Μοριακή Βιοτεχνολογία και Διατροφή

Transcript

1 ΔΗΜΟΚΡΙΣΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗ ΣΜΗΜΑ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΓΕΝΕΣΙΚΗ Μοριακή Βιοτεχνολογία και Διατροφή Δρ. Α. ΓΑΛΑΝΗ

2 Μοριακζσ τεχνικζσ με εφαρμογή ςτη Βιοτεχνολογία τροφίμων

3 Επιζήμανζη ηποθίμων Γενικέρ διαηάξειρ επιζήμανζηρ ηποθίμων Η βαζηθή νομοζεηηθή ππάξε πος πςζμίδεη ζέμαηα επηζήμανζερ, παποςζίαζερ θαη δηαθήμηζερ ηων ηποθίμων είναη ε Οδεγία 2000/13/ΕΚ.

4

5

6

7

8

9 Ειδικέρ διαηάξειρ επιζήμανζηρ ηποθίμων Αλλεργιογόνα ςυςτατικά Η Οδθγία 2003/89/EΚ, θ οποία τροποποιεί τθν Οδθγία 2000/13/EΚ, παρακζτει ζναν κατάλογο αλλεργιογόνων ςυςτατικϊν, τα οποία όταν χρθςιμοποιοφνται ςτα προςυςκευαςμζνα τρόφιμα οφείλουν υποχρεωτικά να αναγράφονται ςτθν επιςιμανςθ των τροφίμων, κακϊσ κεωρείται ότι ενδζχεται να προκαλζςουν αλλεργίεσ ςε ευαίςκθτεσ ομάδεσ πλθκυςμοφ ι ευπακι άτομα. Πρόςθετα Οδθγία 94/54/ΕΚ τθσ Επιτροπισ ςχετικά με τθν αναγραφι, ςτθν επιςιμανςθ οριςμζνων τροφίμων, υποχρεωτικϊν ενδείξεων πζραν των προβλεπόμενων από τθν οδθγία 79/112/ΕΟΚ του Συμβουλίου. Τελευταία τροποποίθςθ ζγινε με τθν : Οδθγία 2004/77/ΕΚ τθσ Επιτροπισ, για τθν τροποποίθςθ τθσ οδθγίασ 94/54/EΚ ςχετικά με τθν επιςιμανςθ οριςμζνων τροφίμων που περιζχουν γλυκυρριηικό οξφ και το μετά αμμωνίου άλασ του.

10 Διατροφική επιςήμανςη Οδθγία 2008/100/ΕΚ τθσ Επιτροπισ, για τθν τροποποίθςθ τθσ οδθγίασ 90/496/ΕΟΚ του Συμβουλίου ςχετικά με τουσ κανόνεσ τθσ διατροφικισ επιςιμανςθσ των τροφίμων, όςον αφορά τισ ςυνιςτϊμενεσ θμεριςιεσ τροφικζσ δόςεισ, τουσ ςυντελεςτζσ μετατροπισ ςε ενεργειακι αξία και τουσ οριςμοφσ. Οδθγία 90/496/ΕΟΚ του Συμβουλίου, ςχετικά με τουσ κανόνεσ επιςιμανςθσ των τροφίμων όςον αφορά τισ τροφικζσ τουσ ιδιότθτεσ. Αναγραφή ποςοςτοφ ενόσ ςυςτατικοφ (Quantitative Ingredient declaration, QUID) Βόειο κρζασ Σρόφιμα που περιζχουν κινίνη ή / και καφεΐνη Κακάο - οκολάτα Αναγνώριςη Παρτίδασ Δηλοφμενο βάροσ προςυςκευαςμζνων τροφίμων

11 Οι καταναλωτζσ ςε όλθ τθν Ευρωπαϊκι Ένωςθ ζχουν ςτθ διάκεςι τουσ μια ολοζνα αυξανόμενθ ποικιλία τροφίμων, κυρίωσ ςε ό,τι αφορά βιομθχανικά επεξεργαςμζνα και προπαραςκευαςμζνα προϊόντα. Επομζνωσ, κακίςταται ολοζνα και πιο δφςκολο να κάνει κάποιοσ υγιεινζσ επιλογζσ, οι οποίεσ βαςίηονται ςε ορκι ενθμζρωςθ, τθ ςτιγμι που βρίςκεται ςτουσ διαδρόμουσ των ςουπερμάρκετ. Η επιςιμανςθ των τροφίμων ίςωσ είναι ζνασ γριγοροσ οδθγόσ ενθμζρωςθσ των καταναλωτϊν ςε ςχζςθ με το κρεπτικό περιεχόμενο διαφόρων προϊόντων. Παρ όλα αυτά, θ ςθμερινι χριςθ τουσ και τα πραγματικά αποτελζςματα που ζχουν ςτθ διαμόρφωςθ των τελικϊν επιλογϊν που φτάνουν ςτο καλάκι του ςουπερμάρκετ, παραμζνουν άγνωςτα. Επιπλζον, οι διαφορετικοί τρόποι ενθμζρωςθσ των καταναλωτϊν (πίνακεσ διατροφισ, θ «ςιμανςθ των φαναριϊν», οι Ενδεικτικζσ Ημεριςιεσ Προςλιψεισ (GDA), λογότυπα που αφοροφν τθν υγεία, κ.ά.) μποροφν να επιφζρουν διαφορετικά αποτελζςματα.

12 Για να αναφερκοφμε λεπτομερϊσ ςτισ δυνατότθτεσ τθσ επιςιμανςθσ τροφίμων ωσ χριςιμθσ πθγισ διατροφικισ ενθμζρωςθσ, το μικρό ςυλλογικό πρόγραμμα FLABEL κα εξετάςει τουσ διαφορετικοφσ παράγοντεσ, οι οποίοι οδθγοφν από τθ διακεςιμότθτα των ετικετϊν ςτισ επιδράςεισ ςτθ διατροφικι πρόςλθψθ. Το FLABEL χρθματοδοτείται από το 7 ο ευρωπαϊκό κοινοτικό πλαίςιο. Το πρόγραμμα FLABEL είναι μία ερευνθτικι κοινοπραξία, ςτθν οποία ςυμμετζχουν 12 ςυνεργάτεσ (ακαδθμαϊκοί, μθ κυβερνθτικζσ οργανϊςεισ, πωλθτζσ λιανικισ) από 8 διαφορετικζσ Ευρωπαϊκζσ χϊρεσ, και το οποίο ςυγκεντρϊνει εξειδικευμζνεσ γνϊςεισ γφρω από τουσ τομείσ τθσ διατροφισ, τθσ ςυμπεριφοράσ του καταναλωτι, των οικονομικϊν και τθσ ζρευνασ αγοράσ.

13 Ξεκινϊντασ με τθν αξιολόγθςθ τθσ ιςχφουςασ πρακτικισ που εφαρμόηεται για τθ διατροφικι επιςιμανςθ ςτθν Ευρωπαϊκι Ένωςθ (27) και τθν Τουρκία, το FLABEL ςυγκεκριμζνα ςτοχεφει να ανακαλφψει αν οι διατροφικζσ πλθροφορίεσ επθρεάηουν τουσ καταναλωτζσ ςτθν επιλογι των τροφίμων, πόςο δυνατι είναι αυτι θ επιρροι, υπό ποιεσ ςυνκικεσ εμφανίηεται, ποιοι παράγοντεσ είναι υπεφκυνοι για τθν εμφάνιςι τθσ, κακϊσ και αν το αποτζλεςμα διαφζρει ανάμεςα ςε διάφορεσ ομάδεσ καταναλωτϊν.

14

15 το πλαίςιο αυτό, οι ςτρατηγικοί ςτόχοι του προγράμματοσ είναι οι εξήσ: Να κακοριςτεί πϊσ οι διατροφικζσ πλθροφορίεσ που υπάρχουν ςτισ ετικζτεσ των τροφίμων επθρεάηουν τισ διατροφικζσ επιλογζσ, τισ ςυνικειεσ των καταναλωτϊν και άλλα κζματα υγείασ που ςχετίηονται με το φαγθτό, αναπτφςςοντασ και εφαρμόηοντασ ζνα ενιαίο ερμθνευτικό πλαίςιο, που κα ενςωματϊνει τόςο τισ πλθροφορίεσ τθσ ετικζτασ όςο και άλλουσ παράγοντεσ. Να παρζχει τισ επιςτθμονικζσ βάςεισ για τθ χριςθ των διατροφικϊν πλθροφοριϊν που υπάρχουν ςτισ ετικζτεσ τροφίμων, ςυμπεριλαμβανομζνων των επιςτθμονικϊν αρχϊν για τθν αξιολόγθςθ τθσ επιρροισ των διαφορετικϊν ςυςτθμάτων επιςιμανςθσ, με ςτόχο να χρθςιμοποιθκοφν από κοινοφ από ιδρφματα τθσ Ευρωπαϊκισ Ένωςθσ, από βιομθχανίεσ τροφίμων, κυρίωσ από μικρζσ και μεςαίου μεγζκουσ επιχειριςεισ, κακϊσ και από άλλα ενδιαφερόμενα μζρθ (stakeholders).

16 Σα αποτελζςματα Ένασ ευρωπαϊκόσ χάρτθσ με τισ διατροφικζσ πλθροφορίεσ που υπάρχουν ςτισ ετικζτεσ τροφίμων ςε όλεσ τισ χϊρεσ τθσ Ευρωπαϊκισ Ένωςθσ, ο οποίοσ κα δείχνει ςε ποιον βακμό υπάρχει ςιμερα διακρεπτικι επιςιμανςθ ςτισ ςυςκευαςίεσ ςε διαφορετικά μζρθ τθσ Ένωςθσ. Πλθροφορίεσ ςχετικά με το πϊσ ακριβϊσ οι καταναλωτζσ κατανοοφν και διαβάηουν τισ ετικζτεσ τροφίμων, ποιεσ είναι οι πιο ελκυςτικζσ και ενθμερωτικζσ ετικζτεσ, και ποιοσ είναι ο καλφτεροσ τρόποσ για να επιτευχκεί μία ιςορροπία ανάμεςα ςτθν παροχι απλϊν αλλά και άρτιων διατροφικϊν πλθροφοριϊν, διευκολφνοντασ κατά αυτόν τον τρόπο μια ελεφκερθ και ενθμερωμζνθ επιλογι. Πλθροφορίεσ για τον τρόπο χριςθ τθσ ετικζτασ τροφίμων ςτθν κακθμερινι πρακτικι. Αυτό κα βαςιςτεί ςε παρατθριςεισ μζςα ςτα καταςτιματα πϊλθςθσ και ςε δεδομζνα που προκφπτουν από τα μθχανιματα ςάρωςθσ ςε καταςτιματα λιανικισ πϊλθςθσ, καταλιγοντασ ςε πλθροφορίεσ ςχετικά με το πϊσ οι διατροφικζσ ετικζτεσ μποροφν να διαμορφϊςουν και να επθρεάςουν τισ καταναλωτικζσ τάςεισ.

17 Σα αποτελζςματα Στοιχεία ςε ςχζςθ με το πϊσ οι καταναλωτζσ διαμορφϊνουν απόψεισ για το πόςο υγιεινά είναι τα προϊόντα και πϊσ οι διατροφικζσ πλθροφορίεσ που υπάρχουν ςτισ ετικζτεσ αλλθλεπιδροφν με άλλεσ πλθροφορίεσ που εμπλζκονται ςε αυτι τθ διαδικαςία, ςυμπεριλαμβανομζνων των μζςων μαηικισ ενθμζρωςθσ, τθσ διαφιμιςθσ και τθσ ςχολικισ εκπαίδευςθσ. Στοιχεία ςε ςχζςθ με το πϊσ οι ετικζτεσ τροφίμων μποροφν να επθρεάςουν κετικά τθ διατροφικι πρόςλθψθ των παιδιϊν, βάςει του ρόλου που παίηουν οι διατροφικζσ πλθροφορίεσ ςτισ αποφάςεισ που λαμβάνονται ςχετικά με τα τρόφιμα από τισ οικογζνειεσ με παιδιά. Επιςτθμονικά τεκμθριωμζνεσ προτάςεισ βζλτιςτων πρακτικϊν διατροφικισ ςιμανςθσ, οι οποίεσ ζχουν δοκιμαςτεί ςε πραγματικζσ ςυνκικεσ. Ένα ςφνολο βζλτιςτων πρακτικϊν για τθν αξιολόγθςθ τθσ επίδραςθσ τθσ διατροφικισ επιςιμανςθσ ςτθν επιλογι προϊόντων από τουσ καταναλωτζσ.

18 Μοριακζσ τεχνικζσ με εφαρμογή ςτη Βιοτεχνολογία τροφίμων

19 Σε αντίκεςθ με τισ προχπάρχουςεσ κλαςικζσ μικροβιολογικζσ τεχνικζσ που βαςίηονται κυρίωσ ςτθ φαινοτυπικι καταγραφι και παρατιρθςθ, με αποτζλεςμα τθ περιοριςμζνθ διακριτικι ικανότθτα, οι μοριακζσ τεχνικζσ ςτθρίηονται ςτθ γονοτυπικι ανάλυςθ των μικροοργανιςμϊν. Πιο ςυγκεκριμζνα, πραγματοποιοφνται μελζτθ και χαρακτθριςμόσ των γενετικϊν δεικτϊν των μικροοργανιςμϊν μζςω κατάλλθλθσ επεξεργαςίασ του γενετικοφ τουσ υλικοφ (DNA). Μια από τισ πιο αποτελεςματικζσ και αξιόπιςτεσ τεχνικζσ είναι θ δοκιμι τθσ Πολλαπλισ Αλυςιδωτισ Αντίδραςθ Πολυμεράςθσ (Μultiplex Polymerase Chain Reaction MPCR).

20 Η PCR πραγματικοφ χρόνου (Real-Time PCR) επίςθσ αποτελεί μια πολφ ιςχυρι μοριακι τεχνικι ανίχνευςθσ μικροοργανιςμϊν. Βαςίηεται ςτθ καταγραφι τθσ ενίςχυςθσ του DNAςτόχου ςε πραγματικό χρόνο με τθ χριςθ κατάλλθλθσ φκορίηουςασ χρωςτικισ. Έτςι, γίνεται άμεςθ καταγραφι του αποτελζςματοσ χωρίσ να απαιτείται περαιτζρω επεξεργαςία των προϊόντων τθσ αντίδραςθσ (διαχωριςμόσ ςε πικτωμα αγαρόηθσ). Παράλλθλα, το δυναμικό εφροσ διάγνωςθσ και θ ευαιςκθςία τθσ μεκόδου είναι υψθλότερα ενϊ τα ψευδϊσ κετικά αποτελζςματα που ενδεχομζνωσ να παρατθρθκοφν ςε ςχζςθ με τθ ςυμβατικι PCR είναι μειωμζνα κατά 99.9%. Η Real-Time PCR ζχει χρθςιμοποιθκεί για τθν μοριακι ταυτοποίθςθ και ποςοτικοποίθςθ των L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. delbrueckii, L. fermentum, L.plantarum και L. reuteri με χριςθ ανιχνευτϊν ειδικϊν για τμιμα του ριβοςωμικοφ γονιδίου 16S αυτϊν των ςτελεχϊν αλλά και με ανάλογο τρόπο για τθν ταυτοποίθςθ ςτελεχϊν L. acidophilus.

21 Στθ περίπτωςθ που το γονιδίωμα των μικροοργανιςμϊν που πρόκειται να μελετθκοφν δεν είναι γνωςτό μπορεί να χρθςιμοποιθκεί θ τεχνικι RAPD PCR (Τυχαία Ενίςχυςθ Πολυμορφικοφ DNA PCR ι Random Amplified Polymorphic DNA PCR). Σφμφωνα με τθν εν λόγω τεχνικι, θ αντίδραςθ PCR πραγματοποιείται με εκκινθτζσ τυχαίασ αλλθλουχίασ, μικουσ 8-12 βάςεων. Συνικωσ απαιτοφνται 3 με 6 αντιδράςεισ με διαφορετικοφσ εκκινθτζσ ϊςτε να προκφψει ζνα μοναδικό πρότυπο για κάκε εξεταηόμενο οργανιςμό, μετά το διαχωριςμό ςε πικτωμα αγαρόηθσ των προϊόντων τθσ αντίδραςθσ PCR. Στα πλεονεκτιματα τθσ μεκόδου περιλαμβάνονται θ υψθλι ακρίβεια τθσ ανάλυςθσ, ο χαμθλόσ χρόνοσ ολοκλιρωςθσ τθσ μελζτθσ κακϊσ και το ςχετικά χαμθλό κόςτοσ των αντιδραςτθρίων. H RAPD PCR ζχει χρθςιμοποιθκεί για τθν ανίχνευςθ και ταυτοποίθςθ διαφόρων λακτοβακίλων ςε καλλιζργειεσ γιαοφρτθσ κακϊσ και ςε άλλα προβιοτικά τρόφιμα.

22 Τζλοσ, οι DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - θλεκτροφόρθςθ πθκτϊματοσ ςε διαβάκμιςθ αποδιατακτικοφ παράγοντα) και TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis θλεκτροφόρθςθ πθκτϊματοσ ςε διαβάκμιςθ κερμοκραςίασ) είναι PCR βαςιηόμενεσ μοριακζσ τεχνικζσ που επιτρζπουν τθν ανάλυςθ και ταυτοποίθςθ βακτθριακϊν ςτελεχϊν ετερόλογων πλθκυςμϊν, χωρίσ να προαπαιτείται διαχωριςμόσ των μικροβιακϊν καλλιεργειϊν. Για παράδειγμα, θ τεχνικι DGGE ζχει με επιτυχία χρθςιμοποιθκεί για τθν ανίχνευςθ ςτελεχϊν L. delbrueckii subsp. bulgaricus και S. thermophilus ςε ανκρϊπινο εντερικό περιεχόμενο φςτερα από κατανάλωςθ προβιοτικισ γιαοφρτθσ, γεγονόσ ιδιαίτερα ςθμαντικό για τθν επιβεβαίωςθ τθσ δράςθ του προβιοτικοφ τροφίμου. Παρόμοιεσ μελζτεσ ζχουν αναφερκεί και για τθ χριςθ τθσ τεχνικισ TGGE.

23 Η δοκιμή τησ Πολλαπλήσ Αλυςιδωτήσ Αντίδραςη Πολυμεράςησ (Μultiplex Polymerase Chain Reaction MPCR) Αρχικά, γίνεται ςυγκριτικι μελζτθ τθσ αλλθλουχίασ ενόσ κακολικοφ γονιδίου με ςκοπό τθν ανίχνευςθ πολυμορφικϊν κζςεων, δθλαδι χαρακτθριςτικϊν για το ςτζλεχοσ προσ διερεφνθςθ γενετικϊν περιοχϊν. Στθ ςυνζχεια, βάςθ των πολυμορφικϊν αυτϊν κζςεων ςχεδιάηονται οι αντίςτοιχοι εκκινθτζσ για τθ δοκιμι ΜPCR. Παράλλθλα γίνεται απομόνωςθ γενετικοφ υλικοφ από τουσ μικροοργανιςμοφσ, το οποίο κα χρθςιμοποιθκεί ωσ μιτρα για τθν αντίδραςθ πολυμεριςμοφ. Η αντίδραςθ πραγματοποιείται ςε ειδικι ςυςκευι (κερμικόσ κυκλοποιθτισ) και το αποτζλεςμα μπορεί να γίνει γνωςτό ςε λιγότερο από μία ϊρα. Η ΜPCR χαρακτθρίηεται για τθ ταχφτθτα, τθν υψθλι επαναλθψιμότθτα και τθ διακριτικι ικανότθτα τθσ. Πρόςφατα, ζχει χρθςιμοποιθκεί για τθν ανίχνευςθ του L. casei ATCC 393 ςε καλλιζργειεσ προβιοτικϊν τροφίμων αλλά και ςε βιολογικά δείγματα.

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Ηλεκτροφόρηςη πηκτώματοσ διαβαθμιςμζνησ ςυγκζντρωςησ παράγοντα αποδιάταξησ) H DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Ηλεκτροφόρθςθ πθκτϊματοσ διαβακμιςμζνθσ ςυγκζντρωςθσ παράγοντα αποδιάταξθσ) είναι μια μοριακι τεχνικι ανίχνευςθσ πολυμορφιςμϊν τμθμάτων DNA. Η τεχνικι είναι ιδιαιτζρα ιςχυρι και αποτελεςματικι για τθν ανίχνευςθ μεταλλάξεων ςε γονίδια αλλά και ταυτοποίθςθ μικροοργανιςμϊν που παρουςιάηουν υψθλό βακμό ςυγγζνειασ. Η ανίχνευςθ πολυμορφιςμϊν τμθμάτων DNA είναι επίςθσ εφικτι με τθν αντίδραςθ PCR (polymerase chain reaction) (αλυςιδωτι αντίδραςθ πολυμεράςθσ) χρθςιμοποιϊντασ εξειδικευμζνουσ εκκινθτζσ. Στισ περιπτϊςεισ όμωσ που τα προϊόντα τθσ PCR είναι παρόμοιου μεγζκουσ, ο διαχωριςμόσ τουσ ςε πικτωμα αγαρόηθσ κακίςταται τεχνικά μθ εφικτόσ. Αντίκετα, ςτθν τεχνικι DGGE, ο διαχωριςμόσ των τμθμάτων DNA γίνεται ςε πικτωμα πολυακριλαμίδθσ διαβακμιςμζνθσ ςυγκζντρωςθσ αποδιατακτικοφ παράγοντα που κακιςτά το διαχωριςμό των τμθμάτων εφικτό.

35 Πιο ςυγκεκριμζνα ο διαχωριςμόσ αρχικά γίνεται βάςθ μεγζκουσ αλλά ςτθ ςυνζχεια με τθν αφξθςθ τθσ ςυγκζντρωςθσ του αποδιατακτικοφ παράγοντα του πθκτϊματοσ το δίκλωνο DNA μετατρζπεται ςε μονόκλωνο (αποδιατάςςεται) με αποτζλεςμα θ ταχφτθτα κίνθςθσ του ςτο πικτωμα πολυακριλαμίδθσ κατά τθν θλεκτροφόρθςθ να μειϊνεται. Έτςι ακόμα και δφο τμιματα DNA που διαφζρουν ςε μία μόνο βάςθ αποδιατάςςονται ςε διαφορετικι ςυγκζντρωςθ, κινοφνται διαφορετικά ςτο πικτωμα και τελικά διαχωρίηονται. Η τεχνικι DGGE ζχει χρθςιμοποιθκεί ςε πολλζσ μελζτεσ ςχετικζσ με τθ βιοτεχνολογία τροφίμων κακϊσ δίνει τθ δυνατότθτα πλιρουσ ταυτοποίθςθσ τθσ μικροβιακισ χλωρίδασ ςε δείγματα τροφίμων με μεγάλθ ακρίβεια και ταχφτθτα.

36

37

38

39

40

41

42

43

44 Στθ περίπτωςθ που το γονιδίωμα των μικροοργανιςμϊν που πρόκειται να μελετθκοφν δεν είναι γνωςτό μπορεί να χρθςιμοποιθκεί θ τεχνικι RAPD PCR (Τυχαία Ενίςχυςθ Πολυμορφικοφ DNA PCR ι Random Amplified Polymorphic DNA PCR). Σφμφωνα με τθν εν λόγω τεχνικι, θ αντίδραςθ PCR πραγματοποιείται με εκκινθτζσ τυχαίασ αλλθλουχίασ, μικουσ 8-12 βάςεων. Συνικωσ απαιτοφνται 3 με 6 αντιδράςεισ με διαφορετικοφσ εκκινθτζσ ϊςτε να προκφψει ζνα μοναδικό πρότυπο για κάκε εξεταηόμενο οργανιςμό, μετά το διαχωριςμό ςε πικτωμα αγαρόηθσ των προϊόντων τθσ αντίδραςθσ PCR. Στα πλεονεκτιματα τθσ μεκόδου περιλαμβάνονται θ υψθλι ακρίβεια τθσ ανάλυςθσ, ο χαμθλόσ χρόνοσ ολοκλιρωςθσ τθσ μελζτθσ κακϊσ και το ςχετικά χαμθλό κόςτοσ των αντιδραςτθρίων. H RAPD PCR ζχει χρθςιμοποιθκεί για τθν ανίχνευςθ και ταυτοποίθςθ διαφόρων λακτοβακίλων ςε καλλιζργειεσ γιαοφρτθσ κακϊσ και ςε άλλα προβιοτικά τρόφιμα.

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55