Μοριακή δοµή του HIV - Ανοσολογία. Κατερίνα Ψαρρά Τµήµα Ανοσολογίας Ιστοσυµβατότητας Γ.Ν.Α. «Ο Ευαγγελισµός»

Transcript

1 Μοριακή δοµή του HIV - Ανοσολογία Κατερίνα Ψαρρά Τµήµα Ανοσολογίας Ιστοσυµβατότητας Γ.Ν.Α. «Ο Ευαγγελισµός»

2 Φωτογραφία ηλεκτρονικού µικροσκοπίου της ιικής εκβλάστησης Charlie Dauguet, Οµάδα Ινστιτούτου Pasteur, Παρασκευή 4/2/1983 5:45µµ

3

4 Ο ιός εκβλαστάνει από το κύτταρο

5 HIV human immunodeficiency virus ιός της ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου ρετροϊός RNA ιός

6 The HIV genome is composed of 9 genes, which encode 15 proteins. hmp://tcf.epfl.ch/page en.html hmp://biology.kenyon.edu/slonc/ gene- web/lenhviral/ Lenhvi2.html For comparison, the E. Coli bacterium contains around 4,377 genes and the human genome encodes around 21,000 genes.

7

8 HIV Genome HIV RNA R U5 U3 R Reverse transcription HIV DNA Integration Host DNA U3 R U5 U3 R U5 Host DNA LTR LTR

9 HIV-1 RNA R U5 U3 R RRE Nature Reviews Microbiology 2, (June 2004)

10 Host DNA HIV-1 Integrated DNA U3 R U5 U3 R U5 Host DNA LTR LTR CD4 & MHC downregula2on Modified from : The AmFAR AIDS Handbook, D Ward, pp. 348

11 RNA Splicing Translational Frameshift

12 Source: The Molecular Biology of HIV/AIDS, D Ward, pp. 19 These are the major spliced RNA species, but HIV can actually produce at least 109 different spliced RNAs (Nucleic Acids Res Nov 1;40[20])

13 Initiation of HIV transcription is performed by cellular factors Source: Atlas of Infectious Diseases, Mandell & Mildvan (ed.), pp. 3.13

14 Dr. Isabelle BOUALLAGA Institut Pasteur.

15 Source: Atlas of Infectious Diseases, Mandell & Mildvan (ed.), pp. 3.13

16 HIV Proteins Structural Proteins Gag: Matrix, Capsid, NC, p6 Pol: Protease, Reverse Transcriptase, Integrase Env: gp120, gp41 Regulatory Proteins Tat Rev Nef Accessory proteins Vif Vpr Vpu

17 Structural protein expression and function CD4 & MHC downregula2on

18 Gag and Gag-Pol Source: The Molecular Biology of HIV/AIDS, D Ward, pp. 19

19 Gag and Gag-Pol Source: BioAfrica Bioinformatics for HIV Research.

20 Gene/Protein Mass, KDa Function gag (Pr) 55gag p55 Gag precursor protein MA - Matrix p17 Aids nuclear import and viral assembly CA - Capsid p24 HIV central core contains HIV genome and enzymes p6 NC - Nucleocapsid p6 p7/p9 Precise location in virion unknown, not generally present in other retroviruses, may aid in incorporation of Vpr into virion Assoc. with HIV RNA, involved in packaging of HIV RNA into virions myristate Association with membrane Formation of Gag multimers RNA binding RNA packing Matrix p17 Capsid p24 p2 NC p9 p1 p6 Envelope Incorporation Viral Budding Viral Entry

21 Source: BioAfrica Bioinformatics for HIV Research.

22 Gene/Protein Mass, KDa Function pol (Pr) 160gag-pol p160 Gag- Pol precursor protein PR - protease p10 Cleaves Gag and Gag-Pol IN - integrase p32 Integrates viral genome into host DNA RT reverse transcriptase p66/p51 p66 copies RNA genome. RNAse H p51 regulatory? Gag p6 PR p10 RT IN p32 p51 p66

23 Envelope Source: The Molecular Biology of HIV/AIDS, D Ward, pp. 19

24 Gene/Protein Mass, KDa Function env (Pr) 160 env gp160 Env precursor protein SU Envelope gp120 Surface glycoprotein that binds CD4 TM - Transmembrane gp41 Transmembrane protein that anchors gp120 to virus, responsible for fusion between virus and host cell membrane.

25 Gene/Protein Mass, KDa Function gag (Pr) 55gag p55 Gag precursor protein MA - Matrix p17 Aids nuclear import and viral assembly CA - Capsid p24 HIV central core contains HIV genome and enzymes p6 Precise location in virion unknown, not generally present in other retroviruses, may aid in incorporation of Vpr into virion NC - Nucleocapsid p7/p9 Assoc. with HIV RNA, involved in packaging of HIV RNA into virions pol (Pr) 160gag-pol p160 Gag- Pol precursor protein PR - protease p10 Cleaves Gag and Gag- Pol precursor proteins IN - integrase p31 Integrates viral genome into host DNA RT reverse transcriptase p6 p66/p51 p66 copies RNA genome. RNAse H p51 functions in RT heterodimer env (Pr) 160 env gp160 Env precursor protein SU Envelope gp120 Surface glycoprotein that binds CD4 and coreceptors TM - Transmembrane gp41 Transmembrane protein that anchors gp120 to virus, responsible for fusion between virus and host cell membrane

26 Regulatory proteins Source: The Molecular Biology of HIV/AIDS, D Ward, pp. 19

27 Regulatory Proteins: TAT: Trans-Activator of Transcription REV: Regulator of Virion protein expression NEF: Negative Regulatory Factor Accessory Proteins: VIF: Virion Infectivity Factor VPU: Viral Protein U VPR: Viral Protein R

28 TAT: Trans-Activator of Transcription TAR Poor transcription

29 TAT: Trans-Activator of Transcription TAR Positivefeedback loop Poor transcription Recruitment of CDK9 Tat Tat Tat Tat Tat CDK9 Enhanced transcription

30 REV: Regulator of Virion protein expression RRE = rev-response element

31 NEF: Negative Regulatory Factor * Downmodulation the expression of several surface molecules important in host immune function: MHC I, MHC II, CD4 * T-cell activation (activates the production of MIP-1alpha and MIP-1beta in macrophages)

32 VIF: Virion Infectivity Factor

33 VPU: Viral Protein U Involved in viral budding, enhancing virion release from the cell Counteracts Tetherin (Bst2/CD317/HM1.24) Tetherin Downregulation of CD4

34 VPU: Viral Protein U * Involved in viral budding, enhancing virion release from the cell * Downregulation of CD4 VPR: Viral Protein R * Regulation of nuclear import of the HIV-1 pre-integration complex * Required for virus replication in non-dividing cells such as macrophages. * Induces cell cycle arrest and apoptosis in proliferating cells

35 Gene/Protein Mass, KDa Function tat Tat p14 Transactivates HIV transcription (kinase adaptor to RNAP2). rev Rev p19 Nuclear export of unspliced & single-spliced RNA (via RRE). nef vif vpu Nef p27 Internalizes cell-surface CD4 & MHC Class I molecules. May enhance cellular activation. Vif p23 Overcomes a post-entry block to infection. May influence virion assembly. Vpu p16 Facilitates virion release via ion channel formation. Targets CD4 for destruction in ER (freeing bound env). vpr Vpr p15 Targets the HIV pre-integration complex to the nucleus. Arrests activated cells in G2 phase of cell cycle.

36 HIV_Mature_and_Immature.PNG

37

38 Take-home points: Structure: Env is only exposed viral protein in virion (neutralization resistant) Binding/fusion with host cell is mediated by gp120 & gp41 (CD4 & CCR5 or CXCR4) RNA genome -- requires HIV reverse transcription to DNA integration requires HIV integrase LTR/promoter requires cellular transcription factors HIV protease activity is needed for generation of infectious virions accessory genes modulate: 1) cellular function (e.g., nef, vpr) 2) viral gene expression (e.g., tat, rev) Capsid (p24) represents the primary structural component of virion small molecule inhibitors of these structure s functional activity represent the primary current antiviral therapeutic strategies

39 Γονίδια του HIV

40

41 HIV family tree hmp:// types.htm

42 Groups Genetic subtypes of HIV-1 M O N P Clades or Subtypes Subclades A-H, J (9) F1 &F2 Limited Spread 1 infected person Reported 09 2nd infected person Reported 10 Strains or isolates JR-CSF 8 full, and 5 partial, Genome sequences

43 Σύντοµη ιστορία των θεωριών για τη δυναµική των Τ λεµφοκυττάρων στην HIV λοίµωξη Η έκβαση της πρώτης-πρώτης αλληλεπίδρασης µεταξύ HIV και ξενιστή βάζει µπρος το ρολόι για την πορεία της λοίµωξης που ακολουθεί.

44 Στα άτοµα µε µακρά επιβίωση επιτυγχάνεται κατάσταση ισορροπίας «ιού-ανοσίας» µεταξύ Ιού σε πολλαπλασιασµό CCR5+CD4+ κυττάρων Κυτταροτοξικών Τ κυττάρων, αντισωµάτων και άλλων ανοσιακών µηχανισµών Τροποποίηση της πορείας κατά τα αρχικά στάδια της λοίµωξης δίνει νέες ελπίδες στη µάχη κατά του HIV

45 Γεγονότα µετά τη λοίµωξη HIV που καταλήγουν στην εξέλιξη προς AIDS CA Jansen 2006

46 Οι παράμετροι του ιού στον ξενιστή που χαρακτηρίζουν την έκβαση της πρωτολοίμωξης μέγιστο ιικό φορτίο (peak viral load) set point της ιαιμίας τελικό σημείο μελετών ανοσιακής απάντησης έναντι του HIV Πολύ νωρίς στη λοίμωξη Ανεξάρτητο περιβάλλοντος

47 Ο ιός

48 Χαρακτηριστικά του HIV υπό µετάδοση Μείωση της ποικιλότητας του HIV Γενετικός περιορισμός (bo7leneck) Βιολογικά χαρακτηριστικά : 1. Υπότυπος HIV 2. τρόπος μετάδοσης : Σεξουαλική μετάδοση Από μητέρα σε παιδί ακεραιότητα βλεννογόνου αντισώματα μητέρας

49 HIV-1 Tropism X4-tropic R5-tropic Maraviroc Blocks interacion of gp120 with CCR5 AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES. Volume 21, Number 2, 2005, pp

50 Περιορισμός ποικιλότητας του HIV στη θύρα εισόδου Ακεραιότητα βλεννογόνου Βλέννη Ελαττωματικά ιικά σωματίδια Langerin πάνω στα κύτταρα Langerhans επιταχύνει την καταστροφή των ιικών σωματιδίων (ίσως να μην υπάρξει μετάδοση σε CD4 κύτταρα) Υπάρχουν διαφορές σε σχέση με τον υπότυπο του HIV και τη γλυκοζυλίωση Επομένως κατά τις πρώτες ημέρες μετά τη λοίμωξη έχουμε ομογενή ιό

51

52 Ελαττωµατικός ιός; Πειράµατα µε εξασθενηµένο ιό Δεν αρκεί για κατάσταση elite Συνήθως long term non progressor (πολύ λίγοι elite controllers)

53 Ελαττωµατικός ιός; Αποµόνωση από elite controllers Gag, pol, env υποστηρίζουν πολύ λιγότερο τον ιικό πολ/σµό σε ουδέτερο σκελετό ιού Συνδυασµός οξείας λοίµωξης µε εξασθενηµένο στέλεχος ιού και Συσσώρευση µεταλλάξεων διαφυγής

54 Μοντέλλο για τη σπάνια µετάδοση ελαττωµατικών ιών σε άτοµα µε ποικίλο γενετικό υπόβαθρο

55 Ο ξενιστής

56 Επίδραση των HLA αλληλίων σε διαφορετικά στάδια της HIV λοίμωξης HLA- B*35 κακή πρόγνωση

57 Elite controller ή elite suppressor δηµογραφικά ετερογενής οµάδα ποικίλης εθνογραφικής προέλευσης ποικίλοι τρόποι µετάδοσης του HIV υψηλό ποσοστό προστατευτικών αλληλίων HLA (HLA-B27, HLA-B57)

58 Ανάλυση των SNPs σε γονίδια με γνωστή ή υποψία για επίδραση στην HIV λοίμωξη

59 >300 αµινοξέα µέσα στο MHC και πουθενά αλλού HLA-B HLA-C Science 2010

60 Ποικιλότητα παραγόντων της φυσικής ανοσίας DC- SIGN και DC- SIGNR και Toll- like receptors πολυμορφισμοί Εγγενής ανοσία (ενδοκυττάρια συστατικά) π.χ TRIM5a και APOBEC3G Χημειοκίνες, κυτταροκίνες και υποδοχείς KIRs

61 Συμπεράσματα από αναλύσεις συσχέτισης που αφορούν το ολικό ανθρώπινο γονιδίωμα HLA- B * 5701 και κοντά στο HLA- C (15% της ποικιλότητας) σε συσχέτιση με το set point της ιαιμίας 7 SNPs στο ή κοντά στο γονίδιο της RNF39 και του ZNRD1 (RNA πολυμεράση) σε συσχέτιση με την απάλειψη των CD4+ κυττάρων

62 Μετάδοση του HIV μέσω βλεννογόνου Σεξουαλική μετάδοση από άνδρα 65% Μητέρα σε παιδί Ανώτερο γαστρεντερικό (κατάποση αμνιακού υγρού) in utero Μολυσμένο αίμα και εκκρίσεις κατά τον τοκετό Μολυσμένο γάλα κατά το θηλασμό

63 Ανίχνευση των μολυσμένων κυττάρων στο λεμφικό ιστό του εντέρου στην HIV λοίμωξη

64 Potential Mechanisms for HIV-1 Transmission Across Mucosal Epithelium

65 B.L. Shacklett & P.A.Anton. Curr Infect Dis Rep (2010) 12: 19 27

66

67 Είδη κυττάρων που μολύνονται στο βλεννογόνο Δενδριτικά (DC- SIGN και CX3CR1) CD4+ T λεμφοκύτταρα (CCR5 και CCR5/ CXCR4) (μέσα σε 4-6 εβδομάδες) Επιθηλιακά κύτταρα (CCR5) Μακροφάγα (CCR5 και CXCR4 ) Ταχεία καταστροφή ακεραιότητας βλεννογόνου

68 Φυσική ανοσία έναντι του HIV Δενδριτικά κύτταρα και HIV στην AHI NK κύτταρα και HIV στην ΑΗΙ

69 Δενδριτικά κύτταρα και HIV Χαμηλό ποσοστό HIV+ δενδριτικών κυττάρων ίσως λόγω APOBECs Μέσω DC- SIGN μολύνουν τα CD4+ κύτταρα και προκαλούν διασπορά του ιού μέσω Langerin ο HIV καταστρέφεται στα κοκκία Birbeck pdcs αλλά όχι mdcs στο ΠΑ

70 Δενδριτικά κύτταρα μόλις συναντήσουν τον HIV

71 NK κύτταρα και HIV στην ΑΗΙ Αύξηση NK στο ΠΑ γύρω στο peak της ιαιμίας πριν την ορομετατροπή και την ανάπτυξη ειδικών για τον HIV CD8+ λεμφοκυττάρων CD3- CD56dim NK (κυτταροτοξική δράση) ποσοστό στο ΠΑ και NK δραστικότητα KIR3DS1/Bw4-80Ile συνδυασµός

72 HIV λοίμωξη Αλληλεπιδράσεις μεταξύ συνδετών α) σε μη μολυσμένο κύτταρο β) σε HIV- μολυσμένο κύτταρο και υποδοχέων ενεργοποίησης/ αναστολής των ΝΚ κυττάρων

73 Χυμική ανοσία στην ΑΗΙ Εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι env, gag!!! (έτσι δημιουργούνται τα στελέχη διαφυγής) - plateau μετά 1 χρόνο ADCC, φαγοκυττάρωση ; Δυσλειτουργία Β κυττάρων

74 B Cells during HIV Infection Nature Reviews Immunology 9, (April 2009)

75 Δυναμική του μεγέθους και της ποικιλότητας του πληθυσμού του ιού και των τίτλων και ποικιλότητας εξουδετερωτικών αντισωμάτων (IgG) στη διάρκεια τυπικής λοίμωξης HIV

76 Διαφυγή από τα εξουδετερωτικά αλλά και μη εξουδετερωτικά αντισώματα Σε μεγάλο βαθμό στην ΑΗΙ Αντικατάσταση, προσθήκη και απαλοιφή αμινοξέων στην αγκύλη V3 του env αλλά και εκτός V3 Είδος ιού «Ασπίδα γλυκοζυλίωσης» Περαιτέρω μελέτες στην ΑΗΙ

77 Factors contribu2ng to the ineffec2ve an2body response against HIV Impediment High degree of HIV diversity Poor immunological access to conserved HIV Env regions Delay in neutralizing antibody response Rapid viral mutation rate and selection pressure Consequence Challenge for vaccine-induced immunity Few broadly reactive neutralizing antibodies Virus dissemination Virus escape Paucity of virus-specific IgAs at mucosal sites Virus dissemination Polyclonal activation Natural antibodies cross-react with self antigens Functional exhaustion of B cells Paucity of IgM + memory B cells Interference by Nef Env, envelope protein. Few specific antibodies of low specificity; few memory B cells Tolerance Few specific antibodies of low specificity Decreased natural immunity Suppressed class switching Nature Reviews Immunology 9, (April 2009)

78 Μεταλλάξεις του HIV από το 1980 (τετράγωνα) 1990 (κύκλοι) (τρίγωνα)

79 Ειδική ανοσιακή απάντηση στην ΑΗΙ CD4+ T λεμφοκύτταρα CD8+ T λεμφοκύτταρα

80 Η διφασική ελάττωση των CD4+ λεµφοκυττάρων κατά την εξέλιξη της HIV λοίµωξης Οξεία HIV λοίµωξη : It takes more than guts... Η απώλεια των CD4 κυττάρων αφορά όλους τους ιστούς

81 απώλεια ειδικών για τον HIV CD4+ κυττάρων δυσλειτουργία CD8+ CTL

82 Zvi Grossman et al. Nature Medicine 12, (2006)

83 Differential expression of HIV-1 co-receptors CCR5 and CXCR4 on CD4 + T-cell subsets Paul R. Gorry & Petronela Ancuta. Curr HIV/AIDS Rep (2011) 8:45 53

84 Η πρώιµη απώλεια των µνηµονικών CD4+ κυττάρων στους βλεννογόνους µπορεί να είναι το κλειδί που καθορίζει την εξέλιξη της HIV λοίµωξης Z Hel et al 2006

85 Mario Stevenson. Nature Medicine July 2003, Volume 9 No 7

86 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ELITE CONTROLLERS

87 CD4+ T λεµφοκύτταρα Πολυλειτουργικά Μακρόβια Μνηµονικά Ειδικά για τον HIV Με καλύτερη ικανότητα απάντησης σε µικρή ποσότητα Ag

88 Αυξηµένη παραγωγή IL-21 από τα ειδικά για τον HIV CD4+ T λεµφοκύτταρα Περφορίνη Κοκκιοένζυµα Αποκοκκίωση (CD107) Ικανότητα καταστολής του ιικού πολλαπλασιασµού Από τα ειδικά για τον HIV CD8+ T λεµφοκύτταρα

89 Εντόπιση των ειδικών για τον HIV CD4+ και CD8+ T λεµφοκυττάρων Στη σωστή θέση Τη σωστή χρονική στιγµή Στο γαστρεντερικό σύστηµα Στη χρόνια ή/και Στην οξεία λοίµωξη

90 Γαστρεντερικός βλεννογόνος CD4+ κύτταρα έχουν απαλειφθεί στους NC αλλά όχι στους C. CD4+ κύτταρα στους C (αλλά όχι τους NC) περιλαµβάνουν σηµαντικούς πληθυσµούς ειδικών για τον HIV, πολυλειτουργικών κυττάρων που δρουν σε συνεργασία µε τα CD8+ CD8+ άφθονα αλλά και ειδικά πολυλειτουργικά HIV στους NC αλλά και τους C Αρτιότητα βλεννογόνου στους C σε σχέση µε NC Εναπόθεση κολλαγόνου στους NC Tregs υψηλότερα στους NC πάρά στους C

91 Ποιότητα και όχι ποσότητα CD8+ T κυττάρων έναντι gag p24 συντηρημένων επιτόπων σε συνάρτηση με HLA- B57 - TW10 Gag ή Gag (KF11), HLA- B27 - Gag (KK10).

92 Σχηματική παράσταση της ιεραρχικής εξάντλησης των λειτουργιών των CD8 T κυττάρων από την οξεία στη χρόνια λοίμωξη

93 Αποτελεσµατικότητα της απάντησης των CD8+ T λεµφοκυττάρων πολυλειτουργικότητα απληστία του TCR και όχι µέγεθος απάντησης εύρος φαινότυπος

94 πολυλειτουργικότητα ικανότητα παραγωγής ποικίλων αντιικών παραγόντων Ø χηµειοκινών Ø κυτταροκινών Ø προιόντων αποκοκκίωσης δυναµικό πολλαπλασιασµού κατασταλτική ικανότητα

95 HIV controllers παρουσιάζουν ωστόσο υψηλή ενεργοποίηση και ανοσογήρανση των CD8+ T λεµφοκυττάρων 6th IAS Conference on HIV Pathogenesis Treatment and Prevention July 17-20, 2011, Rome

96 From Transmission to Chronic Infection (II)

97 Ευχαριστώ πολύ