4. Delavnica raziskovalcev IEI Piran,

Transcript

1 4. Delavnica raziskovalcev IEI Piran, Piran, Predstavitev : Matjaž Novak, univ. dipl. biolog Piran,

2 Predstavitev raziskovalnega projekta: Mladi raziskovalec iz gospodarstva, Inštitut za ekološki inženiring, preko Javnega razpisa za krepitev razvojnih oddelkov v podjetjih Ministrstva za visoko šolstvo, znanost in tehnologijo. Študij: Izobraževalna institucija: Mednarodna podiplomska šola Jožefa Stefana Vrsta študija: Bolonjski študij tretje stopnje Trajanje študija: 3 leta (6 semestrov) Končni pridobljeni naziv: Doktor znanosti Vrsta študijskega programa: Ekotehnologija Usmeritev: Ekotoksikologija Letnik študija: 1. letnik 2

3 Naslov: Uporabnost pokazateljev sprememb izražanja genov pri zarodkih in celicah rib cebric (Danio rerio) za predvidevanje dolgodobnih učinkov okoljskih onesnažil Mentor: prof. dr. Metka Filipič (NIB) Oddelek za genetsko toksikologijo in biologijo raka Somentor: dr. Bojana Žegura Doktorska teza bo zagovarjana na: Mednarodni podiplomski šoli Jožefa Stefana Piran, Citostatiki zaradi svojega genotoksičnega mehanizma delovanja spadajo med najbolj nevarne snovi. Njihovi ostanki se pojavljajo v odpadnih in površinskih vodah. Raziskava bo del projekta Cytothreat. Problem: Genotoksične snovi lahko povzročijo škodljive učinke pri zelo nizkih koncentracijah, posledice, ki so nepovratne, pa se pokažejo z zakasnitvijo. Zaradi tega s klasičnim toksikološkimi testi težko predvidimo posledice pri kronični izpostavljenosti nizkim koncentracijam. Hipoteza: Celice in organizmi se odzovejo na stres z aktivacijo obrambnih mehanizmov, ki se najprej odrazi na ravni izražanja (transkripcije) genov. Z analizo sprememb v izražanju genov celotnega genoma izpostavljenih rib cebric (Danio rerio) v primerjavi s patofiziološkimi in specifičnimi genotoksičnimi učinki je možno identificirati transkripcijske molekularne markerje zakasnelih učinkov in jih uporabiti za zgodnje zaznavanje teh učinkov na eksperimentalnih modelih z zarodki in celicami rib cebric. 3

4 Cilji: Identifikacija molekularnih markerjev izpostavljenosti in učinkov 5-FU in imatiniba na osnovi analize sprememb izražanja genov celotnega genoma rib cebric in jetrnih celic rib cebric (ZFL). Aplikacija identificiranih markerjev (Q-PCR) za detekcijo izpostavljenosti in učinkov drugih citostatikov, njihovih metabolitov, produktov transformacije, njihovih zmesi in realnih okoljskih vzorcev. Ocena napovednosti biomarkerjev za detekcijo zakasnelih učinkov (v primerjavi s testi genotoksičnosti: komet test, MN, γh2ax). Perspektiva: razviti komercialne hitre preseljevalne biološke teste (npr. konstrukcija transgenih celic z reporterskim genom vezanim na promotor molekularnega pokazatelja). Cebrice (Danio rerio) - majhne tropske ribe, sprva uporabne za študij razvojne biologije in embriogeneze - v zadnjem času pa zelo uporabne v ekotoksikologiji Prednosti: -visoka stopnja podobnosti v molekularnih mehanizmih razvoja, celični fiziologiji in celičnem odgovoru na določene kemikalije s sesalci -majhna velikost odraslih in embriev -drstenje sezonsko neodvisno -ponavljajoč se razvoj in zunanja oploditev -transparentni embrii, do 48h Slabosti/pomanjkljivosti: -odsotnost nekaterih sesalskih organov; pljuča, koža, prostata in mlečne žleze -niso avtohtona vrsta v Evropi -zunanji ovoj horion -previdnost pri interpretaciji, ekstrapoliranju rezultatov Več testov v katerih so cebrice uporabljene kot modelni organizem 4

5 Več testov v katerih so cebrice uporabljene kot modelni organizem: -akutni test -FET, embrio test -dvogeneracijski test zamenjava Zakaj? Prednosti FET: -majhnost - -hiter ponavljajoč se razvoj -zunanji razvoj -transparentnost Pomisleki glede horiona in njegove morebitne barierne funkcije Korelacija z akutnim testom In vitro model z ribjimi celicami (ZFL) -gre za poskuse, ki so narejeni izven organizma, na nekem izoliranem sistemu Prednosti: -navadno imajo višjo občutljivost kot in vivo poskusi -natančnejša izpostavitev -celični in molekularni mehanizmi so lažje raziskani -preprostejši sistem -majhni uporabljeni volumni testiranih kemikalij -cenejši in hitrejši Slabosti: -pogosto so celične linije imortilizirane, transformirane -lahko zgubijo določene lastnosti diferenciranih celic -spremembe v preživelosti, metabolni aktivnosti, interakciji med celicami -niso možne sistemske študije Izolirane iz jeter normalnih odraslih živali 5

6 MTT test -test za določanje citotoksičnosti kemikalije, potencial kemikalije, da povzroči celično smrt -gre za kvantitavtivni kalorimetrični test -temelji na redukciji rumenega MTT reagenta v modre formazanske kristale z živimi celicami -za določitev koncentracijskega območja za nadaljne raziskave, genotoksičnost -časovna in dozna odvisnost -najbolj toksičen je etopozid, sledijo mu imatinib, cisplatin in 5-FU Test komet -relativno enostavna in občutljiva elektroforetska tehnika za določanje DNA poškodb na nivoju posamezne celice -zaznavamo lahko eno-, dvo-verižne prelome DNA, alkalno labilna mesta, različne navzkrižne povezave -postopek in prednosti 6

7 Mikronukleus test -je metoda za določanje genomske nestabilnosti na nivoju kromosoma -citohalazin B dvojederne celice -različne posledice Analiza dvoverižnih prelomov s pretočno simetrijo -fosforilacija histona H2AX na mestu dvojnega preloma DNA verige -razmerje med številom DNA dvojnih prelomov in γh2ax -preprosta, natančna in zelo občutljiva metoda -proces optimizacije -iskanje primernega protitelesa γh2ax 7

8 Toksigonemomika -na molekularnem nivoju, zelo zgodnji pokazatelj -zelo občutljiva metoda, učinki pri nizkih, okoljsko relevantnih koncentracijah -omogoča identifikacijo kemikalij s podobnim mehanizmom delovanja -možnost analize celotnega sistema globalen pristop -draga metoda, zahteva veliko znanja, sodelovanja različnih strok, zahtevna interpretacija rezultatov -trenutno stanje -spremembe v izražanju genov morajo biti povezane s fiziološki spremembami -optimizacija postopka izolacije mrna, ZFL in embrii -narejeno je na ZFL sledi obdelava podatkov -obdelava rezultatov dvogeneracijskega testa Hvala za pozornost Piran,