31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus. (Gabriela

31. Cocobacili Gram-negativi. Genul Haemophilus. (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) 31. 1. Definiţie. Încadrare Microorganismele din acest gen sunt cocobacili polimorfi (pot exista chiar şi forme filamentoase), imobili, nesporulaţi, Gram-negativi, aerobi, facultativ anaerobi. Sunt germeni pretenţioşi; pentru a se dezvolta au nevoie de prezenţa factorilor de creştere prezenţi în sânge (de unde şi numele genului). Există mai multe specii. Genul Haemophilus a fost inclus în Familia Pasteurellaceae, împreună cu genurile Actinobacillus, Pasteurella şi alte 4 grupuri ce cuprind peste 80 de specii bacteriene. Taxonomic, genul este într-o permanentă schimbare; unele specii sunt eliminate ori candidate la excludere, altele sunt nou identificate. În prezent genul Haemophilus cuprinde peste 15 specii. Dintre speciile care colonizează/infectează omul, amintim: H. influenzae, H. aegyptius, H. haemolyticus, H. ducreyi, H. aphrophilus, H. parainfluenzae, H. parahaemolyticus, H. paraphrohaemolyticus, H. paraphrophilus şi H. segnis; în cadrul acestui capitolul vom prezenta două specii, H. influenzae şi H. ducreyi. 31. 2. Haemophilus influenzae A fost considerat agentul etiologic al gripei în pandemia de gripă din anii 1890-1892 (Pfeiffer). A fost izolat în 1892. Numele a fost stabilit în 1917, în amintirea erorii din 1892. 31. 2. 1. Caractere generale 31. 2. 1. 1. Habitat Se poate găsi la nivelul mucoasei tractului respirator uman. Poate coloniza şi mucoasa conjunctivală, precum şi tractul genital la 30-70% din persoanele sănătoase. Într-un studiu recent la care au participat în mod voluntar colegii tineri aflaţi în finalul anului 2 de facultate (date nepublicate, 2007), 35,5% dintre studenţi au fost purtători de Staphylococcus aureus, nazal şi / sau faringian dar nici un student nu a fost purtător de H. influenzae. Am identificat un caz de portaj pentru H. parainfluenzae. 31. 2. 1. 2. Caractere morfologice În produsul patologic germenii sunt prezenţi sub formă de cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3µm), uneori dispuşi în lanţuri scurte. În cazul anumitor tulpini pot apărea forme filamentoase, aberante. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie decolorate 20 secunde, pentru că hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu Streptococcus

pneumoniae, iar recolorarea nu se face cu safranină (care nu colorează bine hemofilii), ci numai cu fucsină bazică 0,1% sau cu fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 5 minute. În culturi apar în funcţie de vârsta culturii şi de mediul de cultură: - în medii bogate, la 6-8 ore, predomină formele cocobacilare, care au şi capsulă. - în culturile vechi se caracterizează prin pleomorfism şi pierderea capsulei (probleme de diagnostic diferenţial microbiologic). Polimorfismul apare odată cu îmbătrânirea culturii şi este caracteristic tulpinilor în curs de trecere la forma R. 31. 2. 1. 3. Caractere de cultură Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea creşterii 5-10% CO 2, atmosferă umedă, la 35-37ºC, ph=7,6 incubat pentru o perioadă de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de creştere precum (factorii X şi V). Factorul X, termostabil (rezistă 45 minute la 120 C), este protoporfirina IX sau o protohemă cu fier, prezentă în sânge sau în derivatele sale cu hemină şi asigurată în mediile de cultură prin adaos de 5% sânge chocolatat, de suplimente XV, Fildes sau Levinthal, care conţin aproximativ 500 µg/ml factor X şi 150 µg/ml factor V, sau prin suplimentare cu hemină. Haemophilus influenzae necesită pentru dezvoltare 0,1-10 µg/ml factor X, iar H. ducreyi 200 µg/ml hemină. Factorul V, termolabil (rezistă numai 15 minute la 90 C), este nicotin-amid-adenin dinucleotidul (NAD) sau NADPH (fosfat), prezent în hematii, dar eliberat, este distrus de pirofosfatază şi NAD - ază, prezente în sângele de om, ovine, caprine, ori bovine (enzime inactivate prin chocolatizare). Surse de factor V sunt suplimentele XV, extractul de drojdie, de cartof sau tomate, diferite bacterii: stafilococ, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa mucos, Sarcina lutea, Escherichia coli, levuri şi preparatele de NAD sau NADPH. Necesităţile de factor V pentru H. influenzae sunt de 0,2-1 µg/ml, pentru H. parainfluenzae de 1-5 µg/ml sau, pentru unele tulpini, de 25 µg/ml. Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este necesară eliberarea conţinutului acestora în mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică). Factorul V este sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase în jurul unor colonii de stafilococ (fenomenul de satelitism); util în identificare. Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză. Pe gelozăchocolate, coloniile ating 1-3 mm abia după 36-48 ore, având aspectul unor picături de rouă. 31. 2. 1. 4. Caractere biochimice şi de metabolism

Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi. Necesită pentru dezvoltare factorii X şi V. Fermentează inconstant carbohidraţii. Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol -pozitive (transformă triptofanul în indol). Pe baza unor teste biochimice specia a putut fi împărţită în 8 biotipuri. Majoritatea tulpinilor izolate de la pacienţi se încadrează în biotipurile I-IV; majoritatea tulpinilor cu capsulă de tip b fac parte din biotipul I. 31. 2. 1. 5. Acţiunea agenţilor fizici şi chimici Rezistenţa în mediu este scăzută. Prin uscare sunt distruşi rapid. În spută pot rezista până la 48 de ore. Sunt distruşi de dezinfectanţii obişnuiţi sau de menţinerea timp de 30 minute la 56ºC. Datorită viabilităţii reduse, cultura trebuie repicată pe mediu proaspăt la un interval de 5-6 zile. Totuşi, în tuburi închise (cu geloză-chocolate), cultivate din abundenţă, culturile de H. influenzae ar putea rezista până la 4-5 săptămâni, la temperatura camerei. Cele mai bune metode de conservare sunt reprezentate de a. liofilizare şi de b. menţinerea la -70ºC (după cultivare în mediu lichid, îmbogăţit, cu 20% glicerol). 31. 2. 1. 6. Structură antigenică Tulpinile virulente prezintă o capsulă polizaharidică ce are o compoziţie diferită, în funcţie de tipul serologic. Tipurile (a-f) se pot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei şi de imunofluorescenţă folosind seruri specifice. Cel mai răspândit şi mai patogen este tipul b, la care antigenul este poliribozil-ribitol-fosfat (PRP) şi prezintă înrudiri antigenice cu Streptoccocus pneumoniae, Streptoccocus pyogenes, Stafiloccocus epidermidis, Enteroccocus feccalis, Bacillus pumilus (majoritatea microorganismelor din flora normală a tractului respirator nu prezintă capsulă). Totuşi, răspunsul imun faţă de structura capsulară de tip b este slab, ineficient, în primii ani de viaţă (0-2 ani), exact în perioada în care infecţiile cu H. influenzae au potenţialul cel mai grav. Antigenele somatice sunt reprezentate de cel puţin două proteine: substanţa M, un antigen de suprafaţă labil şi substanţa P, care constituie o parte însemnată a corpului bacterian. Endotoxina (Ag 0, LOZ) se poate extrage de exemplu din culturi realizate în mediu lichid, dar natura ei antigenică nu este foarte clară. Tulpinile din tipul antigenic b produc bacteriocine (hemocine). Hemocinele prezintă activitate faţă de tulpini capsulate de alte tipuri, faţă de tulpinile necapsulate, faţă de alte specii de Haemophilus şi faţă de unele enterobacterii. 31. 2. 1. 7. Răspuns imun La nou-născuţi şi la sugarii sub 3 luni există o stare de imunitate, anticorpii provenind de la mamă. După această vârstă, concentraţia de anticorpi scade. În SUA, Haemophilus influenzae este cea mai frecventă cauză de meningită la copii între 5 luni şi 5 ani. Diferite

studii demonstrează că la vârsta de 3-5 ani un număr important de copii au anticorpi anti-prp care contribuie la realizarea lizei dependentă de complement şi stimulează fagocitoza. Există o corelaţie (insuficient de bine precizată practic) între anticorpii bactericizi şi rezistenţa la infecţii grave cu Haemophilus influenzae. 31. 2. 1. 8. Caractere de patogenitate Haemophilus influenzae este un microorganism condiţionat patogen. Prezintă adezine de suprafaţă (filamentoase). Endoxina are un rol redus în patogenitate. Rolul antigenelor somatice urmează să fie clarificat. Rolul esenţial îl are capsula, iar din cele şase tipuri, tipul b apare în circa 90% din cazurile severe de infecţie cu Haemophilus influenzae. H. influenzae mai produce IgA protează şi 2 proteine pentru achiziţia de fier. Tulpinile necapsulate se pare că îşi exercită virulenţa datorită structurii peptidoglicanului (cu acţiune pro-inflamatorie), LOZ, Cu şi Zn-super oxid dismutaza. 31. 2. 2. Patogenie şi principalele boli produse Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare şi invazie. Microorganismul pătrunde pe cale respiratorie. Boala debutează ca o rinofaringită acută, probabil în asociere cu o infecţie virală la nivelul tractului respirator. Aceasta poate fi urmată de epiglotită, laringotraheită, otită, sinuzită, mai rar de pneumonie, dar şi de meningită acută purulentă la copiii mici preşcolari. Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate prin extensie locală (se poate nota faptul că Haemophilus influenzae tip b şi pneumococul se numără printre agenţii etiologici comuni ai otitei medii bacteriene şi ai sinuzitelor acute). Dacă microorganismul pătrunde în torentul sanguin, pe această cale poate infecta meningele. Ocazional infecţia cu H. influenzae poate duce la o laringotraheită obstructivă fulminantă care necesită traheotomie sau intubare promptă a copilului respectiv. 31. 2. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Haemophilus influenzae Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Haemophilus influenzae este bacteriologic, direct. În vederea discutării examenului de laborator vom avea în vedere meningita. În meningita produsă de H. influenzae diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu sechele şi /

sau deces), de importanţă maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către laborator. Este de preferat realizarea unei cultivări la patul bolnavului, chiar dacă pentru concentrarea germenilor ar putea fi necesară centrifugarea LCR. Analiza citologică şi biochimică a LCR este utilă în stabilirea etiologiei. Tulpinile capsulate (prezintă Ag de tip K) se pot identifica în produsul patologic (LCR sau urină, după centrifugare) prin contraimunoelectroforeză, latex aglutinare, coaglutinare sau ELISA. Pot apărea reacţii fals-pozitive datorită unor înrudiri antigenice, pentru că antigenele capsulare tip a, b, c şi f, conţin acizi teichoici. O altă problemă tehnică este reprezentată de faptul că există şi tulpini autoaglutinabile. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse de Haemophilus influenzae se pot recolta secreţii de la nivelul tractului respirator superior sau inferior, secreţii din sfera ORL, lichide recoltate prin puncţie, sânge, LCR etc. În continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat de LCR (vezi şi anexa nr. 6). Aşa cum am mai menţionat, recoltarea LCR prin puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar pentru pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură, repartizarea unei cantităţi de LCR pentru examenul citologic şi biochimic (vezi şi anexa nr. 6). În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37 C, refrigerarea este contraindicată). H. influenzae ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene etc. Din punct de vedere macroscopic, LCR poate avea aspect purulent. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Dacă LCR este franc purulent frotiurile se pot executa direct din p.p., în caz contrar realizăm iniţial centrifugarea LCR. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocobacililor Gram-negativi, fini, capsulaţi, dispuşi separat sau în grămezi aranjate în aceeaşi direcţie, uneori dispuşi în lanţuri scurte, situaţi intra sau extraleucocitar. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în

coloraţia Gram, ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă sau, recolorarea prelungită cu fucsină (vezi şi 31.2.1.2.). 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi anexa nr. 2). Haemophilus influenzae este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite. Unele tulpini de Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea creşterii 5-10% CO 2. Este necesară pentru incubare o atmosferă umedă, la 35-37 C, şi o durată de minim 24-48 de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de creştere precum hemina (factor X) şi factorul V care poate fi înlocuit prin NAD, NADP sau alte coenzime. Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este necesară eliberarea conţinutului acestora în mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică). Factorul V este sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase şi de dimensiuni mai mari în apropierea unei linii pe care a fost însămânţată o tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Pe de altă parte, atunci când produsele însămânţate sunt potenţial contaminate, este necesară folosirea mediilor selective (ex. cu bacitracină, vancomicină, clindamicină şi amfotericină B). Coloniile sunt de tip S sau M şi ating un diametru de 0,5-0,8 mm după 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, având aspectul unor picături de rouă pe geloză-chocolate. Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3 µm), dispuşi separat sau în grămezi, uneori dispuşi în lanţuri scurte. În medii complexe, la 6-8 ore, predomină formele cocobacilare, care au şi capsulă. În culturile vechi se caracterizează prin pleomorfism şi pierderea capsulei (dificultăţi de diagnostic diferenţial microbiologic). Caractere de cultură: produc coloniile de tip S sau M care ating un diametru de 0,5-0,8 mm după 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, având pe geloză-chocolate aspectul unor picături de rouă. Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorilor de creştere (X şi V). Factorul V este sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase şi de dimensiuni mai mari în apropierea unei linii pe care a fost însămânţată o tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul

de satelitism). Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză. Caractere biochimice: Testul porfirinei este util pentru a demonstra necesităţile de factor X. Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol pozitive (transformă triptofanul în indol). Fermentează inconstant diferiţi carbohidraţii. Pe baza unor teste biochimice (ex. indol, urează, ornitin decarboxilază) specia a putut fi împărţită în opt biotipuri. Utilizând galeria API NH (manuală) putem identifica specii de Neisseria, Haemophilus şi Branhamella catarrhalis, în numai 4 ore. Caractere antigenice: Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Haemophilus influenzae, prin tehnici imunologice, în funcţie de Ag K. Tipurile (a -f) se pot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei, imunofluorescenţă, aglutinare, latex-aglutinare şi coaglutinare. Tiparea LOZ poate fi realizată prin Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare în gel. Au fost caracterizate 5 serotipuri de H. influenzae. Prin aceleaşi tehnici (Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare în gel), tipul b capsular poate fi subtipat (11 subtipuri). Tulpinile necapsulate se pot identifica şi tipiza prin Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) sau prin tipizarea antigenelor OMP (electroforeză în gel de poliacrilamidă; această metodă poate fi utilizată şi pentru subtiparea tulpinilor cu capsulă de tip b). Alte teste: există sonde nucleotidice şi amorse (pentru PCR) produse comercial pentru identificarea H. influenzae (atât din cultură cât şi din produse patologice). 5. Antibiograma (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii tratamentului) este necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Este recomandată utilizarea unui mediu special, respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se pot utiliza şi truse automate pentru testare (ex. ATB HAEMO cu citire şi inter pretare după 18-24 ore sau rapid ATB E 4 cu citire şi interpretare după 4-5 ore incubare). Determinarea CMI şi CMB poate fi necesară şi se realizează prin metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi capitolul 7).

Identificarea răspunsului imun faţă de Haemophilus influenzae Identificarea prezenţei de anticorpi faţă de H. influenzae ar putea fi utilă pentru verificarea răspunsului imun în urma vaccinării. În acest scop au fost utilizate RIA şi ELISA. 31. 2. 4. Tratament Deoarece se estimează că mortalitatea datorită meningitei cu Haemophilus influenzae, în lipsa tratamentului, poate fi de până la 90%, la copii, punerea diagnosticului şi instituirea tratamentului corect reprezintă un deziderat major. Diagnosticul prompt şi tratamentul antimicrobian sunt esenţiale şi pentru scăderea implicării ulterioare neurologice şi intelectuale. Multe din tulpini sunt încă sensibile la ampicilină (circa 25% produc β lactamaze sub control plasmidic). Pentru infecţiile grave, până la obţinerea rezultatelor antibiogramei se poate administra ceftriaxonă. 31. 2. 5. Epidemiologie. Prevenire. Control Haemophilus influenzae tip b se transmite pe cale aeriană, interuman. Deoarece vaccinurile polizaharidice care conţin şi polimeri aparţinând peretelui celular, sunt slab imunogenice la copiii sub 2 ani, s-a realizat un vaccin la care polizaharidul este cuplat cu anatoxina difterică. Acest vaccin conjugat se administrează la copiii în vârstă de peste 18 luni. La minimum 2 luni după prima doză se poate administra a doua doză (între 18 şi 23 de luni). Deoarece vaccinul nu împiedică portajul, în situaţii epidemiologice se pot administra antibiotice în scop profilactic (ex. rifampicină 20 mg/kg-corp, timp de patru zile). În România nu se raportează (s -au nu s-au raportat) infecţiile invazive meningeale, produse de H. influenzae. Se raportează în schimb pneumoniile la care agentul etiologic este acest microorganism. Dacă în 1998 au fost raportate 425 cazuri iar în 2003 au fost raportate 307 cazuri, cel mai mare număr de cazuri s-a înregistrat în 2004 (969 cazuri, cu o incidenţă de 4,5 0 / 0000 ). În anul 2005 au fost înregistrate 263 cazuri iar în anul 2006, 313 cazuri (incidenţa fiind 1,5 0 / 0000 ). Subiectul diagnosticul de laborator în infecţii cu H. influenzae a fost de asemenea tratat în cursul de pregătire pe care dr. M. Popa l-a coordonat în 2004 (proiectul Phare, aprobat pentru România în anul 2000); din păcate, rezultatele nu sunt, încă, remarcate. Chiar şi după introducerea recomandării vaccinării anti - H. influenzae la copii, în SUA au fost înregistrate infecţii invazive cu acest microorganism. Incidenţa acestor manifestări a atins în 1996 cifra de 0,45 0 / 0000, cu 1.170 cazuri raportate, în 1998 s-au înregistrat 1.194 cazuri

(incidenţă 0,44 0 / 0000 ) iar în 1999, 1.309 cazuri (incidenţă 0,48 0 / 0000 ). În următorii ani, incidenţa s-a situat în jurul valorii de 0,70 0 / 0000 (0,7 în 2003; 0,72 în 2004 şi respectiv 0,78 în 2005, cu 2.304 cazuri raportate la nivel naţional). Autorităţile de sănătate publică americane supraveghează în mod special meningitele cu H. influenzae la copiii cu vârsta mai mică de 5 ani, situaţie pentru care sunt raportate şi serotipurile mai frecvent identificate (serotipul b este identificat într-un procent mai mic decât alte serotipuri; au existat şi tulpini ne-tipabile, în 2005). 31. 3. Haemophilus ducreyi Haemophilus ducreyi este agentul patogen al şancrului moale, maladie veneriană umană, identificată pentru prima dată în anul 1889, de către Ducrey. A fost izolat în anul 1900. Cu toate că studiile genetice arată că ar aparţine unui alt grup (1985-1991), deocamdată nu a fost propusă re-clasificarea acestei specii. În SUA au fost raportate 386 de cazuri (incidenţă 0,15 0 / 0000 ) în 1996, respectiv 189 cazuri în 1998 (0,07 0 / 0000 ) şi 143 cazuri în 1999 (0,06 0 / 0000 ). În următorii ani, numărul de cazuri raportate a fluctuat, dar nu a mai depăşit niciodată o valoare mai mare de 80 cazuri / an (78 cazuri raportate în 2000, 38 în 2001, 67 în 2002, 54 în 2003, 30 în 2004 şi respectiv 17 cazuri raportate în anul 2005). România nu a raportat cazuri de infecţie cu H. ducreyi (la nivel naţional); însă acest lucru nu înseamnă că astfel de cazuri nu ar exista. 31. 3. 1. Habitat Este strict patogen pentru specia umană; se poate izola uneori din leziunile bolnavului. Se dezvoltă intra- şi extracelular (mai frecvent). 31. 3. 2. Caractere morfologice Bacil scurt (sau cocobacil), dispus în perechi sau lanţuri paralele, Gram -negativ. Se colorează bipolar. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie decolorate 20 secunde, pentru că hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu bacterii Grampozitive, iar recolorarea nu se face cu safranină (care nu colorează bine hemofil ii), ci cu fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 20-30 minute. Frotiul colorat poate depista H. ducreyi în 40-70% dintre cazurile însoţite de secreţii şancroide [cocobacili, intra- şi extraleucocitari, coloraţi bipolar, dispuşi în lanţuri scurte sau medii, aspect asemănat de unii autori cu lanţurile de bicicletă ]. 31. 3. 3. Caractere de cultură

Necesită pentru cultivare factorul X. Creşte optim dacă produsul patologic este recoltat de la baza şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus vancomicină 3 µg/ml la 33-35ºC şi atmosferă de 10% CO 2. Coloniile sunt de dimensiuni mici şi apar după 3-7 zile de la cultivare. 31. 3. 4. Acţiunea agenţilor fizici şi chimici. Sensibil la acţiunea căldurii, uscăciunii şi dezinfectanţilor obişnuiţi. Sensibil la ampicilină, ceftriaxonă, cloramfenicol, rifampicină, biseptol, eritromicină, azitromicină, claritromicină. Poate deveni rezistent. 31. 3. 5. Structură antigenică Toate tulpinile sunt identice şi posedă un antigen cu capacitate sensibilizantă, precum şi antigenul O. Prezintă receptori pentru hemoglobină. 31. 3. 6. Patogenitate Caracterele de patogenitate includ: pilii, LOZ, toxina citotoxică, OMP care leagă hemoglobina, hemolizina, Cu-Zn superoxid dismutaza şi o proteină filamentoasă asemănătoare hemaglutininei. La om, după câteva zile (în medie 5-7 zile) de la contactul sexual infectant, în regiunea genitală apare şancrul moale (iniţial se formează o papulă sensibilă, cu eritem în jur, urmată de apariţia unei pustule şi apoi a unei eroziuni care ulcerează), dureros, cu eritem şi edem. Pot exista şancre multiple. Sângerează uşor dacă este manipulat. Ganglionii regionali sunt măriţi, dureroşi şi pot supura. Nu sunt depăşite limfaticele învecinate. Diagnosticul diferenţial trebuie făcut cu sifilisul, infecţia cu virusul Herpes simplex, limfogranulomatoza veneriană. 31. 3. 7. Diagnostic de laborator 31. 3. 7. 1. Diagnosticul de laborator este în special microbiologic (bacteriologic, direct). 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse de Haemophilus ducreyi se pot recolta secreţii de la nivel genital (raclarea secreţiei de sub marginea şancrului; puroi din abces). 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Putem vizualiza intra sau extra celular b acili de

dimensiuni mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi în perechi sau lanţuri paralele (în şiruri), frecvent în asociere cu alte microorganisme. Se pot colora bipolar. 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Cultivarea H. ducreyi este dificilă. Necesită pentru cultivare factorul X. Se poate dezvolta dacă produsul patologic este recoltat de la baza şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus vancomicină 3 µg/ml la 33 C în atmosferă de 7-10% CO 2, timp de 3-7 zile. 4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: sunt bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi în perechi sau lanţuri paralele. Se pot colora bipolar. Caractere de cultură: produc coloniile de tip S de dimensiuni mici, după 3-7 zile de la cultivare. Pe geloză-sânge pot produce hemoliză. Caractere biochimice: Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorului de creştere (X); Haemophilus ducreyi este catalază-negativ. - Caractere antigenice: - Tiparea antigenelor OMP permit clasificarea în 7 subtipuri; - Pot fi utilizate în cadrul reacţiei de imunofluorescenţă indirectă. 5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii tratamentului) este necesară şi poate realiza (cu dificultate) prin metode difuzimetrice. 31. 3. 7. 2. Diagnosticul de laborator imunologic Şancrul moale este singura afecţiune produsă de microorganisme din genul Haemophilus în care diagnosticul serologic ar putea fi util. Identificare prezenţei anticorpilor este utilă şi în scop epidemiologic. Se pot utiliza tehnici de tip ELISA pentru identificarea anticorpilor IgG sau IgM care apar faţă de H. ducreyi. Este încă în discuţie utilitatea IDR cu Ag extrase din cultură de bacili Ducreyi. 31. 3. 8. Imunitate Există răspuns imun umoral şi celular dar nu există imunitate faţă de reinfecţie. 31. 3. 9. Tratament În şancrul moale se poate utiliza biseptol sau eritromicină pentru o perioadă de 2 săptămâni.

31. 4. Povestiri adevărate 31. 4. 1. Meningită cu H. influenzae Un copil de sex masculin, în vârstă de 3 ani este adus la camera de gardă a unui spital din provincie, cu febră, letargie (stare de toropeală, apatie, oboseală foarte mare, la limita păstrării stării de conştienţă, stare de somn prelungit); copilul plânge fără ca părinţii să poată găsi o explicaţie. La camera de gardă, prin discuţie cu mama se află că letargia a apărut cu o seară înainte, iar starea actuală (plâns quasi-continuu şi febră) au apărut în ziua prezentării la spital. Mama nu a pus termometrul apreciind personal că este vorba de febră. Termometrizarea la camera de gardă arată că acest copil are 39ºC. Examenul clinic demonstrează areactivitate, tensiunea arterială este 110/52 mm Hg, iar numărul de bătăi cardiace pe minut este 144. Medicul de gardă ia decizia de a recolta 2 probe de sânge pentru hemoculturi ca şi pentru alte analize de laborator, începe ulterior recoltării sângelui administrarea unei cefalosporine de generaţia a 3-a şi ia legătură cu spitalul judeţean unde solicită ca pacientul să fie primit; primeşte acordul şi o salvare transportă copilul însoţit de mamă şi de medic la al doilea spital. Se efectuează puncţia lombară şi se constată că LCR este opalescent, uşor hipertensiv, reacţia Pandy ++, 200 celule / mm 3 (dintre care 93% PMN). Examenul microscopic al p.p. este negativ (sunt vizibile PMN dar nu şi microorganisme). În baza datelor clinice şi de laborator, diagnosticul este meningită bacteriană ; se continuă tratamentul cu medicamentul prescris la primul spital. A treia zi, se primeşte rezultatul hemoculturilor efectuate înainte de administrarea antibioticelor; microorganismul vizualizat pe frotiul colorat este de formă cocobacilară, Gram-negativ. Primul spital transferă către spitalul judeţean şi culturile obţinute, iar diagnosticul bacteriologic continuă la acest nivel. Diagnosticul bacteriologic confirmă ceea ce fusese presupus: meningită cu Haemophilus influenzae, tip capsular b, sensibil la medicamentul prescris la primul spital. Tratamentul continuă până la împlinirea unei cure de tratament de 2 săptămâni. Copilul este externat: vindecat, fără sechele. Prezentarea la timp la camera de gardă, recoltarea sângelui pentru hemoculturi, consultul cu spitalul de nivel superior şi tratamentul medicamentos au asigurat un prognostic bun pentru micul pacient. De subliniat: meningita cu H. influenzae la copilul 3 ani poate avea o evoluţie gravă, uneori fatală. 31. 4. 2. Epiglotita, o situaţie care poate fi foarte gravă

Nu foarte greu de tratat, dar destul de greu de cultivat (H. influenzae)! Câteva sindroame clinice sunt mai frecvent produse de hemofil, de exemplu epiglotita acută a copilului. La un copil febril, cu dureri mari de gât, cu semne de respiraţie dificilă, fără semne importante de tiraj costal, cu o poziţie specifică în cursul respiraţiei (aplecat în faţă), trebuie evitată examinarea laborioasă a faringelui, dacă nu ne aflăm într-un serviciu ORL. Vizualizarea epiglotei (omuşor) intens roşie contraindică apăsarea cu abeslangul pentru a recolta exudatul. Această manevră poate induce (reflex) sufocarea. Etiologia cea mai frecventă este H. influenzae. Se administrează i.v. o cefalosporină de generaţia a 3-a cu sau fără asocierea unui macrolid şi se trimite, rapid, într-o secţie ORL, fără a încerca confirmarea bacteriologică înainte de începerea tratamentului. 31. 4. 3. Izbucnire epidemică de infecţii produse de H. ducreyi, în USA În perioada mai 1981 - ianuarie 1982, într-un district din statul California, au fost raportate peste 1.000 de cazuri de infecţie cu Haemophilus ducreyi, dintre care aproximativ 400 prezentau afecţiuni în sfera genitală (şancru moale, ulceraţie genitală etc.). Având în vedere această izbucnire epidemică ( outbreak ), reacţia autorităţilor de sănătate publică a fost substanţială. Toate cazurile confirmate, precum şi contacţii acestora au primit eritromicină şi cotrimoxazol. Totuşi, numărul cazurilor raportate a continuat să crească în următoarele şase luni, înregistrându-se circa 30 de cazuri noi pe lună. În încercarea de a reduce dimensiunile acestei adevărate probleme de sănătate publică, tratamentul antimicrobian a fost administrat şi la alţi 287 de contacţi, descoperiţi ulterior, în mod activ (majoritatea prostituate) ca şi în alte 700 de cazuri considerate probabile, încă neconfirmate. Măsurile adoptate au avut succes, numărul cazurilor înregistrate scăzând la 14 în luna iulie şi 10 cazuri în luna august. Ultimul caz confirmat prin diagnostic de laborator a fost raportat în ianuarie 1983. Până în 1981 nu se mai raportaseră atât de multe cazuri de infecţie cu H. ducreyi, iar după 1983, numărul acestora a scăzut în mod constant. În cadrul acestei izbucniri epidemice, 96% dintre pacienţi au fost de origine hispanică şi 86% dintre aceştia au recunoscut faptul că au avut cel puţin un contact sexual neprotejat cu prostituate. Pentru obţinerea acestor informaţii, echipele de sănătate publică s-au deplasat din uşă în uşă. În 15 cazuri, a fost confirmată o dublă infecţie, cu H. ducreyi şi Treponema pallidum. Într-un singur caz s-a pus în evidenţă infecţia cu herpes simplex virus de tip II (HSV II), alături de H. ducreyi. Numărul cazurilor din cursul acestei epidemii a fost de peste şapte ori mai mare decât în anii precedenţi.

Instituirea antibioterapiei la pacienţi şi contacţii confirmaţi ai acestora a fost utilă, însă nu suficientă, epidemia evoluând în continuare. Situaţia s-a ameliorat numai după instituirea tratamentului profilactic atât în cadrul comunităţilor de femei cu moravuri uşoare din districtul respectiv (neţinându -se seamă de existenţa tabloului clinic asimptomatic sau de prezenţa unor ulceraţii genitale de natură neprecizată), cât şi în rândul clienţilor acestora, care prezentau sau nu semne ale bolii. Discuţii Situaţia prezentată poate fi considerată de excepţie, întrucât izbucnirile epidemice care au drept agent etiologic Haemophilus ducreyi sunt rare iar numărul de cazuri este, de regulă, relativ mic ( discrete outbreaks ). În aproximativ 10% dintre cazurile confirmate de şancru moale poate apărea co-infecţia cu T. pallidum sau cu HSV II. Tulpinile izolate au fost rezistente la sulfametoxazol şi tetraciclină şi sensibile la eritromicină. Şancrul moale în infecţia cu H. ducreyi (în limba engleză chancroid ) ar putea fi confundat cu sifilisul primar sau cu herpesul genital. Supravegherea epidemiologică a continuat timp de şase luni de la raportarea ultimului caz confirmat, punându-se în evidenţă încă o dată necesitatea emiterii unui diagnostic corect întrun timp cât mai scurt şi a instituirii anchetei epidemiologice extensive în orice epidemie. Istoricul acestei izbucniri epidemice subliniază pe de o parte existenţa unor particularităţi în relaţie cu infecţiile cu transmitere pe cale sexuală iar pe de altă parte necesitatea unui sistem de sănătate publică care să funcţioneze corespunzător, în permanenţă. 32. Genul Bordetella. Bordetella pertussis (MI Popa) 32. 1. Definiţie. Încadrare Genul Bordetella cuprinde cocobacili Gram-negativi asemănători celor din genul Haemophilus, strict aerobi. Specia tip este reprezentată de B. pertussis agentul etiologic al tusei convulsive izolată în 1906 de Bordet şi Gengou; alte exemple sunt reprezentate de Bordetella parapertussis şi Bordetella bronchiseptica. În afară de aceste trei specii (foarte înrudite din punct de vedere genetic) mai sunt cunoscute încă alte cinci.

32. 2. Caractere generale 32. 2. 1. Habitat Bordetelele se pot localiza la nivelul cililor epiteliului respirator; nu au capacitatea de a invada. Reprezintă microorganisme care infectează organismul uman, uneori şi animale cu sânge cald. 32. 2. 2. Caractere morfologice Bordetella pertussis este un cocobacil Gram-negativ, cu dimensiunea de 0,5 μm / 0,5-2 μm, imobil. Atunci când este recent izolat prezintă capsulă. În primele ore de cultivare prezintă pili ataşaţi de peretele bacterian. După 24 ore, pilii se pot identifica în mediul de cultură. Prin treceri succesive microorganismul devine polimorf, lipsit de capsulă şi pili. De regulă celulele bacteriene apar izolate sau în pereche, foarte rar în lanţuri. Dacă se practică o colorare cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule metacromatice situate bipolar. 32. 2. 3. Caractere de cultură B. pertussis este unul din germenii care se cultivă şi se izolează dificil. Fiind inhibat de acizi graşi, peroxizi organici etc, nu se dezvoltă pe mediile uzual folosite în diagnosticul bacteriologic. Necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o temperatură optimă de 35-37ºC. Cel mai cunoscut mediu de cultură este mediul Bordet-Gengou care conţine agar, macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de penicilină sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit dezvoltarea microorganismelor. După 3-6 zile de incubare la 37ºC se pot dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uşor transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un halou de hemoliză (faza I). În lumina transmisă oblic par ca picăturile de mercur. La izolare este necesar mediul Bordet-Gengou, însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau pe geloză simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor apărea modificări morfologice (pleomorfism), alterări structurale, virulenţa fiind scăzută. Incubarea se realizează 3-7 zile la 35-37ºC în atmosferă umedă. Ar fi de menţionat că în această etapă de izolare diagnosticul poate fi urgentat, realizându-se identificarea microorganismului prin imunofluorescenţă. Aspecte genetice

Referitor la modificările antigenice care apar în cursul cultivării, s-a descris la Bordetella pertussis variaţia de fază. Faza I se întâlneşte la tulpinile izolate din produse patologice cultivate pe medii îmbogăţite. Sunt tulpini în formă de S, virulente, capsulate cu mare capacitate imunogenă. Vaccinurile se prepară folosind culturi în faza I. Fazele II şi III sunt intermediare. Faza IV se întâlneşte la tulpini care se pot multiplica pe medii obişnuite. Au aspectul caracteristic formelor R. Sunt degradate antigenic, nu produc toxină şi nu prezintă nici alţi factori de patogenitate. 32. 2. 4. Caractere biochimice Sunt germeni strict aerobi, cu temperatură optimă de dezvoltare 35-37ºC, nu necesită prezenţa factorilor X sau V, metabolizează oxidativ o serie de aminoacizi (ex. acidul glutamic) etc. Tulpinile virulente produc hemoliză. 32. 2. 5. Acţiunea factorilor fizici, chimici În afara organismului Bordetella pertussis are o rezistenţă scăzută. Rezistă maximum 2 ore la temperatura camerei. Lumina solară o distruge în 60 de minute, iar la 55ºC este distrusă în 30 de minute. 32. 2. 6. Structură antigenică Structura antigenică este foarte complexă, bacteria prezentând spre exemplu: - 1 hemaglutinină fimbrială (de natură proteică, cu structură filamentoasă, FHA); - aglutinogene de suprafaţă (K), de natură proteică. Există aglutinogene specifice de gen şi de specie. Datorită implicaţiilor epidemiologice, ar fi de menţionat că microorganismul are capacitatea de a-şi modifica serotipul in vitro; - la nivelul peretelui celular există lipopolizaharidul (endotoxina), antigen comun germenilor Gram-negativi. În afară de aceste antigene mai există şi o serie de substanţe active cu rol important în patogenia bolii şi care ar putea fi grupate astfel: - toxina pertussis (TP), factor major de vir ulenţă, dar şi cel mai important antigen şi imunogen. Este o exotoxină formată din 2 subunităţi (A şi B); - adenilatciclaza; - toxina letală (dermonecrotică); - citotoxina traheală.

32. 2. 7. Răspuns imun După infecţie apar titruri înalte de anticorpi anti-tp şi anti-fha. Titrul anticorpilor anti- TP persistă timp îndelungat (posibil pe tot parcursul vieţii), fiind corelaţi cu imunitatea faţă de o nouă îmbolnăvire. 32. 2.8. Caractere de patogenitate B. pertussis este patogenă în special prin localizare, multiplicare şi toxinogeneză. În realizarea adeziunii la epiteliul ciliat respirator, un rol important îl au: - fimbriile; - aglutinogenele; - hemaglutinina filamentoasă (FHA); - pertactinele (PRNs); - toxina pertussis. Bacteria se multiplică rapid, interferă cu activitatea muco-ciliară normală, produce toxine care determină apariţia manifestărilor clinice (toxinele au fost menţionate anterior). Endotoxina (LOZ) are, probabil, un rol în patogenitate. 32. 3. Patogenie. Principalele afecţiuni produse Bordetella pertussis este patogenă numai pentru om. Transmiterea se realizează în special pe cale aeriană (picături Pflügge) într -un acces de tuse. Contagiozitatea este maximă în primul stadiu de boală şi la începutul stadiului al doilea (de tuse paroxistică). Microorganismul aderă, se multiplică rapid, interferă cu activitatea mucociliară normală, apar primele manifestări clinice care se agravează treptat. Substanţele toxice elaborate (şi în special TP) au următoarele acţiuni: - după legarea subunităţii B (a TP) pe s uprafaţa celulelor gazdei, are loc penetrarea subunităţii A. Subunitatea A se leagă de proteina Gi de la nivelul membranei celulare, o inhibă şi rezultă o stimulare a adenilatciclazei şi respectiv o creştere a sintezei de AMPc. Dintre efectele negative care se datorează sintezei de TP putem enumera hipoglicemia, sensibilizarea la histamină, reducerea activităţii macrofagelor, diminuarea răspunsului imun umoral (sinteza de anticorpi); - adenilatciclaza pertussis diminuă activitatea fagocitară a macrofagelor şi leucocitelor; - toxina letală produce necroze locale; - citotoxina traheală produce ciliostază şi distrugerea celulelor respiratorii ciliate (favorizând, probabil, acumularea de mucus, tusea şi apariţia infecţiilor secundare).

Boala la om se numeşte tuse convulsivă ( tuse măgărească ). După o incubaţie de 7-10 zile, încep manifestările clinice care evoluează în două faze. În prima fază (catarală), care durează aproximativ 10 zile, microorganismul colonizează căile respiratorii superioare, determinând manifestări necaracteristice, asemănătoare unei infecţii respiratorii obişnuite: tuse, strănut, temperatură. În această etapă, pacientul este foarte contagios, elimină prin tuse un număr foarte mare de microorganisme. Diagnosticul de laborator bacteriologic este posibil prin prelevări cu tampon steril de la nivelul faringelui sau prin metoda plăcilor tuşite. Gravitatea şi durata bolii pot fi reduse dacă se face tratament antimicrobian corect. În caz contrar simptomele se agravează treptat. Faza a doua (parox istică) este stadiul toxemic, cu accese de tuse paroxistică, accese adeseori tipice, cu sonoritatea caracteristică. În acces, după o inspiraţie prelungită, forţată, urmează 5-10 secuse expiratorii spasmodice, datorită contracţiei musculaturii bronşice şi glotice (de unde şi denumirea de tuse măgărească dată bolii în ţara noastră sau de cocqueleuche în limba franceză). Adesea accesul se termină cu vomă şi cu aspirarea vomismentelor. Pot apărea cianoză, convulsii, anxietate. La o parte dintre pacienţi nu apar accese paroxistice tipice. La cei la care apar, pot fi până la 30 accese pe zi, mai frecvente în timpul nopţii. Pe parcursul stadiului toxemic apare şi limfocitoza periferică caracteristică, precum şi hipoglicemia. Datorită obstrucţiei bronhiolelor mici cu dopuri de secreţii mucoase, precum şi datorită tusei şi inspirului amplu, pot apărea o serie de complicaţii pulmonare. Problema eliminării secreţiilor este mai importantă la copii deoarece stagnarea secreţiilor contribuie la instalarea hipoxiei şi dificultăţilor de nutriţie. Uneori apar complicaţii şi la nivelul sistemului nervos central, care pot fi foarte grave (encefalita pertussis). Faza a doua durează 2-4 săptămâni şi este urmată de convalescenţă, care durează 2-3 săptămâni. 32. 4. Diagnosticul de laborator Diagnosticul de laborator poate fi bacteriologic sau imunologic. 32. 4. 1. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Bordetella pertussis este bacteriologic, direct. Diagnosticul etiologic este foarte util în primul stadiu al tusei convulsive (pacientul este foarte contagios iar evoluţia bolii poate fi influenţată pozitiv prin administrarea de antibiotice). Diagnosticul bacteriologic poate fi realizat în timpul fazei catarale şi în prima parte a fazei paroxistice (foarte rar se mai pot obţine rezultate, la mai mult de 4 săptămâni de

la debut, în special pentru că, se administrează antibiotice şi chimioterapice). Detectarea adenilat ciclazei (prin activitatea enzimatică) şi a toxinei pertussis (prin efectul c itotoxic sau imunoteste), în produsul patologic, eventual după îmbogăţire, sunt promiţătoare, dar nu au intrat în practică. O valoare a numărului de leucocite de 16-50.000 / dl sânge, cu limfocitoză absolută, vine în sprijinul diagnosticului de tuse convulsivă. Identificarea B. pertussis la persoanele asimptomatice (sau cu simptome nespecifice) şi respectiv la contacţi ar permite aplicarea unor măsuri preventive. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În infecţiile produse de Bordetella pertussis se pot recolta secreţii de la nivelul tractului respirator superior (nazal, faringian). Vom realiza recoltarea cu ajutorul tamponului din alginat de calciu care se lasă pe loc 30-60 de secunde pentru a favoriza adsorbţia B. pertussis (bumbacul inhibă dezvoltarea microorganismelor) sau prin aspirarea secreţiilor traheobronşice. Este descrisă (istoric) şi metoda plăcilor tuşite (se expune o placă Petri cu mediul Bordet-Gengou la care s-a adăugat antibiotic, deschisă, la aproximativ 20 cm în faţa gurii bolnavului în timpul accesului de tuse). Este recomandată prelucrarea imediat a p.p., dacă este posibil la patul bolnavului (microorganismul este foarte puţin rezistent în mediul extern). Nu există o metodă perfectă pentru recoltarea p.p. atunci când se suspicionează o infecţie cu B. pertussis (toate metodele au diferite limite atât din punctul de vedere al sensibilităţii sau specificităţii cât şi din punct de vedere practic). 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Examinăm frotiurile la microscopul optic cu imersie şi notăm prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocobacililor Gram-negativi, dispuşi separat sau în perechi, rareori în lanţuri scurte. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în coloraţia ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă (imunofluorescenţă directă) sau recolorarea prelungită cu fucsină sau safranină. 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2). Bordetella pertussis este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite; este inhibat de acizi graşi, peroxizi organici etc. Izolarea B.

pertussis în culturi este dificilă, dar eforturile sunt necesare pentru a putea fi evaluată variaţia genetică (de fază) şi respectiv pentru a putea supraveghea fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice. Bordetella pertussis necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o temperatură optimă de 35-37 C, cu incubare timp de 3-7 zile, în aerobioză şi atmosferă umedă. Cel mai cunoscut mediu de cultură este mediul Bordet-Gengou care conţine agar, macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de penicilină / meticilină sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit dezvoltarea microorganismelor. Dezavantajul principal al mediului clasic Bordet-Gengou este reprezentat de timpul scurt în care poate fi utilizat (1-7 zile). Actualmente se recomandă utilizarea unui mediu folosit iniţial ca mediu de transport, care include geloză nutritivă, cărbune activat şi este suplimentat cu 10% sânge de cal. Acest mediu poate fi utilizat pe parcursul a 1-2 luni, iar coloniile de B. pertussis apar mai rapid. În vederea izolării primare este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu cărbune activat, însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau chiar şi pe geloză simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor apărea modificări morfologice (pleomorfism), alterări structurale, virulenţa fiind scăzută. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili Gram-negativi, mici, cu dimensiunea de 0,2-0,5 μm / 0,5-2 μm, imobili, dispuşi separat sau în perechi, rareori în lanţuri scurte, cu tendinţa de a deveni pleomorfi în urma subcultivărilor (pot apărea şi forme filamentoase). Utilizând coloraţii speciale, în coloniile rezultate din primoculturi se pot evidenţia structurile capsulare. Dacă frotiul se colorează cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule metacromatice situate bipolar. Imunofluorescenţa directă este utilă şi pentru identificarea microorganismului după cultivare. Caractere de cultură: Produc colonii de tip S sau M. După 3-7 zile de incubare la 37 C pe mediul Bordet- Gengou se pot dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uşor transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un halou de hemoliză (faza I).

În lumina transmisă oblic coloniile seamănă cu picăturile de mercur. Pe mediul cu cărbune activat coloniile apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre, cu suprafaţa perlată. Caractere biochimice: Bordetella pertussis este hemolitică, oxidază-pozitivă, urează-negativă. Se pot utiliza truse comerciale manuale care identifică specii de bacili Gramnegativi (BGN) (ex. API 20 E, API 20 NE), fiind de regulă necesare şi teste adiţionale de identificare. Caractere antigenice: Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Bordetella pertussis, prin reacţia de aglutinare pe lamă. Alte teste de identificare utilizate în laboratoare de referinţă: Se poate utiliza amplificarea genetică folosind diferite amorse ( primeri); tehnica PCR are o bună specificitate şi sensibilitate dezavantajul principal fiind reprezentat de costul ridicat. 5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii tratamentului) poate fi necesară în scopul supravegherii apariţiei fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi se realizează prin metode difuzimetrice. 32. 4. 2. Diagnosticul serologic Diagnosticul serologic este de mică importanţă pentru pacientul cu tuse convulsivă, deoarece o creştere semnificativă a anticorpilor aglutinanţi sau precipitanţi se realizează abia din a doua sau a treia săptămână de boală. Din punct de vedere tehnic au fost utilizate RFC, reacţiile de aglutinare, hemaglutinare şi hemaglutinoinhibare sau tehnicile de tip ELISA. Diagnosticul serologic poate fi realizat în cadrul unor studii epidemiologice, în scop de cercetare; ar putea fi, eventual, util în diagnosticul diferenţial (retrospectiv). 32. 5. Tratament Administrarea eritromicinei în faza catarală duce la blocarea multiplicării microorganismului, reduce gravitatea simptomelor şi are valoare profilactică diminuând perioada în care pacientul este contagios. Se mai pot administra rifampicină, tetraciclină, cloramfenicol, gentamicină dar nu ampicilină. Tratamentul cu antibiotice, instituit după debutul fazei paroxistice, rareori mai poate influenţa cursul boli. În general are drept mic beneficiu limitarea contagiozităţii pacientului respectiv.