Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, I. R. Iran.

Transcript

1 Original Article Study of antibiotic resistance pattern and incidence of pathogenic genes of mgtc, spi4r, agfa, inve/a and ttrc in Salmonella infantis isolated from clinical specimens Aghdasi-Araghinezhad R, Amini K * Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, I. R. Iran. Abstract: Received November 13, 216; Accepted May 29, 217 Background: The importance of the health of red meat, poultry and eggs in human nutrition is very high. One of the factors that jeopardize the health of poultry food products is the bacterial family of Enterobacteriaceae, especially Salmonella. The aim of this study was to detect pathogenic genes in Salmonella infectious bacteria isolated from stool specimens using the multiple PCR assay. Materials and Methods: Selective and specific media for isolation of Salmonella were used. Primary isolation was carried out using Peptone water, Rapaport, selenite cysteine, MacConky agar and xylose-lysine deoxycholate agar. To confirm the diagnosis, biochemical tests including TSI, urea, endodontic, and citrate were used. The Salmonella Polyvalent Kit was used to determine Salmonella groups and mgtc, spi4r, agfa, inve/a and ttrc genes were studied in 6 samples by the multiple PCR method. Results: The results showed that all samples had 2 genes mgtc and ttrc, and none of the samples showed resistance to cefepime. Of the 6 samples of Salmonella, none were resistant to cefepime and ceftriaxone; 38.8% of the samples were resistant to amoxicillin, 53% to erythromycin and 38.3% to sulfamethoxazole. Conclusion: It can be concluded that cefepime is the best selective drug for the treatment of Salmonella infections. Identification and validation of genes in the region's bacteria can play a role in the broad epidemiological examination, antibiotic resistance, vaccine production, level of virulence, prevention and treatment. Also, evaluation of these genes in the samples for their virulence index is very important. Keywords: Salmonella infantis, Pathogenic genes, Antibiotic resistance, Multiple PCR * Corresponding Author. dr_kumarss_amini@yahoo.com Tel: Fax: Conflict of Interests: No Feyz, Journal of Kashan University of Medical Sciences, December, 217; Vol. 21, No 5, Pages Please cite this article as: Aghdasi-Araghinezhad R, Amini K. Study of antibiotic resistance pattern and incidence of pathogenic genes of mgtc, spi4r, agfa, inve/a and ttrc in Salmonella infantis isolated from clinical specimens. Feyz 217; 21(5):

2 بررسي الگوي مقاومت آنتيبيوتيكي و بروز ژنهاي بيماريز يا agfa spi4r mgtc inve/a و ttrc در باكتري سالمونلا اينفنتيس جدا شده از نمونههاي باليني مقدمه خلاصه: عليرغم پيچيدگي خانواده انتروباكترياسه كمتر از 2 جنس آنها عامل بيش از 95 درصد از عفونتهاي ايجاد شده ميباشند. برخي از اعضاي اين خانواده علاوه بر اينكه فلور طبيعي روده انسان و حيوانات ميباشند بهطور گسترده از آب خاك و سبزي - ها جدا ميگردند و همچنين *2 1 رويا اقدسي عراقينژاد كيومرث اميني سابقه و هدف: اهميت سلامت گوشت قرمز مرغ و تخممرغ در تغذيه انسان بسيار زياد است. يكي از عللي كه سلامت فرآوردههاي غذايي طيور را بهمخاطره مياندازد باكتريهاي خانواده انتروباكترياسه بهويژه سالمونلا ميباشد. هدف از اين تحقيق شناسايي ژنهاي بيماريزا در باكتريهاي سالمونلا اينفنتيس جدا شده از نمونههاي مدفوع با روش PCR چندگانه بود. مواد و روشها: از محيطهاي پيشانتخابي و اختصاصي براي جداسازي سالمونلا استفاده شد. بهمنظور جداسازي اوليه از محيطهاي آب پپتونه راپاپورت سلنيت سيستي ين مككانگي آگار و XLD استفاده شد. جهت تا ي يد تشخيص از تستهاي بيوشيميايي شامل TSI اوره اندول و سيترات و حركت استفاده گرديد. براي تعيين گروه سالمونلاي جدا شده از كيت پليوالان سالمونلا استفاده شد و ژنهاي inve/a agfa spi4r mgtc و ttrc در 6 نمونه مورد مطالعه با روش PCR چندگانه بررسي گرديد. ندادند. بعضي از اعضاي اين خانواده بيماريزا بوده و بعضي ديگر عامل عفونت فرصتطلب ميباشند. در حدود 3 تا 35 درصد از عفونتهاي خون بيش از 7 درصد از عفونتهاي مجاري ادراري و بسياري از عفونتهاي رودهاي در اثر آلودگي به باكتريهاي اين خانواده ايجاد ميشوند. 1 دانشآموخته كارشناسيارشد گروه ميكروبيولوژي دانشكده علوم پايه واحد ساوه دانشگاه آزاد اسلامي ساوه ايران 2 استاديار گروه ميكروبيولوژي دانشكده علوم پايه واحد ساوه دانشگاه آزاد اسلامي ساوه ايران * نشاني نويسنده مسي ول: دانشگاه آزاد اسلامي واحد ساوه دانشكده علوم پايه گروه ميكروبيولوژي دورنويس: تلفن: پست الكترونيك: dr_kumarss_amini@yahoo.com تاريخ دريافت: 1395/8/23 تاريخ پذيرش نهايي: 1396/3/8 عفونتهاي ايجاد شده توسط باكتريهاي خانواده انتروباكترياسه ميتوانند از يك مخزن حيواني مانند اغلب گونههاي سالمونلا و يرسينيا يك ناقل انساني مانند گونههاي شيگلا و سالمونلا و نيز از انتشار دروني ارگانيسم در بيماران مستعد مانند اشريشياكلي منشاء گرفته و درواقع ميتوانند هرجايي از بدن انسان و حيوان را درگير [2 1]. نمايند روشهاي مولكولي آنهاييكه بهطور وسيع در مطالعات اپيدميولوژيك سالمونلاها استفاده ميگردند عبارتند از: پلاسميد تايپينگ ريبوتايپينگ عناصر RCCS IS2 و اخيرا انگشتنگاريهاي تايپينگ انگشتنگاري PFGE و.AFLP پيشرفتهاي اخير در روشهاي مولكولي شناسايي ژنها اين امكان را فراهم نموده است تا بتوان باكتريها را براساس خصوصيات ژنوتيپي دستهبندي كرد. و پلاسميدي روشهاي مولكولي بر DNA مبناي نتايج: نتايج تحقيق نشان داد كه تمام نمونهها داراي 2 ژن mgtc و ttrc بوده و هيچكدام از نمونهها مقاومتي نسبت به سفپيم نشان از مجموع 6 نمونه سالمونلا هيچكدام به سفپيم و سفترياكسون مقاوم نبودند 38/8 درصد آنها به آموكسيسيلين 53 درصد به اريترومايسين و 38/3 درصد به سولفامتوكسازول مقاومت نشان دادند. نتيجهگيري: در مجموع ميتوان گفت سفپيم بهعنوان بهترين داروي انتخابي شناسايي ژنهاي حدت پلاسميدي جهت تفريق سويههاي سالمونلا بهكار ميآيند. در يك تحقيق مشابه نيز از روش PCR براي درمان ابتلا به سالمونلا اينفنتيس ميباشد. شناسايي و تاييد ژنها در باكتريهاي منطقه ميتواند در بررسي اپيدميولوژيكي وسيع مقاومتهاي آنتيبيوتيكي توليد واكسن ميزان حدت پيشگيري و درمان نقش داشته و بررسي اين ژنها در نمونهها بهدليل فراواني شاخص حدت بسيار اهميت دارد. واژگانكليدي: سالمونلا اينفنتيس ژنهاي بيماريزا مقاومت آنتيبيوتيكي PCR چندگانه دو ماهنامه علمي پژوهشي فيض دوره بيست و يكم شماره 5 آذر و دي 1396 صفحات چندگانه جهت تعيين هويت سالمونلا تيفيموريوم و سالمونلا انتريتيديس و تعيين ژنهاي پلاسميد حدت (SPV) استفاده شده است [3]. روشهاي متداول تشخيص سالمونلا بين 3 الي 5 روز وقت ميگيرد و امروز سعي بر اين است كه از روش- هاي سريع اما حساس و با ويژگي بالا استفاده شود. آزمايشات 443

3 ) اقدسي عراقينژاد و اميني PCR متنوعي جهت تشخيص سريع سالمونلاها در نمونههاي باليني و مواد غذايي استفاده شده است. PCR چندگانه علاوه بر حساسيت بالا در تشخيص سالمونلا در نمونه مدفوع نياز به نمونه كمتر داشته و 24 ساعت پس از دريافت نمونه قابل پاسخدهي مي- باشد [4 2]. ژنهاي هدف در PCR سالمونلاها بسيار متنوع هستند و در مطالعات زيادي ارزيابي شدهاند. در اين ميان ميتوان ژن inva و آغازگرهاي آن ST139 و ST141 با قطعه افزودهسازي شده 284 bp را نام برد. همچنين ژن oric و ژن agfa كه قطعات 394 و 163 bp را بهترتيب افزودهسازي ميكنند. همين- طور ژن OmpC كه پروتي ين OmpC را در غشاء سيتوپلاسميك كد ميكند و دو آغازگر S 18 و S 19 با قطعه 159 bp و ژن fima كه ژن مربوط به فيمبريه ميباشد و قطعه 85 bp را افزوده مينمايد. همچنين ژنهاي fimy fimz inve و fimw نيز مورد آزمايش قرار گرفتهاند.[5 2] لزوم اين inve/a agfa spi4r mgtc و تحقيق شناسايي ژنهاي ttrc سالمونلا اينفنتيس از نمونههاي باليني مدفوع با روش PCR چندگانه بوده تا بدينگونه ميزان مقاومت اين باكتري نسبت به آنتيبيوتيكهاي مورد نظر بررسي گردد. از جمله ژنهاي ويرولانس ميتوان به ttrc inva agfa spi4r mgtc در جنس سالمونلا اشاره كرد. اين ژنها پروتي ينهايي را كد ميكنند كه در مقابله با سيستم ايمني كمپلمان و مرگ داخل سلولي نقش دارند. عنصر ژنتيكي مهم ديگري كه نقش اساسي در پاتوژنز اين باكتري دارد جزاير پاتوژنيسيته سالمونلاها بهنام SPIs ميباشد كه واسطه تهاجم اوليه به مخاط روده است. spi4r ژن براي بقاي درون ماكروفاژها و ترشح توكسين نقش اساسي دارد. گروهي از ژنها تحت عنوان inva وجود دارند كه در ورود سالمونلا به سلولهاي اپيتليال نقش ايفا ميكنند. اين جزاير هم از نظر اندازه و هم از نظر محتوي ژني بسيار مهم هستند [2]. هدف از انجام اين تحقيق شناسايي ژنهاي inve/a agfa spi4r mgtc و ttrc سالمونلا اينفنتيس از نمونههاي باليني مدفوع با روش PCR چندگانه ميباشد. مواد و روشها نمونههاي در اين پژوهش بيمارستان از انساني مقطعي-توصيفي امام (ره) خميني نمونه از 6 تعداد تهران در ظروف استريل مخصوص جمعآوري و كدگذاري گرديده و با رعايت كليه نكات حمل و نقل نمونههاي عفوني به آزمايشگاه گروه ميكروب شناسي پاسارگاد منتقل شد. جداسازي و تا ييد بيوشيميايي سالمونلا همه ايزولهها توسط روشهاي ميكروسكوپي شناسايي شدند (جدول شماره متداول بيوشيميايي و 1 بدينترتيبكه ابتدا نمونهها روي محيطهاي كشت انتخابي سالمونلا-شيگلا آگار انتقال يافته و پس از 24 ساعت گرمخانهگذاري در C 37 از روي آبگوشت برينهارت روي ژلوز لوريا برتاني (LB) بهصورت خطي جهت بهدست آوردن كلوني منفرد كشت داده شد و در نهايت جهت كارهاي مولكولي استفاده شد د.ن جدول شماره 1- خصوصيات بيوشيميايي سالمونلا نوع تست اندول سيترات اورنيتين نتيجه تست _ نوع تست ليزين نتيجه تست مانيتول سوكروز vp گلوكز k/gas TSI لاكتوز - H2S اورهآز - MR - ONPG مراحل جداسازي باكتريها از نمونههاي محيطي و باليني از نمونههاي انتقال داده شده به آزمايشگاه در زير هود و در كنار شعله با رعايت اصول استريل بودن در محيط غني كنندة راپاپورت واسيلياديس Vassiliadis) (Rappaport كشت انجام شد و بهمدت 24 ساعت در دماي C 37 انكوبه گرديد. پس از گذشت زمان مورد نظر با استفاده از لوپ در محيطهاي انتخابي- افتراقي سالمونلا- شيگلا آگار كروم-آگار سالمونلا رامباخ و XLD بهصورت خطي كشت انجام شد. بعد از گذشت 24 ساعت از پرگنههاي سياه رنگ به محيطهاي بيوشيميايي نظير TSI اوره سيمون سيترات آبگوشت MR-VP و محيط SIM انتقال صورت گرفت. بعد از تا ي يد بيوشيميايي باكتري سالمونلا در ادامه با روش استاندارد آگلوتيناسيون و استفاده از آنتيسرمهاي اختصاصي O و H با دستورالعمل مربوطه سرووار باكتري تعيين شده و نيز به- وسيله PCR چندگانه سالمونلا اينفنتيس تا ي يد شد [6 4]. تعيين حساسيت آنتيبيوتيكي بهروش ديسكديفيوژن آزمايش ديسكديفيوژن كه روش كربيباي ر نيز ناميده مي- شود از سال 1966 در آزمايشگاهها بهطور وسيعي مورد استفاده قرار ميگيرد. اغلب آزمايشگاهها تعيين براي حساسيت آنتي- بيوتيكي از اين روش و بر اساس استانداردهاي NCCLS استفاده ميكنند. عوامل اصلي اين آزمايش عبارتند از ديسكهاي حاوي آنتيبيوتيك محيط كشت مناسب و سوسپانسيون باكتريايي كه هر- 444

4 جدا سازي ژنهاي بيماريزاي... يك از موارد فوق بايستي مطابق با معيارهاي NCCLS فراهم شوند [6]. آزمايشات صورت گرفته با روش ديسكديفيوژن براي ايزولههاي سالمونلا اينفنتيس با استفاده از 5 ديسك آنتيبيوتيكي تهيه شده از شركت پادتن طب كه شامل: اريترومايسين سفيپيم سفترياكسون سولفامتوكسازول و آموكسيسيلين بود انجام گرديد. استخراج DNA از باكتريها براي استخراج DNA NaOH نيمنرمال استفاده گرديد در اين پژوهش از روش ليز بدينصورتكه ابتدا از ذخيره باكتريايي پس از خروج از حالت انجماد در محيط كشت لوريا- برتانيبراث بهمدت ساعت كشت داده شد. سپس از محيط كشت يك كلوني انتخاب شده و به ميكروتيوبهاي 7 ميكرو- ليتري حاوي 25 ميكروليتر NaOH نيمنرمال اضافه گرديد تا شيرابه تهيه گردد. پس از گذشت 2-3 دقيقه 25 ميكروليتر محلول تريس 1 مولار به محلول فوق اضافه گرديد تا عمل هضم باكتري توسط NaOH متوقف گردد و محلول با تهيه شود. 7/5 نهايي ph بلافاصله با افزودن 45 ميكروليتر آب مقطر استريل حجم محلول به 5 ميكروليتر رسيده و رقت نهايي از عصاره DNA جهت انجام آزمايش PCR آماده گرديد. آغازگرها (پرايمرها) پرايمر اليگونوكلي وتيدي اساسيترين عامل موثر بر راندمان و اختصاصيشدن واكنش ميباشد. PCR طراحي دقيق پرايمر براي بهدست آوردن محصولات مورد نظر در مقادير مطلوب و جلوگيري از تكثير تواليهاي غيراختصاصي ضروري است. معمولا /1-1 M پرايمر در هر واكنش مورد نياز است (جدول شماره 2). جدول شماره 2- پرايمرها و سويههاي استاندارد بهكار رفته در PCR ژنهاي مورد مطالعه [7] سكانس پرايمر ) زا 5' به (3' F:TGCCTACAAGCATGAAATGG / R:AAACTGGACCACGGTACAA پرايمر InvE/A (5 bp) ttrc (92 bp) mgtc (655 bp) spi4r (1269 bp) agfa (261 bp) F:GTGGGCGGTACAATATTTCTTTT / R:TCACGAATAATAATCAGTAGCGC F:TGACTATCAATGCTCCAGTGAAT / R:ATTTACTGGCCGCTATGCTGTTG F:GAATAGAAGACAAAGCGATCATC / R:GCTTTGTCCACGCCTTTCATC الكتروفورز و آناليز محصولات PCR F:TCCGGCCCGGACTCAACG / R:CAGCGCGGCGTTATACCG آمپليكونها يا فرآوردههاي حاصل از واكنش PCR شامل ميليونها قطعه از DNA مورد هدف است كه بهطور طبيعي واجد طول مشخصي در ناحيه بين دو پرايمر ميباشد. يكي از روشهاي شناسايي محصولات PCR الكتروفورز روي ژل آگاروز است [6]. نتايج بعد از كشت دادن نمونههاي جمعآوري شده در نهايت نمونههاي آلوده به باكتري سالمونلا براساس آزمونهاي بيوشيميايي جداسازي گرديد. پس از كشتهاي اوليه بهمنظور بالا بردن دقت از تستهاي بيوشيميايي استفاده شد كه تستهاي بيوشيميايي مورد استفاده ما شامل سيترات تست TSI تست SIM MR/VP و بودند اوره (جدول شماره اغلب 1). آزمايشگاهها تعيين براي حساسيت آنتيبيوتيكي از روش ديسكديفيوژن براساس استاندارد NCCLS استفاده ميكنند. همچنين باتوجه به اهميت مقوله ايجاد مقاومت دارويي در اين مطالعه جدايهها از نظر مقاومت دارويي مورد بررسي قرار گرفته كه نتايج آن بهشرح زير است: از مجموع 6 نمونه سالمونلا هيچكدام به سفپيم و سفترياكسون مقاوم نبودند 38/8 درصد آنها به آموكسيسيلين 53 درصد به اريترومايسين و 38/3 درصد به سولفامتوكسازول مقاومت نشان دادند (جدول شماره 3). امروزه افزايش به مقاومت آنتيبيوتيكها در باكتريها يك معضل جهاني است كه در اثر مصرف بيرويه و روزافزون داروها اتفاق افتاده و متاسفانه كشور ما هم از اين قاعده مستثني نيست. نتيجه آزمايش PCR چندگانه جهت شناسايي ژنهاي spi4r mgtc inve/a agfa و ttrc نشان داد كه تمام نمونهها داراي ژنهاي mgtc و ttrc بوده و ژن spi4r در هيچكدام از ايزولهها يافت نشد (شكلهاي شماره 1 و 2). جدول شماره 3- نتايج ديسك ديفيوژن بر حسب تعداد نمونه S: sensitive R: resistance) آنتيبيوتيكها اريترومايسين سولفامتوكسازول آموكسيسيلين سفپيم سفترياكسون و (I: intermediate (S) Mm نيمه حساس (I) (R) Mm

5 اقدسي عراقينژاد و اميني بحث شكل شماره 1- نتايج PCR چندگانه روي ژل از چپ به راست: ماركر (1 ) bp كنترل مثبت كنترل منفي نمونههاي حاوي ژن ttrc و mgtc و inva نمونه 27 داراي ژن agfa ميباشند. شكل شماره 2- نتايج PCR چندگانه روي ژل از چپ به راست: ماركر (1 (bp كنترل مثبت كنترل منفي نمونههاي 49-6 حاوي ژن ttrc و inva و mgtc سالمونلوز يكي از مهمترين بيماريهاي عفوني است كه گسترش جهاني داشته و در انسان و گونههاي مختلف حيوانات به- صورت بيماريهاي متفاوتي ظاهر ميگردد. دو سرووار شايع اين باكتري در حيوانات و انسان سالمونلا انتريتيديس و تيفيموريوم ميباشد Morshed.[6] و همكاران در سال و نمونههاي 52 و 53 و 6 داراي ژن agfa ميباشند. بالاترين 211 مقاومت جدايهها را نسبت به آمپيسيلين آموكسيكلاو و سولفو- متوكسازول تتراسايكلين و كلرامفنيكل گزارش كردهاند. بيشترين مقاومت نسبت به سولفومتوكسازول گزارش شده كه با نتايج اين تحقيق مطابقت ندارد. دلايل اين اختلاف ميتواند به تفاوت در نوع سويهها زمان نمونهگيري و ميزان شيوع پلاسميدهاي حاوي ژنهاي مقاومت آنتيبيوتيكي مرتبط باشد [8]. Ross و همكاران با انجام روش PCR روي ايزولههاي سالمونلا تيفيموريوم جدا شده طي سالهاي 2 تا 21 و 25 تا 26 از بچهخوكهاي داراي اسهال نشان دادند كه همه ايزولهها داراي ژن inva بوده و فقط 14 درصد از ايزولهها داراي ژن ttrc ميباشند [9]. آزمايشات PCR متنوعي جهت تشخيص سريع سالمونلاها در نمونههاي در باليني و مواد غذايي استفاده شده است. در اغلب اين روشها قبل از انجام PCR يك مرحله غنيسازي بهمنظور بالا بردن حساسيت آزمايش پيشنهاد گرديده است. سروتايپهاي سالمونلا از جمله سروتايپ اينفنتيس جزء رايجترين سروتايپها در اكثر نقاط جهان از جمله ايران است. اين سروتايپ طي زمان دچار تغييرات ژنتيكي شده و از نظر جغرافيايي در مناطق مختلف داراي ويژگيهاي ژنو- تيپي متفاوت ميباشد. بنابراين ژنوتايپينگ دقيق اين سروتايپ اطلاعات زيادي در مورد اپيدميولوژي و شناسايي منابع عفونت آن اختيار تعداد 14 محققين [9]. ميدهد قرار 28 سال در مجارستاني سويه سالمونلا اينفنتيس از نمونههاي مدفوع انسان و 182 سويه از نمونههاي مدفوع جوجهها جدا كردند و در اين مطالعه نيز اين سروتايپ از مقاومت دارويي نيز بيشتري فراواني بيشترين ميزان بود. برخوردار مربوط به آنتيبيوتيكهاي استرپتومايسين فورازوليدون ناليديكسيك اسيد تتراسايكلين لينكوايپكتين فلو - مكوي ين و سولفامتوكسازول تريمتوپريم بود و زهرايي [1]. همكاران (1382) با استفاده از PCR ساده به بررسي حضور ژن spi4d در سروتيپهاي متفاوت سالمونلا پرداخته و عنوان كردند 446

6 جدا سازي ژنهاي بيماريزاي... كه از اين ژن ميتوان در شناسايي سويههاي مختلف سالمونلا استفاده كرد [11]. اما باتوجه به نتيجه تحقيق ما ژن مذكور نمي - تواند داراي حساسيت و ويژگي مناسب جهت تشخيص اين باكتري باشد. با افزودهسازي محققين 6 در InvA ژن PCR جدايه سالمونلا حضور قطعه 284bp اين ژن را در تمام جدايهها مورد تا ييد قرار دادند و استفاده از اين روش را كه كمتر از 12 ساعت زمان نياز دارد در جهت تشخيص جنس سالمونلا توصيه نمودند. همچنين در ديگر مطالعات با افزودهسازي ژن PCR OmpC در 2 نمونه مدفوع گاو اخذ شده از نقاط مختلف ايران و نيز 25 جدايه كلينيكي سالمونلا در 7 مورد از نمونههاي مدفوع و همه 25 جدايههاي باليني سالمونلا حضور قطعه 159 bp اين ژن تا ي يد شده و تعيين ژن OmpC با روش PCR بهدنبال غني- سازي مدفوع روش مناسبي جهت جستجوي سالمونلا در نمونه - هاي مدفوع نشان داده شده است [11 3 2]. در مصر طي سال 29 از مجموع 141 ايزوله سالمونلا جداشده از نمونههاي مواد غذايي 81 ايزوله مربوط به سالمونلا اينفنتيس بود كه نسبت به ساير سروتيپهاي سالمونلا بيشترين موارد جداشده از نمونههاي مواد غذايي بود. همچنين در سال 23 در آرژانتين سالمونلا انتريكا سرووار اينفنتيس دومين عامل شايع در ميان سروتيپهاي سالمونلا در ميان كودكان بستري شده در بيمارستان بوده است [12]. در يك مطالعه كه به جستجوي سروتيپ سالمونلا اينفنتيس با استفاده از PCR در بين جدايههاي گروه C سالمونلا طيور و تعيين الگوي مقاومت دارويي جدايهها پرداخته است همه جدايهها نسبت به آنتيبيوتيكهاي فلورفنيكل و دانوفلوكساسين حساس بوده و كمترين مقاومت دارويي به آنتيبيوتيكهاي لووفلوكساسين سفتا- زيديم سفترياكسون و نورفلوكساسين مربوط ميشده كه با نتايج بهدست آمده در مطالعه ما همخواني دارد [13]. دانشمندان بهمنظور اراي ه يك روش اختصاصي و سريع براي شناسايي سالمونلا انتريتيديس و ساير سروتيپهاي واجد پلاسميد حدت از روش spi4r چندگانه با استفاده از آغازگرهاي مربوط به ژنهاي PCR و inva كه بهترتيب قطعات 244 و 571 bp را افزودهسازي مي- نمايند استفاده كردهاند. در اين روش سروتيپهاي واجد پلاسميد حدت نظير سالمونلا تيفيموريوم سالمونلا انتريتيديس سالمونلا كلراسوي يس سالمونلا دابلين سالمونلاهاي فاقد پلاسميد و سالمونلا سنداي ي دو قطعه و حدت تنها يك قطعه مربوط به ژن inva را مشخص كردند [14]. عنوان شده است كه در عفونتهاي سيستميك سالمونلا تيفيموريوم ژنهاي حدت يا پلاسميد حدت باعث تكثير و افزايش باكتريها در سيستم رتيكلواندوتليال و ماكروفاژها شده و حذف ژنهاي ttrc باعث كاهش ميزان حدت ميگردد [15]. همچنين بهوسيله ايجاد جهش در ژنهاي سكانس ttrc صفت ايجاد حدت در سالمونلا تيفيموريوم به اثبات رسيده است. قسمت BttrC از پلاسميد حدت اين توانايي را دارد كه همانند يك ttrc كامل و دستنخورده باعث ايجاد عفونت سيستميك بهواسطه سالمونلا تيفيموريوم در موشهاي BALB/C بعد از ايجاد عفونت به شكل زيرپوستي گردد [17 16]. در مطالعه- Chiu اي كه سالمونلا تيفيموريوم و همكاران (22) روي سويههاي جدا شده و انتريتيديس انجام دادند نشان دادند كه PCR چندگانه در شناخت ايزولههاي سالمونلاي داراي مقاومت چندگانه بهخصوص سالمونلا تيفيموريوم نوع و ACSSUT همچنين در شناسايي توزيع ژن بتالاكتاماز در بين ايزولههاي سالمونلا بسيار سودمند است. در اين روش از سه جفت پرايمر مربوط به ژنهاي مقاومت آنتيبيوتيكي blapse-1 cmla/tetr و blatem و يك جفت پرايمر مربوط به ژن sipb/c كه ژن ويژه جنس سالمونلا است استفاده گرديد [18]. بيان شده است كه سن ژنتيك و محيط فاكتورهاي اصلي در ميزان حدت باكتري بوده و پلاسميدهاي حدت و يا فاكتورهاي حدت بهطور مستقيم دخالتي در واكنش بين ميزبان و باكتري ندارند اما اغلب اين ژنها پروتي ينهايي را كد مينمايند كه در واكنش بين ميزبان و باكتري دخالت نموده و اين پروتي ينهاي تا ثيرگذار نقش مهمي در بقاء و تكثير سالمونلا دارند [19]. Chashni و همكاران با انجام PCR چندگانه روي 1125 نمونه جدا شده از جوجههاي خانگي نشان دادند كه 55/5 درصد از نمونهها سالمونلا انتريتيديس و 22/2 درصد سالمونلا تيفيموريوم هستند. تمام سروتيپهاي سالمونلا تيفيموريوم براي چهار ژن rfbj (پادگنO ) flic (پادگن H1) fljb (پادگن H2) و inva (تهاجم) مثبت بودند. همچنين تمام سروتيپهاي سالمونلا انتريتيديس (انتروتوكسين) مثبت بودند. ايشان براي ژنهاي spi و SefA نتيجه گرفتند كه دقت و حساسيت روش مذكور آن را به يك ابزار ارزشمند براي تعيين گونههاي سالمونلا تبديل كرده است [2]. اميني و همكاران نيز از روش PCR چندگانه براي تعيين و شناسايي همزمان ژنهاي inv A و ttrc و از روش PCR ساده براي تعيين ژنهاي mgtc و agfa در سالمونلا انتريتيديس استفاده كردند. آناليز نمونهها نشان داد كه ژنهاي 9 در mgtc و ttrc درصد از سالمونلا انتريتيدسهاي جدا شده از منابع انساني و 1 درصد گونههاي جدا شده از منابع گاوي وجود دارد [21]. مقايسه نتيجه تحقيق اميني با تحقيق حاضر در ارتباط با ميزان شيوع ژنهاي ttrc mgtc و inv A نشان از شيوع بالاي اين ژنها در گونههاي سالمونلا اينفنتيس و انتريتيديس ميباشد. برخلاف نتايج حاصل از 447

7 اقدسي عراقينژاد و اميني اين مطالعه در بررسي سالمونلا تيفيموريوم نشان از تفاوت زياد در درصد فراواني ژنهاي inv A و ttrc در مقايسه با گونههاي تيفيموريوم و اينفنتيس ميباشد. لوژيكي وسيع مقاومتهاي آنتيبيوتيكي توليد واكسن ميزان حدت پيشگيري و درمان نقش داشته و بررسي اين ژنها در نمونهها بهدليل شاخص حدت بسيار حاي ز اهميت ميباشد. نتيجهگيري باتوجه به وجود ژنهاي mgtc و ttrc در همه نمونهها و حساسيت تمام باكتريها به آنتيبيوتيك سفپيم اين طور ميتوان نتيجه گرفت كه در نهايت داروي سفپيم بهعنوان بهترين داروي انتخابي براي درمان ابتلا به سالمونلا اينفنتيس ميباشد. شناسايي و تاييد ژنها در باكتريهاي منطقه ميتواند در بررسي اپيدميو- تشكر و قدرداني از كليه عزيزاني كه در مراحل مختلف انجام اين پژوهش ما را ياري نمودند كمال قدرداني را بهعمل آورده و مراتب سپاسگزاري فراوان خود را از مسي ول محترم آزمايشگاه ميكروب شناسي و آزمايشگاه تحقيقاتي پاسارگاد جناب آقاي مهندس مقدم References: اعلام ميداريم. [1] Wannaprasat W, Padungtod P, Chuanchuen R. Class 1 integrons and virulence genes in Salmonella enterica isolates from pork and humans. Int J Antimicrob Agents 211; 37(5(: [2] Naghyly B, MoghadasPour, Majidpour A, Pahlevanzdeh H. Evaluation of different strains of Salmonella to antibiotics, infectious diseases, tropical Conference, Tehran, December database computer Congresses, Research Department of the Ministry of Health, Treatment Med Education 3 rd ed. 199; [in Persian] [3] Madadgar Omid, molecular identification of Salmonella isolates to electrophoresis in alternating electric field, Dissertation in Microbiology. Tehran. Faculty of Vet Med University [in Persian] [4] Hojati P, Isolation and identification of Salmonella poultry ERic-PCR and serological methods, Dissertation of Poultry Veterinary. Tehran. Science and Research Azad University [in Persian] [5] Hudson CR, Garcia M, Gast RK, Maurer JJ. Determination of close genetic relatedness of the major Salmonella enteritidis phage types by pulsedfield gel electrophoresis and DNA sequence analysis of several Salmonella virulence genes. Avian Dis 21; 45(4): [6] Mahon CR, Lehman DC, Manuselis G. Textbook of Diagnostic Microbiology-E-Book: Elsevier Health Sciences; 214. P [7] Soto SM, Rodríguez I, Rodicio MR, Vila J, Mendoza MC. Detection of virulence determinants in clinical strains of Salmonella enterica serovar Enteritidis and mapping on macrorestriction profiles. J Med Microbiol 26; 55(4): [8] Morshed R, Peighambari SM. Salmonella infections in poultry flocks in the vicinity of Tehran. Iran J Vet Med 21; 4(4): [in Persian] [9] Ross IL, Heuzenroeder MW. A comparison of three molecular typing methods for the discrimination of Salmonella enterica serovar Infantis. FEMS Immunol Med Microbiol 28; 53(3): [1] Nógrády N, Kardos G, Bistyak A, Turcsányi I, Mészáros J, Galántai Z, et al. Prevalence and characterization of Salmonella infantis isolates originating from different points of the broiler chicken human food chain in Hungary. Int J Food Microbiol 28; 127(1): [11] Zahraei Salehi MT, Study of the antigenic Salmonella typhimurium and use it to detect and track infections caused by this bacterium. Dissertation. Tehran University [in Persian] [12] Ahmed A, Ishida Y, Shimamoto T. Molecular characterization of antimicrobial resistance in Salmonella isolated from animals in Japan. J Appl Microbiol 29; 16(2): [13] Aviv G, Tsyba K, Steck N, Salmon Divon M, Cornelius A, Rahav G, et al. A unique megaplasmid contributes to stress tolerance and pathogenicity of an emergent Salmonella enterica serovar Infantis strain. Environ Microbiol 214; 16(4): [14] Shanmugasamy M, Velayutham T, Rajeswar J. InvA gene specific PCR for detection of Salmonella from broilers. Vet World 211; 4(12): [15] Matsui H, Kawakami T, Ishikawa S, Danbara H, Gulig PA. Constitutively Expressed phop Inhibits Mouse Virulence of Salmonella typhimurium in an Spv Dependent Manner. Microbiol Immunol 2; 44(6): [16] Reed GH, Kent JO, Wittwer CT. Highresolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. 27. [17] Robbe-Saule V, Schaeffer F, Kowarz L, Norel F. Relationships between H-NS, σ S, SpvR and growth phase in the control of spvr, the regulatory gene of the Salmonella plasmid virulence operon. Mol Gen Genet 1997; 256(4): [18] Chiu CH, Wu TL, Su LH, Chu C, Chia JH, Kuo AJ, et al. The emergence in Taiwan of fluoroquinolone resistance in Salmonella enterica 448

8 جدا سازي ژنهاي بيماريزاي... serotype Choleraesuis. N Engl J Med 22; 346(6): [19] Asten AJ, Dijk JE. Distribution of classic virulence factors among Salmonella spp. Pathog Dis 25; 44(3): [2] Chashni S, Hassanzadeh M, Fard M, Mirzaie S. Characterization of the Salmonella isolates from backyard chickens in north of Iran, by serotyping, multiplex PCR and antibiotic resistance analysis. Arch Razi Inst 29; 64(2): [21] Amini K, Salehi TZ, Nikbakht G, Ranjbar R, Amini J, Ashrafganjooei SB. Molecular detection of inva and spv virulence genes in Salmonella enteritidis isolated from human and animals in Iran. Afr J Microbiol Res 21; 4(21):