ΔΝΙΥΤΗ ΚΑΙ ΑΝΙΥΝΔΤΗ ΣΟΤ E6/E7 mrna ΠΔΝΣΔ ΚΑΡΚΙΝΟΓΟΝΩΝ ΣΤΠΩΝ ΣΟΤ HPV (16,18,31,33,45) ME THN TEXNIKH NASBA

Transcript

1 ΔΝΙΥΤΗ ΚΑΙ ΑΝΙΥΝΔΤΗ ΣΟΤ E6/E7 mrna ΠΔΝΣΔ ΚΑΡΚΙΝΟΓΟΝΩΝ ΣΤΠΩΝ ΣΟΤ HPV (16,18,31,33,45) ME THN TEXNIKH NASBA Αλεπάκη Μαπία Βιολόγορ Δπγαζηήπιο Γιαγνυζηικήρ Κςηηαπολογίαρ, Π.Γ.Ν. Αηηικόν

2 ηο θςζιολογικό πληθςζμό η ζςσνόηηηα εμθάνιζηρ ηηρ HPV λοίμυξηρ μποπεί να θηάζει ηο 50%, ενώ η ζςσνόηηηα ηος καπκίνος ηος ηπασήλος ηηρ μήηπαρ δε ξεπεπνά ηο 0,08% κάθε σπόνο. Δίναι επομένυρ πποθανέρ όηι ενώ πολλέρ γςναίκερ έσοςν HPV δε θα αναπηύξοςν όλερ καπκίνο ηος ηπασήλος ηηρ μήηπαρ.

3 Μελέηερ ηα ηελεςηαία 20 σπόνια έσοςν πεπιγπάτει ηη θςζική ιζηοπία ηηρ εξέλιξηρ ηος καπκίνος ηος ηπασήλος και έσει ενοσοποιηθεί η έκθπαζη ηυν ογκογονιδίυν Δ6/Δ7 υρ αναγκαία και ικανή ζςνθήκη για ανάπηςξη καπκίνος ηος ηπασήλος ηηρ μήηπαρ.

4 NASBA Primer 1 RT RNase H Primer 2 RT Primer 2 T7 RNA Polymerase Cyclic Phase RT RNase H Primer 1 RT

5

6

7 10ml αξρηθνύ ThinPrep Απνκόλσζε λνπθιετθώλ νμέσλ (DNA+RNA) (Boom technology) Ελίζρπζε ηνπ E6/E7 mrna HPV ησλ ηύπσλ 16, 18, 31, 33 θαη 45 Αλίρλεπζε παξαγόκελνπ θζνξηζκνύ

8 Research study Stability of E6/E7 mrna in cervical collection media Objectives Evaluate the stability of E6/E7 mrna from clinical specimens in most commonly used or new collection media Study design Thinprep (Cytic/Hologic) T0 : Immediate testing T1 : RT for 1 week Extraction EasyMAG instrument Clinical specimen => 2 nd specimen from double collection => Collection in PBS stored at 4 C until spiking Medium A, B, C or D A: Lysis Buffer (biomerieux) B: PreTect (Norchip) C: CyMol (Copan) D: STM (Digene/Qiagen) T2 : RT for 2 weeks T0 : Immediate testing T1 : RT for 1 week T2 : RT for 2 weeks Amplification/Detection EasyQ instrument EasyQ HPV assay Results Concordance between Thinprep positives and tested media

9 Preliminary study Stability of E6/E7 mrna in cervical collection media Positivity rate of EasyQ HPV on specimens spiked in Thinprep => storage at RT for 1 wk (T1) and 2 wks (T2) T1 => 95% (37/39) EQ HPV + T2 => 92% (36/39) EQ HPV + Good stability of E6/E7 mrna for up to 2 weeks in Thinprep at RT in very challenging conditions (low cell density, collection in PBS, ) Concordance between Lysis Buffer/CyMol/Pretect/STM and Thinprep positives => storage at RT for 2 wks (T2) Medium Concordance with ThinPrep Lysis Buffer 92% CyMol 91% Pretect 89% STM 75% - Very promising results of E6/E7 mrna stability in all the tested collection media - No significant difference observed between all tested media up to 2 wks at RT - Need to confirm these results in a larger study

10 Αναζηολείρ Ένηονα αιμαηηπό ή βλεννώδερ απσικό βιολογικό μειώνει ηην εςαιζθηζία. Αναλςηική ειδικόηηηα Καμία αλληλεπίδπαζη με Mycoplasma hominis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Ureaplasma urealyticum Mycoplasma genitalium G-37, Chlamydia trachomatis, Candida albicans, Neisseria gonorrhoeae,gardnerella vaginalis, Herpes Simplex Virus 1, Herpes Simplex Virus 2, Human Immunodeficiency Virus, Hepatitis B Virus, and Hepatitis C Virus. Αναλςηική εςαιζθηζία Δπαναλητιμόηηηα Δξαιπεηική ζύμθυνα με ηην ανάλςζη πος πεπιγπάθεηαι ζηην IFU

11 Γηαηί κόλν 5 από ηνπο 14 ηύπνπ πςεινύ θηλδύλνπ; Η βειηηζηνπνίεζε ηνπ αξηζκνύ ησλ αληρλεπόκελσλ ηύπσλ αλά αληίδξαζε είλαη ζεκαληηθή γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ HPV, ρσξίο απώιεηα επαηζζεζίαο θαη εηδηθόηεηαο Κάζε ηύπνο HPV έρεη δηαθνξεηηθό νγθνγoληθό δπλακηθό (πρ. Τύπνη ηνπ ηνύ passengers ) Οη ηύπνη 16,18, 31, 33 θαη 45 είλαη νη ζπρλόηεξνη ζε θαξθηλώκαηα ηνπ ηξαρήινπ ηεο κήηξαο Kraus et al, 2006

12 NASBA vs RT-PCR Η NASBA είλαη κηα ηζνζεξκηθή αληίδξαζε πνπ νινθιεξώλεηαη ζηνπο 41 C Σην RT-PCR, επηζηξαηεύεηαη ε αληίζηξνθε κεηαγξαθάζε θαη ζρεκαηίδεηαη πβξίδην RNA- DNA. Αιιεπάιιεινη θύθινη ζέξκαλζεο θαη ςύμεο είλαη αλαγθαίνη γηα ηνλ πνιιαπιαζηαζκό ηνπ cdna Φξεζηκνπνηώληαο ηελ NASBA ε ζεξκηθή απνδηάηαμε δελ είλαη αλαγθαία, επηηξέπνληαο ηελ αλίρλεπζε mrna αλεμάξηεηα ηεο παξνπζία DNA, έρνληαο σο απνηέιεζκα απμεκέλε θιηληθή εηδηθόηεηα

13 % Ε6/Ε7 mrna HPV 16, 18, 31, 33, 45 ζε ζρέζε κε ηελ ηζηνινγηθή δηάγλσζε 120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% απνηηικά θεηικά ΑΝΔΠΑΡΚΔ ΑΡΝΗΣΙΚΟ HPV ΎΠΟΠΣΟ HPV CIN I CIN II CIN III ADENOCA SCC Ιζηνινγηθή δηάγλσζε ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 120,00% 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% PV Sensitivity Specificity P PV N PV OA EasyQ HPV LgSIL+ EasyQ HPV HgSIL+

14 New recommendations for the use of HPV-tests in Denmark

15 Economic aspects of the use of HPV-tests in Denmark

16 Η ανίσνεςζη ηος E6/E7 mrna ηος HPV καηαδεικνύει ηην ογκογονική δπαζηηπιόηηηα και μποπεί να σπηζιμοποιηθεί υρ κλινικόρ ππογνυζηικόρ δείκηηρ για ηην ηαςηοποίηζη ηυν γςναικών πος κινδςνεύοςν να αναπηύξοςν ςτηλού βαθμού δςζπλαζηικέρ αλλοιώζειρ και καπκίνο.