σχήμα 4 (α,β) : Γραφική απεικόνιση της κατάταξης των πειραματοζώων όλων των ομάδων με βάση την έκταση (%) της ιστολογικής βλάβης. Επίσης, όσον αφορά στην έκταση των ιστολογικών βλαβών, η στατιστική ανάλυση έδειξε μία πολύ σημαντική στατιστική διαφορά ανάμεσα στις ομάδες 3 και 4, δηλαδή ανάμεσα στην ομάδα που έλαβε μόνο μπλεομυκίνη και την ομάδα στην οποία χορηγήθηκε επιπλέον και 127

128 ερυθροποιητίνη (p<0.001). Είναι προφανές ότι οι ιστολογικές αλλοιώσεις έχουν μικρότερη έκταση στην τελευταία (σχήμα 5 α,β). Κατάταξη των ομάδων 3 και 4 ανάλογα με την έκταση (%) της βλάβης 8 7 Πλήθος πειραματοζώων <25% 25-50% >50% Έκταση (%) της ιστολογικής βλάβης Ομάδα 3 Ομάδα 4 (α) (β) Σχήμα 5 (α,β): Γραφική απεικόνιση της κατάταξης των πειραματοζώων των ομάδων 3 και 4 με βάση την έκταση (%) της ιστολογικής βλάβης. 128

129 2.5 Ανοσοϊστοχημική χρώση κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2) Στα πειραματόζωα όλων των ομάδων διενεργήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για τον έλεγχο έκφρασης του ενζύμου κυκλοοξυγενάση-2. Με τη χρώση αυτή αναζητείται η έκφραση της COX-2 στους ινοβλάστες του υποστρώματος, στα επιθηλιακά κύτταρα των βρόγχων και στους υποβλεννογόνιους αδένες. Στις ομάδες 1,2 και 5 (μάρτυρες) παρατηρήθηκε ήπια έκφραση της COX-2 στα επιθηλιακά κύτταρα και τις λείες μυϊκές ίνες των λοβιακών βρόγχων και πολύ μικρή έως απούσα στο ενδοθήλιο και τα κύτταρα του υποστρώματος (εικόνες 24-26). Εικόνα 24: Μικρή έκφραση της COX-2 στα επιθηλιακά κύτταρα βρόγχου σε πειραματόζωο της ομάδας 1 (βέλος). Εικόνα 25: Απουσία θετικής χρώσης στο υπόστρωμα. Ήπια έκφραση του ενζύμου στα κύτταρα βρόγχου στην ομάδα 2 (βέλος). Εικόνα 26: Έντονη χρώση στις λείες μυϊκές ίνες βρόγχου της ομάδας 5 (βέλη). 129

130 Στην ομάδα 3 παρατηρήθηκε μία εντονότατα θετική χρώση στα κύτταρα του διάμεσου πνευμονικού ιστού (θετικοί ινοβλάστες). Παρατηρούνται περιοχές του υποστρώματος με εκτεταμένη ίνωση και θετική χρώση στο τοίχωμα των ενδολόβιων βρόγχων στη συντριπτική πλειοψηφία των πειραματοζώων (εικόνες 27-32). Εικόνα 27: Έντονη χρώση του ενζύμου στο διάμεσο χώρο (βέλη). Εικόνα 28: Θετικό υπόστρωμα σε πειραματόζωο της ομάδας 3. Εικόνα 29: Μεγάλη συρρίκνωση των βρόγχων και εντονότατα θετική χρώση των επιθηλιακών κυττάρων και των λείων μυϊκών ινών τους (βέλη). Εικόνα 30: Έντονη έκφραση της COX-2 στα επιθηλιακά κύτταρα των βρόγχων και τους ινοβλάστες του υποστρώματος (βέλη). 130

131 Εικόνα 31: Θετικότατη χρώση στα κύτταρα του διάμεσου χώρου και τα επιθηλιακά κύτταρα των βρόγχων στην ομάδα 3 (βέλη). Εικόνα 32: Πλήρης κατάληψη του διάμεσου χώρου από θετικά κύτταρα. Διάχυτη και εντονότατα θετική έκφραση του ενζύμου στην ομάδα 3. Στην ομάδα 4, παρατηρήθηκε διατήρηση της αρχιτεκτονικής δομής του διάμεσου χώρου και των κυψελίδων, ελαττωμένη έκφραση της COX-2 στο υπόστρωμα με λιγότερους θετικούς ινοβλάστες σε σχέση με την ομάδα 3, και πολύ περιορισμένο αριθμό θετικών βρόγχων, καταδεικνύοντας έτσι την ελάττωση του βαθμού έκφρασης της κυκλοοξυγενάσης στα πειραματόζωα που έλαβαν ερυθροποιητίνη (εικόνες 33-38). Εικόνα 33: Ηπιότερη έκφραση του ενζύμου στο υπόστρωμα. Παραμένουν θετικοί οι ινοβλάστες γύρω από τους βρόγχους (βέλος). Εικόνα 34: Λιγότερο θετική χρώση του υποστρώματος με έντονη όμως τη χρώση των λείων μυϊκών ινών των βρόγχων (βέλος). 131

132 Εικόνα 35: Υποχώρηση της διάχυτης βλάβης και των θετικών ινοβλαστών και διατήρηση υγιών κυψελίδων. Εικόνα 36: Θετική χρώση μόνο στα επιθηλιακά κύτταρα των βρόγχων (βέλος). Εικόνα 37: Θετικές λείες μυϊκές ίνες γύρω από βρόγχο σε πειραματόζωο της ομάδας 4 (βέλος). Εικόνα 38: Εντόπιση θετικής χρώσης μόνο στα επιθηλιακά κύτταρα των δύο εικονιζόμενων βρόγχων. Σαφής υποχώρηση της θετικής χρώσης από τους ινοβλάστες του υποστρώματος (βέλη). Αναλυτικά, για τις 5 ομάδες μελέτης βρέθηκαν τα εξής: Ομάδα 1 (μάρτυρες): Η COX-2 εκφράστηκε σε όλα τα πειραματόζωα στην κατηγορία 0 (ποσοστό 100%). Ομάδα 2 (μάρτυρες): Το 60% των πειραματοζώων κατατάχθηκε στην κατηγορία 0 και το υπόλοιπο 40% στην κατηγορία

133 Ομάδα 3: Στα πειραματόζωα αυτά η COX-2 εκφράστηκε στην κατηγορία 1 σε ποσοστό 20%, στην κατηγορία 2 σε ποσοστό 60%, στην κατηγορία 3 ποσοστό 20%, ενώ σε κανένα στην κατηγορία 0 (ποσοστό 0%). Ομάδα 4 : Παρατηρήθηκε έκφραση της COX-2 στην κατηγορία 0 σε ποσοστό 70% και το υπόλοιπο 30% στην κατηγορία 1. Ομάδα 5 (μάρτυρες): Εκφράστηκε η COX-2 σε ποσοστό 80% στην κατηγορία 0 και σε ποσοστό 20% στην κατηγορία 1. Τα αποτελέσματα για την έκφραση της κυκλοοξυγενάσης-2 παρατίθενται αναλυτικά στον πίνακα 13. Πίνακας 13 : Ποσοστό (%) των πειραματοζώων ανά ομάδα μελέτης που κατατάσσεται σε κλίμακα 0-3 ανάλογα με το βαθμό έκφρασης της COX-2. ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΟΜΑΔΑ 1 100% 0% 0% 0% 2 60% 40% 0% 0% 3 0% 20% 60% 20% 4 70% 30% 0% 0% 5 80% 20% 0% 0% Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων κατέδειξε μία πολύ σημαντική στατιστική διαφορά στην ιστολογική διαβάθμιση όλων των ομάδων (p<0.001) (σχήμα 6 α,β). 133

134 Κατανομή όλων των ομάδων ανά κατηγορία έκφρασης (%) της COX-2 12 Πλήθος πειραματοζώων Ομάδα 1 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Ομάδα 4 Ομάδα % 25-50% 50-75% % Έκφραση (%) της COX-2 (α) (β) Σχήμα 6 (α,β): Γραφική απεικόνιση της κατανομής των πειραματοζώων ανά κατηγορία έκφρασης (%) της COX-2 για όλες τις ομάδες. 134

135 Επίσης μία σημαντική στατιστική διαφορά προέκυψε από τη σύγκριση μεταξύ των ομάδων 3 και 4, δηλαδή της ομάδας της μπλεομυκίνης και της ομάδας της ερυθροποιητίνης (p<0.05). Η έκφραση του ενζύμου είναι ασθενέστερη στην τελευταία (σχήμα 7 α,β). Κατανομή των ομάδων 3 και 4 ανά κατηγορία έκφρασης (%) της COX-2 8 Πλήθος πειραματοζώων Ομάδα 3 Ομάδα % 25-50% 50-75% % Έκφραση (%) της COX-2 (α) (β) Σχήμα 7 (α,β): Γραφική απεικόνιση της κατανομής των πειραματοζώων ανά κατηγορία έκφρασης (%) της COX-2 για τις ομάδες 3 και

136 2.6 Ανοσοσϊστοχημική χρώση επαγώγιμης συνθάσης του οξειδίου του αζώτου (i-nos) Στα πειραματόζωα όλων των ομάδων διενεργήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για τον έλεγχο έκφρασης του ενζύμου επαγώγιμη συνθάση του οξειδίου του αζώτου. Με τη χρώση αυτή αναζητείται η έκφραση της i-nos στους ινοβλάστες του αναπνευστικού επιθηλίου, στο ενδοθήλιο των αγγείων και στις λείες μυϊκές ίνες αυτών καθώς και στα κύτταρα των αδένων. Στις ομάδες 1,2 και 5 (μάρτυρες) η έκφραση της i-nos εντοπίστηκε σε ελάχιστο αριθμό κυττάρων στο υπόστρωμα και καθόλου στις λείες μυϊκές ίνες των αγγείων (εικόνες 39-41). Εικόνα 39: Ελάχιστα θετικά κύτταρα στο αναπνευστικό επιθήλιο των πειραματοζώων της ομάδας 1(βέλος). Εικόνα 40: Ελάχιστη χρώση στα περιβρογχικά κύτταρα του υποστρώματος στα πειραματόζωα της ομάδας 2 (βέλος) 136 Εικόνα 41: Φυσιολογική αρχιτεκτονική κυψελίδων και παρεγχύματος με ελάχιστα θετικά κύτταρα στο υπόστρωμα για τα πειραματόζωα της ομάδας 5.

137 Στην ομάδα 3, η χρώση ήταν εντονότατα θετική στις περιοχές εκτεταμένης ινωτικής βλάβης στην μεγάλη πλειοψηφία των πειραματοζώων. Εμφανίζονται θετικά κύτταρα στο διάμεσο συνδετικό ιστό και θετικές λείες μυϊκές ίνες στο τοίχωμα των βρόγχων και των αγγείων, ενδεικτικά στοιχεία της ενεργής ινωτικής και οξειδωτικής διεργασίας (εικόνες 42-47). Εικόνα 42: Θετικά κύτταρα για τη Εικόνα 43: Θετικές μυϊκές ίνες σε χρώση i-nos στο διάμεσο χώρο τοίχωμα αγγείου (βέλος). (βέλος). Εικόνα 44: Πλήρης Εικόνα 45: Διάχυτη κατάληψη αποδιοργάνωση του διάμεσου του υποστρώματος από θετικούς χώρου, πολλάπλες εστίες θετικών ινοβλάστες. ινοβλαστών που καλύπτουν όλο το οπτικό πεδίο. 137

138 Εικόνα 46: Έντονα θετικά Εικόνα 47: κύτταρα διάμεσου χώρου στο βρογχικό Κατάληψη από του έντονα θετικούς ινοβλάστες (βέλη). Στην ομάδα 4, υπήρχε μικρός αριθμός ινοβλαστών στο υπόστρωμα και η χρώση ήταν ελαφρώς μόνο θετική στις μυϊκές ίνες του μέσου χιτώνα των αγγείων. Παρατηρήθηκε περιορισμένη έκφραση της i-nos σε σύγκριση με τα πειραματόζωα της προηγούμενης ομάδας (εικόνες 48-53). Εικόνα 48: Επανεμφάνιση υγιών Εικόνα κυψελίδων και μικρές εστίες θετικών χρώση κυττάρων αγγείου (βέλος). (βέλος). 138 στο διάμεσο χώρο 49: Ελαφρώς θετική στις λείες μυϊκές ίνες

139 Εικόνα 50: Εστίες θετικών ινοβλαστών στο παρέγχυμα (βέλη) Εικόνα 51: Δειλή επανεμφάνιση υγιών κυψελίδων. που περιβάλλουν υγιείς κυψελίδες. Εικόνα 52: Πολλαπλές εστίες Εικόνα θετικών ινοβλαστών φυσιολογικών ανάμεσα σε κυψελίδες που διατηρούν την αρχιτεκτονική δομή τους 53: Παρουσία κυψελίδων σε ινωτικό πνευμονικό παρέγχυμα. σε πειραματόζωωο της ομάδας 4. Αναλυτικά, για όλες τις ομάδες πειραματοζώων βρέθηκαν τα εξής: Ομάδα 1 (μάρτυρες): Η i-nos εκφράστηκε σε όλα τα πειραματόζωα στην κατηγορία 0 (ποσοστό 100%). Ομάδα 2 (μάρτυρες): Η i-nos εκφράστηκε επίσης σε όλα τα πειραματόζωα στην κατηγορία 0 (ποσοστό 100%). Ομάδα 3 : Στα πειραματόζωα αυτά η i-nos εκφράστηκε στην κατηγορία 1 σε ποσοστό 20%, στην κατηγορία 2 σε ποσοστό 60% και στην κατηγορία 3 σε ποσοστό 20%. Σε κανένα δεν εκφράστηκε στην κατηγορία 0 (ποσοστό 0%). 139

140 Ομάδα 4 : Παρατηρήθηκε έκφραση της i-nos στο 80% των πειραματοζώων στην κατηγορία 0 και στο υπόλοιπο 20% στην κατηγορία 1. Ομάδα 5 (μάρτυρες) : Εκφράστηκε η i-nos σε όλα τα πειραματόζωα στην κατηγορία 0 (ποσοστό 100%). Τα αποτελέσματα για την έκφραση της επαγώγιμης συνθάσης του οξειδίου του αζώτου παρατίθενται αναλυτικά στον πίνακα 14. Πίνακας 14 : Ποσοστό (%) των πειραματοζώων ανά ομάδα μελέτης που κατατάσσεται σε κλίμακα 0-3 ανάλογα με το βαθμό έκφρασης της i-nos. ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΟΜΑΔΑ 1 100% 0% 0% 0% 2 100% 0% 0% 0% 3 0% 20% 60% 20% 4 80% 20% 0% 0% 5 100% 0% 0% 0% Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στην ιστολογική διαβάθμιση έκφρασης του αντισώματος μεταξύ όλων των ομάδων (p<0.05) (σχήμα 8 α,β). 140

141 Κατανομή όλων των ομάδων ανά κατηγορία έκφρασης (%) της i-nos 12 Πλήθος πειραματοζώων % 25-50% 50-75% % Έκφραση (%) της i-nos Ομάδα 1 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Ομάδα 4 Ομάδα 5 (α) (β) Σχήμα 8 (α,β): Γραφική απεικόνιση της κατανομής των πειραματοζώων ανά κατηγορία έκφρασης (%) της i-nos για όλες τις ομάδες Μία επίσης σημαντική στατιστική διαφορά προέκυψε από τη σύγκριση μεταξύ των ομάδων 3 και 4, δηλαδή της ομάδας της μπλεομυκίνης και της ομάδας της ερυθροποιητίνης (p<0.05). Το ένζυμο εκφράζεται λιγότερο στην τελευταία (σχήμα 9 α,β). 141

142 Κατανομή των ομάδων 3 και 4 ανά κατηγορία έκφρασης (%) της i-nos Πλήθος πειραματοζώων % 25-50% 50-75% % Έκφραση (%) της i-nos Ομάδα 3 Ομάδα 4 (α) (β) Σχήμα 9 (α,β): Γραφική απεικόνιση της κατανομής των πειραματοζώων ανά κατηγορία έκφρασης (%) της i-nos για τις ομάδες 3 και

143 2.7 Ανοσοσϊστοχημική χρώση μεταλλοπρωτεϊνάσης- 9 (MMP-9) Στα πειραματόζωα όλων των ομάδων διενεργήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για τον έλεγχο έκφρασης του ενζύμου μεταλλοπρωτεϊνάση - 9. Πρόκειται για μια κυτταροπλασματική χρώση με την οποία αναζητείται η έκφραση της MMP-9 στο κυψελιδικό κυρίως επιθήλιο. Στις ομάδες 1,2 και 5 (μάρτυρες), παρατηρήθηκε μία πολύ μικρή έκφραση της MMP-9 σε μικρό αριθμό αναπνευστικών επιθηλιακών κυττάρων. Η ίνωση ήταν ελάχιστη ή ανύπαρκτη και η αρχιτεκτονική δομή των κυττάρων φυσιολογική (εικόνες 54-56). Εικόνα 54: Ελάχιστη θετική χρώση στο Εικόνα 55: διάμεσο χώρο και όχι στις κυψελίδες σε πειραματόζωο της ομάδας 2 με ελάχιστα πειραματόζωο της ομάδας 1 (βέλος). θετική χρώση στο διάμεσο χώρο και όχι στο Ήπια πνευμονίτιδα σε κυψελιδικό επιθήλιο (βέλη). Εικόνα 56: Έλάχιστη χρώση στα κύτταρα μόνο του υποστρώματος. Θετικός ινοβλάστης στην ομάδα 5 (βέλος). 143

144 Στην ομάδα 3, η χρώση ήταν πολύ έντονη στο κυψελιδικό επιθήλιο σε όλα σχεδόν τα πειραματόζωα. Παρατηρήθηκαν εκτεταμένες εστίες ίνωσης και θετικών κυττάρων, τόσο στο κυψελιδικό επιθήλιο, όσο και στο διάμεσο χώρο, πράγμα που υποδηλώνει την αυξημένη έκφραση της MMP-9 στην ομάδα αυτή (εικόνες 57-62). Εικόνα 57: Κατάληψη κυψελίδας. Μεγάλοι Εικόνα 58: Αποδιοργάνωση του θετικοί ινοβλάστες της εξωκυττάριας ουσίας κυψελιδικού χώρου από τη διήθηση του (βέλη). επιθηλίου του από πολύ θετικά στη χρώση κύτταρα (βέλη). Εικόνα 59: Διάχυτες εστίες θετικών Εικόνα 60: Διήθηση του διάμεσου χώρου ινοβλάστων στο διάμεσο χώρο και στο από μεγάλα σφαιρικά κύτταρα θετικά στη κυψελιδικό επιθήλιο σε πειραματόζωο της χρώση (βέλη). ομάδας

145 Εικόνα 61: Πολλαπλά θετικά κύτταρα στον Εικόνα 62: Εστίες θετικών ινοβλαστών στο κυψελιδικό και διάμεσο χώρο. υπόστρωμα που διηθούν τις κυψελίδες (βέλη). Στην ομάδα 4, παρουσιάστηκε μικρή έκφραση της MMP-9. Οι ινωτικές περιοχές ήταν περιορισμένες σε έκταση και το αναπνευστικό επιθήλιο, σχεδόν στο σύνολό του, βελτιωμένο. Επανεμφανίστηκαν υγιείς κυψελίδες με φυσιολογική αρχιτεκτονική δομή με μικρή έως ελάχιστη παρουσία θετικών κυττάρων στο επιθήλιό τους (εικόνες 63-68). Εικόνα 63: Κατάληψη του χώρου ανάμεσα σε υγιείς κυψελίδες από θετικούς Εικόνα 64: Ήπια θετική χρώση σε κύτταρα του κυψελιδικού επιθηλίου (βέλη). ινοβλάστες (βέλος). 145

146 Εικόνα 65: Παρουσία ελαφρώς θετικής Εικόνα 66: Εστίες θετικής χρώσης στο χρώσης κυρίως στο διάμεσο χώρο και κυψελιδικό επιθήλιο. λιγότερο στο επιθήλιο των κυψελίδων σε πειραματόζωο της ομάδας 4 (βέλος). Εικόνα 67: Χαρακτηριστική διήθηση του Εικόνα 68: Διατήρηση υγιών κυψελίδων. επιθηλίου κυψελίδας (βέλος) από θετικά Παραμονή εστιών θετικής χρώσης στο κύτταρα στην ομάδα 4. ). επιθήλιό τους (βέλος Αναλυτικά, για όλες τις ομάδες πειραματοζώων βρέθηκαν τα εξής: Ομάδα 1 (μάρτυρες): Η MMP-9 εκφράστηκε σε όλα τα πειραματόζωα στην κατηγορία 0 (ποσοστό 100%). Ομάδα 2 (μάρτυρες): Η MMP-9 εκφράστηκε επίσης σε όλα τα πειραματόζωα σε ποσοστό 100% στην κατηγορία 0. Ομάδα 3 : Στα πειραματόζωα αυτά η MMP-9 εκφράστηκε σε ποσοστό 70% στην κατηγορία 2 και 30% στην κατηγορία 3. Σε κανένα πειραματόζωο δεν εκφράστηκε στις χαμηλές κατηγορίες της κλίμακας αξιολόγησης 0 και 1 (ποσοστό 0%). 146

147 Ομάδα 4 : Παρατηρήθηκε έκφραση της MMP-9 σε ποσοστό 50% στην κατηγορία 0 και 50% στην κατηγορία 1. Στις υψηλές κατηγορίες της κλίμακας αξιολόγησης 2 και 3 δεν εκφράστηκε το ένζυμο σε κανένα πειραματόζωο (ποσοστό 0%). Ομάδα 5 (μάρτυρες) : Εκφράστηκε η MMP-9 σε ποσοστό 20% στην κατηγορία 0 και σε ποσοστό 80% στην κατηγορία 1. Τα αποτελέσματα για την έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 παρατίθενται αναλυτικά στον πίνακα 15. Πίνακας 15 : Ποσοστό (%) των πειραματοζώων ανά ομάδα μελέτης που κατατάσσεται σε κλίμακα 0-3 ανάλογα με το βαθμό έκφρασης της MMP-9. ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΟΜΑΔΑ 1 100% 0% 0% 0% 2 100% 0% 0% 0% 3 0% 0% 70% 30% 4 50% 50% 0% 0% 5 20% 80% 0% 0% Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι υπάρχει στατιστικά πολύ σημαντική διαφορά στην ιστολογική διαβάθμιση μεταξύ των ομάδων μελέτης (p<0.001) (σχήμα 10 α,β). 147

148 Κατανομή όλων των ομάδων ανά κατηγορία έκφρασης (%) της MMP-9 12 Πλήθος πειραματοζώων Ομάδα 1 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Ομάδα 4 Ομάδα % 25-50% 50-75% % Έκφραση (%) της MMP-9 (α) (β) Σχήμα 10 (α,β): Γραφική απεικόνιση της κατανομής των πειραματοζώων ανά κατηγορία έκφρασης (%) τηςmmp-9 για όλες τις ομάδες. 148

149 Μεταξύ των ομάδων 3 και 4 εμφανίστηκε επίσης μία πολύ σημαντική στατιστική διαφορά (p<0.001), με πιο αδύναμη έκφραση του αντισώματος στην ομάδα της ερυθροποιητίνης (σχήμα 11 α,β). Κατανομή των ομάδων 3 και 4 ανά κατηγορία έκφρασης (%) της MMP-9 8 Πλήθος πειραματοζώων Ομάδα 3 Ομάδα % 25-50% 50-75% % Έκφραση (%) της MMP-9 (α) (β) Σχήμα 11 (α,β): Γραφική απεικόνιση της κατανομής των πειραματοζώων ανά κατηγορία έκφρασης (%) της MMP-9 για τις ομάδες 3 και

150 2.8 Ανοσοσϊστοχημική χρώση υποδοχέα ερυθροποιητίνης (EPO-R) Στα πειραματόζωα όλων των ομάδων διενεργήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για τον έλεγχο έκφρασης του υποδοχέα της ερυθροποιητίνης. Είναι μία χρώση, με την οποία αναζητείται η έκφραση του EPO-R στη μεμβράνη των ινοβλαστών του διάμεσου χώρου και των καλυκοειδών κυττάρων των αδένων του βρογχικού επιθηλίου, καθώς επίσης και στη μεμβράνη των μακροφάγων και των λεμφοκυττάρων. Η χρώση είναι ιδιαίτερα χαρακτηριστική. Στις ομάδες 1,2 και 5 (μάρτυρες), παρατηρήθηκε ιδιαίτερα μικρή έκφραση του EPO-R. Η χρώση ήταν πολύ αδύναμη στα πειραματόζωα αυτών των ομάδων και δεν παρατηρήθηκε κάποια αξιοσημείωτη μεταβολή στα δομικά χαρακτηριστικά της μεμβράνης των κυττάρων, όπου εντοπίζεται ο EPO-R. (εικόνες 69-71). Εικόνα 69: Ελάχιστη χρώση σε περιβρογχικούς ινοβλάστες πειραματοζώου της ομάδας 1 (βέλη). Εικόνα 70: Ήπια θετική χρώση σε πειραματόζωο της ομάδας 2 λόγω πνευμονίτιδας. Παρουσία θετικών ινοβλαστών στο διάμεσο χώρο. 150

151 Εικόνα 71: Αναπνευστικό επιθήλιο πειραματοζώου της ομάδας 5. Πολύ ήπια έκφραση του ενζύμου στο βρογχικό επιθήλιο. Απουσία μακροφάγων και λεμφοκυττάρων. Στην ομάδα 3, υπήρξε μία εντονότατη έκφραση του υποδοχέα της ερυθροποιητίνης, με χρώση πολύ χαρακτηριστική της μεμβράνης των ινοβλαστών του υποστρώματος και του τοιχώματος των βρόγχων. Διάσπαρτα μακροφάγα και λεμφοκύταρα φέρουν έντονα χρωματισμένη τη μεβράνη τους δηλώνοντας αυξημένη έκφραση του EPO-R (εικόνες 72-77). Εικόνα 72: Κατεστραμένος διάμεσος Εικόνα 73: Πολλαπλοί θετικοί ινοβλάστες χώρος με πληθώρα θετικών ινοβλαστών κατακλύζουν το υπόστρωμα και το περιβρογχικά και ενδοβρογχικά αλλά και βρογχικό επιθήλιο αφήνοντας ελεύθερο τον θετικά καλυκοειδή κύτταρα των βρογχικών αυλό των βρόγχων. αδένων (βέλη). 151

152 Εικόνα 74: Διάχυτη θετική χρώση σε Εικόνα 75: Θετική έκφραση του ενζύμου πειραματόζωο της ομάδας 3. Πλήρης σε ινοβλάστες του υποστρώματος, του αποκλεισμός βρόγχου από θετικούς βρογχικού επιθηλίου ινοβλάστες (βέλος). κύτταρα των αδένων του τελευταίου (βέλη). Εικόνα 76: Έντονη χρώση ινοβλαστών Εικόνα 77: Έντονα θετική χρώση στο του διάμεσου χώρου και του βρογχικού αναπνευστικό επιθήλιο πειραματοζώου της επιθηλίου. Απόφραξη βρόγχου (βέλος). ομάδας 3. Έκφραση του ενζύμου στα και στα καλυκοειδή κύτταρα του βρογχικού επιθηλίου και τους αδένες του (βέλη). Στην ομάδα 4, υπήρξε επίσης έκφραση του EPO-R που κυμάνθηκε σε ελαφρώς χαμηλότερα επίπεδα από αυτά της προηγούμενης ομάδας. Παρατηρήθηκαν υπερμεγέθη, σφαιρικά κύτταρα στις περιοχές της χρώσης, καθώς και μακροφάγα και λεμφοκύτταρα (εικόνες 78-83). 152

153 Εικόνα 78: Διατήρηση υγιών κυψελίδων. Εικόνα 79: Ελάχιστη έκφραση του ενζύμου Λίγες εστίες θετικής χρώσης στο διάμεσο στο διάμεσο χώρο γύρω από φυσιολογική χώρο (βέλος). κυψελίδα (βέλος). Εικόνα 80: Χαρακτηριστική θετική χρώση Εικόνα 81: Θετικά στη χρώση μακροφάγων γύρω από υγιή κυψελίδα λεμφοκύτταρα στο διάμεσο χώρο (βέλη). (βέλη). Εικόνα 82: Ήπια θετική χρώση σε Εικόνα 83: επιθηλιακά κύτταρα βρόγχου. Απουσία ενδοβρογχική χρώσης στο διάμεσο χώρο. ινοβλαστών Περιβρογχική παρουσία (βέλη). Ελάχιστες και θετικών εστίες θετικής χρώσης στο διάμεσο χώρο. 153

154 Αναλυτικά, για όλες τις ομάδες των πειραματοζώων βρέθηκαν τα εξής: Ομάδα 1 (μάρτυρες): Ο EPO-R εκφράστηκε σε ποσοστό 80% στην κατηγορία 0 και 20% στην κατηγορία 1. Ομάδα 2 (μάρτυρες): Στην ομάδα αυτή εκφράστηκε επίσης σε ποσοστό 80% στην κατηγορία 0 και 20% στην κατηγορία 1 της κλίμακας αξιολόγησης. Ομάδα 3 : Στα πειραματόζωα αυτά ο EPO-R εκφράστηκε σε ποσοστό 20% στην κατηγορία 1, σε ποσοστό 70% στην κατηγορία 2 και σε ποσοστό 10% στην κατηγορία 3. Ομάδα 4 : Παρατηρήθηκε έκφραση του EPO-R σε ποσοστό 50% στην κατηγορία 0 και 50% στην κατηγορία 1. Στις κατηγορίες 2 και 3 δεν εκφράστηκε το ένζυμο σε κανένα πειραματόζωο (ποσοστό 0%). Ομάδα 5 : Εκφράστηκε κατά 80% στην κατηγορία 0 και κατά 20% στην κατηγορία 1. Τα αποτελέσματα για την έκφραση του υποδοχέα της ερυθροποιητίνης παρατίθενται αναλυτικά στον πίνακα 16. Πίνακας 16 : Ποσοστό (%) των πειραματοζώων ανά ομάδα μελέτης που κατατάσσεται σε κλίμακα 0-3 ανάλογα με το βαθμό έκφρασης του EPO-R. ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΟΜΑΔΑ 1 80% 20% 0% 0% 2 80% 20% 0% 0% 3 0% 20% 70% 10% 4 50% 50% 0% 0% 5 80% 20% 0% 0% Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι υπάρχει σημαντική στατιστική διαφορά στην ιστολογική διαβάθμιση μεταξύ όλων των ομάδων (p<0.05) (σχήμα 12 α,β). 154

155 Κατανομή όλων των ομάδων ανά κατηγορία έκφρασης (%) του EPO-R Πλήθος πειραματοζώων Ομάδα 1 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Ομάδα 4 Ομάδα % 25-50% 50-75% % Έκφραση (%) του EPO-R (α) (β) Σχήμα 12 (α,β): Γραφική απεικόνιση της κατανομής των πειραματοζώων ανά κατηγορία έκφρασης (%) του EPO-R για όλες τις ομάδες 155

156 Επίσης, από τη σύγκριση των ομάδων της μπλεομυκίνης και της ερυθροποιητίνης, δηλαδή των ομάδων 3 και 4, προέκυψε μια στατιστικώς σημαντική διαφορά (p<0.05), με ασθενέστερη έκφραση του EPO-R στην τελευταία πράγμα που υποδηλώνει ότι και στην περίπτωση αυτή η ερυθροποιητίνη είχε ανασταλτική δράση της ίνωσης (σχήμα 13 α,β). Κατανομή των ομάδων 3 και 4 ανά κατηγορία έκφρασης (%) του EPO-R 8 Πλήθος πειραματοζώων Ομάδα 3 Ομάδα % 25-50% 50-75% % Έκφραση (%) του EPO-R (α) (β) Σχήμα 13 (α,β): Γραφική απεικόνιση της κατανομής των πειραματοζώων ανά κατηγορία έκφρασης (%) του EPO-R για τις ομάδες 3 και

157 2.9 Ανοσοϊστοχημική χρώση κυτοχρώματος C (cyt-c) Στα πειραματόζωα όλων των ομάδων διενεργήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για τον έλεγχο έκφρασης του κυτοχρώματος-c. Πρόκειται για μία χρώση με την οποία διερευνάται η έκφραση του cyt-c στους ινοβλάστες του μεσοκυψελιδικού χώρου και του τοιχώματος των βρόγχων, καθώς και στο στον έξω μυϊκό χιτώνα των αγγείων. Στις ομάδες 1 και 5 (μάρτυρες), η έκφραση του cyt-c ήταν πολύ ήπια και περιορίστηκε σε χαμηλά επίπεδα. Η χρώση ήταν μικρής έκτασης και έντασης στα πειραματόζωα αυτών των ομάδων και παρατηρήθηκαν πολύ μικρές δομικές μεταβολές στους ινοβλάστες του μεσοκυψελιδικού κυρίως χώρου (εικόνες 84 και 85). Εικόνα 84: Θετικοί ινοβλάστες στο μεσοκυψελιδικό χώρο στα πειραματόζωα της ομάδας 1 (βέλη). Εικόνα 85: Περιορισμένη εμφάνιση θετικών ινοβλαστών στο μεσοκυψελιδικό χώρο των πειραματοζώων της ομάδας 5 (βέλος). Στην ομάδα 2 (μάρτυρες), υπήρξε μία πιο ισχυρή έκφραση του κυτοχρώματος-c, με σημεία φλεγμονής σε αρκετά μεγάλο πεδίο της χρώσης, σε σχέση με τις άλλες δύο ομάδες μαρτύρων (εικόνα 86). Αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί με το γεγονός ότι στα πειραματόζωα αυτά χορηγήθηκε ενδοτραχειακά φυσιολογικός ορός, ο οποίος όπως έχει ήδη αναφερθεί προκαλεί την εμφάνιση πνευμονίτιδας. Είναι πάντως γεγονός ότι η εικόνα των μαρτύρων της ομάδας 2 είναι πιο επιδεινωμένη σε σχέση με αυτή των μαρτύρων της ομάδας 5, οι οποίοι έλαβαν ενδοπεριτοναϊκά EPO. 157

158 Εικόνα 86: Εντονότερη παρουσία θετικών ινοβλαστών στην ομάδα 2 σε σχέση με τις ομάδες 1 και 5 (βέλος). Στην ομάδα 3, υπήρξε έκφραση του cyt-c σε πολύ υψηλά επίπεδα, με διάχυτες βλάβες, αλλά και εστιακές εντοπίσεις της χρώσης σε ινοβλάστες του μεσοκυψελιδικού χώρου καθώς και στον έξω χιτώνα των αγγείων (εικόνες 87-92). Εικόνα 87: Διάχυτη μεσοκυψελιδικού χώρου κατάληψη από του θετικούς ινοβλάστες. Εικόνα 88: Πολλαπλές εστιακές εντοπίσεις θετικών ινοβλαστών στο μεσοκυψελιδικό χώρο και γύρω από βρόγχο (βέλος). Εικόνα 89: ινοβλαστών Έντονη εντόπιση θετικών περιφερικά βρόγχων (βέλη). 158 κατεστραμένου Εικόνα 90: Έντονα θετικοί ινοβλάστες στο τοίχωμα αποφραγμένου βρόγχου (βέλη).

159 Εικόνα 91: Χαρακτηριστική έκφραση του Εικόνα 92: Πλήρως κατεστραμένος ενζύμου στον έξω μυϊκό χιτώνα αγγείου μεσοκυψελιδικός (βέλος). εντόπιση χώρος θετικής με χρώσης διάχυτη στα πειραματόζωα της ομάδας 3. Στην ομάδα 4, η χρώση και άρα η έκφραση του ενζύμου κυμάνθηκε σε πιο χαμηλά επίπεδα από αυτά της προηγούμενης ομάδας. Παρατηρείται σαφής βελτίωση της μικροσκοπικής εικόνας, με ελάττωση του αριθμού των θετικών ινοβλαστών τόσο στο μεσοκυψελιδικό και περιβρογχικό χώρο, όσο και στον έξω μυϊκό χιτώνα των αγγείων (εικόνες 93-98). Εικόνα 93: Θετική χρώση στον έξω μυϊκό Εικόνα 94: Θετική χρώση στον έξω μυϊκό χιτώνα αγγείου (βέλος). χιτώνα αγγείου και θετικοί ινοβλάστες γύρω από βρόγχο (βέλη). 159

160 Εικόνα 95: Περιορισμός της έκφρασης του Εικόνα ενζύμου σε ινοβλάστες γύρω από βρόγχους. ινβλαστών στο μεσοκυψελιδικό χώρο (βέλη). Ελάχιστη Καλή αρχιτεκτονική δομή κυψελίδων. παρουσία θετικής χρώσης στο 96: Μικρές νησίδες θετικών μεσοκυψελιδικό χώρο (βέλη). Εικόνα 97: Περιοχές θετικής χρώσης Εικόνα σε ινωτικό μεσοκυψελιδικό χώρο σε θετικής χρώσης σε ολόκληρο το οπτικό μικρή έκταση του οπτικού πεδίου (βέλη). πεδίο. Διατήρηση υγιών κυψελίδων Το στα πειραματόζωα της ομάδας 4. υπόλοιπο πεδίο καταγράφεται 98: Απουσία περιοχών φυσιολογικό. Αναλυτικά, για όλες τις ομάδες των πειραματοζώων βρέθηκαν τα εξής: Ομάδα 1 (μάρτυρες): Το cyt-c εκφράστηκε σε ποσοστό 80% στην κατηγορία 0 της κλίμακας αξιολόγησης και 20% στην κατηγορία 1. Ομάδα 2 (μάρτυρες): Στην ομάδα αυτή εκφράστηκε στην κατηγορία 1 σε ποσοστό 70% και σε ποσοστό 30% στην κατηγορία 2. Ομάδα 3 : Στα πειραματόζωα αυτά το cyt-c εκφράστηκε στην κατηγορία 1 σε ποσοστό 30% και σε ποσοστό 70% στην κατηγορία 2. Ομάδα 4 : Παρατηρήθηκε έκφραση του cyt-c σε ποσοστό 60% στην κατηγορία 0 και 40% στην κατηγορία 1. Στις κατηγορίες 2 και 3 δεν εκφράστηκε το ένζυμο σε κανένα πειραματόζωο (ποσοστό 0%). 160