مقاله پژوهشي 2 گروه زيست شناسي دانشگاه اصفهان اصفهان ايران. چكيده: مقدمه:

Transcript

1 مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 16 شماره 6/ بهمن و اسفند / مقاله پژوهشي ايجاد وكتورهاي تداخلي يوكاريوتي در ژنوم از psvm به آن (attb) با انتقال ناحيهي توالي اتصال *2 حميده جعفري 1 2 زهره حجتي 1 2 گروه زيست شناسي دانشگاه اصفهان اصفهان ايران. مركز تحقيقات سلولي و مولكولي دانشگاه علوم پزشكي شهركرد شهركرد ايران تاريخ دريافت: 90/12/13 تاريخ پذيرش: 93/8/18 چكيده: زمينه و هدف: ساليان زيادي است كه انواع مختلفي از سلوله يا تخمدان هامستر چيني (CHO) غالبا براي توليد اكثر محصولات دارويي استفاده ميشود. توليد داي مي در اين سلولهاي ميزبان يك چالش بزرگ است. هدف از اين مطالعه همسانه سازي ناحيه ي توالي اتصال در ژنوم باكتري (attb) در وكتور psvm با استفاده از سيستم نوتركيبي phic31 براي بقاي طولاني وكتور در سلوله يا CHO بوده است. روش بررسي: در اين مطالعه تجربي آزمايشگاهي يك جايگاه برش آنزيم محدود كنندهي PvuII به عنوان جايگاه كلونينگ توسط نرم افزار CLC در وكتور psvm انتخاب كه برش با اين آنزيم منجر به ايجاد دو انتهاي صاف در وكتور شد. دو پرايمر اختصاصي براي جداسازي و تكثير ناحيهي attb از وكتور pdrbb2 توسط نرم افزار Oligo 5 طراحي شد. ژل الكتروفورز و آناليز PCR بر روي قطعه تكثيرشده در جهت تاييد ساختار آن انجام شد. يافته ها: ناحيهي attb به طور موفق در داخل وكتور psvm الحاق شد و توسط ژل الكتروفورز نشان داده شد. در جهت تاييد ورود ژن attb در وكتور psvm واكنش colony PCR از كلنيهاي نوتركيب انجام شد و صحت كلونينگ با مشاهدهي باند مربوط به ترادف attb انجام گرفت. در اين تحقيق جايگاه attb در پلاسميد psvm همسانه سازي گرديد. با بهره گيري از اين اطلاعات و وجود جايگاه psedo attp در كروموزوم سلوله يا CHO مي توان بعد از الحاق ژن اينترفرون انساني در اين پلاسميد و ورود اين پلاسميد و پلاسميد حاوي آنزيم اينتگراز به سلوله يا CHO براي اولين بار زمينهي پايداري بيان اين پروتي ين را در سلوله يا CHO فراهم كرد. نتيجه گيري: واژه هاي كليدي: سلول هاي تخمدان هامسترچيني ناحيهي توالي اتصال در ژنوم يوكاريوتي نوتركيبي در جايگاه خاص وكتورهاي تداخلي وكتور.pSVM مقدمه: براي افزايش بيان پروتي ينهاي دارويي و نيز در زمينهي ژن درماني با هدف وارد شدن DNA خارجي به صورت پايدار در ژنوم ميتوان از سيستم نوتركيبي در جايگاه خاص در ژنوم بهره برد (1). با استفاده از اين سيستمها زمينهي الحاق اسيدهاي نوكلي يك (وكتور حاوي ژن مورد نظر) به صورت اختصاصي و پايدار در داخل ژنوم سلولهاي ميزبان فراهم ميشود. در اين سيستمها يك آنزيم ريكامبيناز يا اينتگراز نوتركيبي بين دو جايگاه را كاتاليز ميكند (2). - 1 سه نوع سيستم نوتركيبي در جايگاه خاص وجود دارد: سيستم نوتركيبي :cre/loxp يكي از تكنيكهاي الحاق ژني targeting) (gene است كه براي الحاق ژنها در جايگاه هاي ميشود. اين سيستم در باكتريوفاژ خاصي در ژنوم به كار برده P1 وجود دارد و * نويسنده مسي ول: اصفهان- دانشگاه اصفهان- گروه زيست شناسي- تلفن: z.hojati@sci.ui.ac.ir 9

2 ساخت وكتورهاي تداخلي شامل ناحيهي attb حميده جعفري و زهره حجتي آنزيم ريكامبيناز cre اينتگره شدن يك توالي DNA را در داخل يك جايگاه شناسايي 34 جفت بازي به نام جايگاه loxp كاتاليز ميكند (3). جايگاه loxp شامل يك توالي 8 bp در وسط و دو توالي 13 bp با ترادف تكراري معكوس در دو طرف توالي وسط ميباشد (4). مشكل اين سيستم برگشت پذير بودن واكنش نوتركيبي ميباشد. به دليل اينكه بعد از اينتگره شدن توالي DNA دو جايگاه loxp به عنوان سوبسترا براي آنزيم عمل كرده و منجر به خارج شدن توالي بين اين DNA جايگاهها ميشوند. اختصاصيت اين سيستم نوتركيبي در حدود %80 تخمين زده شده است. - 2 سيستم نوتركيبي :FLP/FRT اين سيستم نوتركيبي در ساكاروميسس سرويسيه وجود دارد. در اين سيستم آنزيم ريكامبيناز FLP كاتاليز كنندهي تواليهاي ژني شامل توالي FRT ميباشد. طول كامل جايگاه loxp است (3). اين جايگاه شبيه به توالي 48 bp FRT بوده ولي داراي سه ناحيهي تكراري 13 bp ميباشد. سيستم نوتركيبي FLP/FRT همانند سيستم cre/loxp واكنش نوتركيبي را به صورت برگشت پذير انجام ميدهد ولي اين سيستم برخلاف سيستم cre/loxp اختصاصيت نوتركيبي كمتر از %10 را نشان ميدهد. - 3 سيستم نوتركيبي اينتگراز :QC31 اين سيستم نسبت به دو سيستم قبلي بسيار پيچيدهتر ميباشد. نقش زيستي اين اينتگراز ميانجيگري اينتگره شدن فاژ QC31 به داخل ژنوم استرپتومايسس از طريق تواليهاي تحت هدف موجود در ژنوم هاي فاژ و باكتري است. اين تواليها به ترتيب شامل جايگاه توالي اتصال در ژنوم فاژي attp) (Attachment site in phage genome= و توالي اتصال در ژنوم باكتري attb) (bacterial genome Attachment site in= ميباشند (4). حداقل توالي عملكردي براي اين دو جايگاه به ترتيب شامل 39 و 34 جفت نوكلي وتيد است (5). اگرچه اين دو توالي با هم متفاوت هستند اما هر دو توالي در ناحيهي وسط داراي سه نوكلي وتيد مشترك ميباشند. در اين منطقه كراسينگ آور اتفاق جايگاه ه يا DNA شكافته شده و ميافتد (4). نوتركيبي بين DNA منجر به اينتگره شدن attp و attb در داخل ژنوم ميزبان شده و توالي اينتگره شده مجاور دو توالي هيبريد attl و attr جاي ميگيرد (6). اينتگراز QC31 آنزيمي متشكل از 613 آمينواسيد است و از اعضاي خانواده ي ريكامبينازهاي گروه سرين مي باشد (7). به طوركلي اين سيستم نسبت به دو سيستم قبلي مزايايي دارد از جمله اينكه در اين سيستم برخلاف دو سيستم قبل توالي الحاق شده كوفاكتورها اينتگراز عمل كند. در غياب يكسري از نميتواند به عنوان سوبسترا براي آنزيم بنابراين برخلاف دو سيستم قبلي آنزيم اينتگراز به صورت يك جهتي عمل كرده و به دليل خاصيت نوتركيبي برگشت ناپذير اين سيستم در الحاق ترانس ژنها در سلولهاي پستانداران كاربرد فراواني دارد (4). از طرفي در ژنوم موش و انسان چندين جايگاه شبه attp (psedo-attp) وجود دارد. اين تواليها شبيه به تواليهاي attp ميباشند (8). شباهت اين دو توالي در حدود - 40 %30 ميباشد.(5) بنابراين تواليهاي psedo attp ميتوانند به عنوان سوبستراي آنزيم QC31 عمل كنند. با اين خاصيت به عنوان مثال ميتوان همزمان پلاسميد حاوي ژن رونويسي كنندهي آنزيم اينتگراز و پلاسميد شامل توالي attb و ژن هدف را براي اينتگره شدن در جايگاههاي psedo-attb در سلول هاي CHO ترانسفكت كرد ولي اين سيستم اختصاصيت كمي در حدود %10 را دارا ميباشد. البته نوع جديدي از اين آنزيم توليد شده كه سيگنال جايگيري هسته اي در قسمت C-terminal آن تعبيه كردهاند و فعاليت آن افزايش يافته است. باتوجه به اينكه در زمينه ي توليد پروتي ين هاي دارويي از جمله اينترفرون بتا توليد پايدار يكي از اهداف مهم مي باشد و پروتي ين اينترفرون بتا در سلول هاي CHO به صورت ناپايدار توليد ميشود. هدف از اين مطالعه همسانه سازي ناحيهي attb در وكتور (Pluto, Saturn, Venus, and 10

3 مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 16 شماره 6/ بهمن و اسفند 1393 psvm) Mars= ميباشد تا در آينده بتوان با وارد كردن ژن اينترفرون بتا در آن و انتقال همزمان آن با وكتور pcmv int زمينهي الحاق داي مي ژن اينترفرون بتا در كروموزومه يا فراهم شود. روش بررسي: پلاسميد CHO و توليد داي م اين پروتي ين در اين مطالعه تجربي آزمايشگاهي از دو نوع استفاده شد: وكتور 1- :psvm dhfr اين وكتور در حدود 6400 جفت باز دارد و يك وكتور قابل تكثير در سلولهاي dhfr CHO ميباشد (10). اين وكتور حاوي قطعهاي از پلازميد pbr322 است كه ژن مقاومت به آمپيسيلين و مبدأ همانندسازي را دارا ميباشد. از اجزاي ديگر وكتور ميتوان به جايگاه آغاز همانندسازي و پروموتر SV40 اشاره كرد (11). حضور تواليهاي مشتق از pbr322 اجازه كلونينگ و تكثير پلازميد را در.E coli ميدهد در حاليكه تواليهاي مشتق از SV40 حاوي سيگنالهايي است كه توليد RNA هاي پيامبر عملكردي را در سلولهاي پستانداران باعث ميشود. وجود ژن dhfr بر روي اين وكتور امكان انتخاب سلولهاي dhfr CHO تراريخت شده با اين وكتور را ميدهد و ژن مقاومت به آمپيسيلين شرايط انتخابي را براي باكتريهاي حساس به آمپيسيلين فراهم ميآورد (12). - 2 وكتور :pdrbb2 طول اين وكتور 8308 bp ميباشد. يكي از اجزاي اين وكتور ژن attb است كه بين جايگاه برش آنزيم EcoR1 و HindIII قرار گرفته است. ژن مقاومت به هايگرومايسين (Hygromycin) به عنوان ماركر انتخابي عمل كرده و در دنبالهي پروموتر ترانسپوزون copia قرار گرفته است. هم چنين ژن مقاومت به آمپيسيلين نيز در وكتور وجود دارد. اين پلاسميد با تعداد كپي بالا در باكتري.E coli تكثير براي تهيه سلولهاي مستعد به روش كلريد كلسيم محلول CaCl 2 به صورت 100 ميليمولار تهيه و استريل شد. روش تهيه سلولهاي مستعد.E coli به اين صورت انجام شد: ابتدا يك كلوني.E coli تازه كشت يافته به لوله آزمايش حاوي 5 ميليليتر LB استريل تلقيح گرديد و در دماي 37 C در انكوباتور شيكردار rpm) 150) به صورت شبانه انكوبه شد. يك ميليليتر از كشت E. coli حاصل از مرحله قبل به ارلن سيسي 1000 حاوي 100 ميليليتر LB استريل منتقل شد و 3 تا 4 ساعت در انكوباتور شيكردار با شرايط قبل انكوبه شد تا جذب نوري آن در 600 نانومتر ) 600 (OD به محدوده 0/4-0/6 برسد. اين مرحله مناسب براي ادامه تراريختي ميباشد. 1 ميليليتر از محيط كشت مرحله قبل برداشته و در ميكروتيوب استريل ريخته شد و براي توقف رشد به مدت 10 دقيقه بر روي يخ قرار داده شد. ميكروتيوب به مدت 5 دقيقه در 3000 rpm و دماي 4 C سانتريفيوژ شد و مايع رويي تخليه شد. به رسوب حاصل 400 ميكروليتر 100 CaCl 2 ميلي مولار سرد اضافه شد و براي حل شدن رسوب به آرامي ورتكس شد. بعد از حل شدن رسوب ميكروتيوب به مدت 30 دقيقه بر روي يخ قرار داده شد بدين ترتيب سلولهاي مستعد.E coli جهت تراريختي آماده شدند. براي تراريختي باكتري.E coli سلولهاي مستعد مرحلهي قبل را روي يخ گذاشته و مراحل زير آنها بر روي انجام شد: در حدود 50 نانوگرم پلازميد به هر ميكروتيوب حاوي سلولهاي مستعد باكتريايي اضافه شد. ميكروتيوب حاوي باكتري به مدت 30 دقيقه بر روي يخ قرار داده شد. در جهت ايجاد شوك حرارتي ميكروتيوب به مدت 2 دقيقه در بن ماري حاوي آب 42 C قرار داده شد و پس از آن بلافاصله براي مدت 10 دقيقه روي يخ گذاشته شد.در اين مرحله 400 µl محيط كشت LB به هر ميكروتيوب اضافه شد و به مدت 1 ساعت در انكوباتور شيكردار با دماي 37 C و دور 150 قرار داده شد. در اين مدت ميكند (9). 11

4 ساخت وكتورهاي تداخلي شامل ناحيهي attb حميده جعفري و زهره حجتي باكتريها فرصت بيان ژن از جمله ژن مقاومت به RNase A به ميكروتيوب ها اضافه گرديد و به مدت آنتيبيوتيك را پيدا ميكنند. در حدود 200 µl از اين محلول بر روي محيط LBA حاوي آمپيسيلين كشت داده و در انكوباتور شيكردار در دماي 37 C به مدت يك شبانه روز قرار داده شد. بعد از رشد باكتريها بر روي سطح پليت يك كلني تك تراريخت شده جهت انجام استخراج پلاسميد انتخاب شد. استخراج پلاسميد در اين تحقيق با روش جوشاندن هلمس-كويجلي از باكتريهاي E. coli XL1-Blue صورت گرفت. يك تك كلني از باكتريهاي تراريختي در 10 cc محيط LB حاوي آنتي بيوتيك تلقيح شد و به مدت يك شب در انكوباتور شيكردار با دماي 37 C و 150 rpm قرار گرفت. 1/5 سيسي از محيط كشت به ويال استريل منتقل شد و 30 ثانيه در دماي 4 C و rpm سانتريفيوژ شد. مايع رويي تا حد امكان تخليه شد. 350 ml از بافر بافر ليز كنندهي باكتري (STET) و 25 μl از محلول ليزوزيم به پلت سلولي اضافه و كوتاه ورتكس شد. سپس نمونه ها 40 ثانيه در آب در حال جوشيدن قرار داده شد. باكتريهاي ليز شده به مدت 15 دقيقه در rpm و دماي اتاق سانتريفيوژ شد. محلول شفاف رويي را كه واجد DNA پلاسميدي بود به ميكروتيوب تميزي منتقل شد. به محلول واجد DNA پلاسميدي 40 μl استات سديم و 420 μl ايزوپروپانول اضافه شد و با ورتكس كوتاه مخلوط شد و سپس 5 دقيقه در دماي اتاق قرار گرفت تا DNA پلاسميدي رسوب كند. مدت 5 دقيقه در rpm و دماي 4 C سانتريفيوژ انجام داده شد. رسوب حاصل شامل DNA پلاسميدي و RNA بود. بنابراين مايع رويي به طور كامل خارج شد. 1 ميليليتر از اتانول %70 سرد به پلت سلولي اضافه و ورتكس كوتاه انجام داده شد. سپس به مدت 5 دقيقه در دماي 4 C و rpm سانتريفيوژ و مايع رويي دور ريخته شد. در ادامه ميكروتيوب ها در دماي C قرار داده شد تا باقيمانده الكل تبخير شود. 50 μl محلول + TE يك ساعت در دماي اتاق قرار داده شد (13). وكتور مترادف attb از تكثير قطعهي 353 جفت بازي از pdrbb2 به دست آمد. توالي پرايمرهاي مورد استفاده در اين تحقيق بدينصورت بودند. پرايمر پيشرو ژن 5 GGTACCCAGCTGATCGATG3 پرايمر attb پيرو ژن 5 GGATCGTCGACCTCGGAT3 attb از نظر نزديك بودن دماي اتصال هر دو جفت پرايمر عدم اتصال انتهاي 3 هر دو پرايمر توسط برنامه Oligo 5 بررسي شد. جفت پرايمر ژن attb محصولي به طول 353 جفت باز ميدهد. مواد مورد نياز براي انجام PCR بر روي يخ با هم مخلوط شدند و در دستگاه ترموسايكلر طبق برنامه مشخص به منظور تكثير قرار داده شدند. اين برنامه پس از بهينه سازي متعدد از نظر دما غلظت يون منيزيم و زمان عملكرد آنزيم پليمراز به دست آمد. بنابراين بعد از بهينه سازي شرايط واكنش PCR در سه ويال و هركدام مخلوطي به حجم نهايي PCR10x بافر 5 µl از PCR انجام گرفت. مخلوط 50 µl 2 µl MgSO 4 (25 mm) 2/5 µl از هردو پرايمر به غلظت 0/5 u 10 pmol از آنزيم Pfu DNA Pol و DNA پلاسميدي ngr/µl) 160) و آب به مقدار مناسب تشكيل شده بود. شرايط حرارتي دستگاه ترموسايكلر Genrmany) (Ependorf, جهت انجام PCR بدين شرح است. دناتوراسيون اوليه در دماي 95 5 به مدت ºc دقيقه در ادامه 35 چرخه كه هر چرخه شامل مرحله دناتوراسيون در دماي 94 ºc به مدت 1 دقيقه مرحله اتصال پرايمر در دماي 49 ºc به مدت 45 ثانيه و مرحله گسترش در دماي 70 ºc به مدت 1 دقيقه انجام گرفت و در آخر مرحله گسترش نهايي در دماي 72 ºc به مدت 10 دقيقه انجام گرفت. سپس اين سه ويال بر روي چاهك PCR بزرگي از ژل آگاروز %1 با بافر تشكيل دهندهي TAE بارگذاري شدند. و اين ژن از ژل آگاروز توسط كيت استخراج و خالص سازي DNA كياژن (ساخت كشور كره جنوبي) خالص سازي شد. 12

5 مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 16 شماره 6/ بهمن و اسفند پلاسميد psvm توسط روشهاي توضيح داده شده در بالا به باكتري.E coli XL1 Blue منتقل و سپس از باكتري استخراج شد. اين وكتور توسط آنزيم محدودكنندهي PvuII هضم گرديد. آنزيم PvuII پس از برش انتهاي صاف در وكتور ايجاد ميكند و به دليل اينكه هر ناحيه صاف به ناحيهي صاف ديگر ميچسبد نيازي به ايجاد جايگاه در پرايمرهاي تكثير كنندهي ناحيهي attb نبود. ابتدا واكنش برش آنزيمي وكتور psvm به اين صورت انجام شد: 25 µl پلاسميد G بافر 5 µl (10 u/µl) آنزيم 3/7 µl (300 ngr/ µl) (10X) و آب به حجم لازم تهيه گرديد. دو ويال از اين واكنش هر كدام به حجم 50 µl در دماي 37 C به مدت 3 ساعت در بن ماري انكوبه شدند. سپس بر روي ژل آگارز %1 بارگذاري شده و از ژل استخراج شدند. براي جلوگيري از اتصال مجدد پلاسميد هضم شده از آنزيم آلكالين فسفاتاز (MBI fermentase) Shrimp استفاده شد. واكنش تيمار با آنزيم آلكالين فسفاتازبه اين صورت انجام شد: 25 µl پلاسميد µl) 300) ngr/ 1 µl آنزيم u/µl) 5 µl (10 بافر X) (١٠ و آب به حجم لازم تهيه شد (2 ويال 50 تايي). اين مخلوط 30 دقيقه در دماي 37 C در بن ماري انكوبه گرديد. بعد از عملكرد آنزيم ويالها در جهت غير فعال سازي آنزيم در دماي C 65 به مدت 15 دقيقه انكوبه شدند. و بعد از بارگذاري وكتور بر روي ژل آگارز خالص سازي آن از ژل صورت گرفت. براي انجام واكنش ligation ابتدا بايستي غلظت قطعه وارد شونده به داخل وكتور توسط فرمول زير طبق پروتكل آنزيم T4 DNA ligase خريداري شده از شركت MBI Fermentase محاسبه شود. غلظت قطعهي وارد شونده (ng) برابر است با: غلظت پلاسميد R (ng) غلظت پلاسميد (ng) R (طول پلاسميد / طول قطعهي وارد شونده) نسبت مولي قطعهي وارد شونده به پلاسميد= R در طبق فرمول بالا نسبت مولي براي اين واكنش در نظر گرفته شد. سپس به ترتيب 353 قطعات و 6400 جفت باز از ژن و وكتور در فرمول بالا قرار گرفت. در نتيجه با اين مقادير غلظت وكتور 15 نانوگرم محاسبه شد. واكنش الحاق به اين صورت انجام شد: 320 ng/µl وكتور 120 ng/µl ژن attb بافر (X 10) 2 ماكرو ليتر و آنزيم ليگاز فرمنتاز 1µl و آب به حجم لازم تا حجم 20 ماكروليتر مخلوط شدند. سپس اين واكنش در دماي 22 درجه در بن ماري به مدت يك شبانه روز قرار داده شد. بعد از عملكرد واكنش آنزيم در دماي 65 درجه بن ماري به مدت 10 دقيقه غير فعال گرديد. و سپس حجم 20 ماكروليتر از اين واكنش ماكروليتر 200 گرديد. واكنش سلول colony PCR مستعد باكتري براي تراريخت كلنيهاي رشد يافته انجام شد. واكنش colony PCR همانند واكنش صورت PCR ميگيرد با اين تفاوت كه به جاي پلاسميد از كلنيهاي نوتركيب با خلال دندان استريل برداشته و به مخلوط PCR اضافه ميكنيد. يافته ها: باكتري غلظت پلاسميد pdrbb2 استخراج شده از E. coli XL1-Blue توسط دستگاه اسپكتوفتومتري 80 ng/µl محاسبه شد (نتايج نشان داده نشدهاند). غلظت محصول ژن attb خالص سازي شده از ژل آگاروز %1 ng/µl 15 به دست آمد. (تصوير شماره 1). پلاسميد psvm استخراج شده از باكتري PvuII مورد برش آنزيمي با آنزيم.E coli XL1-Blue قرار گرفت و غلظت پلاسميدهاي هضم شده حاصله 200 ngr/µl برآورد شد (تصوير شماره 2). بعد از تاثير پلاسميد هضم شده با آنزيم آلكالين فسفاتاز و خالص سازي آن از ژل آگارز %1 غلظت پلاسميد 40 ng/µl بود (نتايج نشان داده نشدهاند). سپس پلاسميد و ژن attb طبق واكنش الحاق تحت اثر آنزيم ليگاز قرار گرفتند و پلاسميدهاي نوتركيب به باكتري E.coli 13

6 ساخت وكتورهاي تداخلي شامل ناحيهي attb حميده جعفري و زهره حجتي.XL1-Blue تراريخت شدند (تصاوير شماره 3 و 4). در جهت تاييد ورود ژن attb در وكتور psvm واكنش colony PCR از كلنيهاي نوتركيب انجام شد و صحت كلونينگ با مشاهدهي باند مربوط به ترادف attb انجام گرفت. (تصاوير شماره 5 و 6). در واكنش نوتركيبي بين ناحيهي attb از وكتور psvm و ناحيهي psedo-attp در كروموزومه يا CHO جهت قطعهي attb مهم نميباشد و در هردو جهت واكنش نوتركيبي به درستي انجام ميشود. تصوير شماره 3 : مراحل مختلف شكل گيري پلازميد ps-attb با استفاده از وكتور pdrbb2 و پلازميد psvm dhfr تصوير شماره 4: كلنيهاي حاصل از تراريختي باكتري Ps-attB با وكتور E. coli XL1-Blue تصوير شماره 1 : ژن توالي اتصال در ژنوم باكتري (attb) تكثير و جدا شده از وكتور pdrbb2 با استفاده از PCR محصول PCR بر روي ژل آگارز %1 جهت خالص سازي از ژل بارگذاري شد. M ماركر 100 جفت بازي. تصوير شماره 2: تاييد ساختار پلازميد psvm dhfr با استفاده از هضم با آنزيم PvuII اين آنزيم بر روي اين پلازميد يك جايگاه برش دارد :psvm un cut پلاسميدهاي برش داده شده و :psvm cut برش نخورده بر روي ژل آگارز 1 % تصوير شماره 5: تاييد كلونينگ ژن توالي اتصال در ژنوم باكتري (attb) با استفاده از colony PCR محصول PCR بر روي ژل آگارز %1 بارگذاري شد. M ماركر 100 bp ستون ا تا 3 نتايج colony PCR براي سه كلني نوتركيب را نشان ميدهد..1 kb ماركر M 14

7 مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 16 شماره 6/ بهمن و اسفند تصوير شماره 6: ساختار پلازميد psvm dhfr -attb با استفاده از هضم با آنزيم PvuII اين آنزيم بر روي اين پلازميد يك جايگاه برش دارد :cut پلاسميدهاي برش داده شده و :uncut پلاسميد برش نخورده (پلاسميد dhfr -attb بحث: psvm و ( psvm:dhfr بر روي ژل آگارز.%1 M ماركر.1 Kb DNA در اين تحقيق جايگاه attb در پلاسميد psvm با استفاده از سيستم نوتركيبي phic31 همسانه سازي گرديد. در طول گذشته امكان طراحي مولكوله يا 25 DNA سال جديد در لولهي آزمايش در نتيجهي پيشرفت تكنيكهاي DNA نوتركيب فراهم آمده است اما قابليت كنترل تغييرات در ژنوم سلولي محدود است. استفاده از سيستمهاي نوتركيبي در جايگاه خاص در جهت حل اين مشكل حاي ز ميتواند جايگاه خاص اهميت باشد. دو سيستم نوتركيبي در Cre و Flp واكنش نوتركيبي را به صورت برگشت پذير انجام ميدهند و اغلب در ايجاد حذف ژني كاربرد دارند. ولي سيستم نوتركيبيPhic31 به دليل خاصيت برگشت پذيري واكنش كاربرد بيشتري خواهد داشت (14). با وارد كردن پلاسميدهاي خارج كروموزومي در سلولهاي انساني مشخص شده است كه اينتگراز Phic31 واكنش الحاق DNAخارجي را در كروموزومهاي انساني با كارآمدي بيش از %50 ميانجي گري ميكند. اين نتايج نشان داد كه اينتگراز Phic31 در جهت الحاق DNA خارجي در كروموزومهاي پستانداران مفيد ميباشد. با ايجاد ردهي هاي سلولي موشي و انساني كه شامل جايگاههاي att الحاق شده در نواحي تصادفي در اين كروموزومها بودند. واكنش نوتركيبي و الحاق DNA خارجي در كروموزوم اين ردهي هاي سلولي با موفقيت انجام شد. از طرفي با شناسايي جايگاههاي شبه attp در انسان و موش قابليت الحاق DNA خارجي در ژنوم اين سلولها در حضور جايگاه attb و آنزيم اينتگراز انجام شدني است. با وجود اين استراتژي قابليت تغيير ژنوم سلولهاي زنده در جايگاههاي از قبل تعيين شده وجود دارد (14). عملكرد كارآمد اين سيستم نوتركيبي در سلوله يا جنيني دروزوفيلا ملانوگاستر توسط Groth و همكاران (2003) نشان داده شد. نوتركيبي درون مولكولي در اين سلولها با ترانسفكت كردن پلاسميد حاوي جايگاههاي attb و attp و پلاسميد حاوي آنزيم اين حشره شناسايي كردند كه جايگاه شناسايي آنزيم اينتگراز بوده و به عنوان سوبسترا براي وارد شدن در داخل سلوله يا جنيني استفاده ميشدند. در آزمايشي ديگر Thomason و همكاران (2004) با ترانسفكت كردن پلاسميد (attb ژن كد كننده يوراسيل و جايگاه (حاوي ptl45 و هم چنين پلاسميد حاوي آنزيم اينتگراز در مخمر ساكاروميسز پمبه باعث جاگيري الل يوراسيل در كروموزوم مخمر شدند. آنها در آزمايشي ديگر با ترانسفكت كردن پلاسميد حاوي جايگاه attb و ژن GFP همراه با پلاسميد حاوي ژن اينتگراز زمينهي الحاق پايدار ژن GFP را در كروموزومه يا CHO فراهم كردند (3). در سال 2002 دانشمندان نيز با ترانسفكت كردن پلاسميد حاوي جايگاه attb و ژن لوسيفراز و پلازميد حاوي ژن اينتگراز در سلوله يا 293 انساني باعث پايداري بيان اين پروتي ين در طول 4 هفته گرديدند. اين در حالي بود كه بيان پروتي ين بدون ورود جايگاههاي attb و آنزيم اينتگراز بسيار سريع و

8 ساخت وكتورهاي تداخلي شامل ناحيهي attb حميده جعفري و زهره حجتي ناپايدار بود. با وابستگي اين پايداري در بيان پروتي ين به جايگاه attb و آنزيم اينتگراز پيشنهاد كردند كه ميبايست ترادف خاصي نوتركيبي را فراهم كند. اين آزمايش در مورد سلوله يا موشي 3T3 نيز انجام شد و نتايجي مشابه به دست آمد (4). در مقالهاي ديگردر سال 2002 از اين تكنيك در زمينهي ژن درماني استفاده شد. آنها با تزريق يك پلاسميد حاوي يك جايگاه attb و يك پلاسميد بياني حاوي ژن فاكتور 8 انساني و پلاسميد حاوي ژن اينتگراز در سلوله يا كبدي موش باعث افزايش فاكتور 8 سرمي به ميزان 10 برابر بيشتر از ميزان معمول آن شدند. اين توليد پايدار به مدت 8 ماه در سلوله يا كبدي موش ادامه يافت (2). نتيجه گيري: با بهره گيري از اين اطلاعات و وجود جايگاه در كروموزوم سلوله يا CHO در اين psedo-attp تحقيق جايگاه attb در پلاسميد psvm همسانه سازي گرديد. تا بتوان بعد از الحاق ژن اينترفرون انساني در اين پلاسميد و ورود اين پلاسميد و پلاسميد حاوي آنزيم اينتگراز به سلوله يا بيان اين پروتي ين را در سلوله يا تشكر و قدرداني: ك كم از CHO براي اولين بار زمينهي پايداري CHO فراهم كرد. هاي مالي دانشگاه اصفهان بالاخص تحصيلات تكميلي تشكر فراوان ميگردد. منابع: 1. Olivares EC, Hollis RP, Chalberg TW, Meuse L, Kay MA, Calos MP. Site-specific genomic integration produces therapeutic Factor IX levels in mice. Nat Biotechnol. 2002; 20(11): Richard C, W OD, Lynn T. Dna recombination in eukaryotic cells by the bacteriophage phic31 recombination system. Google Patents; Liu Y, Thyagarajan B, Lakshmipathy U, Xue H, Lieu P, Fontes A, et al. Generation of platform human embryonic stem cell lines that allow efficient targeting at a predetermined genomic location. Stem Cells Dev. 2009; 18(10): Sorrell DA, Kolb AF. Targeted modification of mammalian genomes. Biotechnol Adv. 2005; 23(7-8): Groth AC, Olivares EC, Thyagarajan B, Calos MP. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97(11): Gupta M, Till R, Smith MC. Sequences in attb that affect the ability of phic31 integrase to synapse and to activate DNA cleavage. Nucleic Acids Res. 2007; 35(10): Ginsburg DS, Calos MP. Site-specific integration with phic31 integrase for prolonged expression of therapeutic genes. Adv Genet. 2005; 54: Chalberg TW, Genise HL, Vollrath D, Calos MP. phic31 integrase confers genomic integration and long-term transgene expression in rat retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46(6): Groth AC, Fish M, Nusse R, Calos MP. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 2004; 166(4): Lee F, Mulligan R, Berg P, Ringold G. Glucocorticoids regulate expression of dihydrofolate reductase cdna in mouse mammary tumour virus chimaeric plasmids. Nature Nov 19; 294(5838): Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 2007; 189(23):

9 مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 16 شماره 6/ بهمن و اسفند Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 th edition. New York: Cold Spring Harbor laboratory Press; Holmes DS, Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal Biochem. 1981; 114(1): Thyagarajan B, Olivares EC, Hollis RP, Ginsburg DS, Calos MP. Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phage phic31 integrase. Mol Cell Biol. 2001; 21(12):

10 Journal of Shahrekord University of Medical Sciences (J Shahrekordy Univ Med Sci) 2015 Feb, Mar; 16(6): Original article Construction of eukaryotic integrative vectors by insertion of the integration region attb in psvm Jafari H 1,2, Hojati Z 2* 1 Cellular and Molecular Research Center, Shahrekord University of Medical Sciences, Shahrekord, I.R. Iran; 2 Biology Dept., University of Isfahan, Isfahan, I.R. Iran. Received: 3/Mar/2012 Accepted: 9/Nov/2014 Background and aims: Different varieties of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells are being used frequently for producing most pharmaceutical products for many years. Permanent production in these host cells is a major challenge. The aim of this study was to integrate the vector permanently in the genome. In this study, the phic31 site-specific recombination system was used for prolonged maintenance of the vector in the CHO cells. Methods: In this laboratory experimental study, a restriction enzyme cut site (PvuII) was selected as a cloning site in the psvm vector using CLC software. Cutting with this enzyme led to create two blunt ends into the vector. Two specific primers were designed for isolation and amplification of attb region from pdrbb2 vector, using Oligo 5 software. Gel electrophoresis and PCR analysis were performed on the amplified fragment in order to confirmation of its structure. Results: The attb region was successfully integrated in to psvm vector and was shown by gel electrophoresis. Colony PCR technique has revealed the correct structure of the reconstructed vectors. Conclusion: In this study, the phic31 integrate catalyzes recombination between pseudo-attp sites (in CHO chromosomes) and attb site. A new construct has been made in this project containing attb site. This construct has to be introduced into CHO cells accompanied with pcmv-int vector (co-transfection) containing integrase. This integrase facilitates the incorporation of the psvm vector into the chromosome, in order to get a permanent existence of the new construct into the CHO cells. Keywords: CHO cells, Eukaryotic genome attachment site, Site-specific recombination, recombination, Construct, Gel electrophoresis. Cite this article as: Jafari H, Hojati Z. Construction of eukaryotic integrative vectors by insertion of the integration region attb in psvm. J Shahrekord Univ Med Sci. 2015; 16(6): * Corresponding author: Biology Dept., Faculty of Science, Esfahan University, Esfahan, I.R. Iran, Tel: , z.hojati@sci.ui.ac.ir 18