MIKOLOGIJA Priročnik za vaje s teoretičnimi osnovami pri izbirnem predmetu za študente Biologije

Transcript

1 Izbrana poglavja pri predmetu MIKOLOGIJA Priročnik za vaje s teoretičnimi osnovami pri izbirnem predmetu za študente Biologije Polona Zalar, Sašo Jančič in Nina Gunde Cimerman Ljubljana, april 2012

2 Kazalo Varno delo z mikroglivami... 3 MIKOLOGIJA - časovni razpored vaj (šol. l. 2011/12)... 4 I. Splošno o glivah... 5 Kako se glive prehranjujejo?... 5 Morfologija gliv je zelo raznolika... 6 Razmnoževanje gliv je lahko res kompleksno Opis posameznih skupin gliv... 9 Deblo Chytridiomycota... 9 Deblo Zygomycota Deblo Ascomycota zaprtotrosnice Deblo Basidiomycota prostotrosnice Skupina»Deuteromycota« II. Izolacijske tehnike Direktne izolacijske tehnike Posredne osamitvene tehnike III. Identifikacija nitastih mikrogliv IV. Identifikacija kvasovk V. Ugotavljanje biotehnološko pomembnih lastnosti glivnih izolatov iz solin presevni encimski testi Uporaba encimov Presevne metode za ugotavljanje encimske aktivnosti PRAKTIČNA NAVODILA ZA VAJE S PROTOKOLI VAJA: OSAMITEV HALOFILNIH / HALOTOLERANTNIH GLIV IZ SOLIN POROČILO 1. VAJE: VAJA: IZOLACIJA HALOFILNIH / HALOTOLERANTNIH GLIV DO ČISTIH KULTUR VAJA: PREDSTAVITEV GLAVNIH SKUPIN GLIV VAJA: IDENTIFIKACIJA HALOFILNIH / HALOTOLERANTNIH GLIV IZ SOLIN Ključ za določevanje nekaterih halofilnih rodov gliv iz skupine»deuteromycota« VAJA: IDENTIFIKACIJA KVASOVK S POMOČJO FIZIOLOŠKIH LASTNOSTI VAJA: ENCIMSKE AKTIVNOSTI SOLINSKIH IZOLATOV

3 Varno delo z mikroglivami Glive so človeku lahko potencialno nevarne. Z glivami se lahko okužimo na različne načine: s prehodom spor preko ran ter drugih poškodb na koži, z zaužitjem in prehodom spor preko prebavnega trakta, z inhalacijo, s kontaktom s kožo in kasnejšo invazijo preko telesnih odprtin. Poznane so tudi mikoze nohtov, lasišča, oči ter urogenitalnega trakta. Zaradi tega moramo v laboratoriju, kjer delamo z mikroorganizmi - glivami, upoštevati naslednja pravila: 1. Če imamo katerokoli imunsko bolezen, se pred obiskom vaj posvetujemo s profesorjem in asistentom. 2. V laboratorij vstopamo v laboratorijski halji. 3. Prehranjevanje, pitje in uporaba kozmetičnih preparatov so v laboratoriju strogo prepovedani. 4. V laboratoriju ne shranjujemo hrane. 5. Kulture suhoprašnih gliv odpiramo samo v zaščitni mikrobiološki komori, oz. po navodilu asistenta. 6. Po končanem delu razkužimo delovno površino s 70 % etanolom; razkužimo si tudi roke. Izbirni predmet»mikologija«za študente prvih letnikov študija Biologije smo oblikovali tako, da študentom približamo svet gliv iz večih perspektiv. Glive obravnavamo kot ekološko enoto, študentom pa poskušamo osvetliti tudi biotehnološko, uporabno plat gliv. V skriptah so podane značilnosti osnovnih taksonomskih enot glivnega kraljestva Fungi. Omejujemo se na mikroglive, za katere obravnavamo specifične osamitvene tehnike. Svet gliv bomo spoznavali na posebni skupini ekstremofilnih mikrogliv, t.i. halofilnih / halotolerantnih glivah. Osamili jih bomo iz unikatnega slovenskega okolja, Sečoveljskih solin. 3

4 MIKOLOGIJA - časovni razpored vaj (šol. l. 2011/12) 1. vaja (16.,17.4.): Uvod v vaje Predstavitev izolacijskih tehnik zasnova poskusa in oblikovanje delovnih hipotez Terenske vaje (20.4.): Vzorčenje v Sečoveljskih solinah 2. vaja (23., 24.4.): Nastavitev izolacije mikrogliv iz solinskih vzorcev 3. vaja (7., 8.5.): Izolacija halofilnih / halotolerantnih gliv v čiste kulture Ogled predstavnikov glavnih skupin gliv 4. vaja (14., 15.5.): Identifikacija kvasovk in filamentoznih gliv iz solin 5. vaja (21., 22.5.): Ugotavljanje biotehnološko pomembnih lastnosti glivnih izolatov iz solin encimski testi Kolokvijski roki: 4

5 I. Splošno o glivah Mikologija je veda o glivah. Prave glive (Fungi) predstavljajo svoje kraljesto, paralelno kraljestvu živali in rastlin. Kraljestvo gliv vključuje veliko raznovrstnost organizmov, ki naseljujejo zelo raznolike habitate. Ko pomislimo na glive, se spomnimo dveh osnovnih značilnosti gliv, ki jim dajeta edinstveno prednost pred drugimi organizmi: glivna spora in glivna hifa. Spore omogočajo glivam hitro razširjanje po celotni biosferi (od Arktike do Antarktike in vse vmes) glive so povsod. Hife pa jim omogočajo natančno in»intimno«raziskovanje razpoložljivih substratov. Slika 1: levo- glivne hife; desno- glivne spore. Kako se glive prehranjujejo? Glive predstavljajo skupino evkariontskih heterotrofnih mikroorganizmov, ki pridobivajo energijo z oksidacijo organskih spojin. Prehranjujejo se z absorbcijo. Hranila absorbirajo direktno iz okolja v celice. Odvisne so od energetsko bogatih virov ogljika, ki jih proizvedejo drugi organizmi. Njihova posebnost so številni ekstracelularni hidrolitični encimi, s katerimi lahko razgradijo nekatere zelo težko razgradljive substrate, kot so hitin (npr. zunanji skelet žuželk), keratin (koža, lasje, roževina, perje), celuloza (rastlinski ostanki) in lignin (les). Celuloza in lignin sta vira ogljika, ki sta živalim dostopna le, če imajo v prebavnem sistemu prisotne mikrobne simbionte. Sposobnost razgradnje lignina in celuloze daje nekaterim saprobnim glivam dostop do ogromnih količin rastlinskih ostankov, kar jih uvršča v sam vrh svetovnih reciklatorjev. Hranijo se tudi z zelo nenavadnimi hranili, kot so zidna barva, plastika, ionizirajoče sevanje, itd. Večina gliv je saprofitnih, lahko pa so tudi paraziti, simbionti in patogeni. Slednje povzročajo bolezni rastlin, živali in ljudi. Mikorizne glive živijo v simbiozi z rastlinami. Rastlinam zagotavljajo mineralne snovi v zameno za ogljikove hidrate ali druge snovi, ki jih glive ne morejo sintetizirati. 5

6 Morfologija gliv je zelo raznolika Poznamo različne pojavne oblike gliv. Večina je nitastih (plesni), ki rastejo v obliki tankih, razvejanih nitk (hife), ki se podaljšujejo na konici. Hifne nitke se med seboj prepletajo v micelij. Miceliji lahko rastejo prosto ali pa se združujejo v takoimenovana psevdotkiva, v katera uvrščamo tudi pojavno obliko gliv, plodišče ali gobo. Druga skrajnost je enocelična pojavna oblika gliv, imenovana kvasovka. Razmnoževanje gliv je lahko zelo kompleksno Glive so znane po zelo raznolikem razmnoževanju. To lahko poteka na nespolni ali pa spolni način. Najprimitivnejša oblika nespolnega razmnoževanja so običkane spore, imenovane zoospore. Nastajajo v notranjosti posebnih struktur, imenovanih zoosporangiji. Nespolne, neobičkane, a še vedno s steno sporangija zaščitene spore imenujemo sporangiospore. Nespolne spore lahko nastajajo tudi na hifah, ki se oddelijo od micelija; tedaj jih imejujemo konidiji ali mitospore. Pogosto so obarvane in odporne proti izsuštvi. Spolno razmnoževanje gliv vključuje združitev enoceličnih gamet ali posebnih hif, ki jih imenujemo gametangiji, čemur sledi združitev jeder (kariogamija), in nato redukcijska delitev. Spolne spore (mejospore), ki nastajajo v zaprtem mešičku (askus), imenujemo askospore. Tiste mejospore, ki pa nastanejo na površini posebne strukture, imenovane bazidij, pa so bazidiospore. Spolni in nespolni stadiji se v posameznem življenjskem krogu glive prepletajo. Gliva ima lahko več načinov nespolnega razmnoževanja, zato ima lahko ena in ista biološka vrsta (holomorf) več različnih taksonomskih imen. Spolno razmnoževanje se je tekom evolucije pri številnih glivah izgubilo, saj jim že različne oblike nespolnega razmnoževanja (anamorfi) omogočajo zadovoljivo izmenjavo genetskega materiala. Genetski material namreč lahko izmenjujejo s heterokariozo (migracija jeder preko anastomoz med različnimi miceliji) in paraseksualnostjo (rekombinacija genov brez mejoze in oploditve, preko prehodnega diploidnega stadija). Obstajajo pa tudi glive, ki se razmnožujejo samo spolno (teleomorfi). ZANIMIVOST: Opisanih je le pribl vrst gliv (Kirk s sod., 2008), ocenjeno število vseh vrst gliv pa je miliona (Haksword, 2001). Za protiinformacijo: opisanih je 9000 vrst ptičev, 4500 vrst sesalcev. 6

7 Sistem gliv Kraljestvo pravih gliv (Fungi) ločimo na štiri debla po načinu tvorbe spolnih spor: Chytridiomycota - gibljive spolne in nespolne spore (zoospore) Zygomycota Sporangij na pelodnem zrnu. - debelostenske počivajoče spolne spore, ki jih imenujemo zigospore Ascomycota Zigospora. - spolne spore nastajajo endogeno, znotraj strukture (vrečke), ki jo imenujemo askus v notranjosti so zreli aski. Stekleničasto plodišče (peritecij); Basidiomycota - spolne spore nastajajo eksogeno na strukturi, ki jo imenujemo bazidij Goba (plodišče). Bazidiji z dvema bazidiosporama. Deuteromycota - v njihovem življenjskem krogu spolne strukture niso znane; nespolno razmnoževanje; so anamorfi gliv iz debel Asco- in Basidiomycota 7

8 Slika 2: Danes veljavno filogenetsko drevo pravih gliv (različno obarvane so skupine, ki so tradicionalno pripadale zigomicetam (pikčasta črta) in hitridiomicetam (črna črta). Vir: Hibbett s sod. (2007). 8

9 Opis posameznih skupin gliv Deblo Chytridiomycota Neobarvane strukture s hitinskimi celičnimi stenami in absorbcijskim načinom prehranjevanja so značilnosti, na podlagi katerih so uvrstili te organizme kot edino zoosporno skupino v kraljestvo gliv. Pojavna oblika gliv iz tega debla je pogosto reducirana na sporangij z rizoidi (pritrjevanje) ali pa rastejo iz krajših ali daljših micelijskih oblik, ki so nepravilno septirane. Ekologija So predvsem vodni organizmi. Micelij Cenocitične hife (nepravilno septirane) imajo hitinske celične stene. Talus je lahko holokarpen (v celoti spremenjen v reproduktivne strukture) ali evkarpen (le delno spremenjen). Spolno razmnoževanje Z gibljivimi gametami ali z oploditvijo oocite z gibljivo moško gameto. Pri mnogih vrstah je ta oblika razmnoževanja neznana. Pogosto se po oploditvi tvorijo debelostenske počivajoče spore. Nespolno razmnoževanje Z enojno običkanimi zoosporami v elipsoidnih ali kroglastih sporangijih. Glede na mehanizem odpiranja sporangija ločimo neoperkulatne in operkulatne (s pokrovčkom) sporangije. ZANIMIVOSTI: Glive iz te skupine so bile najdene kot najstarejše fosilne glive in so hipotetično predniki vseh ostalih glivnih skupin. Le v tej skupini najdemo striktne anaerobne glive, ki sicer živijo kot simbionti v vampu prežvekovalcev. Gliv iz debla Chytridiomycota v našem laboratoriju še nismo izolirali, smo pa jih zasledili v izjemno slani vodi solin z neposrednimi nekultivabilnimi tehnikami. 9

10 Deblo Zygomycota Ekologija: Saprofiti, pogosti v tleh, na iztrebkih in drugih organskih substratih, paraziti, simbionti višjih rastlin, koprofili.. Micelij: Cenocitičen (redko septiran) s hitinsko celično steno. Nespolno razmnoževanje: Z negibljivimi, endogeno ali eksogeno nastalimi sporangiosporami v večceličnih sporangijih ali v nekaj oz. enospornih sporangiolih. Spolno razmnoževanje: S somatogamijo po fuziji hif enega micelija (homotalija - tvorba spolnih oblik iz micelija izrastlega iz ene same spore) ali iz spolno diferenciranega micelija (heterotalija - za pozitivno spolno reakcijo sta potrebna genetsko kompatibilna partnerja) v počivajočo, debelostensko in ornamentirano sporo zigosporo. Slika 3: Morfološke strukture gliv iz razreda Zygomycota. sporangij sporangij kolumela apofiza sporangioli merosporangij progametangij zigota zigospora hlamidospore stolon rizoidi oidij ZANIMIVOST: Rod Pilobolus, ki spada med zigomicete, je razvil posebno obliko izstreljevanja spor. Spore te glive namreč ne vzkalijo, če ne preidejo prebavnega sistema prežvekovalcev. V okolje se izločajo z njihovimi izrebki, iz katerih pa se morajo»izstreliti«na travo, ki jo jedo prežvekovalci. Glive iz rodu Pilobolus so razvile posebne sporangije, katerih turgor ob zrelosti izstreli celotne sporangije s hitrostjo 10.8 m/s, 2 m v višino in 2,5 m daleč (preko krave). 10

11 kalitveni sporangij sporangiospore mejoza, kariogamija + - zigosporangij sporangiospore s sporangiji prozigosporangij plazmogamija + - somatska hifa gametangij progametangij Slika 4: Življenjski krog gliv iz reda Mucorales, družine Mucoraceae na primeru glive Rhizopus stolonifer. 11

12 Deblo Ascomycota - zaprtotrosnice Ekologija: So saprofiti, paraziti (predvsem rastlin) ali simbionti z algami oz. cianobakterijami (lišaji). Micelij: Septiran, haploiden; celične stene so slojevite, z enostavnimi porami na septah; celične stene sestavlja različen delež hitina in -glukanov. Spolno razmnoževanje: V mešičkih ali askih, ko se s kariogamijo dveh jeder, ki izhajata iz različnih gametangijev (moških anteridijev in ženskih askogonijev) oblikujejo po mejozi in mitozi 8 askospor (mejospore). Askospore so haploidne in trdožive. Aski lahko nastajajo samostojno ali v plodiščih. a b c d Slika 5. a prosti aski; b skledičasto plodišče (apotecij); c kroglasto, zaprto plodišče (kleistotecij); d stekleničasto plodišče (peritecij). b d a c e Slika 6: Različni tipi askov. A- ask s poklopcem - Pezizales, B- kroglasti ask - Eurotiales, C- ask z apikalno odprtino - Erysiphales, D, F- unitunikatni aski predstavnikov Helotiales in Sphaeriales, G- bitunikatni aksi v različnih stadijih zrelosti (Leptosphaeria acuta). Nespolno razmnoževanje: Spolni oz. askogeni stadij - teleomorf - je pogosto povezan z enim ali več nespolnimi stadiji - anamorfi. Večina gliv iz skupine Deuteromycota (Fungi imperfecti) so anamorfi v življenjskem ciklu askomicet. 12

13 konidiji ANAMORF konidiji askospore kariogamija mejoza, mitoza ask TELEOMORF plazmogamija askogonij Slika 7: posplošeni življenjski cikel gliv iz debla Ascomycota. ZANIMIVOST: anteridij Tartufi ali gomoljike (rod Tuber) spadajo med askomicete. So znani po svoji aromi in zato zelo cenjeni v kulinariki. Delovali naj bi tudi kot afrodiziak. Ljudje jih nabiramo že zadnjih 3600 let. Rastejo pod zemljo in jih zato zelo težko najdemo brez izučenih prašičev ali psov. Slednji so bolj priljubljeni, ker tartufov ne pojedo, medtem ko je svinjam to potrebno preprečiti. 13

14 Deblo Basidiomycota prostotrosnice Ekologija: Saprofiti, simbionti (ektomikoriza) in paraziti (predvsem rastlin). Vegetativni micelij: Septiran, dikariontski, pogosto zapončni. Septa hif imajo centralno poro, ki je lahko zelo raznolika in se uporablja kot pomemben morfološki taksonomski znak. Rodovi nekaterih skupin imajo enostavne pore, za nekatere skupine pa je značilna posebna septa (dolipora), kjer se celična stena razširi okoli pore v obliki sodčka. Pora je lahko dodatno prekrita s kapico iz modificiranega endoplazmatskega retikuluma (porna čepica ali parentesom). Spolno razmnoževanje: Na bazidijih (slika 9), v katerih poteče fuzija dveh jeder (kariogamija), mejoza in mitoza. Bazidiomi (bazidiomata): so plodišča (gobe) pri višjih bazidiomicetah, na katerih se nahajajo bazidiji. Pri pileatnih gobah plodišče delimo na kocen in klobuk. Bazidiji se lahko pojavljajo samostojno ali pa se združujejo v himenij (plodni del plodišča). Bazidij: celica ali organ, diagnostičen za bazidiomicete. Po kariogamiji, mejozi in mitozi na posebnih izvihkih notranje stene bazidija (sterigme) nastane (2-) 4 (-8) bazidiospor. bazidiospora sterigma a b c Slika 8: Različni tipi bazidijev. a: holobazidiji (neseptirani); b in c: fragmobazidiji. 14

15 Slika 9: Posplošeni življenjski krog gliv iz debla Basidiomycota. ZANIMIVOSTI: Gliva Armilaria ostoyae velja za enega največjih organizmov na Zemlji, saj se njen micelij razprostira na 8.9 km² ozemlja. Najdena je bila v gorovju Blue Mountains v Oregonu, ZDA. Ocenili so, da je micelij star okoli 2400 let in da tehta pribl. 605 ton (Canadian Journal of Forest Research, 2003). 15

16 Skupina»Deuteromycota«Deuteromycota, ki jih poimenujemo tudi Fungi imperfecti so glive, ki se razmnožujejo nespolno z mitosporami oz. konidiji. Nespolno obliko glive imenujemo anamorf. Mnoge deuteromicete so tekom evolucije izgubile sposobnost spolnega razmnoževanja. Mnoge pa spolne strukture razvijejo le ob posebnih pogojih, npr. na specifičnih gojiščih, ali pa samo na nekem naravnem substratu (npr. listje dreves). Večina gliv, ki jih uvrščamo v to skupino, spada v deblo Ascomycota, redko med Basidiomycota. Devteromicete so tiste glive, ki jih najpogosteje izoliramo s klasičnimi osamitvenimi tehnikami. Tvorba konidijev - konidiogeneza Konidij je negibljiva glivna spora, nastala pri nespolnem razmnoževanju, ki se ne tvori s cepitvijo. Tvorijo se na posebnih celicah, ki jih imenujemo konidiogene celice. Le-te pa so nameščene na hifi, ki jo imenujemo konidiofor. Konidiogeneza (ontogenetski razvoj) je najpomembnejša za prepoznavanje devteromicetnih gliv. Konidiji lahko nastanejo iz hife na dva načina: a) najprej zraste hifa, ki se predeli s prečnimi stenami in razpade v posamezne oglate enote - talična konidiogenezan (slika 11, A) (artrokonidiji) b) na hifi se oblikuje konidiogena celica, na kateri v obliki brsta nastane nova spora - konidij - blastična konidiogeneza (slika 11, B) (blastokonidiji) A B Slika 10: Različni načini konidiogeneze. A talična, B blastična. 16

17 konidiji vezikel steblo Slika 11: Primer nespolnega razmnoževanja pri glivi iz rodu Aspergillus. 17

18 Kvasovke Uvrstitev: Kvasovke (oz. enocelične glive) so navkljub podobni rasti in ekološkim podobnostim heterogena, polifiletska skupina. Uvrščamo jih predvsem v debli Ascomycota in Basidiomycota, pojavljajo pa se tudi kot dimorfna (rast v obliki kvasnih celic in hif) oblika v deblu Zygomycota. Ekologija: So zelo razširjena oblika gliv, ki jih najdemo na površini sadja, zelenjave, cvetov in listja. Najdemo jih v vodnih habitatih, pa tudi v Arktičnem ledu. Glukozo metabolizirajo v CO 2 in etanol. Metabolne značilnosti: Večino kvasovk uvrščamo med fakultativne anaerobe, saj ob prisotnosti kisika energijo pridobivajo z oksidativnim dihanjem. Ko je kisika relativno malo ali kadar so v okolju prisotne velike količine glukoze, so kljub prisotnosti kisika sposobne anaerobnih procesov (fermentacije). Oblika rasti: Kvasovke predstavljajo veliko skupino povečini enoceličnih gliv, ki le redko rastejo v micelijski ali v pseudomicelijski obliki. Pri kvasovkah poznamo različne načine enocelične nespolne rasti: a) brstenje npr. pivske kvasovke Saccharomyces cerevisiae. b) kvasne celice se lahko predelijo s prečnimi stenami; tedaj jih imenujemo fizijske celice (Schizosaccharomyces pombae) c) balistokonidiji se izstreljujejo zaradi turgorskega pritiska vodne kapljice na izrastek, ki je podoben kot pri sterigmatokonidijih (Sporobolomyces salmonicolor); d) novonastale hife se septirajo, hife razpadajo na septah; nastanejo posamezne, večinoma oglate enote, ki jih imenujemo artrokonidiji (Geotrichum candidum) Slika 12: Schizosaccharomyces pombae; Saccharomyces cerevisiae; Sporobolomyces salmonicor; Geotrichum candidum. Spolno razmnoževanje pri kvasovkah: Pri askomicetnih kvasovkah je mesto mejoze in tvorbe haploidnih askospor ask. Aski so goli in nezaščiteni, in se ne združujejo v plodišča. Tvorbo askospor lahko pri nekaterih rodovih kvasovk izzovemo s specifičnimi gojišči (npr. acetatni agar za rod Saccharomces). Za razvoj askospor je pomembna tudi temperatura, saj večina rodov sporulira pri temperaturi od 20 do 25 ºC. Aski z askosporami pri nekaterih vrstah nastanejo že v času 48 ur, pri drugih je proces lahko dolgotrajen in traja tudi do 6 tednov. 18

19 Askospore imajo lahko gladko ali grobo površino, so kroglaste, klobučaste ali ledvičaste, včasih imajo ekvatorialne zadebelitve. Askospore lahko opazujemo z različnimi barvanji, npr. pri rodu Saccharomyces z acidorezistentnim barvanjem - askospore so acidorezistentne in se ne razbarvajo s kislim alkoholom. ZANIMIVOSTI: Saccharomyces cerevisiae je poznana kot pivska, pekovska in vinska kvasovka. Pri proizvodnji piva jo uporabljajo za pivo zgornjega vrenja (ang.»ale«), medtem ko za pivo spodnjega vrenja oz. ležak (»ang. lager) uporabljajo drugo vrsto, S. pastorianus. Tradicionalno je proizvodnja vina temeljila na»divjih kvasovkah«, ki so po naključju zašle v mošt; končni proizvodi so bili zato različni in spremenljive kvalitete. V današnji pivovarski in vinarski industriji uporabljajo zelo specifične seve kvasovk, ki jih skrbno vzdržujejo in varujejo. S pomočjo genske manipulacije so seve S. cerevisiae tudi izboljšali (npr. toleranca na povišane koncentracije alkohola). Med fermentacijo potekajo specifične stranske metabolne reakcije, na račun katerih nastajajo majhne količine različnih organskih (nealkoholnih) molekul, ki poleg drugih sestavin (slad, grozdje, hmelj) pomembno vplivajo na končni okus, vonj in izgled produkta. Med kvasovkami poznamo ti.»ubijalske kvasovke«, ki izločajo toksine, s katerimi ubijejo druge kvasovke. 19

20 II. Izolacijske tehnike Direktne izolacijske tehnike Direktna izolacija: To je tehnika, ki vključuje prenos glive iz njenega naravnega okolja v čisto kulturo v laboratorijskih pogojih. Izolacija po inkubaciji v vlažni komori: Direktna izolacija gliv je bolj učinkovita, če je material izpostavljen vlagi od enega do nekaj tednov. V ta namen uporabimo vlažne komore. Naredimo jih iz plastičnih ali steklenih pokritih posod, tako da na dno namestimo material, ki začasno zadržuje vlago (npr. omočeno sterilno vato, papir). Na to podlago položimo vzorec ter komoro zapremo. Inkubiramo v prostoru s stalno temperaturo. Glive začnejo izraščati iz vzorca čez nekaj dni. Vlažne komore lahko uporabimo za raznorazne vzorce: iztrebke, les, listje, lubje, semena, sadje, mrtve žuželke, itd. Posredne osamitvene tehnike Pri izolaciji gliv z uporabo gojitvenih - posrednih metod je kot selektivno sredstvo proti bakterijam nujno uporabiti antibiotik. Uporabljamo širokospektralne antibiotike v koncetraciji 50 mg/l (npr. kloramfenikol), kot tudi kombinacije različnih antibiotikov z ožjim spektrom delovanja (npr. penicilin, streptomicin). Časi inkubacije do vidne rasti in sporulacije so precej daljši, kot pri bakterijskih kulturah, okoli 7 dni. Plošče striktno zapiramo s parafilmom in jih ne obračamo na pokrov. Vzorec po potrebi suspendiramo, redčimo in nato nanašamo na trdna gojišča (trdni vzorci z veliko količino želenih mikroorganizmov). Vzorce lahko tudi koncentriramo (centrifugiranje, filtracija) in nato nanašamo na ustrezna gojišča. Selektivne osamitvene tehnike Stresne tehnike: Vse plesni so do neke mere sposobne preživeti stresne pogoje, vendar pa je prevelik stres lahko usoden. Tudi tiste plesni, ki so sposobne živeti v ekstremnih pogojih, pri določenih skrajnih fizikalno kemijskih parametrih okolja odmrejo. Toleranca na stres je pri različnih glivah različna. Glede na to lahko material izpostavljamo pogojem, ki preprečijo rast neželjenim organizmom. Nekatere glive pa npr. ne vzkalijo, če ne preidejo prebavil določenih živali (npr. koprofilne glive). Druge zopet lahko vzkalijo le, če so izpostavljene ognju ali zmrzali. Da preverimo te zanimive prilagoditve, preiskovane vzorce (tla, iztrebek, les ali drugo) izpostavimo določenemi obdelavi, ki bo usodna za večino gliv. Vzorec lahko skuhamo, lahko ga pomočimo v alkohol, kislino, bazo, ali druge kemikalije, vzorec lahko tudi zamrznemo in večkrat zapored odtalimo. Po obdelavi lahko iz vzorca osamimo glive z običajnimi postopki (redčenje, inkubacija v vlažni komori, itd. ). Bogatitev: Snov, katero naj bi gliva razgrajevala, kot vabo dodamo v naravno okolje. Njihovo specializiranost za razgradnjo določenih snovi izkoristimo za privabljanje iz mešanega vzorca. 20

21 Kot vabe lahko uporabimo koščke lesa (celulolitične, lignolitične glive), koščke papirja (celulolitične glive), skelet žuželk (hitinolitične glive), lase (keratinolitične glive), sadje npr. jabolka, hruške (pektolitične glive), orehe (lipolitične glive), itd. Za izolacijo gliv iz vodnih okolij ponavadi uporabljamo različna semena. Ozmofilija, halofilija: Plesni napadejo številne skladiščene produkte, npr. slano, sladko in sušeno hrano, žitarice. Glive, ki so sposobne rasti na neobičajno suhih gojiščih imenujemo kserofili (preferenca do okolij z visokim ozmotskim potencialom na račun znižane vodne aktivnosti) oz. halofili (preferenca do okolij z visokim ozmotskim potencialom na račun soli). Za uspešno osamitev moramo upoštevati njihovo potrebo po znižani vodni aktivnosti gojišča zaradi povišanih koncentracij soli. V večini primerov je glivam vseeno, kateri topljenec uporabimo, le da je vodna aktivnost okolja/gojišča znižana. Principi izolacije gliv iz različnih substratov Voda: Vzorce vode obdelujemo na različne načine in glede na to, koliko mikroorganizmov v njej pričakujemo. Ponavadi (če je voda bistra) moramo celice koncentrirati, kar naredimo s filtracijo (membranski filtri - velikost pore 0,45 m) ali centrifugiranjem. Filtre nato s pinceto nanašamo na ustrezna agarna gojišča. Vodni vzorec lahko tudi obogatimo s hranili (vir ogljika in dušika), ter vodo aeriramo (stresamo na stresalniku). Po določenem času inkubacije vodo: a.) filtriramo in filtre nanašamo na trdna agarna gojišča b.) nanesemo na trdna agarna gojišča in inkubiramo, Po inkubaciji izoliramo glive v čistih kulturah. Trdni substrati: V to kategorijo spada zemlja, blato, mikrobne preproge itd. Trdne vzorce ponavadi najprej suspendiramo v primerni tekočini (fiziološka raztopina oz. raztopina primerne koncentracije soli/sladkorja). Včasih se moramo zaradi strukture vzorca (npr. mikrobne odeje) poslužiti homogenizacije. Če v vzorcu predvidevamo veliko št. glivnih struktur, tak vzorec serijsko redčimo (fiziol. razt. ali drugo) in vsaj 3 različne redčitve nanašamo na agarna gojišča (po 0,1 ml) ter razmažemo po površini z Drigalski spatulo. Če v vzorcu ne predvidevamo velikega števila gliv, tak vzorec prefiltriramo (membranski filtri - velikost pore 0,45 m), filtre pa nanesemo na izbrana agarna gojišča. Lahko pa uporabimo metodo vklopa vzorca tal v agarno gojišče, kar pomeni, da homogeniziran vzorec v primerni tekočini vlijemo v avtoklavirano, na 55 C ohlajeno agarno gojišče željene sestave, dobro premešamo in razlijemo v petrijevke. Rastline: Glive lahko uspevajo na površini rastlin (epifiti), v rastlinah (endofiti), v koreninskem sistemu in v rizosferi - okolici koreninskega sistema. Za proučevanje epifitskih gliv rastlino razrežemo na manjše dele in koščke namestimo na agarna gojišča. Za proučevanje endofitskih gliv moramo površino rastline razkužiti (postopek imenujemo površinska»sterilizacija«), v ta namen pa uporabljamo 10 % varikino, lahko pa tudi 70 % EtOH. Sledi spiranje s sterilno vodo in razrez rastline in nanos koščkov na ustrezna agarna gojišča. 21

22 Enako, kot je navedeno zgoraj za rastline, lahko površinsko steriliziramo tudi korenine. Pred tem postopkom jih speremo s sterilno vodo. Površinsko sterilizirane korenine ponovno speremo s sterilno vodo, jih narežemo na manjše kose in jih namestimo na agarna gojišča. Za proučevanje gliv iz rizosfere vzorec tal iz rizosfere obdelujemo po opisanem postopku za izolacijo gliv iz trdnih substratov (glej zgoraj). Zrak: Trdna gojišča lahko izpostavimo zraku za določen čas (15 do 30 minut) oz. določen volumen zraka prefiltriramo na gojišče z uporabo posebnih aparatur. Plošče zapremo, inkubiramo in glive izoliramo po inkubaciji. Izolacija kvasovk: Za selektivno izolacijo kvasovk lahko uporabimo gojišča z nizko ph vrednostjo (ph=3,5). Vzorce lahko obdelujemo enako kot navedeno zgoraj, gojišča pa lahko inkubiramo v mikroaerofilni (atmosfera z znižanim parcialnim tlakom kisika) oz. v različnih anaerobnih atmosferah (100 % CO 2 ; 80 % N 2, 10 % CO 2, 10 % H 2 ; 100% CO 2 ; 100% N 2 ). Bogatimo pa jih lahko tudi na ta način, da vzorec (npr. tal) homogeniziramo, suspendiramo v primerni tekočini (npr. fiziološka raztopina) v erlenmajerjevih stekleničkah, nato pa tekočino prekrijemo s plastjo sterilnega mineralnega olja in inkubiramo. Kvasovke se namnožijo v interfazi med oljem in vodo. S pipeto jih previdno nanesemo na trdna gojišča z antibiotiki, razmažemo z Drigalski spatulo in inkubiramo do pojava posameznih kolonij. 22

23 III. Identifikacija nitastih mikrogliv Po izolaciji glive v čisti kulturi sledi njena identifikacija. Glivo nacepimo na specifično diagnostično gojišče in jo gojimo določen čas. Glive imajo izjemno raznoliko morfologijo, ki jo s pridom uporabljamo v identifikacijske namene. Kljub temu pa dandanes identifikacija na izključno morfološkem nivoju ni dovolj zanesljiva, zato dodatno uporabljamo različne genetske markerje ugotavljamo zaporedja nukleotidov primernih genov. Za to moramo izolirati genomsko DNA in z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) pomnožiti želen del genoma. Vendar pa je morfologija še vedno primarna metoda identifikacije. Gojišča in čas inkubacije prilagajamo posameznim skupinam gliv. Opazujemo: a) makromorfologijo glive na trdnih gojiščih (barva micelija, barva reverza - stik kolonije z gojiščem, hitrost rasti, struktura kolonije, rob kolonije) ter b) mikromorfologijo razmnoževalnih struktur pod mikroskopom. Za slednje potrebujemo primeren mikroskopski preparat. Tehniko priprave preparata prilagodimo posamezni glivi z namenom opazovanja čim manj poškodovane strukture. Glede na tekočino, ki jo uporabimo za pripravo preparata, so preparati lahko nativni (voda), poltrajni (mlečna kislina, laktofenol in različna barvila) ali trajni (material kemijsko fiksiramo in obarvamo, robove preparata pa nato zaščitimo pred izsuševanjem, s snovmi kot so Canada balzam, lak za nohte). Postopek priprave preparatov: 1. Pod stereomikroskopom poiščemo primerno mesto rasti (sporulacije); 2. na objektno steklo kanemo kapljico barvila (npr. metilen modro) oz. vode ; 3. s pomočjo sterilizirane preparirne igle ali fine pincete odstranimo del kulture z mesta sporulacije; 4. delček kolonije prenesemo v barvilo ali vodo in odstranimo material z igle z uporabo roba krovnega stekelca; material razprostremo po čim večji površini; 5. krovno stekelce položimo na preparat tako, da se izognemo zadrževanju zraka v preparatu. Posebni»triki«pri pripravi preparatov: - če gliva tvori izjemno velike količine suhoprašnih spor, jih speremo z uporabo 70 % etanola (Aspergillus, Penicillium) - če želimo videti intaktne verižice spor, ki bi se sicer z zgoraj omenjenim načinom priprave preparatov razklenile, na lepilni trak (»selotejp«) odtisnemo glivno kolonijo (Cladosporium, Alternaria) ali pa pripravimo kulturo na objektnikih (razloženo v navodilih za vaje) - enocelične kvasovke na preparatu v tekočini se gibljejo; zato pripravljamo preparate na podoben način kot v bakteriologiji fiksiramo jih nad plamenom Za identifikacijo gliv uporabljamo identifikacijske ključe. Ti predstavljajo bližnjico do poimenovanja organizma, saj omogočajo ločevanje na podlagi ključnih lastnosti. Ko nas ključi privedejo do imena nakega rodu ali vrste, preverimo, če naš izolat ustreza predlaganemu opisu. Standard današnje identifikacije vključuje tudi podatke na molekularnem nivoju. 23

24 IV. Identifikacija kvasovk Pri kvasovkah so morfološke lastnosti vegetativnih in spolnih struktur pomembne pri prepoznavanju rodov, medtem ko vrste ponavadi določamo na podlagi fizioloških in biokemijskih karakteristik. V rabi so naslednji testi: 1. Zmožnost fermentacije sladkorjev - opazujemo tvorbo CO 2 v Durhamovih cevkah v tekočih gojiščih. 2. Sposobnost razgradnje določenih virov C in N - asimilacijski testi. Testiramo lahko zmožnost asimilacije številnih virov ogljika in dušika. Te teste lahko izvajamo tako v tekočih kot na trdnih gojiščih. 3. Druge lastnosti: rast brez dodanih vitaminov, pri visokih koncentracijah D-glukoze, NaCl, visoki vsebnosti EtOH, sposobnosti razgradnje sečnine itd. V. Ugotavljanje biotehnološko pomembnih lastnosti glivnih izolatov iz solin presevni encimski testi Uporaba encimov Uporaba encimov je danes vključena v številne industrijske procese (glej tabelo 1). Zaradi raznolikosti encimov in možnosti njihove uporabe na zelo različnih področjih, zanimanje za njihovo izkoriščanje nenehno narašča. Z uporabo encimov zmanjšujejo stroške proizvodnje določenih produktov. V mnogih primerih so encimi zamenjali kemikalije, s čimer so postopki postali okolju prijaznejši. Biotehnološka proizvodnja encimov poteka v specifičnem gojišču pri optimalnih pogojih gojenja izbranega mikroorganizma. Željene encime izoliramo iz produkcijskega gojišča ter jih odvisno od namena uporabe ustrezno očistimo in koncentriramo. Glive proizvajajo številne pomembne industrijske encime. Lastnost proizvodnje specifičnega encima je lahko značilnost posamezne vrste, lahko pa je tudi lastnost posameznega seva. Presevne metode za ugotavljanje encimske aktivnosti Postopek pridobivanja mikrobnih encimov se začne z iskanjem najaktivnejšega mikrobnega seva. V ta namen uporabljamo encimske presevne metode, s katerimi ugotavljamo sposobnosti rasti gliv na specifičnih substratih na definiranih ali poldefiniranih gojiščih. Presevne metode izvajamo v Petrijevih posodicah s točno določenim agarnim gojiščem, ki mora biti specifično za vsako encimsko aktivnost. Agarna gojišča pocepimo z različnimi sevi, jih inkubiramo nekaj dni pri ustrezni temperaturi in opazujemo rast kolonij ter spremenjeno območje okoli njih. Odvisno od lastnosti posameznega gojišča in metabolita se to območje lahko izraža kot: a) bister obroč okoli kolonije v sicer motnem gojišču, b) oborina okoli kolonije v sicer bistrem gojišču, c) obarvano oz. razbarvano območje v sicer drugače obarvanem agarnem gojišču (npr. dodatek ph indikatorjev ob pričakovani spremembi ph vrednosti). 24

25 Aktivnost sevov lahko kvantitativno vrednotimo tako, da izmerimo premer spremenjenega območja okrog kolonij po točno določenem času inkubacije. Za testiranje tvorbe različnih encimov posameznega mikrobnega seva lahko uporabimo tudi komercialne (npr. API ZYM) teste. API ZYM plošča ima 20 vdolbinic s posameznimi encimskimi substrati. Prva vdolbinica služi za kontrolo. Encimski substrati imajo poleg osnovne molekule, na katero encim deluje, vezan še naftil ali njegov derivat (naftol, naftilamid ). Le-ta se po delovanju encima odcepi, kar povzroči barvno reakcijo po inkubaciji filtrata kulture ali celičnega lizata v testnih vdolbinicah, in sicer po obarvanju z reagentoma (ZYM A, ZYM B). Pozitivna barvna reakcija pomeni tvorbo določenega encima. Po intenziteti barvnih reakcij lahko sklepamo tudi o količini proizvedenega encima. Tabela 1. Uporaba encimov v industriji. industrija Encimi namen uporabe detergenti proteaze odstranitev proteinskih barvnih madežev lipaze odstranitev mastnih madežev amilaze odstranitev škrobnatih madežev celulaze Odstranjevanje kratkih celuloznih fibril tekstilna amilaze odstranitev škroba z vodilnih niti industrija katalaze odstranitev H 2 O 2 po beljenju tkanin celulaze razbarvanje jeansa; alternativa za»stone washing«papirna celulaze obdelava lesne pulpe industrija ligninaze katalaze beljenje papirja usnjarska proteaze odstranitev proteinov industrija lipaze odstranitev maščob pekarska -amilaza razgradnja škroba do dekstrinov industrija -amilaza razgradnja dekstrinov do maltoze amiloglukozidaze povečanje vsebnosti glukoze mlečni renet encim za koagulacijo mleka v sirarstvu proizvodi laktaza predelava mlečnih izdelkov za prehrano ljudi alergičnih na laktozo vinarstvo, pektinaze pospešeno sproščanje soka, bistrenje sadni amilaze bistrenje soka sokovi -glukanaze bistrenje vin (razgradnja -glukanov glivnih kontaminantov) pivovarstvo -amilaze glukanaze nadomeščanje encimov sladu z biotehnološko proteaze proizvedenimi -glukanaze -amilaze proizvodnja nizko kaloričnega piva proteaze povečanje deleža dodatkov (koruza, riž, itd.) -amilaze utekočinjanje dodatkov -glukanaze izboljšanje filtracije (razgradnja -glukanov in pentozanov) -acetolaktat dekarboksilaza zmanjšanje časa zorenja piva (pretvorba - acetolaktata direktno v acetoin) 25

26 PRAKTIČNA NAVODILA ZA VAJE S PROTOKOLI 26

27 1. VAJA: OSAMITEV HALOFILNIH / HALOTOLERANTNIH GLIV IZ SOLIN Namen vaje: oblikovati delovno hipotezo, načrtovati in izvesti poskus izolacije halotolerantnih (tolerirajo NaCl)/halofilnih (ne rastejo brez NaCl) gliv iz solinskih vzorcev (voda, blato, mikrobna odeja, zrak, les, halofiti, slana tla,...). Izhodišče za razmišljanje: Soline predstavljajo skrajnostno okolje in so vir številnih ekstremofilnih halotolerantnih in halofilnih mikroorganizmov, tudi gliv. Pri glivah je pomembno upoštevati tudi to, da sta zrak in voda glavna medija za njihovo razširjanje in da se v slanici lahko znajdejo zgolj po naključju. Enega ključnih skrajnostnih parametrov za življenje v slanici (koncentrirana morska voda, kjer koncentracija ključne soli NaCl presega 3 % in seže do 32 %) predstavlajo visoke koncentracije NaCl, ki zmanjšuje vodno aktivnost (dostopnost vode za organizme). V grenčici oz. matični lužini (voda, ki ostane po kristalizaciji NaCl - halita), je visoka koncentracija Mg ionov (MgCl 2, MgSO 4 ), ki so tudi omejujoči za rast mikrobov, saj predvsem MgCl 2 s svojim kaotropnim delovanjem podobno kot visoka temperatura destabilizira celične proteine. V in vitro pogojih že 1 M raztopina MgCl 2 popolnoma inhibira encime, medtem ko je rast mikroorganizmov inhibirana na gojiščih z dodanim 1,26 M MgCl 2. Z raziskavami mrna, ki v okolju velja za pokazatelja aktivne mikrobne rasti, so pokazali, da je zgornja koncentracija MgCl 2, ki še omogoča življenje, 2,3 M. Mikrobna odeja, ki je v Sečoveljskih solinah poznana kot petola, je nekaj mm debela plast različnih bakterij, sadre in mineralov, ki preprečuje stik morskega blata na dnu kristalizacijskih bazenov s kristali soli, ki nastajajo v slanici. Zgornja plast petole vsebuje kisik, zato se v njej v glavnem razraščajo cianobekterije, medtem ko nekaj mm pod njo kisika zmanjka, tu pa so prisotni številni sulfatni reducenti. Plastovitost je posledica gradienta svetlobe, kisika in sulfida. Še vedno obstajajo različna mnenja ali je petola slana ali ne. Glive se v njej pojavljajo sporadično. Tla v solinah, ki so izpostavljena soli oz. so zasoljena, vsebujejo posebno mikobioto. Halofiti oz. slanuše so rastline, ki rastejo na slanih tleh, in so na to posebno življenje prilagojene. Lahko kopičijo kristale soli na površinah listov, lahko pa oblikujejo mesnate liste, ki lahko vsebujejo tudi povišano koncentracijo soli v celičnem soku. Povezava med rastlinami in glivami je zelo pomembna, saj glive povzročajo številne bolezni rastlin. Znane pa so tudi po tem, da lahko živijo na površinah rastlin (epifiti) ali pa v njihovih tkivih (endofiti). Najdemo jih tudi v koreninskem sistemu rastlin, kjer lahko predstavljajo tudi simbionte (npr. mikorizne glive). Navodilo: V okviru posamezne skupine postavite delovno hipotezo in zastavite poskus, s katerim delovno hipotezo preverite. Oblikujte shemo izolacije gliv iz solinskih vzorcev. Sledite lahko klasičnim napotkom za izolacijo gliv, ki so navedeni v skriptah (izolacija iz vode, tal, rastlin; str. 22 in 23). Na posebnem listu oddajte spisek gojišč in raztopin, ki jih boste potrebovali za izolacijo pri naslednji vaji. Izbirate lahko med: a) različnimi gojišči (glejte tabelo spodaj) b) raztopinami za pripravo suspenzij (fiziološka, 10 % NaCl, 20 % glukoza) c) temperaturami inkubacije (15 C, 25 C, 30 C) d) atmosfero (aerobna / mikroaerofilna / anaerobna) 27

28 Tabela 2. Različna gojišča za izolacijo gliv. MEA + Ch kratica opis gojišča vodna aktivnost - a w klasično gojišče za glive s sladnim in kvasnim ekstraktom 0,99 MEA + 10 % NaCl + Ch gojišče s soljo 0,930 MY Ch gojišče s kombinacijo soli (10 %) in sladkorja (12 %) 0,916 DG18 + Ch gojišče z glicerolom 0,946 MEA + 10 % MgCl % MgSO 4 + Ch zelo selektivno gojišče z Mg ioni neznano Legenda: MEA»Malt Extract Agar«- gojišče s sladnim ekstraktom, Ch»chloramphenicol«- antibiotik kloramfenikol, MY»Malt Yeast Extract agar«- agar s sladnim in kvasnim ekstraktom, DG18»Dichloran- Glycerol agar«- agar z dikloranom in glicerolom. 28

29 POROČILO 1. VAJE: Vzorec za izolacijo gliv: Delovna hipoteza: Shema izolacije: 29

30 Rezultati: Opišite (skicirajte) posamezne kolonije iz vaših mešanih kultur! Ugotovitve, kako se rezultati skladajo z delovno hipotezo! 30

31 2. VAJA: IZOLACIJA HALOFILNIH/HALOTOLERANTNIH GLIV DO ČISTIH KULTUR Namen vaje: izolacija gliv do čistih kultur. Navodilo: Ker glive na agarnih gojiščih ponavadi tvorijo suhoprašne spore, je potrebno z njimi rokovati v zaščitni mikrobiološki komori. Petrijevk v vajalnici ne odpirajte!! Vsaka dvojica študentov naj izolira eno glivno kulturo! Za izolacijo bomo uporabili bodisi metodo agarne iglice ali pa bomo spore razredčili in jih nanašali na plošče gojišča MEA. POROČILO 2. VAJE: Opišite (skicirajte), kako ste izolirali čisto kulturo glive! Kakšna je bila kolonija glive na osnovni izolacijski plošči? 31

32 3. VAJA: PREDSTAVITEV GLAVNIH SKUPIN GLIV Material: Čiste kulture gliv: Zygomycota: Rhizopus stolonifer (krušna plesen) Ascomycota: Sordaria macrospora Saccharomyces cerevisiae (pivska, vinska, pekovska kvasovka) Penicillium chrysogenum Basidiomycota: Agaricus bisporus (dvotrosni kukmak) Phragmidium mucronatum (rja) Izvedba: Oglejte si glivno kulturo in opišite njene makroskopske lastnosti. Oglejte si pripravljene mikroskopske preparate kulture. V protokol narišite strukture, ki jih opazujete pod mikroskopom in jih označite! POROČILO 3. VAJE: Gliva: Rhizopus stolonifer Sev: Čas inkubacije: Gojišče: T inkubacije: Makroskopski opis: Skica z oznakami: 32

33 Gliva: Sordaria macrospora Sev: Čas inkubacije: Gojišče: T inkubacije: Makroskopski opis: Skica z oznakami: Gliva: Phragmidium mucronatum Substrat:, Makroskopski opis: Skica z oznakami: 33

34 Gliva: Penicillium chrysogenum Sev: Čas inkubacije: Gojišče: T inkubacije: Makroskopski opis: Skica z oznakami: 34

35 Gliva: Saccharomyces cerevisiae Naredite preparat kvasovke S. cerevisiae zrastle na gojišču PDA (»Potato Dextrose Agar«- krompirjev agar) v fiziološki raztopini. Preparat pokrijte s krovnikom in ga opazujte pod mikroskopom pri 1000 x povečavi! Acidorezistentno barvanje askospor (po Ziehl-Nielsnu) Pobarvajte kulturo Saccharomyces cerevisiae EXF-527 na acetatnem agarju po principu acidorezistentnega barvanja. Askospore se zaradi drugačne kemijske sestave celične stene obarvajo rdeče, aski in vegetativne kvasne celice pa modro. Postopek acidorezistentnega barvanja: kvasovke razmažemo po površini objektnega stekla v kapljici fiziološke raztopine in preparat fiksiramo nad plamenom preparat barvamo s karbol fuksinom 5 minut barvilo odlijemo speremo s 70 % etanolom, cca. 20 s razbarvamo s kislim alkoholom (HCl + Et-OH), cca. 20 s speremo z vodo barvamo z metilenskim modrilom 1 minuto preparat speremo z vodo in osušimo na zraku opazujemo pod mikroskopom (1000 x povečava) brez uporabe krovnika Sev: Čas inkubacije: Gojišče: T inkubacije: Makroskopski opis: Skica z oznakami: Preparat v fiziološki raztopini: Povečava: Preparat po acidorezistentnem barvanju: Povečava: 35

36 4. VAJA: IDENTIFIKACIJA HALOFILNIH/HALOTOLERANTNIH GLIV IZ SOLIN Material: Čiste kulture gliv, izoliranih iz solin (iz 2. vaje) Ključ za določanje. Izvedba: Oglejte si glivno kulturo in opišite njene makroskopske lastnosti. Pripravite preparat kulture po navodilih (glejte str. 23). Po spodnjem ključu identificirajte glivo. Skicirajte in izmerite razmnoževalne strukture. Ključ za določevanje nekaterih halofilnih rodov gliv iz skupine»deuteromycota«1a Konidiji se tvorijo v piknidijih (plodiščem podobne strukture, v katerih nastajajo nespolne spore). Coelomycetes 1b Konidiji se ne tvorijo v piknidijih...2 2a Kulture so kvasnega izgleda, včasih vsebujejo filamentozne sektorje...3 2b Kulture so filamentoznega izgleda..5 3a Kulture so črne oz. temno zelene b Kulture so rdečih barv... Rhodotorula, 36

37 Rhodosporidium 4a Konidiji so podolgovati, eno- in dvocelični.. Hortaea 4b Konidiji so nepravilnih oblik, včasih trikotni, enocelični.. Phaeotheca 5a Konidiji vedno enocelični, na stekleničastih konidiogenih celicah, v ravnih suhih verižicah ali mokrih kapljicah. 6 5b Konidiji so lahko eno- ali večcelični 7 6a Konidiofori imajo vedno apikalno zadebelitev. Konidiogene celice stekleničaste. Konidiji so nanizani v suhe verižice Aspergillus 6b Konidiofori so čopičastega izgleda. Konidiogene celice stekleničaste. Konidiji so nanizani v suhe verižice. Penicillium 37

38 6c Konidiofori so piramidalno razvejani. Konidiogene celice stekleničaste. Konidiji združeni v mokrih kapljicah.. Trichoderma 7a Kulture so rdečkastih barv. 8 7b Kulture so zeleno obarvane.. 9 8a Kulture vsebujejo v snope združene stekleničaste konidiogene celice, na katerih nastajajo svetlo obarvani večcelični konidiji v obliki čolničev. Fusarium 8b Kulture vsebujejo v snope združene konidiogene celice raznolikih oblik, na katerih nastajajo temno obarvani večcelični kroglasti konidiji.. Epicoccum 9a Konidiji večinoma enocelični, bazalni konidiji lahko septirani, vendar samo prečno; konidiofori so grmičasto oblikovani... Cladosporium 9b Konidiji ponavadi večcelični, prečno in vzdolžno septirani; nastajajo v razvejanih verižicah. Alternaria 38

39 POROČILO 4. VAJE: Skica morfologije kulture glive: Gojišče: Čas inkubacije: T inkubacije: Makroskopski opis kulture: Skica: 39

40 5. VAJA: IDENTIFIKACIJA KVASOVK S POMOČJO FIZIOLOŠKIH LASTNOSTI Material: - 24-urne kulture kvasovk na gojišču MEA - poševnik z gojiščem za ugotavljanje ureazne aktivnosti Ugotavljane fermentacijskih sposobnosti: - tekoča gojišča z različnimi sladkorji (glukoza, galaktoza, rafinoza,..) in Durhamovimi cevkami Za kulture na objektnikih: - plastična petrijevka - sterilni filter papirji - sterilni zobotrebci - sterilna objektna stekla - sterilni krovniki - parafilm za zapiranje petrijevk - sterilna destilirana voda - krompirjev agar (PDA) - spatula, cepilna zanka Za API 20 C AUX: - vlažna komora - sterilna voda - API 20C AUX test - C gojišče - epruveta s 5 ml fiziološke raztopine Priprava kulture na objektniku: - Pripravite vlažno komoro: Petrijeva posodica z omočenim sterilnim filter papirjem in dvema sterilnima zobotrebcema. - Iz agarnega gojišča PDA izrežite košček (1 cm 2 ), ga namestite na sterilno objektno steklo v vlažno komoro. - S cepilno zanko inokulirajte kvasovke na vseh 5 prostih površin agarja in košček agarja prekrijte s sterilnim krovnim steklom. - Po treh dneh rasti previdno odstranite krovnik, ga namestite na objektno steklo, kamor ste predhodno kanili kapljico barvila anilin modro v mlečni kislini. - Preparat opazujte pod mikroskopom pri 1000 x povečavi in narišite. Izvedba testa API 20 AUX: - Pripravite vlažno komoro v komoro odpipetirajte 5 ml sterilne destilirane vode. - Odstranite zaščitni ovoj okoli komercialnega kita in ga namestite v vlažno komoro. - Pripravite inokulum v 0,9 % NaCl (zanko kulture suspendirajte v fiziološki raztopini) l inokuluma odpipetirajte v C gojišče (ampule) in ga suspendirajte s pipeto. - Inokulacija kita: napolnite vdolbinice testa s suspenzijo celic. - Inkubirajte teste pri temperaturi 30 C. 40

41 - Branje testa: po 48 in 72 urah: prva vdolbinica je negativna kontrola. Vsebina vsake vdolbinice, ki je bolj motna od negativne kontrole, je pozitivna. - Vsaka trojica rezultatov nam da številko v 7-mestni številčni kodi, na podlagi katere kvasovko identificiramo. - Identifikacija: s pomočjo priročnika, kjer so navedene vse možne številčne kombinacije. Inokulacija fermentacijskih testov: - Odpipetirajte 0,5 ml pripravljene suspenzije kvasnih celic za asimilacijske teste v fermentacijske epruvete. - Inkubirajte pri 30 ºC 7 dni. Sprememba barve indikatorja iz zelene v rumeno in plin v Durhamovi cevki pomenita pozitiven rezultat. POROČILO 5. VAJE: Rezultati API 20 C AUX testa: Koda: Identifikacija na podlagi številčne kode: Identifikacija (% verjetnosti): 41

42 Rezultati ostalih testov: Ureaza Fermentacija glukoza galaktoza rafinoza Skica morfologije kvasovke: Sev: Čas inkubacije: Gojišče: T inkubacije: Makroskopski opis kulture: Skica mikromorfoloških struktur: Povečava. Vprašanje: Ste s proučenimi lastnostmi lahko kvasovko identificirali? Kaj bi morali narediti, da bi jo lahko identificirali do vrste? 42

43 6. VAJA: ENCIMSKE AKTIVNOSTI SOLINSKIH IZOLATOV PRI RASTI NA GOJIŠČU BREZ SOLI IN Z DODATKOM 10 % SOLI A presevni encimski testi Material: Glivne kulture Encimski testi (specifična gojišča v Petrijevih posodicah): Izvedba: encim substrat oznaka gojišč proteaza kazein Ka Ka + 10 % NaCl esteraza Tween 80 Es Es + 10 % NaCl amilaza škrob Š Š + 10 % NaCl celulaza celuloza C C + 10 % NaCl beta-glukozidaza eskulin Ae Ae + 10 % NaCl 1. Kulturo z mikrobiološko zanko nacepimo enotočkovno na sredino gojišča. Inkubiramo pri določeni temperaturi 7 dni. Če je rast počasna, lahko inkubacijo podaljšamo. 2. Po inkubaciji merimo specifične reakcije glede na posamezno metodo, ki so posledice delovanja encimov (npr. premer spremenjene cone okoli kolonije). 3. V tabelo vpišite pozitivne rezultate. Opisi encimskih testov: 1. Proteolitična aktivnost na kazein (Ka) S testom ugotavljamo prisotnost proteaz, ki razgrajujejo kazein kot vir ogljika. Pozitivna reakcija: hidrolizo kazeina opazimo kot kolobar zbistritve okoli glivne kolonije. Izmerimo cono zbistritve in premer kolonije. Negativna reakcija: ni opaziti kolobarja zbistritve okoli kolonije glive, čeprav gliva lahko tudi zraste do določene velikosti. 2. Maščobno kislinska esterazna aktivnost (Es) V gojišče dodamo Tween- 80 kot glavni vir C in mešanico maščobnih kislin: elaidična, linolejska, palmitinska; kot ph indikator dodamo brom krezol rdeče. Končni ph gojišča je kisel. Pozitivna reakcija: Rast na račun hidrolize maščobnih kislin zviša ph, gojišče postaja modro-rdeče oz. vijolično (prvotna barva gojišča je rumena), pogosto se zaradi oboritve 43

44 netopnih Ca soli okoli kolonije pojavi tudi bel obroč. Zabeležimo si velikost kolonij, premer območja spremenjene ph vrednosti in prisotnost oborjenih Ca ionov. Negativna reakcija: Ni spremembe ph vrednosti (gojišče ostane rumene barve), gliva ponavadi tudi ne raste. 3. Amilazna aktivnost (Š) Gojišče vsebuje topni škrob kot edini vir ogljika. Pozitivna reakcija: Rast na gojišču nakazuje razgradnjo škroba na račun prisotnih amilaz. Včasih je razgradnja slabo razvidna, zato jo lahko potrdimo z zalitjem plošč z razredčeno raztopino joda (Lugolovo raztopino). Škrob se obarva modro-črno, območja razgradnje okoli kolonij pa se obarvajo rjavo ali ostanejo brezbarvna. Negativna reakcija: Gliva ne raste oz. če raste, se po zalitju z raztopino joda celotno gojišče obarva modro-črno. 4. Celulazna aktivnost (C) Celulaze so skupina encimov, ki katalizirajo hidrolizo celuloze. So velika skupina encimov, katerih glive so zelo pomembne proizvajalke. Glive proizvajajo pri rasti na celulozi vsaj tri različne vrste ekstracelularne aktivnosti: endo β-1-4-glukanaze, ekso β-1-4-glukanaze ter β-1-4-glukozidaze. Celuloza v agarnem gojišču predstavlja edini vir ogljika. Gojišče je zaradi dodane celuloze motno. Priporočena je dolgotrajna inkubacija (do 4 tedne). Pozitivna reakcija: območje zbistritve gojišča okoli kolonij. Negativna reakcija: gliva ne raste, oz. ni opaziti zbistrenega območja okoli kolonij. 5. Beta - glukozidazna aktivnost (Ae) Beta-glukozidaza je glukozidaza, ki npr. cepi vez β 1-4 med dvema molekulama glukoze (disaharidi). Spada med eksocelulaze; katalizira hidrolizo terminalnih nereducirajočih ostankov v beta-d-glukozidih s sproščanjem glukoze. Agarno gojišče vsebuje poleg omejene količine vira ogljika saharoze še eskulin (6,7- dihidroksikumarin 6-glukozid) kot dodatni vir. Po začetni rasti na saharozi lahko gliva raste zaradi sproščenih encimov beta-glukozidaz, ki cepijo eskulin v glukozo in eskuletin (6,7- dihidroksikumarin). Eskuletin reagira z železovim citratom v gojišču, zaradi česar gojišče počrni. Pozitivna reakcija: črno gojišče okoli kolonij. Negativna reakcija: gojišče okoli kolonij je nespremenjeno. 44