Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος από εμβρυικά κύτταρα και ελεύθερο εμβρυικό DNA στη μητρική κυκλοφορία

ΥΠΕΡΗΧΟΓΡΑΦΙΑ ΤΟΜ.12, ΤΕΥΧ.1, ΣΕΛ. 35-40, 2015 Μαύρου Αριάδνη Καθηγήτρια Γενετικής Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος από εμβρυικά κύτταρα και ελεύθερο εμβρυικό DNA στη μητρική κυκλοφορία Εισήγηση στο 1ο Συμπόσιο Αντιπαραθέσεων στη Μαιευτική Αθήνα, 29-30 Μαρτίου 2014 Περίληψη Αλληλογραφία: Αριάδνη Μαύρου Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο, Νοσοκομείο Παίδων Αγία Σοφία, Αθήνα 11527 e-mail: amavrou@med.uoa.gr Κατατέθηκε 01.02.2015 Έγινε δεκτή 20.03.2015 Η ύπαρξη εμβρυικών κυττάρων και ελεύθερου εμβρυικού DNA (cffdna) στη μητρική κυκλοφορία κατά τη διάρκεια της κύησης επηρέασε σημαντικά τον τομέα της προγεννητικής διάγνωσης και έδωσε τη δυνατότητα ανάπτυξης μη επεμβατικών τεχνικών προγεννητικού ελέγχου. Οι προσπάθειες αξιοποίησης των εμβρυικών κυττάρων προς το παρόν δεν είναι επιτυχείς λόγω της σπανιότητας τους και της έλλειψης ειδικών αντιγόνων που να τα διαχωρίζουν από τα μητρικά. Αντιθέτως το cffd- NA μπορεί να αξιοποιηθεί στην κλινική πράξη για μη επεμβατικό προγεννητικό έλεγχο του φύλου του εμβρύου, σε περιπτώσεις φυλοσύνδετων νοσημάτων, του Rhesus του εμβρύου και ορισμένων μονογονιδιακών νοσημάτων που κληρονομούνται με αυτοσωματικό επικρατητικό τρόπο, όταν η μετάλλαξη είναι de novo ή πατρικής προέλευσης Μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος χρωμοσωμικών ανωμαλιών είναι εφικτός με συστήματα αλληλούχησης νέας γενιάς (NGS). Εφαρμόζεται σε διαγνωστικό επίπεδο από εμπορικές εταιρείες για ανίχνευση των συχνότερων αριθμητικών ανωμαλιών (τρισωμίες 21, 13, 18, Χ, Υ) με αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα, κυρίως για την τρισωμία 21 για την οποία αναφέρεται επιτυχής ανίχνευση παθολογικών εμβρύων σε ποσοστό που ξεπερνά το 99%. Παρ όλον ότι ο μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος χρωμοσωμικών ανωμαλιών του εμβρύου είναι αποδεκτός από τις μέλλουσες μητέρες και τους γιατρούς, με τα σημερινά 35

Μη επεμβατικός Προγεννητικός Έλεγχος Μαύρου Α. δεδομένα μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για πληθυσμιακό έλεγχο και τυχόν θετικό αποτέλεσμα πρέπει να επιβεβαιώνεται με καρυοτύπο του εμβρύου μετά από αμνιοπαρακέντηση ή βιοψία τροφοβλάστης. Λέξεις - κλειδιά: εμβρυικά κύτταρα, μητρική κυκλοφορία, ελεύθερο εμβρυικό DNA, μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος, Rhesus D, χρωμοσωμικές ανωμαλίες του εμβρύου Εισαγωγή Ο προγεννητικός έλεγχος αποτελεί σήμερα απαραίτητο τμήμα της καθημερινής μαιευτικής πράξης. Για την πραγματοποίηση του, όμως, απαιτείται ανάλυση γενετικού υλικού του εμβρύου που λαμβάνεται με επεμβατικές μεθόδους όπως η αμνιοπαρακέντηση ή η βιοψία τροφοβλάστης. Λόγω του μικρού μεν αλλά υπαρκτού κινδύνου αποβολής τα τελευταία χρόνια έχουν αναζητηθεί εναλλακτικοί μη επεμβατικοί τρόποι λήψης εμβρυικού δείγματος. Η ύπαρξη εμβρυικών κυττάρων στη μητρική κυκλοφορία ήταν για πολλά χρόνια γνωστή αλλά οι συστηματικές προσπάθειες για την απομόνωσή τους ξεκίνησαν τη δεκαετία του 1990, μετά την ανάπτυξη των νέων τεχνικών μοριακής βιολογίας. Το ενδιαφέρον εντοπίστηκε από την αρχή στην απομόνωση και μελέτη των εμπύρηνων ερυθροκυττάρων (NRBC), επειδή αφθονούν το 1ο τρίμηνο της κύησης στο εμβρυϊκό αίμα, ενώ σπανίζουν στην κυκλοφορία των φυσιολογικών ενηλίκων. Επειδή έχουν μικρό χρόνο ζωής αφορούν πάντα την παρούσα κύηση. Για την απομόνωση και εμπλουτισμό χρησιμοποιούνται τεχνικές όπως η κυτταρομετρία ροής, ο μαγνητικός διαχωρισμός και η αποκόλληση ενός μόνο κυττάρου. Εν συνεχεία η μελέτη γίνεται με την τεχνική του φθορίζοντος in situ υβριδισμού (FISH), για τις συχνότερες αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες και PCR για τη μελέτη μονογονιδιακών νοσημάτων. Η σπανιότητα τους (στις φυσιολογικές κυήσεις υπολογίζεται ότι αντιστοιχεί 1 εμβρυικό κύτταρο ανά 106 μητρικά κύτταρα) και η έλλειψη ειδικών αντιγόνων που να τα ξεχωρίζουν από τα χιλιάδες μητρικά που τα περιβάλλουν αποτελούν τα πιο σοβαρά και ανυπέρβλητα προς το παρόν προβλήματα (εικόνα 1). Από το 1997 οι προσπάθειες των ερευνητών έχουν στραφεί προς την απομόνωση και αξιοποίηση του ελεύθερου εξωκυτταρικού DNA (cfdna) που βρίσκεται στο πλάσμα των εγκύων κατά τη διάρκεια της κύησης. Σύμφωνα με πρόσφατα δεδομένα το εμβρυικό DNA (cffdna) αντιπροσωπεύει το 10-19% του ολικού ελεύθερου DNA στη μητρική κυκλοφορία. Αποτελείται κυρίως από μικρά θραύσματα DNA μεγέθους <300bp και προέρχεται από απόπτωση και νέκρωση συγκυτιοτροφοβλαστικών κυττάρων του πλακούντα. Ανιχνεύεται από την 18η ημέρα της κύησης, αυξάνεται με την πρόοδο της κύησης και εξαφανίζεται αμέσως μετά τον τοκετό. Τα χαμηλά επίπεδα του cffdna απαιτούν πολύ ευαίσθητη τεχνολογία για έγκυρη ανίχνευση και ανάλυση του εμβρυικού δείγματος. Η δυσκολία πραγματοποίησης μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου από cffdna στη μητρική κυκλοφορία οφείλεται αφ ενός στη μικρή ποσότητα στο πλάσμα της εγκύου, το μικρό ποσοστό σε σχέση με το μητρικό cfdna και τις ατομικές διαφορές στη συνολική συγκέντρωση cfdna στο πλάσμα και αφ ετέρου στις ομοιότητες που παρουσιάζει το εμβρυϊκό με το μητρικό γενετικό υλικό, εφόσον το έμβρυο κληρονομεί το μισό γενετικό υλικό από τη μητέρα του. Σήμερα η κλινική αξιοποίηση της μεθόδου αφορά κυρίως τον προσδιορισμό του Rhesus D του εμβρύου όταν η μητέρα είναι RhD αρνητική και το έμβρυο μπορεί να είναι RhD θετικό, με κίνδυνο για αιμολυτική νόσο του νεογνού και του φύλου του εμβρύου σε περίπτωση φυλοσύνδετου νοσήματος. Ελλειψη ολόκληρου του RhD γονιδίου ευθύνεται για όλους σχεδόν του αρνητικούς φαινοτύπους στους Ευρωπαίους (εικόνα 2). Για τον λόγο αυτό οι τεχνικές μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου που έχουν αναπτυχθεί βασίζονται στον έλεγχο της παρουσίας ή όχι του γονιδίου αυτού και καταλληλό- Εικόνα 1: Εμβρυικό εμπύρηνο ερυθροκύτταρο, από έμβρυο αγόρι στο περιφερικό αίμα εγκύου 36

ΥΠΕΡΗΧΟΓΡΑΦΙΑ ΤΟΜ.12, ΤΕΥΧ.1, ΣΕΛ. 35-40, 2015 Εικόνα 2: Σύμπλεγμα των γονιδίων Rh στην άκρη των βραχέων σκελών του χρωμοσώματος #1 τερα για ανίχνευση θεωρούνται τα εξώνια 7 και 10. Ο προσδιορισμός του RhD του εμβρύου από ελεύθερο εμβρυικό DNA ξεκίνησε επισήμως στην Ευρώπη το 2001. Μετά από μελέτη μεγάλου αριθμού δειγμάτων προσδιορίστηκε ότι τυχόν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα οφείλονται στην μη cffdna στο δείγμα, είτε επειδή ήταν πολύ νωρίς στην κύηση, είτε από λάθος τεχνική κατά την απομόνωση. Το πρόβλημα αντιμετωπίστηκε με την ενσωμάτωση στο PCR αλληλουχιών του χρωμοσώματος Υ ή ενός επιγενετικού δείκτη, όπως το RASSF1A, με διαφορετική μεθυλίωση μεταξύ μητέρας και πλακούντα, ως εσωτερικά κοντρόλ για επιβεβαίωση της ύπαρξης εμβρυικού DNA στο υπό μελέτη δείγμα. Με τον ίδιο τρόπο το ελεύθερο DNA στη μητρική κυκλοφορία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του φύλου του εμβρύου σε περίπτωση φυλοσύνδετου νοσήματος, ή αμφίβολων έξω γεννητικών οργάνων. Επίσης σε περιπτώσεις συγγενούς υπερπλασίας των επινεφριδίων η γνώση του φύλου του εμβρύου εντοπίζει εγκαίρως τις εγκύους που πρέπει να λάβουν στεροειδή για αποφυγή αρρενοποίησης των θήλεων εμβρύων. Ο μη επεμβατικός προσδιορισμός του φύλου του εμβρύου έχει σήμερα ενσωματωθεί στην κλινική πράξη σε πολλές Ευρωπαικές χώρες Όσον αφορά τα μονογονιδιακά νοσήματα που μεταβιβάζονται με επικρατούσα κληρονομικότητα, ο προγεννητικός έλεγχος στηρίζεται στην ανίχνευση της πατρικής μετάλλαξης στο πλάσμα της εγκύου με τεχνικές PCR. Εχει ήδη κλινική εφαρμογή σε συγκεκριμένα εργαστήρια διεθνώς για τον μη επεμβατικό έλεγχο της νόσου Huntington, της αχονδροπλασίας, του συνδρόμου Appert και της μυοτονικής δυστροφίας. Για τα υπολειπόμενα νοσήματα που κληρονομούνται με υπολειπόμενο αυτοσωματικό τρόπο ο μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος είναι εφικτός όταν οι γονείς είναι φορείς διαφορετικών μεταλλάξεων και το έμβρυο πιθανός διπλός ετεροζυγώτης. Στην περίπτωση αυτή, εάν δεν ανιχνευτεί η πατρική μετάλλαξη, μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα εμφάνισης της νόσου, με αποτέλεσμα την ελάττωση του αριθμού των εγκύων που παραπέμπονται για επεμβατικό προγεννητικό έλεγχο. Αναφέρεται εφαρμογή της τεχνικής σε περιπτώσεις ινοκυστικής νόσου, συγγενούς υπερπλασίας των επινεφριδίων, Μεσογειακής και δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Η πραγματοποίηση μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου για χρωμοσωμικές ανωμαλίες, κυρίως της τρισωμίας 21, είναι πολύ πιο δύσκολη. Oι αρχικές προσπάθειες αφορούσαν την αξιοποίηση 37

Μη επεμβατικός Προγεννητικός Έλεγχος Μαύρου Α. Εικόνα 3: Ανίχνευση τρισωμίας 21 με συστήματα αλληλούχισης νέας γενιάς πολυμορφισμών (SNPs) στο ελεύθερο mrna που προέρχεται από τον πλακούντα. Ο σοβαρότερος περιορισμός αφορά την ανάγκη ανεύρεσης πληροφοριακών SNPs, και είναι προτιμότερο ο προγεννητικός έλεγχος να μη στηρίζεται στην ύπαρξη γενετικών πολυμορφισμών, επειδή περιορίζεται μόνο σε ετερόζυγα έμβρυα. Επίσης το RNA είναι πολύ ευαίσθητο και χρειάζεται ειδικό τρόπο και συνθήκες μεταφοράς και αποθήκευσης. Ψηφιακό PCR, δηλαδή πολλαπλά PCR σε αραιές διαλύσεις νουκλεικών οξέων, τόσο αραιές που μπορεί να αφορούν ένα μόνο κύτταρο, επιτρέπει τη μελέτη ενός μόνο κυττάρου. Η τεχνική έχει εφαρμοστεί για ποσοτικοποίηση των νουκλεικών οξέων στο μητρικό αίμα. Θεωρητικά, ακόμη και για μικρές συγκεντρώσεις εμβρυϊκού DNA το έμβρυο με τρισωμία 21 συνεισφέρει μία επιπλέον δόση αλληλουχιών χρωμοσώματος 21 στη μητρική κυκλοφορία. Διαφορετική προσέγγιση αποτελεί ο ποσοτικός προσδιορισμός περιοχών του γονιδιώματος με διαφορετικό πρότυπο μεθυλίωσης μεταξύ πλακούντα και περιφερικού αίματος (DMR). Μετά από ποσοτικό προσδιορισμό για εμπλουτισμό του δείγματος σε DMR με ανοσοκατακρύμνηση, αναφέρεται επιτυχής διάγνωση εμβρύων με τρισωμία 21. Πρόσφατα, η τεχνική αλληλούχησης νέας γενιάς άλλαξε οριστικά το τοπίο του μη επεμβατικού ελέγχου χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Το 2008, δύο ανεξάρτητες μελέτες έδειξαν ότι η ανευπλοειδία του εμβρύου μπορεί να αναγνωριστεί με την αλληλούχηση και αντιστοίχηση μικρών θραυσμάτων DNA μεγέθους 36bp σε σχέση με DNA αναφοράς ολόκληρου του γονιδιώματος. Μπορεί να πραγματοποιηθεί με στοχευμένη αλληλούχιση συγκεκριμένων χρωμοσωμάτων ή χρωμοσωμικών περιοχών ή με μελέτη σημαντικού αριθμού SNPs στα υπό μελέτη χρωμοσώματα. Η ανάλυση συμπληρώνεται με επεξεργασία των δεδομένων με μεθόδους βιοπληροφορικής (εικόνα 3). Η πρόοδος που ακολούθησε ήταν ραγδαία. Από τον Ιανουάριο του 2011 τουλάχιστον δέκα ανεξάρτητες μεγάλες μελέτες έχουν δημοσιευτεί και αφορούν την ανίχνευση των τρισωμιών 21, 18, 13 και χρωμοσωμάτων του φύλου. Σε κλινικό επίπεδο προσφέρθηκε αρχικά στην Κίνα και την Αμερική και σήμερα υπάρχουν διεθνώς τουλάχιστον 4 εταιρείες που προσφέρουν την εξέταση. Δίνεται έμφαση στην κατάλληλη ενημέρωση των γονέων όσον αφορά το γεγονός ότι η μέθοδος δεν 38

ΥΠΕΡΗΧΟΓΡΑΦΙΑ ΤΟΜ.12, ΤΕΥΧ.1, ΣΕΛ. 35-40, 2015 είναι διαγνωστική, μπορεί όμως με μεγάλη ακρίβεια να εντοπίσει κυήσεις που πρέπει να ελεγχθούν με επεμβατικές μεθόδους. Σύμφωνα με στοιχεία από διάφορες μελέτες, σε μονήρεις κυήσεις μπορεί να ανιχνευτούν επιτυχώς 99% των εμβρύων με τρισωμία 21 με < 0.1% ψευδώς θετικά, για τις τρισωμίες 18 και 13 96.3% και 91% αντίστοιχα, ενώ η ανιχνευτική ικανότητα ανωμαλιών των χρωμοσωμάτων του φύλου είναι λίγο μικρότερη. Παρά την αναφερόμενη υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα του μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, έχουν παρατηρηθεί τόσο ψευδώς θετικά όσο και ψευδώς αρνητικά ευρήματα που οφείλονται σε μωσαικισμό που περιορίζεται στον πλακούντα, σε χαμηλό μωσαικό παθολογικού καρυοτύπου στη μητέρα, στην παρουσία δεύτερου κενού σάκου ή στην ύπαρξη νεοπλάσματος στη μητέρα. Για την πραγματοποίηση αξιόπιστης διάγνωσης είναι απαραίτητο το ποσοστό του cffdna στο δείγμα να είναι >4% του cfdna στη μητρική κυκλοφορία. Ο μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος από ελεύθερο εμβρυικό DNA στη μητρική κυκλοφορία με συστήματα αλληλούχησης νέας γενιάς έχει αρχίσει να ενσωματώνεται στον προγεννητικό έλεγχο ως μέθοδος πληθυσμιακού ελέγχου. Ως αποτέλεσμα προέκυψε η ανάγκη εκτίμησης των κλινικών, τεχνολογικών ηθικών και οικονομικών παραμέτρων από αρμόδιες επιστημονικές εταιρείες και φορείς. Μεγάλες επιστημονικές οργανώσεις όπως η Ιnternational Society for Prenatal Diagnosis, National Society of Genetic Counselors, American College of Obstetrics and Gynecology θεωρούν αξιόπιστη τη χρησιμοποίηση της μεθόδου για πληθυσμιακό προγεννητικό έλεγχο χρωμοσωμικών ανωμαλιών του εμβρύου τόσο για υψηλού, όσο και για χαμηλού κινδύνου κυήσεις, με απαραίτητη προϋπόθεση την κατάλληλη γενετική καθοδήγηση, πριν και μετά την αιμοληψία., με έμφαση στο υψηλό ποσοστό αποκλεισμού παθολογικού εμβρύου (>99%) και την ανάγκη επιβεβαίωσης των θετικών ευρημάτων με επεμβατικό ΠΕ. Οι επιστημονικές όμως και τεχνολογικές εξελίξεις, σε συνδυασμό με τον έντονο ανταγωνισμό μεταξύ των εταιρειών που δραστηριοποιούνται στο πεδίο αυτό οδηγούν σε συνεχείς προσθήκες και βελτιώσεις του μη επεμβατικού ελέγχου χρωμοσωμικών ανωμαλιών του εμβρύου. Νon-invasive prenatal diagnosis using fetal cells and cell free fetal DNA in maternal circulation Mavrou A. Professor of Genetics Correspondence: Mavrou A. Dep. of Genetics, Hospital Agia Sofia, Athens 11527 E-mail: amavrou@med.uoa.gr Summary KeyThe identification of fetal cells and cell free fetal DNA (cffdna) in maternal circulation during pregnancy has considerably changed the field of prenatal diagnosis, opening the way for non invasive prenatal testing. Although use of fetal cells is not as yet successful, cffdna is routinely used in clinical practice for the non invasive determination of the sex and RhD of the fetus, as well as for the diagnosis of dominantly inherited monogenic disorders caused by paternal or de novo mutations. Non invasive prenatal testing of fetal aneuploidy can be successfully achieved by next generation sequencing and is widely used by commercial companies for the detection of common numerical chromosome abnormalities ( trisomies 21, 18, 13, X, Y) with a high degree of sensitivity and specificity. For trisomy 21 in particular detection rate of abnormal fetuses is reported to be exceed 99%. Although non invasive prenatal testing of chromosome aneuploidies is widely accepted by women and the medical profession, it should be emphasized that for the time being it is considered as a screening method and any positive results should be confirmed by invasive testing through amniocentesis or CVS sampling. Key words: fetal cells, maternal circulation, cell free fetal DNA, noninvasive prenatal diagnosis, Rhesus D, fetal aneuploidy Βιβλιογραφία 1. Benn, P. Borrell, A. Cuckle H. et al : Prenatal detection of Down syndrome using massively parallel sequencing (MPS): A rapid response Statement from a Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis, Prenat Diagn, 32:1 2(2012) 2. Bianchi, DW., Platt, LD, Goldberg, JD. Abuhamad, AZ., Sehnert, AJ., Rava, RP., MatErnal BLood IS Source to Accurately diagnose fetal aneuploidy (MELISSA) Study Group. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol, 119: 890 901 (2012) 3. Bianchi DW, Wilkins-Haug L. Integration of noninvasive DNA testing for aneuploidy into prenatal care: what has happened since the rubber met the road? Clin Chem. 60: 78-87 (2014) 4. Chiu, RW., Chan, KC., Gao, Y. et al. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA, 105: 20458 20463 (2008) 39

Μη επεμβατικός Προγεννητικός Έλεγχος Μαύρου Α. 5. Fan, HC., Blumenfeld, YJ., Chitkara, U,. Hudgins, L., Quake S.R Non-invasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci USA, 105: 16266 16271(2008) 6.Lench N, Barrett A, Fielding S, McKay F, Hill M, Jenkins L, et al. The clinical implementation of non-invasive prenatal diagnosis for single-gene disorders: challenges and progress made. Prenat Diagn 33:555-562 (2013) 7. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 350:485 (1997) 8. Lun FMF, Chiu RWK, Allen Chan KC, Leung TY, Lau TK, Lo YMD. Microfuidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem 54:1664e72 (2008) 9. Pertl B, Bianchi DW. First trimester prenatal diagnosis: fetal cells in the maternal circulation. Semin Perinatol. 23(5):393-402 (1999) 10. Palomaki. GE., Kloza, EM,. Lambert-Messerlian, G.M et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med, 13: 913 920 (2011) 11. Tsaliki E, Papageorgiou EA, Spyrou C, et al. MeDIP real-time qpcr of maternal peripheral blood reliably identifes trisomy 21. Prenat Diagn 32:996-1001 (2012) 12. Tsui NB, Akolekar R, Chiu RW, Chow KC, Leung TY, Lau TK, Nicolaides KH, Lo Y Synergy of total PLAC4 RNA concentration and measurement of the RNA single-nucleotide polymorphism allelic ratio for the noninvasive prenatal detection of trisomy 21. Clin Chem. 56(1):73-81 (2010) 40