Rast mikrobne populacije

Transcript

1 Rast mikrobne populacije rast posamezne celice : rast populacije hranila fizikalno-kemijski faktorji rasti zaprt in odprt način namnoževanja merjenje rasti mikrobne populacije matematični opis rasti

2 Rast Rast je definirana kot povečanje biomase. Alternativno rast lahko definiramo kot povečanje števila mikrobnih celic, oziroma povečanje CFU (colony forming units) ali MPN (most probable number).

3 Metode za določanje biomase štetje (direktno štetje, gojitvene metode) optična gostota (OD) suha teža, mokra teža celični ogljik, celični dušik koncentracija proteinov, koncentracija DNA s substratom inducirana respiracija fumigacijsko- inkubacijska metoda določanje ATP

4 Potrebni in zadostni pogoji za rast Potrebna je konstantna zaloga vseh virov in ustrezno fizikalno-kemijsko okolje, ki omogoča biokemijske pretvorbe. Potrebni mehanizmi: - mehanizem za vnos snovi in energije - mehanizem za sintezo in razgradnjo makromolekul - mehanizem celične delitve - mehanizem za signaliziranje in regulacijo - mehanizem za odstranjevanje odpadnih produktov

5 Makrohranila C N O P S gradnik celičnega materiala, vir elektronov sestavina aminokislin in proteinov, sestavina purinov, pirimidinov in nukleinskih kislin, sestavina mureina in hitina, sestavina lipidov, kot nitrat je alternativni akceptor elektronov sestavina vseh organskih spojin, akceptor elektronov sestavina nukleinskih kislin, fosfolipidov, tehoičnih kislin, energijska rezerva, signalna molekula sestavina aminokislin (metionin, cistein, homocistein, cistationin), vitaminov (tiamin, biotin), koencimov (CoA), rezervna snov, energijski vir, alternativni akceptor elektronov

6 Makrohranila K Na Mg Ca Fe ozmoregulator, kofaktor encimski aktivator, potreben za sprejem citrata, transport pri halofilih sestavina ATP, klorofila, aktivator kinaz stabilizira celično steno, sestavina endospor, aktivator kinaz citohromi, katalaza, peroksidaza, Fe-S proteini, oksigenaza, nitrogenaza, vir energije, alternativni akceptor elektronov

7 Mikrohranila Co Cu Mn Mo Ni Se W V Zn vitamin B12, transkarboksilaza citohromi, plastocijanin superoksid dismutaza fotosistem II nitrogenaza, nitrat reduktaza, sulfit oksidaza, format dehidrogenaza, oksotransferaze hidrogenaze, koencim F430, CO dehidrogenaza, ureaza format dehidrogenaza, nekatere hidrogenaze format dehidrogenaza, oksotransferaza nitrogenaza, peroksidaza anhidraze, alkohol dehidrogenaza, RNA in DNA polimeraza

8 Vrste mikrobioloških gojišč Kemijsko definirana gojišča vse komponente v gojišču poznamo in jih dodamo v znanih količinah Kemijsko nedefinirana (kompleksna) gojišča hranilni bujoni, krvni agar, kvasni ekstrakt, mesni peptoni Selektivna gojišča gojišče izberemo tako, da raste samo en mikroorganizmem, medtem ko drugi ne morejo rasti (npr. manitol + visoka koncentracija soli za Staphylococce) Diferencialna gojišča na gojišču raste več različnih vrst organizmov, vendar se morfološko ali fiziološko med seboj razlikikujejo (npr. MacConkey agar za diferenciacijo entrobakterij)

9 Viri dušika in žvepla v gojiščih Razen dušik fiksirajočih bakterij in žveplo asimilirajočih bakterij ostali mikrobi niso sposobni asimiliacije elementarnega dušika in žvepla. Viri dušika za večino mikroorganizmov so: NH 4 Cl, (NH 4 )SO 4, NaNO 3 ali KNO 3. Dodatno lahko zagotovimo vir dušika s peptonom ali drugimi proteinskimi hidrolizati. Vir žvepla za večino mikroorganizmov je sulfat. Za tiste, ki sulfata ne morejo izrabiti so uporabni viri žvepla: H 2 S, cistein, metionin ali pa peptoni.

10 Viri kisika, vodika in CO 2 v gojiščih Vsi heterotrofi potrebujejo CO 2. Ker se veliko CO 2 reciklira v celici je potreba po CO 2 majhna. Nekateri mikroorganizmi (npr. Neisseria ali Brucella) potrebujejo povišane koncentracije CO 2 za svojo rast. Vsi heterotrofi potrebujejo vir vodika. Vodik nastaja pri metabolizmu aminokislin, ogljikovih hidratov in z disociacijo vode in se v celici reciklira. Bakterije, ki rastejo na vodiku potrebujejo H 2 v večjih količinah. Za biosintetske potrebe celice kisik običajno ni limiten nutrient. Če je kisik v vlogi terminalnega akceptorja elektronov lahko limitira rast.

11 Viri mineralnih ionov v gojiščih Večina mikroorganizmov zahteva dodatek: Ca 2+, K +, Na +, Mg 2+, Mn 2+, Fe 2+, PO 4 3- v koncentracijah mg/l Zn 2+, Cu 2+, Co 2+, Mo 6+ vkoncentracijiµg/l Bolj zahtevni mikroorganizmi zahtevajo dodatek elementov v sledovih npr. Ni, Se, W, Al, B. Vir mineralnih ionov je lahko raztopina soli po Winogradskem in raztopina mikroelementov.

12 Kelirajoče spojine v gojiščih Večina divalentnih in trivalentnih metalov tvori netopne hidride, karbonate ali fosfate. Precipitiranje metalov se poveča z avtoklaviranjem. Zaradi tega lahko dodajamo gojiščem kelirajoče spojine. V mikrobiologiji uporabljamo: -EDTA - NTA (nitrilotriocetna kislina) - aminokisline (glicin, histidin) - karboksilne kisline (npr. acetat, citrat, sukcinat, tartrat) -porfirini(hem) -siderfori

13 Vitamini - rastni faktorji p-aminobenzojska k. folna kislina prekurzor za folno kislino metabolizem 1C spojin, prenos metilnih spojin biotin sinteza maščobnih k., β-dekarboksilacija, fiksacija CO 2 kobalamin (B12) lipoična kislina nikotinska kislina pantotejska kislina riboflavin tiamin (B1) vitamin B6 vitamin K (quinon) sinteza deoksiriboze, prenos 1C spojin prenos acilnih spojin elektronski transport z NAD in NADP, dehidrogenacije prekurzor za CoA elektronski transport z FMN, FAD, dehidrogenacije α-dekarboksilacija, transketolaza amino in keto kislinske transformacije eelektronski transport, sinteza sfingolipidov hidroksamati vezava Fe 3+

14 Drugi organski rastni faktorji v gojiščih Nekatere bakterije potrebujejo poleg vitaminov, aminokislin, purinov in pirimidinov še dodatne rastne faktorje kot so: maščobne kisline (ocetna, propionska, butirat, valeriat, izovaleriat, izobutirat) diaminopimelična kislina nepoznani rastni faktorji, ki jih dodamo s serumom, kvasnim ekstraktom, posnetim mlekom, sadnimi sokovi, paradižnikovim sokom, talnim ekstraktom in ruminalno tekočino

15 Mikroorganizmi, ki jih ne znamo gojiti ~ 99 % mikroorganizmov ne znamo gojiti. Mikrobe, ki so živi jih pa ne znamo gojiti na standardnih laboratorijskih medijih pri običajnih laboratorijskih pogojih zunaj njihovega naravnega habitata imenujemo viable but non-culturable. Možni razlogi: inaktivacija celic z drugimi celicami neravnotežje uporabljenih substratov indukcija litičnega cikla previsoka koncentracija substrata

16 Fizikalno-kemijsko omejevanje hitrosti rasti vsak organizem lahko do neke mere tolerira neugodne pogoje v okolju, neugodne pogoje lahko preživi tako, da zmanjša hitrost rasti, ustavi rast, celično diferencira, če je tolerančni prag presežen propade poznavanje vpliva okoljskih faktorjev omogoča razumevanje ter razlago prostorske in časovne biološke raznolikosti v okolju (npr. nastanek ekoloških niš), obenem omogoča uspešnejšo kontrolo mikrobne aktivnosti

17 Vpliv redoks potenciala na rast Redoks potencial je mera za tendenco oddajanja ali sprejemanja elektronov. Eh = E 0 + RT nf [ oksidant][ H ln [ reducent] + ] E h je redoks potencial, E o je redoks potencial pri standardnih pogojih (ph=0, 1M konc. oksidanta in reducenta, 1bar, 25 o C), R je plinska konstanta, n je število prenešenih elektronov, F ja Faradejeva konstanta, H + je koncentracija protonov. Za organizme obstaja optimalni redoks potencial za uporabo elektronskih akceptorjev: kisik nitrat/nitrit sulfat CO mv -100 mv -200 mv -300 mv

18 Kisik in redoks potencial V raztopini imamo neto redoks potencial (E o ), ki je odvisen od vseh molekul in njihovih standardnih redoks potencialov. V večini primerov je dominantna komponenta redoks potenciala kisik. E h 2.30RT RT = E 0 + log po log[ H 4F F p O2 je tenzija raztopljenega kisika + ] Npr. pri E h -140 mv je v raztopini raztopljenih ~ 10 8 molekul kisika na ml. V primeru, da imamo ~ 10 8 celic/ml bo v povprečju na celico prišla ena molekula kisika.

19 Klasifikacija mikrobov glede na potrebo po O 2 Aerobi potrebujejio kisik za rast Fakultativni anaerobi uporabljajo kisik če je na voljo, lahko preživijo brez kisika Mikroaerofili uporabijo nižje koncentracije kisika Obligatni anaerobi kisik je zanje toksičen aerob mikroaerofil anaerob aerotoleranten fakultativni aerob

20 Kisik in tvorba radikalov Kisik običajno najdemo v triplet stanju, toksična oblika je singlet, ki reagira s π vezjo. Nastanek singlet kisika je posledica fotokemijskih reakcij Kisikove reaktivne zvrsti nastajajo pri dihanju. O 2 + e - O - 2 superoksid O e- + 2H + H 2 O 2 vodikov peroksid H 2 O 2 + e - + H + H 2 O + OH hidroksilni radikal OH + e - + H + H 2 0 voda

21 Pomembnejši kisikovi in dušikovi radikali Reaktivne kisikove spojine: superoksid O 2 - hidroksil, OH Reaktivne dušikove spojine: dušikov oksid, NO dušikov dioksid, NO 2 peroksil, RO 2 alkoksil, RO hidroperoksil, HO 2

22 Poškodbe z radikali direktna poškodba peptidne vezi ali stranskih verig (cepitev, povezovanje stranskih verig) posredna poškodba proteina z radikalno aktiviranimi lipidi in sladkorji sprememba sekundarne ali terciarne strukture (izguba katalitične ali strukturne funkcije lipidne oksidacije (poškodba membrane) DNA poškodbe (cepitev vezi, mutacije)

23 Odstranjevanje radikalov Pri dihanju poleg H 2 O nastane tudi O 2 - (~5 %). Aerobi, fakultativni aerobi in mikroaerofilci morajo posedovati vsaj dva od znanih načinov aktivnega odstranjevanja toksičnih oblik kisika: 2O H + H 2 O 2 + O 2 superooksid dismutaza H 2 O 2 + H 2 O 2 2H 2 O + O 2 katalaza H 2 O 2 + NADH + H + 2H 2 O + NAD + peroksidaza V kolikor organizem nima enega od omenjenih encimov za odstranjevanje kisika lahko preživi samo v anaerobnih razmerah.

24 Encimski obrambni mehanizmi pri kvasovki encim Cu/Zn superoksid dismutaza Mn superoksid dismutaza katalaza A katalaza T citokrom C peroksidaza glutation reduktaza funkcija dismutacija superoksidnega aniona (citoplazma) dismutacija superoksidnega aniona (mitohondrij) razgradnjavodikovega peroksida (peroksisom) razgradnja vodikovega peroksida redukcija vodikovega peroksida redukcija oksidiranega glutationa

25 Druge obrambne spojine pri kvasovki spojina glutation metalotionini tioredoskin poliamini funkcija odstranjevanje prostih radikalov vezava Cu 2+, odstranjevanje superoksidnih in hidroksilnih radikalov redukcija proteinskih disulfidov zaščita lipidov

26 Topnost kisika v raztopini temperatura c O2 H ( o C) ( mg/l) (mg/l/atm) Topnost kisika v tekočini je nizka (nekaj mg/l). Potrebe po kisiku so običajno precej večje. Zaradi tega je potrebno pri aerobni inkubaciji stalno dovajati kisik. Topnost kisika je c O2 = H p g c O2 = T T T 3 odvisna od parcialnega tlaka kisika (p g ), Henrijeve konstante (H), temperature (T) in prisotnosti topljencev v raztopini.

27 Gojenje anaerobov uporaba posod z majhnim razmerjem površina/volumen uporaba steklenic z navojem in zamaškom napolnjenih s tekočino uporaba poltekočih gojišč (dodatek 0.05 % agarja, manj konvekcije) uporaba parafinskega sloja na površini gojišča dodatek reducentov v medij uporaba večjih inokulumov ( do 10 %) inkubacija v anaerobnem okolju (dodatek indikatorja in reducirajočega sredstva, npr. GasPak)

28 Gojenje anaerobov in redoks potencijal Za gojenje anaerobov je potrebno znižati redoks potencial pod -100 mv, za striktne anaerobe pa pod -300 mv. Za to uporabljamo reducirajoče spojine (S 2-, HS ali pa H 2 S kot aktivno komponento). V mikrobiologiji so uporabni: natrijev tioglikolat (E o < -100 mv v koncentraciji 0.05 %) cistein HCl (E o < -210 mv v koncentraciji %) Na 2 S x 9H 2 O (E o < -270 mv v koncentraciji 0.025%) FeS(E o < -270 mv v koncentraciji 4 µg/ml) ditiotreitol (E o < -330 mv v koncentraciji 0.02 %) H 2 (E o < -420 mv) titanov citrat (E o < -480 mv v koncentraciji 1-4 mm)

29 Namnoževanje anaerobnih mikroorganizmov

30 Vpliv vodne aktivnosti (a w ) na rast mikrobov V bioloških celicah ima voda štiri osnovne funkcije: je kemijski reaktant (hidrolize, kondenzacije) je univerzalno topilo za metabolite ima mehansko vlogo pri ohranjanju celičnega turgorja omogoča strukturo proteinov, DNA, polisaharidom in membranam

31 Vpliv vodne aktivnosti (a w ) na rast mikrobov a w = p p w = n p je parcialni tlak vode nad raztopino s topljencem, p w je parcialni tlak vode nad čisto vodo, n w je število molov vode v raztopini, n s je število molov topljenca v raztopini. RT π= lnaw V n w w + n s Voda je nujno potrebna za rast mikroorganizmov. Vendar prisotnost vode še ne pomeni, da je voda tudi dostopna. Dostopnost vode je odvisna od vodne aktivnosti a w. Npr. zmanjšanje a w iz 0.99 na 0.90 zaradi spremenjene koncentracije NaCl pomeni zmanjšanje koncentracije vode v celici za 50 %. π je ozmotski tlak tekočine, R je plinska konstanta, T je temperatura, Vje volumen raztopine, a w je vodna aktivnost raztopine.

32 Vodna aktivnost, a w vodna aktivnost snov mikroorganizem destilirana voda Caulobacter, Spirilum kri Streptococcus, Escherichia morska voda Pseudomonas, Vibrio kruh G+ paličke sadni sirup G+ koki salame Sacharomyces marmelada Sacharomyces, Penicilium slana jezera Halobacterium, Halococcus žita Xeromyces

33 Adaptacija na nizko vodno aktivnost Rast pri nizki vodni aktivnosti omogočajo kompatiblni topljenci, ki povečajo koncentracijo snovi znotraj celic tako, da voda lahko prihaja v celico. Poznamo več vrst kompatibilnih topljencev: glicin, betain, prolin, glutamat, saharoza, trehaloza, glicerol, manitol.

34 Vpliv temperature na rast mikroorganizmov k= Ae Ea/RT k je hitrostna konstanta reakcije, A je predeksponentni faktor, ki poda frekvenco trkov med molekulami, Ea je aktivacijska energija, R je plinska konstanta, T je temperatura Ea logk= loga 2.30RT µ je rastna konstanta Temperaturno območje za rast bakterij je ~ 35 o C. Temperatura vpliva na hitrost reakcij, vrsto metabolizma, prehranske potrebe in sestavo biomase. Hitrost kemijskih reakcij v odvisnosti od temperature je podana z Arrheniusovo enačbo.

35 Hitrost rasti pri različnih mikroorganizmih

36 Vpliv ph na rast ph = log H + ph vrednost gojišča vpliva na hitrost rasti. Rast je možna v razponu 2-5 ph enot. Metabolni produkti so lodvisni od ph. Večina mikroorganizmov pri nizkem ph ph = pk a [ kislina] log [ baza] producira nevtralne produkte, pri visokem ph pa organske kisline. S ph se spreminja sestava biomase, predvsem celične stene in celične zunanjosti.

37 Zgodovinski razvoj gojenja mikroorganizmov prvi kompletno definiran medij za Aspergilus; (Raulin, 1869) uporaba čistih kultur (Koch, 1870) uporaba stresalnikov za gojenje (Kluyver & Perquin, 1930) uporaba prvih fermentorjev (v 40 letih 20.stoletja) matematični opis rastne kinetike v zaprtem sistemu (1942) matematični opis rastne kinetike v kemostatu (1950) kontrolirano namnoževanje mikroorganizmov (> 1960)

38 Načini gojenja mikroorganizmov Zaprti sistemi gojenja: Pri teh sistemih ne pride do izmenjave energije in snovi med sistemom in okolico. Primer zaprtega sistema je šaržni ali batch sistem. Odprti sistemi gojenja: Pri teh sistemih gojenja prihaja do izmenjave energije in snovi med sistemom in okolico. Primer odprtega sistema so: - kemostat sistemi - kontinuirani šaržni sistemi

39 Rastne faze Rastne faze so definirane v zaprtem sistemu gojenja in se nanašajo na populacijo celic. Posamezna celica lahko raste, ne raste ali propada. Ločimo več faz rasti mikrobne populacije: -lag faza (1) - faza pospešene rasti (2) - eksponentna faza (3) - faza pojemajoče rasti (4) CFU stacionarna faza (5) - faza propada (6) 1 2 čas

40 Lag faza Čas od inokulacije do prve delitve celic imenujemo lag faza. V lag fazi pride do povečanja mase celic. Lag faza je posledica: spremembe prehranskega statusa spremembe fizikalno kemijskega okolja okrevanja celic zaradi toksičnih produktov, ki so se nakopičili v mediju (npr. kisline, baze, alkoholi, topila). sinteze novih encimov kalitve spor

41 Eksponentna faza rasti Eksponentna faza rasti je faza hitre rasti, ko se biomasa pri vsaki delitvi podvoji. Generacijski čas je čas, ki je potreben za podvojevanje biomase. Običajno vse parametre, ki vplivajo na rast mikroorganizma združimo v eno konstatno (µ), ki je mera za trenutno hitrost rasti.

42 Hitrost rasti dx To je osnovna enačba za rast mikrobne = µ X dt populacije. V kolikor so vsi pogoji za rast X je količina biomase, µ je rastna konstanta, t je čas rasti biomase zadovoljeni potem se v časovnem intervalu dt število celic poveča proporcionalno s številom celic X. X = X oe µ t X o je količina biomase (inokuluma) na začetku rasti mikroorganizma Povečanje celic je konstantno. Omenjena predpostavka drži samo v primeru eksponentne rasti.

43 Generacijski čas (t d ) td = ln2 µ X= X t / td o 2 Generacijski čas je čas, ko je X = 2X o in t = t d. Število podvojitev biomase v času t je t/t d. Generacijski čas je pri različnih mikoorganizmih različen in je v rangu od 20 min do 5000 min. t je čas rasti mikroorganizma, t d pa je podvojevalni čas biomase

44 Logistična enačba rasti dx dt X = µ X 1 K Logistična enačba odpravlja predpostavko, da je hitrosti rasti konstantna. Pri povišani gostoti celic X je biomasa, µ je hitrost rasti, K je nosilnost okolja. se hitrost rasti zaustavlja in gre proti nosilnosti, ki jo omogoča okolje. Večino rastnih krivulij mikroorganizmov lahko z logistično enačbo zadovoljivo popišemo.

45 Stacionarna faza V fazi zaustavljanja rasti se velikost celic zmanjšuje. V tej fazi rast in delitev celic nista sklopljena procesa. Celice se delijo tudi potem, ko je prenehala rast, zaradi česar dobimo več manjših celic. Razlogi zakaj pride do prehoda v stacionarno fazo: poraba hranil zniževanje koncentracije kisika pomankanje prostora akumulacija toksičnih produktov

46 Metabolne spremembe stradajočih celic znižan pretok snovi skozi metabolne poti večina energije se porabi za vzdrževalni metabolizem celica vzdržuje adenilatni naboj celice celica vzdržuje protonski gradient spremeni se razmerje med ph in ψ zmanjša se stabilnost RNA molekul del ribosomov dimerizira in postane neaktiven poveča se število mutacij

47 Faza propada Če v stresni situaciji odpovedo vsi obrambni mehanizmi potem nastopi celična smrt, do tega pride zaradi: dramatičnega znižanja energijskega naboja celice dramatičnega znižanja protonskega gradienta kompletne razgradnje kromosomov Zakaj, kljub stresnim razmeram velikokrat propade samo del populacije? asinhronizacija celičnih ciklov v populaciji celic (npr. faza stradanja nastopi v različnih fazah celičnega cikla, ki so različno dovzetne za stres) proces odmiranja celic je stohastičen

48 Kemostat medij X=0; S=Sr; F mikrobna kultura X; S; F V kemostatu imamo stalno mešanja biomase in substrata. Substrat kontinuirano dodajamo kulturi. Po drugi strani pa kulturo in gojišče kontinuirano z istim pretokom odvajamo iz kemostata. Zaradi tega se volumen tekočine v kemostatu ne spreminja.

49 Kontrola mikrobne rasti Rast je limitirana s pomankanjem hranil ali neugodnimi fizikalnokemijskimimi pogoji. Velikokrat je potrebno rast prekiniti predno hranila zmanjkajo ali so razmere za rast neugodne. Kontrolo lahko izvajamo z: -dekontaminacijo - dezinfekcijo - sterilizacijo

50 Dekontaminacija Dekontaminacijski postopki zmanjšujejo obremenjenost okolja z mikroorganizmi. Pri dekontaminaciji ne uničimo vseh mikroorganizmov. Dekontaminacijski postpoki so v veliki meri socialno in kulturno pogojeni. Med te postopke spadajo: -umivanje - čiščenje - odstranjevanje ostankov hrane in zemlje

51 Dezinfekcija - razkuževanje Dezinfekcija je postopek uničenja večine patogenih mikroorganizmov. Z dezinfekcijo ne uničimo vseh mikroorganizmov. Dezinfekcijska sredstva delimo na: -antiseptike(lahko uporabljamo na živalih, rastlinah in človeku) -dezinfektante(uporabljamo na neživih objektih)

52 Antiseptična sredstva antiseptik detergenti fenoli alkoholi gvanidini peroksid klor jod perocetna k. glutaraldehid način delovanja topijo membrane topijo membrane, denaturirajo proteine topijo membrane, denaturirajo proteine topijo membrane oksidant oksidant oksidant, jodira tirozin oksidant alkilirajoče sredstvo

53 Dezinfekcijska sredstva v industriji industrija spojina uporaba papirna živo srebro, fenol med proizvodnjo usnjarska težke kovine, fenol v produktu plastika detergenti v vodni raztopini plastike tekstilna težke kovine, fenoli razpad tekstila lesna fenoli propad lesa metalurška detergenti v emulzijah petrokemična živo srebro, fenoli med pridobivanjem in hranjenjem elektro klor v hladilnih stolpih jedrska klor v reaktorjih

54 Pasterizacija Pastrizacija zmanjša število mikroorganizmov v hrani, ki je občutljiva na obdelavo z visokimi temperaturami. Pasterizacija ni sterilizacija. Npr. mleko pasteriziramo zato, da ubijemo patogene organizme kot so bakterije, ki povzročajo tuberkulozo, brucelozo, Q mrzlico, tifoidno mrzlico in enterobakterije. Pasteriziramo tako, da mleko segrejemo na 71 o C za 15 sek ali pa na 63 o C za 30 min.

55 UV- razkuževanje UV povzroči nastanek pirimidinskih dimerov (mutacije) ne prodira globoko, uporabno za razkuževanje delovnih površin, operacijskih dvoran, prostorov za hranjenje sterilnega materiala UV luči so lahko prižgane samo takrat, ko v prostoru ni ljudi

56 Sterilizacija Sterilzacija pomeni uničenje živosti in je absoluten pojem. Enkrat sterilno vedno sterilno seveda, če ne pride do kontaminacije. Poznamo več vrst sterilizacije: toplotna kemijska radiacijska filtracija

57 Toplotna sterilizacija

58 Autoklaviranje sterlizacija z vlažno toploto Standardno avtoklaviranje: tlak 1.2 atm temperatura 121 o C čas 15 min Kontrola uspešnosti: - Bacillus subtilis - B. stearothermophilus

59 Sterilizacija s suho toploto S suho toploto povečamo oksidacijo (skrajna oblika je sežig). Pri 180 o C je potrebno sterilizirati vsaj 30 min. Uporabna za sterilizacijo, kovinskih instrumentov, olj, praškov in steklovine. Posebna oblika sterilizacije s toploto je žarjenje cepilnih zank, konic pincet in igel.

60 Sterilizacija z elektromagnetnim valovanjem Za strerilizacijo uporabljamo: mikrovalove, X-žarke, γ-žarke in vir elektronov. Mehanizem delovanja je različen. Največkrat za sterilizacijske namene uporabljamo radioizotope 60 Co in 137 Cs. Radiacijsko sterilizacijo uporabljamo za sterilizacijo toplotno občutljivih snovi kot so medicinska oprema, zdravila, tkiva in hrana, predvsem meso in mesni izdelki.

61 Filtracija Za sterilizacijske namene so uporabni filtri s premerom por 0.2 µm. Ločimo več vrst filtrov: globinski filtri (azbest, papir, steklena vlakna) membranski filtri (polimeri acetat celuloze ali nitrat celuloze) nukeoporni filtri (polikarbonatni filtri) Filtriramo lahko s pomočjo siringe ali vakumske črpalke.

62 Plinska sterilizacija Uporabljamo predvsem: - etilenoksid (alkiliranje sulfhidridnih, amino, karboksi in hidroksi skupin) - formaldehid (podoben učinek kot etilenoksid) Uporabljamo za sterilizacijo plastičnih snovi.

63 Kemijska kontrola rasti bakteriostatik bakteriocid bakteriolitik

64 Sintetična kemoterapevtska sredstava Sintetična kemoterapevtska sredstva so predvsem analogi rastnih faktorjev, ki inhibirajo rast. Pomembni analogi: - sulfa spojine - analogi purinov in primidinov - analogi aminokislin - analogi vitaminov folna kislina - quinuloni (preprečitev supernavitja DNA)

65 Analogi rastnih faktorjev V večini primerov so rastni faktorji bromirani ali fluorirani. Struktura rastnega faktorja se zaradi dodatka ne spremeni znatno, tako da spojino encim še vedno prepozna, spremeni pa se encimska aktivnost.

66 Določanje protimikrobne aktivnosti Najbolj običajni metodi biološkega testiranja protimikrobnih aktivnosti sta: določanje minimalne inhibitorne koncentracije, MIC difuzijska metoda z diski na predhodno inokuliranem agariziranem gojišču

67 Alexander Fleming ( ) Nadaljuje Erlichovo delo na kemoterapevtikih. Prvi uspešno aplicira kemoterapevtik. Okrije lizocim po srečnem naključju okrije, da plesen Penicillium notatum zaustavi rast stafilokokov. Po začetnem navdušenju, zaradi težav z izolacijo penicilina, delo na antibiotikih zastane do II. svetovne vojne. Za svoje delo 1945 dobi Nobelovo nagrado.

68 Delovanje protibakterijskih terapevtskih sredstev na celičnem nivoju

69 Lastnosti klinično uporabnih antibiotikov ne smejo biti toksični in imeti stranskih učinkov ne smejo povzročati alergijskih reakcij ne smejo uničiti nativne flore (selektivnost) priti morajo do meste infekcije biti morajo kemijsko stabilni (dolga razpolovna doba) ne sme priti do hitre rezistence

70 Antibiotiki, ki delujejo na sintezo celične stene Inhibirajo sintezo bakterijskega peptidoglikana in so zato visokospecifični za bakterijske celice. Predvsem uporabni pri G+ bakterijah. Ločimo: - β laktamske antibiotike - polipeptidne antibiotike - aminokislinski analogi - glikolipidnu antibiotiki

71 β-laktamski antibiotiki Imajo beta laktamske obroče in se vežejo ter blokirajo transpeptidazo. So baktericidni in delujejo le na rastoče celice. Izzovejo preobčutljivostne reakcije. Beta laktamaza jim uniči delovanje. Predstavniki: penicilin G, penicilin V, meticilin, oksacilin, nafcilin, amoksicilin, bakampicilin, karboksipenicilin, tikarcilin, temocilin, mezlocilin, azlocilin, piperacilin, amoksiciklin, ampicilin, cefalosporin, karbapenam, monobaktram, imipenem, cefaklor, aztreonam.

72 β-laktamski antibiotiki

73 Generacije penicilinov Prva generacija (naravni, penicilin G, penicilin V) Delovanje: streptokoki, večina anaerobov v usni votlini; Treponema pallidum, Clostridium, nepenicilazni stafilokoki, večina Neisseria and Bacteroides sp. razen B. fragilis), Listeria in Pasteurella multocida. Druga generacija (semi-naravni, ampicilin, amoksicilin) Delovanje: širši spekter proti G- bakterijam E. coli, P. mirabilis in H. Influenzae glavni antibiotik za Listeria. Neučinkoviti proti penicilazam Tretja generacija (semi-naravni, karbenicilin, tikarcilin) Delovanje:povečano delovanje proti P. aeruginosa, Enterobacter sp., Morganella morgagni and Proteus sp. Neučinkoviti proti penicilazam, manj učinkoviti proti enterokokom kot druga generacija. Četrta generacija (semi-sintetični, azlocilin, mezlocilin) Delovanje: širši spekter kot 3. Generacija, bolj učinkoviti proti enterokokom, bolj

74 Polipeptidni antibiotiki Preprečijo sproščanje osnovne peptidoglikanske enote iz lipidnega prenašalca baktoprenola in sintezo tehoične kisline. Uporabni za lokalno zdravljenje, zelo toksični. Predstavnik: bacitracin.

75 Aminokislinski analogi cikloserin je podoben D-alaninu in prepreči racemazno reakcijo, ki konvertira L-alanin v D-alanin, ccikloserin se ~ 100 močneje veže na encim kot D-alanin podoben je dipeptidu D-alanil-D-alanin in prepreči transpeptidacijo, v celico pride z aktivnim prenosom za glicin, je zelo toksičen.

76 Glikopeptidi Inhibirajo tako transglikozilacijo (nastanek glikanske verige) kot transpeptidacijo (zamreženje). Vežejo se na osnovno peptidoglikansko enoto, ko le ta zapušča citoplazmo in tako preprečijo vezavo v aktivno mesto encima. Niso učinkoviti za G-, ker ne morejo prečkati zunanje membrane. Predstavniki: vankomicin, teikoplanin

77 Antibiotiki, ki inhibirajo sintezo proteinov Ti antibiotiki blokirajo sintezo proteinov na ribosomu in imajo visoko specifičnost za 30S ali 50S podenoto ribosoma. Predvsem uporabni pri G- bakterijah. Ločimo: - aminoglikozide - tetraciklini - derivati benzena - makrolidi tetraciklini - piranozidi - fucidinska kislina

78 Mesto inhibicije proteinske sinteze inicijacija, vezava prve t-rna na P mesto aminoglikozidi vezava druge t-rna na A mesto nastanek prve peptidne vezi prenos peptida na P mesto 50S vezava nove t-rna na A mesto nastanek peptidne vezi tetraciklinii kloramfenikoli piranozidii makrolidi terminacija fucidinska kislina

79 Antibiotiki, ki inhibirajo sintezo nukleinskih kislin Antibiotiki delujejo tako, da preprečijo sintezo nukleinskih kislin oziroma njihov prepis. Delujejo na: sintezo folne kisline (npr. sulfonamidi, trimoetoprim, kortimoksazol) DNA-girazo (npr. norfloksacin, enoksacin, pefloksacin, ciprofloksacin, ofloksacin) RNA-polimerazo vezava na beta podenoto RNA polimeraze, kar onemogoča vezavo nukleotidov in s tem sintezo RNA (npr. rimfampicin)

80 Antibiotiki, ki blokirajo delovanje membrane Ti antibiotiki razrušijo membransko strukturo. Hitro in učinkovito uničijo celico. Zaradi podobne sestave sestave prokariontskih in evkariontskih membran niso visoko specifični. Klinično uporaben je polimiksin, ki se veže na fosfolipide.

81 Mikroorganizmi, ki producirajo antibiotike Organizmi, ki producirajo antibiotike živijo predvsem v tleh, delajo spore in so neobčutljivi na delovanje lastnega antibiotika. Fiziološka vloga antibiotikov ni popolnoma poznana. Pomembnejši producenti: Penicillium in Cephalosporium producirata β-laktame Streptomyces producira tetracikline, aminoglikozide, makrolide, klarmfenikol, rifamicin in večino ostalih klinično uporabnih antibiotikov Bacillus producira polipeptidne antibiotike

82 Mehanizmi rezistence na antibiotike Mehanizmi rezistence na antibiotike so vezani na mutacijo kromosomske DNA oziroma na prisotnost plazmidne DNA. Rezistenčni mehanizmi: zmanjšana permeabilnost za antibiotik inaktivacija antibiotika (penicilinaze) modifikacija antibiotika (metilaze, acetilaze, fosforilaze) sprememba tarčne molekule (RNA polimeraze, ribosomov ali DNA giraze) sprememba metabolnih poti (npr. namesto sinteze folne kisline, njen vnos) aktiven iznos antibiotika odsotnost strukture (npr. mikoplazme nimajo celične stene)

83 Rezistenca na antibiotike Ali bomo zapravili to luksuzno dobrino, ki nam je skupaj z vakcinacijo podaljšla življenje v povprečju za 20 let???

84 Bakterocini Bakterocini so molekule, ki inhibirajo oziroma ubijejo sorodne vrste ali sorodne seve. Zaradi specifičnega delovanja na sorodne vrste se ločijo od antibiotikov, ki so neselektivni. Bakterocine poimenujemo glede na bakterije, ki jih proizvajajo, npr. Escherichia coli proizvaja kolicin, Bacillus subtilis proizvaja subtilizin, Staphylococcus gallinarum proizvaja galidermin, Lactobacilus johnsonii proizvaja laktacin, Pediococcus acidilactici proizvaja pediocin, Lactobacilus sake proizvaja sakacin, možne pa so tudi izjeme.

85 Delovanje bakterocinov Kolicini in mikrocini lahko: formirajo pore v membrani (npr. kolicin V) cepijo nukleinsko kislino (npr. kolicin E9) inhibirajo lipidne prenašalce (npr. kolicin M), inhibirajo DNA girazo (npr. mikrocin B17) inhibirajo celično delitev (npr. mikrocin 25) inhibirajo proteinsko sintezo (npr. mikrocin C7) Kolicini se običajno vežejo na receptorje, ki jih celica potrebuje za normalno funkcioniranje, npr. transport nutrientov.

86 Posttranslacijske modifikacije bakteriocinov procesiranje pre-epidermin I A S K F I C T C A K T G S F N S Y C C P G 30 a.k. I A dehidracija, EpiB, EpiC, EpiD, dekarboksilacija, EpiP procesiranje K F S S I da da B da A K U G da F N da Y da P G S S NH epidermin Bakterocini so običajno postranslacijsko modificirani.

87 Kontrola glivičnih okužb inhibicija ergosterolne sinteze: inhibirana citokromska P450 zmanjša koverzijo iz 14-α-metilsterola v ergosterol, kar povzroči spremembo v fluidnosti in funkcioniranju membrane, vpliv na sintezo sterolov gostitelja (npr. spremenjena sinteza testosterona), inhibicija transformacije blastospor Candide albicans v invazivno micelarno obliko spremenjeno delovanje membrane: predvsem sredstva z z visoko afiniteto za membrane z ergosterolom, povečana prepustnost za K + in Mg 2+, smrt celice, rezistenca redka

88 Kontrola glivičnih okužb delovanje na niti delitvenega vretena: vezava na mikrotubule mitotičnega delitvenega vretena, kar vodi do zaustavljanja delitve, zato ne pride do invazije in gliva odpade skupaj z odmrlo kožo, dolge terapije od 3 tednov (koža) do 4 mesecev (nohti) inhibicija sinteze celične stene: inhibicija sinteze hitina, inhibicija sinteze 1,3-β- D-gluikana inhibicija sinteze nukleinskih kislin: nukleinski analogi, preprečijo sintezo timina

89 Antivirusna kemoterapija Nukleozidni analogi: aciklovir, ganciklovir in trifluridin blokirajo virusno polimerazo; didanosin, lamivudin in zidovudin blokirajo reverzno transkripcijo; ribaravin blokira sintezo virusne RNA Sintetični amini: amantadin, blokira razstavljanje virusnega plašča Pirofosfatni analogi: fosfonoformična kislina, blokira virusno polimerazo RNA polimerazni inhibitorji: rifamicin, blokira RNA polimerazo Retrovirusni proteazni inhibitorji: indinavir, blokira cepitev polipeptidov Interferoni: inducirajo proteine, ki inhibirajo virusno replikacijo

90 Antiprionska kemoterapija Še v povojih! Material, ki je prišel v stik s prioni je potrebno dekontaminirati z: - 1-urnim avtoklaviranjem pri 134 o C - 1 urnim namakanjem v 1N NaOH - 2 urnim namakanjem v 0.5 % natrijevem hipokloritu

91 Razvoj novih protimikrobnih sredstev Razvoj novega antimikrobnega sredstva za medicinske potrebe traja od let. Stroški razvoja novega sredstva od izuma do postavitve na trg so astronomski (~ USD). Ker so stroški postavitve novega zdravila prohibitivno visoki je na tržišču čedalje manj novih antiinfekcijskih sredstev. Leta 1992 je FDA agencija odobrila 20 novih sredstev leta 2002 pa le enega.

92