يافته / دوره هشتم / شماره / ١ بهار / ٨٥ مسلسل ٢٧

Transcript

1 فصلنامه علمي پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي لرستان شناسايي سويه هاي O157:H7 مولد شيگا توکسين اشريشيا کلي (STEC) جدا شده از نمونه هاي مدفوع وادرار بيماران به روش Multiplex چكيده سيد محمد نايب ا قايي دکتر شهلا منصوري - کارشناس ارشد ميکروبيولوژی دانشگاه لرستان - استاد عضو هيي ت علمی دانشگاه علوم پزشکی کرمان يافته / دوره هشتم / شماره / بهار / ٨٥ مسلسل ٧ دريافت مقاله: ٨٤/٦/ پذيرش مقاله: ٨٤/٩/٩ مقدمه: عفونت با سويههاي مولد شيگا توکسين اشريشياکلي( STEC ) علاوه بر ايجاد اسهال با عوارض وخيم ومرگ ا وري چون سندروم اورميهمو ليتيک( HUS ) همراه است. اين در حالي است که روشهاي تشخيصي اين باکتريها مشکل بوده و اطلاع دقيقي از ميزان بروز بيماري در ايران نيست.اين مطالعه با هدف بررسي سويه هاي مولد شيگا توکسين اشريشيا کلي جدا شده از نمونههاي ادرار و مدفوع به روش در مبتلايان انجام گرفت. مواد و روش ها: در اين مطالعه که يک پژوهش بنيادي-کاربردي است از بين ۵۰۰ نمونههاي جمع ا وري شده ۱۰۰ نمونه که با تستهاي فيزيولوژيک بيشترين امکان وجود انواع O157:H7 درا نها وجود داشت انتخاب شد وپس از استخراج از کلني هاي E.coliحاصل از کشت واکنش Multiplex براي ژنهاي stx 2 و stx 1 انجام گرفت و محصول ا ن بر روي ژل ا گارز الکتروفورز گرديد و پس از رنگ ا ميزي با اتيديوم برومايد مورد بررسي قرار گرفت. يافته ها: در بين ۱۰۰ سويه جدا شده (مشکوک بهSTEC ) تنها ۳ مورد (۳ درصد کل نمونهها) از نظر ژن stx مثبت بودند که هر سه مورد مربوط به سويههاي stx 2 بود. دو مورد ا ن مربوط به نمونه مدفوع ويک مورد مربوط به نمونه ادرار بود. نتيجه گيري: اگر چه ظاهر ا شيوع عفونت با سويههاي STEC درايران بالا نيست اما به دليل بروز عوارض وخيمي چون HUS و کوليت هموراژيک از يک سو وعدم شناسايي اين سويه ها با روش هاي مرسوم در ا زمايشگاههاي کشور از سوي ديگر بکارگيري روشهاي مولکولي به منظور شناسايي موارد مشکوک حداقل در مراکز طبي کودکان ضروري به نظر مي رسد. واژه هاي كليدي: اشريشياکلي وروتوکسيژنيک Multiplex سندروم اورمي هموليتيک ا درس مكاتبه: خرم ا باد بدرا باد دانشكده كشاورزي مهمانسراي اساتيد / 21 يافته دوره هشتم بهار ٨٥

2 مقدمه سويههاي اشريشياکلي وروتوکسيژنيک (VTEC) توکسيني ترشح ميکنند که به دليل توانايي ا ن در کشتن سلولهاي vero وروتوکسين و به دليل شباهتش به نوروتوکسين شيگاي مترشحه از شيگلا ديسانتري تيپ I توکسين شبه شيگا ناميده ميشود و سويههاي توليد کننده ا ن نيز بهSTEC معروفند (). ژن توليد کننده وروتوکسين برروي ژنوم باکتريوفاژ معتدل قرار دارد وتوسط ٤ تبديل فاژي به اشريشيا کلي وارد ميگردد (). توکسين هاي ورو به دوگروه stx 2 و stx 1 تقسيم بندي مي شوند وروتوکسين با اثر بر روي RNA ريبوزومي سبب ممانعت از سنتز پروتي ينها شده وانواعي از اشريشيا کلي که اين سم را توليد مي کنند موجب سندرومهاي خطرناکي از جمله کوليت هموراژيک و به (HC) دنبال ا ن نارسايي کليوي خصوص ا در کودکان و پورپوراي ٥ ترمبوتيک ترمبوسايتوپنيک در انسان ميگردند (٤-). شناسايي اين سويهها به طور روتين در ا زمايشگاهها انجام نمي گيرد و پژوهشگران درصدد يافتن راههاي ساده براي غربالگري اين باکتريها هستند. يکي از روشهاي استاندارد شناسايي توکسين ورو کشت سلولي واثر سيتوتوکسيک توکسين برروي سلولهاي ورو ميباشد. اين روش ا هسته بوده استاندارد کردن ا ن مشکل و نياز به تجربه و مهارتهاي خاصي دارد. علاوه بر ا ن به امکاناتي نظير کشت سلولي وا نتي توکسين ورو جهت خنثي کردن ا زمايش تشخيص نوع توکسين نياز دارد. سروتايپ هاي متعددي در ارتباط با توليد توکسين شناخته شده اند و از اين جهت تستهاي سرولوژيک نيز کمکي به تشخيص نمي کنند O157:H7.(٦ ٥) مهمترين سروتيپ درگروه ايشريشياکلي انتروهموراژيک به شمار مي رود و در بيشتر کشورها به عنوان عامل اصلي عفونت شناخته شده است (٧). به نظر ميرسد که O157:H7 از يک ٦ كلن سلولي بوجود ا مده و در دنيا گسترش يافته است. هموژن بودن اين سويه از نظر ژنتيکي سبب يافتن متدهاي زيادي براي جداسازي اين سويه ها نظير عدم قدرت تخمير سوربيتول و عدم توليد بتا. دي. ٧ گلوكورونيداز است که بيشتر انواع E.coli قادر به انجام ا ن مي باشند. از اين جهت با ساختن محيط هاي انتخابي نظير ٨ سوربيتول مکانکي ا گار سفي کسيم پتاسيم تلوريت سوربيتول ٩ مکانکي ا گار ٠ مکانکي ا گار و سفي کسيم پتاسيم تلوريت رامنوز سوربيتول مي توان اين سويه ها را غربالگري کرد.رشد باکتري روي اين محيط ها به خصوصيات فنوتيپي E.coli O157:H7 نظير عدم توانايي تخمير رافينوز ومقاومت به تلوريت پتاسيم بستگي دارد( ٨ ). با توجه به مطالب فوق و اين که مطالعات بر روي اين سويه در ايران محدود بوده( ٩ ) ودر ا نها صرفا از روش کشت براي شناسايي استفاده شده است لزوم کاربرد يک روش دقيق مولکولي ) (Multiplex جهت شناسايي و بررسي اين باکتريهاي مهم کلينيکي مشخص ميشود. به همين منظور اين مطالعه با هدف بررسي سويه هاي مولد شيگا توکسين اشريشيا کلي جدا شده از نمونه هاي ادرار و مدفوع به روش در مبتلايان انجام گرفت. مواد و روش ها در اين مطالعه بنيادي کاربردي بررسي بر روي تعداد ٥٠٠ نمونه اشريشيا کلي (شامل نمونه جدا شده از ادرار و ٨٩ نمونه جدا شده از مدفوع مبتلا به اسهال) در محيط TSB حاوي ٤٠% گليسرول و در دماي (٧٠-) درجه سانتي گراد که از اوايل اسفند ماه ٧٨ لغايت ا خر تير ماه ٧٩ جمع ا وري شده بودند انجام گرفت. در اين مطالعه ابتدا از بين نمونههاي جمع ا وري شده با توجه به خصوصياتي از جمله واکنش سوربيتول منفي هموليز بر روي خون گوسفند و واکنش دلسيتول و رافينوز مثبت که به عنوان 1. Shiga like toxin 2. Shiga Toxin Production Escherichia 3. Temperate Bacteriophag 4. Phage Conversion 5. Thrombotic Thrombocytopenic Purpurea 6. Clon 7. β.d.glucuronidase 8. SMAC 9. CT-SMAC 10. CTR-SMAC 11. Tripticase Soy Broth / 22 يافته دوره هشتم بهار ٨٥

3 روشهاي شناسايي سويه هاي O157:H7 معرفي شدهاند يکصد نمونه اشريشياکلي انتخاب شده و سپس نمونه ها جدا سازي و تخليص کرده و روي هر کدام از نمونه ها ا زمايش انجام شد. استخراج و تخليص : استخراج ژنوميک يکي از مراحل بنيادي در تشخيص مولکولي عوامل باکتريايي در نمونه هاي کلينيکي محسوب مي گردد.روشهاي متعددي جهت استخراج ژنوميک باکتري مورد نظر مطرح بود که در شروع کار چندين روش مختلف براي استخراج از نمونه ها مورد استفاده و ارزيابي قرار گرفت.در نهايت جهت استخراج وتخليص از محلول Lysis Buffer (شامل ساکارز ٠/ مولار تريس بازي ٠ ميلي مولار وکلرور منيزيم ٥ ميلي مولار و يک درصد ترايتون (X100 استفاده شد و با دستگاه اسپکتروفتومتر UV و الکتروفورز بررسي کمي وکيفي بر روي کليه نمونههاي استخراجي صورت گرفت. محصول استخراج در ) ٠-) درجه سانتيگراد تا زمان انجام نگهداري گرديد. Tag در اين تحقيق از بافر و :Multiplex پليمراز شرکت سيناژن (تهران) ا نزيم به صورت استفاده شد. نوترکيب و از طريق بيان در E.coli تهيه شد. براي انجام از دو جفت پرايمر اختصاصي به نامهاي (stx 1 ) VT 1a,VT 1b و (stx 2 ) VT 2a,VT 2b استفاده گرديد که اين دو جفت به ژنهاي توليد توکسين stx 1 و stx 2 متصل ميشوند( ٠ ). اين پرايمر ها از شرکت ا لماني (Fermentas) توسط شرکت سيناژن سفارش داده شد که بر طبق دستورالعمل پروتکل به منظور داشتن (٠) غلظت ميکرو مول ابتدا يک ٠ Stock ميکرو مولار از هر کدام از پرايمرها تهيه وچون براي انجام ما به ميکرو مولار نياز بود ٥ ميکرو مولار از استوك را برداشته و به ٥٠ ميکرو مولار از محلول Master Mix اضافه شد. براي جلوگيري از انجماد و ذوب مکرر پرايمر ها که باعث خراب شدن بافر حاوي پرايمر ميشود محلول مادر ونمونه ها به صورت مقادير کوچک تقسيم وسپس فريز شدند (جدول و تواليهاي هدف و مشخصات پرايمرهاي مورد استفاده در فرايند را نشان ميدهد). پس از تهيه Master Mix با غلظتهاي dntp (200µm) 10x Buffer MgCl Tag و (1µm) Primers (each of) (1.5µm) Polymerase (2.5U) ميکروليتر به مقدار از استخراجي از سويه هاي کنترل ATCC) (E.coli ) 1 (25923,VT 2,VT و يا نمونهها به هر يک از لولهها افزوده و توسط دستگاه چرخان حرارت مدل Tchne فرايند انجام گرديد. جهت کنترل محصول ا گارز (غلظت %) حاوي اتيديوم برومايد از الکتروفورز بر روي ژل ( mg/ml) همراه با معرفهاي کنترل منفي و مثبت و مارکر وزن مولکولي ٤ استفاده گرديد و ژل را بر روي دستگاه ترانس ايلوميناتور (مدل UVP ساخت امريکا) قرار داده و تصوير ژل توسط دوربين پولارويد متصل به هود (مدلDoc-008-XD ) بر روي صفحه نمايشگر نشان داده شد و با استفاده از دستگاه Black and white polariod photograph باند ها مورد بررسي قرار گرفت. عکسبرداري و در نهايت جدول شماره مشخصات پرايمرها پرايمر غلظت مقيا س وزن مولکولي اندازه * (bp) (bp) (µmol) (µm) موقعيت ا ن در ژن اندازه محصول تکثير شده (bp) VT11(VT 1a ) ٠ ٦٩٩ ٠/ ٠٥ ٦٠ ٩-٠ ٠ VT12(VT 1b ) ٠ ٦٦ ٠/ ٠٥ ٦٠ ٩-٠ VT21(VT 2a ) ٠ ٦٠٠٨ ٠/ ٠٥ ٦٠ ٤٦-٤٤٥ ٤٦ VT22(VT 2b ) ٠ ٦٠٩ ٠/ ٠٥ ٦٠ ٧٥-٧ *bp= base pairs 1. Thermal Cycler 3. Ladder 2. Amplicons 4. Transilluminator / 23 يافته دوره هشتم بهار ٨٥

4 جدول - تواليهاي هدف و پرايمرهاي مورد ا ستفاده در فرايند واکنش زنجيره اي پليمراز يافته ها توالي اليگونوکلي وتيد 5 -GAA-GAG-TCC-GTG-GGA-TTA-CG-3 5 -AGC-GAT-GCA-GCT-ATT-AAT-AA-3 5 -TTA-ACC-ACA-CCC-ACG-GCA-GT-3 5 -GCT-CTG-GAT-GCA-TCT-CTG-GT-3 نتايج انجام : در ا زمايش واکنش زنجيرهاي پليمراز از دو نمونه کنترل مثبت پرايمر VT 1a VT 1b VT 2a VT 2b VT 2 VTو 1 و يک نمونه کنترل منفي (25922 (E.coli ATCC استفاده شد که پس از انجام روشهاي مختلف اين نتايج بدست ا مد از بين نمونه هاي مورد ا زمايش فقط نمونه (با شمارههاي ٤٤٠ ٧ ٦) مثبت شد که جزء سويههاي مثبت با روش ا گلوتيناسيون و کشت سلولي گزارش شده بودند (٩) دو مورد ا ن مربوط به نمونه مدفوع ويک مورد ا ن مربوط به نمونه ادراري بود. در اين بررسي قادر به شناسايي سويه هاي وروتوکسيژنيک از نوع VT 1 نبوديم و کنترل نيز ايجاد باند نکرد و سه مورد مثبت مربوط به VT 2 بود (شکل ). شكل شماره ا گارز ژل الکتروفورز قطعات تکثير شده MW توسط از نمونه کنترل و نمونههاي اسهالي. استاندارد وزن مولکولي (100bp) شماره -کنترل مثبت VT 2 شماره ٥ -اشريشياکلي با کد ٧ بحث در باره شيوع سروگروپ هاي VTEC بخصوص O157:H7 در بيماران اسهالي اطلاعات کمي وجود دارد. اگر چه اثبات شده است که باکتريهاي فوق در تمامي نواحي جغرافيايي يافت مي شود ولي ميزان جداسازي ا ن در مناطق مختلف از ٠/٠٤ درصد تا / درصد متفاوت گزارش شده است که اين امر بسته به حيوانات ناقل نحوه طبخ غذا مصرف گوشت و نحوه زندگي مناطق مختلف متفاوت بوده است( ). E.coli انواع يکي از روشهاي پيشنهادي جهت شناسايي وروتو کسيژنيک روش بررسي با هدف راهاندازي روش در اين است. براي جداسازي سويههاي وروتوکسيژنيک ا زمايش بر روي ٠٠ نمونه اشريشياکلي که با تست هاي فيزيولوژيک بيشترين امکان وجود انواعO157:H7 روشهاي متعددي به منظور شناسايي يکي از ابتدايي ترين روشهاي در ا نها وجود داشت انجام شد. STEC براي تشخيص وجود دارد STEC توسط كاري و ماير توصيف شدند و شامل يک جفت پرايمر از يک منطقه حفاظت شده stx 1 stx 2 در ژنهاي stx 2 و همولوگ است افتراق بين ژنهاي توکسين از طريق هيبريد کردن محصول پذير است. با پروب هاي اليگونوکلي وتيدي امکان پولارد و همکاران وي روشي از را توصيف کردند که در ا ن يک مجموعه ٤ پرايمري از توالي هاي ژنهاي stx 2 stxو 1 به طور همزمان بکار گرفته مي شد. اين گروه مناطق مختلفي از ژنهاي توکسين را مورد هدف قرار دادند تا 1. Karey 3. Pollard 2. Mayer / 24 يافته دوره هشتم بهار ٨٥

5 ا مپليکونهايي با اندازه هاي مختلف ايجاد کنند و امکان افتراق گذاشتن بين ا نها با الکتروفورز ژل ا گارز امکان پذير باشد. جهت راه اندازي روش بود. اولين اقدام جداسازي بدين منظور چندين فاکتور براي انتخاب متد استخراج مد نظر قرار گرفت از جمله: حجم نمونه حساسيت متد سميت مواد مدت زمان استخراج و وسايل اختصاصي مورد نياز و در دسترس. با توجه به اين موارد به بررسي مقالات و روشهاي موجود براي استخراج پرداختيم تا با استفاده از ا ن روشي ساده ومقرون به صرفه طراحي و بهينه نماييم. در بيشتر مقالات از محلول ليزات به صورت کيت هاي تجارتي مانند (Iso Quick Nucleic Acid Extraction) يا Acid Nuclisens kit استفاده شده است که براي ما امکان دستيابي به ا نها وجود نداشت. بعد از استخراج رسيدن به اهداف پژوهشي و راه اندازي روش پرايمرهاي مناسب و اختصاصي داشتيم. براي نياز به بدين منظور از پرايمر هاي پولارد و همکارانش در انجام تحقيق استفاده شد (٠). اين پرايمرها علاوه بر پولارد و همکاران توسط محققين ديگر نيز استفاده شده است که اين مطلب نيز بر اعتبار پرايمر هاي انتخاب شده مي افزود. اين محققان با انجام ا زمايشات متعدد بر روي اين پرايمر ها با استفاده از ويژگي و حساسيت اين پرايمر ها را دقيق ا کنترل کرده و در هيچيک از موارد بررسي شده به وجود واکنش متقاطع برخورد نکرده اند.( ٠) پرايمرهاي انتخاب شده VT 1a و VT 2a مربوط به ژن shiga toxin1a ميباشند. اين ژن با شماره AF در بانک ژن امريکا ( ) سايت اينترنتي (Nation Center for Biotechnology Information) يا مرکز ملي بيوتکنولوژي ا مريکا پذيرش شده است. اين پرايمر ها تعداد bp VT 2b و VT 2a ٠ را از ژن مذکور تکثير ميکنند و پرايمرهاي مربوط به ژن shiga toxin 2A ميباشند. اين ژن با شماره ABO48233 در بانک ژن امريکا پذيرش شده است. اين پرايمر ها تعداد ٤٦ bp را از ژن مذکور تکثير ميکنند. توالي هاي مربوط به پرايمرها در جدول ا مده است. بعد از مطلوب کردن روش و انجام ا زمايش ما موفق به شناسايي سويه وروتوکسيژنيک شديم ( ٠/ درصد) که جزء سويههاي مثبت با روشهاي ا گلوتيناسيون و کشت سلولي بودند (٩) که دو مورد ا ن مربوط به نمونه مدفوع و يک مورد مربوط به نمونه ادراري ميباشد. از سويههاي VT 1 و VT 2 به عنوان کنترل مثبت و از سويه استاندارد E.coli ATCC25922 به عنوان کنترل منفي استفاده شد. ا زمايش بر روي نمونهها به صورت Blind و بدون ا گاهي از نتيجه تستهاي ديگر انجام گرفت و در هيچکدام از ٠٠ ايزوله مورد بررسي باندهاي مورد نظر را مشاهده نشد. ٤٨ در تحقيقاتي که بلانكو و همکارانش انجام دادند از بين نمونه اسهالي متعلق به بچه ها توانستند ٠/٦) کنند. درصد) مورد اشريشيا کلي سويه وروتوکسيژنيک را جداسازي همچنين راجري و همکارانش در بررسي که بر روي نمونههاي حيواني انجام دادند از ٧٠ نمونه جمعا وري شده از ٧ کشتارگاه با بکار بردن روش جهت ژنهاي stx موفق به ايزوله کردن ٥ نمونه STEC شدند. با توجه به اطلاعات و همچنين نتايج بدست ا مده اختلاف واضحي بين نتايج درشناسايي E.coli مولد وروتوکسين با نتايج حاصل از روش کشت سلولي و روش ا گلوتيناسيون مي باشدکه اين مطلب ميتواند دلايل مختلفي داشته باشد. از ا نجاييکه در سويههاي مولد وروتوکسين دو توکسين عمده stx 1 و stx 2 وجود دارد که ژنهاي مرتبط به ا نها بر روي باکتريوفاژ ليزوژنيک قرار دارند يک سوش خاص ممکن است هر دو توکسين و يا فقط يکي از دو را بيان نمايند. دراين مطالعه قادر به شناسايي سويه هاي وروتوکسيژنيک از نوع VT 1 نبوديم و سويه VT 1 کنترل مثبت نيز ايجاد باند نکرد و سه مورد مثبت مربوط به سويههاي VT 2 1. Amplify 3. Rogerie 2. Blanco / 25 يافته دوره هشتم بهار ٨٥

6 نميباشد. از اينرو با توجه به حساسيت و ويژگي مناسب روش در تشخيص باکتري اشريشياکلي O157:H7 و تعيين نوع توکسين توليد کننده توسط هر سويه و امکان کاربرد مستقيم ا ن بر روي نمونههاي کلينيکي به نظر ميرسد روش Multiplex ميتواند به عنوان يک روش روتين در ا زمايشگاههاي رفرانس مورد استفاده قرار گيرد همچنين از اين روش به منظور شناسايي موارد مشکوک حداقل در مراکز طبي کودکان ضروري بنظر ميرسد. ميباشد که احتمال دارد به خاطر پاساژ دادن مکرر کشتها و يا به علت موتاسيون در ژن مولد وروتوکسين را در نمونه استاندارد و يا ساير نمونهها از دست داده باشيم و يا اين که شرايط براي VT 1 مناسب نبوده و هنوز بايد در اين مورد تحقيقات بيشتري انجام گيرد نتيجه گيري روش درتشخيص سويههاي وروتوکسيژنيک با توجه به پرهزينه بودن در ا زمايشگاه هاي روتين مناسب / 26 يافته دوره هشتم بهار ٨٥

7 References 1. Walker TS. Microbiology. Philadelphia, W.B.Sanders Company, 1998: Whittam TS, Wolfe ML, Selander RK, Dyer DW, Loos BG. Clonal relationship among E.coli strains that cause hemorrhagic colitis and infantile diarrhea. Infect Immun 1993; 61: Adwank Abu-Hassan N, Essawi T, Bdir M. Isolation and characterization of shiga toxigenic Escherichia coli strains from northern Palestine. J Med Microbiol 2002; 51: Chart H, Perry NT, Cheasty T, Wright PA. The kinetics of antibody production to antigens of Escherichia coli O157 with hemolytic uremic syndrome. J Med Microbiology 2002; 51: March SB, Ratnam S. Sorbitol MacConkey medium for detection of Escherichia Coli O157:H7 associated with hemorrhagic colitis. J Clin Microbiol 1996; 23: Feng P, Robin C, Choong H, Richard A, Wilson N. Identification of rough strain of Escherichia Coli O157:H7 that produces no detectable O157 antigen. J Clin microbiol 1998; 36(8): Melton-Celsa AR, Alison D. O Brien. Structure, biology, and relative toxicity of shiga toxin family members for cells and animals. In: Kaper JB, O Brien AD.Escherichia Coli O157:H7 and other shiga toxin producing E.coli strains. 1st ed. American society for microbiology, Washington, 1998: Kerr G. Infections associated with shiga toxin-producing Escherichia coli: epidemiology, pathogenesis, diagnosis and management. Department of microbiology, University of leeds, The infections disease review 1989; 1(1): 9-14 ٩- شريفي ث. بررسي پاره اي از خصوصيات فيزيولوژيك اشريشياكلي هاي جداشده از نمونه هاي ادرار و مدفوع جهت شناسايي سويه انتروهموراژيك O157:H7 همراه با تعيين الگوي مقاومت ميكروبي باكتريهاي جداشده پايان نامه دانشكده پزشكي كرمان بهمن ماه ٨٠ با شماره ثبت ٧٧ 10. Pollard DR, Tyler SD, Rozee KR, Johnson MW, Lior H. Rapid and specific detection of verotoxin genes in Escherichia coli by the polymerase chain reaction. J Clin microbiol 1990: Slutsker L, Allen A, Katherine D, Joy G, Lori H, Patrica M. Escherichia coli O157:H7 diarrhea in the United States:Clinical and Epidemiologic Features. Annals of Internal Medicine, 1997; 126: Mead PS, Slutsker L, Dietz V, MCocaig LF, Bresee JS, Shapiro C. Food- related illness and death in the United States. Emerg Infect Dis, 1999; 5: Ramotan K, Waldhart B. Direct detection of verotoxin-producing Escherichia coli in stool samples by. J Clin Microbiol 1995 Mar: / 27 يافته دوره هشتم بهار ٨٥