ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ-ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Κ. ΖΟΥΜΠΟΣ ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΠΡΟΓΟΝΙΚΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΑΠΛΑΣΤΙΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Κ. ΓΙΑΝΝΑΚΟΥΛΑΣ ΙΑΤΡΟΣ-ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2004
ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Νικόλαος Κ. Ζούμπος, Επιβλέπων Καθηγητής 2. Αλίκη Καλλινίκου-Μανιάτη, Καθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών 3. Παναγιώτα Ματσουκά, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Νικόλαος Κ. Ζούμπος, Καθηγητής Παθολογίας-Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών 2. Αλίκη Καλλινίκου-Μανιάτη, Καθηγήτρια Τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών 3. Παναγιώτα Ματσουκά, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογίας- Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών 4. Απόστολος Βαγενάκης, Καθηγητής Παθολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών 5. Κων/νος Τσαταλάς, Αναπληρωτής Καθηγητής Παθολογίας- Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης 6. Μαρίνα Καρακάντζα, Επίκουρη Καθηγήτρια Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών 7. Ανάργυρος Συμεωνίδης, Λέκτορας Αιματολογίας Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών 2
ΑΝΤΙ ΠΡΟΛΟΓΟΥ Η απλαστική αναιμία είναι ένα σπάνιο νόσημα του μυελού των οστών με αδιευκρίνιστα ακόμη στη βιβλιογραφία αρκετά σημεία της αιτιολογίας, των μηχανισμών πρόκλησης αλλά και της θεραπευτικής αντιμετώπισής του. Πριν από αρκετά χρόνια, ο Καθηγητής μου κ. Ν. Ζούμπος, μου πρότεινε ως θέμα της διδακτορικής μου διατριβής, ένα θέμα σχετικό με το σπάνιο αλλά τόσο γοητευτικό αυτό νόσημα. Οι αρχικές μου επιφυλάξεις μετατράπηκαν γρήγορα σε ενθουσιασμό καθώς η μελέτη της σχετικής με το συγκεκριμένο νόσημα βιβλιογραφίας και η πειραματική μου ενασχόληση μ αυτό, προχωρούσε. Η μακρόχρονη προσπάθεια σε συνδυασμό με τη σχετική δυσκολία στην ανεύρεση προς μελέτη ικανού αριθμού ασθενών καθιστούν την εκπόνηση της συγκεκριμένης διατριβής σαν μέγιστη για μένα ικανοποίηση μα και εφαλτήριο για περισσότερη και πιο αποτελεσματική ερευνητική προσπάθεια. Πολλοί άνθρωποι στάθηκαν πολύτιμοι συμπαραστάτες στην προσπάθεια μου, τους οποίους και θερμά ευχαριστώ με την ευκαιρία αυτή. Καταρχήν, τον σεβαστό μου καθηγητή κ. Νικόλαο Ζούμπο, για την αμέριστη αγάπη, εκτίμηση και συμπαράσταση, με την οποία με περιβάλλει από την πρώτη μέρα που γνωριστήκαμε. Μου δόθηκε επανειλημμένα η ευκαιρία να νιώσω το αμέριστο ενδιαφέρον και την στοργική του φροντίδα για μένα και την οικογένειά μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής αλλά και της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. Ιδιαίτερα θα ήθελα να αναφερθώ στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Παναγιώτα Ματσουκά, για την πολύτιμη βοήθεια και συμπαράσταση όλα αυτά τα χρόνια και στην καλή φίλη και εξαιρετική συνάδελφο Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Μαρίνα Καρακάντζα, που με την άοκνη και πολύτιμη βοήθειά της συνέβαλλε τα μέγιστα στην ολοκλήρωση της εργασίας μου. Ένας εξαιρετικός φίλος και ανεκτίμητος συνεργάτης σε κάθε βήμα της προσπάθειάς μου ήταν ο κ. Γιώργος Θεοδώρου, τον οποίο θερμά ευχαριστώ 3
και στον οποίο εύχομαι κάθε προσωπική ευτυχία και επαγγελματική καταξίωση. Πολλές ευχαριστίες ανήκουν στην φίλη κ. Δώρα Κακαγιάννη για την πολύτιμη βοήθειά της καθώς επίσης και σε όλους τους συναδέλφους ιατρούςαιματολόγους του Τμήματός μας και στους εργαζόμενους και υποψήφιους διδάκτορες-ερευνητές του Ειδικού Αιματολογικού Εργαστηρίου για την βοήθειά τους στην κατάρτισή μου στο εργαστήριο αλλά και για την ηθική τους συμπαράσταση. Τέλος, αμέτρητες ευχαριστίες οφείλω στη λατρευτή μου σύζυγο Τασούλα, για την κατανόησή της στις ατέλειωτες ώρες απουσίας μου, για την συμπαράστασή της σε κάθε δυσκολία και για όλα τα όμορφα γεγονότα που έχουμε μοιραστεί και θα συνεχίσουμε να μοιραζόμαστε στην κοινή μας πορεία. 4
5 Στην Τασούλα και στα παιδιά μας
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ.σελ. 7 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΑΠΛΑΣΤΙΚΗΣ ΑΝΑΙΜΙΑΣ 8 1.1 Ορισμοί-Ιστορικά στοιχεία 8 1.2 Επιδημιολογικά δεδομένα..8 1.3 Αιτιολογία 9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΑΠΛΑΣΤΙΚΗΣ ΑΝΑΙΜΙΑΣ.12 2.1 ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΤΩΝ ΑΡΧΕΓΟΝΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΑΠΛΑΣΤΙΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ 13 2.1.1. Φυσιολογικά αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα 13 2.1.1.1 Ορισμοί...13 2.1.1.2 Ρύθμιση...13 2.1.1.3. Πειραματικά μοντέλα μελέτης αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων.15 2.1.1.4. Επιλογή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων με βάση το φαινότυπό τους 16 2.1.2. Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα στην απλαστική αναιμία.16 2.1.2.1. Λειτουργική εκτίμηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στην απλαστική αναιμία 17 2.1.2.2. Φαινοτυπικός προσδιορισμός των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων σε ασθενείς με ΑΑ 19 2.1.2.3. Εκτίμηση της ικανότητας επαναπληθυσμοποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στην ΑΑ..20 2.1.2.4 Γονιδιακή έκφραση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (stem cells) στην απλαστική αναιμία..22 6
2.2 ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΟΥ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ (ΣΤΡΩΜΑ) 24 2.2.1 Εισαγωγή.24 2.2.2 Διαταραχές του στρώματος σε ασθενείς με ΑΑ..24 2.3 ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΤΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΑΠΛΑΣΤΙΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ 25 2.3.1. Εισαγωγή 25 2.3.2. Ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά των Τ και ΝΚ κυττάρων μυελού και περιφερικού αίματος σε ασθενείς με ΑΑ.27 2.3.2.1. CD4 και CD8 λεμφοκύτταρα 27 2.3.2.2. Υποπληθυσμοί ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων 28 2.3.2.3. Μελέτη κλωνικότητας του Τ κυτταρικού υποδοχέα..28 2.3.2.4. NK κύτταρα...29 2.3.3. Παραγωγή μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών 30 2.3.4. Αντιδραστικότητα των Τ λεμφοκυττάρων εναντίον των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων 32 2.3.5. Συσχέτιση συγκεκριμμένων αλληλίων με επιρρέπεια σε ΑΑ.33 2.4 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΤΩΝ ΜΥΕΛΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΑΠΛΑΣΤΙΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ...35 2.4.1. Απόπτωση...35 2.4.1.1.Εισαγωγή....35 2.4.1.2. Χαρακτηριστικά αποπτωτικών κυττάρων. 36 2.4.1.3. Ελεγχος-γονιδιακή ρύθμιση της απόπτωσης....38 2.4.1.4 Αποπτωτικά μονοπάτια...44 2.4.1.5 Ο ρόλος της απόπτωσης στην ανοσολογική ρύθμιση. 47 2.4.1.6. Μέθοδοι ανίχνευσης αποπτωτικών κυττάρων....47 2.4.1.7 Απόπτωση στο αιματολογικό σύστημα...50 2.4.1.8 Έκφραση του Fas στα φυσιολογικά προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα....51 7
2.4.2. Η απόπτωση σε ασθενείς με απλαστική αναιμία..52 2.4.2.1.Η απόπτωση στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα μυελού των οστών σε ασθενείς με ΑΑ...52 2.4.2.2. Έκφραση του Fas στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα μυελού των οστών σε ασθενείς με ΑΑ 53 2.4.2.3. Τροποποίηση της απόπτωσης με θεραπευτικούς χειρισμούς.54 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΤΥΠΟΥ-1 ΚΑΙ ΤΥΠΟΥ-2 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ 57 3.1 Τα κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος...57 2.2.Τύπου 1 και τύπου 2 ανοσολογική αντίδραση 59 2.2.1 Τύπου 1 κύτταρα και κυτταροκίνες.60 2.2.2 Τύπου 2 κύτταρα και κυτταροκίνες.61 2.2.3 Thp και Th0.62 2.2.4 Thr και Tr1..63 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΜΕΝΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ.65 4.1 Κυτταρομετρία ροής 65 4.1.1 Βασικές αρχές λειτουργίας..65 4.1.2 Εφαρμογές...67 4.1.3 Ανίχνευση ενδοκυτταροπλασματικών αντιγόνων...67 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 68 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 71 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5. 73 ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 5.1 Ασθενείς και φυσιολογικοί μάρτυρες.73 5.1.1 Διαγνωστικά κριτήρια.73 8
5.1.2 Ασθενείς και φυσιολογικοί μάρτυρες για τη μελέτη του ανοσοφαινοτύπου επιφανείας περιφερικού αίματος και των τύπου-1 και τύπου-2 ανοσολογικών αντιδράσεων των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος...73 5.1.3 Ασθενείς και φυσιολογικοί μάρτυρες για τη μελέτη των μυελικών κυττάρων (ανοσοφαινοτυπική μελέτη, μελέτη απόπτωσης).76 5.1.4. Μορφολογική μελέτη επιχρισμάτων περιφερικού αίματος και μυελού των οστών.79 5.2 Μέθοδος προσδιορισμού ανοσοφαινοτύπου επιφανείας 79 5.2.1 Μέθοδος προσδιορισμού ανοσοφαινοτύπου επιφανείας κυττάρων περιφερικού αίματος 79 5.2.2 Μέθοδος προσδιορισμού ανοσοφαινοτύπου επιφανείας κυττάρων μυελού των οστών 81 5.3 Μέθοδος προσδιορισμού ενδοκυττάριων κυτταροκινών.82 5.3.1 Κυτταρικές καλλιέργειες 82 5.3.2 Διαδικασία σήμανσης επιφάνειας και κυτταροπλάσματος.82 5.3.3 Ανάλυση σε κυτταρομετρητή ροής. 84 5.4 Προσδιορισμός της απόπτωσης μυελικών κυττάρων ασθενών με ΑΑ με τη μέθοδο της Annexin V..85 5.4.1 Εισαγωγικά.. 85 5.4.2 Υλικά αντιδραστήρια. 86 5.4.3 Εκτέλεση..86 5.5 Στατιστική ανάλυση.....86 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ....88 6.1 Μελέτη λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών περιφερικού αίματος...89 6.1.1 Απόλυτες τιμές και ποσοστά των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών σε ασθενείς με απλαστική αναιμία.89 6.1.2 Δείκτες ενεργοποίησης Τ λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών..89 6.2 Ανοσοφαινοτυπική μελέτη κυττάρων μυελού των οστών..91 9
6.3 Ενδοκυτταροπλασματική παραγωγή των τύπου-1 και τύπου-2 κυτταροκινών στα CD4+ και CD8+ Τ κύτταρα ασθενών με ΑΑ 93 6.3.1 Ενδοκυτταροπλασματική παραγωγή τύπου-1 και τύπου-2 κυτταροκινών χωρίς in vitro διέγερση..93 6.3.2 Ενδοκυτταροπλασματική παραγωγή τύπου-1 και τύπου-2 κυτταροκινών μετά από in vitro διέγερση.95 6.3.3 Ισορροπία των κυττάρων που παράγουν κυτταροκίνες Τύπου-1/Τύπου-2...98 6.3.4 Αποτελέσματα ανίχνευσης των τύπου 1 και τύπου 2 ενδοκυτταροπλασματικών κυτταροκινών στα CD4+ και CD8+ Τ κύτταρα σε σχέση με την ύπαρξη κλωνικής διαταραρχής..101 6.3.4.1 Καρυοτυπική ανάλυση 101 6.3.4.2 Αποτελέσματα ενδοκυτταροπλασματικών κυτταροκινών..101 6.3.4.3 Ισορροπία του λόγου των τύπου 1/τύπου 2κυτταροκινών..104 6.4 Αποτελέσματα ανίχνευσης της απόπτωσης των μυελικών κυττάρων σε ασθενείς με απλαστική αναιμία...106 6.4.1 Έκφραση του αντιγόνου Fas (CD95) στα μυελικά κύτταρα ασθενών με απλαστική αναιμία..106 6.4.2 Ποσοστά απόπτωσης με τη μέθοδο της Annexin V/PI σε μυελικά κύτταρα ασθενών με απλαστική αναιμία 106 6.4.3 Συσχέτιση ανάμεσα στο ποσοστό των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων που παράγουν IFNγ και του λόγου IFNγ/IL-4 με το ποσοστό των Annexin-V (+) μονοπυρήνων και CD34+ κυττάρων του μυελού των ασθενών με ΑΑ. 112 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΣΥΖΗΤΗΣΗ..114 10
ΠΕΡΙΛΗΨΗ...123 SUMMARY 125 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...127 11
Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 12
Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΑΠΛΑΣΤΙΚΗΣ ΑΝΑΙΜΙΑΣ 1.1 Ορισμοί-Ιστορικά στοιχεία O Paul Erlich (1888), περιέγραψε πρώτος, την περίπτωση μιας νεαρής γυναίκας, που πέθανε από μια νόσο που συνοδευόταν από πυρετό, εξέλκωση των ούλων, μητρορραγίες, έντονη αναιμία και λευκοπενία. Στη νεκροτομή βρέθηκε λιπώδης μυελός με ελάχιστα κυτταρικά στοιχεία. Ήταν η πρώτη περιγραφή μιας νόσου, την οποία ο Chauffard (1904) ονόμασε απλαστική αναιμία. Σήμερα, ως απλαστική αναιμία ή μυελική απλασία, ονομάζεται στη βιβλιογραφία ένα σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από πανκυτταροπενία του περιφερικού αίματος και από μείωση ή εξαφάνιση των κυτταρικών στοιχείων στον μυελό, που οφείλεται σε ποσοτική ή ποιοτική διαταραχή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, χωρίς την παρουσία στον μυελό κακοήθους νόσου ή ίνωσης. Στην κλασσική απλαστική αναιμία δεν συμπεριλαμβάνεται η μυελοκαταστολή από ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία, αν και υψηλές δόσεις π.χ. βουσουλφάνης μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα βαριά μυελική απλασία. Η απλαστική αναιμία επίσης θα πρέπει να διακρίνεται από τις πανκυτταροπενίες λόγω δυσερυθροποίησης (π.χ. μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα). 1.2 Επιδημιολογικά δεδομένα Η απλαστική αναιμία είναι σπάνια νόσος, προσβάλλει κυρίως νέους άνδρες και άτομα μεγαλύτερης ηλικίας και των δύο φύλων. Η ετήσια συχνότητα της νόσου κυμαίνεται από 2-25 περιπτώσεις ανά εκατομμύριο κατοίκων, με ευρεία διακύμανση στις διάφορες γεωγραφικές περιοχές και σχετίζεται κυρίως με την οικονομική ανάπτυξη, τις ιδιαίτερες ασχολίες και συνήθειες και την επίπτωση ορισμένων λοιμώξεων. Στο 40-70 % των 13
περιπτώσεων η ΑΑ χαρακτηρίζεται ως ιδιοπαθής. Στις υπόλοιπες περιπτώσεις οφείλεται κυρίως σε τοξικά (φάρμακα, ακτινοβολία) ή λοιμώδη (ηπατίτιδα, φλαβοϊοί, EBV, CMV) αίτια ενώ σπανιότερα εμφανίζεται κατά την εγκυμοσύνη. Στα παιδιά, σε ένα ικανό ποσοστό, ανευρίσκεται κάποια υποκείμενη γενετική διαταραχή (αναιμία Fanconi κλπ). Η διεθνής ομάδα μελέτης της απλαστικής αναιμίας καθόρισε τη συχνότητα της νόσου στην Ευρώπη και στο Ισραήλ σε περίπου 2 περιπτώσεις ανά εκατομμύριο κατοίκων κατά τη δεκαετία του 1980, ενώ η νόσος είναι συχνότερη στην Άπω Ανατολή σε σχέση με τις αναπτυγμένες Δυτικές χώρες ( π.χ. η νόσος είναι 4 φορές πιο συχνή στην Ιαπωνία σε σχέση με την Ευρώπη). Η γεωγραφική κατανομή εμφάνισης της νόσου σχετίζεται επίσης και με διαφορές τόσο στο φύλο όσο και στην ηλικία των πασχόντων. Η εξήγηση των διαφορών, μεταξύ ηλικίας και φύλου εμφάνισης, μπορεί να οφείλεται στις διαφορετικές ασχολίες των διαφόρων ομάδων ατόμων, ενώ η γεωγραφική διακύμανση πιθανόν να σχετίζεται με παράγοντες του περιβάλλοντος, με φυλετικούς παράγοντες ή με τη χρήση διαφόρων «παραδοσιακών» φαρμάκων. Στις περιοχές που η συχνότητα της νόσου είναι αυξημένη, φαίνεται ότι οι περιπτώσεις είναι ηπιότερες σε βαρύτητα και εμφανίζουν καλύτερη πρόγνωση, σε σχέση με την πορεία και τη βαρύτητα της νόσου στις αναπτυγμένες Δυτικές χώρες. 1.3 Αιτιολογία Ανάλογα με τις διάφορες στατιστικές και τα κριτήρια για την ενοχοποίηση του υπεύθυνου παράγοντα, στο 40-70 % των επίκτητων απλαστικών αναιμιών δεν ανευρίσκεται κάποιο γνωστό αίτιο και οι απλαστικές αναιμίες χαρακτηρίζονται ως ιδιοπαθείς. Στις υπόλοιπες περιπτώσεις τα αίτια είναι κυρίως τοξικά ή λοιμώδη. Α) Τοξικά αίτια -φάρμακα Η απλαστική αναιμία σε μεγάλο ποσοστό που κυμαίνεται στις διάφορες χώρες από 30-80%, φαίνεται να είναι τοξικής αιτιολογίας. Με την εμφάνιση της απλαστικής αναιμίας σχετίζονται αρκετά φάρμακα ή ουσίες όπως η 14
χλωραμφενικόλη, το βενζόλιο, τα κυτταροστατικά φάρμακα και η ιοντίζουσα ακτινοβολία. Η δράση των φαρμάκων σχετίζεται με τη δόση τους και η βαρύτητα της απλαστικής αναιμίας εμφανίζει ατομική διακύμανση, ενώ συχνά η τοξική δράση στο μυελό αποκαθίσταται σε άλλο άλλοτε χρονικό διάστημα μετά τη διακοπή τους. Ενοχοποιούνται επίσης διάφορα εντομοκτόνα, αντιεπιληπτικά, αντιβιοτικά, μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα που η δράση τους στο μυελό δεν είναι συνήθως δοσοεξαρτώμενη. Κάθε μέρα αναφέρονται στη βιβλιογραφία καινούργιες ουσίες που ενοχοποιούνται για την πρόκληση περιπτώσεων απλαστικής αναιμίας. Β) Ακτινοβολία Η εμφάνιση απλαστικής αναιμίας αποτελεί την κυριότερη τοξική δράση της έντονης ακτινοβόλησης (π.χ μετά πυρηνικά ατυχήματα), ενώ αντίθετα για την εμφάνιση απλαστικής αναιμίας δεν έχει αποδειχθεί πως ευθύνεται η έκθεση σε μικρές δόσεις ακτινοβολίας (π.χ. επαγγελματική). Γ) Λοιμώξεις από ιούς Αν και κατά τη διάρκεια των ιογενών λοιμώξεων είναι συχνή η εμφάνιση παροδικής καταστολής του μυελού (ιδίως της κοκκιώδους και της μεγακαρυοκυτταρικής σειράς), εντούτοις οι απλαστικές αναιμίες λοιμώδους αρχής φαίνεται να είναι σπάνιες. Αρκετοί ιοί μπορεί να είναι άμεσα ή έμμεσα κυτταροτοξικοί (μέσω ανοσολογικής απάντησης) για τα μυελικά κύτταρα. Ο ιός μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα είτε άμεση προσβολή και καταστροφή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων είτε έμμεση βλάβη μέσω των διεγερμένων Τ λεμφοκυττάρων και των παραγόμενων κυτταροκινών, με αποτέλεσμα αδυναμία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησής τους. Ο παρβοϊός Β19 συνδέται με την εμφάνιση αμιγούς απλασίας της ερυθράς σειράς αλλά σπάνια ευθύνεται για την εμφάνιση απλαστικής αναιμίας. Η απλαστική αναιμία μετά από ηπατίτιδα είναι η πιο συχνή και καλά περιγραφείσα επιπλοκή της λοίμωξης από τους ιούς αυτής της ομάδας. Ο ακριβής τύπος του ιού που προκαλεί την απλαστική αναιμία δεν έχει διευκρινισθεί (non-a, non-b, non-c). Ο ακριβής μηχανισμός πρόκλησης της απλαστικής αναιμίας μετά από ηπατίτιδα δεν είναι πλήρως γνωστός και ενοχοποιούνται η άμεση προσβολή 15
των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων από τον ιό, η προσβολή του μικροπεριβάλλοντος του μυελού, η εμφάνιση κάποιας αυτοάνοσης διαταραχής ως απάντηση στην ιογενή λοίμωξη (βλάβη των Τ λεμφοκυττάρων, αύξηση των κατασταλτικών Τ λεμφοκυττάρων και κυτταροτοξική απάντηση στη λοίμωξη από τον ιό), η διαταραχή της φυσιολογικής ανάπτυξης του μυελού ή και η αναστολή της ανάπτυξης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων λόγω της υπερπαραγωγής ιντερφερόνης γ ή άλλων κυτταροκινών. Το ίδιο αποτέλεσμα μπορεί να έχουν και άλλες ιογενείς λοιμώξεις (π.χ. ιός Epstein-Barr). Δ) Άλλες λοιμώξεις Σπάνια, απλαστική αναιμία μπορεί να συνοδεύσει τη φυματίωση, τη σαλμονέλλωση, τη βρουκέλλωση, την ιστοπλάσμωση κ.α. Ε) Εγκυμοσύνη Ο συνδυασμός ήπιας ή βαριάς απλαστικής αναιμίας με εγκυμοσύνη είναι αρκετά σπάνιος. Πιστεύεται πως ορμονικοί, ανοσολογικοί ή και λοιμώδεις μηχανισμοί πιθανά ευθύνονται για την εμφάνισή της. ΣΤ) Κληρονομικές απλαστικές αναιμίες Το 25% των περιπτώσεων απλαστικής αναιμίας στα παιδιά φαίνεται να έχουν κάποια υποκείμενη γενετική διαταραχή, ενώ στους ενήλικες αυτό αποτελεί το 10% των περιπτώσεων. Ο πιο χαρακτηριστικός τύπος είναι η αναιμία Fanconi, μια νόσος που μεταβιβάζεται με τον αυτοσωματικό υπολειπόμενο χαρακτήρα. Η νόσος χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση μιας ή περισσοτέρων διαμαρτιών διάπλασης, συχνά ψυχοκινητική καθυστέρηση, εμφάνιση καφέ κηλίδων ή διάχυτης μελανοδερμίας. Το πιο χαρακτηριστικό και ενδιαφέρον εύρημα της νόσου είναι η ύπαρξη διαφόρων χρωμοσωμικών διαταραχών, όπως η αύξηση των ρήξεων και η δημιουργία αναδιατάξεων στα χρωμοσώματα. 16
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΑΠΛΑΣΤΙΚΗΣ ΑΝΑΙΜΙΑΣ Η φυσιολογική αιμοποίηση λαμβάνει χώρα στο μυελό των οστών και είναι αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης μεταξύ των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (stem cells) και του μικροπεριβάλλοντος του μυελού. Το μικροπεριβάλλον αποτελείται από κύτταρα του στρώματος όπως ινοβλάστες, μακροφάγα, ενδοθηλιακά κύτταρα και λιποκύτταρα και από τα προϊόντα τους που είναι οι διάφορες λεμφοκίνες καθώς και την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Τα παραπάνω κύτταρα ρυθμίζουν την αιμοποίηση τόσο άμεσα όσο και έμμεσα είτε με την επίδραση αυξητικών παραγόντων στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα είτε μέσω αναστολής τους με την μεσολάβηση κατασταλτικών, αρνητικά δρώντων παραγόντων. Στην απλαστική αναιμία οι πιθανοί παθογενετικοί μηχανισμοί αφορούν: α) στην σημαντική μείωση ή απουσία των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, β) στο παθολογικό μικροπεριβάλλον του μυελού, γ) στην καταστολή της φυσιολογικής αιμοποίησης από κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος (μακροφάγα, λεμφοκύτταρα, δενδριτικά κα) ή δ) σε συνδυασμό των ανωτέρω. Κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα προτείνουν ότι το ανοσολογικό σύστημα και ειδικά τα T λεμφοκύτταρα έχουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της ΑA (Young et al, 1997a; Young et al, 2000). Υψηλά ποσοστά υφέσεων σε κλινικές μελέτες μετά θεραπεία με συνδυασμό ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, όπως η αντιλεμφοκυτταρική (ALG) ή αντιθυμοκυτταρική (ATG) σφαιρίνη και κυκλοσπορίνη, έχουν ισχυρά προτείνει τον σημαντικό ρόλο του ανοσολογικού συστήματος στην παθοφυσιολογία της απλαστικής αναιμίας (Marsh et al, 1995; Rosenfeld et al, 1995; Bacigalupo et al, 1995; Young et al, 1995). Οι ακριβείς μηχανισμοί που εμπλέκονται στην παθογένεια της AA δεν είναι ακόμη πλήρως διευκρινισμένοι. 17
2.1 ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΤΩΝ ΑΡΧΕΓΟΝΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (STEM CELLS) 2.1.1ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΑ ΑΡΧΕΓΟΝΑ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ 2.1.1.1 Ορισμοί Η ανάγκη συνεχούς αντικατάστασης των ώριμων κυττάρων του αίματος απαιτεί την παραγωγή καθημερινά περίπου 10 11 νέων κυττάρων σε έναν φυσιολογικό ενήλικα και ακόμη βέβαια περισσότερο σε stress αιμοποίησης. Είναι γνωστό πως όλα αυτά τα κύτταρα προέρχονται από ένα κοινό πρόγονο, που είναι γνωστό ως πολυδύναμο αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο (pluripotential stem cell). Τα συνήθη αποδεκτά χαρακτηριστικά των stem cells είναι: α) η μεγάλη ικανότητα πολλαπλασιασμού (proliferation), β) η ικανότητα τους για διαφοροποίηση (differentiation) ώστε να δημιουργήσουν ώριμα κύτταρα όλων των λεμφοποιητικών σειρών και γ) η ικανότητά τους για αυτοανανέωση (self-renewal), δηλαδή η ικανότητά τους να παράγουν νέα stem cells (Metcalf et al 1988; Lajtha et al 1983). 2.1.1.2 Ρύθμιση Τα stem cells αποτελούν ένα πολύ μικρό ποσοστό (0.01-0.05%) του συνόλου των κυττάρων του μυελού. Τουλάχιστον 95% των αιμοποιητικών κυττάρων είναι μορφολογικά αναγνωρίσιμα κύτταρα. Τα υπόλοιπα, με μη ειδικά μορφολογικά χαρακτηριστικά, απαιτούν φαινοτυπικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό και περιλαμβάνουν όχι μόνο τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (stem cells), αλλά και τους άμεσους απογόνους τους, τα προγονικά κύτταρα (progenitor cells), τα οποία αρχικά χαρακτηρίσθηκαν από την ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται in vitro σαν απάντηση σε αυξητικούς παράγοντες (colony-stimulating factors, CSF) (Metcalf et al 1988). Τα περισσότερα από τα πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα βρίσκονται σε φάση ηρεμίας (G0). Σε περίπτωση εξάντλησης του διαμερίσματος, τα αρχέγονα κύτταρα έχουν την ικανότητα, υπό την επίδραση 18
τοπικών παραγόντων, να εισέλθουν σε κυτταρικό κύκλο και έτσι να πολλαπλασιαστούν. Σε περιπτώσεις μεγάλης καταστροφής και όταν το διαμέρισμα μειωθεί κάτω από το 10% του φυσιολογικού, υπό φυσιολογικές συνθήκες εμφανίζεται μια παροδική αναστολή της διαφοροποίησης, μέχρις ότου το διαμέρισμα ανασυσταθεί με τους μηχανισμούς αυτοανανέωσης. Στην περίπτωση της ΑΑ, είναι ενδιαφέρον να υποθέσουμε ότι σε μερικές περιπτώσεις οι «προστατευτικοί μηχανισμοί» που θα έπρεπε να προστατέψουν τα αρχέγονα κύτταρα από εξάντληση είναι ελαττωματικοί. Έτσι, τα πολυδύναμα κύτταρα δεν αντιλαμβάνονται πιθανώς το αρχικό ερέθισμα και συνεχίζουν τη διαφοροποίηση, με αποτέλεσμα μείωση του αριθμού τους μέχρι εξαφάνισης. Καθώς τα αρχέγονα κύτταρα αλληλεπιδρούν με το στρώμα του μυελού, είναι γενικά αποδεκτό ότι αυτά τα στρωματικά κύτταρα παράγουν έναν μεγάλο αριθμό ρυθμιστικών κυτταροκινών, που περιλαμβάνουν διεγερτικά της αιμοποίησης μόρια, όπως η ιντερλευκίνη 1 (IL-1), ο αυξητικός παράγοντας των μακροφάγων (M-CSF), ο αυξητικός παράγοντας των κοκκιοκυττάρωνμακροφάγων (GM-CSF), ο αυξητικός παράγοντας των κοκκιοκυττάρων (G- CSF), η ιντερλευκίνη 6 (IL-6) και ο stem cell factor (SCF), καθώς και ανασταλτικές κυτταροκίνες όπως transforming growth factor b (TGF b) και macrophage-inflammatory protein 1a (MIP 1a) (Lord et al 1997). Εντούτοις, δεν είναι γνωστό αν αυτά τα μόρια έχουν κάποιο ρόλο στην διαφοροποίηση των stem cells. Μερικά φαίνεται πως πράγματι παίζουν κάποιο ρόλο, τουλάχιστον in vitro, στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό τους (Fairbairn et al 1993). Καθώς ο αιμοποιητικός ιστός είναι ένα συνεχές σύνολο από διαφοροποιούμενα και πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, τα όρια ανάμεσα στους πρώιμους κυτταρικούς πληθυσμούς δεν είναι καλά αποσαφηνισμένα. Εντούτοις, είναι γενικά παραδεκτό ότι ή δέσμευση (commitment), δηλαδή η απόφαση να εισέλθει ένα κύτταρο σε μια συγκεκριμένη σειρά διαφοροποίησης, η οποία φαίνεται να μη είναι αναστρέψιμη, διακρίνει τα αρχέγονα από τα προγονικά κύτταρα. Λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη διαδικασία δέσμευσης 19
και προς το παρόν δεν είναι σαφές αν η διαδικασία αυτή είναι ένα εσωτερικό γεγονός του κυττάρου ή είναι μια απάντηση σε εξωτερικά ερεθίσματα του περιβάλλοντος (Jimener et al 1992; Ogawa et al 1993). Αυτές οι υποθέσεις είναι σημαντικές στην κατανόηση της ΑΑ, καθώς τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα τα οποία πρέπει να παράσχουν ώριμα λειτουργικά κύτταρα για ολόκληρη τη ζωή, πρέπει να προστατευτούν από τις απαιτήσεις για ώριμα κύτταρα ως απάντηση σε φυσιολογικές ή παθολογικές ανάγκες. Η γρήγορη απάντηση του αιμοποιητικού ιστού ικανοποιείται από πιο ώριμα, δεσμευμένα προς διαφοροποίηση πρόδρομα κύτταρα όπως για παράδειγμα τα BFU-E κύτταρα (burst-forming unit; erythroid) ως απάντηση στην υποξία ή την απώλεια αίματος ή τα granulocyte/macrophage colony-forming κύτταρα (GM- CFC) ως απάντηση σε λοίμωξη. Αυτά τα κύτταρα καθώς και ισοδύναμοι κυτταρικοί πληθυσμοί άλλων σειρών, ελέγχονται από αυξητικούς παράγοντες (growth factors). 2.1.1.3 Πειραματικά μοντέλα μελέτης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Ενώ οι καλλιέργειες ανιχνεύουν κυρίως τα προγονικά κύτταρα, πειράματα μεταμόσχευσης προσδιορίζουν τα stem cells από τη λειτουργία τους π.χ την ικανότητά τους να επαναπληθυσμοποιούν μόνιμα τον αιμοποιητικό ιστό. Σήμερα, τα πιο πρώιμα ανθρώπινα κύτταρα που μπορούν να καλλιεργηθούν in vitro είναι τα κύτταρα έναρξης των καλλιεργειών μακράς διάρκειας (long-term culture-initiating cells, LTC-IC). Τα κύτταρα αυτά έχουν χαρακτηριστικά stem cell, αλλά δεν είναι ακόμη γνωστό κατά πόσο σχετίζονται με τα ανθρώπινα stem cells. Αρκετά μοντέλα ζώων έχουν αναπτυχθεί για μελέτες μεταμόσχευσης. Ακτινοβοληθέντα με ημιθανατηφόρα δόση ακτινοβολίας μη παχύσαρκα διαβητικά (nonobese diabetic, NOD/SCID) ποντίκια, με σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια, χρησιμοποιήθηκαν για να ελεγχθεί η εγκατάσταση και το δυναμικό επαναπληθυσμοποίησης ανθρώπινων stem-cells. Τεχνικές περιορισμένης αραίωσης (limiting dilution) δείχνουν ότι η συχνότητα ενός κυττάρου ικανού για επαναπληθυσμοποίση 20
NOD/SCID ποντικού είναι 1 στα 10 6 μονοπύρηνα ομφαλίου λώρου, ενώ το 1 στα 3x10 3-10 4 μονοπύρηνα κύτταρα ήταν LTC-IC. Καθαρά, τα ανθρώπινα κύτταρα ικανά για επαναπληθυσμοποίηση (human repopulating cells) όπως εκτιμώνται με το μοντέλο NOD/SCID, φαίνεται να είναι πιο αρχέγονα από τα ανθρώπινα LTC-IC (Pettengelet al 1994). Από την άλλη μεριά, ποντίκια ακτινοβοληθέντα με δυνητικά θανατηφόρα δόση ακτινοβολίας, μπορεί να διασωθούν με 5x10 4 ως 10 5 μυελικά κύτταρα (Lord et al 1997). Δεν είναι ξεκάθαρο αν οι μεγάλοι αριθμοί ανθρώπινων κυττάρων που απαιτούνται για τη διάσωση ακτινοβοληθέντων ποντικών οφείλεται στο ότι υπάρχουν λιγότερα stem cells στους ανθρώπους από ότι στα ποντίκια. Οι κλωνογόνες in vitro μέθοδοι ανιχνεύουν κυρίως προγονικά κύτταρα, τα οποία είναι πιο ώριμα από τα stem cells. 2.1.1.4 Επιλογή των αρχέγονων κυττάρων με βάση το φαινότυπο Υπάρχουν διαφορές των πιο πρώιμων κυττάρων από τα πιο ώριμα προγονικά κύτταρα. Τα πρώτα έχουν συγκεκριμένους μεμβρανικούς δείκτες και επίσης χαρακτηρίζονται από χαμηλή μεταβολική δραστηριότητα. Το δεύτερο χαρακτηριστικό επιτρέπει στα πρώιμα κύτταρα να διαχωρισθούν με αρνητική επιλογή, χρησιμοποιώντας χρωστικές όπως η rhodamine-123 η οποία συγκεντρώνεται σε ενεργά μιτοχόνδρια ή χρωστικές νουκλεϊκών οξέων όπως Hoechst 33342 (Spangrude et al 1994; Ratajczak and Gerwitz 1995). Ένας από τους πιο χρήσιμους μεμβρανικούς δείκτες για την επιλογή των αρχέγονων κυττάρων είναι το αντιγόνο CD34. Aυτό το χαρακτηριστικό έχει χρησιμοποιηθεί σε έναν αριθμό διαφορετικών τρόπων θετικής επιλογής (de Wynter et al 1995). Εντούτοις, τα κύτταρα που είναι CD34+ περιλαμβάνουν έναν ευρύ πληθυσμό, που περιλαμβανει stem cells, προγονικά κύτταρα και πιο διαφοροποιημένα αιμοποιητικά κύτταρα. Στην πραγματικότητα, μόνο 0.1-1% των CD34+ κυττάρων έχουν τον πιο αρχέγονο φαινότυπο, ενώ περίπου 10-30% είναι προγονικά κύτταρα και τα υπόλοιπα είναι πιο διαφοροποιημένα κύτταρα. 21
2.1.2 ΑΡΧΕΓΟΝΑ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (STEM CELLS) ΣΤΗΝ ΑΠΛΑΣΤΙΚΗ ΑΝΑΙΜΙΑ 2.1.2.1 Λειτουργική εκτίμηση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων στην AA Βιβλιογραφικά δεδομένα δείχνουν ότι στην απλαστική αναιμία στον άνθρωπο, υπάρχει σημαντική μείωση ή και πλήρης εξαφάνιση στο αίμα και στο μυελό των προγονικών κυττάρων της κοκκιώδους, της ερυθράς και της μεγακαρυοκυτταρικής σειράς. Κλινική απόδειξη του ποσοτικού ελλείμματος και της μείωσης της δεξαμενής των αρχέγονων κυττάρων αποτελεί η αποκατάσταση και φυσιολογική λειτουργία και των τριών κυτταρικών σειρών μετά επιτυχή αλλογενή μεταμόσχευση μυελού και η αποκατάσταση της απλασίας στο 50% περίπου με ομοιογονιδιακή μεταμόσχευση χωρίς προηγούμενη χορήγηση ανοσοκαταστολής. Η πλήρης απουσία των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων είναι μάλλον απίθανη, αφού σε αρκετές περιπτώσεις εμφανίζεται αιματολογική ανταπόκριση με τη χορήγηση ανοσοκατασταλτικής αγωγής. Τούτο δείχνει ότι πιθανότατα υπάρχει ένας πληθυσμός αρχέγονων κυττάρων που μπορεί να διεγερθεί και που έχει την ικανότητα να αποκαταστήσει την φυσιολογική αιμοποίηση. Χωρίς αμφιβολία υπάρχει βέβαια πολύ μεγάλη ελάττωση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, όπως φαίνεται από την σημαντική μείωση τόσο των CD34+ κυττάρων όσο και των δεσμευμένων κυττάρων για τις διάφορες μυελικές σειρές τόσο στο αίμα όσο και στο μυελό των αρρώστων. Αρχικές εργασίες από τα τέλη της δεκαετίας του 70, με καλλλιέργειες ολικών μονοπύρηνων κυττάρων μυελού με διάφορα καλλιεργητικά μέσα σαν πηγή διέγερσης, έδειξαν μείωση ή απουσία των όψιμων και πρώιμων αποικιών σε ασθενείς με ΑA (Barret et al 1979; Kern et al 1977; Dexter et al, 1977; Hara et al 1980). Παρόλο που υπήρχε ποικιλία στον αριθμό των αποικιών ανάμεσα σε διάφορους ασθενείς, δεν υπήρχε συσχέτιση ανάμεσα στην δραστηριότητα της νόσου όσον αφορά τον αριθμό των ουδετερόφιλων του περιφερικού αίματος και στα πρόδρομα κύτταρα μυελού της μυελικής σειράς. Ο αριθμός 22
των αποικιών περιφερικού αίματος ήταν τουλάχιστον 10 φορές λιγότερος από τις αποικίες του μυελού και συχνά ήταν μη ανιχνεύσιμος. Πιο πρόσφατες μελέτες χρησιμοποιώντας καθαρά CD34+ αιμοποιητικά κύτταρα και ανασυνδυασμένους αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες σε κλωνογόνες καλλιέργειες επιβεβαίωσαν τους μειωμένους αριθμούς όλων των προγονικών κυττάρων του μυελού (Marsh et al 1991; Maciejewski et al 1994a, 1996, 2000; Schrezenmeier et al, 1994; Scopes et al 1996). Το σύστημα καλλιεργειών μακράς διάρκειας (LTBMC) έχει χρησιμοποιηθεί από διάφορες ομάδες για να εκτιμηθούν τα πιο πρώιμα στάδια της αιμοποίησης και η ικανότητά τους να σχηματίσουν φυσιολογικό στρώμα, που είναι η in vitro εκπροσώπηση του μυελικού μικροπεριβάλλοντος. Όλες οι μελέτες σε ασθενείς με AA έχουν δείξει σημαντική ανεπάρκεια στην αιμοποίηση, που εκδηλώνεται με σοβαρή μείωση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων μέσα στο σύστημα (Bacigalupo et al 1992; Gibson and Gordon-Smith 1990; Holnberg et al 1994; Marsh et al 1990, 1996). Παρόμοια αποτελέσματα φάνηκαν τόσο σε ασθενείς χωρίς θεραπεία, είτε με σοβαρή είτε μη σοβαρή νόσο, όσο και σε ασθενείς που έχουν θεραπευθεί και απάντησαν αιματολογικά σε ανοσοκατασταλτική θεραπεία (Marsh et al 1990). Ο σχηματισμός του στρώματος είναι φυσιολογικός στους περισσότερους ασθενείς με AA (Gibson and Gordon-Smith 1990; Marsh et al 1991), παρόλο που μια μελέτη έδειξε αδυναμία σχηματισμού στρώματος σε σχεδόν μισούς ασθενείς, και αυτό συνδεόταν με μεγαλύτερη διάρκεια νόσου (Holmberg et al 1994). Η βλάβη στην αιμοποίηση που φαίνεται στις LTBMC μπορεί να αντανακλά είτε αποτυχία του διαμερίσματος των stem cells με ανεπάρκεια των αρχέγονων κυττάρων για ικανότητα επαναπληθυσμοποίησης του μυελού, ή δυσλειτουργικό μικροπεριβάλλον. Διασταυρούμενα (cross-over) πειράματα LTBMC επιτρέπουν ξεχωριστό έλεγχο των δύο διαμερισμάτων. Χρησιμοποιώντας μονοπύρηνα κύτταρα από ασθενείς με ΑΑ, μια ομάδα έδειξε ελαττωματική δημιουργία των CFU-GM όταν τα κύτταρα τοποθετούνταν σε φυσιολογικά ακτινοβολημένα LTBMC στρώματα. Αντίθετα, φυσιολογική λειτουργία του στρώματος σε ασθενείς με ΑΑ φάνηκε με φυσιολογικούς 23