PROTEINI U URINU PROTEINURIJE CILJ ANALIZE URINA STANJE BUBREGA I DONJEG DELA URINARNOG TRAKTA SISTEMSKE BOLESTI UZROK BOLESTI, STANJE I PROGNOZA 1
2
FUNKCIJA BUBREGA- HOMEOSTAZA PROTEINA 180 L plazme dnevno 70 g/l proteina Ukupno 12600 g proteina dnevno proñe kroz glomerule 3
REFERENTNE VREDNOSTI ZA KONCENTRACIJU PROTEINA U 24h URINU < 150 mg/24h SASTAV URINARNIH PROTEINA PROTEINI PLAZME - 60% PROTEINI URINARNOG TRAKTA- 40% 4
PROTEINI PLAZME Albumin (20% od ukupno ekskretovanih proteina 20mg/24h) Proteini male molekulske mase (β 2 -mikroglobulin, lizozim, prealbumin, α 1 -kiseli glikoprotein, RBP) Imunoglobulini PROTEINI URINARNOG TRAKTA Tamm-Horsfallov protein (40 mg/24h) Urokinaza Sekretorni IgA 5
PROTEINURIJA Povećana koncentracija proteina u urinu TIPOVI PROTEINURIJE PREMA KONCENTRACIJI IZLUČENIH PROTEINA 1. Mikroalbuminurija 30-300 mg/24h 2. Blaga proteinurija 300-500 mg/24h 3. Umerena proteinurija 500-1000 mg/24h 4. Teška proteinurija 1000 3000 mg/24h 5. Nefrotski sindrom > 3500 mg/24h 6
PODELA PROTEINURIJA ASIMPTOMATSKA SIMPTOMATSKA IZOLOVANA ili POVEZANA SA HEMATURIJOM PROLAZNA TRAJNA PROLAZNA PROTEINURIJA Funkcionalna ili benigna proteinurija (<1g/danu) Vežbanje, temperatura, izlaganje hladnoći, hipertenzija, ateroskleroza Ortostatska proteinurija (i više od 1g/24h) Trudnoća (200-300 mg/24h) preeklampsija do 3g/24h 7
TRAJNA PROTEINURIJA PRERENALNA RENALNA POSTRENALNA PRERENALNA PROTEINURIJA (PRP) Uzrok oboljenje van bubrega Veća količina proteina male molekulske mase se filtrira kroz glomerule i to prevazilazi kapacitete reapsorpcije tubula 8
TIPOVI PRP HEMOGLOBINURIJA MIOGLOBINURIJA LIZOZINURIJA PROTEINURIJA LAKIH LANACA RENALNA PROTEINURIJA PRIMARNA GLOMERULARNA PRIMARNA TUBULARNA MEŠOVITI TIP 9
GLOMERULARNA PROTEINURIJA > 2g/24h SELEKTIVNA NESELEKTIVNA PROCENA SELEKTIVNOSTI GLOMERULARNE PROTEINURIJE Odnos klirensa IgG i albumina [Albumin, se] X [IgG, ur] [Albumin, ur] X [IgG, se] Odnos klirensa IgG/albumin Selektivna proteinurija <0.2 Neselektivna proteinurija >0.2 10
AKUTNI GLOMERULONEFRITIS oligurija hematurija urea, kreatinin GFR proteinurija EDEM hipertenzija NEFROTSKI SINDROM Masivna proteinurija (> 2-3g/24h) Edemi Hipoalbuminemija hiperlipidemija lipidurija 11
TUBULARNA PROTEINURIJA < 2g/24h β 2 mikroglobulin RBP lizozim α 1 kiseli glikoprotein enzimi hormoni DETEKCIJA TUBULARNE PROTEINURIJE ELEKTROFOREZA URINARNIH PROTEINA agaroza SDS-PAGE SPECIFIČNI TESTOVI ZA PROTEINE MALE MOLEKULSKE MASE (β 2 -mikroglobulin, lizozim) 12
TIPOVI TUBULARNE PROTEINURIJE AKUTNA TUBULARNA PROTEINURIJA Opekotine Ac. pankreatitis Lekovi HRONIČNA TUBULARNA PROTEINURIJA Fanconi sindrom Hronični pijelonefritis TUBULARNA PROTEINURIJA KOD SISTEMSKIH OBOLJENJA Cistinoza Wilsonova bolest Galaktozemija Balkanska nefropatija Sarkoidoza Multipli mijelom Infektivna oboljenja urinarnog trakta Fankonijev sindrom Trovanje Pb, Cd, As, CCl 4, Hg, nefrotoksični lekovi 13
Izabrani elektroforetogrami SDS-PAG EF 1i 6 standardi Maachi, M. et al. Clin Chem 2004;50:1834-1837 Copyright 2004 American Association for Clinical Chemistry 9 i 10 Bence-Jones proteinurija 2- infekcija UT 11- albuminurija 3 i 7 glomerularna proteinurija 4,8,12-15 mešoviti tip proteinurije 5 tubularna proteinurija POSTRENALNA PROTEINURIJA OBOLJENJA (infektivna ili maligna) Mokraćne bešike uretera uretre prostate spoljnih genitalija SEDIMENT URINA 14
AKUTNO ZATAJIVANJE BUBREGA oligurija ili anurija proteinurija hematurija urea, kreatinin metabolička acidoza VASKULARNE BOLESTI Hipertenzija Oboljenje arteriola Tromboza renalnih vena DIABETES MELLITUS Dijabetička nefropatija Mikroalbuminurija 15
ANALIZA PROTEINA U URINU KVALITATIVNA KVANTITATIVNA PROBLEMI KOD ODREðIVANJA PROTEINA U URINU Sakupljanje 24h urina Mala koncentracija proteina u uzorku Velika inter i intraindividualna varijacija u sastavu i količini proteina u uzorku Koncentracija neproteinskih interferenata Sadržaj neorganskih jona 16
UZORAK 24h ili 12h URIN BEZ KONZERVANSA, na +4ºC SLUČAJNI UZORAK STABILNOST: 48h NA +4ºC 1 GODINA NA -80 C ODREðIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA U POJEDINAČNOM NOM UZORKU URINA ODNOS PROTEINI-KREATININ Ref. vrednosti - P : Kr < 100 mg p/g Kr P : Kr > 2000 mg p/ g Kr > 3-4 g/24h PROTEINA 17
METODE ZA ODREðIVANJE KONC. PROTEINA U URINU 1. TURBIDIMETRIJSKE TCA, SSA, BENZETONIJUM-HLORID 2. VEZIVANJE BOJE PONCEAU S, COOMASIE BRILLIANT BLUE, PIROGALOL RED 3. HEMIJSKE METODE BIURETSKA METODA, FOLIN-LOWRY, FeCl 3 sa taninskom kiselinom ph URINA KISELI URIN Proteinska ishrana Gladovanje Dehidratacija Diareja Dijabetička acidoza Metabolička i respiratorna acidoza Metabolizam masti San Bakterije BAZNI URIN Biljna hrana Povraćanje Renalna tubularna acidoza Respiratorna i metabolička alkaloza NH 4 bakterije Th acetazolamidom Ishrana siromašna UH Hronično oboljenje bubrega 18
REAGENS TRAKE Skrining urina Reagens trake specifične za albumin Konfirmacioni test - precipitacija u kiseloj sredini Sorensenova proteinska greška indikatora (ph) lekovi i Bence Jones proteini (blago + test traka i jako + turbidimetrijski test) TEST TRAKE - PRINCIP REAKCIJE Tetrabromfenol plavo ph=3 proteini + rezultat ph=3 Tetrabromfenol plavo nema proteina - rezultat Detekcioni limit 70-100 mg/l 19
TURBIDIMETRIJSKE METODE 1.SSA sulfosalicilna kiselina 1.Proteini denaturisani kiselinom se talože pa je nastalo zamućenje veće što je veća koncentracija proteina. Najosetljivija metoda (10-25 mg/l) Precipitira i polipeptide Loša preciznost Loše slaganje sa drugim metodama 4x veći turbiditet sa albuminom nego sa globulinima LAŽNO + REZULTATI UZROK ZAMUĆENJE URINA KONTRASTI ZA Rö TOLBUTAMID PENICILIN SULFOKSAZOL ALKALNI URIN 4 amonijumove soli TEST TRAKE - SSA Ne utiče lažno + ili ne utiče lažno + ne utiče lažno + ne utiče lažno + ne utiče lažno + lažno + lažno - lažno + ne utiče 20
2. TCA trihlor-sirćetna kiselina Denaturisani protein u vidu fine suspenzije se odreñuje turbidimetrijski. manje osetljiva od SSA (20 mg/l, 1/2 zamućenja) važna kontrola temperature (25 C) interferencije: α 1 kiseli glikoprotein, lekovi 3. METODA SA BENZETONIJUM HLORIDOM Najosetljivija od turbidimetrijskih metoda (10 mg/l) γ-globulini 11-31% manji turbiditet od albumina interferencija fluoresceina 21
KOLORIMETRIJSKE METODE Precipitacija proteina sa TCA ili sa Tsuchiya reagensom (fosfovolframova kiselina, HCl,etanol) i odreñivanje precipitiranih proteina biuretskim reagensom ili Folin-Lowry reagensom. Reakcija sa feri-hloridom posle taloženja proteina taninskom kiselinom. KOLORIMETRIJSKE METODE KOLORIMETRIJSKE METODE Jako osetljive metode (5-17 mg/l) Mala varijacija izmeñu različitih proteina Velika linearnost (do 5g/L) Mane: zametne metode i ne mogu se automatizovati Biuretska metoda interferiraju Bi i NH 4 + jon. 22
METODE KOJE SE ZASNIVAJU NA VEZIVANJU BOJE Coomassie Brilliant Blue (CBB) Pyrogallol red Ponceau S PRINCIP METODA CBB Vezivanje proteina za boju pomera apsorpcioni maksimum boje sa 465 nm na 595 nm. Obojeno jedinjenje je stabilno 1h. Interferencija timol i salicilati, urea. PONCEAU S Reakcija izmeñu proteina i boje Ponceau-S u TCA koja dovodi do koprecipitacije proteina i boje. Crveni talog se rastvara pomoću NaOH a nastala ljubičasta boja se meri na 560 nm. Interferencija aminoglikozida. 23
MIKROALBUMINURIJA Rani marker za razvoj dijabetičke nefropatije Koncentracija albumina 30-300 mg/24h ili 30-300 mg/g kreatinina ili Brzina ekskrecije albumina 20-200 mg/min MIKROALBUMINURIJA TEST- KOME I KADA? DM I - nakon 5 godina od postavljanja Dg i kasnije jednom godišnje DM II - u trenutku postavljanja Dg i kasnije jednom godišnje Perzistentna, jasna proteinurija (> 300 mg/24h) nije indikacija za test na mikroalbuminuriju 24
PROLAZNA MIKROALBUMINURIJA Kratkotrajna hiperglikemija Vežbanje Infekcije urinarnog trakta Hipertenzija Srčane bolesti Povišena telesna temperatura MIKROABUMINURIJA- DEFINITIVNA DIJAGNOZA Nakon preliminarne Dg povećanih koncentracija albumina pozitivan nalaz u još bar 2 uzorka u toku 3-6 meseci. Prevencija nefropatije: lekovi ACEi i ARB 25
MIKROALBUMINURIJA - METODE Test trake sa imunohemijskim reagensom specifičnim za albumin ( Micral test ) Imunofelometrijske metode - metoda izbora Imunoturbidimetrijske metode RID EIA RIA - referentna metoda MIKROALBUMINURIJA- UZORAK 24h urin prvi jutarnji ili bilo koji uzorak u toku dana - albumin/kreatinin odnos 26