ايران به روشهاي اسپكتروفتومتري TLC و HPLC

Transcript

1 فصلنامه گياهان دارويي مطالعه و تعي ني فلاونوليگنانها در ميوههاي گياه خارمريم جمعآوري شده از نقاط مختلف ايران به روشهاي اسپكتروفتومتري TLC و HPLC طاهره حسنلو * رمضانعلي خاورينژاد اسلام مجيديهروان سيدعلي ضيايي محمدرضا شمساردكاني تاريخ تصويب: 8// - دانشجوي دكتري فيزيولوژي گياهي گروه زيستشناسي دانشكده علوم دانشگاه تربيت معلم تهران - استاد گروه زيست شناسي دانشكده علوم دانشگاه تربيت معلم تهران - استاد پژوهشي بخش فيزيولوژي پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي تهران - استاديار پژوهش گروه پژوهشي فارماكولوژي پژوهشكده گياهان دارويي جهاددانشگاهي تهران - دانشيار گروه فارماكوگنوزي دانشكده داروسازي دانشگاه علوم پزشكي تهران * آدرس مكاتبه: كرج ابتداي جاده ماهدشت پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي تلفن: (06) 706 نمابر: (06) 709 پست الكترونيك: thasanloo@yahoo.com چكيده مقدمه: سيليمارين تركيبي فلاونوييدي متشكل از نوع فلاونوليگنان مختلف است كه در ميوههاي رسيده گياه خارمريم وجود دارد. اين فلاونوليگنانها شامل سيليبين B,A ايزوسيليبين B,A سيليديانين سيليكريسيتين و تاكسيفولين ميباشند. سيليبين تركيب اصلي اين ماده است. سيليمارين داراي خواص آنتياكسيدانت ميباشد و به عنوان يك داروي موثر در درمان مسموميت كبدي شناخته شده است. هدف: جهت درك بهتر از مسير متابوليسمي و تاثير محيط رويش گياه بر تجمع سيليمارين ميوههاي رسيده اين گياه از نقاط مختلف كشور (شمال غرب و جنوب غرب) جمعآوري و ميزان سيليمارين اندازهگيري شد. روش تحقيق: دانههاي جمعآوري شده از مناطق مختلف ايران و با منشا مجارستان و همچنين دانههاي حاصل از كشت رقم مجاري در گلخانه در محل پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي تهيه شده و مقدار كمي و كيفي تركيبات فلاونوييدي پس از استخراج به سه روش اسپكتروفتومتري TLC و HPLC مورد بررسي قرار گرفت. يافتهها: مطابق روش اسپكتروفتومتري بالاترين مقدار تجمع سيليمارين مربوط به منطقه ولشت و سپس برازجان است. با انجام روش TLC و با مقايسه با نمونههاي استاندارد لكه مربوط به فلاونوليگنانهاي حاضر در سيليمارين در تمام مناطق شناسايي شد. مقدار كمي اين تركيبات به روش HPLC بررسي شد و نتايج نشان ميدهد كه بالاترين مقدار سيليمارين در دانههاي مربوط به منطقه برازجان تجمع دارد. در اين روش سيليبين A و B ايزوسيليبين A و B به راحتي از يكديگر جدا شده و قابل بررسي است. نتيجهگيري : بنابر ضرورت توليد تجاري اين گياه و ثبات فرمولاسيون دارويي آن نياز به ارزيابي وسيعتر و انتخاب ژنوتيپ برتر و خالصسازي آن جهت توليد صنعتي ميباشد. گلواژگان: فلاونوليگنان سيليبين سيليمارين خارمريم سال چهارم ويژهنامة گياه خارمريم زمستان 8

2 مطالعه و تعيين مقدار سيليمارين در... مقدمه خار مريم گياهي يك يا دو ساله از خانواده كاسني داراي ريشه ضخيم و ساقهاي منشعب با ارتفاع 0/8 تا / متر است. ساقه گياه كركي و به رنگ قهوهاي كمرنگ ميباشد. برگ آن براق دندانهدار با رگبرگهاي سفيد با خارهاي نوك تيز است. گل داراي كاپيتولهاي درشت منفرد و شامل گلهاي لولهاي و ارغواني رنگ است. ميوه فندقه صاف به رنگ قهوهاي و در انتهاي آن تارهايي به نام پاپوس وجود دارد. ميوههاي آن داراي فلاونوليگنانهايي است كه به عنوان داروي محافظ كبدي مورد استفاده قرار گرفته است []. اين تركيبات شامل سيليبين (سيليبين A و B ايزوسيليبين A و B) 6 سيليكريستين سيليديانين و تاكسيفولين ميباشند كه مجموعا سيليمارين ناميده ميشود [ ]. اين گياه در كشورهاي امريكايي در مناطق معتدل استراليا و مناطقي با آب و هواي مديترانهاي رويش مييابد []. خار مريم در نواحي مختلفي از ايران نيز رشد ميكند. اين ماده سبب تغيير ساختمان سطح غشاي سلولهاي كبدي ميشود و با اثرات ضد اكسيداسيوني به عنوان يك آنتياكسيدانت عمل ميكند [ ]. در سال 977 بيكر و همكاران به مطالعه فلاونوييدهاي اين گياه پرداخته و موفق به جداسازي و مطالعه اين فلاونوييدها شدند []. تايتل و همكاران نيز در 977 به مطالعه اين فلاونوييدها از طريق HPLC پرداختند [6]. وگنر و همكاران در 97 و 968 مطالعه و آناليز سيليمارين در اين گياه را انجام دادند [7 8]. در سالهاي اخير مطالعات زيادي در مورد نحوه عمل داروي سيليمارين در موش و انسان انجام شده است [9 0]. مطالعات زيادي نشان داده كه سيليبين تركيب اصلي ماده سيليمارين ميباشد اگر چه سيليديانين و سيليكريستين نيز داراي خواص آنتياكسيدان هستند [ ]. نتايج مطالعات نشان ميدهد كه سيليمارين اگر به صورت تركيبي از سيليبين به همراه تركيبات سيليديانين و سيليكريستين باشد نسبت به زمانيكه به تنهايي مورد استفاده قرار ميگيرد داراي اثرات بيشتري است [ ]. گرچه در گذشته متابوليتهاي ثانويه گياهي را تنها به عنوان تركيباتي شيميايي تعريف ميكردند كه در مراحل بيوشيميايي سلول زنده و ساختار و حفاظت سلولهاي گياهي وارد نميشود. تحقيقات اخير نشان داده است كه اين تركيبات داراي نقشهاي اساسي در گياه خصوصا اكوفيزيولوژي آن هستند []. گياهان قادر هستند به گستره وسيعي از محركهاي محيطي پاسخ دهند و بسياري از اين پاسخها مربوط به فعالسازي ژنهاي كد كننده پروتي ين با اعمال حفاظتي و به ويژه پاسخ ژني به محركهاي خاص ميباشد. امروزه پذيرفته شده است كه يك برهم كنش دروني بين گياهان و محيطشان و متابوليتهاي ثانويه خاص آن گونه وجود دارد كه در اين برهم كنش داراي نقشهاي كليدي ميباشند [9]. متابوليتهاي ثانويه ميتوانند به عنوان تركيبات سيگنالي در نمو گياهي نيز شركت كنند [6]. در مطالعات تنوع شيميايي علاوه بر جمعآوري و تجزيه و تحليل تودههاي گياهي مربوط لااقل فاكتور عمده را بايد بررسي نمود -تنوع ژنتيكي - تنوع آنتوژنتيك و مورفولوژيك - تغييرات حاصل از اثرات محيط. از آنجا كه شرايط محيطي محل رويش و نيز نوع گياه از عواملي هستند كه در كيفيت و كميت تركيبات ثانويه موجود در گياهان دارويي تاثير دارند و با توجه به مصرف دارويي گسترده اين گياه و همچنين فقدان وجود داروي جايگزين با منشاي طبيعي در ايران مطالعه بر روي متابوليتهاي ثانويه موجود گياهان رويش يافته در ايران از اهميت به سزايي برخوردار ميباشد [ 7]. به اين منظور دانههاي اين گياه از نواحي مختلف رويش يافته گياه در ايران جمعآوري شدند و با نمونهاي كه از پژوهشكده گياهان دارويي جهاددانشگاهي (رقم مجاري) تهيه ودر گلخانه و در محل پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي در كرج كشت شده بود به سه روش اسپكتروفتومتري TLC و HPLC از نظر مقدار سيليمارين مقايسه شدند. روش كار دانههاي گياه خارمريم در طي ماه خرداد و تير از نقاط مختلف ايران (مازندران لرستان فارس خوزستان و بوشهر) كه اين گياه به صورت خودرو رويش مييابد جمعآوري شدند (جدول شماره ). بذرهاي با منشاي مجارستان از پژوهشكده گياهان دارويي جهاددانشگاهي تهيه شدند و در گلخانه با فتوپريود 8 ساعته و نيز در محوطه در پژوهشكده بيوتكنولوژي كشاورزي در كرج كشت گرديدند و مقدار سيليمارين آنها به روش زير استخراج و مورد اندازهگيري قرار گرفت. به منظور استخراج سيليمارين از دانههاي خشك گياه خارمريم سه گرم از ميوههاي خشك شده گياه خار مريم آسياب شده و جهت روغنگيري به مدت 0 ساعت در حلال پترولي وم اتر در سوكسله قرار گرفتند. پس از جداسازي روغن باقيمانده نمونهها كاملا خشك و سپس به مدت 6 ساعت با استفاده از متانول جهت استخراج سيليمارين سوكسله شدند. محلول متانولي حاصل به مدت ساعت در دماي 0 درجه سانتيگراد قرار گرفت و پس از تبخير متانول پودر زرد رنگي حاصل شد. پودر حاصل با متانول به حجم 0 ميليليتر رسانده شد []. اندازهگيري سيليمارين به روش اسپكتروفتومتري يك ميليليتر از محلول نمونه را به داخل بالن 0 ميليليتر انتقال داده ميليليتر محلول و - دينيتروفنيل هيدرازين - سولفوريك Silybum marianum (L.) Gaertn. Silybin Isosilybin Silychristin Silydianin 6 Taxifolin 6

3 حسنلو و همكاران اسيد (يك گرم از ماده مزبور در دو ميليليتر سولفوريك اسيد حل شده سپس با متانول به حجم 00 ميليليتر رسانده شد) به آن اضافه و به مدت 0 دقيقه روي بن ماري 0 درجه سانتيگراد قرار داده شد. پس از سرد شدن بالن حجم آن با افزودن پتاس متانولي ده درصد به 0 ميليليتر رسانده شد. سپس يك ميليليتراز اين محلول به لوله سانتريفيوژ منتقل و 0 ميليليتر متانول به آن اضافه و سانتريفيوژ شد. محلول رويي حاصل از سانتريفيوژ را به بالن 0 ميليليتري منتقل نموده و با افزودن 0 ميليليتر متانول به لوله سانتريفيوژ دوباره سانتريفيوژ تكرار شد و محلول رويي به بالن 0 ميليليتري منتقل شد. در نهايت محتويات بالن توسط متانول به حجم 0 ميليليتر رسيد و جذب نوري محلول در طول موج 90 نانومتر اندازهگيري شد. محاسبه مقدار سيليمارين: ميزان سيليمارين با دو روش زير محاسبه گرديد: - روش محاسبه از طريق رسم منحني رگرسيون با استفاده از رقتهاي محلول سيليبين استاندارد: به اين منظور 0 ميليگرم سيليبين در بالن 00 ميليليتري انتقال يافته و با متانول به حجم 00 ميليليتر رسانده شد. سپس يك سري محلول با رقتهاي مختلف تهيه گرديد و جذب محلولهاي رقيق شده پس از افزودن معرفهاي لازم در طول موج 90 نانومتر اندازهگيري و سپس منحني رگرسيون رسم شده و مقدار سيليمارين بر حسب ميليگرم بر گرم وزن خشك با استفاده از منحني خطي اندازهگيري شد. - روش محاسبه بر مبناي شدت جذب محلول درصد سيليبين در سل كوارتز سانتيمتري cm= ) A). % محاسبه درصد سيليمارين طبق رابطه ذيل به دست ميآيد: = A / A%cm 00 M درصد سيليمارين كه در اين رابطه A برابر ميزان جذب محلول نمونه و M عبارت از وزن نمونه گياهي ميباشد [8]. اندازهگيري سيليمارين به روش كروماتوگرافي لايه نازك 0 ميكروليتر از نمونههاي استخراجي و استانداردهاي تهيه شده از سيليبين (تهيه شده از شركت (Sigma با استفاده از روش كروماتوگرافي لايه نازك (TLC) و با استفاده از صفحات سيليكاژل HF و سيستم حلال حاوي كلروفرم استون فرميك اسيد به نسبت 9:: تحت كروماتوگرافي قرار گرفتند [7 ]. پس از خشك شدن صفحات سيليكاژل هر صفحه توسط KOH متانولي درصد و محلول درصد متانولي از NP رنگآميزي شدند و باندهاي ايجاد شده در زير لامپ UV با طول موج 66 نانومتر و با مقايسه با R f تركيبات استاندارد شناسايي شدند. با توجه به نمونههاي استاندارد سيليبين سيليكريستين سيليديانين تاكسيفولين نارينجنين (پيشساز) و كوماريليك اسيد (پيشساز) كه تحت نورهاي با طول موج 66 نانومتر پس از رنگآميزي به ترتيب به رنگهاي سبز فسفري سبز فسفري خردلي نارنجي آبي و سبز نمايان شدند. باند در تمامي نمونهها تشخيص داده شد كه مربوط به سيليبين ايزوسيليبين سيليكريستين سيليديانين و تاكسيفولين بود (جدول شماره ) [9]. اندازهگيري سيليمارين به روش كروماتوگرافي مايع جهت بررسي دقيقتر و تعيين كمي تركيبات از دستگاه كروماتوگرافي مايع با كارآيي بالا استفاده شد [9 0 ]. اين دستگاه از كارخانه Knauer شامل پمپ K00 دتكتور UV مدل K0 اتوسمپلر Marathon و نرمافزار Chromgate استفاده شد. 0 ميكروليتر از نمونههاي قبلي كه به نسبت به 0 رقيق شده بودند به دستگاه تزريق شدند و با فاز متحرك متانول استونيتريل و آب (مطابق جدول ) و با فلوي يك ميليليتر در دقيقه از ستون Nucleosil C 8 به قطر ذرات μ و ابعاد.6mm 0 عبور كرده و در طول موج 80 نانومتر شناسايي شدند. كل زمان هر كروماتوگراف 0 دقيقه بود. پيكهاي اجزاي فلاووليگنانها در مقايسه با سيليمارين استاندارد سيگما مشخص شده و مقادير هر يك بر اساس منحني استاندارد سيليبين استاندارد محاسبه ميشود. براي انجام آزمونهاي آماري از نرمافزار SASS استفاده شد. دادهها به صورت ميانگين ± خطاي استاندارد گزارش شده است (جدول شماره ). اختلاف آماري ميانگينها در طرح بلوكهاي كامل تصادفي با استفاده از آزمون دانكن در سطح خطاي درصد محاسبه گرديد. نتايج با توجه به به كارگيري دو روش محاسبه نتايج حاصل از اندازهگيري سيليمارين به روش اسپكتروفتومتري مشابه يكديگر بوده و اختلاف آماري معنيداري نشان نميدهد. مقايسه ميانگين سيليمارين بذور به روش دانكن (جدول شماره ) نشان ميدهد بالاترين ميانگين سيليمارين مربوط به منطقه ولشت بوده و پايينترين ميانگين مربوط به منطقه وليآباد و كازرون ميباشد. به طوريكه ميانگين مقدار سيليمارين بر حسب ميليگرم بر گرم ماده خشك در دانههاي جمعآوري شده از ناحيه ولشت / و در منطقه وليآباد در دو ارتفاع متفاوت 00 و 800 متر به ترتيب 9/7 و 9/8 كه تفاوتي از نظر مقدار سيليمارين در دو ارتفاع مختلف ديده نميشود (جدول شماره ). درصد سيليمارين تجمع يافته در دانههاي مربوط به منطقه ولشت نسبت به رقم مجاري حدود دو برابر بوده و از نظر آماري داراي تفاوت معنيدار ميباشد. دانههاي گياهان كشت شده در كرج (رقم مجاري) از نظر درصد سيليمارين تجمع يافته در دانه (/80) نسبت به نمونههاي تهيه شده از اين رقم از پژوهشكده گياهان دارويي جهاددانشگاهي و بذور كشت شده در گلخانه اين رقم بالاتر بوده ولي درصد سيليمارين حاصل از نمونههاي كشت شده در Natural Product 7

4 مطالعه و تعيين مقدار سيليمارين در... گلخانه و رقم با منشا مجارستان تفاوت چنداني نداشته است. مقدار سيليمارين در مناطق برازجان بنفشه ده كلاردشت هزارچم حسن آباد رودبارك و خرمآباد در مقايسه ميانگينها در يك گروه قرار ميگيرند و اين در حالي است كه درصد سيليمارين آنها نسبت به مناطق مرزنآباد اهواز بوشهر كازرون و وليآباد بالاتر ميباشد ولي از نظر آماري در يك گروه قرار ميگيرند. با انجام روش TLC از عصاره متانولي حاصل از دانههاي مربوط به هر يك از مناطق لكه در كليه نمونهها مشاهده شد. مربوط به لكهها در جدول شماره ارايه گرديده است. در اين روش سيليبين A و B. ايزوسيليبين A و B در طي صفحه سيليكاژل به طور جداگانه حركت كردهاند. جهت تعيين مقدار كمي فلاونوليگنانهاي حاضر در عصاره متانولي استخراج شده و بررسي كيفي از روش كروماتوگرافي مايع با كارايي بالا استفاده شد و با استفاده از روش ارايه شده در اين مقاله سيليبين A و B ايزوسيليبين A و B به راحتي از يكديگر جدا شده و قابل بررسي ميگردند. R f شماره نمونه محل جمعآوري وليآباد هزارچم رودبارك بنفشهده ولشت مرزنآباد حسنآباد وليآباد خرمآباد اهواز كازرون برازجان بوشهر گلخانه كرج جدول شماره - مشخصات جغرافيايي مناطق جمعآوري ميوههاي رسيده خارمريم ارتفاع طول جغرافيايي عرض جغرافيايي حداقل دما (تير 8) حداكثر دما (تير 8) حداقل رطوبت (تير 8) 6 حداكثر رطوبت (تير 8) ' 6 ' 6 9' 6 ' 6 ' 6 7' 6 8' 6 ' 9' 0' 9 6' 9 0' 8 9' ' 7' 8' 0' 7' ' 8' 8' ' 8' 8 ' 8 0' ' 7' 0 0' 0 9' 0 6' نتايج نشان ميدهد كه بالاترين مقدار تجمع سيليمارين در دانههاي مربوط به منطقه برازجان است (جدول شماره ). از نظر آماري تفاوت معنيداري با مقدار سيليمارين با منشاي مجاري و منطقه كازرون ندارد. ولي نسبت به مناطق خرمآباد اهواز حسنآباد بوشهر و دانههاي مجاري كه در گلخانه كشت شدهاند تفاوت معنيداري وجود دارد. نكته جالب اين است كه مقدار سيليمارين در دانههاي با منشاي مجار كه در شرايط گلخانه و كنترل شده كشت گرديده بودند بسيار پايين بود. مهمترين فلاونوليگانهاي تجمع يافته در دانههاي مربوط به منطقه برازجان سيليبين B,A ميباشند كه داراي نسبت 7 و درصد هستند و با توجه به اهميت حضور اين تركيب از نظر خواص دارويي و درماني سيليمارين اين نكته حايز اهميت بسياري ميباشد بهطوريكه مقدار سيليبين B,A در منطقه برازجان كازرون حسنآباد و نمونه مجاري آن تفاوت قابل ملاحظهاي با ساير مناطق خصوصا نمونههاي مجاري كه در گلخانه كشت شدهاند دارد. بالاترين مقدار سيليبين B در مناطق خرمآباد و برازجان ديده ميشود كه باز هم نسبت به نمونههاي منطقه بوشهر و نمونههاي مجاري رشده كرده در گلخانه تفاوت بسياري دارد. حدود 0 درصد از مقدار سيليمارين موجود در ميوههاي منطقه برازجان كه برابر با نمونه استاندارد سيليمارين ميباشد سيليبين A و B است و در نمونه مجاري مورد بررسي حدود درصد از كل سيليمارين متعلق به سيليبين A و B ميباشد. مقدار ايزوسيليبين B در منطقه برازجان بالاترين مقدار را دارا است و تفاوت معنيداري با ساير مناطق دارد كه حدود برابر مقدار اين ماده در نمونه مجاري ميباشد. مقدار ايزوسيليبين A بيشتر از ايزوسيليبين B خصوصا در نمونه رودبارك كه برابر مقدار آن در نمونه مجاري است و تفاوت معنيداري بين بيشتر مناطق از نظر مقدار اين تركيب ديده نميشود. مقدار سيليديانين در دانههاي مربوط به برازجان (بالاترين مقدار) و نمونههاي مجار خرمآباد و كازرون نسبت به مقدار اين ماده در دانههاي مناطق اهواز بوشهر و گلخانه تفاوت معنيداري دارد. مقدار سيليكريستين در دانههاي مجاري بالاترين مقدار و در بقيه مناطق تفاوت معنيداري وجود ندارد و دانههاي برازجانو خرمآباد فاقد اين ماده بودند. 8

5 حسنلو و همكاران جدول شماره - مقايسه ميانگين مقدار سيليمارين در ميوههاي رسيده گياهان خارمريم جمعآوري شده از مناطق مختلف كشور و رقم مجاري شماره 6 به روش اسپكتروفتومتري (آزمون چند دامنهاي دانكن در سطح خطاي درصد) شماره نمونه ميانگين (ميليگرم بر گرم ماده خشك) ميانگين (درصد) /a /a /89ab /7ab /6ab /6ab /7ab /9ab /7ab /b /9b /08b /0b /0b 0/96b 0/9b 0/9b 9/9ab 6/7ab 6/6ab 6/ab /ab 0/8ab 0/6ab 6/6b /8b /6b /b 0/8b 0/b 9/7b 9/8b حروف يكسان بيانگر عدم وجود اختلاف است. جدول شماره - f R فلاونوليگنانها در مطالعه به روشTLC فلاونوليگنانها سيليبين A سيليبين B ايزوسيليبين A ايزوسيليبين B تاكسيفولين سيليكريستين سيليديانين 0/6 0/6 0/6 0/6 0/ 0/ 0/ R f جدول شماره - برنامه سيستم حلالها در دستگاه HPLC آب /) (ph= با 0 H PO درصد زمان (دقيقه) متانول 0 استونيتريل 0 0:00 7:0 :00 0:00 9

6 مطالعه و تعيين مقدار سيليمارين در... جدول شماره - مقدار فلاونوليگنانها (ميليگرم بر گرم ماده خشك) در ميوههاي رسيده گياه خارمريم از نواحي مختلف ايران و نمونه مجاري نمونه تاكسيفولين سيليكريستين سيليديانين مقدار فلاونوليگنانها سيليبين A سيليبين B ايزوسيليبين A ايزوسيليبين B سيليمارين 8/78 ± 0/6 /7 ± 0/ /6 ± 0/0 /66 ± 0/07 0/8 ± 0/0 0/9 ± 0/0 0/ ± 0/09 /690 ± 6/ / ± 0/7 /8 ± /8 /69 ± 0/7 / ± 0/77 0/968 ± 0/6 /0 ± 0/70 /098 ± 0/6 /7 ± /7 / ± 0/ 7/ ± 0/ /8 ± 0/8 0/96 ± 0/ 6/06 ± 0/ / ± 0/ /08 ± 0/08 /690 ± 0/6 0/ ± 0/ /68 ± 0/ /68 ± 0/0 / ± 0/07 0/89 ± 0/ 0/77 ± 0/0 0/7 ± 0/0 /88 ± 0/6 0/9 ± 0/ /7 ± 0/ /69 ± 0/ /9 ± 0/ 0/99 ± 0/ 0/7 ± 0/6 0/86 ± 0/ 9/78 ± 0/ /06 ± 0/9 / ± 0/09 /0 ± 0/06 0/9 ± 0/0 0/90 ± 0/0 0/78 ± 0/0 6 8/8 ± 0/7 /0 ± 0/ /9 ± 0/0 / ± 0/9 0/ ± 0/0 0/6 ± 0/0 0/79 ± 0/0 7 6/99 ± 0/ /97 ± 0/06 /78 ± 0/08 /79± 0/8 0/6 ± 0/ 0/9 ± 0/0 0/ ± 0/0 0/68 ± 0/0 8 7/6 ± / 0/9 ± 0/9 /0 ± 0/ 7/66 ± /8 / ± 0/68 /68 ± 0/ 9 6/0 ± / / ± / /6 ± /80 /98 ± 0/ 0/88 ± 0/6 /7 ± 0/9 /6 ± 0/70 /79 ± 0/ 0 7/97 ± /7 /8 ± 0/70 /08 ± /6 /90 ± 0/7 /7 ± 0/0 /09 ± 0/ 0/80 ± 0/8 /7 ± 0/6 7/0 ± 0/0 8/69 ± 0/0 / ± 0/0 6/0 ± 0/0 /9 ± 0/0 /776 ± 0/0 / ± 0/0 9/ ± 0/0 /6 ± 0/0 /7 ± 0/0 0/6 ± 0/0 /8 ± 0/0 0/8 ± 0/0 /07 ± 0/0 /9 ± /9 /7 ± /6 /968 ± / /87 ± 0/0 0/80 ± 0/ /778 ± 0/8 /90 ± 0/69 0/9 ± 0/07 /08 ± 0/ 0/9 ± 0/0 0/9 ± 0/ 0/87 ± 0/0 0/8 ± 0/08 /7 ± 0/0 /79 ± 0/0 /89 ± 0/0 /9 ± 0/0 / ± 0/0 /67 ± 0/0 /66 ± 0/00 /7 ± 0/00 6 شكل شماره - كروماتوگرام HPLC عصاره متانولي از ميوههاي رسيده خارمريم 0

7 حسنلو و همكاران تاكسيفولين در دانههاي مناطق برازجان اهواز كازرون و مجار بالاتر از ساير مناطق و نمونههاي گلخانه كمترين ميزان اين ماده را دارا بودند. بالا بودن مقدار تاكسيفولين به عنوان پيشساز سيليبين در نمونههاي برازجان و رودبارك كه بالاترين مقدار سيليمارين را داشتند و همچنين در نمونههاي اهواز و كازرون كه داراي مقدار كمي از اين ماده هستند قابل توجه است. بحث گياهان به محركهاي محيطي پاسخ ميدهند و متابوليتهاي ثانويه داراي نقشهاي كليدي در برهم كنش بين گياه و محيطشان هستند و مطابق نتايج بسياري از محققان فلاونوييدها نيز از جمله متابوليتهاي ثانويهاي هستند كه مسير بيوسنتزي آنها تحت تاثير شرايطي محيطي قرار ميگيرد و در مراحل نموي و شرايط محيطي داراي نوسان هستند [6 ]. طبق مشاهدات و مقايسات حاصل از اين تحقيق به نظر ميرسد شرايط محيطي در تغييرات فلاونوليگنانهاي موجود در دانههاي جمعآوري شده از مناطق مختلف تاثير گذاشته باشد. در مقايسه بين نمونههاي رشد كرده در گلخانه و فضاي آزاد كرج با وجود يكساني ژنوتيپ شرايط محيطي متفاوت در مقدار سيليمارين تاثيرگذار بوده است. ضمنا چالكون سنتاز آنزيمي است كه در مرحله اتصال واحد استيل از مالونيل كوانزيم A با هيدروكسيسيتاميل كوانزيم A براي توليد نارينجنين به عنوان پيشساز توليد تاكسيفولين در مسير بيوسنتز سيليبين نقش دارد. اين آنزيم يك نقطه كليدي در كنترل متابوليكي اين مسير بيوسنتزي است. سطح آنزيمي و mrna چالكونسنتتاز در طي مراحل نموي با نوع سلول و در پاسخ به محركهاي محيطي تغيير ميكنند و موجبات تغييرات سطوح تركيبات نهايي در مسير بيوسنتزي را فراهم ميآورند [ ]. استفاده از روش اسپكتروفتومتري در بررسيهاي كلي مقدار سيليمارين مفيد ميباشد و با توجه به اهميت تعيين درصد تركيبات فلاونوييدي مختلف حاضر در سيليمارين موجود در ميوهها استفاده از روشهاي دقيقتر مثل HPLC توصيه ميشود. با توجه به نتايج به دست آمده و عدم اطلاع از مقدار وابستگي و سطح كنترل مقدار تركيبات به وسيله عوامل ژنتيكي مطالعه براساس ماركري مولكولي و نيز براساس سطوح آنزيمي حاضر در نقاط كليدي اين مسير بيوسنتزي حايز اهميت است و به فهم كاملتر اين مسير و نقاط كليدي در كنترل اين مسير بيوسنتزي كمك شاياني خواهد كرد.[0] بايد توجه داشت كه نسبت تركيبات حاضر در سيليمارين استخراج شده كه در صنايع داروسازي استفاده خواهد شد داراي اهميت است و مقدار تجمع اين تركيب در عصاره استخراجي از جنبه اقتصادي در چرخة توليد تاثيرگذار ميباشد. بنابراين با ارزيابي وسيعتر و شناخت بيشتر منابع طبيعي اين ثروت ملي و خالصسازي اين نمونهها ميتوان در آينده منابعي با كيفيت بالاتر معرفي كرد. منابع. Alikaridis F, papadakis D, Pantelia K.and Kephalas T. Flavonolignan production from Silybum marianum transformed and untransformed root. culture. 000; 7: Baker H. Schrall R. Tissue and Suspension Culture of Silybum marianum.l. Communication: isolation and growth of tissue and suspension cultures and studies on flavonoids (authors transl). Planta Med. 977; : Szentmihalyi K, Kery A, Lakatos B, Sandor Z, Petri G. Determination of elements in milke thistle. Acta. Pharm. Hung. 998; 68: Cacho M, Moran M, Corchete P, Fernandez- Tarrago J. Influence of medium composition on the accumulation of flavonolignans in cultured cells of Silybum marianum (L.) Gaertn. Plant Science 999; : Schnfeld JV, Weisbrod B, Muller MK. Silibinin, aplant extract with antioxidant and membrane stabilizing properties, protects exocrine pancreas from cyclosporine A toxicity. Cellular and Molecular Life Sciences 997; : Titel G, Wagner H. High- performance liquid chromatographic seperation of silymarins and their determination in a raw extract of silybum marianum. J. Chromatogr. 977; : Wagner H, Diesel P, Seites M. The chemistry and analysis of silymarin from Silybum marianum, Arzheimittle forschung. 97; : Wagner H, Horhammer L, Seitz M. Chemical evaluation of a silymarin-contaning flavonoid conce ntrate from Silybum marianum. Arzheimittel forschung 968; 8: Valenzuela A. Biochemical bases of the

8 مطالعه و تعيين مقدار سيليمارين در... pharmacological action of the flavonoid silymarin and of its structural isomer silibinin. Biol. Res. 99; 7: Chlopclkova S, Psotova J, Miketova P. Chemoprotective effect of plant phenolics against anthracycline-induced toxicity on rat cardiomyocytes.part I.Silymarin and its flavonolignans. Phytoter. Res. 00; 8: Bourgand F, Gravot A, Milesi S and Gontier E. Production of Plant Secondary Metabolites: a historical 6 perspective. plant science 00; 6: Hadolin M, Skerget M, Knez Z, Bauman D. High pressure extraction of vitamin E-rich oil from Silybum marianum. Food chemistry. 00; 7: -6.. Krecman V, Skottova N, Waterova D, Ultichova J,Simanek V. Silymarin inhibits the development of diet-induced hypercholesterolemia in rats. Planta media. 998; 6: 8-.. Lee DY, Liu Y. Molecular structure and stereochemistry of silybin A, silybin B, isosilybin A, isosilybinb, isolated from Silybum marianum J. Nat. Prod. 00; 66: Briskin DP. Medicinal Plants and Phytomedicines. Linking Plant Biochemistry and Physiology to Human Health. Plant Physiology 000; : Kutchan TM. Echological arsenal and developmental dispatcher. The paradigm of secondary metabolism. Plant physiology 00; : Brenda WS. Flavonoid Biosynthesis: A Colorful Model for Genetics, Biochemistry, Cell Biology, and Biotechnology. Plant Physiology 000; 6: قاسمي دهكردي نصراالله طالب امير مهدي. استخراج شناسايي و تعيين مقدار تركيبات موجود در گياهان دارويي شاخص. انتشارات چوگان. 80 صفحات Gunaratna C, Zhang T. Application of liquid chromatography electrospray ionization-ion trap mass spectrometry to investigate the metabolism of silibin in human liver microsomes. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 00; 79: Quercia V, Pierini N, Incarnato G P, Papetti P, Gambero 7 P. HPLC evaluation of the ratio between the antihepatotoxic constituents of Silybum marianum. Fitoterapia. 980; : Schmid J, Doerner PW, Clouse SD, Dixon RA, Lamb CJ. Developmental and environmental regulation of a bean chalcone synthase promoter in transgenic tobacco. The plant cell 990; : Narayana KR, Sripal R, Chaluvadi MR, Krishan DR. Bioflavonoids classification, pharmacological, biochemical effects and therapeutic potential. Indian journal of pharmacology 00; :-6.