DIAGNOSTIC PRENATAL NEINVAZIV PRIN ANALIZA MOLECULARA A ADN FETAL DIN PLASMA MATERNA. Decembrie 2008

Transcript

1 DIAGNOSTIC PRENATAL NEINVAZIV PRIN ANALIZA MOLECULARA A ADN FETAL DIN PLASMA MATERNA Decembrie 2008 I. AMPLIFICAREA DYS14 PORNIND DE LA CELULELE FETALE Diagnosticul prenatal cu privire la afecţiunile genetice fetale presupune analiza materialului genetic fetal. Acesta este obţinut prin proceduri invazive ca amniocenteza sau biopsia vilozităţilor coriale. Deoarece aceste proceduri sunt asociate cu un risc de avort mic, dar nu absent, numeroşi cercetători au căutat de-a lungul ultimelor decenii, alternative neinvazive de a obţine materialul genetic fetal. Una din aceste metode a fost izolarea celulelor fetale nucleate ce trec în circulaţia maternă. Căutarea şi identificarea celulelor nucleate fetale în sângele matern a început încă din anii Au fost astfel identificate multiple populaţii de celule fetale, incluzând eritrocite nucleate, limfocite şi trofoblaste. Totodată, au fost încercate numeroase metode în scopul izolării şi detecţiei acestor celule: sortare celulară prin fluorescenţă, magnetism, microdisecţie sau în funcţie de talie. Primul demers a constat în încercarea de a separa celule fetale din circulaţia maternă. Acestea au fost separate folosind o tecnologie bazată pe asocierea nanotehnologie anticorpi monoclonali. Pe scurt, un fir de oţel acoperit cu microparticule de aur este acoperit cu anticorpi monoclonali. S-au utilizat anticorpi anti CD71, Fab, MemG9. Reacţia de amplificare a fost realizată de primeri specifici genei Dys14, situată pe cromozomul Y, în scopul de a identifica materialul genetic al fătului de sex masculin. Amplificarea s-a efectuat direct pe celulele fixate, fără extracţie prealabilă a ADN. Primerii au fost verificaţi în baza de date NIH (National Institute of Health), prin programul BLAST, contra falselor hibridări. De asemenea, programul NetPrimer a fost utilizat pentru verificarea eventualilor dimeri de primeri sau cross-dimeri. Reacţiile PCR au fost efectuate într-un volum total de 50μl, folosind alternativ termociclorul Mastercycler Gradient, Eppendorf sau PalmCycler, Corbett Research. Amestecul de reacţie a fost alcătuit din :

2 ADN genomic, 100 ng, respectiv 1 µl din soluţia de 100 ng/ µl. În cazul celulelor fixate sau a controlului negativ, soluţia ADN a fost înlocuită cu apă Fiecare din cei doi primeri Dys14, câte 0,5 µl din soluţia stoc ; Amestec Mastermix Prime5, furnizat (conţine ADN Polimeraza termostabilă, Buffer aferent, Soluţie MgCl 2, amestec nucleotide) ; Apă bidistilată nuclease-free, qsp 50μl. Au fost realizate controale NTC (No template control) lipsite de ADN, pentru verificarea contaminării. Termociclorul a fost programat după cum urmează : 2 minute la 94 C etapă iniţială de denaturare (etapă de activare) ; 35 cicluri de amplificare compuse din : - 30 secunde la 94 C etapă de denaturare ; - 30 secunde la 53 C etapă de hibridare ; - 60 secunde la 72 C etapă de extensie ; 10 minute la 72 C etapă finală de extensie ; Răcire şi păstrare la 4 C. Înainte de depozitul în gel, la amestecul PCR a fost adăugat un marker de migrare colorat (Blue/Orange 6X Loading Dye, Promega), în raportul de 1 μl marker la 5 μl soluţie ADN. Între 10 şi 20 μl din reacţiile PCR au fost depuse direct în gel de agaroză 1,7% şi migrate electroforetic la un curent electric echivalent a 5V / cm de migrare. Acelaşi marker a folosit pentru depozitarea markerului de talie folosit (50 bp DNA Step Ladder, Promega), din care de asemenea s-au depozitat 10 μl în gelul de agaroză pentru verificarea taliei fragmentelor obţinute. Gelurile de agaroză au fost realizate şi migrate utilizînd sistemul Sub-Cell System for Submerged Horizontal Electroforesis, Bio-Rad. Pentru un gel mic 1,7% au fost folosite 0,8 g agaroză în 50 ml tampon TBE 1X. După încălzire şi răcire lentă la 55 C, soluţia omogenă de agaroză a fost suplimentată de o soluţie de bromură de etidiu (BET), pentru o concentraţie finală a acesteia din urmă de 0,5 μg / ml soluţie. Soluţia mamă de BET de 10 mg / ml a fost preparată în felul următor (pentru 50 ml): 0,5 ml Tris-HCl 1M, ph8

3 0,1 ml EDTA 0,5M 500 mg BET solid H2O distilată qsp 50 ml. Pentru realizarea unui gel mic au fost adăugaţi în consecinţă 25 μl soluţie mamă BET la 50 ml soluţie agaroză. Tamponul folosit pentru migrare a fost acelaşi ca cel folosit la fabricarea gelului, cu excepţia BET. A fost aşadar preparată o soluţie stoc tampon TBE 20X (Tris-borat 1,8M + EDTA 40mM), după cum urmează : 216 g Tris-bază 110 g Acid boric 80 ml EDTA 0,5M ph8 H2O distilată qsp 1 l. Soluţia stoc TBE a fost sterilizată prin autoclavare şi păstrată în flacoane de culoare închisă la temperatura camerei. Tamponul de migrare 1X a fost preparat de fiecare dată cu puţin înainte de electroforeză, după cum urmează : 50 ml soluţie stoc TBE 20X dh2o qsp 1 l Benzile corespunzătoare fragmentelor ADN au fost vizualizate, fotografiate şi analizate folosind sistemul de documentare G:BOX Chemi, Syngene, cu ajutorul softurilor GeneSnap şi GeneTools.

4 a b Figura 1. Amplificarea DYS14, direct din celulele fetale izolate (a după 45 minute de migrare ; b după 105 minute de migrare) Pistele 1 şi 10 : 50 pb step ladder; Pistele 2 şi 9 : nimic (pentru evitarea contaminării de godeu) Pistele 3 şi 4 : produşii de amplificare provenind din celule fetale izolate (amplificarea nu a funcţionat) Pista 5 : control pozitiv, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex masculin Pista 6 : control negativ, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex feminin Pista 7 : Control NTC (No Template Control) Pista 8 : Control pozitiv intern Din figura de mai sus putem deduce următoarele : Amplificarea a funcţionat, dovadă controalele pozitive ; Fragmentul de amplificare Dys14 se situează în jur de 400 perechi de baze ; Controalele NTC şi negativ nu prezintă amplificare, ceea ce demonstrează absenţa contaminării ; Probele din celule fetale izolate nu au amplificat, ceea ce arată lipsa de sensibilitate a metodei de amplificare calitativă pentru o cantitate atât de mică de ADN sechestrat în celule.

5 Figura 2. Amplificarea DYS14, direct din celulele fetale izolate Pistele 1, 12 şi 21 : 50 pb step ladder; Pista 2 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, CD71, fixare la 4 C Pista 3 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, MEMG9, fixare la 4 C Pista 4 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, Fab, fixare la 4 C Pista 5 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, CD71, fixare la temperatura camerei Pista 6 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, MEMG9, fixare la temperatura camerei Pista 7 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, Fab, fixare la temperatura camerei Pista 8 : control pozitiv, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex masculin Pista 9 : control negativ, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex feminin Pista 10 : Control NTC (No Template Control) Pista 11 : Control pozitiv intern Pista 13 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, CD71, fixare la temperatura camerei Pista 14 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, CD71, fixare la temperatura camerei Pista 15 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, MEMG9, fixare la temperatura camerei Pista 16 : produs de amplificare provenind din celule fetale izolate, Fab, fixare la temperatura camerei Pista 17 : control pozitiv, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex masculin Pista 18 : control negativ, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex feminin Pista 19 : Control NTC (No Template Control) Pista 20 : Control pozitiv intern Din figura de mai sus putem deduce următoarele : Controalele NTC şi negativ prezintă amplificare, ceea ce demonstrează contaminarea primerilor Dys14 ; Nu există diferenţe între cei trei monoclonali utilizaţi pentru izolarea celulelor fetale. Prezenţa contaminării a determinat orientarea către altă strategie de lucru. Prin urmare, următorul demers s-a orientat către ADN-ul liber din plasma maternă.

6 II. EXTRACŢIA TOTAL LIBER DIN PLASMA MATERNĂ Celulele fetale din circulaţia maternă sunt extrem de rare (o celulă fetală per mililitru de sânge matern) şi necesită procese speciale de izolare, pentru care tehnologia actuală încă necesită progrese şi perfecţionare. Astfel, au apărut metode alternative. În ultimii 40 de ani au fost depuse numeroase eforturi în scopul dezvoltării metodelor pentru diagnosticul prenatal neinvaziv. Începând cu 1997, progresele în acest domeniu au fost accelerate prin neaşteptata identificare a acizilor nucleici fetali extracelulari în plasma matenă. Aceste progrese s-au tradus prin descoperirea a numeroşi markeri noi genetici, epigenetici şi de expresie, considerându-se a avea în viitor un impact fundamental în practica diagnosticului prenatal. După descoperirea surprinzătoare a ADN-ului fetal extracelular în circulaţia maternă, au apărut informaţii asupra naturii sale. Astfel, ADN-ul fetal circulant este constituit predominant din fragmente mici, 80% din ele fiind sub 200 pb (perechi baze). Mai mult, ADN-ul fetal reprezintă numai o mică fracţie (3-6%) din ADN-ul liber, extracelular din plasma maternă. Cea mai mică vârstă gestaţională la care a fost detectat ADN-ul fetal circulant în plasma maternă a fost ziua a 18-a după embriotransfer. Concentraţia ADN fetal creşte o dată cu vârsta gestaţională, iar după naştere este extrem de rapid eliminat din plasma maternă, având o perioadă medie de înjumătăţire de aproximativ 16 minute. ADN-ul fetal din plasma maternă poate fi utilizat pentru obţinerea de informaţii valoroase asupra fătului sau a sarcinii, fie pentru diagnosticul prenatal sau monitorizare. Aceste aplicaţii pot fi clasificate în două categorii: cele ce necesită analiza calitativă a ADNului fetal şi cele ce necesită o evaluare cantitativă. Determinările încep tipic prin separarea plasmei de componentele celulare ale sângelui matern, urmate de exptracţia ADN-ului din fracţiunea plasmatică. Pentru ambele tipuri de aplicaţii este important să se reţină faptul că ADN-ul fetal reprezintă o fracţiune minoră a ADN-ului total din plasma maternă. Prin urmare, metodele analitice trebuie să depisteze această sub-populaţie de ADN fetal extracelular, liber, cu o înaltă sensibilitate şi trebuie să diferenţieze ADN-ul fetal ţintă de fondul covârşitor al materialului genetic matern. În practică, cel mai simplu mod este prin ţintirea cromosomilor, genelor sau polimorfismelor genetice şi a mutaţiilor pe care fătul le moşteneşte de la tată, şi care sunt prin urmare absente sau diferite la mamă. Este un fapt de la sine înţeles, acela că de la identificarea în 1997 a ADN-ului liber fetal în plasma maternă şi până astăzi, nenumărate au fost încercările de optimizare şi

7 ameliorare a extracţiei ADN-ului plasmatic. Dată fiind concentraţia redusă a ADN la nivel plasmatic pe de o parte, iar pe de altă parte natura chimică şi proporţia redusă a ADN fetal, dificultatea extracţiei preferenţiale a ADN-ului fetal a reprezentat o problemă constantă, atât pentru firmele producătoare de kituri de extracţie, cât şi pentru laboratoarele de diagnostic şi cercetare. Astfel, majoritatea rezultatelor cu adevărat probante au fost obţinute folosind kitul de extracţie QIAamp DNA Blood Mini Kit (QDNA) produs de societatea QIAGEN. Aceasta a fost şi alegerea noastră. Concret, sângele periferic a fost mai întâi centrifugat 10 minute la 3000 X g, la temperatura camerei. Supernatantul a fost recentrifugat 10 minute la X g, iar plasma supernatantă a fost păstrată la 4 C şi utilizată pentru extracţie. Plasma neutilizată a fost alicotată corespunzător şi păstrată la -20 C. 400 μl plasmă au fost procesate conform protocolului Blood and blood fluids folosind kitul de extracţie QIAamp DNA Blood Mini Kit (QDNA) produs de societatea QIAGEN. Volumul de eluţie finală a fost de 50 μl. Estimarea cantităţii de ADN genomic după resuspendare a fost realizată prin măsurarea densităţii optice la 260 şi 280 nm cu aparatul DU800 Spectrophotometer, Beckman Coulter. Au fost realizate diluţii de ADN 1/12, volumul final pentru măsurarea densităţii optice fiind de 60 µl. Tabelul I. Concentrţiile ADN ale probelor extrase DO260 DO 280 Ratio Concentraţia (ng/μl) Proba 1 0,0166 0,0141 1,3856 5,4899 Proba 2 0,0164 0,0121 1,5898 6,9735 Proba 3 0,0179 0,0130 1,5530 8,3613 Proba 4 0,0116 0,0085 1,4617 5,8512 Proba 5 0,0163 0,0117 1,5256 8,0396 Proba 6 0,0183 0,0137 1,5427 7,8243 Din tabelul I putem observa un randament relativ bun de extracţie (o medie de 7,09 ng/μl), cu toate că puritatea ADN-ului nu este încă cea optimă. Extracţia trebuie optimizată în continuare. Cea mai bună probă este proba 2. Dacă estimăm ADN-ului fetal extracelular la 3% din ADN-ul liber total, media acestuia ar fi de 0,213 ng/μl, dici aproximativ 11 ng în cei 50 μl volum de eluţie, ceea ce reprezintă un randament suficient.

8 III. AMPLIFICAREA PORNIND DE LA ADN TOTAL LIBER DIN PLASMA MATERNĂ Amestecul de reacţie a fost alcătuit din (concentraţii optimizate) : ADN genomic, 100 ng, respectiv 1 µl din soluţia de 100 ng/ µl. În cazul probelor extrase, am folosit 5 µl ADN, adică aproximativ 35 ng ADN liber total. În cazul controlului negativ, soluţia ADN a fost înlocuită cu apă ; Fiecare din cei doi primeri Dys14, câte 0,5 µl din soluţia stoc ; Alternativ, au fost realizate amplificări pe genele BRCA1 şi IL-1B, cu primeri adecvaţi ; Amestec de dezoxiribonucleotide PCR Nucleotide Mix, Promega (1 µl din soluţia stoc de 10mM pentru fiecare dntp, pentru o concentraţie finală de 0,2 mm a fiecărui dntp); Soluţie MgCl 2, în concentraţie finală de 2,5 mm (5 µl din soluţia stoc de 25 mm); ADN Polimeraza : GoTaq Flexi DNA Polymerase, Promega (1,25 unităţi pe reacţie, folosind 0,25 µl din soluţia stoc de 5 unităţi/ µl); Tampon de reacţie PCR, în concentraţie finală de 1X (10 µl din soluţia stoc de 5 X); Apă bidistilată nuclease-free, qsp 50μl. Programul de amplificare a fost identic pentru toate cele trei gene (vezi mai sus). Au fost realizate controale NTC (No template control) lipsite de ADN, pentru verificarea contaminării. În cazul folosirii tamponului GoTaq Green Buffer, între 10 şi 20 μl din reacţiile PCR au fost depuse direct în gel de agaroză 3% şi migrate electroforetic la un curent electric echivalent a 5V / cm de migrare. În cazul folosirii tamponului GoTaq Colorless Buffer, înainte de depozitul în gel, la amestecul PCR a fost adăugat un marker de migrare colorat (Blue/Orange 6X Loading Dye, Promega), în raportul de 1 μl marker la 5 μl soluţie ADN. Acelaşi marker a folosit pentru depozitarea markerului de talie folosit (50 bp DNA Step Ladder, Promega), din care de asemenea s-au depozitat 10 μl în gelul de agaroză pentru verificarea taliei fragmentelor obţinute.

9 Gelurile de agaroză au fost realizate şi migrate utilizînd sistemul Sub-Cell System for Submerged Horizontal Electroforesis, Bio-Rad. Pentru gelurile mari 3% au fost folosite 9 g agaroză în 300 ml tampon TBE 1X. Pentru gelurile mici 3% a fost folosit 1,5 g agaroză în 50 ml tampon TBE 1X. Electroforeza şi lecturarea gelurilor au fost realizate la fel ca la punctul anterior. Figura 3. Amplificări pornind de la ADN liber extras din plasmă Pistele 1, 16, 23 şi 30 : 50 pb step ladder; 2-15 : Amplificare Dys14 : Pista 2 : control pozitiv, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex masculin Pista 3 : control negativ, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex feminin Pista 4 : control pozitiv intern, ADN 1 Pista 5 : control pozitiv intern, ADN 2 Pistele 6-12 : produs de amplificare ale probelor extrase 1-6 Pista 13 : Control NTC (No Template Control), apa 1 Pista 14 : Control NTC (No Template Control), apa 2 Pista 15 : Control NTC (No Template Control), apa : Amplificare BRCA1 : Pista 17 : control pozitiv, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex masculin Pista 18 : control pozitiv, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex feminin Pista : produs de amplificare ale probelor extrase 1-3 Pista 22 : Control NTC (No Template Control) : Amplificare IL-1B : Pista 24 : control pozitiv, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex masculin Pista 25 : control pozitiv, realizat pe 50 ng ADN provenind de la o persoană de sex feminin Pista : produs de amplificare ale probelor extrase 1-3 Pista 29 : Control NTC (No Template Control)

10 Din figura de mai sus putem deduce următoarele : Controalele NTC şi negativ prezintă amplificare, ceea ce demonstrează contaminarea primerilor Dys14 ; Prezenţa contaminării a determinat orientarea către altă strategie de lucru. Amplificările BRCA şi IL-1 nu prezintă contaminare ; ADN-ul total liber extras este suficient pentru amplificări calitative ; Schimbarea primerilor şi verificarea prin primeri SRY va permite eventual evidenţierea amplificării pornind doar de la ADN liber fetal.