Ukupni proteini u serumu

Transcript

1 Ukupni proteini u serumu Proteini u humanom serumu se nalaze u vidu kompleksne smeše, a mogu se klasifikovati prema hemijskim osobinama, katalitičkoj sposobnosti i imunološkim osobinama. U plazmi je do sada identifikovano 300 različitih proteina koji imaju sledeće funkcije u organizmu: 1. Nutritivna funkcija - Aminokiseline koje nastaju u toku metabolizma proteina ulaze u sastav aminokiselinske rezerve. Jedan njihov deo se koristi u sintezi novih proteina ili drugih jedinjenja azota, a ostatak se dezaminuje i daje supstance koje se potpuno katabolizuju do ugljendioksida i vode ili se procesom glukoneogeneze prevode u glukozu. 2. Kontrola distribucije vode - Koloidno-osmotski ili onkotski pritisak proteina plazme omogućava održavanje odgovarajućeg volumena krvi. Albumin najviše doprinosi ovom pritisku obzirom da se nalazi u najvećoj koncentraciji u krvi. 3. Transportna funkcija - Posredstvom albumina transportuje se veliki broj supstanci. Specifičnu transportnu funkciju imaju i drugi proteini plazme (npr. transferin prenosi gvožđe, ceruloplazmin bakar, itd.). Proteini učestvuju i u transportu hormona (npr. kortizol i tiroksin), mnogih lekova, vitamina, metala, lipida, itd. Na ovaj način se supstance koje su nerastvorne u vodi transportuju do željenog organa. 4. Funkcija koagulacije - Svi faktori koagulacije su proteini. 5. Zaštitna funkcija - Antitela su po svojoj prirodi imunoglobulini koji učestvuju u odbrani organizma od infekcija. U ovu grupu proteina spadaju i komponente sistema komplementa. 6. Funkcija pufera - Proteini plazme sudeluju u održavanju ph krvi. Negativno su naelektrisani pri ph krvi 7,4 i ponašaju se kao baze koje primaju jone vodonika. 7. Funkcija enzima - Veliki broj enzima koji se nalaze u plazmi po svojoj strukturi su proteini. Proteini se u rutinskim laboratorijama određuju u serumu, urinu, likvoru, amnionskoj tečnosti, salivi, fecesu i peritonealnoj i pleuralnoj tečnosti. U metode za određivanje proteina u telesnim tečnostima ubrajaju se: - određivanje koncentracije ukupnih proteina i albumina - razdvajanje elektroforezom, pri čemu se semikvantitativno određuju glavne klase proteina - imunohemijsko određivanje koncentracije specifičnih proteina. U ovim metodama se koriste specifični antiserumi (antitela) na proteine čija se koncentracija određuje. U reakciji nastaje kompleks antigen-antitelo (Ag-At), koji se dalje može određivati nefelometrijski, turbidimetrijski, radijalnom imunodifuzijom (RID) ili elektro-imunodifuzijom (EID). Ukoliko je nastali Ag-At kompleks prisutan u jako maloj koncentraciji, određuje se radio-imunoesejom (RIA) ili enzimskim imunoesejom (EIA). - detekcija i određivanje koncentracije abnormalnih proteina radijalnom imunodifuzijom (RID), imunoelektroforezom (IEP) i imunofiksacionom elekroforezom (IFE). 1

2 Određivanje koncentracije ukupnih proteina u serumu Najstarija metoda za određivanje koncentracije proteina u serumu i plazmi je metoda po Kjeldahl-u u kojoj se vrši digestija proteina kiselinom kako bi se azot iz proteina pretvorio u amonijum jon. Koncentracija azota u amonijaku se zatim određuje titracijom ili neslerizacijom. Međutim, pošto su u serumu prisutna i azotna jedinjenja koja ne potiču od proteina, mora se izvršiti korekcija za azot koji potiče iz neproteinskih azotnih jedinjenja (korekcija se vrši množenjem sa faktorom 6,25, jer je sadržaj azota u molekulu proteina 16%). Metoda je dobro definisana i reproducibilna, rezultati su tačni i precizni, ali je vremenski jako zametna i neadekvatna za svakodnevnu primenu. U kliničkim laboratorijama danas služi kao referentna metoda za uvođenje novih metoda, a pre svega za definisanje referentnog standarda za biuretsku metodu. Biuretska metoda se najčešće koristi u kliničkim laboratorijama za određivanje koncentracije ukupnih proteina u plazmi ili serumu. Zasniva se na reakciji između karbonilnog kiseonika i azota amida peptidne veze veze sa kupri jonom u alkalnoj sredini, pri čemu nastaje obojeni helat. Biuretska reakcija je specifična za jedinjenja sa najmanje dve peptidne veze. Jedan Cu 2+ jon se vezuje koordinativnim vezama sa šest susednih peptidnih veza. Boja nastalog kompleksa se kreće od purpurne do tamno ljubičaste, a intezitet boje je proporcionalan broju peptidnih veza koje reaguju, samim tim i broju molekula proteina u reakcionom sistemu. Sasatav dva najčešće korišćena biuretska reagensa je: 1. 0,1-0,2 mol/l NaOH; mmol/l CuSO 4 ili 2. 0,5 mol/l NaOH; 4-6 mmol/l CuSO 4 Pored CuSO 4 i NaOH, da bi reagens bio stabilan potrebno je dodati i K, Na-tartarat (po nekim modifikacijama K, Na-citrat), jer bi se u suprotnom Cu 2+ jon u baznoj sredini istaložio u vidu Cu(OH) 2. Takođe u sastav reagensa ulazi i KJ koji sprečava autoredukciju alkalnog Cu-tartarata i stvaranje Cu 2 O. Metoda je jednostavna, može da se primeni na automatima i dovoljno je precizna za kliničku upoterebu. Linearnost metode je u opsegu od g/l. Hiperbilirubinemija, lipemija i blaga hemoliza mogu da ometaju reakciju, te se koriguju upotrebom slepe probe analize sa belim biuretom (biuretski reagens koji ne sadrži CuSO 4 ). Inače, hemoliza izaziva povećanje vrednosti proteina za 3% na svakih 1g/L hemoglobina u uzorku. U reakciji može da interferira i amonijum jon, ali pošto se u plazmi nalazi u niskoj koncentraciji ne dovodi do interferencije. 2

3 Koncentracija proteina u plazmi je viši za 2-4 g/l u odnosu na serum zbog prisustva fibrinogena. Proteini u serumu i plazmi su stabilni 7 dana na sobnoj temperaturi, mesec dana u frižideru i 2 meseca na -20 C. Za kalibraciju biuretske metode obično se koristi goveđi ili humani serumski albumin. Postoji više razloga za upotrebu albumina kao standarda. Naime, albumin je po sastavu jednostavan ili prost protein, količina azota u molekuli albumina je konstantna u odnosu na molekulsku masu, a broj peptidnih veza u molekuli je poznat. Takođe, albumin velike čistoće se lako se dobija. Zbog povoljnije cene češće se koristi goveđi serumski albumin. Međutim, humani serumski albumin ima nižu reakcionu brzinu sa biuretskim reagensom od goveđeg, tako da tehnike koje mere inicijalnu brzinu moraju biti standardizovane humanim albuminom. Određivanje proteina spektrofotometrijski na 280 nm zasniva se na apsorpciji specifičnih proteinskih veza koje sadrže aromatična jezgra aminokiselina tirozina, triptofana i fenilalanina. Apsorbancija zavisi od raspodele (udela) ovih aminokiselina u pojedinim proteinima, ali i od prisustva slobodnog tirozina, triptofana, mokraćne kiseline i bilirubina u serumu, pošto ova jedinjena takođe imaju apsorpcioni maksimum na talasnim dužinama blizu 280 nm. Metoda je jednostavna i osetljiva, ali zahteva upotrebu UV-spektrofotometra i nije specifična za proteine (određuju se sva jedinjenja koja sadrže aromatične aminokiseline, zatim same aminokiseline i odgovarajući peptidi). Metoda je tačna i osetljiva za relativno prečišćene proteinske rastvore (posle eluiranja i frakcionisanja), kao i za analiziranje velikog broja uzoraka posle hromatografskog razdvajanja na koloni. Određivanje proteina Folin-Ciocalteu-ovom metodom zasniva se na redukciji Folin- Ciocalteu-ovog reagnesa (fosfovolframova i fosfomolibdenska kiselina) u prisustvu aminokiselina tirozina i triptofana koje potiču iz proteina, pri čemu nastaje plavo obojeni kompleks, čija se koncentarcija određuje spektrofotometrijski. Kako svaki protein sadrži tačno određenu količinu ovih aromatičnih aminokiselina ova metoda je pogodnija za određivanje koncentracije pojedinačnih proteina (npr. fibrinogen). Modifikacija ove metode po Lowry-ju danas je najosetljiviji postupak za određivanje ukupnih proteina. Lowry metoda se zasniva na pretretmanu uzorka alkalnim rastvorom bakra, a zatim se dodaje Folin-Ciocalteu-ov fenolni reagens. Boja nastaje redukcijom fosfovolframove i fosfomolibdenske kiseline pod dejstvom kompleksa bakar-peptidna veza iz tirozina i triptofana u proteinima. Cistin, cistein i histidin takođe daju ovu reakciju, ali u manjoj meri. Ova metoda je osetljivija oko 100 puta od biuretske metode, a oko 10 puta od spektrofotometrijskog određivanja na 280 nm. Naročito je pogodna za određivanje ukupnih proteina u situacijama gde se dobijaju male količine biloškog materijala (npr. kod biopsija) ili kad je koncentracija proteina u biološkom materijalu jako niska (npr. u likvoru). Međutim, iako je osetljivost ove metode velika, ona se ne koristi za određivanje proteina u urinu i likvoru, zato što reagensi reaguju nespecifično sa neproteinskim komponentama (posebno u likvoru) i daju pozitivnu grešku. Takođe, zbog male specifičnosti i brojnih interferencija ova metoda nema primenu ni u rutinskim laboratorijama. Pošto količina tirozina u proteinima varira, to uslovljava razlike u intezitetu dobijene boje, tj. intenzitet boje zavisi od sastava proteina. Konačno, ovaj postupak određivanja koncentracije proteina je nastao kao spoj dve metode, a oba reagenasa su nestabilna i imaju kratak rok upotrebe. Turbidimetrijsko određivanje koncentracije ukupnih proteina se vrši nakon precipitacije jednim od sledećih reagenasa: sulfosalicilna kiselina, sulfosalicilna kiselina u kombinaciji sa natrijumsulfatom, sulfosalicilna kiselina i trihlorsirćetna kiselina ili samo trihlorsirćetna kiselina. Taložne metode se zasnivaju na stvaranju finog precipitata ukupnih proteina, tj. suspenzije nerastvornih čestica koje raspršuju inicijalnu svetlost. Osnovni preduslov ovog načina određivanja je da se postignu 3

4 takvi uslovi izvođenja reakcije (temperatura, reagensi) pod kojima se podjednako uspešno talože i albumin i globulini. Sem toga, neophodno je postići i homogenu raspodelu suspendovanih čestica u medijumu tokom merenja. Takođe je potrebno izabrati odgovarajući standard koji ima iste precipitirajuće osobine kao proteini plazme. Precipitacija proteina sa trihlorsirćetnom kiselinom koristi se kod određivanja proteina u urinu, pri čemu se supernatant dekantuje, a precipitat rastvori biuretskim reagensom. Ova metoda se primenjuje za urin, ali ne i za likvor jer je potrebna velika količina uzorka. Metode koje se zasnivaju na vezivanju boje za proteine koriste se kod elektroforeze za bojenje razdvojenih frakcija proteina, a takođe i za određivanje koncentracije albumina i proteina u urinu i likvoru. Boje koje se primenjuju za ove metode su Amido Black, Ponceau S i Coomassie Brilliant Blue. Nedostaci ovih metoda su nejednak afinitet i vezujući kapacitet pojedinih proteina, kao i nemogućnost pronalaženja odgovarajućeg standarda. Od ovih boja najviše se koristi Coomassie Brilliant Blue (CBB) za analizu proteina u likvoru i urinu. CBB se vezuje za protonizirane amino grupe ostataka aminokiselina u polipeptidnim lancima, a ovo dovodi do pomeranja apsorpcionog maksimuma boje CBB sa 465 nm na 595 nm. Merenje indeksa refrakcije je istorijska metoda sa brojnim interferencijama. Zasniva se na merenju indeksa refrakcije supstanci koje su rastvorene u serumu. Pored proteina, u serumu su prisutni elektroliti i glukoza, pa se refrektometer mora kalibrisati serumom poznate koncentracije proteina. Referentne vrednosti 66,5-81,5 g/l (biuretska metoda) Kod ležećih pacijenata se dobijaju za oko 5% niže vrednosti. Između muškaraca i žena nema razlike u koncentraciji proteina. Intraindividualna varijacija se kreće između 3 i 30%. Interpretacija rezultata Određivanje ukupnih proteina može samo grubo da ukaže na promenu koncentracije albumina, odnosno globulina. Mnogi proteini plazme imaju nezavisnu regulaciju koncentracije, tako da iza normalne koncentracije ukupnih proteina može da se krije povišena ili snižena koncentracija pojedinačnih proteina. Kao kliničke slike mnogo se češće sreću hipo- nego hiperproteinemije. Povišene vrednosti proteina u serumu Kao hiperproteinemije se označavaju ona stanja u kojima je koncentracija proteina veća od 83 g/l, a mogu da budu posledica prekomerne sinteze proteina ili posledica gubitka vode iz organizma (relativna ili pseudohiperproteinemija). Hiperproteinemije zbog prekomerne sinteze proteina se sreću kod pacijenata sa bolestima plazma ćelija, kao što su multipli mijelom, makroglobulinemija, bolest teških lanaca, primarna amiloidoza i monoklonalna gamopatija nepoznatog porekla. Kod ovih bolesti osmolalnost plazme nije promenjena. Hiperproteinemija može da se ustanovi i kod nekih pacijenata sa cirozom jetre i virusnim hepatitisom, kod kojih je pojačana sinteza imunoglobulina, ali još uvek nije došlo do smanjenja sintze albumina. 4

5 Blaga hiperproteinemija može biti posledica povećanih koncentracija specifičnih proteina koji se normalno nalaze u malim koncentracijama, kao što su proteini akutne faze ili poliklonalni imunoglobulini kod infekcija. Koncentracija proteina akutne faze značajno se povećava u toku akutnog zapaljenskog procesa, koji može biti posledica operacija, infarkta miokarda, infekcija ili tumora. Svi ovi proteini inače imaju svoju ulogu u veoma kompleksnom odbrambenom mehanizmu inflamacije. Akutni porast koncentracije proteina je odgovor na inflamaciju i u skladu je sa porastom temperature i brojem leukocita, ali nije specifičan za neko oboljenje. Od proteina akutne faze prvo naglo rastu koncentracije C-reaktivnog proteina i alfa-1-antihimotripsina, a u toku narednih 12 sati alfa-1- kiseliglikoprotein, zatim alfa-1-antitripsin, haptoglobin, C4 komponenta komplementa i fibrinogen. Najsporije rastu koncentracije C3 komponente komplementa i ceruloplazmina. Određivanje koncentracije C-reaktivnog proteina je važno za praćenje progresa inflamacije i odgovora na terapiju. Povećana sinteza pozitivnih proteina akutne faze, dovodi do smanjene sinteze prealbumina, albumina i transferina (negativni proteini akutne faze) tako da generalno nema značajne promene u koncentraciji ukupnih proteina. Pseudo-hiperproteinemija može biti posledica nedovoljnog unošenja vode, što se uglavnom dešava kod dece ili povećanog gubitka vode, što se sreće kod teških infektivnih bolesti koje su praćene febrilnim stanjem, kao i kod dijabetične acidoze. Kod pseudo-hiperproteinemije koja je posledica smanjene zapremine vode iz plazme (hemokoncentracija) srazmerno se povećava koncentracija svih specifičnih proteina. Snižene vrednosti proteina u serumu Kao hipoproteinemija se označava stanje kod koga je koncentracija proteina manja od 63 g/l, a može biti posledica pojačanog gubitka proteina, poremećene apsorpcije proteina u digestivnom traktu ili smanjene sinteze proteina. Hipoproteinemija nastaje najčešće zbog smanjene intravazalne koncentracije albumina, a ređe zbog smanjene koncentracije globulina. Pojačan gubitak proteina dešava se u sledećim stanjima: - putem bubrega kod glomerulonefritisa, nefrotskog sindroma, intoksikacija teškim metalima itd.; - putem gastrointestinalnog trakta (eksudativne enteropatije) kod Crohn-ove bolesti, ulceroznog kolitisa, polipoza i divertikuloza kolona itd.; - putem kože kod opekotina, vlažnih ekscema, dermatoza itd.; Gubitak proteina putem bubrega i putem kože može biti masivan jer se u tim stanjima gubi uglavnom albumin. Poremećaji u apsorpciji proteina u digestivnom traktu javljaju se kod različitih inflamatornoatrofičnih promena sluzokože tankog creva, kao što su celijačna bolest, alergija na različite namirnice, mukoviscidoze, selektivni nedostatak IgA, nedostatak disaharidaza itd. Smanjena sinteza proteina može biti urođeni ili stečeni defekt. Uzroci urođenih hipoproteinemija mogu biti vrlo retka nasledna analbuminemija ili takođe vrlo redak sindrom nedostatka antitela, kod koga nema sinteze nijedne klase imunoglobulina. Česti uzroci stečenih hipoproteinemija su smanjena sinteza albumina ili drugih proteina plazme kao posledica funkcionalnog oštećenja jetrenog parenhima, što se sreće kod različitih hroničnih i nekrotičnih bolesti jetre. 5

6 Pored stanja u kojima je koncentracija proteina stvarno snižena, postoje i hipoproteinemije u kojima je sniženje koncentracije proteina samo prividno i stoga se nazivaju pseudohipoproteinemije. Uzroci koji dovode do pseudo-hipoproteinemija su masivna krvarenja, polidipsija, infuziona terapija ili trudnoća. Kod akutnog gubitka krvi dolazi do ulaska intersticijelne tečnosti u krvne sudove da bi se smanjila hipovolemija, a kako u toj tečnosti nema proteina, rezultat je diluciona hipoproteinemija. Isti efekat se dobija i kod davanja infuzionih rastvora koji povećavaju zapreminu plazme a količina proteina u njoj ostaje ista. Lakši oblik pseudo-hipoproteinemije sreće se i u trudnoći, takođe zbog povećanja volumena vaskularne tečnosti. 6

7 Albumin Albumin je globularni protein koji čini 40-60% mase ukupnih proteina seruma. Sintetiše se u jetri, a brzina sinteze zavisi kako od unosa proteina u organizam, tako i od same koncentracije albumina u serumu. Molekulska masa albumina je , a njegov poluživot iznosi 15 do 19 dana. Izoelektrična tačka se nalazi između ph 4-5,8, tj. radi se o anjonu sa preko 200 negativnih mesta po molekulu. Najvažnije funkcije albumina u organizmu su transportna uloga, održavanje osmotskog pritiska i endogeno obezbeđivanje aminokiselina. Albumin vezuje i solubilizuje nepolarne komponente plazme kao što su: bilirubin, masne kiseline, hormoni (tiroksin, trijodtironin, kortizol i aldosteron), kalcijum i lekovi (varfarin, fenilbutazon, salicilati, itd.). Takođe, albumin reguliše onkotski pritisak i time utiče na raspodelu vode izmedju intra- i ekstravaskularnog prostora. U stanjima kada je smanjena koncentracija albumina u serumu može doći do izlaska vode iz vaskularnog prostora u okolna tkiva i do nastanka edema. Kako je albumin relativno mali molekul njegova koncentracija u ekstracelularnoj tečnosti predstavlja koristan indikator propustljivosti različitih membrana u organizmu. Sem toga, koncentracija albumina odražava i nutritivni status organizma, jer zavisi od unosa proteina. Koncentracija albumina se određuje u serumu, a može se koristiti i heparizirana plazma. Metode za određivanje koncentracije albumina Precipitacione metode su najstarije metode za određivanje koncentracije albumina. Zasnivaju se na precipitaciji proteina solima ili kiselinama (npr. sa 2,05 mol/l rastvorom (NH 4 ) 2 S0 4 na 25 C), nakon čega albumin ostaje u rastvoru (ne taloži se). Nakon centrifugiranja uzorka, albumin ostaje u supernatantu i njegova koncentracija se određuje biuretskom metodom. Metoda nije specifična zbog interakcije sa drugim proteinima i ne može da se primeni na automatima, te ima istorijski značaj. Metoda za određivanje koncentracije albumina preko određivanja koncentracije globulina zasniva se na velikoj razlici u sadržaju triptofana između albumina (ima ga oko 7-10%) i globulina (uglavnom se sastoje iz triptofana). Glioksilna kiselina u prisustvu Ca +2 u kiseloj sredini reaguje sa triptofanom iz globulina pri čemu nastaje purpurna boja čiji se intezitet meri na 540 nm. Koncentracija albumina se dobija iz razlike koncentracija ukupnih proteina i globulina. Nedostatak ove metode je u tome što je potrebno izvršiti standardizaciju metode serumom kako bi se izbegla interferencija albumina. Slobodan triptofan ne interferira u ovoj metodi. Takođe, nedostatkom se smatra i činjenica da je potrebno prethodno odrediti ukupnu koncentraciju proteina u serumu. Danas se za određivanje albumina uglavnom koriste elektroforetske, imunohemijske i metode koje se zasnivaju na vezivanju boje. Elektroforetske metode za određivanje koncentracije albumina zasnivaju se na elektroforetskom razdvajanju proteina na celuloza-acetatu ili agarozi. Nakon bojenja razdvojenih frakcija procenat svake frakcije određuje se denzitometriranjem. Koncentracija albumina se dobija množenjem ukupne koncentracije proteina procentualnim udelom albumina. Nedostaci ove metode ogledaju su u tome što se boja ne vezuje podjednako za sve serumske proteine. Naime, stepen vezivanja boje je direktno proporcionalan koncentraciji određenog proteina u serumu, te stoga ova metoda daje nešto više vrednosti za albumin (u najvećoj je koncentraciji, pa ima i veliki kapacitet za vezivanje boje). Ukoliko se albumin eluira sa gela i odredi standardnom metodom za proteine, metoda postaje tačnija. Iako se 7

8 ovom metodom dobija dobro razdvajanje albumina od ostalih serumskih proteina, nije pogodna za rutinski rad, jer je dosta zametna. Od imunohemijskih metoda za određivanje koncentracije albumina koriste se radijalna imunodifuzija (RID), elektroimunodifuzija (EID), nefelometrija i turbidimetrija. Kao stacionarna faza kod RID i EID koristi se agaroza sa antitelima na albumin. Albumin se može dobiti u prečišćenom stanju tako da su i antiserumi koji se koriste u reakcijama jako dobri, a metode zasnovane na njegovoj primeni su izuzetno specifične i osetljive, ali se ipak koriste samo u specijalne dijagnostičke svrhe. Metode koje se zasnivaju na vezivanju boje za albumin se najčešće koriste u rutinskom radu. Zasnivaju se na promeni apsorpcionog maksimuma boje kada se za nju veže albumin, pri čemu se specifično vezivanje sa albuminom odvija u prisustvu drugih proteina seruma. Ovo skretanje apsorpcionog maksimuma omogućava da nastali intezitet boje može da se meri u prisustvu viška neizreagovane boje koji je neophodan da bi se vezao sav albumin. Boje koje se najčešće koriste u ovim metodama su metil-oranž, 2-(4'-hidroksiazobenzen)-benzoeva kiselina (HABA), bromkrezol-zeleno (BCG) i bromkrezol-purpurno (BCP). a) Metoda sa metil-oranžom je nespecifična, jer interferiraju β lipoproteini i α 1 i α 2 globulini, pa se mogu dobiti lažno povišene vrednosti za albumin (naročito ukoliko je prisutan u niskoj koncentraciji). U ovoj metodi slabije interferiraju bilirubin i drugi proteini, za razliku od metode u kojoj se koristi HABA. b) HABA je specifična za albumin, ali ima malu osetljivost. U ovoj metodi salicilati, sulfonamidi, penicilini i konjugovani bilirubin u serumu interferiraju sa albuminom za vezivanje sa bojom. Kao standard može se koristiti humani albumin ili humani merkapto-albumin, dok se hemjski tretiran ili hemijski stabilizovan albumin ne vezuju na istin način kao humani, te se i ne koriste kao standardi. Korelacija rezultata ove metode sa rezultatima elektroforetskog određivanja je slaba, što je naročito izraženo kod novorođenčadi sa hemolitičkom bolesti i kod pacijenata sa bolestima jetre, a metoda daje nešto više vrednosti kod pacijenata sa renalnim bolestima. c) Metoda sa BCG izvodi se pri ph 4,2-4,5. Ova ph vrednost sredine se obezbeđuje sukcinatnim puferom, a nastala boja se meri na nm (628 nm). Nejonski deterdžent, Brij 35, se dodaje da bi se smanjila apsorbancija slepe probe, sprečio turbiditet i obezbedila linearnost. Kao standardi mogu da se koriste humani serumski albumin ili goveđi serumski albumin. Specifičnost ove metode je dobra kada se analizira serum zdravih osoba, pošto bilirubin, slaba do umerena lipemija i salicilati ne pokazuju interferenciju sa ovom metodom. Hemoliza smanjuje vrednost albumina, a slepa proba uzorka ne koriguje ovu interferenciju. Metoda pokazuje slabu korelaciju sa elektroforezom, EID i RID. Kada su koncentracije albumina u opsegu od g/l rezultati ovih metoda su slični, a za koncentracije niže od 35 g/l metoda sa BCG daje više vrednosti u odnosu na elektroforezu. Jedna od modifikacija metode sa BCG podrazumeva uklanjanje interferencija koje potiču od α i β globulina, fibrinogena i hemoglobina dodatkom NaCl (0,8 mol/l), snižavanjem reakcione temperature sa 45 C na sobnu temperaturu i smanjenjem koncentracije deterdženta. U drugoj modifikaciji specifičnost metode se povećava merenjem apsorbancije odmah nakon završetka reakcije. Naime, utvrđeno je da albumin dovodi do pomeranja apsorpcionog maksimuma boje BCG u roku od jednog minuta, a proteini akutne faze (ceruloplazmin i α 1 -kiseli glikoprotein) posle 5 min. Zato se preporučuje merenje apsorbancije nakon sekundi. 8

9 d) U metodi sa BCP reakcija sa albuminom se vrši na ph 5,2 a pomeranje apsorpcionog maksimuma boje se meri na 603 nm. Prednost u odnosu na BCG je to što BCP ne vezuje druge serumske proteine, kao što su ceruloplazmin i α 1 -kiseli glikoprotein, tako da merenje apsorbancije ne mora da se završi u kratkom vremenskom roku. Kao standard se koristi humani serumski albumin, jer goveđi serumski albumin sa bojom gradi kompleks koji ima malu apsorbanciju na talasnoj dužini od 603 nm. Interpretacija rezultata Hipoalbuminemija je česta pojava koja se javlja kod mnogih oboljenja, a može biti posledica: a) poremećaja u sintezi albumina, što se javlja kod oboljenja jetre (primarno) ili usled smanjenog unošenja proteina hranom (sekundarno); b) povećanog katabolizma proteina, usled razgradnje tkiva ili nekog inflamatornog procesa; c) smanjene apsorpcije aminokiselina kod malapsorpcije; d) gubitka proteina: urinom (nefrotski sindrom, hronični glomerulonefritis, dijabetes), fecesom (enteropatije, inflamacija, neoplazme), kožom (opekotine); e) promene u distribuciji albumina, tj. prelazak u ekstravaskularni prostor (kod ascita). Referentne vrednosti Kod novorođenčadi: g/l Kod odraslih osoba: g/l Kod osoba starijih od 60 godina: g/l 9

10 Eksperimentalni rad: 1. Određivanje koncentracije ukupnih proteina Princip metode Ukupni proteini seruma reaguju sa bakar-(ii)-jonima i formiraju ljubičasto obojeno kompleksno jedinjenje sa maksimumom apsorbancije na 546 nm. Intenzitet nastale boje je proporcionalan koncentraciji ukupnih proteina u serumu. Radni reagens Bakar (II) sulfat Kalijum-jodid Natrijum hidroksid EDTA 6 mmol/l 12 mmol/l 1,15 mmol/l Standard proteina 62,4 g/l Kao uzorak koristiti nehemolizovan i nelipemičan serum. Analitički postupak Pipetirati u epruvete A A A ST A SP Uzorak 20 µl - - Standard - 20 µl - Destilovana voda µl Radni reagens 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Sadržaj epruveta dobro promešati i posle 10 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, izmeriti apsorbancije analize i standarda prema slepoj probi reagensa na 546 nm. Izračunavanje Ca= Aa/Ast Cst Referentne vrednosti 66,5-81,5 g/l 10

11 2. Određivanje koncentracije albumina Princip metode Serumski albumin se vezuje sa bojom bromkrezol-zeleno (BCG) na ph 4,2 i gradi obojeno jedinjenje sa maksimumom apsorbancije na 630 nm. Apsorbancija formiranog kompleksa proporcionalna je koncentraciji albumina u uzorku. Radni reagens Acetatni pufer ph 4,2 BCG Brij mmol/l 0,27 mmol/l Standard albumina 47,7 g/l Kao uzorak koristiti nehemolizovan i nelipemičan serum. Analitički postupak Pipetirati u epruvete A A A ST A SP Uzorak 10 µl - - Standard - 10 µl - Destilovana voda µl Radni reagens 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml Sadržaj epruveta dobro promešati i posle 1 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi izmeriti apsorbancije analize i standarda prema slepoj probi reagensa na 630 nm. Izračunavanje Ca= Aa/Ast Cst Referentne vrednosti Odrasli: g/l 11