ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΤΖΙΩΝΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΤΖΙΩΝΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΝΕΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΙΒΟΥΠΡΟΦΑΙΝΗΣ ΩΣ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΧΗΜΕΙΑ, ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΡΕΚΚΑ ΕΛΕΝΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2 Αφιερωμένο στους γονείς μου, Ελένη Ζιώγου και Αθανάσιο Τζιώνα, και στην επιβλέπουσά μου, Ελένη Ρέκκα 1

3 Περιεχόμενα I. Πρόλογος ΙΙ. Εισαγωγή 1. Παθοφυσιολογία της φλεγμονής Ορισμός και αίτια της φλεγμονής Συμπτώματα φλεγμονής Τριπλός στόχος της φλεγμονής Φλεγμονώδης αντίδραση Ορισμός και φυσική πορεία Διάκριτες φάσεις- κατηγορίες της φλεγμονής.6 3.Κύτταρα και μόρια που συμμετέχουν στην φλεγμονή Λευκοκύτταρα Μόρια προσκόλλησης Αιμοπετάλια Ενδοθηλιακά κύτταρα Μεσολαβητές της φλεγμονής` Κριτήρια του Dale Γενικός ορισμός- προέλευση Κατηγορίες μεσολαβητών φλεγμονής ι σημαντικότεροι μεσολαβητές της φλεγμονής α Ορισμός κυτταροκιτοκινών β Πολλαπλός ρόλος κυτταροκινών- Κατηγορίες γ Το σύστημα του συμπληρώματος δ Προϊόντα μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος ε1 Οδός λιποξυγονάσης ε2 Οδός κυκλοξυγονάσης Θεραπευτική αντιμετώπιση της φλεγμονής Εικοσανοειδή και αναστολείς τους α Ορισμός εικοσανοειδών- Μελετούμενοι υποδοχείς β Αναστολείς βιοσύνθεσης εικοσανοειδών γ Μη στερεοειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα Μηχανισμός δράσης των NSAIDs Το ενζυμικό σύστημα της κυκλοξυγονάσης Κατάταξη NSAIDs βάση της δομής τους α Φαρμακευτικές προσεγγίσεις των NSAIDs Εκδήλωση της αναλγητικής δράσης των NSAIDs Ανεπιθύμιτες ενέργειες των αναστολέων κυκλοξυγονάσης Ανεπιθύμιτες ενέργειες προκαλούμενες από εκτεταμένη χορήγηση NSAIDs Μηχανισμός βλάβης του γαστρεντερικού 2

4 Βλεννογόνου Μηχανισμός πρόκλησης καρδιαγγειακών παρενεργειών Ελεύθερες ρίζες Γενικά α Δραστικές μορφές οξυγόνου Ο ρόλος των δραστικών μορφών οξυγόνου στη φλεγμονώδη απόκριση Θεωρίες για το μηχανισμό της αθηρωγένεσης Οξειδωτικό στρες, φλεγμονή, αθηροσκλήρωση 32 ΙΙΙ. Αντικείμενο και σκοπός.34 IV. Πειραματικό μέρος 1. Όργανα- υλικά Όργανα, αντιδραστήρια στο συνθετικό μέρος Όργανα, υλικά, πειραματόζωα στο βιολογικό μέρος Σύνθεση αρχικών και ενδιαμέσων ενώσεων α Σύνθεση μεθυλεστέρων των αμινοξέων β Σύνεση του μεθυλεστέρα της προλίνης Σύνθεση αμιδίων της ιβουπροφαίνης α Γενική μέθοδος σύνθεσης αμιδίων β Σύνθεση αμιδίων της ιβουπροφαίνης μέσω χλωριδίου Υδρόλυση εστέρων Σύνθεση αλκοόλης μέσω αναγωγής εστέρα Σύνθεση τελικών προϊόντων α Γενική μέθοδος εστεροποίησης β Εστεροποίηση καρβοξυλικών οξέων μέσω μετατροπής τους στο αντίστοιχο χλωρίδιο γ Εστεροποίηση σε όξινο περιβάλλον Σύνθεση διαμιδικών παραγώγων Βιολογικό μέρος In vitro δοκιμασίες α Αναστολή της κυκλοοξυγονάσης 1, β Αναστολή της λιποξυγονάσης γ Λιπιδική υπεροξείδωση In vivo δοκιμασίες α Προσδιορισμός αντιφλεγμονώδους δράσης β Προσδιορισμός αντιδυσλιπιδαιμικής και αντιυπερχοληστερολαιμικής δράσης Υπολογιστική μελέτη Υπολογισμός λιποφιλικότητας..55 3

5 5.2 Στατιστική ανάλυση..55 V. Αποτέλεσματα και συζήτηση..56 Συνθετικό μέρος α Σύνθεση υδροχλωρικών αλάτων των μεθυλεστέρων των αμινοξέων 56 1.β Σύγκριση μεθόδων.58 2.α Σύνθεση εστέρων της ιβουπροφαίνης 59 2.β Σύγκριση μεθόδων Ι και ΙΙ.61 2.γ Ταυτοποίηση των εστέρων της ιβουπροφαίνης α Σύνθεση διαμιδικών παραγώγων της ιβουπροφαίνης 62 3.β Σύγκριση των μεθόδων Ι και ΙΙ Αναγωγή Υδρόλυση Εμφάνιση διαστερομέρειας Σύνθεση δευτερευόντων προϊόντων.69 Βιολογικό μέρος In vitro μελέτη της βιολογικής δράσης 69 1.α Εκτίμηση της δράσης της κυκλοξυγονάσης.69 1.β Εκτίμηση της δράσης της λιποξυγονάσης.73 1.γ Εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης In vivo μελέτη της βιολογικής δράσης.81 2.α Προσδιορισμός αντιφλεγμονώδους δράσης 81 2.β Εκτίμηση της αντιδυσλιπιδαιμικής ικανότητας Υπολογιστικοί προσδιορισμοί.85 3.α Υπολογιστικός προσδιορισμός παραγόντων που επηρεάζουν την διάβαση των βιολογικών μεμβρανών 85 3.β Υπολογιστικός προσδιορισμός λιποφιλικότητας.87 VI. Συμπεράσματα.89 VII. Περίληψη 91 IIX. Βιβλιογραφία.94 ΙΧ. Φάσματα.105 4

6 Ι. Πρόλογος Πώς να ζωγραφίσετε έναν πίνακα Αρχίστε με μια κενή επιφάνεια. Δεν είναι ανάγκη να είναι ούτε χαρτί ούτε καμβάς, αλλά αισθάνομαι ότι πρέπει να είναι λευκή. Τη λέμε λευκή επειδή χρειαζόμαστε μια λέξη, αλλά το αληθινό της όνομα είναι τίποτα. Stephen King, Ντούμα Κη 5

7 IΙ. Εισαγωγή 1. Παθοφυσιολογία φλεγμονής 1.1 Ορισμός και αίτια της φλεγμονής Η λέξη φλεγμονή ετυμολογείται από το ουσιαστικό φλέγμα -ομηρική λέξη (= καύσις, ανάφλεξις)- το οποίο, από τον Ιπποκράτη ( π.χ.) και εξής, χρησιμοποιείται με ιατρική σημασία για να υποδηλώσει το αντικείμενο που καίγεται (1). Ορίζεται ως η τοπική αντίδραση των ιστών σε κάθε βλάβη (2α). Συγκεκριμένα, αποτελεί την απόκριση των ιστών σε κάθε είδους τραυματισμό έτσι ώστε να προσελκύσουν μόρια και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος στο σημείο της βλάβης (3). Τα αίτια της φλεγμονής είναι ποικίλα και ετερογενή. Στην ουσία εμφανίζεται ως απόκριση μετά από ερεθίσματα, τα οποία περιλαμβάνουν μικρόβια, θερμότητα, ακτινοβολίες, μηχανικούς και χημικούς παράγοντες, και αναμφίβολα αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού σε τέτοιου είδους καταστάσεις (4). Πολλές φορές όμως η φλεγμονή πυροδοτείται και από αβλαβείς παράγοντες όπως η γύρη, ή από μια αυτοάνοση αντίδραση η οποία λαμβάνει χώρα σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, με κλασσικό παράδειγμα τη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Σε αυτές τις περιπτώσεις, οι ίδιες οι αμυντικές αντιδράσεις του οργανισμού μπορούν να προκαλέσουν τραυματισμό ιστών (5, 6). Εικόνα 1: Κλασσικά συμπτώματα φλεγμονής όπως περιγράφησαν από την αρχαιότητα μέχρι σήμερα. 6

8 1.2 Συμπτώματα φλεγμονής Ήδη από τον 1ο αιώνα μ.χ. ο Κέλσος κατέγραψε τα τέσσερα κλασσικά συμπτώματα της φλεγμονής (rubor, calor, tumor, dolor) (7). Άλλωστε εξ ορισμού, η λέξη φλεγμονή αποτελεί έκφραση η οποία περιγράφει το θερμό, την ερυθρότητα, το οίδημα, που χαρακτηρίζει μια φλεγμαίνουσα περιοχή με συνυπάρχοντα πόνο. Αργότερα, ο Γαληνός, ( μχ), έρχεται να προσθέσει σε αυτά και το πέμπτο χαρακτηριστικό της φλεγμονής, δηλαδή τη μειωμένη λειτουργικότητα (1). Τα παραπάνω χαρακτηριστικά επιβεβαιώνονται μακροσκοπικά, από τις μορφολογικές αλλοιώσεις που λαμβάνουν χώρα. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρείται διαστολή των αιμοφόρων αγγείων, γεγονός που προκαλεί υπεραιμία και συνεπώς την περιγραφείσα ερυθρότητα και υπερθερμία στη φλεγμαίνουσα περιοχή. Επιπλέον η αύξηση της διαπερατότητας των τριχοειδών αγγείων έχει ως άμεση συνέπεια εκροή μεγάλης ποσότητας υγρού στο μεσοκυττάριο χώρο, προκαλώντας μηχανικά οίδημα και πόνο. 1.3 Τριπλός στόχος της φλεγμονής Η προστατευτική απόκριση του οργανισμού έχει ως πρωταρχικό στόχο την εξάλειψη του παράγοντα πρόκλησης φλεγμονώδους αντίδρασης. Έπειτα ακολουθεί η προαγωγή της επανόρθωσης των ιστών και της επούλωσης της πληγής. Τελικό αλλά εξίσου σημαντικό στόχο αποτελεί η εγκατάσταση μνήμης, η οποία δίνει τη δυνατότητα πιο ταχείας και εξειδικευμένης απόκρισης σε μελλοντική επίδραση. 2. Φλεγμονώδης αντίδραση 2.1 Ορισμός, φυσική πορεία Υπό φυσιολογικές συνθήκες τα κύτταρα αλληλεπιδρούν όχι μόνο μεταξύ τους, αλλά και με το εξωκυττάριο υγρό, έτσι ώστε να προάγουν και να διατηρούν τη δομική και λειτουργική ακεραιότητα των ιστών. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές, κάτω από την επίδραση βλαπτικού παράγοντα, οδηγούν σε σύνθετη αντίδραση του συνδετικού ιστού που φέρει αγγεία, την φλεγμονώδη αντίδραση (2α). Η αρχική τοπική αντίδραση εκδηλώνεται με αγγειοσύσπαση και οφείλεται σε άμεσο ερεθισμό του τοιχώματος των αγγείων. Μέσα σε λίγα λεπτά από την εμφάνιση της βλαπτικής επίδρασης ακολουθεί αγγειοδιαστολή, κάτι το οποίο έχει ως αποτέλεσμα την ταχεία μετάβαση του αίματος προς το φλεβικό σκέλος. Η αγγειοδιαστολή και η αύξηση της ροής του αίματος οδηγούν σε τοπική αύξηση της θερμοκρασίας και ερυθρότητα. 7

9 Στη συνέχεια παρατηρείται αύξηση της διαπερατότητας του αγγειακού τοιχώματος, εξαγγείωση στοιχείων του πλάσματος και αύξηση του ιξώδους του αίματος. Οι παραπάνω βιολογικές αποκρίσεις έχουν ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση των ερυθρών αιμοσφαιρίων, επιβραδύνοντας έτσι τη ροή του αίματος η οποία μπορεί να φθάσει μέχρι τη πλήρη διακοπή της, οδηγώντας σε θρόμβωση. Καθώς τα ερυθρά αιμοσφαίρια συσσωρεύονται, τα λευκά αιμοσφαίρια μεταφέρονται αιμοδυναμικά και προσκολλώνται στο ενδοθήλιο. Στο σημείο αυτό αρχίζει το φαινόμενο της μετανάστευσης, που έχει ως αποτέλεσμα την εξωαγγειακή συσσώρευση λευκών αιμοσφαιρίων (8). 2.2 Διακριτές φάσεις - κατηγορίες φλεγμονής Η εκδήλωση της φλεγμονής συμβαίνει σε τρεις διακριτές φάσεις, στην κάθε μια από τις οποίες μεσολαβεί διαφορετικός μηχανισμός. Έτσι έχουμε μια οξεία φάση, η οποία λαμβάνει χώρα στο σημείο της ιστικής βλάβης. Χαρακτηρίζεται από αρχική αύξηση της διαπερατότητας των τριχοειδών. Παράλληλα απελευθερώνονται χημικοί Εικόνα 2: Μεταβολές του συνδετικού ιστού κατά τη φλεγμονώδη αντίδραση Παρατηρούνται: 1) αυξημένη ροή αίματος, 2) προσέλκυση ουδετερόφιλων, και 3) πρωτεϊνών του πλάσματος 8 παράγοντες οι οποίοι προκαλούν χάλαση των τριχοειδών με αποτέλεσμα την παροδική διαστολή τους. Πλούσιο σε πρωτεΐνες υγρό εξαγγειώνεται από τα τριχοειδή προς το μεσοκυττάριο υγρό (1). Η επίλυση της οξείας φλεγμονής αρχίζει νωρίς από τα ουδετερόφιλα, καθώς προάγουν την αλλαγή από την παραγωγή του αραχιδονικού οξέος (που προήλθε από φλεγμονώδεις παράγοντες) σε παραγωγή αντιφλεγμονωδών παραγόντων (9). Επιπλέον, έχουμε μια υποξεία φάση, η οποία χαρακτηρίζεται βασικά από μετακίνηση πολυμορφο- πύρηνων λευκοκυττάρων. Εάν το αίτιο που διέγειρε τη διαδικασία της φλεγμονής απομακρυνθεί, τότε τις

10 παραπάνω φάσεις ακολουθεί περίοδος αποκατάστασης των τραυματισμένων ιστών και κυττάρων (1). Οι παραπάνω αγγειακές και κυτταρικές αντιδράσεις αποτελούν άμεση και πρώιμη απάντηση σε ιστική βλάβη, και είναι χαρακτηριστικές στην οξεία φλεγμονή. Η οξεία φλεγμονή μπορεί να έχει μια από τις τέσσερις εκβάσεις: πλήρη αποδρομή, σχηματισμό αποστήματος, επούλωση με αντικατάσταση συνδετικού ιστού, ή εξέλιξη σε χρόνια φλεγμονή. Έτσι περνάμε στην άλλη κατηγορία της φλεγμονής, τη χρόνια φλεγμονή, η οποία άλλες φορές μπορεί να ξεκινήσει ως ήπια αντίδραση, ασυμπτωματικά, και χαρακτηρίζεται από διήθηση με μονοπύρηνα, ιστική καταστροφή και προσπάθεια αποκατάστασης του κατεστραμμένου ιστού (αγγειογένεση, ίνωση). Μετά την εξαγγείωση των μονοκύτταρων, αυτά μετατρέπονται σε μακροφάγα και αρχίζει η φαγοκυττάρωση. Όπως και στην οξεία, έτσι και στη χρόνια φλεγμονή, έχουμε συσσώρευση μακροφάγων. Στην οξεία όμως, τα μακροφάγα μετά την απομάκρυσνη του βλαπτικού παράγοντα εξαφανίζονται. Αντίθετα, στην χρόνια φλεγμονή, υπάρχει συνεχής στρατολόγηση μονοκυττάρων από την κυκλοφορία, τοπικός πολλαπλασιασμός, και ακινητοποίηση των μακροφάγων στη θέση της φλεγμονής. Όταν το μακροφάγο ενεργοποιείται παράγει πληθώρα τοξικών ουσιών, προκαλώντας ιστική καταστροφή. Επίσης προάγει παράγοντες ανάπτυξης που αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, την εναπόθεση κολλαγόνου και την αγγειογένεση (2β). Πίνακας 1: Αίτια Πρόκλησης Χρόνιας Φλεγμονής (10). Ξένα σώματα Μικρο-οργανισμοί Ιστοί Ασθένειες Παχυσαρκία Τάλκης, σίλικα, αμίαντος, χειρουργικά ραπτικά υλικά Ιοί, βακτήρια, μύκητες, μεγάλα παράσιτα μετρίας έως χαμηλής μολυσματικότητας Τραυματισμένοι ιστοί γύρω από θεραπευμένο τμήμα Υπερβολική και αναίτια διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος Αυτοάνοσα νοσήματα 3 Κύτταρα και μόρια που συμμετέχουν στη φλεγμονώδη διαδικασία Η φλεγμονώδης αντίδραση λαμβάνει χώρα στο συνδετικό ιστό που φέρει αγγεία, και περιλαμβάνει τα ίδια τα αγγεία (ενδοθήλιο), συστατικά του πλάσματος, κυκλοφορούντα κύτταρα του αίματος (λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια), αλλά και κυτταρικά και εξωκυτταρικά συστατικά του συνδετικού ιστού (2α). Μερικά από αυτά πυροδοτούν, πολλαπλασιάζουν ή διατηρούν τη φλεγμονώδη διαδικασία, ενώ άλλα την αναστέλλουν. Μερικά από τα μόρια που συμμετέχουν μπορούν να συνεισφέρουν και στις δύο κατευθύνσεις ανάλογα με την χρονική εξέλιξη της φλεγμονής (2α). 9

11 Εικόνα 3: Κύτταρα που συμμετέχουν στη φλεγμονή 3.1 Λευκοκύτταρα Τα λευκά αιμοσφαίρια χωρίζονται σε φαγοκύτταρα και λεμφοκύτταρα (παράγουν ανοσοσφαιρίνες-αντισώματα, απόκτηση μνήμης). Τα φαγοκύτταρα χωρίζονται σε μικροφάγα (τα οποία απαρτίζουν τα πολυμορφοπύρηνα ή κοκκιοκύτταρα) και σε μακροφάγα (π.χ. τα μονοπύρηνα, όπως τα σιτευτικά κύτταρα). Τα τελευταία, εκκρίνουν κυτταροκίνες (εμφάνιση φλεγμονώδουςπυρετογόνου δράσης) κατά τη φλεγμονώδη απόκριση. Τα κοκκιοκύτταρα, που αποτελούν το 40-70% των λευκών κυττάρων, χωρίζονται στα ουδετερόφιλα (επάγονται κατά τη λοίμωξη-απελευθέρωση κυτταροτοξικών ουσιών), βασεόφιλα (περιέχουν κοκκία ισταμίνης) και εωσινόφιλα (επάγονται στις αλλεργίες, απελευθερώνουν ισταμινικούς παράγοντες) (11, 2β). Τα λευκοκύτταρα φαγοκυτταρώνουν βλαπτικούς παράγοντες, θανατώνουν βακτήρια και αποδομούν νεκρούς ιστούς. Έπειτα, είτε υφίστανται αποπτωτικό θάνατο, είτε φαγοκυτταρώνονται από τα μακροφάγα. 3.2 Μόρια προσκόλλησης Μόρια προσκόλλησης ονομάζεται κατηγορία μορίων, τα οποία χρησιμοποιούν τα φλεγμονώδη κύτταρα, ώστε να προσκολληθούν στο ενδοθήλιο των αγγείων και να διαπιδύσουν στην εστία της φλεγμονής (2α). Τα μόρια προσκόλλησης ταξινομούνται σε τρεις κατηγορίες: τις σελεκτίνες (Ε- σελεκτίνη, Ρ-σελεκτίνη, που επάγονται κατά τη φλεγμονή και L- σελεκτίνη), τις ανοσοσφαιρίνες και τις ιντεκρίνες. Σε ορισμένες νόσους (π.χ. αυτοάνοσες, μερικές αγγειίτιδες) τα μόρια προσκόλλησης εκφράζονται συνεχώς με αποτέλεσμα την προσέλκυση ουδετερόφιλων στην περιοχή της φλεγμονής. Αντίθετα, απουσία των μορίων προσκόλλησης οδηγεί σε μη φυσιολογικό πληθυσμό λευκοκυττάρων και 10

12 επομένως σε υποτροπιάζουσες λοιμώξεις. 3.3 Αιμοπετάλια Ο ρόλος των αιμοπεταλίων στη φλεγμονώδη απόκριση είναι πολλαπλός. Αρχικά ενισχύουν την αιμόσταση, έπειτα προάγουν την επούλωση του τραύματος και τέλος παίρνουν μέρος στην απόκριση της κυτταρικής βλάβης. Μετά την ενεργοποίησή τους, παράγουν προϊόντα (π.χ. σεροτονίνη, ADP, θρομβοσποντίνη), τα οποία προσελκύουν και άλλα φλεγμονώδη κύτταρα στην εστία της φλεγμονής. Οι κύριοι χημειοτακτικοί τους παράγοντες είναι ο παράγοντας ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (PAF, platelet activating factor) και τα θραύσματα κολλαγόνου. Επιπλέον, η απελευθέρωση των κοκκίων των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων προάγουν την πήξη, αλλά και την περαιτέρω συσσώρευσή τους. Σε ορισμένες αυτοάνοσες νόσους (π.χ. άσθμα, διασυστηματικό ερυθηματώδη λύκο), ένα χαρακτηριστικό εύρημα αποτελεί ο ενεργοποιημένος πληθυσμός των αιμοπεταλίων. 3.4 Ενδοθηλιακά κύτταρα Κυτοκίνες, στρες ροής, υποξία, ιοί, οξειδωμένα λιπίδια ενεργοποιούν το ενδοθήλιο κατά τη φλεγμονώδη απόκριση. Η ενεργοποίηση αυτή παίζει βασικότατο ρόλο, καθώς φέρει σειρά πολλαπλών αποτελεσμάτων/μεταβολών. Στις προκαλούμενες έτσι δυσλειτουργίες του ενδοθηλίου παρατηρούνται: απελευθέρωση χημειοτακτικών παραγόντων, απελευθέρωση αγγειοδιασταλτικών (μονοξείδιο του αζώτου, προστακυκλίνη) αλλά και αγγειοσυσπαστικών παραγόντων (αγγειοτασίνη ΙΙ, PDGF), αύξηση της διαπερατότητας, αύξηση της προσκολλητικής ικανότητας των κυττάρων του αίματος επάνω στο ενδοθήλιο (φυσιολογικά, το ενδοθήλιο αποτρέπει την προσκόλληση των λευκοκυττάρων επάνω του), και τέλος σχηματισμός θρόμβων (2β). 11

13 Εικόνα 4: Ενεργοποίηση του ενδοθηλίου κατά τη φλεγμονώδη απόκριση 4. Οι μεσολαβητές της φλεγμονής 4.1 Κριτήρια Dale Σύμφωνα με τον Dale, για να οριστεί μια ουσία ως μεσολαβητής πρέπει να πληροί τα εξής πέντε κριτήρια: να υπάρχει ένδειξη παραγωγής ή απελευθέρωσής της εντός του ιστού, τα λειτουργικά αποτελέσματά της να προσομοιάζουν in vitro και in vivo η επίδρασή της να τερματίζεται με ενδογενείς διαδικασίες, ανταγωνιστές του υποδοχέα της να παρεμβαίνουν στη δράση της και απομάκρυνσή της να έχει ως αποτέλεσμα την ανάλογη μεταβολή στην απόκριση (12). 4.2 Γενικός ορισμός- προέλευση Μεσολαβητές της φλεγμονής ονομάζονται οι χημικοί παράγοντες, που παράγονται είτε από τα κύτταρα, είτε από το πλάσμα, και, δρώντας μεμονωμένα, αλλά και σε συνδυασμό, ενισχύουν την φλεγμονώδη αντίδραση. Η δράση τους επιτυγχάνεται μέσω ειδικών υποδοχέων στα κύτταρα-στόχους. Όσοι προέρχονται από το πλάσμα βρίσκονται στην πρόδρομη μορφή τους και υφίστανται πρωτεολυτική κοπή τμημάτων τους ώστε να ενεργοποιηθούν. 12

14 Αντίστοιχα, οι μεσολαβητές που προέρχονται από κύτταρα είτε βρίσκονται προαποθηκευμένοι σε κοκκία, είτε συντίθενται de novo (2α). 4.3 Κατηγορίες μεσολαβητών φλεγμονής Οι μεσολαβητές τις φλεγμονής απελευθερώνονται από τους ιστούς κατά τη διάρκεια της ιστικής βλάβης, αλλά και κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους απόκρισης. Μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις κατηγορίες σύμφωνα με τον τρόπο δράσης τους. 1. Ουσίες που δρουν άμεσα στις κυτταρικές μεμβράνες, και προς συγκεκριμένους υποδοχείς (π.χ. ισταμίνη) 2. Ουσίες που προέρχονται από το πλάσμα ή τα κύτταρα, και προκαλούν άμεση ιστική βλάβη (π.χ. βασικές πρωτεϊνες, συμπλήρωμα) 3. Χημειοτακτικοί παράγοντες που προσελκύουν κύτταρα όπως τα ηωσινόφιλα και τα μακροφάγα στο σημείο της φλεγμονής (π.χ. μεταβολίτες του αραχιδονικού οξέος- λευκοτριένια και προσταγλανδίνες) (13). Επίσης οι μεσολαβητές διακρίνονται σε κατηγορίες, ανάλογα με την χημική τους δομή: 1. Βιογενείς αμίνες 2. Πρωτεάσες και πολυπεπτίδια 3. Ετερογενείς αλλά έντονα δραστικές ουσίες Στις βιογενείς αμίνες ανήκουν κυρίως η ισταμίνη και η σεροτονίνη. Αυτές προκαλούν διαστολή των αρτηριών και αύξηση της διαπερατότητας των τριχοειδών αγγείων και κυρίως των φλεβών. Στην κατηγορία των πρωτεασών και πολυπεπτιδίων ανήκουν οι κινίνες, το ινωδολυτικό σύστημα και το σύστημα του συμπληρώματος. Οι κινίνες είναι υπεύθυνες για τα περισσότερα από τα φαινόμενα της φλεγμονής, όπως τη διαστολή των αρτηριών και την αύξηση της διαπερατότητάς τους, αλλά και την επίταση της μετανάστευσης των λευκών αιμοσφαιρίων. Το ινωδολυτικό σύστημα ενεργοποιεί το σύστημα των κινινών, ενώ το σύστημα του συμπληρώματος είναι γνωστό για την χημειοτακτική του δράση. Στην τρίτη κατηγορία ανήκουν οι κυτοκίνες ή κυτταροκίνες, οι κατιονικές αμίνες και οι προσταγλανδίνες. Στις κυτοκίνες ανήκουν οι ιντερλευκίνες. Στις κατιονικές αμίνες που ενεργοποιούν τις κινίνες περιέχονται κατιονικές πρωτεΐνες και πρωτεάσες που αυξάνουν τη διαπερατότητα των αγγείων και συμβάλλουν στο μηχανισμό της τοπικής ίνωσης. Οι προσταγλανδίνες προκαλούν αγγειοδιαστολή και αύξηση της διαβατότητας των αγγείων, δρουν χημειοτακτικά στα λευκοκύτταρα και εωσινόφιλα, ευαισθητοποιούν τους υποδοχείς του άλγους σε χημικά και μηχανικά ερεθίσματα και μπορούν, τέλος, να προκαλέσουν πυρετό (2a, 4, 6, 8). 13

15 Εικόνα 5: Μεσολαβητές της φλεγμονής Κατηγορίες και σύνθεση των μεσολαβητών της φλεγμονώδους απόκρισης Περιληπτικά μια γρήγορη ματιά σε βασικούς μεσολαβητές: Ισταμίνη Η απελευθέρωση ισταμίνης από τα βασεόφιλα κύτταρα των ιστών, καθώς και η συσσώρευση των βασεόφιλων είναι γνωστές κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους απόκρισης. Η ισταμίνη προκαλεί διαστολή των αρτηριών, αλλά και αύξηση της διαπερατότητας τριχοειδών και φλεβών. Βραδυκινίνη Εϊναι μια από τις βασικότερες κινίνες. Μικρά ποσά βραδυκινίνης προκαλούν πόνο, οίδημα και συνεισφέρουν στη φλεγμονή. Προκαλούν διαστολή των αρτηριών, αύξηση της διαπερατότητάς τους, και προάγουν την μετανάστευση των λευκοκυττάρων. Θρομβοξάνιο Α 2 και Προστακυκλίνη PGI 2 Το 1975 ο Samuelson (14) ανακάλυψε ότι στα αιμοπετάλια το αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) μεταβολίζεται στο ενδοϋπεροξείδιο PGH 2. Το τελευταίο μεταβολίζεται επίσης σε δύο άλλα ασταθή και βιολογικώς ενεργά συστατικά. Το ένα εξ αυτών είναι το θρομβοξάνιο ΤxΑ 2 (που προκαλεί τη θρόμβωση), το οποίο σχηματίζεται από το PGH 2 με τη δράση του ενζύμου συνθετάση των θρομβοξανίων, το οποίο βρίσκεται ως επί το πλείστον στα αιμοπετάλια. Το ΤxΑ 2 έχει πολύ μικρή ημιπερίοδο ζωής, περίπου 30 δευτερόλεπτα. Διασπάται χωρίς τη δράση κάποιου ενζύμου στο σταθερό και σχετικά 14

16 ανενεργό ΤxΒ 2. Μετά την ανακάλυψη του θρομβοξανίου Α 2, μια προσταγλανδίνη, η προστακυκλίνη PGI 2 έδειξε ότι εμφανίζει αντίρροπη ενέργεια. Η προστακυκλίνη αυτή αποτελεί τον άλλο ασταθή μεταβολίτη της PGH 2 (ημιπερίοδος ζωής 3 λεπτά), προκαλεί χάλαση των τριχοειδών και αναστέλλει την συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Γενικά, οι προσταγλανδίνες προκαλούν αγγειοδιαστολή, αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων, και προσελκύουν στο χώρο της φλεγμονής λευκοκύτταρα και εωσινόφιλα (15, 16). Παράγοντας ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (PAF) Το φωσφολιπίδιο PAF απελευθερώνεται με τη δράση της φωσφολιπάσης Α 2, από τα φλεγμονώδη κύτταρα, αλλά και από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα αιμοπετάλια. Προκαλεί φλεγμονώδη αντίδράση σε πολλά είδη ζώων αλλά και στον άνθρωπο. Προσελκύει εωσινόφιλα στους ιστούς των πνευμόνων, και μιμείται την αλλεργική αντίδραση του άσθματος. Ιντερλευκίνη-1 Η ιντερλευκίνη-1 είναι πολυπεπτίδιο που παράγεται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα και μιμείται τα συμπτώματα της χρόνιας φλεγμονής. Ενεργοποιεί τα λεμφοκύτταρα και προάγει τη διαφοροποίησή τους. Ενεργοποιεί τα βοηθητικά Τ-λεμφοκύτταρα και προκαλεί έμμεσα πυρετό, ο οποίος προκαλείται κυρίως από τη μεσολάβηση της PGE 2 (13). 4.4 Οι σημαντικότεροι μεσολαβητές της φλεγμονής 4.4.a Ορισμός κυτταροκινών Δομικά είναι μικρομοριακές πρωτεΐνες που παράγονται κυρίως από μακροφάγα και λεμφοκύτταρα. Παίζουν ρόλο σε φυσιολογικές λειτουργίες, όπως η ανάπτυξη και η διαφοροποίηση αιμοποιητικών, λεμφικών και μεσεγχυματικών κυττάρων. Η δράση τους σχετίζεται με την ανοσολογική απόκριση και παίζουν σημαντικότατο ρόλο στη φλεγμονή. Μερικές κυτταροκίνες παίρνουν την ονομασία τους από το κύτταρο προέλευσής τους. Έτσι, έχουμε τις μονοκίνες, όταν παράγονται από τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα και λεμφοκίνες, όσες προέρχονται από τα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα. Άλλες κυτταροκίνες ονοματίζονται ανάλογα με την δράση που αναλαμβάνουν. Για παράδειγμα οι ιντερλευκίνες είναι μια ιδιαίτερη ομάδα κυτταροκινών που δρα σε λευκοκύτταρα και οι χημειοκίνες έχουν χημειοτακτικό ρόλο. 4.4.β Πολλαπλός ρόλος κυτταροκινών- Κατηγορίες Οι κυτταροκίνες εξαιτίας της πολυπλοκότητας της προέλευσής τους δεν παρουσιάζουν την ίδια λειτουργία. Έτσι χωρίζονται σε κατηγορίες, ανάλογα με την εξειδικευμένη δράση τους. 15

17 1. Παράγοντες που διεγείρουν αποικίες (colony stimulating factors, CSF): οι παράγοντες αυτοί διεγείρουν την αιμοποίηση, μεσολαβούν στην ανάπτυξη και στην διαφοροποίηση ανώριμων λευκοκυττάρων. Παράλληλα δρουν και σε ώριμα κύτταρα του αίματος, προκαλώντας αυξημένη χημειοταξία, άλλες φορές παραγωγή ελεύθερων ριζών, ακόμα και ικανότητα φαγοκυττάρωσης στα ουδετρόφιλα. 2. Παράγοντες ανάπτυξης και διαφοροποίησης 3. Ανοσορρυθμιστικοί παράγοντες (ιντερλευκίνες, ιντερφερόνες) 4. Φλεγμονώδεις κυτταροκίνες που ενισχύουν την φλεγμονή 5. Αντιφλεγμονώδεις κυτταροκίνες και αναστολείς παραγόντων ανάπτυξης και διαφοροποίησης (π.χ. αναστολείς υποδοχέων ιντερλευκινών) 4.4.γ Το σύστημα του συμπληρώματος Το σύστημα του συμπληρώματος αποτελείται από περισσότερες από τριάντα πρωτεΐνες. Δρα στην ανοσία και παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της φλεγμονής. Αυξάνει την αγγειακή διαπερατότητα, τη χημειοταξία, καθώς και τον οψωνισμό. Δύο είναι οι βασικές λειτουργίες του. Αφενός στοχεύει στην τροποποίηση των μεμβρανών με αποτέλεσμα τη λύση ή τον οψωνισμό και αφετέρου ενισχύει την φλεγμονή ενεργοποιώντας κύτταρα. Ανεπάρκειες συμπληρώματος προδιαθέτουν σε βακτηριακές λοιμώξεις και αυτοάνοσες νόσους, ειδικά σε διασυστηματικό ερυθηματώδη λύκο. 4.4.δ Προϊόντα μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος Αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) Το αραχιδονικό οξύ, λιπαρό οξύ 20 ατόμων άνθρακα, είναι ο κύριος πρόδρομος εικοσανοειδών (οικογένεια μεσολαβητών φλεγμονής) και βασικό συστατικό όλων των κυττάρων. Αν και δε βρίσκεται ελεύθερα διαθέσιμο, το αραχιδονικό οξύ απελευθερώνεται από τις αποθήκες των κυτταρικών μεμβρανών μέσω της δράσης αρκετών φωσφολιπασών (17). 16

18 Εικόνα 6: Προϊόντα μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος Το αραχιδονικό οξύ, αφού επελευθερωθεί από τις μεμβράνες με τη βοήθεια λιπασών, μεταβολίζεται μέσω δύο βασικών οδών σε μια μεγάλη οικογένεια μεσολαβητών της φλεγμονής, τα εικοσανοειδή. Οι προσταγλανδίνες και τα θρομβοξάνια είναι γνωστά και με την κοινή ονομασία προστανοειδή και οι μεν προσταγλανδίνες φέρουν δακτύλιο 5 ατόμων ενώ ο δακτύλιος του μορίου των θρομβοξανίων έχει 6 άτομα. (18, 19) Συγκεκριμένα, το αραχιδονικό οξύ αποθηκεύεται υπό τη μορφή εστέρων με γλυκερόλη, στα φωσφολιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης και αφθονεί ή εντοπίζεται σε όλους τους ιστούς του σώματος (20-22). Η απελευθέρωσή του σε μορφή ελεύθερου λιπαρού οξέος επιτελείται μετά από διέγερση από αμινοξέα (π.χ. γλουταμινικό), βιογενείς αμίνες (σεροτονίνη, ισταμίνη) και πεπτίδια (βραδυκινίνη). Τρία ένζυμα μεσολαβούν στην αποακυλίωση του φωσφολιπιδίου: η φωσφολιπάση Α 2 (PLA 2 ), η φωσφολιπάση C (PLC), και η φωσφολιπάση D (PLD), τα οποία δρουν είτε άμεσα είτε έμμεσα. Ο μεταβολισμός του αραχιδονικού οξέος επιτελείται από τρία συγκεκριμένα ενζυμικά συστήματα στα αντίστοιχα μονοπάτια. Τα ένζυμα που παίζουν ρόλο είναι: η κυκλοξυγονάση, η λιποξυγονάση και το κυτόχρωμα Ρ450. Αρχικά ένας διεγερτικός παράγοντας (π.χ. βραδυκινίνη) αλληλεπιδρά με μια ρυθμιστική G 17

19 πρωτεΐνη της κυτταρικής μεμβράνης με αποτέλεσμα την αύξηση του κυτοσολικού Ca 2+ και την ενεργοποίηση του ενζύμου φωσφολιπάση Α 2. Το ένζυμο αυτό υδρολύει τον εστερικό δεσμό των 2-αραχιδονυλοφωσφολιπιδίων των μεμβρανών, καταλύοντας έτσι την απελευθέρωση του αραχιδονικού οξέος. Στη συνέχεια, το αραχιδονικό οξύ υφίσταται βιομετατροπή προς προσταγλαδίνες και λευκοτριένια, με τη δράση της κυκλοξυγονάσης και της λιποξυγονάσης, αντίστοιχα. Το ελεύθερο λιπαρό οξύ έχει μικρό χρόνο ζωής, κατά τη διάρκεια του οποίου μπορεί να αλληλεπιδράσει, αλλά και να επηρεάζει την δραστηριότητα των διαύλων και των πρωτεϊνικών κινασών που υπάρχουν στο κύτταρο. Από την άλλη, μπορεί να μετατραπεί σε οικογένεια μεταβολιτών -τα εικοσανοειδή- από τα προαναφερθέντα ένζυμα (20-24). 4.4.ε1 Οδός λιποξυγονάσης (LX) Οι σημαντικότερες λιποξυγονάσες είναι η 12-LX και η 5-LX. Το αραχιδονικό οξύ, μέσω του μονοπατιού της λιποξυγονάσης, μετατρέπεται σε εικοσιτετρενοϊκά οξέα και λευκοτεριένια. Συγκεκριμένα μέσω της 12-LX παράγονται τα εικοσιτετρενοϊκά οξέα (12(s)HPETE), ενώ μέσω της παρέμβασης της 5-LX έχουμε τα 5- HPETΕ, και μετά από ένα δεύτερο αφυδατικό στάδιο, απελευθερώνεται το εποξείδιο λευκοτριένιο Α4 (LTA 4 ), το οποίο μεταβολίζεται προς άλλα λευκοτριένια, (LTC 4, LTB 4 ) (23). Μεγαλύτερη προσοχή έχει προσελκύσει η 5-LX, λόγω της εμπλοκής της στη σύνθεση των λευκοτριενίων, κατά την επαγωγή της από οποιονδήποτε φλεγμονώδη παράγοντα. Αναλυτικότερα, ο μηχανισμός έχει ως εξής: σε πρώτο στάδιο, η μετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε λευκοτριένια καταλύεται από την 5-LX κατά την μετατροπή του στο υδροϋπεροξείδιο 5- HPETE, εισάγοντας μοριακό οξυγόνο στη θέση 5, με τη βοήθεια της πρωτεΐνης που ενεργοποιεί την 5-LX (FLAP). Αυτό το ενδιάμεσο (5- υδροϋπεροξυεικοσατετρενοϊκό οξύ, 5-HPETE) ανάγεται αμέσως στο 5- υδροξυεικοσατετρενοϊκό οξύ, 5-ΗΕΤΕ). Το 5-ΗΡΕΤΕ, με την απομάκρυνση ενός μορίου νερού, μπορεί να μετατραπεί σε ένα ασταθές 5,6-εποξείδιο με ένα συζευγμένο τριένιο (LΤA 4 ), το οποίο έπειτα είτε μετατρέπεται στο LTB 4, μέσω της υδρολάσης του LTA 4, με εισαγωγή ενός υδροξυλίου στον C-12 (25, 18

20 26), είτε στο LTC 4 με σύζευξη με γλουταθειόνη (GSH), από την γλουταθεινυλο-s-τρανσφεράση (27). Σχήμα 1: Βιοσυνθετική πορεία λευκοτριενίων, μέσω επίδρασης της LX στο μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος. Ας αναφερθεί επιπρόσθετα ότι για να δράσει η 5-LX, πρέπει να πληρούνται τρεις προϋποθέσεις: αυξημένη συγκέντρωση Ca 2+, ύπαρξη ΑΤΡ, και τέλος μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, γνωστή ως ενεργοποιητής της 5-LΧ-πρωτεΐνης (5FLAP). Από τις προαναφερθείσες λιποξυγονάσες, η 5- είναι αυτή που προάγει τους μεσολαβητές της φλεγμονής (23). Εκτός από την 5-LX, και την προαναφερθείσα 12-LX, υπάρχει επίσης η 8- και η 15-. ι τύποι της LX διαχωρίζονται ονομαστικά με βάση το άτομο του άνθρακα του αραχιδονικού οξέος όπου εισάγουν το οξυγόνο. Η 12-LX εκφράζεται κυρίως στα αιμοπετάλια και στο δέρμα, ενώ η 15-LX κυρίως στα μαλλιά, στην προστάτη και στον κερατοειδή (28). Προϊόντα μεταβολισμού λιποξυγονασών 1. Λευκοτριένια Α 4, Β 4, C 4, D 4, Ε 4 : Προκαλούν βρογχοσπασμό (άσθμα), αύξηση της διαπερατότητας αγγείων (2γ). Παθολογικά, συνεισφέρουν σε πληθώρα φλεγμονωδών και αλλεργικών παθήσεων, όπως η ρευματοειδής 19

21 αρθρίτιδα, οι φλεγμονώδεις νόσοι του εντέρου, η ψωρίαση, η αλλεργική ρινίτιδα, το βρογχικό άσθμα, ο καρκίνος, η αθηροσκλήρωση και η οστεοαρθρίτιδα (29). Β 4 : προκαλεί την προσκόλληση των ουδετερόφιλων στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων και αυξάνει το ρυθμό της μετανάστευσής τους στους εξωαγγειακούς ιστούς. Πυροδοτεί αρκετές αντιδράσεις για την λειτουργία των ενζύμων, την ενεργοποίηση της οξειδάσης NADPH και τη φαγοκυττάρωση. Μελέτες έχουν δείξει ότι το LTB 4 ευθύνεται σε μεγάλο βαθμό για την εμφάνιση ελκωδών καταστάσεων επί του γαστρεντερικού συστήματος, πιθανότα λειτουργώντας ως μεσολαβητής της φλεγμονής. Τέλος εμπλέκεται σε χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις που σχετίζονται με την παθοφυσιολογία της αθηροσκλήρωσης. D 4, Ε 4 : σχετίζονται με τη στένωση των αεροφόρων οδών και σύσπαση των λείων μυϊκών ινών των αγγείων, όπως και με την ανάπτυξη του οιδήματος και αύξηση των βλεννωδών εκκρίσεων που είναι δυνατόν να εμφανίζονται σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Είναι σημαντικοί μεσολαβητές στο άσθμα αλλά και σε πολλές άλλες ασθένειες όπου εμπλέκεται η φλεγμονή. C 4 : συμμετέχει στο σχηματισμό γαστρικού ερεθισμού, επιπλέον των προηγούμενων ιδιοτήτων (29-31). 2. Λιποξίνες: Aγγειοδιαστολή, ανασολογικές ιδιότητες. Υψηλά επίπεδα σε φλεγμονώδη αρθρίτιδα και σπειραματονεφρίτιδα (2γ). 4.4.ε2 Οδός κυκλοξυγονάσης Το αραχιδονικό οξύ μπορεί να ακολουθήσει και ένα ακόμα μεταβολικό μονοπάτι, που επιτελείται από την κυκλοξυγονάση (συγκεκριμένα τις CX-1 και CX-2. Η τελευταία είναι η κύρια υπεύθυνη για την προαγωγή της φλεγμονής). H CX είναι διλειτουργικό ένζυμο που διεκπεραιώνει περίπλοκη αντίδραση ελευθέρων ριζών, ενεργώντας διαδοχικά ως δισοξυγονάση και υπεροξειδάση. Από τη δράση της κυκλοξυγονάσης προκύπτουν δύο προϊόντα, αρχικά η προσταγλανδίνη G (PGG 2 ), καθώς και η προσταγλανδίνη H 2. Από την τελευταία, δημιουργούνται επιπλέον προϊόντα μεταβολισμού, το θρομβοξάνιο Α 2 (TXA 2 ), η προσταγλανδίνη E 2 και η προστακυκλίνη I 2. Αρχικά δρώντας ως δισοξυγονάση, και παράλληλα κυκλοποιώντας το αραχιδονικό οξύ, παράγεται το πρώτο προϊόν, η προσταγλανδίνη G, σύμφωνα με το παρακάτω σχήμα. Μετά, το τμήμα του ενζύμου που δρα ως υπεροξειδάση ανάγει το υδροϋπεροξείδιο στη θέση 15 προς αλκοόλη, σχηματίζοντας την προσταγλανδίνη H 2. Ο σχηματισμός των βιολογικά ενεργών προστανοειδών 20

22 από την PGH 2 λαμβάνει χώρα μέσω δράσεων μιας ομάδας συνθασών που εκφράζονται εκλεκτικά ανάλογα με τον ιστό και το είδος των κυττάρων. Σε αυτές περιλαμβάνονται η συνθάση της προσταγλανδίνης D (PGDS), E (PGES), F (PGFS), I (PGIS) και του θρομβοξανίου Α (ΤΧΑS), με προϊόντα τα PGD2, PGE2, PGF2α, PGI2 και το ΤΧΑ 2, αντίστοιχα. Η διαφορική έκφραση αυτών των ενζύμων μέσα στα κύτταρα καθορίζει το ποιό προστανοειδές θα παραχθεί (32-34). Σχήμα 2: Σύνθεση προσταγλανδινών, μέσω της επίδρασης της CX στη βιοσύνθεση του αραχιδονικού οξέος Προϊόντα μεταβολισμού μέσω κυκλοξυγονασών 1. Προστακυκλίνη I 2 : ενισχύει την αγγειοδιαστολή 2. Προσταγλανδίνη E 2 : επιτείνει την αγγειοδιαστολή, την πρόκληση οιδήματος και την αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας. Παράλληλα ασκεί κυτταροπροστατευτική δράση κατά του έλκους. Είναι ο πιο ισχυρός γνωστός πυρετογόνος παράγοντας, και αυξημένες συγκεντρώσεις αυτής βρίσκονται στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) ασθενών με βακτηριακές ή ιικές λοιμώξεις. 3. Θρομβοξάνιο Α 2 : προκαλεί σύσπαση λείων μυϊκών ινών (βρογχόσπασμος), συσσώρευση αιμοπεταλίων, και ενισχύει τον αγγειοσπασμό στη νεφρική λειτουργία με μείωση της σπειραματικής διήθησης. Ονομάστηκε έτσι λόγω της θρόμβωσης που δίναται να προκαλέσει. Παίζει σπουδαίο ρόλο 21

23 στη νεφρίτιδα, στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο και στο άσθμα. Αναστολείς του βρίσκονται σε πειραματικό στάδιο για την κυκλοφορία τους ως θεραπευτικό μέσο (2γ, 35-40). Φυσιολογικός ρόλος των προσταγλανδινών Αγγειοδιαστολή-διατήρηση ροής αίματος σε γαστρικό βλενογόννο ή νεφρούς, ιδίως επί της νεφρικής ανεπάρκειας. Φλεγμονή Αγγειοδιαπερατότητα: συνεπικουρούμενη από άλλους παράγοντες όπως ισταμίνη, λευκοτριένια, βραδυκινίνη. Ωορηξία, έναρξη τοκετού. Μεταβολισμός οστών Επούλωση πληγών (2γ) 5. Θεραπευτική αντιμετώπιση της φλεγμονής 5.1 Εικοσανοειδή και αναστολείς τους 5.1α Ορισμός εικοσανοειδών- Μελετούμενοι υποδοχείς Εικοσανοειδή όπως έχει ήδη αναφερθεί- ονομάζεται μια μεγάλη οικογένεια οξυγονωμένων προϊόντων που περιλαμβάνει προσταγλανδίνες, θρομβοξάνια, λευκοτριένια και υδροξυλιωμένα εικοσιτετρενοϊκά οξέα. Γίνεται εμφανές ότι προέρχονται κυρίως από το αραχιδονικό οξύ, αλλά και από άλλα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Προκαλούν τα βασικά χαρακτηριστικά της φλεγμονής όπως οίδημα, ερυθρότητα (λόγω αύξησης της αγγειακής διαπερατότητας), άλγος και αύξηση της τοπικής θερμοκρασίας (κυρίως σε συνέργεια με άλλους μεσολαβητές), απελευθέρωση ενζύμων και ενεργών μορφών οξυγόνου. Οι δράσεις τους εκδηλώνονται μέσω της αλληλεπίδρασής τους με λιπιδικούς υποδοχείς συζευγμένους με G-πρωτεϊνες. Οι υποδοχείς χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες σύμφωνα με την IUPHAR. Οι υποδοχείς BLT, των οποίων οι βιολογικές δράσεις σχετίζονται με το λευκοτριένιο LTB 4. Έχουν βρεθεί δύο είδη, το πρώτο βρίσκεται στα λευκά αιμοσφαίρια, ενώ το δεύτερο απαντάται στους περισσότερους ιστούς του οργανισμού. Έχει παρατηρηθεί αύξηση και των δύο κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους απόκρισης. 22

24 Οι υποδοχείς cys-lts, των οποίων οι προσδέτες είναι σειρά λευκοτριενίων (LTC 4, LTD 4, LTE 4 ). Οι συγκεκριμένοι προσδέτες παίζουν ρόλο στη χρόνια φλεγμονή, αλλά και στο σύνδρομο μη ανοχής στην ασπιρίνη. Διέγερση των υποδοχέων cys-lts διεγείρει τη βρογχοσύσπαση, την υπερβολική διαπερατότητα των τριχοειδών, την παραγωγή βλέννης και χημειοκίνης, καθώς και την κυτταρική προσκόλληση. Τοπογραφικά βρίσκονται στα εωσινόφιλα, μακροφάγα, ουδετερόφιλα και βασεόφιλα. Στη χρόνια αλλεργική ρινίτιδα παρατηρείται αύξηση των υποδοχέων. Οι υποδοχείς λιποξίνης ALX. Οι υποδοχείς προσταγλανδινών: Υπάρχουν οχτώ μέλη στην οικογένεια (υποδοχέας προσταγλανδίνης D (PD), υποδοχέας ΕΡ (ΕΡ1, ΕΡ2, ΕΡ3 ΕΡ4), υποδοχέας προσταγλανδίνης F (FP), υποδοχέας προσταγλανδίνης Ι (ΙΡ) και υποδοχέας θρομβοξανίου Α (ΤΡ)) ενώ πρόσφατα έχει ανακαλυφθεί ένας ένατος, ο CRTH 2, διέγερση του οποίου εμφανίζει χημειοτακτική δράση (41). 5.1β Αναστολείς βιοσύνθεσης των εικοσανοειδών Από όλα τα παραπάνω, γίνεται κατανοητό ότι, για να τερματιστεί η φλεγμονώδης αντίδραση, σκόπιμο είναι να ανασταλεί η βιοσύνθεση των εικοσανοειδών. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα γλυκοκορτικοειδή και οι αναστολείς των κυκλοξυγονασών. Οι τελευταίοι διαχωρίζονται σε αυτούς που αναστέλλουν μικτά την κυκλοξυγονάση 1 και 2, και σε εκείνους που αναστέλλουν εκλεκτικά την κυκλοξυγονάση 2. Τα γλυκοκορτικοειδή αναστέλουν μη εκλεκτικά όλα τα προϊόντα μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος (2γ). Συγκεκριμένα, τον πρωταρχικό μηχανισμό δράσης τους αποτελεί η καταστολή της φωσφολιπάσης Α 2, συνεπώς και η μη απελευθέρωση αραχιδονικού οξέος. Η τελευταία παρατήρηση έχει ως έμμεσο αποτέλεσμα την αναστολή της σύνθεσης λευκοτριενίων και προσταγλανδινών (εικόνα 7, σελίδα 12). Παράλληλα αναστέλλει τις αντιφλεγμονώδεις εκδηλώσεις των λευκοκυττάρων (μετανάστευση, χημειοταξία, φαγοκυττάρωση). Τέλος, εκτός των δύο αυτών δράσεων (αναστολή ανοσολογικής απόκρισης- παρεμπόδιση προϊόντων φλεγμονής), αναστέλει τα ισοένζυμα της κυκλοξυγονάσης. (42) Τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη (NSAIDs) αποτελούν μια από τις ευρύτερα χορηγούμενες ομάδες φαρμάκων, με περίπου 70 εκατομμύρια συνταγές να πωλούνται ετησίως μόνο στις ΗΠΑ. Τα μη στερεοειδή αντιφλεγμονώδη αποτελούν μέρος μεγάλης αλλά ετερογενούς οικογένειας, αφού διαφέρουν τόσο ως προς την ισχύ τους, όσο και προς την διάρκεια δράσης τους. Μεγάλη ετερογένεια παρουσιάζουν και ως προς τη δομή τους. Όμως ο μηχανισμός 23

25 δράσης των NSAIDs είναι κοινός για όλα τα μέλη. Εμφανίζουν την αντιφλεγμονώδη, αντιπυρετική, αναλγητική και αντιρρευματική δράση τους αναστέλλοντας τη βιοσύνθεση των προσταγλανδινών, σε αντίθεση με τα στεροειδή, των οποίων η αντιφλεγμονώδης δράση οφείλεται σε καταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος (43, 44). 5.1 γ Μη στερεοειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα Τα μη στερεοειδή αντιφλεγμονώδη (NSAIDs) είναι τα πιο ευρέως κυκλοφορούντα φάρμακα, χορηγούμενα είτε συνταγογραφούμενα είτε χωρίς ιατρική συνταγή, διαθέσιμα στις περισσότερες χώρες. Άλλωστε, τη φαρμακοθεραπεία επιλογής κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους απόκρισης (που έχει ξεπεράσει τους αρχικούς της στόχους, δηλαδή την προστασία του ίδιου του οργανισμού) αποτελεί η μεγάλη οικογένεια των μη στερεοειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων. Δευτερεύοντως, χρησιμοποιούνται για την ανακούφιση από τον ήπιο έως μέτριο πόνο αλλά και από τον πυρετό. Ταυτόχρονα με την εισαγωγή τους στην κυκλοφορία, παρουσιάστηκε βιβλιογραφία που καταδεικνύει τις παρενέργειές τους. Παρόλο που τα μη στερεοειδή αντιφλεγμονώδη παράγωγα επηρεάζουν αναπνευστικό και καρδιαγγειακό σύστημα, η συχνότερη, ευρέως μελετούμενη, καταγεγραμμένη ανεπιθύμητη ενέργεια αναφέρεται στην επιβάρυνση του γαστρεντερικού συστήματος (GIT) (45-48). 5.2 Μηχανισμός δράσης των NSAIDs Ο μηχανισμός δράσης των NSAIDs σχετίζεται με την αναστολή παραγωγής προσταγλανδινών (PGs). Το μόριο του φαρμάκου, αφού πλησιάσει το κύτταροστόχο, διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη και εισέρχεται στην καταλυτική κοιλότητα του ενζύμου CX. Στη συνέχεια συνδέεται με αμινοξέα του τοιχώματος της κοιλότητας με τέτοιο τρόπο, ώστε το μόριο του φαρμάκου να προκαλεί πλήρη απόφραξη της κοιλότητας. Όταν διεγερθεί το συγκεκριμένο κύτταρο από φυσιολογικό ή παθολογικό ερέθισμα, θα παραχθεί αραχιδονικό οξύ, το οποίο θα προσπαθήσει να εισέλθει στην CX για να παραχθούν οι αναγκαίες προσταγλανδίνες και να αντιμετωπιστεί η διέγερση που προκάλεσε το ερέθισμα. Στην πορεία του όμως προς την κοιλότητα της CX θα βρει την είσοδο κλειστή από το μόριο του φαρμάκου και έτσι δεν θα παραχθούν προσταγλανδίνες. (49, 50) 5.3 Το ενζυμικό σύστημα της κυκλοξυγονάσης Η κυκλοξυγονάση βρίσκεται σε δύο κύριες ισομορφές, την CX-1 και CX-2. Έχει περιγραφεί και μια τρίτη ισομορφή, η CX-3, η οποία όμως είναι 24

26 πιθανώς παραλλαγή του γονιδίου CX-1 με μια επιπλέον πεπτδική αλληλουχία ( 49, 50). Η CX-1 βρίσκεται φυσιολογικά στον οργανισμό, και παράγει προσταγλανδίνες. Όταν οι προστακυκλίνες απελευθερώνονται από το ενδοθήλιο, δρουν αντιθρομβωτικά, ενώ εάν απελευθερωθούν από το γαστρικό επιθήλιο, η δράση τους είναι προστατευτική. Αναστολή της CX-1 προκαλεί τις ανεπιθύμητες ενέργειες των NSAIDs, δηλαδή την τοξικότητά τους. Έτσι, ως βασική ανεπιθύμητη ενέργεια μπορεί να εμφανιστεί έλκος, και μάλιστα εμφανίζεται στατιστικά στο 25% των ασθενών. Η δεύτερη σοβαρότερη ανεπιθύμητη ενέργεια είναι η ελάττωση της πηκτικότητας του αίματος, καθώς και η νεφροτοξικότητά τους. Η άλλη ισομορφή είναι επαγόμενη από κυτοκίνες, μιτογόνα και ενδοτοξίνες σε κύτταρα που επιτελείται η φλεγμονώδης διεργασία. Η CX-2, που ανακαλύφθηκε έξι χρόνια μετά την πρώτη ισομορφή, κρίνεται η πραγματικά υπεύθυνη για την εξέλιξη της φλεγμονής. Έτσι οι εκλεκτικοί αναστολείς της CX-2 αποτέλεσαν τους φαρμακευτικούς στόχους των τελευταίων ετών. Η τελευταία ενέργεια εκ των υστέρων αποδείχτηκε εσφαλμένη καθώς αναστολή της CX-2 πυροδοτεί σειρά από σοβαρά καρδιαγγειακά προβλήματα. Έχει βρεθεί ότι εκλεκτική αναστολή της CX-2 έχει ευνοϊκή επίδραση στη νόσο Alzheimer (ειδικά το μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες ιβουπροφαίνη) αλλά και στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα περισσότερα NSAIDs αναστέλλουν μη εκλεκτικά και τις δύο ισομορφές του ενζύμου. Όσο πιο πολύ αυξάνεται η αναστολή της CX-1, τόσο πιο μεγάλη η τάση του φαρμάκου για πρόκληση γαστρικού έλκους (αφού η 1 και όχι η 2 βρίσκεται στον στόμαχο), αλλά και πρόκληση αιμορραγίας. Ας σημειωθεί ότι δεν παρουσιάζεται αναστολή της σύνθεσης των λευκοτριενίων, ενώ κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, μπορεί να επάγουν και την παραγωγή τους (αντίθετα, η χορήγηση κορτικοστεροειδών αναστέλλει αμφότερα, την παραγωγή προσταγλανδινών και λευκοτριενίων) (2γ, 43,44). Στην παρακάτω πίνακα καταδεικνύεται η διαφορετική φύση των δύο ισομορφών της κυκλοοξυγονάσης (2γ). Έτσι η CX-1 βρίσκεται στον οργανισμό φυσιολογικά, γι αυτό και ονομάζεται δομική, εκφράζεται στα περισσότερα κύτταρα και ιστούς με κυτταροπροστατευτικό στόχο. Αυτή είναι υπεύθυνη για την παραγωγή εικοσανοειδών για τις φυσιολογικές λειτουργίες όπως της ρύθμισης της νεφρικής ροής του αίματος, της αγγειακής ομοιόστασης και της παραγωγής κυτταροπροστατευτικών προσταγλανδινών από το ενδοθήλιο και το γαστρικό βλεννογόνο (15, 51). Αντίθετα η CX-2 είναι συνήθως μη ανιχνεύσιμη, και επάγεται ραγδαία σε περιπτώσεις φλεγμονωδών ερεθισμάτων (52). 25

27 5.4 Κατάταξη των NSAIDs βάσει της δομής τους Ο ρόλος των NSAIDs είναι η καταστολή των εκδηλώσεων της φλεγμονής. Είναι ετερογενής ομάδα και συνήθως, δεν εχουν όμοια δομικά χαρακτηριστικά. Με βάση τη χημική τους δομή, τα κλασσικά NSAIDs μπορούν να καταταχθούν στις ακόλουθες κατηγορίες: Πίνακας 2: Δομική κατάταξη των NSAIDs 1. Παράγωγα του σαλικυλικού οξέος ασπιρίνη διφλουνιζάλη 2.Παράγωγα του α-φαινυλο-προπιονικού οξέος ναπροξένη ιβουπροφαίνη κετοπροφαίνη φλουμπιπροφαίνη 26

28 θειαπροφαινικό οξύ 3.Παράγωγα του ανθρανιλικού οξέος (ισχυρή αντιφλεγμονώδης δράση) μεφαιναμικό οξύ φλουφαιναμικό οξύ 4. Παράγωγα των πυραζολονών φαινυλοβουταζόνη οξυφαινυλοβουταζόνη μεταμιζόλη αμινοφαιναζόνη προπυφαιναζόνη 5.Παράγωγα της 4-υδροξυ-1,2- βενζοθειαζίνης πιροξικάμη τενοξικάμη λορνοξικάμη Μελοξικάμη 6. Παράγωγα του αρυλοξικού οξέος ινδομεθακίνη σουλινδάκη 27

29 ετοδολάκη κετορλάκη 7. Παράγωγα π-αμινοφαινόλης (στερούνται αντιφλεγμονώδους δράσης) παρακεταμόλη φαινακετίνη 8. Σουλφοναμίδια διφλουμιδόνη 9. Κιναζολινόνες 10. Αλκανόνες ναβουμετόνη 11. Διάφορες ενώσεις από άποψης χημικής δομής, όπως π.χ. διφταλόνη, τριμπενοσίδη, νικτινδόλιο, καθώς και ενώσεις χρυσού, χαλκού κ.ά. Παρατηρώντας προσεκτικά τα δομικά χαρακτηριστικά των διαφόρων κατηγοριών είναι εμφανές ότι τα περισσότερα από τα φάρμακα που εντάσσονται σε αυτές είναι οργανικά οξέα ή παράγωγά τους. Επιπλέον, υπάρχουν σε αυτά δύο ή τρεις αρωματικοί δακτύλιοι, απλοί ή συμπυκνωμένοι. Παρατηρήθηκε ότι η δράση βελτιώνεται όταν οι δακτύλιοι δεν βρίσκονται στο ίδιο επίπεδο. Μερικά από τα μη στερεοειδή αντιφλεγμονώδη που βρίσκουν κλινική εφαρμογή ανήκουν στην κατηγορία των ενολών, ενώ υπάρχουν και μη όξινα NSAIDs όπως η ναβουμετόνη και η παρακεταμόλη. 5.4α Φαρμακευτικές προσεγγίσεις των NSAIDs 1. Κλασσικά μη στερεοειδή αντιφλεγμονώδη (π.χ. ασπιρίνη). Αποτελούν αναστολείς κυρίως της CX-1. Είναι εμφανές ότι εκλεκτικότερη αναστολή αυτής της ισομορφής συνοδεύεται με αντιθρομβωτική δράση, αλλά και με γαστρεντερικές παρενέργειες (53). 2. Εκλεκτικοί αναστολείς CX-2 (γνωστοί με τον όρο κοξίμπες). Στις αρχές του 1990, μόλις έγινε αντιληπτό ότι υπάρχουν δύο ισομορφές της κυκλοξυγονάσης, προτάθηκε ότι η αναλγητική, αντιπυρετική και 28

30 αντιφλεγμονώδης δράση τους οφείλεται στην αναστολή της ισομορφής CX-2. Αυτή η θεωρία προέβλεπε ισχυρότερα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη, που θα μπορούσαν να χορηγηθούν σε επίπονες αρθροπάθειες, χωρίς να εμπλέκουν το γαστρεντερικό σύστημα. Αργότερα έγινε φανερό ότι πυροδοτούσαν παρενέργειες από το καρδιαγγειακό σύστημα (53, 54). 3. Τρίτης γενιάς NSAIDs. Η προσπάθεια εξέλιξης των NSAIDs δεν σταμάτησε ποτέ. Ως αποτέλεσμα, αναπτύχθηκαν πολλαπλές θεωρίες, με καινοτόμες φαρμακολογικές προσεγγίσεις, που ορισμένες στοχεύουν τους υποδοχείς εικοσανοειδών (55). Παρακάτω παρατίθενται μερικές διαφορετικές στρατηγικές. i. Διπλός ανταγωνισμός CX-2/TP. Οι υποδοχείς TP αποτελούν τους υποδοχείς του θρομβοξανίου TXA 2. Οι ανταγωνιστές τους αναστέλλουν την ενεργοποίησή τους από όλους τους πιθανούς μεσολαβητές, ακόμα και τa ισοπροστάνια (aντίθετα με τους αναστολείς της συνθετάσης του θρομβοξανίου TXs-I). Ο ανταγωνισμός των υποδοχέων TP αποτελεί ευνοϊκή προσθήκη στις κοξίμπες. Έτσι, έχουμε συνδυασμό της ισχυρότατης αντιφλεγμονώδους δράσης των εκλεκτικών αναστολέων της κυκλοξυγονάσης-2, αποφεύγοντας παράλληλα ανεπιθύμητες ενέργειες από το καρδιαγγειακό. ii. NSAIDS δότες μονοξειδίου του αζώτου. iii. Αναστολή ενζύμων που εμπλέκονται στο βιοσυνθετικό μονοπάτι των προσταγλανδινών PGs, όπως στη συνθετάση της PGE 2 (55-57). iv. Συνδυασμοί των ΝSAIDs είτε με φάρμακα που αναστέλλουν την έκκριση των πρωτονίων στο βλεννογόνο του επιθηλίου (αναστολείς της αντλίας των πρωτονίων), είτε με αναστολείς των υποδοχέων Η 2. v. NSAIDs συζευγμένα με θειολοομάδες. vi. Συγχορήγηση NSAID με την κοβιπροστόνη, ένα εικοσανοειδές ικανό να ενεργοποιεί την αντλία ιόντων χλωρίου. vii. Συγχορήγηση NSAID με την μισοπροστόλη, κυτταροπροστατευτική προσταγλανδίνη (59-67). 5.5 Εκδήλωση αναλγητικής δράσης των NSAIDs Η αναστολή της παραγωγής προσταγλανδινών (ιδιαίτερα της PGE 2 ) μπορεί να ανακουφίσει από τον πόνο ακόμα και όταν δεν υπάρχει αμιγώς φλεγμονώδης νόσος. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η PGE 2 παράγεται μετά από τη δράση 29

31 οποιουδήποτε ερεθίσματος στην περιφέρεια και ευαισθητοποιεί τους περιφερικούς υποδοχείς πόνου (περιφερεική ευαισθητοποίηση), αλλά ταυτόχρονα παράγεται μέσω της ειδικής δράσης των ιντερλευκινών στον εγκέφαλο, τον οποίο επίσης ευαισθητοποιεί για την αντίληψη του πόνου (κεντρική ευαισθητοποίηση). Αυτός είναι ο λόγος που τα NSAIDs χρησιμοποιούνται ως αναλγητικά, πέραν της αντιφλεγμονώδους δράσης τους (68). Ένας άλλος μηχανισμός δράσης των NSAIDs είναι η άμεση δράση στους νευρώνες (κεντρικούς και περιφερικούς) με μείωση της ικανότητας αντίληψης του πόνου (69). 6. Ανεπιθύμητες ενέργειες των αναστολέων κυκλοξυγονάσης 6.1 Ανεπιθύμητες ενέργειες προκαλούμενες από εκτεταμένη χορήγηση NSAIDs Είναι δύσκολο να αποφασιστεί ποιό NSAID θεωρείται περισσότερο ασφαλές από τα υπόλοιπα. Ωστόσο η ασφάλεια έχει να κάνει με την ικανότητά του να αναστέλλουν τη δράση της CX. Θεωρείται ότι τα NSAIDs που αναστέλλουν ασθενέστερα την κυκλοξυγονάση είναι και τα πιο ασφαλή. (70). Γαστρεντερικό σύστημα: Οι συχνότερα αναφερόμενες παρενέργειες ποικίλλουν σε βαθμούς σημαντικότητας. Αρχίζουν από απλά δυσπεπτικά συμπτώματα, κοιλιακό πόνο, ναυτία, μέχρι και πολύ σοβαρές παρενέργειες όπως αιμορραγίες αλλά και διάτρηση γαστρικών ελκών. Φυσικά η βαρύτητα των παραπάνω συμπτωμάτων έχει να κάνει άμεσα με το χρόνο έκθεσης του ασθενούς στα μη στερεοειδή αντιφλεγμονώδη παράγωγα. Έτσι δύνανται να υπάρξουν έλκη και τοπικές διαβρώσεις που επουλώνονται αυθόρμητα από τον πάσχοντα οργανισμό χωρίς να χρειάζεται φαρμακευτική αντιμετώπιση, αλλά επίσης υπάρχουν έλκη διαμέτρου μεγαλύτερης των τριών χιλιοστών με εμφανές βάθος τα οποία μπορούν να οδηγήσουν σε σοβαρότατα αιμορραγικά επεισόδια, διάτρηση και εμβολή. Είναι ευρέως γνωστό ότι εκτεταμένη λήψη των NSAIDS αυξάνει τον κίνδυνο για αιμορραγία και διάτρηση του άνω γαστρεντερικού συστήματος (UGIB). Συγκεκριμένα έχει βρεθεί ότι οι πιθανότητες πολλαπλασιάζονται τρεις με τέσσερις φορές στους χρήστες από ότι στους υπόλοιπους. Αυτό σημαίνει ότι εμφανίζονται τρια με τέσσερα σοβαρά περιστατικά που παρουσιάζουν κλινική εικόνα καθε χρόνο ανά χίλια άτομα. Στον κίνδυνο πρόκλησης UGIB πρέπει να συνυπολογιστεί σειρά από ποικίλλους παράγοντες όπως η ηλικία και το φύλο του ασθενούς, το κάπνισμα, η αλκοόλη, το ιστορικό του ασθενούς αναφορικά με το πεπτικό έλκος, και η συγχορήγηση κορτικοστερεοειδών ή αντιπηκτικών. Επιπλέον η δόση του μη στερεοειδούς αντιφλεγμονώδους παραγώγου αποτελεί έναν 30

32 ακόμα παράγοντα αύξησης του κινδύνου. Έτσι, χαμηλή δόση υπολογίζεται οτι προσδίδει δυόμιση φορές περισσότερο κίνδυνο, μια ενδιάμεση τέσσερις και ένα δεύτερο ενώ μια υψηλή περίπου εννέα. Η ίδια η δομή των παραγώγων προσθέτει με την σειρά της διαφορετική πιθανότητα πρόκλησης έλκους. Συγκεκριμένα η ιβουπροφαίνη και η δικλοφαινάκη παρουσιάζουν χαμηλή αλλά όχι αμελητέα επικινδυνότητα, ενώ η κετοπροφαίνη και η αζαπροπαζόνη έχουν τους μεγαλύτερους συντελεστές κινδύνου (71). Ήπαρ: Όλα τα NSAIDS μπορούν να προκαλέσουν παροδική τρανσαμιναιμία, η οποία παρέρχεται με τη διακοπή του φαρμάκου. Σπανιότερα μπορεί να εμφανιστεί ηπατική βλάβη μέσω μηχανισμών υπερευαισθησίας κυρίως από τη νιμεσουλίδη και τη δικλοφαινάκη. (68) Νεφροί: Για να γίνουν κατανοητές οι παρενέργειες, χρήσιμο είναι να αναφερθεί η δράση των προσταγλανδινών στους νεφρούς μέσω δύο μηχανισμών. Από τη μια πλευρά δρουν στα αγγεία, διατηρώντας τη νεφρική ροή του αίματος και το ρυθμό σπειραματικής διήθησης μέσω ενίσχυσης της αγγειοσύσπασης που προκαλεί η αγγειοτασίνη ΙΙ, αυξάνοντας την έκκριση ρενίνης και ανταγωνιζόμενα τυχόν διασυστηματική αγγειοσύσπαση. Από την άλλη πλευρά οι προσταγλανδίνες δρουν και στα νεφρικά σωληνάρια, ανταγωνιζόμενες τη δράση της αντιδιουρητικής ορμόνης (72). Σε περιπτώσεις 1%-5% μπορεί να προκαλέσουν οιδήματα ή υπέρταση, και σπάνια νεφρική ή καρδιακή ανεπάρκεια και ηλεκτρολυτικές διαταραχές. Αιμοπετάλια: Αφού αναστέλλεται η σύνθεση θρομβοξανίου, η συσσώρευση των αιμοπεταλίων μειώνεται οδηγώντας σε πιθανές αιμορραγίες (68). Καρδιαγγεακό σύστημα: Περιλαμβάνουν υπέρταση, επιδείνωση προϋπάρχουσας καρδιακής ανεπάρκειαςκαι αύξηση των στεφανιαίων επεισοδίων (73). 6.2 Μηχανισμός βλάβης του γαστρεντερικού βλεννογόνου Όπως αναφέρθηκε, αναστολή της κυκλοξυγονάσης-1 προκαλεί από τραυματισμό του γαστρεντερικού επιθηλίου μέχρι και έλκος, αφού καταστρέφονται οι προστατευτικοί μηχανισμοί του βλεννογόνου του επιθηλίου, οι οποίοι εξαρτώνται από την παραγωγή προσταγλανδινών, και πιο συγκεκριμένα των κυτοπρoστατευτικών προσταγλανδινών PGE 2 και PGI 2. Αναστολή της σύνθεσής τους επιφέρει επιζήμια αποτελέσματα. Αρχικά παρατηρείται σημαντική μείωση της έκκρισης ανθρακικών και παράλληλη αύξηση της έκκρισης των υδρογονοκατιόντων. Έτσι το όξινο περιβάλλον που κυριαρχεί στα υγρά του στομάχου δεν ελέγχεται. Τα περισσότερα NSAIDS είναι όξινα μόρια και στο όξινο ph του στομάχου δεν ιονίζονται, απορροφώνται και παγιδεύονται στο επιθήλιο, όπου το ph δεν είναι πλέον όξινο, μη μπορώντας να απορροφηθούν από αυτό. Ακόμη παρατηρείται αισθητή μείωση του πάχους της βλεννογόνου στιβάδας που καλύπτει το 31

33 επιθήλιο του στομάχου. Ένα ακόμα άμεσο αποτέλεσμα αυτής της αναστολής είναι η δράση στα τριχοειδή αγγεία και συγκεκριμένα η επιβάρυνση της ροής μέσω των τριχοειδών που αιματώνουν τον βλεννογόνο. Κατά τη φλεγμονώδη απόκριση, παράγεται μονοξείδιο του αζώτου το οποίο δρα ομοιοστατικά, προκαλώντας αγγειοδιασταλή. Μετά τη λήψη NSAIDs, μειώνεται απότομα η παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου, αποσταθεροποιείται ο ομοιοστατικός μηχανισμός, με άμεσο αποτέλεσμα την αγγειοσύσπαση και συνεπώς την μειωμένη ροή αίματος στην περιοχή. Ο τελευταίος μηχανισμός που σχετίζεται με τα NSAIDs προτάθηκε τα τελευταία χρόνια και εμπλέκει την ύπαρξη των ελευθέρων ριζών στο γαστρεντερικό επιθήλιο, αλλά και τις ποικίλλες επιζήμιες αλυσιδωτές αντιδράσεις που δύναται να προκαλέσουν (45, 71). 6.3 Μηχανισμός πρόκλησης καρδιαγγειακών παρενεργειών Όπως αναφέρθηκε, οι εκλεκτικοί αναστολείς των CX-2 προκαλούν παρενέργειες από το καρδιαγγειακό σύστημα. Μια προσέγγιση προτείνει ότι οι κοξίμπες μειώνουν την ενδοθηλιακή PGI 2 (αφού στο ενδοθήλιο εκφράζεται η επαγόμενη CX-2), χωρίς όμως να επηρεάζουν το TXA 2 (αφού η παραγωγή του οφείλεται στην CX-1) (58). H PGI 2 αποτελεί προστανοειδές που αποτρέπει θρομβωτικά φαινόμενα (και ίσως και την αθηρογένεση) που προέρχoνται από όλους τους γνωστούς ανταγωνιστές της CX-2 (55). Πιο συγκεκριμένα οι κοξίμπες μπορούν να αυξήσουν την αρτηριακή πίεση ή να επιδεινώσουν την προϋπάρχουσα υπέρταση διότι τα NSAIDs αναστέλλουν τη σύνθεση αγγειοδιασταλτικών προσταγλανδινών από τους νεφρούς και έχουν άμεση αγγειοσυσπαστική επίδραση (72, 73). Έρευνες έχουν δείξει τον προστατευτικό ρόλο της CX-2 στη λειτουργία του μυοκαρδίου που αρνητικοποιούνται με την αναστολή της CX-2, ενώ άλλες έχουν δείξει βελτιωμένη ενδοθηλιακή λειτουργία με τους αναστολείς CX-2 (75). Διάφοροι μηχανισμοί συνδέονται με την παθογένεση αυτών των παρενεργειών (76, 77): α) Η εκλεκτική αναστολή της CX-1 μειώνει τη σύνθεση του θρομβοξανίου (ΤΧΑ 2 ) στα αιμοπετάλια, ένα αθηρογενετικό εικοσανοειδές, ενεργοποιητή και συσσωρευτή αιμοπεταλίων. Οι εκλεκτικοί αναστολείς της CX-2 δεν έχουν καμιά επίδραση στην παραγωγή θρομβοξανίου Α 2 αλλά δρουν μειώνοντας την παραγωγή της προστακυκλίνης (PGI 2 ) στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η προστακυκλίνη είναι ένα παράγωγο του αραχιδονικού οξέος που έχει αντίθετες δράσεις από το θρομβοξάνιο, προκαλεί αγγειοχάλαση και είναι αναστολέας της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων. 32

34 Η μείωση του θρομβοξανίου περιορίζει την αθηρογένεση ενώ η μείωση της προστακυκλίνης επιταχύνει την αθηρογένεση. Η εκλεκτική αναστολή της CX-2 μπορεί επομένως να διαταράξει τη φυσιολογική ισορροπία μεταξύ του προθρομβωτικού θρομβοξανίου Α 2 και της αντιθρομβωτικής προστακυκλίνης PGI 2 και μ αυτόν τον τρόπο να επιταχύνει αθηροσκλήρωση, θρομβογένεση και να οδηγήσει έτσι στην αύξηση των θρομβωτικών καρδιαγγειακών επεισοδίων. β) Η αναστολή του ενζύμου CX μπορεί να αυξήσει τα επίπεδα του αραχιδονικού οξέος και να αναστείλει την οξειδωτική φωσφορυλίωση. Πολλά NSAIDs, συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων CX-2, άμεσα αναστέλλουν την οξειδωτική φωσφορυλίωση (78). Επάγεται ακόμη η αυξημένη έκφραση της θρομβομοντουλίνης (αναστολέας θρομβίνης) στα ανθρώπινα λεία μυικά κύτταρα που παρέχει μοριακή βάση για έναν άγνωστο, αιμοπεταλιακά-εξαρτώμενο μηχανισμό, υπογραμμίζοντας τα προθρομβωτικά αποτελέσματα των NSAIDs και των αναστολέων CX-2 (79). 7. Ελεύθερες ρίζες 7.1 Γενικά Ως ελεύθερη ρίζα ορίζεται κάθε αυθύπαρκτο χημικό είδος, το οποίο περιέχει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια (δηλ. ηλεκτρόνια το καθένα από τα οποία καταλαμβάνει μόνο του ένα ατομικό ή μοριακό τροχιακό) (80, 81). Οι περισσότερες ελεύθερες ρίζες είναι εξαιρετικά δραστικές, όπως η ρίζα υδροξυλίου, δίνοντας έναρξη σε διαδοχικές αντιδράσεις και έχοντας πολύ μικρή ημιπερίοδο ζωής, ενώ άλλες είναι λιγότερο δραστικές. Για παράδειγμα η ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου, λόγω φορτίου, δεν μπορεί να διαπεράσει τις λιπιδικές μεβράνες. Ο σχηματισμός της ρίζας ανιόντος υπεροξειδίου είναι αυθόρμητη διαδικασία που λαμβάνει χώρα κυρίως στο πλούσιο σε ηλεκτρόνια αερόβιο περιβάλλον κοντά στην εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη κατά την αναπνευστική αλυσίδα. Η ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου (όπως και το υπεροξείδιο του υδρογόνου) παράγεται επίσης ενδογενώς από ένζυμα που περιέχουν φλαβίνη όπως η ξανθινοξειδάση που ενεργοποιείται σε ισχαιμικές καταστάσεις. Άλλα έζυμα που παράγουν ρίζες ανιόντος υπεροξειδίου είναι η λιποξυγονάση (LX) και η κυκλοξυγονάση (CX) (82-85). 7.1α Δραστικές μορφές οξυγόνου Στον οργανισμό των θηλαστικών, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, ένα μικρό μέρος του χρησιμοποιούμενου οξυγόνου ανάγεται μερικώς. Η αναγωγή αυτή διεκπεραιώνεται από το σύστημα μεταφοράς ηλεκτρονίων των μιτοχονδρίων, από τα ενζυμικά συστήματα του κυτοχρώματος Ρ450, της ξανθινοξειδάσης, της προσταγλανδινικής συνθετάσης και της 33

35 μονοαμινοξειδάσης, με τη συμμετοχή μεταβατικών μετάλλων. Έτσι δημιουργούνται δραστικές μορφές οξυγόνου (δηλαδή μερικώς ανηγμένο οξυγόνο), όπως ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου (Ο 2 ), ρίζα υδροϋπεροξειδίου (ΗΟ 2 ), ρίζα υδροξυλίου (ΗΟ ) και υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα (86). e (Fe 2+ ) e +2H 2 + e +Fe 2 H (Fe 3+ ) -H + +H + Fe 2+ H H e +H + H 2 H 2 Σχήμα 3: Παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου σε βιολογικό σύστημα, με είσοδο ενός ηλεκτρονίου κάθε φορά (μερική αναγωγή οξυγόνου) Οι σημαντικότερες δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species, RS) που δημιουργούνται κατά τη μερική αναγωγή του οξυγόνου φαίνονται στο προηγούμενο σχήμα, και περιλαμβάνουν: 1. Ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου Ο 2-2. Ρίζα υδροϋπεροξειδίου, ΗΟ 2 3. Υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) 4. Ρίζα υδροξυλίου (ΗΟ ) 7.2 Ο ρόλος των δραστικών μορφών οξυγόνου στη φλεγμονώδη απόκριση Το οξειδωτικό στρες και οι δραστικές μορφές οξυγόνου παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική απάντηση του οργανισμού έναντι των μικροοργανισμών (87). Υπάρχουν αρκετά στοιχεία που αποδεικνύουν τη συμμετοχή των ελευθέρων ριζών σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Ελεύθερες ρίζες και ενεργές μορφές οξυγόνου αντιδρούν με τα περισσότερα βιομόρια δίνοντας έναρξη σε αλυσιδωτές αντιδράσεις παραγωγής νέων ελευθέρων ριζών. Μελέτες έχουν δείξει ότι ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα, εωσινόφιλα, μονοκύτταρα και μακροφάγα παράγουν ενεργές μορφές οξυγόνου και λυσοσωμικά υδρολυτικά ένζυμα κατά τη φλεγμονώδη απόκριση. Τα φαγοκύτταρα παράγουν τη ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου στις φλεγμαίνουσες περιοχές, γεγονός το οποίο σχετίζεται και με άλλες ενεργές μορφές οξυγόνου, όπως η ρίζα υδροξυλίου (ΗΟ. ). Οι ρίζες υδροξυλίου παράγονται από αντιδράσεις όπου εμπλέκονται μεταβατικά μέταλλα με κύριο το σίδηρο (Fe 2+ ) (88-90). Οι οξυγονούχες ελεύθερες ρίζες μπορούν να ενεργοποιήσουν τη φωσφολιπάση Α 2 των μεμβρανών, η οποία καταλύει τη βιομετατροπή του αραχιδονικού οξέος σε εικοσανοειδή μέσω δύο κύριων οδών, της λιποξυγονάσης, προς σχηματισμό λευκοτριενίων, και της κυκλοξυγονάσης, προς σχηματισμό προσταγλανδινών και 34

36 θρομβοξανίου Α 2. Οι προσταγλανδίνες και τα υπεροξείδια των λιπιδίων προσελκύουν περισσότερα μακροφάγα και λευκοκύτταρα στους φλεγμαίνοντες ιστούς μέσω της ικανότητάς τους να προάγουν το χημειοτακτισμό και την αγγειακή διαπερατότητα. Επίσης, κατά τη φλεγμονώδη απόκριση, τα φαγοκύτταρα εκκρίνουν όξινες (καθεψίνη G) και ουδέτερες πρωτεϊνάσες (ελαστάση, κολλαγονάση κλπ). Η δραστηριότητα αυτών των ενζύμων είναι στενά συνδεδεμένη με το σύστημα μυελοϋπεροξειδάσης-ηοcl και οδηγεί σε ενίσχυση της εξέλιξης της φλεγμονής (91-93). Η αυξημένη συγκέντρωση δραστικών μορφών οξυγόνου αφενός προκαλεί βλάβη των ιστών και αφετέρου εμπλέκεται στην ενεργοποίηση οδών μετάδοσης σήματος, οδηγώντας σε διαταραγμένη κυτταρική λειτουργία ή και σε κυτταρικό θάνατο (87). Δραστικές μορφές οξυγόνου παράγονται συνεχώς ως αποτέλεσμα μεταβολικών αντιδράσεων σε ζωντανούς οργανισμούς και εμπλέκονται σε πλήθος παθολογικών καταστάσεων όπως σε αθηροσκλήρωση, καρκίνο, φλεγμονή, αρθρίτιδα, αρνητικές συνέπειες γήρανσης κλπ (80-81, 94-97). 7.3 Θεωρίες για τον μηχανισμό της αθηρωγένεσης Θεωρία της επικάλυψης: απόθεση ινώδους στο εσωτερικό τοίχωμα των αρτηριών φέρει ως αποτέλεσμα την πάχυνση του έσω χιτώνα (αθήρωμα) των μέσου και μεγάλου μεγέθους αρτηρίων, περιορίζοντας ή και εμποδίζοντας τη ροή αίματος (98, 99). Οι βλάβες του έσω χιτώνα ποικίλλουν από μικρές και ελαφρώς υπεγειρόμενες επιμήκεις ραβδώσεις (λιπώδεις ραβδώσεις) ως τον σχηματισμό εστιών υπό μορφή οζιδίων ή πλακών ή και ακόμη ως τον σχηματισμό προχωρημένων βλαβών με εξελκώσεις, θρομβώσεις, αιμορραγίες και εναποθέσεις αλάτων ασβεστίου (επιπεπλεγμένες αλλοιώσεις) (100). Θεωρία της λιποειδικής διαπίδυσης: σύμπλοκα λιποειδών με βλεννοπολυσακχαρίτες προκαλούν την αθηροσκλήρωση Θεωρία της απόκρισης σε τραυματισμό: Οι Ross και Glomset (101) προτείνουν ως αρχική αιτία την αλλοίωση του ενδοθηλίου. Αυτή η διαδικασία οδηγεί σε διάφορες αντισταθμιστικές αποκρίσεις οι οποίες αλλάζουν τη φυσιολογική ομοιόσταση των αγγείων. Ο τραυματισμός αυξάνει την συγκολλητικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων με τα λευκοκύτταρα και τα αιμοπετάλια, και μεταβάλλει το τοπικό περιβάλλον από αντιθρομβωτικό σε προμθροβωτικό με την απελευθέρωση κυτταροκινών, χημοκινών και αυξητικών παραγώγων Θεωρία οξειδωτικής τροποποίησης: Η χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνη (LDL) είναι το κύριο μέσο μεταφοράς της χοληστερόλης στο αίμα. Η άθικτη LDL δεν είναι αθηρογόνος, όμως η οξειδωμένη LDL είναι 35

37 επικίνδυνη. Η οξειδωτικά τροποποιημένη LDL (oxldl) δεν αναγνωρίζεται πλέον από τους υποδοχείς της, αλλά από τους εκκαθαριστικούς υποδοχείς των μακροφάγων. Έτσι προσλαμβάνεται από τα μακροφάγα, τα οποία σταδιακά σχηματίζουν τα αφρώδη κύτταρa. Η συσσώρευση αφρωδών κυττάρων οδηγεί στις λιπώδεις γραμμώσεις και, τελικά, στην αθηρωματική πλάκα, την εστία της αθηροσκληρωτικής βλάβης (99) 7.4 Οξειδωτικό στρες, φλεγμονή, αθηροσκλήρωση Αθηροσκλήρωση ονομάζεται η χρόνια νόσος του αρτηριακού τοιχώματος, φλεγμονώδους αιτιολογίας, η οποία εξελίσσεται σε περιβάλλον υπερλιπιδαιμίας και οξειδωτικού στρες, με την ταυτόχρονη συμμετοχή μεσολαβητών, γενετικών παραγόντων, ανοσολογικών αντιδράσεων και αιμοδυναμικών μηχανισμών. Τα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια που είναι προσδεδεμένα στις πρωτεογλυκάνες έχουν αυξημένη ευαισθησία στις οξειδωτικές ή άλλες χημικές τροποποιήσεις (οξείδωση και μη ενζυμική γλυκοζυλίωση), οι οποίες θεωρούνται από πολλούς ερευνητές ως ένα σημαντικό συστατικό της παθογένεσης των αρχικών σταδίων της αθηροσκλήρωσης ( ). Το οξειδωτικό στρες, περιλαμβάνοντας προϊόντα που βρίσκονται στις τροποποιημένες λιποπρωτεΐνες, μπορεί να προκαλέσει την τοπική παραγωγή κυτοκινών. Οι κυτοκίνες, στη συνέχεια, επάγουν την αυξημένη έκφραση μορίων προσκόλλησης για τα λευκοκύτταρα προκαλώντας την πρόσδεση των λευκοκυττάρων καθώς και την έκφραση χημειοτακτικών μορίων που κατευθύνουν τη μετανάστευσή τους στον έσω χιτώνα. Υψηλά επίπεδα λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας (LDL) έχουν αθηρογόνο δράση και συνδέονται με κίνδυνο στεφανιαίας νόσου. Η δράση αυτή ασκείται μέσω της οξείδωσης της LDL, η οποία πραγματοποιείται στον έσω χιτώνα του αρτηριακού τοιχώματος. Η oxldl ανευρίσκεται άφθονα στις αθηρωματικές πλάκες. Με την οξείδωση της LDL μεταβάλλεται η σύστασή της και οι φυσικοχημικές της ιδιότητες. Ο σχηματισμός αφρωδών κυττάρων γίνεται μέσω πρόσληψης της oxldl από τους εκκαθαριστικούς υποδοχείς των μακροφάγων. Έτσι, το οξειδωτικό στρες και οι παρακείμενες ελεύθερες ρίζες προάγουν την οξείδωση των LDL και παίζουν καταλυτικό ρόλο στην πρόκληση αθηροσκλήρωσης. Ωστόσο, σε φλεγμονώδεις καταστάσεις, λόγω δυσλειτουργίας του μηχανισμού ρύθμισης των υποδοχέων LDL, είναι δυνατόν να προσλαμβάνονται και οι μη τροποποιημένες LDL από τα μακροφάγα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων (99). 36

38 ΙIΙ. Αντικείμενο και σκοπός Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η τροποποίηση της δομής του κλασσικού μη στεροειδούς αντιφλεγμονώδους φαρμάκου ιβουπροφαίνη, ώστε να ληφθούν ενώσεις, οι οποίες να διατηρούν την ικανοποιητική αντιφλεγμονώδη δράση της και να τη συνδυάζουν με αντιοξειδωτική ικανότητα και μειωμένη γαστρεντερική τοξικότητα. Το κυριότερο πρόβλημα των NSAIDs εκτός από τις ποικίλλες παρενέργειές τους είναι ότι χαρακτηρίζονται από αναλγητική δράση η οποία δεν μπορεί να αυξηθεί περαιτέρω παρά την αύξηση δόσης (φαινόμενο οροφής). Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο, παρόλο που υπάρχουν αρκετά NSAIDs πρέπει να αναπτύσσονται και καινούρια συνεχώς (105). Είναι γνωστό ότι οι δραστικές μορφές οξυγόνου λαμβάνουν ενεργό μέρος σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Έχει βρεθεί ότι αρκετοί αντιοξειδωτικοί παράγοντες κατέχουν αντιφλεγμονώδη δράση (106), καθώς και ότι το οξειδωτικό στρες είναι σημαντικό συστατικό του γαστρεντερικού ερεθισμού που προκαλούν τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Παραδείγματος χάριν, χορήγηση ινδομεθακίνης οδηγεί σε αυξημένη παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου στον γαστρεντερικό βλεννογόνο, που ακολουθείται από δημιουργία γαστρεντερικού έλκους. Έτσι, η ανάπτυξη ενώσεων με συνδυασμό αντιφλεγμονώδους και αντιοξειδωτικής ικανότητας μπορεί να οδηγήσει σε ενώσεις με βελτιωμένες ιδιότητες. Προς το σκοπό αυτό ίσως είναι χρήσιμη προσέγγιση η δομική τροποποίηση γνωστών μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων, ώστε να περιλαμβάνουν και αντιοξειδωτικό τμήμα, υπό την προϋπόθεση ότι οι δομικές αλλαγές δεν επηρεάζουν την αντιφλεγμονώδη δράση. Έχει βρεθεί ότι αμιδικά παράγωγα του μεκλοφαιναμικού οξέος δρουν ως εκλεκτικοί αναστολείς της κυκλοξυγονάσης-2 (107), καθώς και ότι εστέρες της ιβουπροφαίνης και του μεφαιναμικού οξέος είναι αποτελεσματικά αντιφλεγμονώδη μέσα με μειωμένη γαστρεντερική τοξικότητα (108). Φαίνεται, λοιπόν, ότι η καρβοξυλική ομάδα των κλασσικών μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων, μπορεί να μην είναι απαραίτητη για την αντιφλεγμονώδη δράση και κατά συνέπεια αποτελεί κατάλληλη δομική μονάδα για μοριακές τροποποιήσεις. Η αθηροσκλήρυνση είναι χρόνια φλεγμονώδης πάθηση των αρτηριών, που αρχίζει με την οξείδωση της χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (LDL) και καταλήγει στο σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας. Έχει βρεθεί ότι κυκλοξυγονάση και λιποξυγονάση έχουν πρωτεύοντα ρόλο στην αθηροσκλήρυνση, αλλά και αντιστρόφως, ότι η οξειδωμένη LDL προκαλεί αύξηση της παραγωγής ιντερλευκίνης-8 (109, 110) Η βιταμίνη Ε, αλλά και η προβουκόλη μειώνουν την οξείδωση της LDL. Η προβουκόλη ελαττώνει τα επίπεδα χοληστερόλης στο αίμα, επειδή αυξάνει τον καταβολισμό της LDL. Πάντως, η αντι-αθηρωματογόνος δράση της είναι μεγαλύτερη από την ικανότητά της να μειώνει τα επίπεδα χοληστερόλης, και αποδίδεται και στην αντιοξειδωτική της ικανότητα. Άλλα αντιοξειδωτικά, όπως το βουτυλιωμένο 37

39 υδροξυτολουόλιο (ΒΗΤ) και ορισμένα 21-αμινοστεροειδή (λαζαροειδή) έχουν επίσης βρεθεί να δρουν εναντίον της αθηροσκλήρυνσης σε ορισμένα πειραματικά πρότυπα (111). Με βάση τα δεδομένα αυτά, την εργασία αυτή σχεδιάζονται τρεις ομάδες ενώσεων: 1) Εστέρες της ιβουπροφαίνης με κερκετίνη (LD50 p.o., μυς, 160 mg/kg) και με σαλικυλική αλκοόλη (LD50 p.o., μυς, >500 mg/kg). Στις περιπτώσεις αυτές αναμένεται κυρίως η ενισχυμένη αντιοξειδωτική και διαμέσου αυτής την ενίσχυση της αντιφλεγμονώδους δράσης των ενώσεων. 2) Στο εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας έχουμε βρει ότι αμίδια γνωστών μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων με κυστεαμίνη και αιθυλεστέρα κυστεΐνης κατέχουν σημαντική αντιφλεγμονώδη, αντιοξειδωτική και γαστροπροστατευτική δράση (106, 112). Επίσης, παράγωγα του αμιδίου της ιβουπροφαίνης με προλίνη εμφανίζουν ενδιαφέρουσα βιολογική δράση που σχετίζεται με φλεγμονή (113). Στην εργασία αυτή, λοιπόν, συντίθενται αμίδια της ιβουπροφαίνης με προλίνη, κυστεΐνη, αλανίνη και σερίνη, με σκοπό να διερευνηθεί η επίδραση των δομικών αυτών αλλαγών, δηλαδή της αντικατάστασης της θειολικής από αλκοολική ομάδα ή από άτομο υδρογόνου, στη δράση. Επίσης, η καρβοξυλική ομάδα των αμιδίων αυτών εστεροποιείται με σαλικυλική αλκοόλη, επίσης με βενζυλική αλκοόλη, δηλ. με απουσία του φαινολικού υδροξυλίου της πρώτης, και με 4-βουτανοδιόλη, τέλος, αμιδοποιείται με 4-υδροξυβουτυλαμίνη, ώστε να μελετηθεί η δράση σε σχέση με τη δομή. Ο επιτυχής σχεδιασμός ελέγχεται in vitro και in vivo. Ιn vitro, εξετάζεται η επίδραση των ενώσεων στη λιποξυγονάση και στις ισομορφές 1 και 2 της κυκλοξυγονάσης. Επίσης, ελέγχεται η αντιοξειδωτική τους δράση ως ικανότητα αναστολής της υπεροξείδωσης ηπατικών μικροσωμικών μεμβρανών επιμύων. In vivo, εξετάζεται η επίδρασή τους στην οξεία φλεγμονή, η οποία προκαλείται από καρραγεννίνη, καθώς και η δράση τους στα επίπεδα λιπιδίων αίματος υπερχοληστερολαιμικών επιμύων. Σκοπός όλων αυτών των δοκιμασιών είναι η συσχέτιση της δομής με τη δράση και η προσπάθεια εξήγησης της επίδρασης στη δράση των δομικών και φυσικοχημικών χαρακτηριστικών των μορίων. 38

40 ΙV. Πειραματικό μέρος 1. Οργανολογία- υλικά 1.1 Όργανα, αντιδραστήρια στο συνθετικό μέρος Ταυτοποίηση δομής Φάσματα 1 H-NMR: Ελήφθησαν σε όργανο Bruker AC 300 (300ΜΗz, Karlsruhe, Germany). Ως διαλύτες χρησιμοποιήθηκαν CDCl 3, d6-dms, καθώς και CD 3 H. Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε τετραμεθυλοσιλάνιο (TMS). Οι τιμές χημικής μετατόπισης δίνονται σε μονάδες δ (ppm). Φάσματα υπερύθρου (IR): Ελήφθησαν σε φασματοφωτόμετρο απλής δέσμης τύπου Perkin Elmer Spectrum BX. Σε στερεά προϊόντα η λήψη τους έγινε μετά την εναιώρηση τους σε παραφινέλαιο (Nujol). Έλεγχος καθαρότητας Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC): Η καθαρότητα των ενώσεων, καθώς και η πορεία των αντιδράσεων ελέγχθηκε με πλάκες F silica-gel 254 (Merck, Darmstadt, Germany). Σημεία τήξεως (σ.τ.): Προσδιορίστηκαν σε συσκευή υάλινων ανοιχτών τριχοειδών τύπου Mel-TempII, Laboratory Devices, Holliston, MA, USA. Καθαρισμός προϊόντων Χρωματογραφία στήλης Flash: Χρησιμοποιήθηκε silica gel 60 (Merk 40-60μm) Διαλύτες ανακρυστάλλωσης/στήλης: Xρησιμοποιήθηκαν διαλύτες αναλυτικής καθαρότητας, ή της υψηλότερης καθαρότητας που ήταν δυνατόν να βρεθεί στο εμπόριο. 39

41 1.2 Όργανα, υλικά, πειραματόζωα στο βιολογικό μέρος Μετρήσεις απορροφήσεων Απορροφήσεις στο υπεριώδες/ορατό: Οι μετρήσεις που ελήφθησαν για υπολογισμό αναστολής της LX, υπολογισμό της λιπιδικής υπεροξείδωσης, καθώς και υπολογισμό της υπερχοληστερολαιμικής δράσης των ενώσεων, πραγματοποιήθηκαν σε όργανο Perkin Elmer Lambda 20 UV/Vis Spectrometer. Στη δοκιμασία της αναστολής των ενζύμων CX-1 και CX-2 χρησιμοποιήθηκε το όργανο Perkin Elmer Victor X Multilabel Reader για τη μέτρηση των τελικών απορροφήσεων. Χρησιμοποιούμενα μέσα προσδιορισμού δράσεως Αναστολή της κυκλοξυγονάσης: Η ικανότητα των τελικών προϊόντων να αναστέλλουν την CX-1 και CX-2 προσδιορίστηκε με τη χρήση βόειας CX-1 και ανασυνδυασμένης ανθρώπινης CX-2, που περιλαμβάνονται σε εμπορικό kit (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI). Αντιδυσλιπιδαισμική δράση: Η ικανότητα των ενώσεων να αναστέλλουν την υπερλιπιδαιμία, προσδιορίστηκε με εμπορικό kit (Spinreact, SGMItalia). Πρόκληση οιδήματος: Ως φλογιστικό μέσο χρησιμοποιήθηκε η καρραγενίνη τύπου Κ100 και ως πρότυπο σύγκρισης για την αντιφλεγμονώδη δράση χρησιμοποιήθηκε η ιβουπροφαίνη (Sigma Chem. Co. St Louis, Mo, USA). Πειραματόζωα: Για τη μέτρηση της αντιφλεγμονώδους και αντιδυσλιπιδαιμικής δράσης, χρησιμοποιήθηκαν επίμυες Fisher Σύνθεση αρχικών και ενδιάμεσων ενώσεων 2.1 α Σύνθεση μεθυλεστέρων των αμινοξέων (υδροχλωρικό άλας) Σε 0,1 mol του αμινοξέος προστίθεται στάγδην 0,2 mol πρόσφατα απεσταγμένου χλωροτριμεθυλοσιλανίου, ενώ παράλληλα το μίγμα αναδεύεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η αντίδραση ολοκληρώνεται με την προσθήκη 100ml μεθανόλης στο προκύπτον διάλυμα ή εναιώρημα, σε παρόμοιες με τις παραπάνω συνθήκες. Η πορεία της αντίδρασης ελέγχεται με χρωματογραφία λεπτης στιβάδας (TLC). Μετά το πέρας ωρών, ολοκληρώνεται η αντίδραση. Το προϊόν λαμβάνεται με συμπύκνωση υπό ελαττωμένη πίεση, υπό τη μορφή του υδροχλωρικού άλατος (114). 40

42 Μεθυλεστέρας της DL-αλανίνης (υδροχλωρικό άλας) Μ.Β. 139,62 Μ.Τ. C 4 H 10 N 2 Cl Σ.Τ. : C (εμπορίου 157 ο C) Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3473 (-N + H 3 ), 1746 (-C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η- NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 1,42-1,45 (d, J=9 Hz, 3Η, -CH 3 ), 3,73 (s, 3H, -CH 3 ), 3,99-4,06 (q, 1H,-CH-), 8,71 (ευρεία, 3H, N + H 3 -) Απόδοση: 99% Μορφή: Λευκό στερεό Διάρκεια αντίδρασης: 24 ώρες Μεθυλεστέρας της L-προλίνης (υδροχλωρικό άλας) N H CH3 HCl Μ.Β. 165,66 Μ.Τ. C 6 H 12 N 2 Cl Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1 ): 3372 (-N + H 3 ), 1745 (-C-) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η- NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 1,50-1,59 (m, 2Η, πυρολιδίνη), 1,81-2,00 (m, 2Η, πυρολιδίνη), 2,75-2,86 (m, 2Η, πυρολιδίνη), 3,60 (t, 1Η, πυρολιδίνη), 3,65 (s, 1Η, -CH 3 ) Απόδοση: 80% Μορφή: Καφέ έλαιο Διάρκεια αντίδρασης: 12 ώρες 2.1 β Σύνθεση του μεθυλεστέρα της L-προλίνης (υδροχλωρικό άλας) L-προλίνη (11,5g, 0,1 mol) διαλύεται σε 125ml άνυδρης μεθανόλης και ψύχεται στους 0 0 C. Κατόπιν, το διάλυμα οξινίζεται με την προσθήκη μεθανολικού διαλύματος υδροχλωρίου 30%. Το διάλυμα αφήνεται 12 ώρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος υπό ανάδευση. Κατόπιν συμπυκνώνεται υπό ελαττωμένη πίεση και το ελαιώδες υπόλειμμα κατεργάζεται με μεθανόλη. Η διαδικασία κορεσμού με υδροχλωρικό οξύ και συμπύκνωσης επαναλαμβάνεται και το ελαιώδες υπόλειμμα ξηραίνεται (υπεράνω πεντοξειδίου του φωσφόρου και στερεού καυστικού νατρίου) επί 12 ώρες. Το ελαιώδες υπόλειμμα στερεοποιείται και οι κρύσταλλοι εκπλύνονται με ξηρό διαιθυλαιθέρα (115). Απόδοση: 29% 41

43 Προσπάθεια σύνθεσης του μεθυλεστέρα της αλανίνης (υδροχλωρικό άλας) Η σύνθεση του μεθυλεστέρα της DL-αλανίνης (υδροχλωρικού άλατος), δοκιμάστηκε με την ίδια συνθετική μέθοδο. Μετά από 48 ώρες, η αντίδραση δεν είχε προχωρήσει καθόλου. Προφανώς αυτό οφείλεται στην δυσδιαλυτότητα της αλανίνης, που παρέμεινε εν αιωρήσει στην μεθανόλη, ακόμα και μετά από προσθήκη διπλάσιας ποσότητας της τελευταίας, καθώς και αύξηση της θερμοκρασίας της αντίδρασης. Για το λόγο αυτό, εφαρμόστηκε η μέθοδος που χρησιμοποιεί χλωροτριμεθυλοσιλάνιο (υποκεφάλαιο 2.1α, σελ. 37) 3-(3,5-Δισ-tert-βουτυλο-4-υδροξυφαινυλο)ακρυλικός μεθυλεστέρας Ακολουθήθηκε η ίδια πορεία σύνθεσης που περιγράφεται στην παράγραφο 2.1 α. Το τελικό προϊόν της αντίδρασης απομονώνεται με ανακρυστάλλωση (πετρελαϊκός αιθέρας-χλωροφόρμιο). H Μ.Β. 290,40 Μ.Τ. C 18 H 26 3 Σ.Τ. 118 o C Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1 ): 3560 (ph-h), 1697 (-C=0), 1630 (- C=C-) Απόδοση: 70% Μορφή: Λευκό στερεό Διάρκεια αντίδρασης: 24 ώρες. 2.2 Σύνθεση αμιδίων της ιβουπροφαίνης 2.2 α Γενική μέθοδος σύνθεσης αμιδίων Η ιβουπροφαίνη (10mmol) αντιδρά με 1,1 -καρβονυλοδιιμιδαζόλιο (CDI) (10,4mmol) σε ξηρό διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF) (6ml) στους 0 0 C υπό ανάδευση. Μετά την αρχική έντονη έκλυση αερίου C 2, δηλαδή σε χρονικό διάστημα 20-30min από την έναρξη της αντίδρασης, το διάλυμα αφήνεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και συνεχίζεται η ανάδευση μέχρι ολοκλήρωσης σχηματισμού του ενδιαμέσου ιμιδαζοϋλοπαραγώγου της ιβουπροφαίνης. Θεωρητικά το πέρας του πρώτου σταδίου της αντίδρασης σηματοδοτείται από την παύση έκλυσης αερίου. Ωστόσο, εύκολα παρακολουθείται η πορεία της, με ανάπτυξη σε TLC (μίγμα πετρελαϊκού αιθέρα-οξικού αιθυλεστέρα σε αναλογία 3:1), και για την ολοκλήρωσή της απαιτoύνται περίπου 45 min. Ακολουθεί προσθήκη του εστέρα του εκάστοτε αμινοξέος (10,1 mmol) και το 42

44 μίγμα της αντίδρασης αναδεύεται μέχρι 12 ώρες, αναλόγως της διαλυτότητας του αμινοξέος. Το δεύτερο στάδιο ελέγχεται και αυτό με ανάπτυξη σε TLC (σε μίγμα πετρελαϊκού αιθέρα-οξικού αιθυλεστέρα σε αναλογία 3:1). Εφόσον έχει ολοκληρωθεί, ακολουθεί προσθήκη στάγδην νερού (δεκαπλάσια ποσότητα νερού από διμεθυλφορμαμίδιο) και τόση ποσότητα διχλωρομεθανίου, ώστε να μην διαχωρίζεται πλέον ελαιώδες υγρό ή κηρώδες στερεό. Τελικά, το προϊόν παραλαμβάνεται με συνεχείς εκχυλίσεις με διχλωρομεθάνιο. Τα οργανικά εκχυλίσματα ξηραίνονται (Na 2 S 4 ), διηθούνται και συμπυκνώνονται υπό ελαττωμένη πίεση. Το προϊόν καθαρίζεται με χρωματογραφία στήλης flash χρησιμοποιώντας ως διαλύτες έκλουσης μίγμα πετρελαϊκού αιθέρα-οξικού αιθυλεστέρα, σε αναλογία 3:1. 2-(2-(4-Ισοβουτυλο-φαινυλο-προπιονυλαμιδο)-3-μερκαπτοπροπιονικός αιθυλεστέρας, ένωση ICe.e. Μ.Β. 337,48 Η σύνθεση του αμιδίου αυτού έγινε ακολουθώντας τη γενική μέθοδο, από το υδροχλωρικό άλας του αιθυλεστέρα της κυστεΐνης. Μ.Τ. C 18 H 27 N 3 S Σ.Τ. : C Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3326 (-ΝΗ-), 1736 (-C-Et), 1646 (-C-NH-) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,91-0,93 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CH 2 -), 1,21-1,27 (t, J=18 Hz, 3H, -CH 2 CH 3 ), 1,53-1,55 (d, J=6 Hz, 3H, CH 3 -), 1,83-1,92 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 2,46-2,48 (d, J=6 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 3,119-3,125 3,136-3,142 (dd, 2H, -CH 2 SH), 3,59-3,66 (q, J=21 Hz, 1H, -ph-ch(ch 3 )C-), 4,12-4,19 (q, J= 21 Hz, 2H, -CH 2 CH 3 ), 4,74-4,80 (t, J=18 Hz, 1H, NHCH(CH 2 SH)CC 2 H 5 ), 7,118-7,145 7,223-7,250 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 85% Μορφή: Λευκό στερεό κηρώδους σύστασης 2-(2-(4-Ισοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο) προπανοϊκός μεθυλεστέρας, ένωση IAm.e. Μ.Β. 291,39 H σύνθεσή της έγινε ακολουθώντας τη γενική μέθοδο, από το υδροχλωρικό άλας του μεθυλεστέρα της DL-αλανίνης. 43

45 Μ.Τ. C 17 H 25 N 3 Σ.Τ.: C Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3260 (ΝΗ), 1749 (C εστέρα), 1638 (C αμιδίου) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,91-0,93 (d, J=6Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CH-CH 2 ), 1,29-1,32 και 1,36-1,39 (d, J= 9 Hz, 3H, - NHCHCH 3 C-), 1,51-1,52 και 1,53-1,54 (d, J= 3Hz, 3H, -phchch 3 C-), 1,81-1,95 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 2,47-2,49 (d, J=6 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 - ), 3,54-3,61 (q, J= 21 Hz, 1H, -phchch 3 C-), 3,69 και 3,78 (s, 3H, - CCH 3 ), 4,51-4,62 (m, 1H, -NHCHCH 3 C-), 7,12-7,15 και 7,20-7,23 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 95% Μορφή: Λευκό στερεό 1-((4-ισοβουτυλοφαινυλο)προπανοϋλο)πυρολίδινο-2-καβοξυλικός μεθυλεστέρας, ένωση IPe.e. Μ.Β. 317,42 Η σύνθεση αυτής έγινε ακολουθώντας τη γενική μέθοδο, από το υδροχλωρικό άλας του μεθυλεστέρα της προλίνης. Μ.Τ. C 19 H 27 N 3 Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3260 (ΝΗ), 1749 (C εστέρα), 1638 (C αμιδίου) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,88-0,91 (d, J=9 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-), 1,40-1,42 (d, J=6 Hz, 3H, -phchch 3 C-), 1,86-1,88 (m, 3H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-, -NCH 2 CH 2 CH 2 CH-CCH 3 ), 2,00-2,16 (d, J=48 Hz, 2H, -NCH 2 CH 2 CH 2 CH-CCH 3 ), 2,42-2,46 (d, J=12 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-), 3,18-3,26 και 3,44-3,52 (m, m, 1H, 1H, NCH 2 CH 2 CH 2 CH- CCH 3 ), 4,50-4,54 (m, 1H, -NCH 2 CH 2 CH 2 CH-CCH 3 ), 7,08-7,28 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 85% Μορφή: Άχρωμο έλαιο 2.2β Σύνθεση αμιδίων της ιβουπροφαίνης μέσω χλωριδίου Σύνθεση του χλωριδίου της ιβουπροφαίνης Η ιβουπροφαίνη (10mmol) μετατρέπεται στο αντίστοιχο χλωρίδιο, επιδρώντας σε αυτή με θειονυλοχλωρίδιο (12 mmol). Η ιβουπροφαίνη διαλύεται σε ελάχιστη ποσότητα ξηρού διχλωρομεθανίου, το διάλυμα ψύχεται 44

46 στους 0 0 C, και γίνεται στάγδην η προσθήκη του θειονυλοχλωριδίου. Όταν τελειώσει η προσθήκη, αφήνεται το διάλυμα υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για μισή ώρα. Έπειτα η ανάδευση συνεχίζεται υπό βρασμό για 3 ώρες περίπου. Η πορεία της αντίδρασης ελέγχεται με TLC σε μίγμα πετρελαϊκού αιθέρα-οξικού αιθυλεστέρα, 3:1. Μετά το τέλος της αντίδρασης, ο διαλύτης και η περίσσεια θειονυλοχλωριδίου απομακρύνονται με συμπύκνωση υπό ελαττωμένη πίεση. Σύνθεση των αμιδίων της ιβουπροφαίνης με αμινοξέα Το αμινοξύ (46,2mmol) διαλυέται σε υδατικό διάλυμα NaH 2N (26,2ml). Ακολουθεί στάγδην προσθήκη 46,72 mmol χλωριδίου της ιβουπροφαίνης και 12 ml υδατικού διαλύματος NaH 4N ταυτόχρονα στους 0 0 C και υπό συνεχή ανάδευση. Η ανάδευση του μίγματος της αντίδρασης συνεχίζεται στους 0 0 C για ακόμη 20 λεπτά και κατόπιν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για επιπλέον μια ώρα. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης γίνεται πλύση του μίγματος με 30ml οξικό αιθυλεστέρα και οξίνιση της υδατικής στιβάδας σε ph 2 με διάλυμα HCl 1Ν, ώστε να ελευθερωθεί η ένωση ως οξύ, το οποίο παραλαμβάνεται με εκχύλιση με CHCl 3. Η οργανική φάση ξηραίνεται (Na 2 S 4 ) και ο διαλύτης απομακρύνεται με απόσταξη υπό ελαττωμένη πίεση. Το προϊόν τελικά λαμβάνεται με ανακρυστάλλωση από μίγμα διαιθυλαιθέρα και πετρελαϊκού αιθέρα. 2-(2-(4-Ισοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο)προπανοϊκό οξύ, ένωση ΙΑ- ΟΟΗ Μ.Β. 227,36 Μ.Τ. C 17 H 25 N 3 Σ.Τ. : C Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3347 (-C-NH-), 1708 (-C- H), 1649 (-C-NH-) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,91-0,93 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-), 1,33-1,36 και 1,37-1,40 (d, J=9 Hz, 3H, - phchch 3 C-), 1,51-1,54 και 1,53-1,55 (d, J=6 Hz, 3H, - NHCH(CH 3 )CH), 1,81-1,94 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-), 2,47-2,49 (d, J=6 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-), 3,56-3,64 (m, 1H, -NHCHCH 3 CH), 4,48-4,59 (m, 1H, -phchch 3 C-), 6,00 (broad, 1H, NH), 7,12-7,15 και 7,19-7,22 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 90% Μορφή: Λευκό στερεό 45

47 1-(4-Ισοβουτυλοφαινυλο)προπανοϋλο)πυρολιδινη-2-καρβοξυλικό οξύ, ένωση ΙΡΟΟΗ Μ.Β. 303,40 Μ.Τ. C 18 H 25 N 3 Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 1724 (-C-N), 1588 (-C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,91-0,93 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-), 1,46-1,48 (d, J=6 Hz, 3H, -phchch 3 C-), 1,83-1,97 (m, 5H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph- -NCH 2 CH 2 CH 2 CH-CH), 2,45-2,47 (d, J=6 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph), 3,25-3,31 (m, 1H, NCHHCH 2 CH 2 CH-CH), 3,46-3,54 (m, 1H, NCHHCH 2 CH 2 CH-CH), 3,69-3,82 (m, 1H, -phchch 3 C-), 4,11-4,19 (m, 1H, -NCH 2 CH 2 CH 2 CH-CH), 7,10-7,13 και 7,15-7,18 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 70% Μορφή: Λευκό στερεό κηρώδους σύστασης 3-Υδροξυ-2-(2-(4-ισοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο)προπανοϊκό οξύ, ένωση ΙSerΟΟΗ H N CH H Μ.Β. 293,36 Μ.Τ. C 17 H 25 N 4 Σ.Τ. : C Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3389 (-CH 2 H), 1744 (-CNH- ), 1722 (-CH) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,90-0,92 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-), 1,50-1,53 (d, J=9 Hz, 3H, -phchch 3 C-), 1,82-1,91 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-), 2,45-2,47 (d, J=6 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph-), 3,59-3,73 (d, J=12 Hz, 2H, -NHCHCH 2 HCH), 3,98-3,99 (d, J=3 Hz, 1H, -NHCHCH 2 HCH), 4,48-4,55 (m, 1H, -phchch 3 C-), 7,10-7,13 και 7,20-7,22 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 50% Μορφή: Λευκό στερεό 2.3 Υδρόλυση εστέρων Ο εστέρας των παραγώγων της ιβουπροφαίνης (που συντέθηκε με την γενική 46

48 μέθοδο σύνθεσης αμιδίων μέσω CDI, 1.2α) (10mmol) διαλύεται σε διοξάνιο (100ml) και σε 5% υδατικού διαλύματος NaH (100ml). Το διάλυμα αναδεύεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος περίπου για μια ώρα. Η πορεία της αντίδρασης ελέγχεται με ανάπτυξη σε TLC σε μίγμα πετρελαϊκού αιθέραοξικού αιθυλεστέρα σε αναλογία 3:1. Εφόσον έχει ολοκληρωθεί η δημιουργία των μετά νατρίου αλάτων, απομακρύνεται το διοξάνιο υπό ελαττωμένη πίεση, μειώνοντας τον όγκο του διαλύματος στο μισό. Αφού προστεθούν 100ml νερού, το διάλυμα ψύχεται στους 5 0 C. Ακολουθεί οξίνιση με διάλυμα πυκνού υδροχλωρικού οξέος, μέχρι να κατέβει το ph του διαλύματος περίπου στο 1-2. Έπειτα, το προϊόν παραλαμβάνεται με συνεχείς εκχυλίσεις με διχλωρομεθάνιο. Η οργανική στιβάδα εκπλύνεται με κορεσμένο διάλυμα χλωριούχου νατρίου και ακολούθως ξηραίνεται (Na 2 S 4 ), διηθείται και συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού υπό ελαττωμένη πίεση. Με τον παραπάνω τρόπο υδρολύθηκαν οι εστέρες που συντέθηκαν με τη γενική μέθοδο 2.2 α. 2-(2-(4-Ισοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο)-3-μερκαπτοπροπανοϊκό οξύ, ένωση ΙCH Μ.Β. 309,42 Μ.Τ. C 16 H 32 N 3 S Σ.Τ.: 96 0 C Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3326 (-SH), 1731 (-CNH-), 1646 (-CH) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,91-0,93 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CH 2 -), 1,25-1,26 (d, J=3 Hz, 3H, CH 3 -) και 1,27-1,29 (d, J=6 Hz, 3H, CH 3 -, 1,83-1,92 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 2,46-2,48 (d, J=6 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 3,12-3,13 3,13-3,14 (dd, 2H, -CH 2 SH), 3,59-3,66 (q, J=21 Hz, 1H, -ph-ch(ch 3 )C-), 4,74-4,80 (t, J=18 Hz, 1H, NHCH(CH 2 SH)CH), 7,12-7,14 και 7,22-7,25 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 80% Μορφή: Υποκίτρινο στερεό 1-(4-Ισοβουτυλοφαινυλο)προπανοϋλο)πυρολιδινη-2-καρβοξυλικό οξύ, ένωση ΙΡΟΟΗ Μ.Β. 303,40 47

49 Με τη μέθοδο αυτή, η απόδοση είναι περίπου 100%. 2-(2-(4- Ισοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο)προπανοϊκό οξύ, ένωση ΙΑΟΟΗ Μ.Β. 227,36 Με τη μέθοδο αυτή, η απόδοση είναι περίπου 100%. 2.4 Σύνθεση αλκοόλης μέσω αναγωγής εστέρα Σύνθεση της 2,6-δι-tert-βουτυλο-4-(3-υδροξυπρoπ-1-εν-1 υλο) φαινόλης Μ.Β. 262,93 Σε ξηρό THF προστίθεται υπό ανάδευση 1,1 ισοδύναμα LiAlH 4, εφόσον ψυχθεί στους 0-5 ο C. Έπειτα 1 ισοδύναμα εστέρα διαλύεται στον ίδιο διαλύτη, και προστίθεται στάγδην στο εναιώρημα. Ολοκλήρωση της προσθήκης σηματοδοτεί και ολοκλήρωση της αντίδρασης. Ακολουθεί στάγδην προσθήκη οξικού αιθυλεστέρα και στη συνέχεια νερό. Τα σχηματιζόμενα υδροξείδια απομακρύνονται από το μίγμα με διήθηση. Το διήθημα συμπυκνώνεται μέχρι απομάκρυνσης των οργανικών διαλυτών, και εκχυλίζεται με χλωροφόρμιο. Οι οργανικές στιβάδες συνενώνονται και ξηραίνονται με MgS 4, και τελικά ο διαλύτης απομακρύνεται υπό ελαττωμένη πίεη. Το τελικό προϊόν παραλαμβάνεται με χρωματογραφία στήλης flash (μίγμα περελαϊκός αιθέραςχλωροφόρμιο). Μ.Τ. C 17 H 26 2 Φασματοσκοπική ανάλυση IR (cm -1 ): 3638 (ph-h), 3367 (-CH 2 H) Απόδοση: 90% Μορφή: Πορτοκαλί έλαιο Διάρκεια αντίδρασης: 1 ώρα 3. Σύνθεση τελικών προϊόντων 3.1α Γενική μέθοδος εστεροποίησης των καρβοξυλικών οξέων 48

50 Διάλυμα του καρβοξυλικού οξέος, δηλαδή της ιβουπροφαίνης, ή του αντίστοιχου παραγώγου της (ιβουπροφαίνη αμιδοποιημένη με αλανίνη, προλίνη, κυστεΐνη, σερίνη) (1mmol) και του N,N -δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμιδίου (DCC) (1mmol) αναδεύται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος σε ξηρό τετραϋδροφουράνιο (THF). Μετά την πάροδο είτε μιας ώρας (όταν το καρβοξυλικό οξύ είναι η ιβουπροφαίνη), είτε 12 ωρών (όταν το καρβοξυλικό οξύ αποτελεί το αμιδοποιημένο παράγωγο της ιβουπροφαίνης) ο σχηματισμός ενδιαμέσου έχει πραγματοποιηθεί. Αυτό γίνεται εμφανές από την ύπαρξη ιζήματος, της δικυκλοεξυλοουρίας (DCU). Η αντίδραση ελέγχεται με ανάπτυξη σε TLC σε μίγμα πετρελαϊκού αιθέρα: οξικού αιθυλεστέρα. Εφόσον έχει ολοκληρωθεί το πρώτο στάδιο, προστίθεται η αντίστοιχη αλκοόλη διαλυμένη σε ξηρό THF ισομοριακά, και ακολούθως η 4-διμεθυλαμινοπυριδίνη (DMAP) διαλυμένη στον ίδιο διαλύτη, σε αναλογία 0,1 mmol. Το δεύτερο στάδιο της αντίδρασης ολοκληρώνεται μετά το πέρας 24 ωρών. Στην περίπτωση των παραγώγων της ιβουπροφαίνης, το δεύτερο στάδιο επιτυγχάνεται σε περίοδο μεγαλύτερη των 48 ωρών με βρασμό και με χαμηλές αποδόσεις (10%). Όταν η αντίδραση ολοκληρωθεί, γίνεται διήθηση ώστε να απομακρυνθεί η δικυκλοεξυλουρία που έχει σχηματιστεί. Το διήθημα στη συνέχεια εκπλύνεται με CH 3 CH 1% και με απιονισμένο νερό. Ακολουθεί ξήρανση της οργανικής στιβάδας (Να 2 S 4 ), διήθηση, και εκδίωξη του THF με απόσταξη υπό ελαττωμένη πίεση. Για να απομακρυνθεί η DCU που εξακολουθεί να υπάρχει στο υπόλειμμα, το τελευταίο διαλύεται σε οξικό αιθυλεστέρα και φυλάσσεται στους 4 0 C για 24 ώρες. Ακολουθεί διήθηση και εκδίωξη του διαλύτη με απόσταξη υπό ελαττωμένη πίεση. Το τελικό προϊόν απομονώνεται με χρωματογραφία flash, με μίγμα διαλυτών πετρελαϊκού αιθέρα: οξικού αιθυλεστέρα. (45, 116, 117) 2-(4-Ισοβουτυλοφαινυλο)προπανοϊκός 2-υδροξυβενζυλεστέρας, ένωση IS M.B. 312,40 Μ.Τ. C 20 H 24 3 Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3388 (ευρεία του H), 1706 (C εστέρα) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,91-0,93 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2- ), 1,49-1,51 (d, J=6 Hz, 3H, -phchch 3 C-), 1,81-1,96 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ), 2,46-2,48 (d, J=6 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 3,71-3,79 (q, J=24 Hz, 1H, -phchch 3 C-), 5,06-5,09 (d, J= 9Hz, 1H, - 49

51 0CHHph(H)), 5,17-5,20 (d, J= 9Hz, 1H, -0CHHph(H)), 6,85-6,94 (m, 2H, αρωματικά), 7,08-7,28 (m, 6H, αρωματικά) Απόδοση: 68% Μορφή: Κίτρινο έλαιο 2-(2,3-Διυδροξυφαινυλο)-5,6-διυδροξυ-4-οξο-4Η-χρωμεν-7-υλο 2- (4-ισοβουτυλοφαινυλο)προπανοϊκός εστέρας, ένωση IQ Μ.Β. 490,50 Μ.Τ. C 28 H 26 8 Σ.Τ.: C Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3306 (H), 1716 (-C), 1625 (- C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η- NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,86-0,88 (d, J=6 Hz, 6Η, (CH 3 ) 2 CH-), 1,52-1,54 (d, J=6 Hz, 3H, CH 3 CH-), 1,80-1,91 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CH-), 2,44-2,46 (d, J=6 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 4,06-4,10 (q, J=16 Hz, 1H, ph-ch(ch 3 )C-), 6,21 (br, 1H, H), 6,42 (br, 1H, H), 7,06-7,95 (m, 9H, αρωματικά), 12,5 (sh, 1Η, H) Απόδοση: 60% Μορφή: Κίτρινο στερεό 2-(2-(4-Iσοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο)προπανοϊκός 2- υδροξυβενζυλεστέρας, ένωση IAS H N H Μ.Β. 383,48 Μ.Τ. C 23 H 29 N 4 Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3372 (ph-h), 1731 (-CNH-), 1704 (-C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,91-0,93 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 1,23-1,25 (d, J=6 Hz, 3H, NHCHCH 3 C-), 1,49-1,51 (d, J=6Hz, 3H, phchch 3 C-) 1,80-1,91 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 2,45-2,48 (d, J=9 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 3,47-3,54 (q, J=21 Hz, 1H, NHCHCH 3 C- ), 3,72-3,79 (q, J=21 Hz, 1H, phchch 3 C-), 5,06-5,10 (d, J=12 Hz, 1H, - 0CHHph(H)), 5,17-5,21 (d, J=12 Hz, 1H, -0CHHph(H)), 6,86-6,88 και 6,92-6,95 (m, 2H, αρωματικά), 7,08-7,28 (m, 6H, αρωματικά) 50

52 Απόδοση: 20% Μορφή: Κίτρινο έλαιο 2-(2-(4-Ισοβουτυλο)φαινυλο)προπαναμιδο 3-μερκαπτοπροπανοϊκός 2- υδροξυβενζυλικός εστέρας, ένωση ICS H N SH H M.B. 415,55 Μ.Τ. C 23 H 29 N 4 S Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3318 (ph-h), 3283 (-SH), 1731 (-CNH-), 1704 (-C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,90-0,92 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 1,13 (s, 1H, -NHCHCH 2 SH), 1,28 (s, 2H, - NHCHCH 2 SH), 1,48-1,50 (d, J=6 Hz, 3H, -phchch 3 C-), 1,80-1,90 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 2,45-2,48 (d, J=9 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 - ), 3,71-3,79 (q, J=24 Hz,1H, -phchch 3 C), 5,03-5,07 (d, J=12 Hz, 2H, -CHHph(H)), 5,17-5,21 (d, J=12 Hz, 2H, -CHHph(H)), 6,88-6,90 και 6,94-6,96 (m, 2H, αρωματικά), 7,09-7,31 (m, 6H, αρωματικά), 7,70 (sh, 1H, -NH-) Απόδοση: 8% Μορφή: Κίτρινο έλαιο 1-(2-(4-Ισοβουτυλοφαινυλο)προπανοϋλο)πυρολιδινο-2-καρβοξυλικός 2- υδροξυβενζυλεστέρας, ένωση IPS N H Μ.Β. 409,52 Μ.Τ. C 25 H 31 N 4 Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3370 (ph-h), 1730 (-CNH-), 1703 (-C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,91-0,93 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 1,13-1,14 (d, J=3 Hz, 3H, -phch(ch 3 )C-), 1,45-1,51 (m, 3H, (CH 3 ) 2 CH, -NCH 2 CH 2 -), 1,82-1,91 (m, 2H, -NCH 2 CH 2 CH 2 -), 2,46-2,48 (d, J=6 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ), 3,72-3,79 (m, 4H, -phch(ch 3 )C-,- NHCH 2 CH 2 CH 2 -), 5,06-5,21 (m, 3H, -C-CH 2 -ph, -NCH 2 CH 2 CH 2 CH-), 6,92-6,95 (m, 2H, αρωματικά), 7,11-7,29 (m, 6H, αρωματικά) Απόδοση: 9% 51

53 Μορφή: Κίτρινο έλαιο 1-(2-(4-Ισοβουτυλοφαινυλο)προπανοϋλο)πυρολιδινο-2-καρβοξυλικός-4- υδροξυβουτυλεστέρας, ένωση IPes N H Μ.Β. 375, 50 Μ.Τ. C 22 H 33 N 4 Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1 ): 3330 (-H), 1735 (-CNH-), 1693 (- C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 1,89-1,91 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 1,43-1,46 (d, J=9 Hz, 3H, -phch(ch 3 )C-), 1,83-1,97 (m, 5H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -, --CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -), 2,04-2,09 (m, 4H, - NCH 2 CH 2 CH 2 -), 2,43-2,46 (d, J=9 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 3,40-3,55 (q, J=45 Hz, 1H, phch(ch 3 )C-), 3,66-3,80 (m, 3H, -NCH 2 -, -CH 2 -), 4,44-4,56 (m, 1H, -NCH(C)-), 7,06-7,23 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 30% Μορφή: Κίτρινο υγρό 3-(3,5-Δι-tert-βουτυλο-4 υδροξυφαινυλο)αλλυλο2-(4- ισοβουτυλοφαινυλο) προπανοϊκός εστέρας Η σύνθεση έγινε με τη μέθοδο που περιγράφηκε παραπάνω (2.1α). Η μοναδική διαφορά είναι ότι χρησιμοποιήθηκε η πενταπλάσια ποσότητα διμεθυλάμινοπυριδίνης από αυτής παραπάνω μεθόδου. M.B. 450,63 Μ.Τ. C 30 H 42 3 Φασματοσκοπική ανάλυση IR (cm -1 ): 3649 (ph-h), 1735 (-C=0), 1654 (- C=C-) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η- NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,90-0,92 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 1,28 (s, 18H, [(CH 3 ) 3 CH] 2 ph), 1,43-1,46 (d, J=9 Hz, 3H, -phch(ch 3 )C-), 1,80-1,91 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 2,45-2,50 (d, J=15 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 3,40-3,55 (q, J=45 Hz, 1H, phch(ch 3 )C-), 5,44-5,50 (q, J=48 Hz, 2H, --CH 2 CH=CH-), 6,5-6,6 (m, 2H, -CH=CH-), 6,91-7,34 (m, 6H, αρωματικά) Απόδοση: 90% Μορφή: Κίτρινο έλαιο 52

54 Διάρκεια αντίδρασης: 48 ώρες 3.1β Εστεροποίηση καρβοξυλικών οξέων μέσω της μετατροπής τους στο αντίστοιχο χλωρίδιο Οι τελικές ενώσεις IAS, IPS και ICS που συντέθηκαν με την 2.1α μέθοδο, παρουσίασαν πολύ χαμηλή απόδοση, παρά το βρασμό και τον τριπλασιασμό της ποσότητας της 4-διμεθυλαμινοπυριδίνης, καθώς και την αντικατάστασή της από τριαιθυλαμίνη. Έτσι, δοκιμάστηκε η σύνθεσή τους μέσω της μετατροπής των παραγώγων της ιβουπροφαίνης (10mmol) στο αντίστοιχο χλωρίδιο, επιδρώντας με θειονυλοχλωρίδιο (12mmol), κατά τη 1.2β γενική μέθοδο παρασκεύης χλωριδίων. Αρχικά παρασκευάστηκε ο βενζυλο 2-(2-(4-ισοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο) προπιονικός εστέρας, που χρησιμοποιήθηκε για έλεγχο της σύνθεσης για τους υπόλοιπους τρεις (παράγωγα της σαλικυλικής αλκοόλης), καθώς αποτελεί την πιο απλή δομή. 2-(2-(4-Iσοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο)προπιονικός βενζυλεστέρας, ένωση ΙΑb H N Μ.Β. 367,48 Μ.Τ. C 23 H 29 N 3 Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3372 (ph-h), 1731 (-CNH-), 1704 (-C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CDCl 3 ): 0,93-0,95 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 1,25-1,29 (d, J=12 Hz, 3H, ph-ch(ch 3 )C-), 1,86-1,99 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 2,39-2,41 (d, J=6 Hz, 2H, -CH 2 ph-), 2,52-2,54 (d, J=6 Hz, 3H, -NHCH(CH 3 )-), 4,11-4,18 (m, 1H, -phch(ch 3 )-), 5,07-5,12 (q, J=15 Hz, 2H, -CH 2 ph), 7,13-7,66 (m, 9H, αρωματικά) Απόδοση: 40% Μορφή: Κίτρινο έλαιο Πράγματι, οι αποδόσεις των ενώσεων αυξήθηκαν ελαφρώς, όπως φαίνεται παρακάτω: IAS Απόδοση: 15% IPS Απόδοση: 10% ICS Απόδοση: 12% Λόγω των παραπάνω αποδόσεων (που αν και αυξήθηκαν παρέμειναν χαμηλές), έγινε η παρακάτω αλλαγή στη μέθοδο, εφόσον παρασκευάζεται κατά τα γνωστά το χλωρίδιο. 53

55 Σε διάλυμα υπό ανάδευση της 2-υδροξυβενζυλικής αλκόολης (10mmol) σε ξηρό διχλωρομεθάνιο (20ml) προστίθεται στάγδην, αφού το διάλυμα ψυχθεί στους 0 0 C, πυριδίνη (10mmol) και το ακυλοχλωρίδιο υπό ατμόσφαιρα αζώτου. Αφού τελειώσει η προσθήκη, το διάλυμα αφήνεται υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για μια περίπου ώρα και μετά αφήνεται υπό βρασμό για 24 ώρες. Το διάλυμα της αντίδρασης εκπλένεται με κορεσμένο διάλυμα χλωριούχου αμμωνίου (3x20ml) και στη συνέχεια με κορεσμένο διάλυμα θεϊικού χαλκού (3x20ml). Η οργανική στιβάδα ξηραίνεται με θεϊκό μαγνήσιο, διηθείται και συμπυκνώνεται υπό ελαττωμένη πίεση. Το τελικό προϊόν παραλαμβάνεται μετά από χρωματογραφία flash σε μιγμα διαλυτών πετρελαϊκός αιθέρας-οξικός αιθυλεστέρας περίπου σε αναλογία 50:1 (118) Δεν παρουσιάστηκε παρά αμελητέα αύξηση των αποδόσεων. 3.1 γ Εστεροποίηση σε όξινο περιβάλλον Σε διάλυμα υπό ανάδευση της 2-υδροξυβενζυλικής αλκοόλης (0,287mol) και 2-(2-(4-ισοβουτυλφαινυλο)προπαναμιδο)προπανοϊκού οξέος (0,75 mol) σε ξηρό χλωροφόρμιο, γίνεται προσθήκη 1ml πυκνού θειϊκού οξέος. Το διάλυμα θερμαίνεται μέχρι βρασμού για 9 ώρες. Μετά το πέρας της αντίδρασης το διάλυμα πλένεται δύο φορές με νερό. Στη συνέχεια η οργανική στιβάδα πλένεται με κορεσμένο διάλυμα όξινου ανθρακικού νατρίου. Ακολουθεί ξήρανση της οργανικής φάσης με θειϊκό μαγνήσιο, και συμπύκνωση υπό ελαττωμένη πίεση. Το προϊόν καθαρίζεται και συλλέγεται με χρωματογραφία flash (σύστημα έκλουσης μίγμα πετρελαϊκού αιθέρα και οξικού αιθυλεστέρα 5:1) (119). 2-(2-(4-Ισοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο)προπανοϊκός 2- υδροξυβενζυλεστέρας, ένωση IAS H N H Απόδοση : 30% 3.2 Σύνθεση διαμιδικών παραγώγων H σύνθεση των διαμιδικών παραγώγων γίνεται σύμφωνα με τις μεθόδους 2.2α και 2.2β, χωρίς να παρατηρούνται αποκλίσεις στις αποδόσεις τους. Ν-(4-υδροξυβουτυλο)-2-(2-(4-ισοβουτυλοφαινυλο)προπαναμιδο-3- μερκαπτοπροπαναμίδιο, ένωση ICam 54

56 H N NH H HS Μ.Β. 380,54 Μ.Τ. C 20 H 32 N 2 3 S Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3343 (-SH), 3330 (-H), 1735 (-CNH-), 1693 (-C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CD 3 ΟΗ): 0,91-0,93 (d, J=6 Hz, 6Η, (CH 3 ) 2 CH-), 1,18-1,20 (d, J=6 Hz, 3H, -phch(ch 3 )-), 1,42-1,48 (m, 4H, -NHCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -), 1,83-1,84 (m, 1H, (CH 3 ) 2 CH-), 2,44-2,47 (d, J=9 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 2,87-2,95 (d, J=24 Hz, 2H, -CH 2 SH), 3,17-3,19 (m, 2H, -NHCH 2 -), 3,53-3,58 (m, 2H, -NHCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -), 7,11-7,25 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 30% Μορφή: Κίτρινο υγρό Ν-(4-υδροξυβουτυλο)-1-(2-(4- ισοβουτυλφαινυλο)προπανοϋλο)πυρολιδινο-2-καρβοξαμίδιο, ένωση IPam Μ.Β. 374,52 Μ.Τ. C 22 H 34 N 2 3 Φασματοσκοπική ανάλυση IR: (cm -1, Nujol): 3335 (-H), 1755 (-CNH-), 1700 (-C--) Φασματοσκοπική ανάλυση 1 Η-NMR: (δ ppm, CD 3 ΟΗ): 0,89-0,91 (d, J=6 Hz, 6H, (CH 3 ) 2 CH-), 1,30-1,32 (d, J=6 Hz, 3H, -phch(ch 3 )C-), 1,50-1,70 (m, 4H, -NHCH 2 CH 2 CH 2 -), 1,75-1,90 (m, 5H, (CH 3 ) 2 CH-, -NHCH 2 CH 2 CH 2 -), 2,48-2,49 (d, J=3 Hz, 2H, (CH 3 ) 2 CHCH 2 ph), 2,75-2,76 (dd, 2H, -NHCH 2- ), 3,49-3,53 (m, 2H, -NHCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 H), 3,60-3,75 (m, 2H, - NΗCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 H), 3,89-3,91 (m, 1H, -NCH), 4,12-4,17 (q, J=15 Hz, 1H, -phch(ch 3 )), 7,12-7,24 (m, 4H, αρωματικά) Απόδοση: 30% Μορφή: Κίτρινο υγρό 4. Βιολογικό μέρος 4.1 In vitro δοκιμασίες 4.1α Αναστολή της κυκλοοξυγονάσης 1, 2 55

57 Ο προσδιορισμός της ανασταλτικής δράσης των ενώσεων γίνεται σε συγκέντρωση αραχιδονικού οξέος 100μΜ. Οι ενώσεις διαλύονται σε DMS, και βρίσκονται σε τελικές συγκεντρώσεις 200μΜ. Ως πρότυπο σύγκρισης ελέγχου δράσης των ενώσεων χρησιμοποιείται η ναπροξένη και η ιβουπροφαίνη, σε συγκεντρώσεις 200μΜ, διαλυμένες ομοίως σε DMS. Η συγκέντρωση της CX είναι 10-9 IU/ml και για τις δύο ισομορφές. Ο τελικός προσδιορισμός της επί τοις εκατό αναστολής της CX 1/2 γίνεται ύστερα από τον προσδιορισμό της απορρόφησης στα 405nm με χρήση μετρητή ELISA (120, 121). 4.1β Αναστολή της λιποξυγονάσης Ο προσδιορισμός της ανασταλτικής δράσης των ενώσεων γίνεται σε συγκέντρωση λινελαϊκού οξέος 100μΜ. Οι ενώσεις διαλύονται σε 60% EtH, και βρίσκονται σε τελικές συγκεντρώσεις 300μΜ. Οι ενώσεις, μαζί με τη λιποξυγονάση σόγιας (500 u/3ml μίγματος αντίδρασης), καθώς και το ρυθμιστικό διάλυμα Τris/HCl (ph 9,0) επωάζονται για 4 λεπτά στους 28 C. Έπειτα προστίθεται το υπόστρωμα, και σηματοδοτείται η έναρξη της αντίδρασης. Η πορεία της αντίδρασης παρακολουθείται για 7 λεπτά στους 28 C με καταγραφή της απορρόφησης ανά 30 sec σε μήκος κύματος 234nm (122, 123). Για τους δραστικότερους αναστολείς προσδιορίστηκαν οι τιμές μέσης ανασταλτικής συγκέντρωσης (IC 50 ), κάνοντας διαδοχικές αραιώσεις των διαλυμάτων των υπό έλεγχο ουσιών. Τελικά, η IC 50 προέκυψε από την γραφική παράσταση της αναστολής της λιποξυγονάσης σε συνάρτηση με τις συγκεντρώσεις της υπό εξέτασης ένωσης. 4.1γ Λιπιδική υπεροξείδωση Παρασκευάζεται ηπατικό μικροσωμικό κλάσμα από επίμυες που δεν έχουν υποστεί αγωγή, με διαφορική φυγοκέντρηση. Όλες οι ουσίες καθώς και οι διαλύτες που χρησιμοποιούνται ελέγχονται και διαπιστώνεται ότι δεν επιδρούν στην πορεία της δοκιμασίας. Το μίγμα της επώασης αποτελείται από μικροσωμικό κλάσμα, ενζυμικά ανενεργοποιημένο με θέρμανση στους 90 C για 90 sec, που αντιστοιχεί σε 2,5mg ηπατικής πρωτεΐνης ανα ml (τελική συγκέντρωση) ή 4mM υπόλοιπα ακόρεστων λιπαρών οξέων, ασκορβικό οξύ (μετά Κ άλας, 0,2mΜ) σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl/KCl (50mM, 150mM, ph 7,4) και τις προς έλεγχο ενώσεις διαλυμένες DMS σε διάφορες συγκεντρώσεις (5μΜ-1mM). Η αντίδραση υπεροξείδωσης αρχίζει με την προσθήκη πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος FeS 4 (10μΜ) και το μίγμα επωάζεται στους 37 C για 45 λεπτά. Δείγματα λαμβάνονται από το μίγμα επώασης σε 2½, 5, 10, 15, 20, 30, 45 λεπτά και μεταφέρονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες που βρίσκονται σε πάγο και περιέχουν 10:1 μίγμα 2- θειοβαρβιτουρικού οξέος σε τριχλωροξικό οξύ/hcl (29mM/13mM) και 3,5-56

58 δι-t-βουτυλο-4-υδροξυ-τολουόλιο σε απόλυτη αιθανόλη (6,8mM). Ακολουθεί θέρμανση των δειγμάτων στους 80 C για 15 λεπτά και φυγοκέντρηση στις 3000rpm για 15 λεπτά. Η πορεία της λιπιδικής υπεροξείδωσης εκτιμάται με φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό (535/600nm) των προϊόντων της αντίδρασης της λιπιδικής υπεροξείδωσης με το 2-θειοβαρβιτουρικό οξύ (124, 125). 4.2 In vivo δοκιμασίες 4.2α Προσδιορισμός αντιφλεγμονώδους δράσης Η αντιφλεγμονώδης δράση των ενώσεων προσδιορίζεται βάσει της ικανότητάς τους να αναστέλλουν το οίδημα, μετά από χορήγηση 0,1ml υδατικού διαλύματος καραγεννίνης 2%. Το διάλυμα ενίεται ενδοδερμικά στο πέλμα του δεξιού οπίσθιου άκρου επιμυών, ενώ το αριστερό χρησιμεύει ως αναφορά. Χρησιμοποιήθηκαν επίμυες και των δύο φύλων, και διατηρώντας τους υπό νηστεία κατά τη διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας. Η κάθε ένωση που μελετάται χορηγείται αμέσως μετά τη χορήγηση της καρραγενίνης, ενδοπεριτοναϊκά ως υδατικό αιώρημα, στο οποίο έχουν προστεθεί μερικές σταγόνες Tween-80, σε δόση 150 μmol/kg βάρους σώματος. Σε μια ομάδα από πειραματόζωα, που αποτελεί τους μάρτυρες, χορηγείται μονάχα το φλογιστικό μέσο. Τα ζώα θανατώνονται μετά από 3,5 ώρες από τη χορήγηση της καρραγενίνης, αποκόπτονται τα πίσω άκρα από την άρθρωση του γόνατος και προσδιορίζεται η αύξηση του βάρους των άκρων. Γίνεται σύγκριση με τους μάρτυρες και εκφράζεται η αντιφλεγμονώδης δράση ως ποσοστό αναστολής της αύξησης του βάρους στο πέλμα του δεξιού οπίσθιου άκρου των επιμύων, σε σύγκριση με το αριστερό που χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά (CPE%). Ως πρότυπο σύγκρισης για την αντιφλεγμονώδη δράση των ενώσεων χρησιμοποιείται η ιβουπροφαίνη, ένα κλασσικό μη στερεοειδές αντιφλεγμονώδες, της οποίας άλλωστε τα παράγωγα βρίσκονται υπό μελέτη (126). 4.2β Προσδιορισμός αντιδυσλιπιδαιμικής δράσης Η δυσλιπιδαιμία προκαλείται σε αρσενικούς επίμυες με ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση υδατικού διαλύματος τυλοξαπόλης (200mg/kg). Η εξεταζόμενη ουσία χορηγείται ενδοπεριτοναϊκά ως υδατικό αιώρημα (150μmol/kg), μια ώρα μετά τη χορήγηση της τυλοξαπόλης. Περίπου 24 ώρες αργότερα, και αφού οι επίμυς βρίσκονται υπό την αναισθητική δράση εξοβαρβιτάλης συλλέγεται αίμα από την αορτή σε ηπαρινωμένους δοκιμαστικούς σωλήνες. Το αίμα φυγοκεντρείται στις 3000 rpm για 15 λεπτά, και συλλέγεται το πλάσμα. Στο πλάσμα προσδιορίζεται η συγκέντρωση της ολικής χοληστερόλης (ΤC), των τριγλυκεριδίων (TG) και της υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεινης (HDL). H επίδραση της ένωσης ορίζεται η επί τοις εκατό ελάττωση των τιμών αυτών, σε σχέση με τις τιμές των μαρτύρων (127). 57

59 5. Υπολογιστική μελέτη 5.1 Υπολογισμός της λιποφιλικότητας Η λιποφιλικότητα των ενώσεων εκφράζεται ως τιμές ClogP. Υπολογίζονται οι τιμές ΤPSA (Topological Polar Surface Area). Ακόμη ελέγχεται εάν οι ενώσεις πληρούν τα κριτήρια του κανόνα των 5 ώστε να είναι πιθανή η διάβαση βιολογικών μεμβρανών. 5.2 Στατιστική ανάλυση Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή και τυπική απόκλιση. Στατιστικές συγκρίσεις έχουν γίνει με τη μέθοδο Student s t-test και στατιστικά σημαντική διαφορά αναφέρεται ως P< 0, Συντμήσεις ICe.e. IAm.e. IPm.e. ICH IAH 58

60 IPH ISerH H N H CH ICS H N SH H IPS N H IAS H N H IS IQ ICin 59

61 IPes N H IPam ICam H N NH H HS IAb H N V. Αποτελέσματα και συζήτηση Συνθετικό μέρος 1.α Σύνθεση μεθυλεστέρων των αμινοξέων αλανίνης και προλίνης (ως υδροχλωρικά άλατα) Μέθοδος Ι Ο μηχανισμός μετατροπής ενός οξέος στο άλας του αντίστοιχου μεθυλεστέρα, μέσω του τριμεθυλοχλωροσιλανίου παρουσιάζεται στο παρακάτω σχήμα: 60

62 Σχήμα 4: Μηχανισμός σύνθεσης του μεθελεστέρα της αλανίνης (υδροχλωρικού άλατος) Μέσω του ίδιου μηχανισμού συντίθεται και ο αντίστοιχος μεθυλεστέρας της προλίνης. Το ελεύθερο ζεύγος ηλεκτρονίων του οξυγόνου του υδροξυλίου του οξέος, προσβάλλει το ηλεκτρονιόφιλο πυρίτιο του τριμεθυλοχλωροσιλανίου. Το χλώριο, ως καλή αποχωρούσα ομάδα αποσπάται και επακόλουθα σχηματίζεται ο ενδιάμεσος εστέρας τριμεθυλοσιλανίου. Λόγω της περίσσειας διαλύτου (μεθανόλη), αυθόρμητα ο ενδιάμεσος εστέρας μεταπίπτει στον σταθερότερό του μεθυλεστέρα, δημιουργώντας παράλληλα υδροξείδιο του τριμεθυλοσιλανίου. Το ελέυθερο ζεύγος ηλεκτρονίων του αζώτου της αμινοομάδας (πρωτοταγές ή δευτεροταγές άζωτο) προσβάλλει πυρηνόφιλα το πρωτόνιο του ήδη δημιουργηθέντος υδροχλωρίου ενώ παράλληλα το χλώριο αποσπάται για ακόμα μια φορά, ώστε να δημιουργηθεί το υδροχλωρικό άλας. Το εναπομένον οξείδιο του πυριτίου απομακρύνεται πολύ εύκολα από το διάλυμα της αντίδρασης με διήθηση, καθώς είναι δυσδιάλυτο σε νερό. Πλύση του διαλύματος με νέρο αλλά και με NaHC 3 μετατρέπουν το Si 2 σε στερεό ίζημα εύκολα απομακρυνόμενο. Μέθοδος ΙΙ Την εναλλακτική μέθοδος που χρησιμοποιήθηκεαποτέλεσε η εστεροποίηση οξέος σε όξινο περιβάλλον. Ο μηχανισμός της κλασσικής εστεροποίησης φαίνεται παρακάτω στο σχήμα 5. Ο μηχανισμός της όξινης κατάλυσης διενεργείται σε τρία στάδια: 61

63 (1 ο Στάδιο) (2 ο Στάδιο) (3 ο Στάδιο) Σχήμα 5: Μηχανισμός σύνθεσης του μεθυλεστέρα της προλίνης Κατά το πρώτο στάδιο, το οξυγόνο της καρβοξυλικής ομάδας πρωτονιώνεται και το σχηματιζόμενο ιόν σταθεροποιείται μέσω δομών συντονισμού (Σχημα 5, στάδιο 1 0 ). Έτσι ο άνθρακας του ενδιάμεσου μη απομονώσιμου παραγώγου φορτίζεται θετικά και το ελεύθερος ζεύγος ηλεκτρονίων της μεθανόλης τον προσβάλλει πυρηνόφιλα σχηματίζοντας ένα τετραεδρικό ενδιάμεσο (Σχήμα 5, στάδιο 2 0 ). Στη συνέχεια, αυτό, αποβάλλει ένα μόριο νερού μέσω της δομής συντονισμού του (Σχήμα 5, στάδιο 3 0 ), και τελικά μεταπίπτει στον τελικό μεθυλεστέρα. Ας σημειωθεί, ότι λόγω της αποβολής νερού, μετά το πέρας 12 ωρών, το διάλυμα συμπυκνώνεται ώστε να απομακρυνθεί το σχηματιζόμενο νερό, το υπόλειμμα επαναδιαλύεται σε μεθανόλη, και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία. 1.β Σύγκριση μεθόδων Και οι δύο μέθοδοι είναι αρκετά εύκολο να εφαρμοστούν με τις συγκεκριμένες ενώσεις, παρόλο που απαιτούν μεγάλο χρονικό διάστημα (12-24 ώρες). Η ουσιαστική διαφορά τους είναι η πολύ μεγάλη απόκλιση στις αποδόσεις τους. Με την πρώτη μέθοδο λαμβάνεται περίπου 100% απόδοση, και στα δύο 62

64 προϊόντα. Αντίθετα, με την δεύτερη μέθοδο έχουμε 29% απόδοση στην παρασκευή του μεθυλεστέρα της προλίνης και αμελητέα στον αντίστοιχο εστέρα της αλανίνης. Το τελευταίο οφείλεται πιθανότατα στην δυσδιαλυτότητα της αλανίνης στην μεθανόλη. Το πρόβλημα της δυσδιαλυτότητας εμφανίζεται και στην πρώτη μέθοδο Μετά την προσθήκη όμως του τριμεθυλοχλωροσιλανίου, η αλανίνη διαλύεται πλέον εντελώς. Αυτό δεν γίνεται μετά την προσθήκη μεθανολικού διαλύματος 30% ΗCl. Επιπλέον στην πρώτη μέθοδο, για να καταλυθεί πλήρως η αντίδραση, απαιτείται το πέρας τουλάχιστον 24 ωρών. Αυτό συμβαίνει στην περίπτωση της δυσδιάλυτης αλανίνης, ενώ αντίστοιχα όταν το αμινοξύ είναι η προλίνη, η οποία είναι αρκετά ευδιάλυτη απαιτούνται οι μισές ώρες. Παρακάτω στον πίνακα 3 φαίνονται οι διαφορές μεταξύ των διαφορετικών μεθόδων αλλά και των διαφορών μεταξύ των δύο αντιδράσεων. Πίνακας 3: Συγκριτικός πίνακας προϊόντων σε διαφορετικές συνθήκες σύνθεσης Ένωση Τ ( o C) Χρονική διάρκεια(ώρες) Μεθυλεστέρας αλανίνης (Μέθοδος Ι) Μεθυλεστέρας προλίνης (Μέθοδος Ι) Μεθυλεστέρας αλανίνης (Μέθοδος ΙΙ) Μεθυλεστέρας προλίνης (Μέθοδος ΙΙ) Απόδοση % Βρασμός Από τον παραπάνω πίνακα γίνεται φανερό γιατί επιλέχτηκε η μέθοδος Ι. Η ίδια μπορεί να εφαρμοστεί για όλα τα αμινοξέα εκτός της σερίνης, αφού περιέχει αλκοολικό υδροξύλιο και με αυτή τη μέθοδο θα μπορούσε να μετατραπεί σε αιθέρας. Είναι σχετικά γρήγορη, αρκετά εύκολη και πολύ αποτελεσματική. Παρόλο που στη μέθοδο ΙΙ το νερό απομακρύνεται με απόσταξη, και μετά επαναλαμβάνεται η διαδικασία, αυτό δεν είναι αρκετό για να αυξήσει την απόδοση. 2.α Σύνθεση εστέρων της ιβουπροφαίνης Η δομή των τελικών ενώσεων που συντέθηκαν μέσω ενός σταδίου φαίνεται παρακάτω στο Σχήμα 6. 63

65 R H H H H Σχήμα 6: Εστέρες της ιβουπροφαίνης με αντιοξειδωτικά μόρια Μέθοδος Ι Eφαρμόζεται κλασσική μέθοδος εστεροποίησης. Η ιβουπροφαίνη μετατρέπεται στο αντίστοιχο ακυλοχλωρίδιο, μετά την επίδραση θειονυλοχλωριδίου σε 0-5 ο C σύμφωνα με τον παρακάτω μηχανισμό: R: H 3 C CH CH 2 CH CH 3 H 3 C Σχήμα 7: Μηχανισμός σχηματισμού ακυλοχλωριδίου, με θειονυλοχλωρίδιο Ακολουθεί προσθήκη της αντίστοιχης αλκοόλης, και σχηματίζεται ο επιθυμητός εστερικός δεσμός, με ταυτόχρονη παραγωγή ενός μορίου υδροχλωρίου, το οποίο δεσμεύεται από καταλυτική ποσότητα τριαιθυλαμίνης. Σχήμα 8: Σχηματισμός εστέρων, μέσω ακυλοχλωριδίου (R όμοιο σχήματος 6) Μέθοδος ΙΙ Η άλλη μέθοδος που ακολουθήθηκε, για την σύνθεση των ίδιων ενώσεων, είναι η επίσης κλασσική μέθοδος εστεροποίησης με δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο (DCC). Ο μηχανισμός της αντίδρασης φαίνεται παρακάτω στα Σχήματα 9.1 και

66 Η εστεροποίηση των παραπάνω δύο ενώσεων λαμβάνει χώρα παρουσία DCC και διμεθυλαμινοπυριδίνης (DMAP). Η μέθοδος είναι αρκετά εύκολη, καθώς η αντίδραση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος σε σχετικά μικρό χρονικό διάστημα και με μέτριες αποδόσεις. Η δικυκλοεξυλοουρία (DCU) που προκύπτει ως παραπροϊόν από το DCC (128), αποβάλλεται ως άσπρο ίζημα, στο πέρας του πρώτου σταδίου, καθώς είναι δυσδιάλυτη στο τετραϋδροφουράνιο (THF), που χρησιμοποιείται ως διαλύτης. Παράλληλα, όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα 9.1, σχηματίζεται μη απομονώσιμο ενδιάμεσο προϊόν, το οποίο είναι ο ανυδρίτης του αντιδρώντος οξέος. Σχήμα 9.1 : Μηχανισμός εστεροποίησης με DCC, ενδιάμεσο στάδιο 1 Στη συνέχεια ο ανυδρίτης αμιδοποιείται με DMAP με αντίδραση προσθήκηςαπόσπασης. Η αντίδραση αυτή ευνοείται από τον ιδιαίτερο πυρηνόφιλο, λόγω δομών συντονισμού, χαρακτήρα του πυριδινικού αζώτου και από το γεγονός ότι ο υποκαταστάτης RC - του ανυδρίτη αποτελεί καλή αποχωρούσα ομάδα ως ασθενής βάση. A B Σχήμα 9.2 : Μηχανισμός εστεροποίησης με DCC, σχηματισμός τελικού προϊόντος και αναγέννηση καταλύτη Με τον τρόπο αυτό προκύπτει το ιοντικό ζεύγος Α, το οποίο βρίσκεται σε ισορροπία με το ιοντικό ζεύγος Β, που προκύπτει με την προσθήκη της 65

67 αλκόολης RH. Πυρηνόφιλη προσβολή του καρβονυλικού άνθρακα του Β από το R - οδηγεί στο σχηματισμό του επιθυμητού εστέρα RCR και στην αναγέννηση του καταλύτη DMAP, ο οποίος επαναχρησιμοποιείται για την παραγωγή του Α, ενώ το δεύτερο μόριο καρβοξυλικού οξέος που χρησιμοποιήθηκε για το σχηματισμό του ανυδρίτη αντιδρά πάλι με το DCC. 2.β Σύγκριση μεθόδων Ι και ΙΙ Οι παραπάνω δύο μέθοδοι που περιγράφηκαν, διαφέρουν ως προς: τη διάρκεια ολοκλήρωσης της αντίδρασης την παραλαβή ενδιάμεσων προϊόντων τον τελικό καθαρισμό, και την απόδοση Όπως είναι αναμενόμενο, οι αντιδράσεις μέσω σχηματισμού των ενδιάμεσων ακυλοχλωριδίων είναι ταχείες. Συγκεκριμένα, το ενδιάμεσο χλωρίδιο σχηματίζεται σε λιγότερο από τρεις ώρες, ενώ το επόμενο στάδιο αντίδρασης με την αλκοόλη ολοκληρώνεται σε περίπου δύο ώρες. Αντίθετα, η μέθοδος ΙΙ απαιτεί μια ώρα για το σχηματισμό του ενδιαμέσου, ενώ για τον σχηματισμό του τελικού εστέρα χρειάζονται σχεδόν 24 ώρες. Αν και η μέθοδος ΙΙ είναι σαφώς λιγότερο ταχεία, υπερτερεί στο ότι μπορεί να ελεγχεί με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας ο σχηματισμός ενδιαμέσου. Και στις δύο περιπτώσεις το τελικό προϊόν παραλαμβάνεται μετά από καθαρισμό με χρωματογραφία στήλης flash. Επιπλέον, ο καθαρισμός είναι αρκετά εύκολος και γρήγορος, καθώς η δημιουργία παραπροϊόντων είναι περιορισμένη. Τέλος, η απόδοσή τους διαφέρει σημαντικά. Η αντίδραση μέσω ακυλοχλωριδίου δίνει αποδόσεις >80%, ενώ η αντίδραση μέσω σχηματισμού του ενδιάμεσου ανυδρίτη δίνει περίπου 49% στην περίπτωση σχηματισμού εστέρα της σαλικυλικής αλκοόλης, και 60% στην περίπτωση σχηματισμού εστέρα με την κερκετίνη. 2.γ Ταυτοποίηση των εστέρων της ιβουπροφαίνης Ταυτοποίηση των εστέρων της ιβουπροφαίνης (Σχήμα 6) πραγματοποιήθηκε φασματοσκοπικά (IR, 1 H-NMR) και με στοιχειακή ανάλυση. Στη φασματοσκοπική εξέταση των ενώσεων με IR παρατηρήθηκαν χαρακτηριστικές απορροφήσεις στην περιοχή cm -1 για την καρβονυλική ομάδα (C=) του εστέρα, που δικαιολογείται λόγω της ύπαρξης συζυγίας στο μόριο, και στην περιοχή cm -1 για την υδροξυλομάδα (ΟΗ). Η τελευταία παρουσιάζεται ως χαρακτηριστική ευρεία κορυφή. Το φάσμα 1 H-NMR της ένωσης ταυτοποιεί αρχικά την ύπαρξη ιβουπροφαίνης 66

68 (0,86-0,88 (6Η, d, (CH 3 ) 2 CH-), 1,52-1,54 (3H, d, CH 3 CH-), 1,80-1,91 (1H, m, (CH 3 ) 2 CH-), 2,44-2,46 (2H, d, (CH 3 ) 2 CHCH 2 -), 4,06-4,10 (1H, q, ph- CH(CH 3 )C-)) και την ύπαρξη του υπολοίπου αρωματικού τμήματος. 3.α Σύνθεση διαμιδικών παραγώγων της ιβουπροφαίνης Η δομή των διαμιδικών παραγώγων της ιβουπροφαίνης που συντέθηκαν ως τελικά προϊόντα φαίνονται παρακάτω στο Σχήμα 10. HN NH H IAam NH CH 2 H NH H ISam CH 2 N C NH IPam H Σχήμα 10: Δομή των διαμιδικών παραγώγων της ιβουπροφαίνης Όπως φαίνεται, η δομή τους περιλαμβάνει όπως και προηγουμένως την αμιδοποίηση της ιβουπροφαίνης με αμινοξύ, ενώ σε δεύτερο στάδιο το συντεθέν παράγωγο αμιδοποιείται με την αμινοβουτανόλη. Στο Σχήμα 11 παρουσιάζεται η πορεία της αντίδρασης Σχήμα 11: Αντίδραση σχηματισμού αμιδίων, μέσω σχηματισμού ενδιαμέσου ιμιδαζολοπαραγώγου Παρακάτω (Σχήμα 12) φαίνεται ο αντίστοιχος μηχανισμός. Μέθοδος Ι 67

69 R C N N C N N R C C N N H N NH R C N NH 2 R 1 -C 2 R NHR 1 N NH N NH N R: CH 2 H NH NH 2 R 1 : H 2 N H Σχήμα 12: Μηχανισμός αμιδοποίησης με CDI Για την αμιδοποίηση χρησιμοποιείται το καρβονυλοδιιμιδαζόλιο (CDI). Το αντιδραστήριο αυτό, όπως και το DCC, έχει το πλεονέκτημα να χρησιμοποιείται σε σχετικά ήπιες συνθήκες. Έχει μάλιστα και το πρόσθετο πλεονέκτημα να μην απαιτεί την προσθήκη βάσης, π.χ. τριαιθυλαμίνης, διότι, κατά την αντίδραση, το ελευθερούμενο ιμιδαζόλιο χρησιμεύει για την ελευθέρωση της βάσης από το αντίστοιχο υδροχλωρικό άλας, όταν η αμίνη που αντιδρά με το οξύ βρίσκεται υπό μορφή υδροχλωρικού άλατος. Έτσι, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί απευθείας και άλας των αμινών προς αμιδοποίηση (129). Μάλιστα, στην περίπτωση αμινοξέος στη θέση της αμίνης, ο συγκεκριμένος μηχανισμός απαιτεί την ύπαρξη υδροχλωρικού άλατος (ενώσεις ICe.e., IAm.e., IPm.e.). Μια πιθανή εξήγηση είναι η αύξηση της διαλυτότητας των αμινοξέων, καθώς στην ελεύθερη μορφή τους είναι εξαιρετικά δυσδιάλυτα στους κοινούς διαλύτες σχηματίζοντας εσωτερικά άλατα. Κατά την αντίδραση αμιδοποίησης με CDI έχουμε ενεργοποίηση του οξέος με τον ενδιάμεσο σχηματισμό αρχικά μικτού ανυδρίτη, όπως φαίνεται στο Σχήμα 12. Ο μικτός ανυδρίτης σχηματίζεται κατά τη διάρκεια του πρώτου σταδίου, όπου στη διαλυμένη ιβουπροφαίνη προστίθεται CDI. Τότε έχουμε προσβολή του άνθρακα του καρβονυλίου του CDI από το οξυγόνο του οξέος. Το καρβοξυλικό ιόν που σχηματίζεται αποβάλλει ένα μόριο ιμιδαζολίου ώστε να δώσει το ενδιάμεσο καρβοϊμιδαζόλιο. Κατά τη διάρκεια του πρώτου σταδίου διατηρούνται άνυδρες συνθήκες (αφού αποσκοπεί στη δημιουργία ανυδρίτη). Επιπλέον, καλό είναι η προσθήκη του αντιδραστηρίου να πραγματοποιείται σε C, καθώς έχουμε έντονη έκλυση διοξειδίου του άνθρακα. 68

70 Κατά το επόμενο στάδιο γίνεται η προσθήκη του δεύτερου αντιδραστηρίου. Το ελεύθερο ζεύγος ηλεκτρονίων της αμινοομάδας προσβάλλει το καβονυλικό άτομο άνθρακα του μη απομονώσιμου ενδιαμέσου, που σχηματίστηκε κατά την ολοκλήρωση του πρώτου σταδίου. Εξαιτίας της πυρηνόφιλης προσβολής, έχουμε ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό του επιθυμητού προϊόντος (του αμιδίου) και ιμιδαζολίου. Το τελικό προϊόν παράγεται σε ικανοποιητικές αποδόσεις (60%), και παραλαμβάνεται με καθαρισμό με χρωματογραφία στήλης flash. Το ιμιδαζόλιο που τυχόν παρέμεινε, απομακρύνεται πολύ εύκολα με πλύση με υδατικό διάλυμα 10% HCl. Μέθοδος ΙΙ Όπως και στην σύνθεση των εστέρων, δοκιμάστηκε εναλλακτικά η μέθοδος της εστεροποίησης με θειονυλοχλωρίδιο. Ο μηχανισμός της αντίδρασης φαίνεται στο σχήμα 7, σελ β Σύγκριση των μεθόδων Ι και ΙΙ Οι παραπάνω δύο μέθοδοι που περιγράφηκαν, διαφέρουν ως προς: τη διάρκεια ολοκλήρωσης της αντίδρασης την απομόνωση ενδιάμεσων προϊόντων τον τελικό καθαρισμό, και την απόδοση Οι αντιδράσεις αμιδοποίησης μέσω χλωριδίου περιγράφονται βιβλιογραφικά ως ταχείες και αποτελεσματικές. Αντίθετα στην παρούσα εργασία παρατηρήθηκαν καλύτερες αποδόσεις δια μέσου μετατροπής της ιβουπροφαίνης στο αντίστοιχο ιμιδαζολοπαράγωγο. Η διάρκεια ολοκλήρωσης της αντίδρασης με καταλύτη CDI κυμαίνεται από 12 μέχρι 24 ώρες, ενώ δια μέσου μετατροπής του οξέος στο αντίστοιχο χλωρίδιο, 4 ώρες περίπου. Είναι προφανές ότι η ταχύτητα των αντιδράσεων διαφέρει σημαντικά, χωρίς να αποτελεί όμως καθοριστικό παράγοντα επιλογής μεθόδου. Και στις δύο αντιδράσεις το τελικό προϊόν σχηματίζεται μέσω ενός ενδιάμεσου σταδίου. Το σχηματιζόμενο χλωρίδιο, αφού απομακρυνθεί ο διαλύτης, χρησιμοποιείται ως έχει στην επόμενη αντίδραση. Την αντίδραση δυσχεραίνει το γεγονός ότι δεν υπάρχει η δυνατότητα ελέγχου καθαρότητας του παραγόμενου χλωριδίου, καθώς ο έλεγχός της με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) καθίσταται αδύνατος, διότι το χλωρίδιο διασπάται κατά τη διαδικασία. Αντίθετα, το ιμιδαζολοπαράγωγο είναι μη απομονώσιμο, και η αντίδραση συνεχίζεται με την προσθήκη της αμίνης. Επιπλέον, το ενδιάμεσο 69

71 σχηματίζεται ποσοτικά και επιβεβαιώνεται με έλεγχο με TLC. Η παραλαβή του τελικού προϊόντος επιτυγχάνεται και στις δύο περιπτώσεις με χρωματογραφία στήλης flash. Ο καθαρισμός είναι δύσκολος, καθώς το προϊόν σε μικρές συγκεντρώσεις δεν εμφανίζεται με έκθεση του χρωματογραφήματος στο υπεριώδες φως και για την εμφάνισή του πρέπει να χρησιμοποιηθεί διάλυμα βανιλλίνης. Επίσης, το προϊόν αργεί να εκλουστεί από τη στήλη, πιθανόν επειδή προσκολλάται στη silica. Στη μέθοδο ΙΙ, η απομόνωση καθίσταται πιο δύσκολη καθώς τα σχηματιζόμενα παραπροϊόντα είναι περισσότερα. Συμπερασματικά, αν και η απόδοσή τους κυμαίνεται περίπου στο ίδιο ποσοστό (~30%), προτιμάται η μέθοδος Ι, η οποία, αν και είναι πιο χρονοβόρα, είναι πιο απλή και απαιτεί ηπιότερες συνθήκες. 4. Αναγωγή εστέρα με LiAlH 4 Το νουκλεόφιλο υδρογόνο του υδριδίου κάνει πυρηνόφιλη προσθήηκη στον ηλεκτρονιόφιλο άνθρακα του καρβονυλίου του εστέρα. Τα ηλεκτρόνια του διπλού δεσμού του καρβονυλίου μετακινούνται προς το οξυγόνο, επιτρέποντας έτσι το σχηματισμό ενός τετραεδρικού μεταλλικού αλκοξειδικού ενδιάμεσου. Σχήμα 12: Αναγωγή εστέρα προς αλκόολη Το ενδιάμεσο σύμπλοκο διαλύεται, διώχνοντας την αλκοoλική ομάδα του εστέρα ως αλκοξείδιο (R 2 - ), και σχηματίζοντας τελικά μια ενδιάμεση αλδεΰδη. Το επόμενο βήμα αποτελεί η αναγωγή της αλδεΰδης. Το νουκλεόφιλο υδρογόνο του υδριδίου προσβάλει τον πυρηνόφιλο άνθρακα του καρβονυλίου της αλδεΰδης. Σχηματίζεται και πάλι ένα σύμπλοκο, το οποίο όμως και διασπάται με πρωτονίωσή του και τελικά συντίθεται μια πρωτοταγή αλκόολη. 5. Υδρόλυση εστέρα Η υδρόλυση αποτελεί την αντίστροφη διαδικασία της εστεροποίησης. Αρχικά, το υδροξύλιο της βάσης κάνει πυρηνόφιλη προσβολή στον ηλεκτρονιόφιλο 70

72 άνθρακα του καρβονυλικού δεσμού. Ο π- δεσμός διασπάται, δημιουργώντας ένα τετραεδρικό ενδιάμεσο. Σχήμα 13: Υδρόλυση εστέρα παρουσία βάσης- Δημιουργία αντίστοιχου άλατος Το ενδιάμεσο διαλύεται, ο καρβονυλικός δεσμός επαναδημιουργείται και αποβάλεται ένα αλκοξείδιο. Το σχηματιζόμενο οξύ δεν σταθεροποιείται και γρήγορα γίνεται μια αντίδραση οξέος/ βάσης. Μια πολύ γρήγορη ισορροπία όπου το αλκοξείδιο λειτουργεί ως βάση και αποπρωτονιώνει το οξύ. Με προσθήκη οξέος, το άλας διασπάται και επανασχηματίζεται το οξύ και ένα σταθερότερο άλας (NaCl). 6. Αποκλίσεις φασμάτων από τα αναμενόμενα Σε κάποια 1 H-NMR φάσματα από τις συντεθιμένες ενώσεις παρατηρήθηκαν συγκεκριμένες παρεκκλίσεις από το προβλεπόμενο, οι οποίες όμως μπορούν να ερμηνευτούν. Συγκεκριμένα οι πιθανές αιτιολογίες είναι είτε η ύπαρξη διαστερεομέρειας, είτε η ιδιάζουσα χημική τους δομή (αμιδικός δεσμός). 6.1 Εμφάνιση διαστερεομέρειας Διαστερεομέρεια εμφανίζεται σε μόρια με δύο ή περισσότερα ασύμμετρα άτομα άνθρακα. Τα διαστερεομερή έχουν παρόμοιες χημικές αλλά διαφορετικές φυσικές ιδιότητες. Στην εργασία αυτή η ιβουπροφαίνη καθώς και τα αμινοξέα που χρησιμοποιήθηκαν εμφανίζουν ασύμμετρα άτομα άνθρακα. Αρχικά χρησιμοποιήθηκε το ρακεμικό μίγμα της ιβουπροφαίνης. Κατά την αμίδοποίηση αυτής με την L-προλίνη ((S)-πυρρολιδινο-2-καρβοξυλικό οξύ) απομονώθηκε ένα προϊόν όπως φαίνεται από τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας και το φάσμα ΝΜR. Η αντίδραση επανελήφθη χρησιμοποιώντας την (S)-(+)- ιβουπροφαίνη. Το προϊόν που λαμβάνεται ταυτίζεται με το 71

73 προηγούμενο. Φαίνεται ότι κατά την επεξεργασία απομονώνεται το ένα από τα δύο ισομερή (SS). Ανάλογη παρατήρηση αναφέρεται και στην βιβλιογραφία (113). Στο φάσμα 1 Η-ΝΜR του αμιδίου της (S)-ιβουπροφαίνης με την αλανίνη (ρακεμικό μίγμα) φάνηκαν κορυφές που αποδεικνύουν την ύπαρξη μίγματος διαστερεομερών. Συγκεκριμένα σε δ 1,33-1,40 εμφανίζεται ζεύγος διπλών κορυφών και αποδίδεται στην ομάδα α-ch 3 του τμήματος της ιβουπροφαίνης, δηλαδή: 1,33-1,36 και 1,37-1,40 (d, 3H, -phchch 3 C-). Ανάλογο φαινόμενο παρατηρήθηκε και σε δ 1,51-1,55, και οι κορυφές αποδίδονται στη μεθυλική ομάδα του τμήματος της αλανίνης: 1,51-1,54 και 1,53-1,55 (d, 3H, - NHCH(CH 3 )CH) (Εικόνα 8). Εικόνα 8: Ολοκλήρωση των κορυφών του φάσματος 1 Η-ΝΜR της ΙAH Παρόμοιο φαινόμενο συναντάται στον αντίστοιχο μεθυλέστερα. Παρατηρείται πάλι ο διπλάσιος αριθμός κορυφών στα πρωτόνια που βρίσκονται πλησίον των ασύμμετρων ατόμων άνθρακα. Συγκεκριμένα σε δ: 1,29-1,32 και 1,36-1,39 (d, 3H, d, -NHCHCH 3 C-), καθώς επίσης 1,51-1,52 και 1,53-1,54 (3H, d, - phchch 3 C-). Παράλληλα, αντί για μια απλή κορυφή του μεθυλίου του εστέρα, εμφανίζονται δύο που αντιστοιχούν σε τρία πρωτόνια: 3,69 και 3,78 (3H, s, -CCH 3 ). Το φάσμα παρακάτω επιβεβαιώνει την απόδοση των κορυφών: 72

74 Εικόνα 9: Ολοκλήρωση των κορυφών του φάσματος 1 Η-ΝΜR της ΙAme Στο αμίδιο ιβουπροφαίνης (ρακεμικό μίγμα) με την L-κυστεΐνη ((R)-2-αμινο- 3-μερκαπτοπροπανοϊκό οξύ) εμφανίζεται ο διπλάσιος αριθμός κορυφών που αντιστοιχούν στα πρωτόνιa μεθυλικής ομάδας που βρίσκονται σε α-θέση του τμήματος της ιβουπροφαίνης. Συγκεκριμένα εμφανίζονται: 1,25-1,26 και 1,27-1,29 (3H, d, CH 3 -). 73

75 Στην περίπτωση του αμιδίου της ιβουπροφαίνης (ρακεμικό μίγμα) με τον μεθυλεστέρα της L-αλανίνης ((S)-2-αμινοπροπανοϊκός μεθυλεστέρας) κατέστη δυνατός ο διαχωρισμός των διαστερεομερών με χρωματογραφία στήλης flash. Στα φάσματα NMR των δύο αυτών ενώσεων δεν παρατηρήθηκαν διαφορές. 6.2 Διαφορές στη διαμόρφωση Η αμιδική ομάδα εμφανίζει συντονισμό, επομένως μπορεί να υπάρχουνε δύο διαμορφομερή, το cis και το trans. Στις προαναφερθείσες ενώσεις οι διπλάσιες κορυφές μπορεί να οφείλονται στην ύπαρξη διαμορφομερών, στα οποία τα πρωτόνια βρίσκονται σε διαφορετικό χημικό περιβάλλον. 7. Σύνθεση δευτερεύοντων προϊόντων Κατά την εστεροποίηση των αμιδίων της ιβουπροφαίνης με σαλικυλική αλκοόλη χρησιμοποιώντας DCC ή μέσω του χλωριδίου ελήφθησαν δύο προϊόντα τα οποία διαχωρίστηκαν. Η μελέτη των φασμάτων NMR υποδεικνύει ότι έγινε εστεροποίηση τόσο στο αλκοολικό, όσο και στο φαινολικό υδροξύλιο αυτής, σε μικρό ποσοστό. Κατά την εστεροποίηση του αμιδίου της ιβουπροφαίνης με αλανίνη σε όξινο περιβάλλον, ελήφθη μόνο ο εστέρας στο αλκοολικό υδροξύλιο της σαλικυλικής αλκοόλης, όπως ήταν αναμενόμενο. Σχήμα 14: Προϊόντα εστεροποίησης Βιολογικό μέρος 1 In vitro μελέτη της βιολογικής δράσης 1.a Εκτίμηση της δράσης επί της κυκλοξυγονάσης Οι κυκλοξυγονάσες (CX) είναι ένζυμα με βασικό ρόλο στο μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος, οδηγώντας στη σύνθεση των προσταγλανδινών, ουσιών που εμπλέκονται ενεργά στη διαδικασία της φλεγμονής. Οι κυκλοξυγονάσες έχουν δύο δράσεις: α) δράση ενδοϋπεροξειδικής συνθετάσης, που οξυγονώνει και κυκλοποιεί το υπόστρωμα, ώστε να σχηματιστεί το κυκλικό ενδοϋπεροξείδιο PGG και β) δράση υπεροξειδάσης, που μετατρέπει το PGG σε 74

76 PGH. Για τον έλεγχο της ανασταλτικής δράσης των τελικών προϊόντων επί του ενζύμου κυκλοξυγονάση 1 και 2, χρησιμοποιήθηκαν η πρόβεια CX-1 και η ανθρώπινη ανασυνδυασμένη CX-2. Η μέθοδος στηρίζεται στον ανοσοενζυμικό προσδιορισμό της PGF 2a. H αρχή της μεθόδου βασίζεται στην δράση της κυκλοξυγονάσης επί του υποστρώματος, δηλαδή του αραχιδονικού οξέος. Από την δράση της παράγεται η προσταγλανδίνη PGH 2. Έπειτα, μετά την αναγωγή της με SnCl 2, παράγεται η υπό προσδιορισμό PGF 2a (σελ. 17, σχήμα 1). Οι συντεθιμένες ενώσεις εξετάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν την κυκλοξυγονάση 1 και 2. Στόχος ήταν να συντεθούν ενώσεις οι οποίες να διατηρούν τη δράση της ιβουπροφαίνης, και εάν είναι δυνατό, να την βελτιώνουν. Στον παρακάτω σχήμα φαίνεται η δομή των ενώσεων των οποίων έγινε εκτίμηση της ανασταλτικής ικανότητας. IS IQ ICS N H IAS IPS N IPes H IPam Σχήμα 15: Δομή των ενώσεων που εξετάστηκαν ως προς την ανασταλτική τους δράση επί των ισοενζύμων της κυκλοξυγονάσης Στον Πίνακα 4 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα επί της CX-1. Σχεδόν όλες εμφανίζουν ικανοποιητική δράση επί του ισοενζύμου (σε συγκεντρώσεις 200μΜ), αν και μόνο μια υπερβαίνει τη δράση της μητρικής ένωσης (Ibu). Για 75

77 συγκριτικούς λόγους δίνεται και η ανασταλτική δράση της ιβουπροφαίνης, που αποτελεί την ένωση αναφοράς. Πίνακας 4: Επί τοις εκατό ανασταλτική δράση των ενώσεων επί της CX-1 Ένωσεις % Ανασταλτική δράση επί της CX-I Ibu 68 IQ 20 IAS 54 ICS 62 IPS 63 IS 69 Συγκεκριμένα, η IQ παρουσιάζει την πιο μικρή ανασταλτική ικανότητα από όλες. Αντίθετα η IS που εμφανίζει την βέλτιστη δράση από την ομάδα των ενώσεων που εξετάστηκαν, παρουσιάζεται ισοδύναμη προς την ιβουπροφαίνη. Σε σχέση με τις φυσικοχημικές ιδιότητες, όλες οι ενώσεις έχουν παρόμοια λιποφιλικότητα, διαφέρουν όμως στην TPSA (πίνακας 8, σελ. 87). Φαίνεται ότι η αναστολή της CX-1 βαίνει παράλληλα προς τη μείωση της πολικής επιφάνειας των μορίων. Από τα παραπάνω αποτελέσματα συνάγονται δύο συμπεράσματα, αναφορικά με την ικανότητα των μορίων να αναστέλουν την CX-1: Ευνοούνται τα μόρια με μικρότερο όγκο Η ύπαρξη πολικής ομάδας μειώνει την αλληλεπίδραση των μορίων με το ένζυμο Στον Πίνακα 5 παρουσιάζεται η ανασταλτική δράση των ίδιων ενώσεων επί του άλλου ισοενζύμου της κυκλοξυγονάσης (σε συγκεντρώσεις 200μΜ), καθώς και της ιβουπροφαίνης. Ο βασικός στόχος ήταν να επιτευχθεί σημαντική αναστολή επί της CX-2, η οποία και αποτελεί το επαγόμενο κατά την φλεγμονή ένζυμο και άρα το πλέον υπεύθυνο για τις φλεγμονώδεις δράσεις της. Πίνακας 5: Ανασταλτική δράση των ενώσεων επί της κυκλοξυγονάσης 2 Ένωσεις % Ανασταλτική δράση επί της CX-2 Ibu 46 IQ 49 IAS 73 ICS 42 IPS 86 76

78 IS 62 IPes 0 IPam 14 Εκτός από την ICS που εμφανίζει την μικρότερη ανασταλτική ικανότητα, όλες οι υπόλοιπες υπερτερούν της ιβουπροφαίνης. Η IPS παρουσιάζει όχι μόνο την καλύτερη ανασταλτική ικανότητα από όλες αλλά και παράλληλα η αναστολή της φτάνει τα 86%. Έτσι, εξετάστηκαν και άλλες δύο ενώσεις παρόμοιας δομής με την IPS. Ουσιαστικά, αλλάζει μέρος του μορίου, όπου αντί για το αρωματικό τμήμα υπάρχει ένα αλειφατικό παρόμοιας λιποφιλικότητας (4 άτομα άνθρακα). Στη μια περίπτωση, συντέθηκε ο εστέρας, και στην άλλη το αμίδιο. Από 86% της ΙPS η δράση του αντίστοιχου εστέρα μηδενίστηκε, ενώ του αμιδίου μειώθηκε στα 14%. Έτσι εξάγεται το συμπέρασμα ότι η ύπαρξη δεύτερου αρωματικού μέρους πιθανόν είναι χρήσιμο χαρακτηριστικό για την ανασταλτική ικανότητα των μορίων. Από τις IAS, IPS και ICS, η τελευταία παρουσιάζει την μικρότερη δράση, και μάλιστα αρκετά χαμηλότερη από τις άλλες. Αφού η βασική τους διαφορά έγκειται στην ύπαρξη σουλφυδρυλομάδας, η ύπαρξή της μειώνει την αλληλεπίδραση του μορίου με το ένζυμο, πιθανόν επηρεάζοντας τη λιποφιλικότητα. Η IQ εμφανίζει διπλάσια αναστολή της CX-2 από την CX-1. Φαίνεται ότι η CX-2 ανέχεται μεγαλύτερη ποικιλία στον όγκο του μορίου απ όσο η CX-1. Από τη δράση των ενώσεων IPam και IPes φαίνεται ότι η αντικατάσταση της εστερικής από αμιδική ομάδα αυξάνει την δράση του μορίου. Οι πρωτεΐνες των δύο ισομορφών της CX διαφέρουν λίγο μεταξύ τους (130). Παρ όλα αυτά, η CX-2 διαθέτει μεγαλύτερη περιοχή σύνδεσης από την CX-1. Έτσι, έχει βρεθεί ότι δομικές τροποποίησεις της ινδομεθακίνης που οδηγούν σε ογκωδέστερα μόρια αυξάνουν την εκλεκτικότητα αυτών έναντι της CX-2 (131, 132). Μια τάση προς επιβεβαίωση αυτών διαφαίνεται και με τις εξεταζόμενες ενώσεις. Φαίνεται ότι κατέχουν μικρότερη ή ίση ικανότητα αναστολής της CX-1, σε σχέση με την ιβουπροφαίνη, και μεγαλύτερη ή ίση ικανότητα αναστολής της CX-2. H κρυσταλλική δομή της CX-2 (133) μοιάζει πολύ με αυτή της CX-1, αλλά οι θέσεις δέσμευσης του αραχιδονικού οξέος σ αυτά τα ένζυμα είναι ελαφρά διαφορετικές (εικόνα 10). 77

79 Εικόνα 10: Η ενεργός περιοχή της CX-2 είναι μεγαλύτερη της CX-1 Ο συνολικός όγκος της κοιλότητας της CX-2 είναι μεγαλύτερος αυτής της CX-1. Επιπλέον, η κοιλότητα της CX-2 επεκτείνεται με την αντικατάσταση δύο μορίων ισολευκίνης της CX-1 με δύο μόρια βαλίνης στην CX-2. Η βαλίνη 523 επιτρέπει καλύτερη πρόσβαση στην κοιλότητα αυτή και η βαλίνη 434 επιτρέπει στη φαινυλανίνη 518 να μεταβάλλει τη μορφή της, παράγοντας επιπλέον χώρο στην κορυφή της κοιλότητας. Η αργινίνη 513 στην CX-2, η οποία αντικαθιστά την ιστιδίνη 513 στην CX-1, επιτρέπει επιπλέον αλληλεπιδράσεις στην κοιλότητα (εικόνα 11). Οι εκλεκτικοί αναστολείς της CX-2, συνήθως είναι μεγαλύτερα μόρια από τους συνήθεις μη εκλεκτικούς αναστολείς. Ως εκ τούτου, προσαρμόζονται ευκολότερα στη μεγαλύτερη ενεργό περιοχή της CΧ-2, σε σύγκριση με την CX-1. 78

80 Εικόνα 11: Διαφορές αμινοξέων μεταξύ CX-1 και CX-2. Οι γραμμοσκιασμένες περιοχές της εικόνας 16 στην CX-1 είναι περισσότερο προσβάσιμες στην CX-2 λόγω αντικατάστασης των αμινοξέων, με αποτέλεσμα τη δημιουργία περισσότερου χώρου και την ευκολότερη πρόσβαση. 1.β Εκτίμηση της δράσης επί της λιποξυγονάσης Οι λιποξυγονάσες (LX) είναι κυτοσολικά ένζυμα, στο ενεργό κεντρο των οποίων υπάρχει σίδηρος, όχι με τη μορφή αίμης. Ο σίδηρος μπορεί να βρίσκεται σε δύο οξειδωτικές καταστάσεις, είτε στην Fe 3+, οπότε το ένζυμο είναι ενεργοποιημένο, είτε στην Fe 2+, που ονομάζεται σιωπηλή κατάσταση και το ένζυμο είναι ανενεργό (134). Απαντώνται τόσο στα φυτά όσο και στα ζώα, και καταλύουν την είσοδο και των 2 ατόμων του μοριακού οξυγόνου σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα στη δομή των οποίων υπάρχει το 1,4- πενταδιενικό σύστημα. Έτσι τα μετατρέπουν σε υδροϋπεροξυ-λιπαρά οξέα που περιέχουν ένα συζευγμένο διένιο. Οι λιποξυγονάσες των θηλαστικών κατατάσσονται σε 5-, 8-, 12-, και 15-LX, ανάλογα με τη θέση διοξυγόνωσης του αραχιδονικού οξέος. Η 5-LX είναι σημαντικό ένζυμο στη βιοσύνθεση των λευκοτριενίων. Αν και υπάρχουν αρκετές υποθέσεις σχετικά με τη βιολογική σημασία των υπόλοιπων ισομορφών, ο ρόλος τους δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος. Θεωρείται ότι στα φυτά συμμετέχουν στη βιοσύνθεση ορμονών και άλλων μορίων μεταφοράς μηνυμάτων. Στα φυτά το αραχιδονικό οξύ δεν είναι το κύριο πολυακόρεστο λιπαρό οξύ, καθώς ως υπόστρωμα των λιποξυγονασών των φυτών θεωρείται κατ'εξοχήν το λινελαϊκό οξύ. Πάντως 79

81 οι λιποξυγονάσες δεν είναι απόλυτα εξειδικευμένες, και η θέση διοξυγόνωσης εξαρτάται από τη δομή του υποστρώματος και τις συνθήκες της αντίδρασης. Έχει βρεθεί ότι η 15-LX των θηλαστικών καταλύει in vivo υπεροξείδωση και στη θέση 5 (135). Το κύριο προϊόν της υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος από τη λιποξυγονάση σόγιας είναι το 13(S)-υδροϋπεροξείδιο. In vitro, σε αλκαλικό ph, λιποξυγονάση σόγιας καταλύει αποκλειστικά το σχηματισμό (n-6)- υδροϋπεροξειδίων των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Το αραχιδονικό οξύ μετατρέπεται κυρίως σε 15-υδροϋπεροξυ-εικοσιτετρενοϊκό οξύ, αν και έχει αναφερθεί σχηματισμός του 5-υδροϋπεροξυ-παραγώγου του. Σχήμα 16: Σχηματισμός του 13-υδροϋπεροξυπαραγώγου του λινελαϊκού οξέος με τη δράση της 13-λιποξυγονάσης Με τη δράση της λιποξυγονάσης, η απόσπαση του δισαλλυλικού υδρογόνου καταλήγει στο σχηματισμό λιπιδικής αλκυλο-ρίζας (L ). Μέρος από τις σχηματιζόμενες αλκυλο- ρίζες διαφεύγει από το ενζυμικό αυτό σύστημα και μπορεί να αντιδράσει με το Ο 2 προς λιποϋπεροξυ-ρίζες (L ). Επιπλέον, η γλουταθειόνη, παρουσία πολυακόρεστου λιπαρού οξέος, οξειδώνεται με τη δράση της λιποξυγονάσης. Έτσι, θεωρείται ότι η δραστηριότητα της λιποξυγονάσης συνεισφέρει σημαντικά στη γένεση κυτταρικού οξειδωτικού στρες. Για να διερευνήσουμε το μηχανισμό της αντιφλεγμονώδους δράσης των ενώσεων, εξετάσαμε την επίδρασή τους στη λιποξυγονάση σόγιας, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα λινελαϊκό νάτριο, in vitro, σε ph 9. Το 13- υδροϋπεροξυ-παράγωγο που προκύπτει περιέχει σύστημα συζευγμένου διενίου που απορροφά σε λ 234nm. Η λιποξυγονάση σόγιας αναστέλλεται από τα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα κατά τρόπο ανάλογο προς αυτόν της αναστολής της λιποξυγονάσης των σιτευτικών κυττάρων επιμύων, έτσι το ένζυμο αυτό χρησιμοποιείται ως αξιόπιστο μέσο για έλεγχο αναστολέων λιποξυγονάσης. Γνωστοί αναστολείς της 5-LX είναι το νορ-διυδρογουαϊαρετικό οξύ [4,4'-(2,3- διμεθυλοτετραμεθυλενο)διπυροκατεχόλη] και το zileuton. Το δεύτερο κυκλοφορεί από το 1996 για την συντηρητική θεραπεία του άσθματος, με την εμπορική ονομασία ZYFL (136). Γενικά, οι αναστολείς της λιποξυγονάσης δρουν μέσω της σύνδεσης με τον 80

82 σίδηρο του ενζύμου (137). ι Walther et al. (138) απέδειξαν ότι η φαρμακοκινητική και το είδος (ανταγωνιστική ή μη ανταγωνιστική) της αναστολής εξαρτάται από την οξειδωτική κατάσταση στην οποία βρίσκεται ο σίδηρος. Όταν λοιπόν, συνδέεται ο αναστολέας με το σίδηρο του ενζύμου το οποίο βρίσκεται στην σιωπηλή κατάσταση, τότε η αναστολή είναι μη αντιστρεπτή. Αντίθετα αν βρίσκεται στην κατάσταση Fe 3+, ο αναστολέας μπορεί να εκδιωχθεί παρουσία λιπαρών οξέων (138). Δοκιμάσαμε την ανασταλτική δράση των ενώσεων που συντέθηκαν. Μόνο η IQ βρέθηκε να έχει ανασταλτική δράση επί της λιποξυγονάσης. Κρίνοντας από την δομή τους αλλά και από τα αποτελέσματα της λιπιδικής υπεροξείδωσης, η IQ έχει την πιο ισχυρή αντιοξειδωτική δράση. Η πορεία της οξείδωσης του λινελαϊκού οξέος με την αντίδραση που καταλύεται από τη λιποξυγονάση σε συνάρτηση με το χρόνο, αλλά και η επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων της IQ φαίνεται στο σχήμα 17. Σχήμα 17: Μεταβολή της δρασης της λιποξυγονάσης από διαφορετικές συγκεντρώσεις της IQ, σε συνάρτηση με το χρόνο Η αντίστοιχη μέση ανασταλτική συγκέντρωση (IC 50 ) της ιβουπροφαίνης έχει βρεθεί (139) 200μΜ, συγκέντρωση αρκετά υψηλή. Το συγκεκριμένο παράγωγο, η IQ, εμφανίζει δεκαπλάσια ανασταλτική ικανότητα σε σύγκριση με το μητρικό. Αυτό αποδίδεται στην προσθήκη του αντιοξειδωτικού τμήματος. Η κερκετίνη μόνη της αποτελεί έναν πάρα πολύ καλό αναστολέα της LX (140) αφού προκαλεί 50% αναστολή σε συγκέντρωση μόλις 1μΜ. Έτσι, η IQ, ενώ εμφανίζει μικρή δράση επί της CX-1 και μέτρια αναστολή της CX-2, φαίνεται ότι κατέχει αντιφλεγμονώδεις ικανότητες, μέσω της πολύ καλής αναστολής της LX. Θα μπορούσε ίσως να θεωρηθεί ότι δεν θα παρουσιάζει τις ανεπιθύμητες ενέργειες που παρουσιάζουν οι γνωστοί αναστολείς των ισοενζύμων της κυκλοξυγονάσης, 81

83 εφόσον σταματά τη φλεγμονώδη απόκριση μέσω του μονοπατιού της LX. Οι ενώσεις IS, IPS, IAS και ICS δεν εμφάνισαν καθόλου ανασταλτική δράση επί της λιποξυγονάσης, σε συγκέντρωση 100μΜ και δεν κρίθηκε σκόπιμη η εκτίμηση δράσης σε μεγαλύτερη συγκέντρωση. Παρατηρήθηκε ότι δράση επί της LX εμφάνισε μόνο μια τελική ένωση, η IQ, η οποία όμως έχει τη μεγαλύτερη ικανότητα αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης. Καθώς η LX καταλύει σχηματισμό υπεροξειδίων, συνάγεται ότι πιθανόν οι δύο ανασταλτικές διαδικασίες να συνδέονται μέσω της ικανότητας της ένωσης να διακόπτει αλυσιδωτές αντιδράσεις ελευθέρων ριζών. Το παραπάνω συμπέρασμα ενισχύεται από τα αποτελέσματα της ενδιάμεσης συντεθιμένης ένωσης ICe.e., η οποία παρουσιάζει σημαντική αντιοξειδωτική ικανότητα, και πολύ καλή ανασταλτική δράση επί της LX. Για τα παράγωγα πυροκατεχόλης, αρχικά είχε προταθεί η σύνδεσή τους με το σίδηρο του ενζύμου, αποτρέποντας έτσι την αναγωγή του στον καταλυτικό κύκλο του ενζύμου. Οι Spaapen et al. το 1980 έθεσαν την παραπάνω πρόταση μελετώντας την πορεία της αναστολή της λιποξυγονάσης της σόγιας από την 4-νιτροκατεχόλη(141). Από την δεύτερη παρατήρηση ότι η αλληλεπίδραση του αναστολέα με το Fe 3+ δεν αποτρέπει την αναστολή του ενζύμου, εξάγεται το συμπέρασμα ότι δεν γίνεται άμεση αλληλεπίδραση με τον σίδηρο. Συγκεκριμένα οι Skrzypczak-Jankun et al. (137), μέσω της ανάλυσης με ακτίνες X επιβεβαίωσαν την σύνδεση της 4-νιτροκατεχόλης με το ένζυμο, όχι όμως χηλικά με το σίδηρο, αλλά σε περιοχή πλησίον του σιδήρου. Μια τρίτη δράση των πυροκατεχολικών ενώσεων αποτελεί η αναγωγή των υπεροξειδίων, που είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση του ενζύμου αφού μετατρέπουν το ενεργό σίδηρο στην σιωπηλή του μορφή. Σύμφωνα με τους Mahesha et al. (142) η αναστολή της LX από ενώσεις με δομή ισοφλαβονών γίνεται με τον παρακάτω μηχανισμό: ένα ηλεκτρόνιο προσφέρεται από την ισοφλαβόνη στον Fe 3+ της λιποξυγονάσης, και έτσι ανάγεται στην σιωπηλή μορφή (Fe 2+ ), αναστέλλοντας το ένζυμο. Παράλληλα η κερκετίνη βρέθηκε ότι αποκοδομείται από το ένζυμο (143), διαδικασία που είναι πιθανό να συμβαίνει και στην IQ. Παρακάτω φαίνεται η αποκοδόμηση που θεωρείται ότι υφίσταται η κερκετίνη: H H H H LX H H H CH Σχήμα 18: Αποικοδόμηση της κερκετίνης από την λιποξυγονάση προς πρωτοκατεχικό οξύ (3,4 διϋδροξυβενζοϊκό οξύ) 82

84 Η αποικοδόμηση της κερκετίνης προς πρωτοκατεχικό οξύ κοντά στο σίδηρο του ενζύμου επιβεβαιώθηκε με ανάλυση με ακτίνες Χ (143). Η αλληλεπίδραση της κερκετίνης με τη LX είναι πολύπλοκος μηχανισμός που δεν περιορίζεται στην εμπλοκή της πρόσβασης στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Δρώντας ως υπόστρωμα αλλά και ως αναστολέας παίζει διττό ρόλο (144). Αυτό μπορεί να εξηγηθεί διότι αποτελεί ένα πολυλειτουργικό υπόστρωμα που μπορεί να ενεργοποιηθεί αλλά και αποικοδομηθεί μέσω διαφορετικών οδών (144). Η ερώτηση που προκύπτει είναι εάν τον πραγματικό αναστολέα αποτελεί η ίδια η ένωση ή ο μεταβολίτης της μέσω της αλληλεπίδρασης με την λιποξυγονάση (137). 1.γ Εκτίμηση της επίδρασης των ενώσεων επί της λιπιδικής υπεροξείδωσης Είναι γνωστό ότι οξειδωτικό stress και ενεργές μορφές οξυγόνου εμπλέκονται στη διαδικασία της φλεγμονής. Η ρίζα ανιόντος υπεροξειδίου (Ο 2 -. ), για παράδειγμα, προκαλεί αλλοιώσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων και αυξάνει την αγγειακή διαπερατότητα. Το οξειδωτικό στρες συντελεί ακόμα στο σχηματισμό χημειοτακτικών παραγόντων, στη συσσώρευση ουδετερόφιλων στη φλεγμαίνουσα περιοχή, στη λιπιδική υπεροξείδωση και στην καταστροφή του DNA. Επιπλέον, κατά την καταλυτική δράση της CX σχηματίζονται ελεύθερες ρίζες ως ενδιάμεσα προϊόντα, και για αυτό το λόγο ενώσεις με ικανότητα δέσμευσης των ελευθέρων ριζών αναμένεται να παρεμβαίνουν τόσο στη δράση του ενζύμου, όσο και στην όλη διαδικασία της φλεγμονής. Μελετάται η ικανότητα των ενώσεων IQ, IS, ICe.e, ICS και IAS, προσδιορίζοντας την αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης που επάγεται από το σύστημα FeII/ασκορβικό οξύ. Ως πηγή λιπιδίων χρησιμοποιούνται ηπατικές μικροσωμικές μεμβράνες επιμύων, που έχουν αδρανοποιηθεί ενζυμικά με θέρμανση. Έχει δειχθεί ότι τα λιπίδια των μικροσωμικών μεμβρανών, τα οποία είναι πλούσια σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, αποτελούν καλό υπόστρωμα για αντιδράσεις λιπιδικής υπεροξείδωσης. διαλύτης (DMS) έχει ελεγχθεί και βρέθηκε ότι δεν επηρεάζει τη δοκιμασία. Η έκταση της υπεροξείδωσης αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου και η λαμβανόμενη αναστολή της εξαρτάται από τη συγκέντρωση των εξεταζόμενων ουσιών. Μεταξύ των τελικών προϊόντων της λιπιδικής υπεροξείδωσης είναι η μηλονική διαλδεΰδη. Η μηλονική διαλδεΰδη, καθώς και άλλες αλδεΰδες, δίνει έγχρωμο προϊόν αντιδρώντας με το 2-θειοβαρβιτουρικό οξύ (2-ΤΒΑ), το οποίο απορροφά σε λ 535nm. Η αντίδραση αυτή χρησιμοποιείται για εκτίμηση της λιπιδικής υπεροξείδωσης. 83

85 Σχήμα 19: Αντίδραση χρωματομετρικής ανίχνευσης της μηλονικής διαλδεϋδης CH αραχιδονικό οξύ απόσπαση Η. H. H 2 Fe H + Fe 3+ + H CH λιπιδική αλκυλο-ρίζα ενδομοριακή ανακατανομή (ισομερίωση). 2 CH λιπιδική υπεροξειδκή ρίζα H λιπιδικό υδροϋπεροξείδιο CH 12 ρίζα κυκλικού υπεροξειδίου (ενδοϋπεροξειδίου). 8 CH ισομερίωση. R RH CH 2 CH ρίζα κυκλικού ενδοϋπεροξειδίου 9 11 H CH Fe 2+ Fe CH + H - 2 υδρόλυση ή θέρμανση Αλκενυλο-ρίζα + H H + Λιπο-αλδεϋδη Υδρογονάνθρακας Μηλονική διαλδεϋδη Σχήμα 20: Οδός σχηματισμού της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) από πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFAs). Έχουν προταθεί διάφορα μονοπάτια σχηματισμού της MDA, αλλά το πιθανότερο είναι να σχηματίζεται από 84

86 μονοκυκλικά υπεροξείδια τα οποία έχουν σχηματιστεί από λιπαρά οξέα με 3 ή περισσότερους διπλούς δεσμούς (145). Η πορεία της λιπιδικής υπεροξείδωσης, όπως επηρεάζεται από τις εξεταζόμενες ενώσεις, σε συνάρτηση με τον χρόνο δίνεται στα παρακάτω σχήματα: Σχήμα 21: Πορεία λιπιδικής υπεροξείδωσης, όπως επηρεάζεται από διάφορες συγκεντρώσεις της IQ. 1,4 IC50=185μΜ 1, μΜ 0,8 0,6 0,4 0, μΜ Σχήμα 22: Πορεία λιπιδικής υπεροξείδωσης όπως επηρεάζεται από τις διάφορες συγκεντρώσεις της IS Μεταξύ αυτών των δύο ενώσεων παρατηρείται μεγάλη διαφορά στην αντιοξειδωτική δράση. Η δομική ομάδα που τους προσδίδει την αντιοξειδωτική δράση θεωρείται ότι είναι και στις δύο περιπτώσεις το φαινολικό υδροξύλιο. Η IS έχει ένα, ενώ η IQ τέσσερα, μάλιστα τα δύο από αυτά είναι σε ορθο-θέση. Δομικά λοιπόν, είναι αναμενόμενο ότι η τελευταία θα παρουσιάζει μεγαλύτερη 85

87 αντιοξειδωτική ικανότητα (συγκεκριμένα 11,6 φορές μεγαλύτερη). Παρατηρώντας την πορεία της αντίδρασης της λιπιδικής υπεροξείδωσης διαπιστώνεται, και για τις δύο ενώσεις, IQ και ΙS, εμφάνιση λανθάνουσας περιόδου κατά τα πρώτα 20 λεπτά της επώασης, η οποία ακολουθείται από σχετικά απότομη αύξηση της απορρόφησης. Καμπύλη αυτής της μορφής είναι χαρακτηριστική για τις αντιοξειδωτικές ενώσεις οι οποίες δρουν διακόπτοντας την αλυσιδωτή αντίδραση της λιπιδικής υπεροξείδωσης. Η παρατήρηση αυτή αποτελεί επί πλέον επιβεβαίωση του προτεινόμενου μηχανισμού δράσης των εξεταζομένων ενώσεων, ο οποίος περιλαμβάνει την οξείδωση του φαινολικού ή κατεχολικού συστήματος προς σχετικά σταθερές ρίζες. Με τον τρόπο αυτό διακόπτουν τη συνεχιζόμενη απόσπαση αλλυλικού ατόμου υδρογόνου από τα λιπίδια, προστατεύοντας αυτά από υπεροξείδωση (146). Φυσικά, η αντιοξειδωτική δράση είναι συνάρτηση της δομής, αλλά και της διάταξης του μορίου στο χώρο, της λιποφιλικότητας και της πολικής επιφάνειας αυτού. Έτσι, όταν το ίδιο πείραμα έγινε για την IAS, η οποία έχει ένα φαινολικό υδροξύλιο όπως η IS, τα αποτελέσματα που ελήφθησαν έδειξαν διαφορετική εικόνα. Σε συγκέντρωση 100μΜ η IAS παρουσιάζει περίπου την υποδιπλάσια δράση της IS καθόλη τη διάρκεια της επώασης. Στα 300μΜ η IAS αναστέλλει την αντίδραση υπεροξείδωσης κατά 20%, ενώ η IS κατά 100%. Το 50% της ανασταλτικής δράσης της πρώτης είναι περίπου 400μΜ, συγκέντρωση διπλάσια από αυτή της IS. Μεγάλη διαφορά επίσης παρατηρείται, αν η αλανίνη της IAS αντικατασταθεί από κυστεΐνη (ICS). Σε συγκέντρωση 300μΜ, η ICS εμφανίζει το μέγιστο της αντιοξειδωτικής της ικανότητας, 100%, ενώ η άλλη μόνο 20% αναστολή. Στα 200μΜ συνεχίζει να διατηρεί το 100% της αντιοξειδωτικής της ικανότητας, ενώ η IAS μόλις το 13%. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν αναμενόμενα, λόγω της ισχυρής αντιοξειδωτικής δράσης της σουλφυδρυλομάδας. Η ICe.e. περιέχει μόνο μια αντιοξειδωτική ομάδα, την θειολική, και εμφανίζει IC 50 =38μΜ, δράση περίπου 5 φορές μεγαλύτερη από την IS που έχει ένα το φαινολικό υδροξύλιο, και την ICS που έχει και σουλφυδρυλομάδα και φαινολικό υδροξύλιο. Η ΙQ παρουσιάζει την καλύτερη αντιοξειδωτική δράση ως παράγωγο του φλαβονοειδούς κερκετίνη. Σχήμα 23: Βασική δομή των φλαβανοειδών Οι Bors et al. (147) ήταν οι πρώτοι που παρατήρησαν τρία δομικά στοιχεία 86

88 που συμβάλλουν στην πολύ καλή αντιοξειδωτική δράση ενώσεων που φέρουν τον πυρήνα των φλαβανοειδών: μια διϋδροξυ υποκατάσταση στον δακτύλιο Β (δομή κατεχόλης) λόγω της καλής ηλεκτρονιακής κατανομής αποτελεί τον στόχο των ριζών, και έπειτα η δομή σταθεροποιείται ως φαινοξυ ρίζα ένας 2,3-διπλός δεσμός, μια 4-οξο υποκατάσταση και υδροξύλια στη θέση 3- και 5- είναι απαραίτητα για την περαιτέρω αύξηση της δράσης. 2. In vivo μελέτη της βιολογικής δράσης 2.α Προσδιορισμός αντιφλεγμονώδους δράσης Για τη μελέτη εμφάνισης πιθανούς αντιφλεγμονώδους δράσης χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο φλεγμονής το οίδημα (148) που προκαλείται στο πέλμα του δεξιού οπίσθιου άκρου επιμύων από ενδοδερμική χορήγηση καρραγενίνης. Η καρραγενίνη είναι πολυσακχαρίτης του φύκους Chondrus crispus και αναφέρονται πέντε μορφές της (149) (κ, λ, μ, ν και ι). Στην εργασία αυτή Εικόνα 12: Δομή καραγεννίνης χρησιμοποιήθηκε μίγμα των πέντε μορφών της. Το οίδημα που προκαλείται από την καρραγενίνη είναι μη ειδική φλεγμονή, αποτέλεσμα διαφορετικών μεταβιβαστών και μοιάζει με την ανθρώπινη οξεία φλεγμονή (150). Το οίδημα αυτού του τύπου είναι πολύ ευαίσθητο στα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα και για το λόγο αυτό η καρραγενίνη θεωρείται χρήσιμο μέσο για την αρχική μελέτη και διερεύνηση νέων αντιφλεγμονωδών ενώσεων. Το οίδημα από καραγεννίνη χαρακτηρίζεται ως διφασικό. Κατά την πρώτη φάση, η ανάπτυξη του οιδήματος οφείλεται στην απελευθέρωση ισταμίνης και σεροτονίνης και διαρκεί 0,5-1,5 ώρα μετά τη χορήγηση του φλογιστικού. Η δεύτερη φάση (3-6 ώρες) χαρακτηρίζεται από τη συμμετοχή των προσταγλανδινών. Στη φάση αυτή λαμβάνει χώρα η μετανάστευση των λευκοκυττάρων (πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα), καθώς και η απελευθέρωση των λυσοσωμικών ενζύμων ( ). Η φλογιστική δράση της καρραγενίνης οφείλεται στο γεγονός ότι ως πολυσακχαρίτης έχει την ικανότητα να διεγείρει το σύστημα του συμπληρώματος, που προκαλεί απελευθέρωση της ισταμίνης, η οποία με τη σειρά της επάγει την ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης Α 2 και την απελευθέρωση του αραχιδονικού οξέος Εικόνα 13: Chondrus Chrispus 87

89 με τελικό αποτέλεσμα την παραγωγή των προσταγλανδινών (156). Η επίδραση όλων των ενώσεων στην ενδοπελμική φλεγμονή παρουσιάζεται ως επι τοις εκατό (%) ελάττωση του οιδήματος που προκαλείται από χορήγηση υδατικού διαλύματος 2% καραγεννίνης. Το οίδημα εκφράζεται ως η επι τοις εκατό αύξηση βάρους του δεξιού άκρου ποδιού επιμύων συγκρινόμενο με το αριστερό, στο οποίο δεν ενέθηκε καραγεννίνη. Η κάθε εξεταζόμενη ουσία χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά αμέσως μετά τη χορήγηση του φλογιστικού ως αιώρημα σε νερό και σε δόση 150μmol/kg βάρους σώματος. Στο σχήμα 23 παρατίθενται οι δομές των ενώσεων που προσδιορίστηκε πειραματικά η αναστολή % του οιδήματος, και στον πίνακα 7, τα ποσοτικά αποτελέσματα. Σχήμα 23: Δομή ενώσεων που εξετάσθηκαν για in vivo αντιφλεγμονώδους δράσης τους Πίνακας 7: Αναστολή του οιδήματος(%) μετά την πρόκληση φλεγμονής από καραγεννίνη, και χορήγηση των παραπάνω ενώσεων Ενώσεις % αναστολή του οιδήματος IS 59 IQ 61 IAm.e. 14 ICe.e. 53 IPm.e. 20 IAS 47,5 Ibu 71 Καμιά από τις εξεταζόμενες ενώσεις δεν κατάφερε να υπερβεί την αναστολή που προκαλεί η ιβουπροφαίνη. Το αποτέλεσμα αυτό έρχεται σε αντιδιαστολή με τα in vitro αποτελέσματα. Πιθανώς αυτό να οφείλεται στο ότι στο προκαλούμενο από καραγεννίνη οίδημα, συμβαίνουν και άλλες διαδικασίες, εκτός από το μονοπάτι της CX. Το παραπάνω συμπέρασμα επιβεβαιώνει η 88

90 αξιοσημείωτα καλή δράση της IQ. Ενώ είχε μέτρια αναστολή των ισοενζύμων της κυκλοξυγονάσης, in vivo εμφανίζει την καλύτερη δράση από όλα τα παράγωγα. Πιθανώς συμβάλλει σημαντικά το γεγονός ότι έχει πολύ καλή ικανότητα αναστολής της λιποξυγονάσης, οπότε αναστέλλει την φλεγμονή και μέσω αυτής της οδού. Επιπλέον, στην ανάπτυξη του οιδήματος παίζει ρόλο η παραγωγή ελευθέρων ριζών. Έτσι η IQ εμφανίζει ένα ακόμα πλεονέκτημα έναντι των υπολοίπων ενώσεων. Όλα τα παράγωγα της ιβουπροφαίνης φαίνεται ότι δρουν ως έχουν και όχι μετά από υδρόλυση στη συγκεκριμένη δοκιμασία. Ένα ακόμα συμπέρασμα που επαληθεύεται είναι ότι η ελεύθερη καρβοξυλομάδα δεν είναι απαιτούμενο δομικό χαρακτηριστικό για την εκδήλωση της αντιφλεγμονώδους δράσης. Η IAS παρουσιάζει μέτρια δράση in vivo, ενώ στη δοκιμασία αναστολής των CX-1, 2 in vitro εμφανίζει πάρα πολύ καλά αποτελέσματα. Βέβαια, ο μηχανισμός ανάπτυξης οιδήματος, όπως προαναφέρθηκε, δεν οφείλεται αποκλειστικά στην οδό των κυκλοξυγονασών. Επιπλέον, η IAS δεν αναστέλλει την λιποξυγονάση και δεν έχει σημαντική αντιοξειδωτική ικανότητα. Έτσι, in vivo φαίνεται να μην αναστέλλει τα αρχικά στάδια της φλεγμονώδους απόκρισης, καθώς δεν περιορίζει ικανοποιητικά την ανάπτυξή της μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης ελευθέρων ριζών. Το παραπάνω αποτέλεσμα υποστηρίζεται και από το γεγονός ότι αρκετά γνωστά μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα είναι ασθενή στην πρώτη φάση του οιδήματος καρραγενίνης, σε αντίθεση με την επόμενη φάση, όπου συμμετέχουν προσταγλανδίνες και εκδηλώνεται τότε ισχυρή αντιφλεγμονώδης δράση (156). Ενώ η IAm.e. παρουσιάζει αμελητέα δράση, μετά την εστεροποίηση με την σαλικυλική αλκοόλη (ΙΑS) η δράση τετραπλασιάζεται. Για μια ακόμη φορά επιβεβαιώνεται η ευεργετική παρουσία του φαινολικού υδροξυλίου (αντιοξειδωτικό τμήμα), σε συνδυασμό με τη δομή της σαλικυλικής αλκοόλης. Η IPm.e. παρουσιάζει μικρή ανασταλτική ικανότητα, μεγαλύτερη όμως της IAm.e. Η ICe.e. εμφανίζει ικανοποιητική ανασταλτική δράση, η οποία αποδίδεται στη σουλφυδρυλική ομάδα που προσδίνει σημαντική αντιοξειδωτική ικανότητα. Ακόμα μια φορά αποδεικνύεται ότι η παρουσία αντιοξειδωτικού τμήματος συντελεί στην βελτίωση της δράσης. Η IS εμφανίζει αρκετά καλά in vivo αποτελέσματα. Συνδυάζει αντιοξειδωτική δράση και ικανοποιητικά αποτελέσματα στην in vitro αναστολή της CX. Είναι ένα αρκετά απλό παράγωγο που συνδυάζει την ιβουπροφαίνη και τη σαλικυλική αλκόολη. 2.β Εκτίμηση της αντιδυσλιπιδαιμικής ικανότητας Μελετήθηκε η ικανότητα των ενώσεων να βελτιώνουν τα επίπεδα δεικτών δυσλιπιδαιμίας σε επίμυες που 89

91 καταστήσαμε δυσλιπιδαιμικούς με χορήγηση τυλοξαπόλης. Η Triton WR1339 (τυλοξαπόλη) αποτελεί μια μη ιονική τασενεργό ουσία (εικόνα 17) δομής πολυμερούς. Η ενδοπεριτοναϊκή χορήγησή της έχει ως αποτέλεσμα την παροδική αύξηση των λιπιδίων στο πλάσμα (157). Η τυλοξαπόλη αναστέλλει την δράση της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης στα σημεία όπου εκκρίνονται οι λιποπρωτεΐνες. Το παραπάνω οφείλεται ίσως στην τροποποίηση του υποστρώματος του ενζύμου. Η κάλυψη των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος από την τυλοξαπόλη οδηγεί στον εσφαλμένο μεταβολισμό τους (158). Επιπλέον εμποδίζει την πρόσληψή τους από την κυκλοφορία στους υποδοχείς λιποπρωτεϊνών στο ήπαρ (159). Ο έλεγχος αντιδυσλιπιδαιμικής δράσης έγινε στην ομάδα των ενώσεων που εμφάνισαν αντιοξειδωτική ικανότητα. Αφού τα φαινολικά οξέα παρουσιάζουν αντιοξειδωτικές ικανότητες μπορούν παράλληλα να προστατέψουν την οξείδωση της LDL (160, 161). Έτσι, το πείραμα πραγματοποιήθηκε για τις IQ, IS και ICe.e. (η δομή τους εμφανίζεται στο σχήμα 23, σελίδα 105), που παρουσίασαν ικανοποιητική δράση κατά των ελευθέρων ριζών. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στo παρακάτω σχήμα: Εικόνα 14: Δομή τυλοξαπόλης Σχήμα 24: Aντιδυσλιπιδαιμική δράση των εξεταζομένων ενώσεων ***P<0.001, **P<0.005, συγκρινόμενα με μάρτυρες (Student s t-test). Από το παραπάνω σχήμα φαίνεται ότι όλες οι υπό έλεγχο ενώσεις παρουσίασαν αντιδυσλιπιδαιμική δράση στην ίδια δόση. Και οι τρεις ενώσεις προκαλούν πτώση της ολικής χοληστερόλης. Παρατηρήθηκε ότι οι πιο ισχυρές αντιοξειδωτικές ενώσεις εμφανίζουν μεγαλύτερη μείωση. Έτσι, η IQ, που εμφανίζει την μεγαλύτερη αντιοξειδωτική ικανότητα (αναστολή λιπιδικής υπεροξείδωσης: IC 50 = 16μΜ ) προκαλεί μείωση των επιπέδων χοληστερόλης 90