ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΜΥΝΑΣ ΣΤΟ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΩΝ ΠΤΗΝΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΓΡΟΤΙΚΩΝ ΖΩΩΝ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΜΥΝΑΣ ΣΤΟ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΩΝ ΠΤΗΝΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑΔΟΥ ΜΑΡΙΑ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΑΥΔΗ ΜΕΛΠΟΜΕΝΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2013

Τριµελής Συµβουλευτική Επιτροπή : Αυδή Μελποµένη Χαδιώ-Μάντζαρη Στέλλα Μιχαηλίδης Γεώργιος Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Αν. Καθηγήτρια Γ.Π.Α. Επ. Καθηγητής Α.Π.Θ. Επταµελής Εξεταστική Επιτροπή : Αυδή Μελποµένη Καρατζιάς Χαρίλαος Χαδιώ-Μάντζαρη Στέλλα Μιχαηλίδης Γεώργιος Βατζιάς Γεώργιος Θεοδωρίδης Αλέξανδρος Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Καθηγητής Α.Π.Θ. Αν. Καθηγήτρια Γ.ΠΑ. Επ. Καθηγητής Α.Π.Θ. Επ. Καθηγητής Α.Π.Θ. Λέκτορας Α.Π.Θ. Αργυρίου Αναγνώστης Ερευνητής Β Ε.Κ.Ε.Τ.Α - ΙΝΕΒ

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Αναπαραγωγής των Αγροτικών Ζώων της Κατεύθυνσης Ζωικής Παραγωγής, υπό την επίβλεψη της Καθηγήτριας και Διευθύντριας του Εργαστηρίου, κας Μελποµένης Αυδή. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα Καθηγήτρια του Τµήµατος Γεωπονίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ., κα. Αυδή Μελποµένη, καταρχήν για την ευκαιρία, την εµπιστοσύνη και την καίρια συµβολή της στην απόφασή µου να εκπονήσω διδακτορική διατριβή, καθώς επίσης και για την ειλικρινή υποστήριξη και την πολύπλευρη µέριµνά της για την ολοκλήρωση της διατριβής, τόσο κατά τη διεξαγωγή των πειραµάτων, όσο και κατά τη διάρκεια της συγγραφής. Παράλληλα εκφράζω τις θερµές µου ευχαριστίες στον Επίκουρο Καθηγητή του Τµήµατος Γεωπονίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ., κ. Μιχαηλίδη Γεώργιο για την πολύτιµη καθοδήγηση, την εποικοδοµητική συνεργασία και την αµέριστη συµπαράσταση που µου παρείχε καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής, έτσι ώστε να αποκτήσω νέες εµπειρίες και προσανατολισµούς σχετικά µε την έρευνα. Επιπροσθέτως, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τµήµατος Επιστήµης Ζωικής Παραγωγής και Υδατοκαλλιεργειών του Γ.Π.Α. και µέλος της Συµβουλευτικής Επιτροπής, κα. Χαδιώ-Μάντζαρη Στέλλα, της οποίας η ενεργός συνεισφορά και οι επιστηµονικές της συµβουλές και διορθώσεις, υπήρξαν πολύτιµες σε όλη τη διάρκεια της διατριβής µου. Περαιτέρω, ευχαριστώ θερµά τον Λέκτορα του Τµήµατος Κτηνιατρικής, της 1

Σχολής Επιστηµών Υγείας του Α.Π.Θ., κ. Θεοδωρίδη Αλέξανδρο, για την αµέριστη βοήθειά του στην κατανόηση και καθοδήγηση της στατιστικής ανάλυσης των αποτελεσµάτων, καθώς επίσης και για τη συµβολή του στην ανάπτυξη των αναλυτικών µεθόδων που εφαρµόστηκαν. Επίσης, ευχαριστώ θερµά τα µέλη της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής κ. Καρατζιά Χαρίλαο, Καθηγητή του Τµήµατος Κτηνιατρικής της Σχολής Επιστηµών Υγείας του Α.Π.Θ., τον κ. Βατζιά Γεώργιο, Επίκουρο Καθηγητή του Τµήµατος Γεωπονίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ. και τον κ. Αργυρίου Αναγνώστη, Ερευνητή Β του Ε.Κ.Ε.Τ.Α ΙΝΕΒ, για την τιµή που µου έκαναν, καθώς επίσης και για την πρόθυµη συµµετοχή τους στην κρίση της διδακτορικής µου διατριβής. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον Ερευνητή του Ινστιτούτου INRA της Γαλλίας, Pascal Froment, για τη συνεργασία του, τις πολύτιµες συµβουλές του και την πραγµατοποίηση της αποµόνωσης και καλλιέργειας των κυττάρων Sertoli. Τέλος, ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω προς την µητέρα µου και τους αγαπηµένους µου ανθρώπους για τη συνολική υποστήριξη, τη συνεχή ενθάρρυνση και την ανοχή που επέδειξαν στις προτεραιότητες, που επέβαλε αυτή η προσπάθεια, όλα τα χρόνια των σπουδών µου. 2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... 3 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ... 6 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ... 7 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ... 9 ΑΠΟΔΟΣΗ ΑΓΓΛΙΚΗΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ... 12 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ... 12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 14 1.1. Αναπαραγωγικό σύστηµα της όρνιθας... 19 1.2. Ανοσοποιητικό σύστηµα... 21 1.2.1. Έµφυτη ανοσία... 22 1.2.2. Αναγνώριση παθογόνων µικροοργανισµών στην έµφυτη ανοσία... 25 1.2.3. Επίκτητη ανοσία... 26 1.3. Ο ρόλος των Toll-like υποδοχέων στο ανοσοποιητικό σύστηµα... 29 1.3.1. Συνδέτες... 31 1.3.2. Αναγνώριση εξωγενών συνδετών από τους TLRs... 32 1.3.3. Αναγνώριση ενδογενών συνδετών από τους TLRs... 34 1.3.4. Επαγόµενη σηµατοδότηση από την ενεργοποίηση των TLRs... 35 1.3.5. Τα TLRs στα πτηνά... 36 1.4. Ο ρόλος των αντιµικροβιακών πεπτίδιων στο ανοσοποιητικό σύστηµα... 37 1.4.1. Αντιµικροβιακά πεπτίδια Avian β-defensins (AvβDs)... 40 1.5. Ο ρόλος των κυτταροκινών στο ανοσοποιητικό σύστηµα... 41 1.6. Ο ρόλος του ανοσοποιητικού συστήµατος στη φυσιολογία αναπαραγωγής... 45 3

1.7. Μολύνσεις αναπαραγωγικού συστήµατος - Σαλµονέλα... 49 1.8. Σκοπός της διατριβής... 57 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 58 2.1. Ζωικό υλικό... 58 2.2. Μολύνσεις µε Salmonella Enteritidis... 59 2.3. Αποµόνωση γενωµικού DNA... 61 2.4. Αποµόνωση RNA... 62 2.5. Χειρισµός µε DNase... 65 2.6. Σύνθεση cdna... 67 2.7. Σχεδιασµός εκκινητών και Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυµεράσης... 68 2.8. Ηλεκτροφόρηση DNA και RNA σε πήκτωµα αγαρόζης... 72 2.9. PCR πραγµατικού χρόνου (Real-Time PCR)... 75 2.10. Στατιστική Ανάλυση... 80 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 82 Μελέτη του πρότυπου έκφρασης και των αλλαγών των επιπέδων έκφρασης των AvβDs, των TLRs και των κυτταροκινών... 82 3.1. Έκφραση των AvβDs... 83 3.1.1. Έκφραση των AvβDs στον ωαγωγό... 83 3.1.2. Έκφραση των AvβDs στους όρχεις... 89 3.1.3. Έκφραση των AvβDs στην επιδιδυµίδα... 93 3.1.4. Έκφραση των AvβDs στα κύταρρα Sertoli... 97 3.2. Έκφραση των TLRs... 100 4

3.2.1. Έκφραση των TLRs στους όρχεις... 100 3.2.2. Έκφραση των TLRs στην επιδιδυµίδα... 105 3.2.3. Έκφραση των TLRs στα κύτταρα Sertoli... 109 3.3. Έκφραση των κυτταροκινών... 111 3.3.1. Έκφραση των κυτταροκινών στα έµβρυα... 111 3.3.2. Έκφραση των κυτταροκινών στην ωοθήκη... 113 3.3.3. Έκφραση των κυτταροκινών στον ωαγωγό... 118 3.3.4. Έκφραση των κυτταροκινών στους όρχεις... 123 3.3.5. Έκφραση των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα... 127 3.3.6. Έκφραση των κυτταροκινών στα κύτταρα Sertoli... 131 3.4. Συζήτηση... 135 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 153 5. ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 155 6. SUMMARY... 159 7. ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ... 162 8. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 163 5

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1. Οι µεγαλύτερες παραγωγικές χώρες κρέατος πουλερικών στην Ευρωπαική Ένωση, τα έτη 2008 και 2010... 16 Πίνακας 2. Ονοµασία, νουκλεοτιδική αλληλουχία εκκινητών των γονιδίων της οικογένειας των Toll-like υποδοχέων (TLRs), µήκος του PCR προϊόντος σε cdna και θερµοκρασία σταθεροποίησης των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα έκφρασης και ποσοτικοποίησης των επιπέδων της έκφρασης µέσω των τεχνικών RT- PCR και Real-Time PCR, αντίστοιχα... 69 Πίνακας 3. Ονοµασία, νουκλεοτιδική αλληλουχία εκκινητών των γονιδίων της οικογένειας των αντιµικροβιακών πεπτιδίων Avian β-defensins (AvβDs), µήκος του PCR προϊόντος σε cdna και θερµοκρασία σταθεροποίησης των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα έκφρασης και ποσοτικοποίησης των επιπέδων της έκφρασης µέσω των τεχνικών RT-PCR και Real-Time PCR, αντίστοιχα... 70 Πίνακας 4. Ονοµασία, νουκλεοτιδική αλληλουχία εκκινητών των γονιδίων της οικογένειας των κυτταροκινών, µήκος του PCR προϊόντος σε cdna και θερµοκρασία σταθεροποίησης των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα έκφρασης και ποσοτικοποίησης των επιπέδων της έκφρασης µέσω των τεχνικών RT-PCR και Real- Time PCR, αντίστοιχα... 71 6

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1. Παραγωγή κρέατος στην Ελλάδα το 2010... 17 Εικόνα 2. Έµφυτη και επίκτητη ανοσία... 31 Εικόνα 3. TLRs και οι συνδέτες τους... 31 Εικόνα 4. Βακτήριο Salmonella spp... 54 Εικόνα 5. Ηλεκτροφόρηση δειγµάτων RNA σε πηκτή αγαρόζης 1%... 83 Εικόνα 6. Έκφραση των AvβDs στον ωαγωγό ορνίθων, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR... 83 Εικόνα 7. Έκφραση των AvβDs στους όρχεις αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR... 89 Εικόνα 8. Έκφραση των AvβDs στην επιδιδυµίδα αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR... 93 Εικόνα 9. Έκφραση των AvβDs στα κύτταρα Sertoli, µέσω της RT-PCR... 97 Εικόνα 10. Έκφραση των TLRs στους όρχεις αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR... 100 Εικόνα 11. Έκφραση των TLRs στην επιδιδυµίδα αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR... 105 Εικόνα 12. Έκφραση των TLRs στα κύτταρα Sertoli, µέσω της RT-PCR... 109 Εικόνα 13. Έκφραση των κυτταροκινών σε έµβρυα από την 3 έως τη 10 ηµέρα (Ε3- Ε10) της εµβρυικής ανάπτυξης, µέσω της RT-PCR... 112 Εικόνα 14. Έκφραση των κυτταροκινών στην ωοθήκη ορνίθων, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR... 113 7

Εικόνα 15. Έκφραση των κυτταροκινών στον ωαγωγό ορνίθων, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR... 118 Εικόνα 16. Έκφραση των κυτταροκινών στους όρχεις αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR... 123 Εικόνα 17. Έκφραση των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR... 127 Εικόνα 18. Έκφραση των κυτταροκινών στα κύτταρα Sertoli, µέσω της RT-PCR... 132 8

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ Διάγραµµα 1. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στον ωαγωγό ορνίθων, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης...... 86 Διάγραµµα 2. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στον ωαγωγό µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 28 εβδοµάδων... 88 Διάγραµµα 3. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στον ωαγωγό µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 104 εβδοµάδων... 88 Διάγραµµα 4. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στους όρχεις αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης... 91 Διάγραµµα 5. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στους όρχεις µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων... 92 Διάγραµµα 6. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στην επιδιδυµίδα αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης... 95 Διάγραµµα 7. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στην επιδιδυµίδα µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων... 96 Διάγραµµα 8. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στα κύτταρα Sertoli σε διαφορετικά χρονικά διαστήµατα επώασης µε LPS... 99 Διάγραµµα 9. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στους όρχεις αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης... 102 Διάγραµµα 10. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στους όρχεις µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων... 104 Διάγραµµα 11. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στην επιδιδυµίδα αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης... 106 9

Διάγραµµα 12. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στην επιδιδυµίδα µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων... 108 Διάγραµµα 13. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στα κύτταρα Sertoli σε διαφορετικά χρονικά διαστήµατα επώασης µε LPS... 110 Διάγραµµα 14. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην ωοθήκη ορνίθων, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης... 114 Διάγραµµα 15. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην ωοθήκη µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 28 εβδοµάδων... 116 Διάγραµµα 16. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην ωοθήκη µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 104 εβδοµάδων... 117 Διάγραµµα 17. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στον ωαγωγό ορνίθων, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης... 120 Διάγραµµα 18. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στον ωαγωγό µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 28 εβδοµάδων... 122 Διάγραµµα 19. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στον ωαγωγό µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 104 εβδοµάδων... 122 Διάγραµµα 20. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στους όρχεις αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης... 125 Διάγραµµα 21. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στους όρχεις µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων... 126 Διάγραµµα 22. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης... 129 10

Διάγραµµα 23. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων... 131 Διάγραµµα 24. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στα κύτταρα Sertoli σε διαφορετικά χρονικά διαστήµατα επώασης µε LPS... 133 11

ΑΠΟΔΟΣΗ ΑΓΓΛΙΚΗΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ Accession Number = Αριθµός καταχώρησης Gene bank = γενετική τράπεζα δεδοµένων bp = base pair = ζεύγη βάσεων ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ BSA = Bovine Serum Albumin = Αλβουµίνη ορού βοός DNΑ = Deoxyribonucleic Acid = Δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ DNase = Deoxyribonuclease = Δεοξυριβονουκλεάση cdna = Complementary DNA = Συµπληρωµατικό DNA DEPC= di-ethyl-pyro-carbonic acid = διαίθυλο-πυρανθρακικό οξύ dntps = deoxynucleotide triphosphates = Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια dh 2 O = Distilled H 2 O = Απιονισµένο Νερό EDTA = Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr = Ethidium bromide = Βρωµιούχο Αιθίδιο IFN-γ = interferon-gamma = Ιντερφερόνη-γ LPS = Lipopolysaccharide = Λιποπολυσακχαρίτης LTA = Lipoteichoic acid = Λιποτεχοϊκό οξυ MHC = Major Histocompatibility Complex = Μείζον Σύστηµα Ιστοσυµβατότητας mg = milligram = χιλιοστόγραµµο ml = milliliter = χιλιοστόλιτρο 12

NK = Natural Killer cells = Κύτταρα φυσικοί φονείς NF-κΒ = Nuclear Factor-κΒ = Πυρηνικός παράγοντας-κβ PAMP = Pathogen Associated Molecular Patterns = Μοριακά πρότυπα Παθογόνων qpcr = Quantitative PCR = ποσοτική PCR PBS = Phosphate Buffer Saline = Ρυθµιστικό Διάλυµα Φωσφορικών αλάτων PCR = Polymerase Chain Reaction = Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυµεράσης PRR = Pattern Recognition Receptors = Υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων RNA = Ribonucleic Acid = Ριβονουκλεϊκό οξύ RTase =Reverse transcriptase = Αντίστροφη Μεταγραφάση RT-PCR = Reverse Transcription PCR = Αντίστροφης Μεταγραφής Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυµεράσης TNFα = Tumor Necrosis Factor-α (Παράγοντας νέκρωσης του όγκου-α) U = Unit = Μονάδα UV = Ultra Violet (radiation, Υπεριώδης Ακτινοβολία) V = Volts µl = microliter 13

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Παγκόσµια τάση στη Ζωική Παραγωγή είναι η πρόληψη των ασθενειών και η ενίσχυση της άµυνας του ζωικού οργανισµού µε στόχο την αποφυγή µετάδοσης παθογόνων µικροοργανισµών και τροφιµογενών λοιµώξεων από τα παραγόµενα κτηνοτροφικά προϊόντα στον άνθρωπο. Η υγεία και η πρόληψη των ασθενειών των εκτρεφόµενων ζώων αποτελούν από τους σηµαντικότερους παράγοντες, οι οποίοι διαµορφώνουν το κόστος παραγωγής και την ποιότητα των προϊόντων ζωικής προέλευσης. Τα τελευταία χρόνια, η απαγόρευση της Ευρωπαικής Ένωσης (Ε.Ε.) στη χρήση των αντιβιοτικών ως αυξητικών παραγόντων στις ζωοτροφές, συµπεριλαµβανοµένων και εκείνων που προβλέπονται για τις όρνιθες αυγοπαραγωγής και κρεοπαραγωγής, µπορεί να οδηγήσει σε αύξηση των µολυσµένων πουλερικών, αλλά και των προιόντων τους. Εποµένως, η γνώση των ενδογενών µηχανισµών του έµφυτου ανοσοποιητικού συστήµατος, που λειτουργούν στην αναπαραγωγωγική οδό των αρσενικών και θηλυκών ορνίθων, προστατεύοντας από τον µικροβιακό αποικισµό, τη µόλυνση και τη µετάδοση παθογόνων µε φυσικό τρόπο και χωρίς να επηρεάζουν τις λειτουργίες των αναπαραγωγικών οργάνων, µειώνοντας την πιθανότητα της µετάδοσης λοιµώξεων στον άνθρωπο από µολυσµένα αυγά και κρέατα όρνιθας, κρίνεται απαραίτητη. Μέσω της γονιδιακής τεχνολογίας επιχειρείται η αποσαφήνιση του ρόλου γονιδίων στον πολύπλοκο µηχανισµό του ανοσοποιητικού συστήµατος, µε σκοπό την ενίσχυσή του και τη δυνατότητα χρησιµοποίησης των πεπτιδίων και των πρωτεινών που κωδικοποιούν, στην πρόληψη και την αντιµετώπιση µε φυσικό τρόπο των ασθενειών των ζώων. Πλήθος αντιµικροβιακών πεπτιδίων και πρωτεϊνών έχουν 14

πρόσφατα αναγνωριστεί ως κύριοι ρυθµιστές του ανοσοποιητικού συστήµατος των αγροτικων ζωων, λειτουργώντας ως η πρώτη γραµµή άµυνας εναντίον παθογόνων µικροοργανισµών. Το αναπαραγωγικό και το ανοσοποιητικό σύστηµα αν και διαχωρίζονται λειτουργικά, υφίστανται πολύπλοκες διασυνδέσεις και αλληλεπιδράσεις µεταξύ τους έχοντας σηµαντικότατες επιδράσεις στη φυσιολογία αναπαραγωγής. Το αναπαραγωγικό σύστηµα αντιµετωπίζει διάφορες προκλήσεις όπως είναι, οι αναπαραγωγικά µεταδιδόµενες µολύνσεις, οι συστηµατικές λοιµώξεις και διάφορες χρόνιες φλεγµονώδεις καταστάσεις. Όλες αυτές οι µολύνσεις µπορούν να αντιµετωπισθούν µε τη βοήθεια του ανοσοποιητικού συστήµατος. Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ του ανοσοποιητικού και του αναπαραγωγικού συστήµατος έχουν σηµαντικές συνέπειες για τη γονιµότητα και τη φυσιολογία αναπαραγωγής. Την τελευταία δεκαετία υπάρχουν ολοένα και περισσότερες ενδείξεις ότι σε πολλές από αυτές τις αλληλεπιδράσεις εµπλέκονται οι οικογένειες των Toll-like υποδοχέων (Toll-like Receptors, TLRs), των αντιµικροβιακών πεπτιδίων, όπως είναι τα µέλη της οικογένειας των β-defensins καθώς και των κυτταροκινών, για τα οποία, εκτός από το ρόλο τους στην έµφυτη ανοσία των αναπαραγωγικών οργάνων, έχει αναφερθεί ότι διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στη φυσιολογία αναπαραγωγής, στη γονιµότητα, στην επιβίωση του σπέρµατος, στην εµφύτευση και ανάπτυξη του εµβρύου και στην αλληλεπίδραση µεταξύ σπέρµατος-ωαρίου στα θηλαστικά (Com et al., 2003; Palladino et al., 2003; Yudin et al., 2005; Girling and Hedger, 2007). Σε παγκόσµιο επίπεδο, η Ε.Ε. βρίσκεται στην τρίτη θέση παραγωγής κρέατος πουλερικών µετά τις ΗΠΑ και την Κίνα. Συγκεκριµένα, η παραγωγή κρέατος πουλερικών στην Ευρωπαική Ένωση ανήλθε το 2011 σε 11.923,69 χιλιάδες τόνους, ενώ το 2012 η παραγωγή αυξήθηκε στους 12.041,33 χιλιάδες τόνους 15

(http://ec.europa.eu). Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια η αυξηµένη ζήτηση του κρέατος πουλερικών στην Ευρωπαική Ένωση οδηγεί στην πρόβλεψη ότι η παραγωγή του, το 2020 θα ανέλθει στους 12.631,88 χιλιάδες τόνους (http://ec.europa.eu). Η παραγωγή κρέατος πουλερικών είναι κατανεµηµένη σε ολόκληρη την Ε.Ε., όµως παρατηρείται ιδιαίτερα µεγάλη συγκέντρωση στη Γαλλία, τη Γερµανία, την Ιταλία, το Ηνωµένο Βασίλειο, την Πολωνία, την Ολλανδία, το Βέλγιο και την Ισπανία. Από τα κράτη µέλη της Ε.Ε., την περίοδο 2003-2010, η Πολωνία παρουσίασε την πιο γρήγορη αύξηση της παραγωγής κρέατος πουλερικών, καθώς η παραγωγή της αυξήθηκε κατά 41%. Στον ακόλουθο Πίνακα παρουσιάζεται η εξέλιξη της παραγωγής κρέατος πουλερικών σε χώρες της Ευρωπαικής Ένωσης κατά τα έτη 2008 και 2010. Πίνακας 1. Οι µεγαλύτερες παραγωγικές χώρες κρέατος πουλερικών στην Ευρωπαική Ένωση, τα έτη 2008 και 2010 (σε χιλιάδες τόνους, http://faostat.fao.org). Χώρες 2008 2010 Αυστρία 85 90 Βέλγιο 450 450 Βουλγαρία 98 100 Δανία 176 180 Γαλλία 932 940 Γερµανία 746 750 Ηνωµένο Βασίλειο 1.259 1.265 Ισπανία 1.155 1.070 Ιταλία 790 790 Ολλανδία 693 690 Ουγγαρία 195 180 Πολωνία 882 900 16

Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι η κατανάλωση κρέατος πουλερικών στην Ευρωπαική Ένωση, κατά τη δεκαετία 1999 έως 2009, αυξήθηκε από 66 εκατ. τόνους σε 98 εκατ. τόνους, ενώ αναµένεται το 2017 να έχει φτάσει τους 129 εκατ. τόνους (www.statistics.gr). Η παραγωγή αυγών σε επίπεδο Ευρωπαικής Ένωσης παρουσιάζει αυξητική πορεία άνω των 7,2 εκατοµµυρίων τόνων κατά το έτος 2007, ενώ η κατά κεφαλή κατανάλωση αυγού παρουσιάστηκε στα 14,53 κιλά, το ίδιο έτος (European Union, 2007). Η πτηνοτροφία στην Ελλάδα αποτελεί έναν από τους πιο δυναµικούς κλάδους της ζωικής παραγωγής, µε τη µεγαλύτερη καθετοποίηση, παρά το γεγονός ότι δεν επιδοτείται από την Κοινή Αγροτική Πολιτική (ΚΑΠ) της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Ο κλάδος αυτός είναι ιδιαίτερα σηµαντικός για την εθνική οικονοµία, καθώς καλύπτει σχεδόν πλήρως τις ανάγκες της εγχώριας ζήτησης. Το έτος 2010 η παραγωγή κρέατος στη χώρα µας διαµορφώθηκε όπως στην ακόλουθη εικόνα. Εικόνα 1. Παραγωγή κρέατος στην Ελλάδα το 2010. (Πηγή: Υπ.Α.Α.Τ). 17

Στη χώρα µας, η συνολική παραγωγή αυγών κυµάνθηκε µεταξύ των 108.000-125.000 τόνων κατά την περίοδο 2001-2009, ενώ η συνολική παραγωγή κρέατος πουλερικών κυµάνθηκε σε επίπεδα µεταξύ 163.000-181.000 τόνων την ίδια περίοδο. Το 2010, η κατά κεφαλή κατανάλωση κρέατος πουλερικών στη χώρα µας διαµορφώθηκε στα 19 κιλά και η κατανάλωση αυγών στα 11 κιλά. Επιπλέον, στις οργανωµένες επιχειρήσεις του κλάδου απασχολούνται περίπου 11-12.000 άτοµα, ενώ άλλες 3.000 θέσεις εργασίας συνδέονται άµεσα µε την πτηνοτροφία (www.statistics.gr). Η παραγωγή κρέατος πουλερικών το 2010 ήταν κατανεµηµένη κατά 37,5% στην Ήπειρο, κατά 30% στη Στερεά Ελλάδα, κατά 14% στη Μακεδονία και τη Θράκη, κατά 2% στην Πελοπόννησο, κατά 4,5% στην Αττική, κατά 5% στο Αιγαίο και την Κρήτη, κατα 4% στη Θεσσαλία και κατά 3% στη Δυτική Ελλάδα. Επιπρόσθετα, η παραγωγή αυγών είναι οµοιόµορφα κατανεµηµένη, αν και η µισή παραγωγή προέρχεται από την περιφέρεια της Αττικής (www.minagric.gr). Σε ορισµένες περιοχές όπως ο Νοµός Ιωαννίνων και η ορεινή Εύβοια, η πτηνοτροφία αποτελεί κύρια οικονοµική δραστηριότητα για τον πληθυσµό. Ιδιαίτερα στις ορεινές και νησιωτικές περιοχές συνιστά ένα συµπληρωµατικό εισόδηµα από την πώληση των αυγών που παράγονται, τα οποία όπως είναι γνωστό προτιµώνται ιδιαίτερα από τους καταναλωτές. 18

1.1. ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΗΣ ΟΡΝΙΘΑΣ Η αναπαραγωγή των ορνίθων διαφέρει από εκείνη των θηλαστικών. Ο λόγος που συµβαίνει αυτό είναι γιατί το γεννητικό σύστηµα της όρνιθας αποτελείται µόνο από την αριστερή ωοθήκη και τον ωαγωγό, αφού η δεξιά ωοθήκη ατροφεί στη διάρκεια της εµβρυϊκής ανάπτυξης του πτηνού. Στις όρνιθες δεν υπάρχει οιστρικός κύκλος και η ωοθυλακιορρηξία αφορά στο ωάριο που ονοµάζεται λέκιθος. Το ωάριο περιλαµβάνει, εκτός από τον πυρήνα (βλαστικό κυστίδιο ή βλαστοδίσκος), το ωόπλασµα, το οποίο περιέχει θρεπτικά συστατικά απαραίτητα για την ανάπτυξη του εµβρύου και στη συνέχεια του νεοσσού κατά τις πρώτες τρεις ηµέρες της ζωής του. Εποµένως, τα γεννητικά όργανα της όρνιθας περιλαµβάνουν την αριστερή ωοθήκη και τον αριστερό ωαγωγό. Τέλος η ανάπτυξη του εµβρύου γίνεται εκτός του σώµατος της µητέρας (Μάγρας, 2003). Το γεννητικό σύστηµα των αρσενικών, αποτελείται από τους δύο όρχεις (γεννητικούς αδένες), τους δύο σπερµατικούς πόρους, τις δύο επιδιδυµίδες και το όργανο σύζευξης που είναι διαφορετικό από εκείνο των θηλαστικών ζώων. Το αρσενικό δεν έχει βοηθητικούς αδένες, όπως εκείνοι στο γεννητικό σύστηµα των θηλαστικών, εποµένως στερούνται του προστάτη, των σπερµατοδόχων κύστεων και των αδένων του Cowper. Οι όρχεις είναι αδένες µε εξωκρινή και ενδοκρινή λειτουργία. Ως εξωκρινείς αδένες παράγουν τα σπερµατοζωάρια, τα οποία είναι τα γεννητικά κύτταρα του αρσενικού, ενώ ως ενδοκρινείς αδένες εκκρίνουν τις ανδρογόνες ορµόνες. Από ιστολογική άποψη, ο όρχης αποτελείται από τον ινώδη χιτώνα, τα σπερµατικά σωληνάρια, τη διάµεση ουσία, αγγεία και νεύρα. Οι όρχεις του πετεινού περιλαµβάνουν χιλιάδες εσπειραµένα σπερµατικά σωληνάρια, που περιέχουν γεννητικά κύτταρα στα διάφορα στάδια της εξέλιξής τους κατά τη 19

σπερµατογένεση. Τα σπερµατοζωάρια βρίσκονται σε οµάδες, µε την κεφαλή τους προσκολληµένη στα κύτταρα του Sertoli και την ουρά τους να προβάλλει στον αυλό των σωληναρίων. Οι όρχεις αποτελούνται από τα σπερµατικά σωληνάρια, σπειροειδούς µορφής, στο κέντρο των οποίων σχηµατίζεται ο αυλός µεταφοράς των παραγόµενων σπερµατοζωαρίων. Εσωτερικά, προς τα τοιχώµατα των σπερµατικών σωληναρίων, υπάρχουν πολύ εξειδικευµένα κύτταρα, τα κύτταρα Sertoli και οι αρχέγονες µορφές των σπερµατοζωαρίων, τα σπερµατογόνια. Έξω από τα σπερµατικά σωληνάρια υπάρχουν τα κύτταρα Leydig (Μάγρας, 2003). Τα κύτταρα Sertoli αποτελούν µια εξειδικευµένη οµάδα κυττάρων στους όρχεις και κατέχουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την ωρίµανση των γεννητικών κυττάρων, µια διαδικασία η οποία ονοµάζεται σπερµατογένεση. Η δράση τους έγκειται στην παροχή θρεπτικών ουσιών στα αναπτυσσόµενα σπερµατικά κύτταρα καθώς και στη µεταφορά των άχρηστων προϊόντων της σπερµατογένεσης. Επίσης, κατά την ωρίµανση των σπερµατικών κυττάρων, φαγοκυτταρώνουν κάθε υπόλοιπο κυτταροπλάσµατος αλλά και το υλικό από την εκφύλιση αυτών και παράγουν το υγρό που χρησιµοποιείται για τη µεταφορά του ώριµου σπέρµατος. Τέλος, σχετίζονται µε την έκκριση ορµονών για την προώθηση της σωστής ανάπτυξης των κυττάρων του σπέρµατος (Sundstrom et al., 1999; Timmons et al., 2002; Yunhe et al., 2013). 20

1.2. ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το ανοσοποητικό σύστηµα βρίσκεται διάσπαρτο στο σώµα και έχει ως αποστολή την προφύλαξη του οργανισµού από επιβλαβείς για την υγεία του ουσίες που εισέρχονται ή παράγονται σε αυτόν, είναι δηλαδή ένα καθαρά αµυντικό σύστηµα (Κοπτόπουλος, 2008). Το σύνολο των κυττάρων, ιστών και µορίων που συµβάλλει στην αντίσταση έναντι λοιµωδών παραγόντων καλείται σύστηµα ανοσίας, ενώ η συντονισµένη αντίδρασή του στους λοιµώδεις παράγοντες, ανοσιακή απόκριση. Οι ανοσιακές αποκρίσεις εκδηλώνονται µέσω της κινητοποίησης εξειδικευµένων τύπων κυττάρων που προέρχονται από πολυδύναµα αδιαφοροποίητα αρχέγονα κύτταρα του µυελού των οστών. Η οργάνωση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήµατος σε συνδυασµό µε τη µεγάλη ποικιλία σηµατοδοτικών µορίων καθιστούν το ανοσοποιητικό σύστηµα ικανό να ανιχνεύσει και να ενεργοποιηθεί άµεσα και αποτελεσµατικά σε οποιοδήποτε ξένο παράγοντα (αντιγόνο). Η φυσιολογική λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήµατος είναι να καταπολεµά τους µολυσµατικούς παράγοντες και να αναχαιτίζει τις λοιµώξεις (Abbas and Lichtman, 2004). Αυτό επιτυγχάνεται µε την συνδυασµένη ειδική και µη ειδική απάντηση έναντι των διαφόρων µικροοργανισµών που χαρακτηρίζει τους δύο βασικούς κλάδους της ανοσιακής απόκρισης, δηλαδή την επίκτητη (adaptive immunity) και την έµφυτη (innate immunity) ανοσία, αντίστοιχα. Συγκεκριµένα η έµφυτη ανοσία είναι αρµόδια για την αρχική προφύλαξη έναντι των λοιµώξεων, λειτουργώντας ως η πρώτη γραµµή άµυνας, και η επίκτητη ανοσία αναπτύσσεται µεταγενέστερα, αλλά συνιστά την αποτελεσµατικότερη γραµµή άµυνας έναντι των λοιµώξεων (Abbas and Lichtman, 2001). Ο όρος έµφυτη ανοσία αναφέρεται στο 21

γεγονός ότι ο τύπος αυτός της άµυνας του ξενιστή υπάρχει πάντα σε υγιείς οργανισµούς από τη γέννησή τους, έτοιµος να σταµατήσει την είσοδο των παθογόνων µικροοργανισµών και να αποµακρύνει γρήγορα τους µικροοργανισµούς που επιτυγχάνουν να εισέλθουν στους ιστούς του ξενιστή, ενώ η επίκτητη ανοσία είναι ο τύπος της άµυνας του ξενιστή που διεγείρεται από τους µικροοργανισµούς που εισβάλλουν στους ιστούς, δηλαδή προσαρµόζεται στην παρουσία µικροβιακών εισβολέων. 1.2.1. Έµφυτη ανοσία Η έµφυτη ανοσία (innate immunity) αποτελεί την πρώτη γραµµή άµυνας του οργανισµού ενάντια σε µολυσµατικούς παράγοντες και χαρακτηρίζεται από πανοµοιότυπη απάντηση κάθε φορά που o οργανισµός έρχεται σε επαφή µε τον ίδιο ξένο εισβολέα (Medzhitov and Janeway, 2000). Η έµφυτη ανοσία χρησιµοποιεί µηχανισµούς, οι οποίοι προστατεύουν τον οργανισµό από τη µόλυνση του από παθογόνους παράγοντες µε µη-ειδικό τρόπο, και έχουν τα εξής χαρακτηριστικά: α) έλλειψη µνήµης για τη φύση του εισβολέα, β) η αποτελεσµατικότητά τους δε βελτιώνεται µε συνεχή έκθεση του οργανισµού στο συγκεκριµένο παθογόνο, δηλαδή δεν παρέχεται ανοσία στον ξενιστή, γ) δεν απαιτούν χρόνο για την πλήρη ανάπτυξή τους. Η έµφυτη ανοσία δε χαρακτηρίζεται από εξειδίκευση, από την άποψη ότι αναγνωρίζονται µόνο µικροβιακές δοµές που είναι κοινές σε µεγάλες οµάδες και απουσιάζουν από τους πολυκύτταρους ξενιστές τους χωρίς δυνατότητα διάκρισης λεπτών διαφορών µεταξύ των ξένων συστατικών (Delves and Roitt, 2000). Πιο αναλυτικά, το έµφυτο ανοσοποιητικό σύστηµα περιλαµβάνει τους ακόλουθους 22

παράγοντες ή µηχανισµούς: 1) Φυσικούς και ορολογικούς φραγµούς, όπως τα επιθήλια και η βλέννα που τα καλύπτει, η οποία περιέχει και αντιµικροβιακά πεπτίδια (ντιφενσίνες), στις πύλες εισόδου των µικροοργανισµών, οι οποίες είναι το δέρµα, ο γαστρενερικός σωλήνας και η αναπνευστική οδός (Κοπτόπουλος, 2008). 2) Τα φαγοκύτταρα, τα οποία είναι τα ουδετερόφιλα (πολυµορφοπύρηνα, κοκκιοκύτταρα), τα µονοκύτταρα και τα µακροφάγα. Επίσης στην έµφυτη ανοσία συµµετέχουν τα ηωσινόφιλα και τα φυσικά φονικά κύτταρα (natural killer cells, NK κύτταρα). Στο αίµα συναντώνται τα µονοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα, ενώ στους ιστούς τα µακροφάγα και τα ουδετερόφιλα. (Κοπτόπουλος, 2008). 3) Οι διαλυτοί παράγοντες της έµφυτης ανοσίας που είναι οι πρωτεΐνες του πλάσµατος του αίµατος, στις οποίες περιλαµβάνονται οι πρωτεΐνες του συµπληρώµατος και µόρια που µεσολαβούν στις αντιδράσεις (Nappi et al., 2004). 4) Οι διάφορες κυτταροκίνες, µεταβιβαστές, οι οποίες συντονίζουν πολλές από τις δραστηριότητες των κυττάρων που συµµετέχουν στην έµφυτη ανοσία (Bodian et al., 2004; Ottaviani et al., 2004). Τα κύτταρα του έµφυτου ανοσοποιητικού συστήµατος οργανώνονται λειτουργικά σε ένα πολύπλοκο δίκτυο που περιλαµβάνει κύτταρα εγκατεστηµένα στους ιστούς (επιθηλιακά, µακροφάγα ιστών, κύτταρα Langerhans του δέρµατος, δενδριτικά), αλλά και µεταναστευτικά κύτταρα (κύτταρα φυσικοί δολοφόνοι, 23

σιτευτικά κύτταρα και πολυµορφοπύρηνα) που προσελκύονται σε αυτούς (Yuan and Walker, 2004). Οι µηχανισµοί µέσω των οποίων εκδηλώνεται η φυσική ανοσία είναι η φλεγµονή, που αποτελεί την εντοπισµένη απόκριση σε µόλυνση ή τραυµατισµό και έχει ως στόχο την καταστροφή ή απενεργοποίηση των ξένων εισβολέων και την επιδιόρθωση της ιστικής βλάβης, η φαγοκυττάρωση, η οποία περιλαµβάνει την αναγνώριση µακροµορίων, την πρόληψή τους από φαγοκύτταρα και την καταστροφή τους. Κύριες λειτουργίες του έµφυτου ανοσοποιητικού συστήµατος των σπονδυλωτών είναι: α) η παραγωγή χηµικών παραγόντων (κυτταροκίνες) που επιστρατεύονται στα σηµεία της µόλυνσης και η ανάπτυξη της αντίδρασης φλεγµονής από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος, β) η ενεργοποίηση του συστήµατος του συµπληρώµατος προκειµένου να αναγνωριστούν τα βακτήρια-εισβολείς και να επιστρατευτούν τα ειδικά κύτταρα ώστε να αποµακρύνουν τα νεκρά κύτταρα ή τα σύµπλοκα αντιγόνου-αντισώµατος, γ) η αναγνώριση και αποµάκρυνση µικροοργανισµών που βρίσκονται στα όργανα, στους ιστούς, στο αίµα και στη λέµφο και δ) η ενεργοποίηση του επίκτητου ανοσοποιητικού συστήµατος. Εποµένως, ο ρόλος της φυσικής ανοσίας δεν περιορίζεται µόνο στην ανάπτυξη της πρώτης γραµµής άµυνας του ξενιστή αλλά επεκτείνεται και στην προετοιµασία της εκδήλωσης της επίκτητης ανοσίας έναντι των ξένων εισβολέων (Pasare and Medzhitov, 2004), παρέχοντας τη βιολογική πληροφορία ή αλλιώς το σήµα κινδύνου (danger signal) ώστε να σηµατοδοτήσει την έναρξη της επίκτητης (ειδικής) ανοσιακής απάντησης. Μεγάλο ρόλο σε αυτό παίζουν οι υποδοχείς TLR, που ανιχνεύουν µοριακές δοµές που σχετίζονται µε παθογόνα (Gordon, 2002; Heine and Ulmer, 2005) 24

1.2.2. Αναγνώριση παθογόνων µικροοργανισµών στην έµφυτη ανοσία Παρά το γεγονός ότι το έµφυτο ανοσοποιητικό σύστηµα δεν παρουσιάζει αντιγονο-εξειδίκευση, διαθέτει έναν επιτηδευµένο µηχανισµό µέσω του οποίου ανιχνεύει την παρουσία των µικροοργανισµών και παρέχει έτσι τη δυνατότητα στον ξενιστή να εκδηλώσει άµεση απόκριση, καθώς τα κύτταρα της έµφυτης ανοσίας διαθέτουν µη-ειδικούς υποδοχείς που αναγνωρίζουν συγκεκριµένους αντιγονικούς επιτόπους των µικροβιακών εισβολέων. Οι υποδοχείς της φυσικής ανοσίας αναγνωρίζουν δοµές που είναι κοινές για διάφορες τάξεις µικροβίων και που δεν υπάρχουν στα κύτταρα του ξενιστή. Οι δοµές αυτές ονοµάζονται µοριακά πρότυπα παθογόνων (Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs). Τα PAMPs είναι συντηρηµένες µοριακές δοµές, ουσιώδους σηµασίας για την επιβίωση και την παθογόνο δράση του µικροβιακού κυττάρου, µε σηµαντικά διαφορετική µοριακή δοµή από ανάλογα δοµικά στοιχεία του ξενιστή. Οι δοµές αυτές συµπεριλαµβάνουν τη µαννόζη ως τελικό σάκχαρο στις γλυκοπρωτείνες, το διπλής έλικας RNA, το οποίο βρίσκεται σε πολλούς ιούς, τον λιποπολυσακχαρίτη (LPS), το οποίο είναι συστατικό του κυτταρικού τοιχώµατος των Gram-αρνητικών βακτηρίων, τη µη µεθυλιωµένη CpG ακολουθία του βακτηριακού DNA, την πεπτιδογλυκάνη και τα λιποτειχοικά οξέα, που βρίσκονται στο κυτταρικό τοίχωµα των Gram-θετικών βακτηρίων. Το γεγονός ότι οι PAMPs εµφανίζονται εξελικτικά ως υψηλού βαθµού συντηρηµένες δοµές επιτρέπει στο ανοσοποιητικό σύστηµα των ζώων να ανιχνεύει σχεδόν όλους τους µικροοργανισµούς µε περιορισµένο αριθµό υποδοχέων (Akira et al., 2006). Αυτά τα µοριακά πρότυπα των παθογόνων αναγνωρίζονται από ειδικευµένους υποδοχείς (Pattern Recognition Receptors, PRRs) που βρίσκονται στη µεµβράνη και το πλάσµα των κυττάρων του έµφυτου ανοσοποιητικού συστήµατος και προκαλούν 25

µια ταχεία ανοσολογική αντίδραση. Εποµένως, οι PRRs είναι υποδοχείς που αναγνωρίζουν τα PAMPs και είναι ικανοί να πυροδοτήσουν αντιµικροβιακή λειτουργία στα λευκοκύτταρα: φαγοκυττάρωση, µεταβίβαση σήµατος, απελευθέρωση κυτταροτοξικών κοκκίων από το εσωτερικό των κυττάρων (NK cells) (Akira et al., 2006). 1.2.3. Επίκτητη ανοσία Οι δύο φάσεις της ανοσιακής απόκρισης στην πραγµατικότητα δεν είναι διακριτές. Η επίκτητη ανοσιακή απόκριση χρησιµοποιεί κύτταρα και µόρια της φυσικής ανοσίας και µάλιστα ενισχύει και επαυξάνει την αποτελεσµατικότητα των µηχανισµών της φυσικής ανοσίας. Το επίκτητο ανοσοποιητικό σύστηµα αναπτύσσεται σε κάθε άτοµο µετά τη γέννησή του και χρειάζεται τουλάχιστον µερικές ηµέρες για να αποκτήσει την αποτελεσµατικότητά του (Κοπτόπουλος, 2008). Η επίκτητη ανοσία, οι αποκρίσεις της οποίας πυροδοτούνται µε έκθεση σε µολυσµατικούς παράγοντες, σε αντίθεση µε την έµφυτη, χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ικανότητα διάκρισης και αναγνώρισης ανάµεσα σε διαφορετικούς εισβολείς αλλά και δυνατότητα να τους καταστρέφει. Επίσης, χαρακτηρίζεται από ανοσολογική µνήµη, η οποία συνδέεται µε ενισχυµένη ανοσιακή απόκριση σε κάθε νέα εισβολή των ίδιων ξένων µικροοργανισµών, καθώς επίσης και από αυξανόµενη ένταση και αποτελεσµατικότητα ακόµα και όταν επαναλαµβάνεται η έκθεση στον ίδιο µικροοργανισµό (Κοπτόπουλος, 2008). Συγκεκριµένα η επίκτητη ανοσία έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: 1. Ειδικότητα: Εξασφαλίζει ειδική ανοσιακή απάντηση για κάθε αντιγόνο και για την 26

ακρίβεια, για καθένα από τα επιµέρους δοµικά στοιχεία των πολύπλοκων πρωτεινικών και πολυπεπτιδικών αντιγόνων. 2. Ετερογένεια: Επιτρέπει στο ανοσοποιητικό σύστηµα να αντιδρά σε µια τεράστια ποικιλία αντιγόνων, αφού αυτό διαθέτει ένα ρεπερτόριο λεµφοκυττάρων περίπου 10 9 διαφορετικών αντιγονικών ειδικοτήτων. 3. Μνήµη: Αυξάνει την έκταση και την ικανότητα της ανοσιακής απάντησης στην επαναλαµβανόµενη έκθεση στο ίδιο αντιγόνο. 4. Αυτορύθµιση: Επιτρέπει στο ανοσοποιητικό σύστηµα να επανέρχεται σε κατάσταση ηρεµίας µετά από την αντιµετώπιση του κάθε αντιγονικού ερεθίσµατος και το καθιστά ικανό να ανταπεξέρχεται αποτελεσµατικότερα στα διαδοχικά ερεθίσµατα που δέχεται ο οργανισµός. 5. Διάκριση ιδίου από ξένο ή ανοχή: Αποτρέπει την δυνητική αντίδραση έναντι κυττάρων και ιστών του ίδιου του οργανισµού και οδηγεί στην παραγωγή µιας τεράστιας ποικιλίας λεµφοκυτταρικών κλώνων ειδικών για τα ξένα αντιγόνα (Κοπτόπουλος, 2008). Και οι δύο κατηγορίες ανοσοαποκρίσεων συνεργάζονται και συγκροτούν ένα αµυντικό σύστηµα, όπου πολυάριθµοι τύποι κυττάρων και µορίων συνεργάζονται και λειτουργούν αποτελεσµατικά. Η έµφυτη ανοσολογική απόκριση διεγείρει και επηρεάζει τη φύση των επίκτητων ανοσολογικών αποκρίσεων και οι επίκτητες αποκρίσεις χρησιµοποιούν πολλούς από τους µηχανισµούς της έµφυτης ανοσίας για την εξουδετέρωση µικροβίων. Συνήθως λειτουργούν ενισχύοντας την αντιµικροβιακή δράση των αµυντικών της µηχανισµών (Medzhitov and Janeway, 2000; Kimbrell and Beutler, 2001; Beutler, 2004). Εποµένως, η συνδυασµένη απάντηση µέσω των µηχανισµών της µη ειδικής και ειδικής ανοσίας επιτρέπει την έγκαιρη και αποτελεσµατική προστασία απέναντι στο πλήθος των µικροοργανισµών µε τους 27

οποίους έρχεται σε καθηµερινή επαφή ο οργανισµός καθ όλη τη διάρκεια της ζωής του. 28

1.3. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ TOLL-LIKE ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Όπως προαναφέρθηκε, το σύστηµα έµφυτης ανοσίας αποτελεί την πρώτη γραµµή άµυνας του οργανισµού ενάντια στα µικροβιακά παθογόνα. Βασικό ρόλο σε αυτό έχουν ειδικοί υποδοχείς PRRs, oι οποίοι αναγνωρίζουν τα ειδικά µοριακά πρότυπα παθογόνων PAMPs και επάγουν την ανοσολογική απάντηση (Medzhitov and Janeway, 2000). Οι Toll-like υποδοχείς είναι σηµαντικοί PRRs και παίζουν έναν κύριο ρόλο στην επαγωγή της έµφυτης ανοσίας και των φλεγµονωδών αποκρίσεων (Akira, 2001; Beutler, 2004). Συγκεκριµένα, οι TLRs αντιλαµβάνονται την παρουσία παθογόνων µικροοργανισµών (βακτήρια, µύκητες, ιούς, παράσιτα) και ενεργοποιούν την ταχεία ανοσιακή απόκριση του ξενιστή και τη φλεγµονώδη αντίδραση, έτσι ώστε να επιτευχθεί η καταστροφή του εισβολέα. Διαφορετικοί TLRs ενεργοποιούν την παραγωγή διαφορετικών συνδυασµών κυτταροκινών και αντιµικροβιακών πεπτιδίων και διαφορετικά µικροβιακά προϊόντα ενεργοποιούν διαφορετικές αντιδράσεις (Akira and Takeda, 2004). Κατά τη διαδικασία της αναγνώρισης των µικροοργανισµών, αυτοί οι υποδοχείς εµπλέκουν διαφορετικές πρωτείνες, οι οποίες ενεργοποιούν διαδοχικά σειρά γονιδιακών σηµάτων, τα οποία επάγουν την παραγωγή αντιµικροβιακών πεπτιδίων και προφλεγµονωδών κυτταροκινών (Furrie et al., 2005). Οι TLRs εντοπίζονται σε όλους τους ευκαριωτικούς οργανισµούς και ονοµάστηκαν έτσι λόγω της οµοιότητάς τους µε το Toll, έναν υποδοχέα που αρχικά ταυτοποιήθηκε στη µύγα Drosophila melanogaster. Πρόκειται για διαµεµβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες αποτελούνται από: α) ένα εξωκυττάριο πεδίο πλούσιο σε λευκίνες (Leucine-Rich Repeat, LRR) και β) µία κυτταροπλασµατική περιοχή 29

οµόλογη µε εκείνη του υποδοχέα της ιντερλευκίνης 1 (Toll/IL-1 homology domain) (Aderem and Ulevitch, 2000), ο οποίος ονοµάζεται ΤΙR (Toll/ IL-1 receptor). Ενώ οι δύο οικογένειες υποδοχέων έχουν διαφορετικό εξωκυττάριο τµήµα, καθώς το εξωκυττάριο τµήµα των υποδοχέων της IL-1R αποτελείται από πεδία ανοσοσφαιρίνης (immunoglobulin domains), φέρουν το ίδιο ενδοκυττάριο τµήµα TIR (Akira and Takeda, 2004). Οι TLRs εκφράζονται σε διάφορα κύτταρα, όπως µονοκύτταρα, ουδετερόφιλα κύτταρα, λεία µυϊκά κύτταρα, σε αιµοπετάλια, καθώς και σε κύτταρα που εκτίθενται άµεσα στο εξωτερικό περιβάλλον, όπως τα επιθηλιακά κύτταρα (Muzio et al., 2000; Pryshchep et al., 2008). Επίσης, οι υποδοχείς αυτοί εκφράζονται στα µακροφάγα, στα σιτευτικά και στα δενδριτικά κύτταρα που αποτελούν και τα κύτταρα-φρουρούς του οργανισµού (Tizard, 2004). Έχουν αναγνωριστεί 13 µέλη TLRs στα ποντίκια, εκ των οποίων 10 µέλη βρίσκονται στον άνθρωπο και στα περισσότερα αγροτικά ζώα (Zhang et al., 2004). Τα TLRs εµπλέκονται στην ωρίµανση των δενδριτικών κυττάρων και στη διέγερση των µακροφάγων συµβάλλοντας στην τοπική φλεγµονή και στη συσσώρευση λευκοκυττάρων αποτελώντας σπουδαίες γέφυρες µεταξύ φυσικής και ειδικής ανοσίας (Cook et al., 2004; Akashi-Takamura and Miyake, 2006; Schroppel and He, 2006; Anders, 2007). 30

Εικόνα 2. Έµφυτη και επίκτητη ανοσία (Takeda and Akira, 2005). 1.3.1. Συνδέτες Οι TLRs αναγνωρίζουν δύο ειδών συνδέτες, τους εξωγενείς, οι οποίοι είναι τα PAMPs, και τους ενδογενείς, οι οποίοι είναι µόρια που παράγονται από τον ξενιστή. Εικόνα 3. TLRs και οι συνδέτες τους (Takeda and Akira, 2005). 31

1.3.2. Αναγνώριση εξωγενών συνδετών από τους TLRs Κάθε Toll υποδοχέας µπορεί να αναγνωρίζει τελείως διαφορετικούς συνδέτες, χωρίς δοµικές οµοιότητες, όµως οι περισσότεροι συνδέτες των TLRs που έχουν αναγνωρισθεί µέχρι τώρα είναι διατηρηµένα µικροβιακά προϊόντα που σηµατοδοτούν την παρουσία λοίµωξης. Οι TLR1, TLR2 και TLR6 εντοπίζονται στα φαγοσώµατα των µακροφάγων και αναγνωρίζουν λιποπεπτίδια των Gram θετικών βακτηρίων (Akira et al., 2001). Επιπλέον, ο TLR2 αναγνωρίζει λιποπρωτεΐνες, λιποτειχοϊκό οξύ (LTA) και γλυκολιπίδια, στοιχεία που ανευρίσκονται σε µία ποικιλία βακτηρίων συµπεριλαµβανοµένων των Gram θετικών και αρνητικών βακτηρίων διαµεσολαβεί κυτταρικές αποκρίσεις σε µια µεγάλη ποικιλία λοιµογόνων παραγόντων και των προϊόντων τους (Akira et al., 2001). Η ειδικότητα του συνδέτη και η ικανότητα µεταβίβασης σήµατος από τον TLR2 καθορίζεται από ετεροδιµερικές αντιδράσεις µε άλλους TLRs, όπως ο TLR6 και ο TLR1, καθώς ο διµερισµός του κυτταροπλασµατικού µέρους του TLR2 δεν επάγει την παραγωγή κυτταροκινών στα µακροφάγα, ενώ το κυτταροπλασµατικό κοµµάτι του TLR2 συνδυασµένο λειτουργικά µε αυτό του TLR6 συνεπάγεται την παραγωγή κυτταροκινών, δηλαδή υπάρχει συνεργιστικός ρόλος συγκεκριµένων TLRs (Underhill et al., 1999; Arbour et al., 2000). Ο TLR3 αναγνωρίζουν το διπλής έλικας RNA των ιών, ενώ ο TLR8 αναγνωρίζει το µονής έλικας RNA και το µη-µεθυλιωµένο βακτηριακό CpG DNA (Akira, 2001; Beutler, 2004). Ο TLR4 αναγνωρίζει ενδογενείς και εξωγενείς συνδέτες, κυρίως LPS, αλλά και µη βακτηριακά συστατικά (Uematsu and Akira, 2007). Ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS) είναι µέρος του κυτταρικού τοιχώµατος των Gram-αρνητικών βακτηρίων και 32

συγκεκριµένα αποτελεί το εξωκυττάριο στοιχείο του κυτταρικού περιβλήµατος. Πρόκειται για παράγοντα κλειδί στην έναρξη της φλεγµονώδους αντίδρασης (Suffredini and O Grady, 1999) και θεωρείται σηµαντικός λοιµογόνος παράγοντας. Η αναγνώριση του LPS από φλεγµονώδη κύτταρα και η µεταγωγή του LPS σήµατος εµπλέκει τους TLRs και διάφορα άλλα µόρια, ιδιαίτερα τον υποδοχέα CD14 και την λιποπολυσακχαριτιδική συνδετική πρωτεΐνη (LBP) (Shapira et al., 1994; Chow et al., 1999). Αναλυτικά το µακροφάγο ενεργοποιείται και παράγει κυτταροκίνες όταν αναγνωρίσει LPS, µέσω του TLR4 ως εξής: Ο LPS ενός Gram αρνητικού βακτηρίου πρώτα αντιδρά µε µία πρωτεΐνη του ορού, που λέγεται LPS-binding protein (LBP), η οποία µεταφέρει τον LPS στο CD14 (υποδοχέα των µακροφάγων και των Β- λεµφοκυττάρων, που βρίσκεται στην κυτταρική επιφάνεια). Μία άλλη πρωτεΐνη, η MD-2 στρατολογείται για την αναγνώριση του LPS από τον TLR4, που σηµαίνει ότι το σύµπλεγµα που αναγνωρίζει τον LPS αποτελείται τουλάχιστον από τρία συστατικά: το CD14, τον TLR4 και την MD-2. Ο TLR4 και η MD-2 συνδέονται µεταξύ τους, ενώ το CD14 στρατολογείται στο σύµπλοκο µετά τη δέσµευση του LPS (Akira et al., 2001). Ο TLR5 αναγνωρίζει την φλαγγελίνη στα Gram θετικά και αρνητικά βακτήρια (Akira et al., 2001). Οι TLR7 αναγνωρίζουν φαρµακευτικούς παράγοντες (αντι-ϊικά-φάρµακα) (Takeda and Akira, 2005). Ο TLR9 αναγνωρίζει τις θέσεις του βακτηριακού DNA µε αλληλουχία «-Cφωσφορικό-G-» (Akira, 2001; Beutler, 2004). Το βακτηριακό DNA και συγκεκριµένα ολιγονουκλεοτίδια περιέχουν µη µεθυλιωµένα CpG δινουκλεοτίδια που µπορούν να διεγείρουν λεµφοκύτταρα ανθρώπου και ποντικού, ενώ το ευκαρυωτικό DNA και µεθυλιωµένα ολιγονουκλεοτίδια δεν µπορούν. Τα CpG µοτίβα είναι 33

περισσότερο κοινά στο βακτηριακό DNA από το DNA των σπονδυλωτών και ακόµη και όταν υπάρχουν είναι µεθυλιώµενα. Μετά από διέγερση µε CpG DNA τα κύτταρα εκφράζουν συνδιεγερτικά µόρια και δείχνουν αυξηµένη αντιγονοπαρουσιαστικότητα (Takeda and Akira, 2005). Η ανακάλυψη και η έρευνα των TLRs αλλά και η ταυτοποίηση του συνόλου των συνδετών τους οδήγησε στην υπόθεση του «γραµµοκώδικα» στην έµφυτη αναγνώριση των βακτηρίων. Σύµφωνα µε αυτή τη θεωρία, οι TLR αναγνωρίζουν έναν «γραµµοκώδικα» στα παθογόνα για να σχεδιάσουν την κατάλληλη έµφυτη ανοσοαπάντηση (Aderem, 2003), απέναντι σε έναν συνδιασµό απειλής. Για παράδειγµα, ταυτόχρονη ενεργοποίηση των TLR5 και TLR4 θα µπορούσε να ερµηνευθεί σαν µόλυνση από κάποιο Gram-αρνητικό βακτήριο. Με αυτόν τον τρόπο, ο ξενιστής µπορεί να ανταποκριθεί µέσω της φλεγµονής σε µια µεγάλη ποικιλία ερεθισµάτων, από µια µόλυνση που προκαλείται από Gram-αρνητικά βακτήρια µέχρι την παρουσία αυξηµένων επιπέδων χοληστερόλης (Dixon et al., 2004). Επίσης, διάφορες µελέτες αναφορικά µε τη συνεργασία διαφόρων TLRs, έδειξαν ότι η ταυτόχρονη ενεργοποίηση των TLR2 και TLR4 κατέληξε σε συνέργεια παραγωγής TNF (Sato, 2000; Beutler et al., 2001). 1.3.3. Αναγνώριση ενδογενών συνδετών από τους TLRs Σήµατα από κατεστραµµένα κύτταρα ή κύτταρα σε stress µπορούν να επάγουν µια ανοσιακή απάντηση ακόµα και απουσία λοίµωξης, το καλούµενο «danger model» της ανοσιακής απάντησης. Τέτοια σήµατα µπορεί να δηµιουργηθούν όταν τα κύτταρα υφίστανται παθολογικό κυτταρικό θάνατο (νέκρωση), o οποίος ξεκινά φλεγµονώδεις και ανοσιακές αποκρίσεις, σε αντίθεση µε τον φυσιολογικό αποπτωτικό κυτταρικό 34

θάνατο, ο οποίος δεν προκαλεί ανοσοαπόκριση. Τέτοια κύτταρα θα µπορούσαν να δηµιουργήσουν σήµατα ως αποτέλεσµα αλλαγών στα λιπίδια ή/και στους υδρογονάνθρακες, που εκφράζονται στις επιφάνειές τους ή από την έκφραση πρωτεϊνών που φυσιολογικά δε βρίσκονται στην εξωτερική κυτταρική µεµβράνη. Διάφορα ενδογενή µόρια φαίνεται ότι προσδένονται και ενεργοποιούν τους TLRs (Johnson et al., 2003). Σε αυτά συµπεριλαµβάνονται οι πρωτεΐνες του θερµικού σοκ (heat shock proteins) (Prohaszka, 2003; De Graaf et al., 2006), η high-mobility group B1 πρωτεΐνη (HMGB1) (Li, 2006; Van Beijnum, et al., 2008), το διαλυτό υαλουρονικό οξύ (Scheibner et al., 2006), η ινωδονεκτίνη (Okamura et al., 2001) και τα κορεσµένα λιπαρά οξέα (Lee et al., 2003). 1.3.4. Επαγόµενη σηµατοδότηση από την ενεργοποίηση των TLRs Η ενεργοποίηση των TLRs από τους συνδέτες τους υποκινεί µία σειρά ενδοκυτταρικών οδών σηµατοδότησης µε µεγάλη ποικιλοµορφία, οι οποίες καθορίζουν τόσο τις ποιοτικές, όσο και τις ποσοτικές διαστάσεις της φλεγµονώδους απάντησης του ξενιστή. Στη συνέχεια, προκαλείται ενεργοποίηση των αντιδράσεων του συµπληρώµατος, η παραγωγή κυτταροκινών, χηµειοκινών και αντιµικροβιακών πεπτιδίων, αλλά και η έκφραση συνδιεγερτικών µορίων στην επιφάνεια των δενδριτικών κυττάρων, τα οποία λειτουργούν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (antigen-presenting cells, APCs), µε αποτέλεσµα την επαγωγή της φλεγµονής για την αποτελεσµατική αντιµετώπιση των παθογόνων. Οι TLRs συνδέονται µε προσαρµοστικές πρωτείνες στο κυτταρόπλασµα µε σκοπό τη µετάδοση του σήµατος. Δύο είναι οι κύριες σηµατοδοτικές οδοί που επάγονται από τους TLRs, οι οποίες καταλήγουν στην ενεργοποίηση του παράγοντα 35

NF-kB που επάγει τη µεταγραφή πολλών γονιδίων, τα οποία οδηγούν στην παραγωγή των προφλεγµονωδών κυτταροκινών και τη φλεγµονώδη ανοσοαπάντηση (Aderem and Ulevitch, 2000; Guha and Mackman, 2001; Dower and Qwarnstrom, 2003). Η µία σηµατοδοτική οδός εξαρτάται από το γονίδιο 88 πρωταρχικής απάντησης µυελοειδούς διαφοροποίησης (myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88) και ονοµάζεται MyD88-µεσολαβούµενη οδός, και η άλλη είναι η TRIF- µεσολαβούµενη οδός, η οποία είναι ανεξάρτητη της MyD88 πρωτείνης και εξαρτώµενη της ιντερφερόνης-β (Toshchakov et al., 2002; Thomas et al., 2006). Αυτές οι δύο οδοί ενεργοποιούνται αλληλοδιαδοχικά. Συγκεκριµένα, µόλις ενεργοποιηθεί ο TLR4 προσδένεται στην πρωτεΐνη MyD88, στη συνέχεια η MyD88 απελευθερώνεται και ο TLR4 προσδένεται στην πρωτεΐνη TRIF (Kagan et al., 2008). 1.3.5. Τα TLRs στα πτηνά Σε γενικές γραµµές, οι ανοσολογικοί µηχανισµοί των πτηνών είναι παρόµοιοι µε αυτούς στα θηλαστικά ζώα. Βασικά στοιχεία της Ανοσολογίας αποκαλύφθηκαν από µελέτες στην όρνιθα Gallus gallus domesticus, όπως η διάκριση µεταξύ Β και Τ ανοσολογικών κυττάρων. Στο γονιδίωµα των πτηνών εντοπίστηκαν τα TLRs γονιδία, οµόλογα των θηλαστικών. Αρκετές αναφορές, έχουν επιβεβαιώσει την ύπαρξη στην όρνιθα δέκα TLRs, και συγκεκριµένα των TLR1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3, 4, 5, 7, 15 και 21, εκ των οποίων τα TLR2-1, 2-2, 4, 5 και 7 είναι οµόλογα µε εκείνα που εντοπίστηκαν σε ποντίκια και ανθρώπους (Smith et al., 2004; Yilmaz et al., 2005; Boyd et al., 2007; Temperley et al., 2008; Brownlie and Allan, 2011). Το TLR15 φαίνεται να είναι µοναδικό για τα είδη πτηνών, αν και είναι φυλογενετικά σχετιζόµενο µε την οµάδα TLR2 ( TLR2-1, TLR2-2). 36

1.4. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ ΣΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Τα αντιµικροβιακά πεπτίδια είναι σηµαντικότατοι παράγοντες του έµφυτου ανοσοποιητικού συστήµατος των οργανισµών και παρέχουν ένα φυσικό µηχανισµό άµυνας, λειτουργώντας στην προστασία των οργανισµών από µικροβιακό αποικισµό και µολύνσεις. Τα τελευταία χρόνια πλήθος αντιµικροβιακών πεπτιδίων έχουν αναγνωριστεί ως κύριοι ρυθµιστές του ανοσοποιητικού συστήµατος, λειτουργώντας ως η πρώτη γραµµή άµυνας εναντίον πιθανών παθογόνων (Hancock and Diamond, 2000; Schroder and Harder, 2006). Αυτά τα πεπτίδια εκφράζουν µια ποικιλία αντιµικροβιακών λειτουργιών που περιλαµβάνουν τη διαπερατότητα των µεµβρανών, την αποδόµηση του κυτταρικού τοιχώµατος και τη βακτηριακή οξείδωση (Dale and Fredericks, 2005; Tabak, 2006), παρέχοντας άµεση αντιµικροβιακή δράση. Εποµένως, η κύρια δραστηριότητά τους ασκείται µέσω της αλληλεπίδρασής τους µε τη κυτταρική µεµβράνη των παθογόνων µικροοργανισµών, επιτυγχάνοντας τη λύση της και τελικά την εξόντωση των παθογόνων. Τα αντιµικροβιακά πεπτίδια ανιχνεύονται σε όλα τα είδη του ζωικού και φυτικού βασιλείου, ως ισχυροί προστατευτικοί παράγοντες κατά των µικροβίων. Επιπλέον, τα αντιµικροβιακά πεπτίδια εκφράζονται από πολλά κύτταρα και ιστούς των οργανισµών, αποτελώντας την πρώτη γραµµή άµυνας έναντι πλήθους παθογόνων, όπως τα Gram θετικά και αρνητικά βακτήρια, µύκητες, παράσιτα, ιοί και καρκινικά κύτταρα. Τα αντιµικροβιακά πεπτίδια είναι υδρόφοβα πεπτίδια, ικανά να ενσωµατώνονται και να αποδιοργανώνουν τις µικροβιακές µεµβράνες, προκαλώντας έτσι τη λύση των βακτηρίων. Βασικής σηµασίας για τη δράση τους φαίνεται ότι είναι 37

η χηµική συγγένειά τους µε τις αρνητικά φορτισµένες φωσφολιπιδικές ρίζες της εξωτερικής µεµβράνης των βακτηρίων. Αντίθετα, δεν παρουσιάζουν χηµική συγγένεια µε την κατ εξοχήν λιπιδικής σύστασης, ουδέτερη µεµβράνη των κυττάρων των ξενιστών, έναντι των οποίων είναι, ως εκ τούτου, αβλαβή. Ο µηχανισµός δράσης των αντιµικροβιακών πεπτιδίων συνίσταται στο ότι τα αντιµικροβιακά κατιονικά πεπτίδια αλληλεπιδρούν µε τις αρνητικά φορτισµένες οµάδες φωσφολιπιδίων στην εξωτερική µεµβράνη µικροβιακών κυττάρων στόχων µέσω ηλεκτροστατικής έλξης (Zasloff, 2002). Συγκεκριµένα, ο µηχανισµός δράσης των αντιµικροβιακών πεπτιδίων µπορεί να περιγραφεί ως εξής: τα αντιµικροβιακά πεπτίδια δρουν ενδοκυττάρια µέσα στο φαγολυσσοσωµάτιο και φονεύουν το εγκυστωµένο βακτήριο ή τον οποιοδήποτε άλλον παθογόνο µικροοργανισµό, σχηµατίζοντας πόρους στο κυτταρικό του τοίχωµα, µε αποτέλεσµα τη λύση αυτού (Cunliffe, 2003). Στη συνέχεια, αυτά τα κατιονικά πεπτίδια αλληλεπιδρούν µε τα ανιονικά συστατικά της επιφάνειας των µικροοργανισµών, µε αποτέλεσµα την ανάπτυξη ισχυρών ηλεκτρολυτικών δυνάµεων, οι οποίες καθιστούν τη φονική δράση των αντιµικροβιακών πεπτιδίων έναντι των παθογόνων. Εποµένως, οι τρόποι δράσης των αντιµικροβιακών πεπτιδίων κατά των παθογόνων, περιλαµβάνουν: 1. αποδόµηση κυτταρικών στοιχείων του παθογόνου, 2. αποσταθεροποίηση της κυτταρικής του µεµβράνης και 3. παρεµπόδιση της προσκόλλησής του σε ιστούς του ξενιστή. Επιπλέον, υπάρχουν αναφορές που δείχνουν ότι τα αντιµικροβιακά πεπτίδια µπορούν να µεταβάλλουν τον σχηµατισµό του διαφράγµατος της κυτταροπλασµατική µεµβράνης του παθογόνου και να αναστείλλουν τη σύνθεση των κυτταρικών τοιχωµάτων, νουκλεϊκών οξέων, πρωτεΐνων και της ενζυµατικής δραστηριότητας 38

(Brogden, 2005). Έχουν ανακαλυφθεί αρκετές οικογένειες αντιµικροβιακών πεπτιδίων στους σπονδυλωτούς και ασπόνδυλους οργανισµούς, όπως είναι οι ντεφενσίνες (defensins), οι καθελισιδίνες (cathelicidins), οι λυσοζύµες (lysozymes), οι ιστατίνες (histatins), οι κεκροπίνες (cecropins), προτεγκρίνες (protegrins) κ.α. Η σηµαντικότητά των αντιµικροβιακών πεπτιδίων απεικονίζεται από το γεγονός ότι η εξάντληση των κατιονικών πεπτιδίων στα σωµατικά υγρά αποµακρύνει επίσης και την αντιµικροβιακή δραστηριότητα (Cole et al., 2002). Οι ντεφενσίνες (defensins) είναι αντιµικροβιακά 2-6kDa κατιονικά πεπτίδια, πλούσια σε κυστείνη και αργινίνη, τα οποία ποικίλουν σε µήκος, από 18 έως 45 αµινοξέα περίπου (Selsted and Quellette, 2005), και ως αντιµικροβιακά πεπτίδια, αποτελούν τα πρώτα κυτταρικά συστατικά που δρουν έναντι των παθογόνων µικροοργανισµών (Quellette and Selsted, 1996). Παράγονται τόσο από τα κύτταρα του Paneth, όσο και από τα επιθηλιακά, τα Τ-λεµφοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα πολυµορφοπύρηνα. Έχουν ευρεία αντιµικροβιακή δράση, η οποία περιλαµβάνει Gram θετικά και αρνητικά βακτήρια, ιούς, µύκητες αλλά και πρωτόζωα. Οι ντεφενσίνες έχουν τη δυνατότητα να καταστρέφουν τους παθογόνους µικροοργανισµούς, καθώς οδηγούν σε εκπόλωση την κυτταρικής τους µεµβράνης (Lehrer, 1993), διαταράσσοντας την ακεραιότητά της (Zasloff, 2002). Ο µηχανισµός δράσης τους συνίσταται στο ότι τα κατιονικά πεπτίδια είναι σε θέση να αλληλεπιδρούν ηλεκτροστατικά µε αρνητικά φορτισµένα συστατικά της κυτταρικής µεµβράνης, όπως είναι ο λιποπολυσακχαρίτης, το λιποτειχοικό οξύ (LTA) και τα ανιονικά φωσφολιπίδια και στη συνέχεια να διαπερνούν την κυτταρική µεµβράνη (Hancock, 1997). Εξαιτίας της πολύ υψηλής συγγένειας των ντεφενσινών µε τα δισθενή κατιόντα της εξωτερικής µεµβράνης, τα κατιονικά πεπτίδια µπορούν να 39

εκτοπίσουν τα ιόντα Ca 2 + και Mg 2 +, τα οποία είναι πολύ σηµαντικά για τη σταθερότητα της µεµβράνης του παθογόνου και εν συνεχεία τα πεπτίδια, εξαιτίας του µεγαλύτερου µεγέθους τους, διαταράσσουν τη δοµή της µεµβράνης (Hancock, 1997; Hancock and Chapple, 1999), µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό πόρων στην κυτταρική µεµβράνη των παθογόνων και την τελική τους εξόντωση (Ganz, 2003). Χαρακτηρίζονται από την παρουσία στο µόριό τους τριών δισουλφιδικών δεσµών στις θέσεις α, β και θ. Για αυτό τον λόγο τα αντιµικροβιακά πεπτίδια διακρίνονται σε τρεις υποκατηγορίες, τις α-, β- και θ- ντεφενσίνες. Οι α-ντεφενσίνες έχουν βρεθεί µόνο σε θηλαστικά, ενώ οι β-ντεφενσίνες προσδιορίστηκαν σε όλα τα σπονδυλωτά είδη (Lehrer and Ganz, 2002). Οι θ-ντεφενσίνες έχουν βρεθεί µόνο σε πρωτεύοντα θηλαστικά (Tang et al., 1999), και δεν έχουν µελετηθεί εκτενώς. 1.4.1. Αντιµικροβιακά πεπτίδια Avian β-defensins (AvβDs) Όσον αφορά στις ντεφενσίνες, στο γονιδίωµα των πτηνών υπάρχει µόνο η οικογένεια των β-ντεφενσινών (Avian β-defensins, AvβDs), όπου έχουν αναγνωριστεί 14 γονίδια τα οποία κωδικοποιούν τα AvβDs πεπτίδια (Lynn et al., 2007, Xiao et al., 2004). Τα γονίδια αυτά αποτελούνται από τέσσερα εξώνια, µε εξαίρεση το γονίδιο AvβD12, όπου τα τελευταία δύο εξώνια έχουν συντηχθεί (Xiao et al., 2004). Ενώ τα AvβDs εκφράζονται σε ορισµένους ιστούς σε σταθερό επίπεδο, η έκφρασή τους αυξάνεται ως ανοσολογική απάντηση προς τη µόλυνση παθογόνων οργανισµών ή µέσω της προφλεγµονώδους διέγερσης (Zhao et al., 2001; Sugiarto and Yu, 2006). Επίσης, η έκφραση των AvβDs εξαρτάται από τη φυλή, το φύλο και από το είδος του ιστού ή των κυττάρων (Sadeyen et al., 2004; 2006; Ebers et al., 2009). 40

1.5. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΩΝ ΣΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Η επικοινωνία µέσα στο έµφυτο ανοσοβιολογικό σύστηµα και η λειτουργική του ενοποίηση µε την επίκτητη ανοσία πραγµατοποιείται, κυρίως, µέσω της σύνθεσης και έκκρισης των κυτταροκινών. Οι κυτταροκίνες είναι αγγελιοφόρα µόρια του ανοσοποιητικού συστήµατος. Ο ρόλος τους είναι η ρύθµιση της λειτουργίας διαφορετικών κυττάρων που συµµετέχουν στην έµφυτη και στην επίκτητη ανοσιακή απάντηση, καθώς είναι οι κύριοι µεσολαβητές της ενδοεπικοινωνίας µεταξύ των µακροφάγων και των Τ-λεµφοκυττάρων, και παράγονται από µια ποικιλία εξειδικευµένων κυττάρων, ως απάντηση σε διάφορα αντιγονικά ερεθίσµατα. Αυτό το σύστηµα περιγράφεται ως δίκτυο διακυτταρικής επικοινωνίας. Συγκεκριµένα οι κυτταροκίνες είναι πρωτεΐνες που συµµετέχουν στην ενεργοποίηση, στην καταστολή, στην απόπτωση, στη µετανάστευση και τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων ανοσίας, καθώς και στην έναρξη και τον έλεγχο της φλεγµονώδους αντίδρασης (Kuby, 1997; Frydas et al., 2004; Abbas et al., 2007; Alexander and Hilton, 2004; Smith-Garvin et al., 2009). Μέσω των παραπάνω δράσεων, οι κυτταροκίνες εµπλέκονται σε όλους σχεδόν τους µηχανισµούς της έµφυτης και επίκτητης ανοσίας και αποτελούν βασικούς ρυθµιστές της ανοσοβιολογικής απόκρισης του ξενιστή (Belardelli et al., 1995). Κατά κανόνα οι κυτταροκίνες εµφανίζουν πλειοτροπική δράση. Συγκεκριµένη κυτταροκίνη επιδεικνύει διαφορετικά βιολογικά αποτελέσµατα σε διαφορετικού τύπου κύτταρα-στόχους. Οι κυτταροκίνες που παράγονται από λευκοκύτταρα και επιδρούν κυρίως σε αλλά λευκοκύτταρα ονοµάζονται ιντερλευκίνες. Η κατηγορία των χηµειοκινών περιλαµβάνει κυτταροκίνες που επιδεικνύουν χηµειοτακτική δράση 41

ενώ οι κυτταροκίνες που σχετίζονται µε αντι-ιική δράση ονοµάζονται ιντερφερόνες (Parkin and Cohen, 2001; Winkler et al., 2007). Οι κυτταροκίνες συνδέονται ισχυρά µε ειδικούς υποδοχείς στη µεµβράνη των κυττάρων-στόχων και ενεργοποιούν διαδικασίες προώθησης µηνυµάτων σε γονιδιακό επίπεδο, ρυθµίζοντας ενεργά τη σύνδεση των κυττάρων και τη λειτουργία τους (Abbas and Lichtman, 2003). Επιπλέον, οι κυτταροκίνες µε τις δράσεις τους ρυθµίζουν το µέγεθος, το είδος και τη διάρκεια της ανοσιακής απόκρισης διεγείροντας ή αναστέλλοντας την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση των λεµφοκυττάρων σε ποικίλα δραστικά κύτταρα, τα οποία εξουδετερώνουν τα αντιγόνα, και ρυθµίζοντας την έκκριση αντισωµάτων ή άλλων κυτταροκινών (Hoffman et al., 2002; Abbas and Lichtman, 2003; Lu and Rudensky, 2009). Συνήθως, η απάντηση ενός κυττάρου στη σύνδεση µιας κυτταροκίνης µε τον αντίστοιχο υποδοχέα είναι η ρύθµιση της έκφρασης άλλων υποδοχέων, καθώς και η έκκριση άλλων κυτταροκινών, µε αποτέλεσµα την επακόλουθη διέγερση και άλλων κυττάρων. Με αυτό τον τρόπο η διέγερση ενός και µόνο λεµφοκυττάρου, για ένα αντιγόνο, είναι ικανή να επηρεάσει έναν αριθµό κυττάρων, µε αποτέλεσµα τη έναρξη µιας αποτελεσµατικής ανοσιακής απάντησης (Kuby, 1997; Hoffman et al., 2002; Abbas and Lichtman, 2003; Abbas et al., 2007; Dorhoi and Kaufmann, 2009; Smith- Garvin et al., 2009). Ο τρόπος δράσης των κυτταροκινών διακρίνεται σε αυτοκρινή, κατά τον οποίο οι κυτταροκίνες προσδένονται σε υποδοχείς του ίδιου του κυττάρου που τις εκκρίνει, σε παρακρινή, όπου οι κυτταροκίνες προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρων-στόχων που βρίσκονται κοντά στο κύτταρο το οποίο τις εκκρίνει, και τέλος σε ενδοκρινή, κατά τον οποίο προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρων τα οποία βρίσκονται σε 42

αποµακρυσµένα µέρη από το κύτταρο το οποίο τις εκκρίνει, µέσω της κυκλοφορίας του αίµατος (Naka et al., 2005). Ανάλογα µε τη δοµή τους, οι κυτταροκίνες διακρίνονται σε: 1. Ιντερλευκίνες (interleukins,ils) 2. Ιντερφερόνες (interferones, IFNs) 3. Μέλη της οικογένειας του παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNFs, Tumor Necrosis Factors: TNF-α, TNF-β) 4. Παράγοντες διέγερσης αποικιών ή παράγοντες πολλαπλασιασµού των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων (Colony Stimulating Factors, CSFs). 5. Χηµειοκίνες (chemokines). 6. Αυξητικοί και τροποποιητικοί παράγοντες: TGF, Transforming Growth Factor (Μετατρεπτικός Αυξητικός Παράγοντας), PDGF Platelet derived growth factor ((Αυξητικός παράγοντας αιµοπεταλίων), EGF epidermal growth factor (Επιδερµικός αυξητικός παράγοντας), FGF fibroblast growth factor (Αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών). Οι κυτταροκίνες που µεσολαβούν στην φυσική ανοσία περιλαµβάνουν: α) αυτές που προστατεύουν έναντι των µολυσµατικών ιών, όπως οι ιντερφερόνες και β) αυτές που ξεκινούν τη φλεγµονώδη αντίδραση, η οποία προστατεύει τον οργανισµό έναντι των παθογόνων βακτηρίων και περιλαµβάνουν τις ιντερφερόνες, ιντερλευκίνες και τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων. Συνοπτικά οι βιολογικές δράσεις των κυτταροκινών µπορούν να διακριθούν στις ακόλουθες οµάδες: 1) Συµµετέχουν στην εκτελεστική φάση τόσο της ειδικής όσο και της µη ειδικής ανοσίας (Abbas and Lichtman, 2003). 2) Ρυθµιστικοί παράγοντες της έναρξης και της ενίσχυσης ανοσιακής φλεγµονής. Για 43

το σκοπό αυτό συµµετέχουν κυρίως οι εξής κυτταροκίνες: IFN-γ, IL 5, IL-10 και η IL-12 (Hoffman, 2002). 3) Διεγερτικοί παράγοντες του πολλαπλασιασµού και της διαφοροποίησης των λευκοκυττάρων (Abbas and Lichtman, 2003). 4) Οι κυτταροκίνες έχουν και πολλαπλές άλλες δράσεις, καθώς πολλές κυτταροκίνες έχουν αντινεοπλασµατική δράση (Abbas and Lichtman, 2003). 44

1.6. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΣΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗΣ Η φυσιολογία και η ανοσολογία του θηλυκού αναπαραγωγικού συστήµατος είναι εξαιρετικά πολύπλοκη. Η µήτρα παρέχει χώρο για την εµφύτευση και την ανάπτυξη των αλλογενών του εµβρύου και παρέχει επίσης προστασία έναντι της εισβολής µιας ποικιλίας παθογόνων οργανισµών. Στα θηλυκά τα TLRs εµπλέκονται σε πλήθος παραµέτρων φυσιολογίας αναπαραγωγής, όπως στη ρύθµιση της ωοθηλακιορρηξίας, της γονιµοποίησης, της εµφύτευσης και ανάπτυξης του εµβρύου, της κυήσεως και του τοκετού, καθώς και σε παθολογικές καταστάσεις όπως είναι η ενδοµητρίτιδα και η µαστίτιδα (Kannaki et al., 2010a, b). Στα αρσενικά, οι TLRs παίζουν ρόλο στην στεροειδογένεση και τη σπερµατογένεση (Hedger, 2011). Πρόσφατες έρευνες έχουν εντοπίσει την ύπαρξη πρότυπου έκφρασης των TLRs στην ωοθήκη και στον ωαγωγό διαφόρων οργανισµών, όπως στους χοίρους, στα βοοειδή, στα βουβάλια και στα πτηνά (Alvarez et al, 2006; Herath et al., 2007; Subedi et al., 2007; Vahanan et al., 2008; Kannaki et al., 2010b; Michailidis et al., 2010; 2011). Σε µια λεπτοµερή έρευνα στις όρνιθες που διεξήχθη από τους Subedi et al. (2007), παρατηρήθηκε διαφορετικό πρότυπο έκφρασης των TLRs κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των ωοθυλακίων, καθώς επίσης και µεταξύ των κυττάρων της έσω θήκης και των κοκκωδών κυττάρων του θυλακίου. Το στρώµα της έσω θήκης εκφράζει τα γονίδια TLR2, 4, 5 και 7, ενώ στο στρώµα των κοκκωδών κυττάρων εκφράζονται µόνο τα γονίδια TLR4 και 5. Τα επίπεδα της έκφρασης των TLR4 και 5 στα κοκκώδη κύτταρα αυξάνονται µε την ανάπτυξη των ωοθυλακίων και τα αποτελέσµατα ποσοτικοποίησης των επιπέδων έκφρασης επιβεβαίωσαν αυτή την αύξηση στα κοκκώδη κύτταρα (Kannaki et al., 2010a). 45

Επίσης, έχει αναφερθεί ότι η έκφραση των TLRs παρέµεινε σε υψηλά επίπεδα στο ωοκύτταρο µετά την ωοθυλακιορρηξία και υποστηρίζεται ότι προφλεγµονώδη µόρια, όπως είναι η IL-6 και ο TNF-α, απελευθερώνονται µέσω της ενεργοποίησης των TLRs (Gérard et al., 2004; Shimada et al., 2006; Liu et al., 2008). Επιπλέον, έρευνες απέδειξαν πρότυπο έκφρασης των TLRs σε αναπτυσσόµενα έµβρυα διαφορετικών ειδών. Στα πρόβατα, κατά τη διάρκεια της κυοφορίας αυξήθηκε η έκφραση των TLR2 και 4 και επίσης, η έκφραση των γονιδίων αυτών αυξήθηκε, µετά την έγχυση µε LPS, στον εµβρυικό πνεύµονα προβάτου (Meyerholz et al., 2006; Hillman et al., 2008; Kramer et al., 2009). Στην όρνιθα, όλα τα µέλη της οικογένειας των TLRs, εκτός του TLR1-1, εκφράζονται κατά τη διάρκεια της εµβρυικής ανάπτυξης (Michailidis et al., 2010). Ωστόσο, διαφορετικά επίπεδα έκφρασης παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της εµβρυικής ανάπτυξης για τα γονίδια TLR2, 15 και 21, αλλά όχι του TLR4 (Meade et al., 2009). Ως εκ τούτου, ενισχύεται η υπόθεση σχετικά µε έναν πιθανό ρόλο των TLR στην εµβρυϊκή ανάπτυξη των πτηνών. Στα αρσενικά, οι TLRs διαδραµατίζουν ρόλο στη στεροειδογένεση και τη σπερµατογένεση, τόσο στη φυσιολογική τους λειτουργία, όσο και στην παθολογία τους. Επίσης, εµπλέκονται στην ικανότητα του σπερµατοζωαρίου να διεισδύει στο αναπαραγωγικό σύστηµα του θηλυκού και να γονιµοποιεί το ωάριο (Girling and Hedger, 2007). Η ενεργοποίηση των TLR2 και 4 στα ωοκύτταρα διεγείρει την παραγωγή συγκεκριµένων κυτταροκινών, η οποία επάγει τη γονιµοποιητική ικανότητα των σπερµατοζωαρίων (Kannaki et al., 2010b). Επιπλέον, το πρότυπο έκφρασης των TLRs στα κύτταρα Sertoli, υποδηλώνει τον πιθανό ρόλο τους στη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων αυτών, εκτός από την προστασία κατά των µολύνσεων των όρχεων (Wu et al., 2008). 46

Επιπρόσθετα, τα αντιµικροβιακά πεπτίδια διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στους µηχανισµούς άµυνας των αναπαραγωγικών οργάνων. Η παρουσία αντιµικροβιακών πεπτιδίων είναι πολύ σηµαντική ακόµη και στην πολύ ευαίσθητη περίοδο της κυοφορίας, καθώς η κοιλότητα της µήτρας, αποµονώνεται από το µολυσµατικό περιβάλλον του κόλπου και περιέχει αντιµικροβιακά πεπτίδια και πρωτεΐνες (Strominger, 2009). Το αµνιακό υγρό, από την άλλη πλευρά, παρουσιάζει ισχυρή αντιµικροβιακή δράση έναντι πολλών Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων. Επιπρόσθετα, πρότυπο έκφρασης αντιµικροβιακών πεπτιδίων, όπως οι οικογένειες των καθελισιδινών και β-ντεφενσινών, έχει εντοπιστεί σε επιθηλιακά κύτταρα του δέρµατος εµβρύων όρνιθας, όπως επίσης και πολλά µέλη της οικογένειας των AvβDs εκφράζονται στα έµβρυα της όρνιθας κατά τα πρώτα στάδια της εµβρυικής ανάπτυξης (Michailidis et al., 2010). Έχει αναφερθεί ότι η έκφραση των AvβDs µπορεί να επηρεάζεται από πολλούς φυσιολογικούς παράγοντες, όπως είναι η ηλικία των πτηνών, η φυλή, καθώς και το είδος του ιστού ή του οργάνου που εξετάζονται (Hasenstein et al., 2006; Yoshimura et al., 2006; Ebers et al., 2009). Επίσης, η διακοπή της αυγοπαραγωγής, προκαλούµενη από τη διακοπή της διατροφής, συνοδεύεται από µείωση της έκφρασης των AvβD1, 2 και 3 (Yoshimura et al., 2006). Όσον αφορά στις κυτταροκίνες, πρόσφατες µελέτες έχουν αναφερθεί στη δράση τους σε διάφορες αναπαραγωγικές λειτουργίες, όπως την ανάπλαση του τραχήλου της µήτρας, τη διάρρηξη της εµβρυϊκής µεµβράνης, τη συστολή της µήτρας και τον τοκετό (Friebe-Hoffmannet al., 2001; Rauk et al., 2001; Abdelsalam et al., 2011). Ο NF-κΒ, ένας βασικός µεταγραφικός παράγοντας στη µεσολάβηση της οδού σηµατοδότησης των TLR, εµπλέκεται στη ρύθµιση των κυτταροκινών και την παραγωγή προσταγλανδίνης µέσω των ιστών που σχετίζονται µε την κυοφορία. Οι 47

Patni et al. (2007) ανέφεραν ότι η διαστολή του τραχήλου της µήτρας και η συστολή του µυοµητρίου προκαλούνται µέσω της δράσης των IL-1β και της ωκυτοκίνης, µε αποτέλεσµα την πραγµατοποίηση του τοκετού, την αποβολή του πλακούντα και την προστασία από µολύνσεις αµέσως µετά τον τοκετό. Όσον αφορά στο αρσενικό, πολλές έρευνες έχουν αναφέρει ότι οι κυτταροκίνες έχουν άµεση επίδραση στη φυσιολογική λειτουργία των όρχεων. Πολλές κυτταροκίνες εκφράζονται στους όρχεις και στα κύτταρα Sertoli των θηλαστικών, ακόµη και σε απουσία µολύνσεων, διαδραµατίζοντας ένα σηµαντικό ρόλο στη ανάπτυξη και φυσιολογική λειτουργία των όρχεων, καθώς και στη σπερµατογένεση (Hedger and Meinhardt, 2003; Guazzone et al., 2012). Είναι γνωστό ότι η προστασία από µολύνσεις αποτελεί µία πολύ σηµαντική παράµετρο της φυσιολογικής λειτουργίας του αναπαραγωγικού συστήµατος. Καθώς, τα TLRs, AvβDs και οι κυτταροκίνες διαδραµατίζουν έναν πολύ σηµαντικό ρόλο στην έµφυτη ανοσία, πρόσφατες έρευνες έχουν αναφερθεί και στο ρόλο τους τόσο σε θηλαστικά, όσο και σε πτηνά, στην προστασία των αναπαραγωγικών οργάνων από µολύνσεις. 48

1.7. ΜΟΛΥΝΣΕΙΣ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ - ΣΑΛΜΟΝΕΛΑ Κατά τη διάρκεια της εισβολής των παθογόνων µικροβίων τα PAMPs αναγνωρίζονται από τους TLRs στο ενδοµήτριο, το οποίο κινεί κλιµακωτή αντίδραση σηµατοδότησης για την παραγωγή διαφόρων κυτταροκινών, µε αποτέλεσµα την αντιµετώπιση της µόλυνσης. Η παθογόνος µόλυνση των όρχεων ή τµηµάτων του αναπαραγωγικού συστήµατος του αρσενικού οδηγεί στην ενεργοποίηση της έµφυτης ανοσολογικής απόκρισης και των TLRs. Το LPS, ένα σηµαντικό συστατικό των εισβαλλόµενων βακτηριακών παθογόνων έχει την ικανότητα να διεγείρει τα κύτταρα Sertoli άµεσα, µε αποτέλεσµα την παραγωγή διαφόρων φλεγµονωδών κυτταροκινών όπως η IL-1β, η IL-6 και ο TNF-α. (Gérard et al., 1992; Stéphan et al., 1997; Okuma et al., 2006; Rodrigues et al., 2008). Τα AvβDs εκφράζονται στα κοκκώδη κύτταρα της όρνιθας (Subedi et al., 2008; Abdelsalam et al., 2010) και η επώαση µε LPS αυξάνει την έκφραση ορισµένων γονιδίων, πιθανόν µέσω της σηµατοδότησης του TLR4 (Subedi et al., 2007). Επιπλέον, πρόσφατες έρευνες έχουν αναφέρει ότι στην ωοθήκη, στον ωαγωγό και στα ωοθυλάκια όρνιθας, εκφράζονται µέλη της οικογένειας AvβDs, και η έκφρασή τους επάγεται από το LPS (Ohashi et al., 2005; Yoshimura et al., 2006; Milona et al., 2007; Subedi et al., 2007; Mageed et al., 2008; 2009; Ebers et al., 2009, Michailidis et al., 2012). Επίσης, σε in vitro καλλιέργειες κυττάρων του κόλπου της όρνιθας, η έκφραση ορισµένων AvβDs αυξήθηκε µετά από µόλυνση µε Salmonella enteritidis (Yoshimura et al., 2006). Πρόσφατα ερευνητικά δεδοµένα αναφέρουν την επαγωγή ορισµένων 49

AvβDs γονιδίων στον κόλπο της όρνιθας µετά από in vivo έγχυση λιποπολυσακχαρίτη (Mageed et al., 2008), καθώς επίσης και στην ωοθήκη, µετά από in vivo µόλυνση µε Salmonella enteritidis (Michailidis et al., 2012). Τα παραπάνω ερευνητικά δεδοµένα υποδηλώνουν ότι τα AvβDs αποτελούν µία οικογένεια αντιµικροβιακών πεπτιδίων, τα οποία έχουν ένα βασικό ρόλο όσον αφορά στην προστασία των αναπαραγωγικών οργάνων και κυττάρων στην όρνιθα από παθογόνους µικροοργανισµούς, συµπεριλαµβανοµένου και της σαλµονέλας. Σχετικά µε τα πτηνά, έχει αναφερθεί ότι µέλη της οικογένειας των κυτταροκινών στην όρνιθα εκφράζονται σε ωοθυλάκια, στον ωαγωγό, στην ωοθήκη, στους όρχεις και στην επιδιδυµίδα, ενώ παρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση της έκφρασης ορισµένων κυτταροκινών στα παραπάνω όργανα µετά από έκθεση σε LPS (Sundaresan et al., 2007; 2008a,b; Abdelsalam et al., 2011; 2012; Nii et al., 2011; Zhang et al., 2012). Στη βιοµηχανία των πουλερικών η υπογονιµότητα των αρσενικών, η µειωµένη γονιµότητα και παραγωγικότητα έχουν ως αποτέλεσµα σηµαντικές οικονοµικές απώλειες και την επακόλουθη διακοπή της γραµµής παραγωγής. Επιπλέον, η προστασία των αρσενικών αναπαραγωγικών οργάνων από την εισβολή παθογόνων µικροοργανισµών αποτελεί ένα πολύ σηµαντικό αντικείµενο της φυσιολογίας αναπαραγωγής, καθώς η εισβολή των µικροβιακών παθογόνων αποτελεί απειλή για την υγεία των αναπαραγωγικών οργάνων που έχει ως συνέπεια τη µείωση της γονιµότητας (Dejucq et al., 2001; Com et al., 2003; Palladino et al., 2003), και αποτελεί κίνδυνο για την πιθανή ενσωµάτωση των µικροβιακών παθογόνων στα νεοσχηµατιζόµενα αυγά. Η µικροβιακή µόλυνση του όρχι και της επιδιδυµίδας είναι πιθανό να προκαλέσει ασθένειες όπως ορχίτιδα, επιδιδυµίτιδα, επιδιδυµοορχίτιδα, πρόκληση ανωµαλίας του σπέρµατος και ως εκ τούτου µείωση της γονιµότητας και 50

εξάπλωση των παθογόνων µολυσµατικών παραγόντων, µέσω της φυσικής και τεχνητής γονιµοποίησης (Boltz et al., 2006; Jackson et al., 2006; Monleon et al., 2008; Shimizu et al., 2008), οδηγώντας σε παροδική ή µόνιµη στειρότητα (Dejucq et al., 2001; Hall et al., 2002; Com et al., 2003; Rodrigues et al., 2008). Επίσης, η επιδιδυµίδα διαδραµατίζει έναν πολύ σηµαντικό ρόλο στην αναπαραγωγή, καθώς είναι το όργανο που εµπλέκεται τόσο στην ωρίµανση και την ικανότητα, όσο και στη µεταφορά και την αποθήκευση του των σπερµατοζωαρίων πριν από την εκσπερµάτιση (Rodrigues et al., 2008; Hedger, 2011). Επιπλέον, η επιδιδυµίδα είναι ένα όργανο που εκτίθεται σε φλεγµονώδεις καταστάσεις, οι οποίες µπορούν να οδηγήσουν σε επιδιδυµίτιδα, που έχει ως αποτέλεσµα τη µειωµένη γονιµότητα και στειρότητα (Purvis and Christiansen, 1993; Dejucq and Jegou, 2001; Tracy et al., 2008). Εποµένως, η αντιµικροβιακή προστασία των αναπαραγωγικών οργάνων των αρσενικών είναι µια κρίσιµη πτυχή της φυσιολογίας αναπαραγωγής. Επιπλέον, η µόλυνση της ωοθήκης και του ωαγωγού στην όρνιθα, είναι συχνά η κύρια αιτία µόλυνσης των αυγών. Ο ωαγωγός αποτελείται από διάφορα τµήµατα, τα οποία είναι ο κώδωνας, η λευκοµατογόνος µοίρα, ο ισθµός, η µήτρα και ο κόλπος. Καθώς, ο ωαγωγός της όρνιθας ανοίγει µέσω του κόλπου στην αµάρα, διάφοροι µικροοργανισµοί, όπως η σαλµονέλα, µπορούν να εισέλθουν και να προκαλέσουν µόλυνση (Takata et al., 2003; De Buck et al., 2004a, b; Promkuntod et al., 2006; Chousalkar and Roberts, 2007). Συνεπώς, η προστασία του ωαγωγού των ορνιθίων από τις µικροβιακές µολύνσεις, είναι απαραίτητη για την επιτυχή γονιµοποίηση και την πρόληψη των παθογόνων µικροβιακών οργανισµών από την πιθανή ενσωµάτωσή τους στα νεοσχηµατιζόµενα αυγά. Επιπρόσθετως, είναι γνωστό ότι η ωοθήκη των ορνίθων είναι σηµείο προτίµησης για τον αποικισµό παθογόνων και µετάδοσής τους στα έµβρυα και αυγά (Barua and Yoshimura, 1999; De Buck et al., 2004a, b). Για 51

αυτό το λόγο, η προστασία της ωοθήκης στις όρνιθες έναντι παθογόνων είναι απαραίτητη τόσο για την αντιµικροβιακή προστασία και την παραγωγή υγιών αυγών, όσο και για τη διατήρηση της φυσιολογικής λειτουργία της ωοθήκης. Επίσης, έχει αναφερθεί ότι στα εµπορικά πτηνοτροφία, η σαλµονέλα µπορεί να µεταδοθεί είτε οριζοντίως, µέσω της αποβολής των κοπράνων, είτε µε κάθετο τρόπο, σύµφωνα µε τον οποίο η µετάδοση µπορεί να εµφανιστεί µέσω της διαδροµής από τις ωοθήκες, και αυτή η τελευταία οδός είναι συχνά η κύρια αιτία της µόλυνσης των αυγών µε σαλµονέλα (Guard, 2001). Συµπερασµατικά, τα αυγά µπορούν να µολυνθούν από τη διείσδυση των παθογόνων µέσω των κελύφων από µολυσµένα κόπρανα, µετά ή κατά τη διάρκεια της ωοτοκίας ή µέσω της µόλυνσης του περιεχοµένου των αυγών, όπως ο κρόκος, το ασπράδι του αυγού, η µεµβράνη των κελύφων ή τα κελύφη των αυγών πριν από την ωοτοκία, που προέρχεται από τη µόλυνση των αναπαραγωγικών οργάνων (De Buck et al., 2004b; Wigley et al., 2005; Gantois et al., 2009). Ένα σηµαντικό πρόβληµα που σχετίζεται µε την κατανάλωση πτηνοτροφικών προιόντων, αφορά στις µεταδιδόµενες στον ανθρώπινο οργανισµό τροφιµογενείς λοιµώξεις. Οι λοιµώξεις αυτές είναι γνωστό ότι προκαλούν σηµαντικά προβλήµατα δηµόσιας υγείας, κοινωνικά και οικονοµικά. Κύριοι παράγοντες για τις ενδηµικές, τις αναδυόµενες και επανα-αναδυόµενες λοιµώξεις παγκοσµίως, αποτελούν η στενή επαφή ανθρώπων και ζώων, η αυξανόµενη κατανάλωση προι όντων ζωικής προέλευσης και η ταχεία µεταφορά τους, η κατανάλωση µη παστεριωµένου γάλακτος και φρέσκων γαλακτοκοµικών προι όντων, η αυξανόµενη ζωική παραγωγή, η παράνοµη σφαγή ζώων, οι ακατάλληλες αποχετεύσεις, ο πολλαπλασιασµός ιολογικών και παρασιτικών φορέων και άλλες αιτίες. Οι τροφιµογενείς λοιµώξεις µπορούν να προκληθούν στον άνθρωπο µέσω της κατανάλωσης ζωικών προϊόντων, όπως τα ωµά αυγά, τα πουλερικά, το χοιρινό και το 52

βοδινό κρέας, τα γαλακτοκοµικά προιόντα, καθώς και άλλων προϊόντων κρέατος. Οι κυριότερες τροφιµογενείς λοιµώξεις είναι η σαλµονέλωση, η βρουκέλλωση (ή µελιταίος πυρετός), η εχινοκοκκίαση, η λεπτοσπείρωση, η τριχίνωση, η σπογγώδης εγκεφαλοπάθεια, οι αιµοραγικοί πυρετοί κ.α. Η σαλµονέλωση είναι ένα µία τις πιο συχνά αναφερόµενες τροφιµογενείς ασθένειες σε όλο τον κόσµο. Στον άνθρωπο οι σαλµονέλες προκαλούν λοιµώξεις των εντέρων και έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα από τα κυριότερα αίτια των τροφικών δηλητηριάσεων (http://www.keelpno.gr). Σύµφωνα µε την Ετήσια επιδηµιολογική έκθεση της Ευρωπαικής Ένωσης (Scientific Report of EFSA and ECDC) για το 2011, οι λοιµώξεις από νέλα και καµπυλοβακτηρίδιο παραµένουν οι συχνότερα αναφερόµενες γαστρεντερικές νόσοι στην Ε.Ε. Η καταγεγραµµένη συχνότητα εµφάνισης των λοιµώξεων από σαλµονέλα µειώνεται σταθερά από το 2004 και αυτό οφείλεται, τουλάχιστον εν µέρει, στην επιτυχία των προγραµµάτων ελέγχου των λοιµώξεων στην πτηνοτροφία. Ωστόσο, το 2009 τα κράτη µέλη της Ε.Ε. επαλήθευσαν 4.500 εντοπισµένα κρούσµατα. Σύµφωνα µε το Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσηµάτων, ΚΕ.ΕΛ.Π.ΝΟ., (http://www.keelpno.gr), Τµήµα Επιδηµιολογικής Επιτήρησης και Παρέµβασης, η µέση ετήσια δηλούµενη συχνότητα του νοσήµατος της σαλµονέλωσης στην Ελλάδα, µε βάση το σύστηµα υποχρεωτικής δήλωσης νοσηµάτων, ήταν για τα έτη 2000-2010, 6,6 κρούσµατα ανά 100.000 πληθυσµού. Στην Ελλάδα, το 2004 παρατηρήθηκε µία αύξηση των κρουσµάτων της σαλµονέλας κατά 270%, σε σχέση µε τον µέσο όρο των προηγούµενων 4 ετών. Το νόσηµα στη χώρα µας παρουσιάζει υψηλότερη δηλούµενη συχνότητα στα παιδιά, και ιδιαίτερα στην ηλικιακή οµάδα 0-4 έτη. Οι σαλµονέλες βρίσκονται στη φύση ως παράσιτα του εντερικού σωλήνα του ανθρώπου, των ζώων, των πτηνών και των ερπετών. Οι σαλµονέλες είναι αρνητικά 53

κατά Gram βακτήρια και ανήκουν στην οικογένεια Enterobacteriaceae (εντεροβακτηριοειδή). Οι σαλµονέλες αναπτύσσονται σε θερµοκρασία 5 C-45 C (µε τη βέλτιστη θερµοκρασία να είναι στους 37 C), σε pη 4-9 και σε άλµη πυκνότητας µέχρι 7 έως 8% NaCl, ενώ αδρανοποιούνται σε θερµοκρασία το λιγότερο 74 C και ph 4.1. Έχουν αντοχή στο χλωριούχο νάτριο (4% NaCl). Είναι εξαιρετικά ανθεκτικές και επιζούν ακόµη και όταν στερούνται των θρεπτικών συστατικών, των απαραίτητων για το µεταβολισµό τους. Επιβιώνουν στην κατάψυξη. Όπως σε όλα τα Gram-αρνητικά βακτήρια, το κυτταρικό τοίχωµα των Salmonella περιέχει λιποπολυσακχαρίτες (Holt, 2000). Οι σαλµονέλες ταξινοµούνται σε 4 υποοµάδες ή υποείδη και η διαίρεση αυτή γίνεται µε τη βοήθεια ορισµένων βιοχηµικών χαρακτήρων. Η υποοµάδα I, περιλαµβάνει το 99% περίπου των σαλµονελών, οι οποίες είναι παθογόνες για τον άνθρωπο. Στις υποοµάδες II και IV, δεν περιλαµβάνονται τύποι παθογόνοι για τον άνθρωπο. Στην υποοµάδα III, περιλαµβάνονται όλοι οι τύποι του πρώην γένους Arizona. Το υποείδος I των παθογόνων για τον άνθρωπο σαλµονελών, χαρακτηρίζεται ως Salmonella enterica subsp. enterica και περιλαµβάνει περισσότερους από 2500 γνωστούς ορότυπους (Αντωνιάδης, 2000; Hawker et al., 2005). 54

Εικόνα 4. Βακτήριο Salmonella spp. Σύµφωνα µε το Τµήµα Επιδηµιολογικής Επιτήρησης και Παρέµβασης του ΚΕ.ΕΛ.Π.ΝΟ (Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσηµάτων), οι ορότυποι που αποµονώνονται συχνότερα από τις τροφιµογενείς λοιµώξεις του ανθρώπου, στην Ελλάδα, είναι η Salmonella enterica ορότυπος Enteritidis και η Salmonella enterica ορότυπος Typhimurium (www.keelpno.gr). Η Salmonella enterica ορότυπος Enteritidis είναι η κύρια αιτία των τροφιµογενών σαλµονελώσεων, και αυτό οφείλεται, τουλάχιστον, εν µέρει στον ασυνήθιστο αποικισµό της στην αναπαραγωγική οδό της όρνιθας και την παραγωγή µολυµένων αυγών (Braden, 2006; Little, 2008). Η Salmonella Enteritidis (SE) είναι ένας ζωονοσογόνος παράγοντας που βρίσκεται συνήθως στα οικόσιτα πουλερικά και είναι υπεύθυνος για πολλά κρούσµατα σαλµονέλωσης στον άνθρωπο (Altekruse, 2006; Humphrey, 2006; Gast, 2007). Έχει αποδειχθεί ότι η Salmonella enterica ορότυπος Enteritidis έχει έναν ασυνήθιστο αποικισµό στο αναπαραγωγικό σύστηµα των ορνίθων και µία ικανότητα να παραµένει στον ωαγωγό και την ωοθήκη. Ελάχιστα γνωρίζουµε σχετικά µε τον τρόπο µε τον οποίο, τα αυγά µολύνονται ή ποιοί είναι οι µηχανισµοί που αναπτύσσονται έτσι ώστε να µπορεί η Salmonella 55

Enteritidis (SE) να προκαλέσει τη µόλυνση. Δύο είναι οι γνωστές πιθανές οδοί της µόλυνσης των αυγών µε σαλµονέλα. Η οριζόντια µετάδοση, η οποία προυποθέτει τη διείσδυση της σαλµονέλας µέσω των κελύφων, αφού τα αυγά καλυφθούν από το κέλυφος (De Reu et al., 2006; Messens et al., 2007). Η κάθετη µετάδοση αναφέρεται στην άµεση µόλυνση του περιεχόµενου του αυγού στον ωαγωγό, πριν από την ωοτοκία, ως αποτέλεσµα της µόλυνσης των αναπαραγωγικών οργάνων από σαλµονέλα (Okamura et al., 2001). Θεωρείται ότι η πιο σηµαντική οδός µόλυνσης των αυγών είναι µέσω µολυσµένων αναπαραγωγικών ιστών, τόσο του ωαγωγού όσο και της ωοθήκης (Gast and Beard, 1990; Keller et al., 1995). 56

1.8. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Παρόλο που τα TLRs, τα AvβDs και οι κυτταροκίνες έχουν µελετηθεί από διάφορους ερευνητές, οι οποίοι αναφέρουν ότι εκφράζονται στα αναπαραγωγικά όργανα των διαφόρων οργανισµών και εµπλέκονται σε κρίσιµα σηµεία της λειτουργίας των ωοθηκών, του ενδοµητρίου και του πλακούντα (Fazeli et al., 2005; Girling and Hedger, 2007; Woods et al., 2009; Michailidis et al., 2010; 2011), η δραστηριότητά τους στο αναπαραγωγικό σύστηµα της όρνιθας δεν έχει µελετηθεί εκτενώς. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ του αναπαραγωγικού και του ανοσοποιητικού συστήµατος έχουν πολύ σηµαντικές επιπτώσεις στη γονιµότητα και τη φυσιολογική λειτουργία των αναπαραγωγικών οργάνων. Δεδοµένης της σηµασίας των TLRs, των AvβDs και των κυτταροκινών στην έµφυτη ανοσία και τη φυσιολογία αναπαραγωγής, σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να µελετηθεί το πρότυπο έκφρασης των παραπάνω γονιδίων στην ωοθήκη, τον ωαγωγό, τους όρχεις, την επιδιδυµίδα, τα κύτταρα Sertoli και σε έµβρυα όρνιθας, σε διάφορα στάδια της εµβρυικής ανάπτυξης. Επίσης, στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η επίδραση της αναπαραγωγικής ηλικίας στα επίπεδα της έκφρασης των TLRs, των AvβDs και των κυτταροκινών στα παραπάνω αναπαραγωγικά όργανα και προσδιορίστηκαν τόσο οι επιπτώσεις της µόλυνσης µε σαλµονέλα των αναπαραγωγικών οργάνων στην έκφραση των παραπάνω γονιδίων, όσο και η επίδραση της επώασης µε LPS στα επίπεδα της έκφρασής τους, σε in vitro καλλιέργειες κυττάρων Sertoli. 57

2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Ζωικό υλικό Τα πτηνά που χρησιµοποιήθηκαν για την έρευνα της παρούσας διατριβής ήταν της φυλής Rhode Island Red. Τα πειραµατικά πτηνά στεγάστηκαν σε κλωβούς και εφαρµόστηκε συγκεκριµένη αγωγή, η οποία ήταν 14 ώρες φωτός και 10 ώρες σκοτάδι, ενώ η τροφή και το νερό δόθηκαν κατά βούληση. Η διαχείριση των πειραµατόζωων ήταν σε συµφωνία µε το θεσµικό πλαίσιο των αποδεκτών κατευθυντήριων γραµµών καλής µεταχείρισης και αντιµετωπίστηκαν σύµφωνα µε τις αρχές για τη φροντίδα των ζώων που χρησιµοποιούνται σε πειράµατα (National Research Council, 1985). Για να διαπιστωθεί κατά πόσο η ηλικία, καθώς επίσης και η µόλυνση των αναπαραγωγικών οργάνων µε Salmonella Enteritidis, επηρεάζει την έκφραση των TLRs, AvβDs και κυτταροκινών στα αναπαραγωγικά όργανα αρσενικών και θηλυκών ορνίθων in vivo, πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση RNA από τους όρχεις, τις επιδιδυµίδες, τις ωοθήκες και τους ωαγωγούς, των εξής πειραµατικών οµάδων : Ø Από θηλυκά (n = 5 σε κάθε ηλικία), στην ωοθήκη και ωαγωγό, ορνίθων ηλικίας 12, 26, 52 και 104 εβδοµάδων και από τα µολυσµένα µε Salmonella Enteritidis όργανα, 28 και 104 εβδοµάδων. Ø Από αρσενικά (n = 5 σε κάθε ηλικία), στους όρχεις ηλικίας 12, 26, 52 εβδοµάδων και 104 εβδοµάδων και στις επιδιδυµίδες ηλικίας 26, 52 και 104 εβδοµάδων. Στους µολυσµένους, µε Salmonella Enteritidis, όρχεις και 58

επιδιδυµίδες, πραγµατοποιήθηκε RNA αποµόνωση στην ηλικία των 28 εβδοµάδων. Ø Γονιµοποιηµένα αυγά, φυλής Rhode Island Red, επωάστηκαν σε θερµοκρασία 38 C και σε ποσοστό σχετικής υγρασίας 65-75% σε έναν επωαστήρα αέρος. Τα έµβρυα αποµονώθηκαν από την τρίτη (Ε3) έως την δέκατη ηµέρα (Ε10) της εµβρυικής ανάπτυξης (n=4 για κάθε ηµέρα). Το αλλαντοϊκό υγρό από τα αυγά αποµακρύνθηκε, τα έµβρυα καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 C, µέχρι να χρησιµοποιηθούν στα πειράµατα έκφρασης (Michailidis et al., 2010). Πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση RNA από τα έµβρυα πτηνών (n=4 για κάθε ηµέρα), από την τρίτη έως την δέκατη ηµέρα της εµβρυικής ανάπτυξης. Ø Τέλος, πραγµατοποιήθηκε in vitro καλλιέργεια κυττάρων Sertoli και επώαση µε λιποπολυσακχαρίτη (LPS) για χρονικά διαστήµατα 0, 6, 12, 24 και 48 ώρες, σε συνεργασία µε τον ερευνητή Pascal Froment του Ινστιτούτου INRA της Γαλλίας (Guibert et al., 2011). 2.2. Μολύνσεις µε Salmonella Enteritidis Όλα τα πτηνά του πειραµατισµού ελέγχθηκαν για µόλυνση από οροτύπους σαλµονέλας, χρησιµοποιώντας το θρεπτικό υπόστρωµα SS άγαρ (Salmonella/Shigella, Sigma). Κάθε πτηνό ελέγχθηκε για σαλµονέλωση χρησιµοποιώντας δείγµατα περιττωµάτων σε τριβλία επιλογής θρεπτικού 59

υποστρώµατος SS. 63 gr SS άγαρ διαλύθηκαν σε 1 λίτρο αποσταγµένου νερού και 150 ml περίπου του διαλύµατος τοποθετήθηκαν σε αποστειρωµένα τριβλία. Στα τριβλία αυτά τοποθετήθηκαν δείγµατα περιττωµάτων διαλυµένα σε 1x PBS (Ambion). Μετά από επώαση 12-16 ωρών στους 37 C, έγινε έλεγχος των σχηµατιζόµενων αποικιών και επιβεβαιώθηκε ότι τα δείγµατα ήταν αρνητικά για τα βακτήρια της σαλµονέλας (Michailidis, et al., 2010). Στη συνέχεια, για τις ανάγκες του πειραµατισµού, αρσενικά (n=5), ηλικίας 28 εβδοµάδων, και θηλυκά (n=5), ηλικίας 28 και 104 εβδοµάδων, µολύνθηκαν µε Salmonella Enteritidis. Αυτά τα πτηνά καθετηριάστηκαν, µέσω του στόµατος, µε 0,1 ml διαλύµατος που περιείχε, περίπου 5 x 10 6 οργανισµούς της Salmonella Enteritidis ορότυπου 7 (PT7). Μη µολυσµένα πτηνά ελέγχου (µάρτυρες), της ίδιας ηλικίας, των οποίων η εκτροφή πραγµατοποιήθηκε στις ίδιες περιβαλλοντικές συνθήκες, καθετηριάστηκαν µε 0,1 ml ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών αλάτων, PBS (Phosphate Buffered Saline). Την τέταρτη ηµέρα µετά τη µόλυνση, τα πτηνά θανατώθηκαν µε αυχενική εξάρθρωση, τα αναπαραγωγικά τους όργανα (όρχεις, επιδιδυµίδα, ωοθήκη και ωαγωγός) συλλέχθηκαν, καταψύχθηκαν αυτοµάτως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 C, µέχρι να αναλυθούν (Michailidis, et al., 2010). Η παρουσία της σαλµονέλας στα αναπαραγωγικά όργανα (όρχεις, επιδιδυµίδα, ωοθήκη και ωαγωγός) των µολυσµένων πτηνών, επιβεβαιώθηκε µε τη χρήση Salmonella / Shigella (SS) άγαρ (Sigma). Οι όρχεις, οι επιδιδυµίδες, οι ωοθήκες και οι ωαγωγοί του κάθε µολυσµένου πτηνού (αρσενικού και θηλυκού) ελέγχθηκαν για σαλµονέλα µε επίστρωση διαφορετικών αραιώσεων των οµογενοποιηµένων δειγµάτων των αναπαραγωγικών οργάνων, που επαναιωρήθηκαν σε 1Χ PBS, των SS επιλεκτικών τριβλίων άγαρ (Sigma). Χρησιµοποιώντας αυτό το µέσο, η ανάπτυξη της 60

αποικίας του είδους Salmonella Enteritidis είναι συνεχής και εµφανίζεται ως µία άχρωµη (διαφανής) αποικία, µε ένα µαύρο κέντρο. Στα πειράµατα έκφρασης της παρούσας διατριβής, χρησιµοποιήθηκαν µόνο οι ιστοί των δειγµάτων των αναπαραγωγικών οργάνων µε περισσότερο από 1 10 6 cfu/ml οργανισµούς σαλµονέλας. 2.3. Αποµόνωση γενωµικού DNA Για την αποµόνωση γενωµικού DNA πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση ιστού και λειοτρίβισή του σε γουδί παρουσία υγρού αζώτου, έως ότου ο ιστός λάβει κοκκώδη µορφή (µορφή πούδρας). Η εξαγωγή του ολικού DNA πραγµατοποιήθηκε µε την τυποποιηµένη συσκευασία αποµόνωσης DNA της εταιρίας Macherey Nagel µε το kit Genomic DNA from tissue Nucleospin Tissue (Macherey Nagel, MN), µε τη χρήση του κατάλληλου πρωτοκόλλου, σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η µέθοδος που πραγµατοποιήθηκε ήταν η ακόλουθη: 1) Σε καθαρό σωλήνα eppendorf τοποθετούµε 25mg ζωικού ιστού από τα αναπαραγωγικά όργανα, όρχεις, επιδιδυµίδες, ωοθήκες, ωαγωγοί, και τα έµβρυα. 2) Προσθήκη 180µL διαλύµατος T1 και 25µL Proteinase K στο ζωικό ιστό και οµογενοποίηση του µίγµατος µε συσκευή ανάδευσης. 3) Επώαση του µίγµατος στους 56 C, µέχρι να ολοκληρωθεί η λύση των κυττάρων. Κατά τη διάρκεια της επώασης, είτε πραγµατοποιείται περιστασιακά ανάµιξη µε συσκευή ανάδευσης (χρήση vortex, δόνηση), είτε χρησιµοποιείται θερµαινόµενος επωαστήρας µε ανάδευση. 4) Προσθήκη 200 µl διαλύµατος Β3, γρήγορη ανακίνηση µε συσκευή ανάδευσης 61

και επώαση στους 70 C για 10 min. 5) Προσθήκη 210 µl απόλυτης αιθανόλης (100%) στο µίγµα και γρήγορη ανακίνηση µε συσκευή ανάδευσης. 6) Μεταφορά του διαλύµατος. Για κάθε δείγµα χρησιµοποιήθηκαν ειδικές στήλες συγκράτησης DNA. Φυγοκέντρηση για 1 min σε 11.000 x g, αποµάκρυνση του υποκειµένου και επανατοποθέτηση των κολώνων DNA σε µικροσωληνάρια. 7) Προσθήκη 500 µl διαλύµατος BW και φυγοκέντρηση για 1 min σε 11.000 x g, αποµάκρυνση του υποκειµένου και επανατοποθέτηση των ειδικών στήλων συγκράτησης DNA σε µικροσωληνάρια. 8) Προσθήκη 600 µl διαλύµατος B5 και φυγοκέντρηση για 1 min σε 11.000 x g, αποµάκρυνση του υποκειµένου και επανατοποθέτηση των ειδικών στήλων συγκράτησης DNA σε µικροσωληνάρια. 9) Φυγοκέντρηση για 1 min σε 11.000 x g. 10) Μεταφορά των ειδικών στηλών σε µικροσωληνάρια και προσθήκη 100 µl διαλύµατος BE, το οποίο έχει προθερµανθεί στους 70 C. Επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου για 1min και φυγοκέντρηση για 1 min σε 11.000 x g. 11) Αποθήκευση του αποµονωµένου DNA στους -20 C. 2.4. Αποµόνωση RNA Πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση RNA από τα κύτταρα Sertoli, από τα έµβρυα από την τρίτη (Ε3) έως την δέκατη (Ε10) ηµέρα της εµβρυικής ανάπτυξης (n=4 για κάθε ηµέρα) και από τα αναπαραγωγικά όργανα (ωοθήκη, ωαγωγός, όρχεις και επιδιδυµίδα), υγειών και µολυσµένων, αρσενικών (n=5) και θηλυκών (n=5) ορνιθίων. Πραγµατοποιήθηκε λειοτρίβιση του ιστού σε γουδί παρουσία υγρού αζώτου, έως 62

ότου ο ιστός λάβει κοκκώδη µορφή (µορφή πούδρας). Ο ιστός µεταφέρθηκε σε µικροσωληνάρια και είτε χρησιµοποιήθηκε αµέσως για την αποµόνωση ολικού RNA, είτε διατηρήθηκε στους -80 C. Η εξαγωγή του ολικού RNA από τους ιστούς πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση τριζόλης και συγκεκριµένα χρησιµοποιήθηκε το αντιδραστήριο Trizol (Molecular Research Center, MRC), µε τη χρήση του κατάλληλου πρωτοκόλλου, σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν ήταν: 1) Το αντιδραστήριο Trizol 2) Χλωροφόρµιο 3) Ισοπροπυλική αλκοόλη 4) 75 % Αιθανόλη 5) Απιονισµένο νερό, απαλλαγµένο από RNase Η µέθοδος που πραγµατοποιήθηκε ήταν η ακόλουθη: 1. Προσθήκη 1ml τριζόλης (Trizol) για 5-10x10 6 κύτταρα ή για 50-100mg ιστού και οµογενοποίηση των δειγµάτων µε έντονη ανάδευση. 2. Επώαση των οµογενοποιηµένων δειγµάτων για 5 min σε θερµοκρασία δωµατίου, ώστε να γίνει ο πλήρης διαχωρισµός των νουκλεοπρωτεινικών συµπλόκων. 3. Προσθήκη 0,2 ml χλωροφορµίου για κάθε 1ml Trizol. 4. Έντονη ανάδευση για 15 sec και επώαση για 10 min σε θερµοκρασία δωµατίου. 5. Φυγοκέντρηση στα 12.000 x g για 15 min στους 4 C. 6. Μετά τη φυγοκέντρηση, προκύπτει ένα ίζηµα (µίγµα), το οποίο αποτελείται από 63

τρεις φάσεις: η υπερκείµενη (άνω) άχρωµη υδάτινη φάση, η οποία περιέχει το RNA και είναι σε όγκο το 60% του Trizol που χρησιµοποιήθηκε στην αρχική οµογενοποίηση, η ενδιάµεση λευκή φάση, η οποία περιέχει το DNA και τις πρωτείνες, και η υποκείµενη (κατώτερη) κόκκινη οργανική φάση, στην οποία λαµβάνονται οι πρωτείνες. 7. Μεταφορά µόνο της άνω άχρωµης υδάτινης φάσης σε νέο µικροσωληνάριο και προσθήκη ισοπροπυλικής αλκοόλης σε ποσότητα 0,5ml για κάθε 1ml Trizol που χρησιµοποιήθηκε στην αρχική οµογενοποιήση. 8. Επώαση για 8 min σε θερµοκρασία δωµατίου. 9. Φυγοκέντρηση στα 12.000 x g για 8 min στους 4 C. 10.Μετά τη φυγοκέντρηση το RNA παραµένει υπό τη µορφή σφαιριδίου γέλης, στον πυθµένα του µικροσωληναρίου. 11.Αποµάκρυνση υπερκείµενου και έκπλυση του σφαιριδίου RNA µε 75% αιθανόλη, σε ποσότητα 1ml ανά 1ml Trizol που χρησιµοποιήθηκε στην αρχική οµογενοποίηση. 12.Φυγοκέντρηση στα 7.500 x g για 5 min στους 4 C. 13.Αποµάκρυνση υπερκείµενου και ελαφρά ξήρανση του σφαιριδίου RNA στο φυσικό αέρα του δωµατίου για 2 min. 14.Προσθήκη 70-100ml νερού (RNase-free) και διάλυση του σφαιριδίου RNA µε διαδοχικές αναρροφήσεις στην πιπέτα. 15.Επώαση για 10 min στους 60 C. Για τον περιορισµό της αποικοδόµησης του RNA, προστέθηκε σε κάθε δείγµα RNase αναστολέας (RNase inhibitor, Invitrogen), 1 µονάδα ανά µg (1 U/µg) RNA, πριν από την αποθήκευση στους -80 C. 64

Η ποσότητα του εξαγόµενου RNA προσδιορίστηκε µε φωτοµέτρηση στα 260nm και 280nm, χρησιµοποιώντας το BioPhotometer (Eppendorf), ενώ η ποιότητά του µέσω της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωµα αγαρόζης 1% και της έκθεσης σε υπεριώδη ακτινοβολία, έτσι ώστε να είναι δυνατή η διάκριση του 28S και 18S ριβοσωµικού RNA. Ο φωτοµετρικός προσδιορισµός νουκλεικών οξέων, µπορεί να µας δώσει δύο πληροφορίες, µία για την ποσότητα του DNA ή RNA του δείγµατος και µία για την καθαρότητά του, αναφορικά µε την ανάµιξή του µε πρωτείνες. Η µέτρηση στα 260nm επιτρέπει τον υπολογισµό της συγκέντρωσης του νουκλεικού οξέος στο δείγµα, ενώ η µέτρηση στα 280nm, µας επιτρέπει τον υπολογισµό της συγκέντρωσης των προσµίξεων των πρωτεινών ή φαινόλης που βρίσκονται στο δείγµα. Εποµένως, η καθαρότητα του DNA ή του RNA εκτιµάται έπειτα από δύο µετρήσεις: µία στα 260nm και µία στα 280nm. Στη συνέχεια, από το λόγο αυτό των τιµών της οπτικής απορρόφησης στα 260nm και στα 280nm (260/280nm), υπολογίζεται ο βαθµός της καθαρότητας του νουκλεικού οξέος. Καθαρά δείγµατα DNA και RNA δίνουν τιµές 1,8 και 2, αντίστοιχα. Εάν υπάρχουν προσµίξεις πρωτεινών ή φαινόλης, ο λόγος 260/280nm δίνει πολύ µικρότερες τιµές και ο ακριβής προσδιορισµός των νουκλεικών οξέων δεν είναι δυνατός. 2.5. Χειρισµός µε DNase Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αποµόνωσης του ολικού RNA, ενδέχεται να αποµονωθεί και µέρος του γενωµικού DNA και εποµένως τα δείγµατα RNA να είναι µολυσµένα από DNA. Το γεγονός αυτό είναι µη επιθυµητό γιατί θα προκύψουν λανθασµένα αποτελέσµατα κατά την πραγµατοποίηση των τεχνικών RT-PCR και 65

Real-Time PCR. Εποµένως, απαιτείται ο καθαρισµός του RNA από το γενωµικό DNA. Η βασική αρχή αυτής της µεθόδου συνίσταται στη δράση συγκεκριµένων ενζύµων, τα οποία αφήνουν ανέπαφο το RNA καταστρέφοντας όµως το DNA. Σε όλα τα RNA δείγµατα, πριν την αντίδραση της RT-PCR και της Real-Time PCR, έγινε προσθήκη της δεσοξυριβονουκλεάσης (DNAase, Fermentas), η οποία είναι µία ενδονουκλεάση που αποκοδοµεί το DNA υπόστρωµα. Ο χειρισµός µε DNase που πραγµατοποιήθηκε ήταν σε συγκέντρωση 1U/µg RNA για την αποµάκρυνση του γενωµικού DNA, σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εφαρµόστηκε το πρωτόκολλο της Fermentas ως εξής: 1. Σε µικροσωληνάριο προστέθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: Δείγµα RNA 1µg 10Χ Ρυθµιστικό διάλυµα DNase 1µL DNase (1U/µg) 1µL ddh2o µέχρι τελικό όγκο 10µL Συνολικός όγκος 10µL 1. Το µίγµα των αντιδραστηρίων επωάζεται στους 37 C για 30 min. 2. Προσθήκη 1µL EDTA (Ethylenediamine tetraacetate, αιθυλενοδιαµινοτετραοξικό οξύ) για κάθε 1U DNase και επώαση στους 65 C για 10 min. Η απουσία πρόσµιξης του RNA µε DNA ανιχνεύθηκε µε PCR χρησιµοποιώντας εκκινητές σχεδιασµένους µεταξύ ιντρονίου. Αν υπήρχε DNA, το δείγµα υποβαλλόταν σε περαιτέρω χειρισµό µε DNase και ξαναδοκιµαζόταν για την παρουσία DNA, 66

µέχρις ότου να µην ανιχνεύεται πλέον. 2.6. Σύνθεση cdna Η διαδικασία σύνθεσης cdna από RNA ονοµάζεται αντίστροφη µεταγραφή και καταλύεται από το ένζυµο αντίστροφη µεταγραφάση (reverse transcriptase). Το ένζυµο αντίστροφη µεταγραφάση είναι µια RNA-εξαρτώµενη DNA µεταγραφάση, που αποµονώνεται από ορισµένους RNA ιούς, χρησιµοποιεί το RNA ως υπόστρωµα (ολικό ή mrna) ώστε από το µονόκλωνο RNA να συντεθούν συµπληρωµατικά δίκλωνα µόρια DNA (cdna). Αρχικά, στα µόρια RNA υβριδοποιούνται µόρια κατάλληλου εκκινητή, στα οποία η RTase προσθέτει τα συµπληρωµατικά µε το RNA δεοξυριβονουκλεοτίδια για τη δηµιουργία του cdna. Κάθε εκκινητής καθορίζει την ειδικότητα της αντίδρασης αντίστροφης µεταγραφής, δηλαδή ποιά µόρια θα µεταγραφούν αντίστροφα σε cdna. Η σύνθεση του cdna µπορεί να γίνει χρησιµοποιώντας διάφορα είδη εκκινητών, όπως τυχαία εξαµερή ολιγονουκλεοτίδια, oligo-dt, ή ειδικούς για το γονίδιο εκκινητές. Με τη χρήση τυχαίων εξαµερών, όλο το RNA αποτελεί υπόστρωµα για την αντίδραση. Με τη χρήση ενός εκκινητή oligo-dt, ο οποίος υβριδίζεται µε την 3 poly(a)+ ουρά του mrna, η ποσότητα του συντιθέµενου cdna είναι µικρότερη από εκείνη στην περίπτωση χρήσης των τυχαίων εξαµερών, καθώς το RNA που φέρει poly(a)+ ουρά, αποτελεί περίπου 1%-2% του συνολικού RNA. Επίσης, χρησιµοποιούµε εκκινητές ειδικούς (target specific primers) για το γονίδιο που µελετάµε που περιέχουν την πληροφορία της αλληλουχίας του cdna στόχου, όταν απαιτείται εξειδίκευση. Για την εκπόνηση αυτής της διατριβής, χρησιµοποιήθηκαν τα ολιγονουκλεοτίδια εξαµερών (random hexamer primers), που 67

είναι µη ειδικά µόρια, µε ικανότητα να ενισχύουν το RNA σε όλο το µήκος του, γι αυτό και προκύπτει cdna µε την υψηλότερη ποσότητα (Bustin and Nolan, 2004). Για τη σύνθεση cdna χρησιµοποιήθηκαν 1 µg RNA από κάθε δείγµα και το ένζυµο RT Bioscript (Bioline), σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το µίγµα της αντίδρασης περιείχε 1µg ολικού RNA, µίγµα τριφωσφονουκλεοτιδίων (dntps) 0.1 mm, 50 ng εκκινητών (random hexamer primers), 5X RT Buffer 4µl, DEPC-H2O µέχρι τελικού όγκου 20 µl και RT Bioscript 0,5 µl. Οι συνθήκες ήταν οι ακόλουθες: Το µίγµα της αντίδρασης παρέµεινε για 10min στους 25 C και έπειτα ακολούθησε επώαση για µία ώρα (1h) στους 42 C και για 10min στους 70 C. Στη συνέχεια, όλες οι αντιδράσεις διατηρούνταν σε πάγο (4 C). Η ποιότητα του cdna ελέγχθηκε µε ενίσχυση της β-ακτίνης µέσω της PCR. 2.7. Σχεδιασµός εκκινητών και Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυµεράσης Για τον σχεδιασµό εκκινητών χρησιµοποιήθηκε το πρόγραµµα Primer 3 (Rozen et al., 2000). Όλοι οι εκκινητές σχεδιάστηκαν σε κωδικές περιοχές κάθε γονιδίου και ανάµεσα σε τουλάχιστον ένα ιντρόνιο, έτσι ώστε να γίνεται διαχωρισµός των προϊόντων έκφρασης σε περίπτωση µόλυνσης του RNA µε γενωµικό DNA. Η αλληλουχία των εκκινητών, το µέγεθος των PCR προιόντων στο cdna και οι θερµοκρασίες τήξης των εκκινητών των TLRs, AvβDs και κυτταροκινών, απεικονίζονται στους ακόλουθους πίνακες (Πίνακες 2, 3, 4). 68

Πίνακας 2. Ονοµασία, νουκλεοτιδική αλληλουχία εκκινητών των γονιδίων της οικογένειας των Toll-like υποδοχέων (TLRs), µήκος του PCR προϊόντος σε cdna και θερµοκρασία σταθεροποίησης των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα έκφρασης και ποσοτικοποίησης των επιπέδων της έκφρασης µέσω των τεχνικών RT-PCR και Real-Time PCR, αντίστοιχα. Γονίδιο Αλληλουχία ζεύγους εκκινητών Tm ( C) Μέγεθος GenBank cdna (bp) ctlr1-1 5 -TTACTGCCAATTGCTTGCAC-3 56 187 AY633574 5 -GGTTAGGAAGACCGTGTCCA-3 ctlr1-2 5 -CCCGTTCAAGTGTTCATGTG-3 57 120 NM_001081709 5 -GTTCCGCTCAAGTCTTCTGG-3 ctlr2-1 5 -ACATGTGTGAATGGCCTGAA-3 56 151 NM_204278 5 -TTGAGAAATGGCAGTTGCAG-3 ctlr2-2 5 -TCTCAACACGCTGAGGATTG-3 56 145 NM_001161650 5 -AGAGTGCAGAAGGTCCCTGA-3 ctlr3 5 -CCCTGATGGAGTGTTTGCTT-3 56 166 NM_001011691 5 -CAGCTGTTGCTGCAATCCTA-3 ctlr4 5 -GTTTGACATTGCTCGGTCCT-3 56 182 NM_001030693 5 -GCTGCCTCCAGAAGATATGC-3 ctlr5 5 -TTTCAGGAACCTGCCAAATC-3 57 141 NM_001024586 5 -TCCAGGATGGAATCTCCAAG-3 ctlr7 5 -GATGCAGTGTGGTTTGTTGG-3 56 111 NM_001011688 5 -AACCAAGCTCCTCCCTTTGT-3 ctlr15 5 -ATCCCGAATACTTCCCATCC-3 56 145 NM_001037835 5 -TGGCAGGCAGGTTCTAGTCT-3 ctlr21 5 -AGCTGGAGCTGTTGGACCTA-3 56 148 NM_001030558 5 -TTCACGTGCCATAGCATCTC-3 β-actin 5 -CTCCCTGATGGTCAGGTCAT-3 5 -ATGCCAGGGTACATTGTGGT-3 56 203 L08165 69

Πίνακας 3. Ονοµασία, νουκλεοτιδική αλληλουχία εκκινητών των γονιδίων της οικογένειας των αντιµικροβιακών πεπτιδίων Avian β-defensins (AvβDs), µήκος του PCR προϊόντος σε cdna και θερµοκρασία σταθεροποίησης των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα έκφρασης και ποσοτικοποίησης των επιπέδων της έκφρασης µέσω των τεχνικών RT-PCR και Real-Time PCR, αντίστοιχα. Γονίδιο Αλληλουχία ζεύγους εκκινητών Tm ( C) Μέγεθος GenBank cdna (bp) AvβD-1 5'-CGAAAGAGTGGCTTCTGTGC-3' 56 156 bp NM 204993 5'-GGTGATGTCCTGCTTGGG-3 AvβD-2 5'-AGGTTTCTCCAGGGTTGT-3' 56 146 bp NM 204992 5'-TGCATTCCAAGGCCATTT-3' AvβD-3 5'-CCACTCAGTGCAGAATAAGAG-3' 56 131 bp NM 204650 5'-AATTCAGGGCATCAACCTC-3' AvβD-4 5'-CATCTCAGTGTCGTTTCTCTGC-3' 56 157 bp NM 001001610 5'-CGCGATATCCACATTGCATG-3' AvβD-5 5'-CTGCCAGCAAGAAAGGAACCTG-3' 56 155 bp NM 001001608 5'-GTAATCCTCGAGCAAGGGACA-3' AvβD-6 5'-AGGATTTCACATCCCAGCCGTG-3' 56 156 bp NM 001001193 5'-CGACATGGCCCAGGAATGCAG-3' AvβD-7 5'-TGGAGAAGGGAGACAGAAGGCA-3' 56 177 bp NM 001001194 5'-CGAAGCCTACAAGTATCAAT-3' AvβD-8 5'-ACAGTGTGAGCAGGCAGGAGGGA-3' 56 153 bp NM 001001781 5'-GAAGAGCTGCTTAGCTGGTCT-3' AvβD-9 5'-GCAAAGGCTATTCCACAGCAG-3' 58 167 bp NM 001001611 5'-GGAGCACGGCATGCAACAA-3' AvβD-10 5'-TGGGGCACGCAGTCCACAAC-3' 56 157 bp NM 001001609 5'-CATGCCCCAGCACGGCAGAA-3' AvβD-11 5'-ACTGCATCCGTTCCAAAGTCTG-3' 58 168 bp NM 001001779 5'-GTCCCAGCTGTTCTTCCAG-3' AvβD-12 5'-CCCAGCAGGACCAAAGCAATG-3' 58 157 bp NM 001001607 5'-AGTACTTAGCCAGGTATTCC-3 AvβD-13 5'-CATCGTTGTCATTCTCCTCCTC-3' 56 163 bp NM 001001780 5'-GGTGGAGAACCTGCAGCAGCG-3' AvβD-14 5'-ATGGGCATATTCCTCCTGT-3' 5'-CACTTTGCCAGTCCATTGT-3' 58 161 bp AM402954 70

Πίνακας 4. Ονοµασία, νουκλεοτιδική αλληλουχία εκκινητών των γονιδίων της οικογένειας των κυτταροκινών, µήκος του PCR προϊόντος σε cdna και θερµοκρασία σταθεροποίησης των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα έκφρασης και ποσοτικοποίησης των επιπέδων της έκφρασης µέσω των τεχνικών RT-PCR και Real- Time PCR, αντίστοιχα. Γονίδιο Αλληλουχία ζεύγους εκκινητών Tm ( C) Μέγεθος GenBank cdna (bp) IL-1β 5 -GCATCAAGGGCTACAAGCTC-3 56 131 bp NM_204524 5 -CAGGCGGTAGAAGATGAAGC-3 IL-2 5'-AACTGGGACACTGCCATGAT-3' 56 200 bp NM_204153 5'-TCCTGGGTCTCAGTTGGTGT-3' IL-4 5'-GAGAGGTTTCCTGCGTCAAG-3' 56 154 bp NM_001007079 5'-TGACGCATGTTGAGGAAGAG-3' IL-6 5'-CTCCTCGCCAATCTGAAGTC-3' 56 164 bp NM_204628 5'-GGATTGTGCCCGAACTAAAA-3' IL-8 5'-GATTGAACTCCGATGCCAGT-3' 56 108 bp NM_205018 5'-TCCACATTCTTGCAGTGAGG-3' IL-10 5'-GGAGCTGAGGGTGAAGTTTG-3' 56 147 bp NM_001004414 5'-TAGAAGCGCAGCATCTCTGA-3' IL-12 5'-CTGTGGCTCGCACTGATAAA -3' 56 101 bp NM_213571 5'-GAACATCTCAGTCGGCTGGT-3' IL-15 5'-CAGCCAACACAAAACTCTGC-3' 56 118 bp NM_204571 5'-GGCAAAAGAAATGGCTGTTC-3' IL-16 5'-ATCGCGAAGCTTTCCACTTA-3' 56 105 bp HQ329099 5'-GCGGATGACACCTGGTTACT-3' IL-17 5'-TGCCTAACCCAAAAAGATGG-3' 56 112 bp NM_204460 5'-CCAGTGAGCGTTTGCTGATA-3' IL-18 5'-AGAGCATGGGAAAATGGTTG-3' 56 168 bp HM854281 5'-TCTTCCTCAAAGGCCAAGAA-3' IFNg 5'-AGCCGCACATCAAACACATA-3' 56 192 bp NM_205149 5'-TCCTTTTGAAACTCGGAGGA-3' NOX1 5'-TCAGCACCTGAGGAGGACTT-3' 5'-CACTTTGATCCTGGGCATCT-3' 56 114 bp NM_001101830 Στην παρούσα διατριβή, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) πραγµατοποιήθηκε µε τα αντιδραστήρια της Bioline (My Taq) και σε τελικό όγκο 25 µl από τα οποία 1 µl (περίπου 300 ng) ήταν το δείγµα του DNA (cdna) και 24 µl το µίγµα των υπόλοιπων αντιδραστηρίων. Αναλυτικότερα, η αντίδραση περιείχε 5 µl από 5x ρυθµιστικό διάλυµα αντίδρασης (Reaction Buffer, Bioline), 0,5 µl εµπρόσθιου και οπίσθιου εκκινητή (200 nm ο καθένας), 0,25 µl My Taq TM DNA πολυµεράση και 71

προσθήκη αποσταγµένου νερού µέχρι τον τελικό όγκο. Η PCR αντίδραση πραγµατοποιήθηκε σε θερµοκυκλοποιητή Creacon χρησιµοποιώντας ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 C για 5 λεπτά και ακολούθησαν τα εξής στάδια για 35 κύκλους: 95 C για 30 δευτερόλεπτα, 56-58 (ανάλογα τη θερµοκρασία της υβριδοποίησης του ζέυγους εκκινητών του κάθε γονιδίου) για, τα υπό µελέτη, γονίδια, για 30 δευτερόλεπτα για τον υβριδισµό των εκκινητών και 72 C για 30 δευτερόλεπτα για επιµήκυνση, ενώ µετά το τέλος των 35 επαναλήψεων πραγµατοποιήθηκε ένα τελικό στάδιο επιµήκυνσης για 10 λεπτά στους 72 C. Σε όλες τις αντιδράσεις PCR πραγµατοποιήθηκε έλεγχος για τυχόν επιµόλυνση, προσθέτοντας µια επιπλέον αντίδραση µε αποστειρωµένο νερό στη θέση του DNA, δηµιουργώντας έναν αρνητικό µάρτυρα. Σε όλα τα ζεύγη εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή πραγµατοποιήθηκε έλεγχος της αποτελεσµατικότητάς τους µε τη χρήση της PCR. Συγκεκριµένα, πραγµατοποιήθηκε ενίσχυση µε PCR, σε γενωµικό DNA, για να διαπιστωθεί εάν οι εκκινητές και οι συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν στην PCR για την ενίσχυση των γονιδίων ήταν σωστές. Σε περιπτώσεις µη ενίσχυσης του επιθυµητού τµήµατος γονιδίου, οι εκκινητές επανασχεδιάζονταν. 2.8. Ηλεκτροφόρηση DNA και RNA σε πήκτωµα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί µία αναλυτική µέθοδο για το διαχωρισµό και την ταυτοποίηση πρωτεινών και νουκλεϊκών οξέων. Οι κυριότερες ηλεκτροφορητικές τεχνικές είναι η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, πηκτής πολυακρυλαµιδίου και ισοηλεκτρικής εστίασης. Τα πηκτώµατα της αγαρόζης έχουν µικρότερη διαχωριστική ικανότητα από τα 72

πηκτώµατα πολυακρυλαµίδης, τα οποία χαρακτηρίζονται από υψηλη διαχωριστική ικανότητα και όπου διακρίνονται διαφορές ανάµεσα σε λίγα µόνο ζεύγη βάσεων. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης είναι µια εύχρηστη µέθοδος, µε την οποία καθορίζονται µε βάση το µοριακό τους βάρος τα νουκλεικά οξέα. Με την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης µορίων RNA, εκτιµάται η ακεραιότητα του RNA που αποµονώθηκε µέσω της κατανοµής των µεγεθών των µορίων RNA και της παρουσίας των 18S και 28S rrna µορίων, τις δύο ζώνες ριβοσωµικού RNA. Για την αποφυγή των ριβονουκλεασών (RNases), οι οποίες µέσα σε λίγα λεπτά µπορούν να καταστρέψουν το RNA, χρησιµοποιούνται υλικά κατεργασµένα µε DEPC (diethylpyrocarbonate). Όλα τα διαλύµατα πραγµατοποιούνται µε νερό επεξεργασµένο µε DEPC. Τα µόρια των νουκλεικών οξέων γίνονται ορατά µέσα στην πηκτή µε την προσθήκη του Βρωµιούχου Αιθίδιου (EtBr). Αυτή η ένωση έχει τη δυνατότητα να ενσωµατώνεται στα µόρια των νουκλεικών οξέων, καθώς παρεµβάλλεται µεταξύ των βάσεων τους, και να φθορίζει όταν ακτινοβοληθεί µε υπεριώδες φως. Εποµένως, το βρωµιούχο αιθίδιο προστίθεται για να γίνονται ορατά τα νουκλεικά οξέα στο υπεριώδες φως, αλλά και για τον ποσοτικό προσδιορισµό τους καθώς ενσωµατώνεται σε αυτά σε ποσότητα ανάλογη µε τη συγκέντρωσή τους. Έτσι, µπορεί να ανιχνευτεί και ποσότητα 1ng DNA κατόπιν έκθεσης σε υπεριώδη ακτινοβολία. Τα µεγέθη (σε bp) των ηλεκτροφορούµενων δειγµάτων DNA υπολογίζονται µε τη βοήθεια µαρτύρων µοριακών βαρών, δείκτη µοριακών βαρών (Mass Ruler DNA Ladder, Fermentas), που ηλεκτροφορούνται µαζί µε τα δείγµατα και έχουν γνωστά µεγέθη. Για να πραγµατοποιηθεί η φόρτωση των δειγµάτων στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, θα πρέπει να δηµιουργηθεί το πήκτωµα αγαρόζης και στη µήτρα 73

της συσκευής ηλεκτροφόρησης να τοποθετηθεί η ειδική χτένα για το σχηµατισµό των οπών φόρτωσης. Επίσης, τα νουκλεικά οξέα φορτώνονται µαζί µε ένα ειδικό έγχρωµο ρυθµιστικό διάλυµα (loading buffer), ώστε να υπάρχει ένα µέτρο του σηµείου που βρίσκεται το υπό εξέταση µόριο ανά πάσα στιγµή στο πήκτωµα. Η προετοιµασία του πηκτώµατος αγαρόζης, συγκέντρωσης 1%, γίνεται ως εξής: 1. Σε µια κωνική φιάλη κατάλληλη ποσότητα αγαρόζης (0,45g, Invitrogen) προστίθεται σε ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης 1x TΒE (45ml) και θερµαίνεται σε φούρνο µικροκυµάτων µέχρι να διαλυθεί. Το διάλυµα της αγαρόζης σε θερµοκρασία περίπου 100 C πολυµερίζεται, δηµιουργώντας ένα κολλοειδές διάλυµα που πήζει σε θερµοκρασία µικρότερη των 45 C. Η ποσότητα της αγαρόζης εξαρτάται από την επιθυµητή τελική συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωµα. 2. Το διάλυµα παραµένει για λίγα λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου, µέχρι η θερµοκρασία του να φτάσει περίπου στους 60 C και στη συνέχεια µέσα στην κωνική φιάλη προστίθεται βρωµιούχο αιθίδιο, περίπου 2µl, σε τελική συγκέντρωση 10µg/mL και ανακινείται ώστε να αναµιχθεί πολύ καλά. 3. Το διάλυµα απλώνεται στο καλούπι της συσκευής ηλεκτροφόρησης, όπου εφαρµόστηκε η κατάλληλη χτένα για το σχηµατισµό των οπών φόρτωσης, και αφήνεται να στερεοποιηθεί σε θερµοκρασία δωµατίου. 4. Μόλις στερεοποιηθεί το πήκτωµα της αγαρόζης, αποµακρύνεται (αφαιρείται) η ειδική χτένα και προστίθεται ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης 1xTΒE. Στις οπές που δηµιουργήθηκαν µετά την αφαίρεση της ειδικής χτένας, τοποθετούνται 5µl δείγµατος που αναµιγνύονται µε 0,5µl διαλύµατος φόρτωσης (χρωστικής, 10x loadingdyesolution, Fermentas). Τα ηλεκτρόδια συνδέονται στους 74

υποδοχείς της συσκευής ηλεκτροφόρησης υπό σταθερή τάση 100 Volt για περίπου 20-25min. Στη συνέχεια, το πήκτωµα της αγαρόζης τοποθετείται σε συσκευή εκποµπής υπεριώδους ακτινοβολίας (UV, 260-360nm), ώστε να διακριθούν και να φωτογραφηθούν οι ζώνες των µορίων που διαχωρίστηκαν. 2.9. PCR πραγµατικού χρόνου (Real-Time PCR) Η αντίδραση PCR πραγµατικού χρόνου είναι µια µέθοδος λογαριθµικής ενίσχυσης και ποσοτικού προσδιορισµού ακολουθιών DNA. Με την PCR πραγµατικού χρόνου, δίνεται η δυνατότητα παρακολούθησης της αλυσιδωτής αντίδρασης, σε όλη τη διάρκειά της, σε πραγµατικό χρόνο. Η έννοια του πραγµατικού χρόνου οφείλεται στο γεγονός ότι το µηχάνηµα που χρησιµοποιείται είναι συνδεδεµένο µε έναν υπολογιστή απ όπου καθίσταται ορατή κάθε στιγµή η πορεία των προϊόντων της αντίδρασης. Το µεγάλο πλεονέκτηµα της PCR πραγµατικού χρόνου έναντι της συµβατικής PCR, είναι ότι στη συµβατική PCR εµφανίζεται το τελικό προιόν µέσω της ηλεκτροφόρησης µε αγαρόζη, ενώ µε την PCR πραγµατικού χρόνου, γίνεται ποσοτικοποίηση του cdna σε κάθε κύκλο ξεχωριστά, µε τη βοήθεια χρωστικών και laser που είναι προσαρµοσµένα στο θερµοκυκλοποιητή που πραγµατοποιείται η αντίδραση. Η παρακολούθηση της εξέλιξης της αντίδρασης γίνεται λόγω της παρουσίας της χρωστικής SYBR Green. Η SYBR Green είναι ένα φθορίζον µόριο ικανό να ενώνεται σε δίκλωνο µόριο DNA. Αυτή η χρωστική έχει την ικανότητα να φθορίζει µόνο όταν προσδεθεί στα δίκλωνα µόρια του DNA, αντανακλώντας έτσι στην ποσότητα του σχηµατιζόµενου προιόντος, ενώ σε διάλυµα όπου βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση δεν φθορίζει. Είναι εξαιρετικά σταθερό µόριο, µε µόνο 6% της συνολικής ενεργότητας να χάνεται κατά 75

την όλη διαδικασία. Το ειδικό σπεκτροφωτόµετρο του µηχανήµατος (ροµποτικός σαρωτής) επιτρέπει την ανάγνωση ενός τέτοιου φθορίζοντος µορίου και έτσι τα επίπεδα του φθορισµού µετρούνται στο τέλος κάθε κύκλου της αντίδρασης. Τα επίπεδα του φθορισµού διαφέρουν ανάλογα µε τη φάση της αλυσιδωτής αντίδρασης. Συγκεκριµένα, η ποσότητα του προιόντος PCR που σχηµατίζεται κατά την qrt-pcr ανιχνεύεται µε µέτρηση του φθορισµού σε κάθε κύκλο της αντίδρασης, και όχι στο τέλος της αντίδρασης, όπως συµβαίνει στη συµβατική PCR. Κατά τη φάση των πρώτων κύκλων της αντίδρασης, το σήµα αυτό είναι ασθενές και είναι γνωστή ως φάση υπόβαθρου ή φάση θορύβου (background phase). Στη συνέχεια, συσσωρεύονται τα προιόντα της αντίδρασης και διακρίνουµε την εκθετική φάση, κατά την οποία τα αντιδραστήρια βρίσκονται σε περίσσεια. Στην εκθετική φάση ή λογαριθµική φάση (log phase) η απόδοση της αντίδρασης είναι η µέγιστη δυνατή και το αποτέλεσµα είναι ο διπλασιασµός των προιόντων της αντίδρασης σε κάθε κύκλο. Έπειτα, διακρίνουµε τη γραµµική φάση της αντίδρασης (linear phase), όπου η συγκέντρωση των αντιδραστηρίων είναι περιορισµένη και συµβαίνει αποικοδόµηση του προιόντος σε µικρό βαθµό, κάτι που προκαλεί τη σταδιακή µείωση της απόδοσης της αντίδρασης. Η τελευταία φάση της αντίδρασης ονοµάζεται φάση κορεσµού ή πλατό (plateau). Ο κορεσµός αυτός οφείλεται στη σηµαντική µείωση της καταλυτικής δραστικότητας της DNA πολυµεράσης (Kubista et al., 2006). Στη λογαριθµική φάση, η απόδοση της αντίδρασης αγγίζει το 100% και σε κάθε κύκλο η ποσότητα του προιόντος διπλασιάζεται. Στη φάση της αποδιάταξης της διπλής έλικας του DNA, ο φθορισµός που παράγεται είναι µικρός γιατί η SYBR Green βρίσκεται σε ελευθερη µορφή. Στις φάσεις του υβριδισµού (πρόσδεσης) των εκκινητών και της επιµήκυνσης, έχουµε δίκλωνο DNA. Οπότε η SYBR Green προσδένεται στη διπλή έλικα του DNA και ο 76

φθορισµός αυξάνεται σηµαντικά. Η ανίχνευση του παραγόµενου φθορισµού γίνεται από ένα ειδικό φωτόµετρο που ανιχνεύει το φθορισµό που παράγεται στα 520nm. Το σήµα του φθορισµού εξαρτάται από την αρχική ποσότητα της µήτρας του cdna που υπάρχει κατά την έναρξη της αντίδρασης. Ωστόσο, ο παραγόµενος φθορισµός είναι αποτέλεσµα της πρόσδεσης της SYBR Green σε οποιοδήποτε δίκλωνο µόριο DNA, όπως διµερή εκκινητών ή ανεπιθήµητα προιόντα της αντίδρασης. Για αυτό το λόγο είναι απαραίτητοι οι προσεκτικοί χειρισµοί κατά τη διάρκεια των πειραµάτων µε σκοπό την αποφυγή των µολύνσεων των δειγµάτων. Επιπλέον, ο σχεδιασµός των εκκινητών πρέπει να είναι πολύ προσεκτικός, έτσι ώστε να µην υπάρχουν εσφαλµένες µετρήσεις φθορισµού. Το επίπεδο φθορισµού στο οποίο λαµβάνονται οι τιµές που χρησιµοποιούνται στους υπολογισµούς ονοµάζεται threshold. Σε αυτό το επίπεδο γίνεται η ανάλυση των δεδοµένων. Το threshold καθορίζεται στο επίπεδο όπου ο ρυθµός παραγωγής προϊόντος είναι ο υψηλότερος κατά την εκθετική φάση. Fluorescence acquisition είναι η µέτρηση του φθορισµού των προϊόντων. Για να µειωθεί ο «θόρυβος» από την πιθανή παραγωγή µη ειδικών τµηµάτων ή το σχηµατισµό διµερών από τα µόρια των εκκινητών, τίθεται µια θερµοκρασία στην οποία η συσκευή µετράει το φθορισµό που εκπέµπουν τα προϊόντα. Η θερµοκρασία αυτή πρέπει να είναι υψηλότερη από το σηµείο τήξης (Tm) των ανεπιθύµητων προϊόντων και χαµηλότερη από το Tm της αλληλουχίας στόχου. Επίσης, απαιτείται κανονικοποίηση των δειγµάτων που µελετώνται, δηλαδή να υπάρχει ίδια ποσότητα µήτρας (cdna) για κάθε αντίδραση, που γίνεται µε επεξεργασία των πρώτων δεδοµένων και κατάλληλες αραιώσεις του cdna. Με την τεχνική της Real Time PCR υπάρχει η δυνατότητα όχι µόνο της παρακολούθησης της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο, αλλά και του προσδιορισµού της ποσότητας των παραγόµενων προϊόντων µε απόλυτο ή σχετικό υπολογισµό. Η 77

απόλυτη ποσοτικοποίηση προσδιορίζει τον αριθµό αντιγράφων του αρχικού δείγµατος µε χρήση καµπύλης ποσοτικοποίησης, ενώ η σχετική ποσοτικοποίηση προσδιορίζει το ρυθµό έκφρασης σε σχέση µε την παραγωγή mrna του κυττάρου. Με τη σχετική ποσοτικοποίηση της Real Time PCR, προσδιορίζονται οι αλλαγές των επιπέδων του mrna ενός γονιδίου σε σχέση µε το επίπεδο έκφρασης ενός γονιδίου αναφοράς. Η σχετική ποσοτικοποίηση βασίζεται στο λόγο των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου-στόχο ως προς το γονίδιο αναφοράς και εν συνεχεία συγκρίνονται οι λόγοι. Για τον υπολογισµό αυτού του λόγου έχει εφαρµοστεί το µαθηµατικό µοντέλο 2 -ΔΔCt. Οι λόγοι έκφρασης υπολογίζονται από την εξίσωση R = 2 (ΔCt sample ΔCt control) (Livak and Schmittgen, 2001). Το γονίδιο αναφοράς συνήθως είναι ένα διατηρηµένο (housekeeping) γονίδιο. Τα housekeeping γονίδια είναι παρόντα σε όλα τα γονιδιώµατα, αφού είναι υπεύθυνα για τις φυσιολογικές λειτουργίες των κυττάρων. Η σύνθεση mrna αυτών των γονιδίων παραµένει σταθερή, ανεξάρτητα από τις συνθήκες στις οποίες εκτίθεται το κύτταρο, γι αυτό και χρησιµοποιούνται για τη µελέτη της έκφρασης γονιδίων κάτω από διάφορες συνθήκες. Επίσης, το γονίδιο σταθερής έκφρασης χρησιµοποιείται για τον έλεγχο ποιότητας και ποσότητας του cdna, που αντανακλά την ποιότητα του RNA. Τα housekeeping γονίδια που συνήθως χρησιµοποιούνται είναι: το γονίδιο της β-ακτίνης, τα γονίδια των ριβοσωµικών υποµονάδων (18S και 28S rrna για ευκαρυωτικά κύτταρα ή 16S και 23S rrna για προκαρυωτικά κύτταρα), το GAPDH, το γονίδιο της β-2 µικροσφαιρίνης κ.α. Για το σχεδιασµό και την επιλογή των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στην ποσοτική PCR σε πραγµατικό χρόνο, υπήρχε ο περιορισµός, ότι το µέγεθος του σχηµατιζόµενου προιόντος δεν έπρεπε να υπερβαίνει τις 200bp, καθώς, µικρού µεγέθους προιόντα ευνοούν την υψηλή απόδοση της ενίσχυσης και αποτρέπουν το 78

σχηµατισµό µη ειδικών προιόντων, επιτρέποντας στη συνέχεια τη σχετική ποσοτικοποίηση (Livak and Schmittgen, 2001). Οι αντιδράσεις Real-Time PCR πραγµατοποιήθηκαν χρησιµοποιώντας το Light Cycler (Roche). Το συγκεκριµένο µηχάνηµα επιτρέπει τον ταυτόχρονο πολλαπλασιασµό 32 δειγµάτων µε χρήση της φθορίζουσας χρωστικής SYBR Green. Σε κάθε κύκλο PCR, σε κάθε τριχοειδές, µέσω ενός οπτικού συστήµατος laser, µετριέται ο φθορισµός. Η Real-Time PCR πραγµατοποιήθηκε, χρησιµοποιώντας το KAPA SYBR FAST qpcr kit (KapaBiosystems), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συγκεκριµένα, η τεχνική πραγµατοποιήθηκε µε 200nM από κάθε εκκινητή, 10µl SYBR Green και DEPC H 2 0 µέχρι τελικού όγκου 20µl, χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο 1/5 του cdna που είχε συντεθεί από 1 µg RNA. Τα επίπεδα της έκφρασης των γονιδίων ποσοτικοποιήθηκαν χρησιµοποιώντας τη β- ακτίνη, ως γονίδιο αναφοράς. Οι συνθήκες της PCR πραγµατικού χρόνου ήταν επώαση στους 95 C για 3 min, ακολουθούµενη από 45 κύκλους επώασης στους 95 C για 10 sec, στους 56-58 C (ανάλογα τη θερµοκρασία της υβριδοποίησης του ζέυγους εκκινητών του κάθε γονιδίου) για 7 sec και 72 C για 8 sec, µέτρηση στους 60 C. Για τον εντοπισµό των PCR προϊόντων και επιβεβαίωση της ενίσχυσης των cdna προιόντων, µία καµπύλη τήξης πραγµατοποιήθηκε από τους 65 C έως τους 95 C µε µέτρηση κάθε 0,2 C και µε απόσταση 5 sec µεταξύ των µετρήσεων. Η σχετική ποσοτικοποίηση πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση λογισµικού προγράµµατος της Roche (LightCycler Software 4.1). 79

2.10. Στατιστική Ανάλυση Η στατιστική ανάλυση και η αξιολόγηση των πειραµατικών δεδοµένων πραγµατοποιήθηκαν µε τη χρήση µεθόδων τόσο της περιγραφικής όσο και της συµπερασµατικής στατιστικής. Οι υπό µελέτη παράµετροι εκτιµήθηκαν µε τη χρήση των βασικών περιγραφικών µέτρων θέσης και διασποράς σε µια προσπάθεια να αναδειχθούν καλύτερα τα χαρακτηριστικά του δείγµατος. Για τη συγκριτική αξιολόγηση των παραµέτρων µεταξύ των ηλικιακών οµάδων των πουλιών της έρευνας αυτής χρησιµοποιήθηκε η µεθοδολογία της ανάλυσης των διακυµάνσεων µιας κατεύθυνσης (one-way Analysis of Variance), σύµφωνα µε το εντελώς τυχαιοποιηµένο σχέδιο. Η κανονικότητα των πειραµατικών δεδοµένων ελέγχθηκε µε το κριτήριο των Shapiro-Wilk, ενώ η οµοιογένεια των διακυµάνσεων ελέγχθηκε µε το κριτήριο Levene. Όπου κρίθηκε αναγκαίο πραγµατοποιήθηκε µετασχηµατισµός των πρωτογενών δεδοµένων σε λογάριθµους ή τετραγωνικές ρίζες, µε στόχο την κανονικοποίησή τους και την οµοιογένεια των διακυµάνσεων. Στις περιπτώσεις όπου οι προϋποθέσεις αυτές (κανονικότητας και οµοιογένειας) επιτεύχθηκαν, µε ή χωρίς µετασχηµατισµό των δεδοµένων, και η ανάλυση διακύµανσης αξιολογήθηκε ως στατιστικώς σηµαντική, χρησιµοποιήθηκαν οι έλεγχοι πολλαπλής σύγκρισης του Tukey και του Duncan µε στόχο την αξιολόγηση της ακριβούς θέσης των στατιστικών διαφορών. Επιπρόσθετα, για τον στατιστικό έλεγχο διαφοράς µεταξύ των µέσων δύο ανεξάρτητων οµάδων εφαρµόστηκε το κριτήριο της student s t κατανοµής. Παράλληλα, στις περιπτώσεις ετερογένειας των διακυµάνσεων και µη κανονικότητας των δεδοµένων, χρησιµοποιήθηκε ο µη παραµετρικός έλεγχος των 80

Kruskal-Wallis και όπου διαπιστώθηκε στατιστική σηµαντικότητα, για την ακριβή ταυτοποίηση των επιµέρους διαφορών µιας ποσοτικής µεταβλητής µεταξύ δύο ανεξάρτητων οµάδων πραγµατοποιήθηκε ο µη παραµετρικός έλεγχος των Mann- Whitney. Τα πειραµατικά δεδοµένα αναλύθηκαν µε το στατιστικό πακέτο IBM SPSS (version 20.0, συνδροµή ΑΠΘ) και όλοι οι έλεγχοι έγιναν σε επίπεδο σηµαντικότητας α = 5% (Κάτος, 1986; Μπάτζιος, 1999). 81

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μελέτη του πρότυπου έκφρασης και των αλλαγών των επιπέδων έκφρασης των AvβDs, των TLRs και των κυτταροκινών Με σκοπό τη µελέτη του πρότυπου έκφρασης και των αλλαγών των επιπέδων έκφρασης των AvβDs, TLRs και των κυτταροκινών, πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση RNA, από τα αναπαραγωγικά όργανα (ωοθήκη, ωαγωγό, όρχεις και επιδιδυµίδα), υγιών και µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis πτηνών, από κύτταρα Sertoli µετά από 0, 6, 12, 24 και 48 ώρες επώασης µε LPS, καθώς και από έµβρυα ορνίθων, από την τρίτη έως τη δέκατη ηµέρα της εµβρυικής ανάπτυξης (Ε3-Ε10). Ακολούθησε φασµατοφωτοµετρικός προσδιορισµός της συγκέντρωσης κάθε αποµονωµένου RNA και εκτίµηση της ποιότητάς του ηλεκτροφορητικά σε gel αγαρόζης 1%. Ο φασµατοφωτοµετρικός προσδιορισµός πραγµατοποιήθηκε µε την εκτίµηση του λόγου των απορροφήσεων του διαλύµατος του RNA στα 260nm και 280nm. Όλα τα δείγµατα που εξετάστηκαν στη συνέχεια µέσω της ανάλυσης της RT-PCR, είχαν λόγο απορροφήσεων µεταξύ 1,8 και 2,2, οπότε ήταν µέσα στα αποδεκτά όρια του εύρους της ποιότητας του αποµονωµένου RNA. Επίσης, κατά την ηλεκτροφόρηση 1 µg RNA σε πήκτωµα αγαρόζης 1%, διαπιστώθηκε η ακεραιότητα του του ολικού RNA που αποµονώθηκε, καθώς ήταν ορατές οι ζώνες των µορίων rrna 18S και 28S χωρίς να σχηµατίζουν smear (εικόνα κοµήτη) σε όλα τα δείγµατα RNA που χρησιµοποιήθηκαν στις αναλύσεις της RT-PCR. Ενδεικτικά στην εικόνα 5 παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα ηλεκτροφόρησης 82

αποµονωµένου RNA. Εικόνα 5. Ηλεκτροφόρηση δειγµάτων RNA σε πηκτή αγαρόζης 1%. 3.1. Έκφραση των AvβDs 3.1.1. Έκφραση των AvβDs στον ωαγωγό Για τη µελέτη του πρότυπου έκφρασης των 14 γονιδίων που ανήκουν στην οικογένεια των AvβDs στον ωαγωγό, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από τον ωαγωγό αναπαραγωγικά ώριµων πτηνών, ηλικίας 52 εβδοµάδων. Tα αποτελέσµατα των RT-PCR αναλύσεων απεικονίζονται στην Εικόνα 6. Εικόνα 6. Έκφραση των AvβDs στον ωαγωγό ορνίθων, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT- PCR. 83

Σύµφωνα µε την Εικόνα 6, mrna µεταγραφήµατα εντοπίστηκαν για 11 γονίδια της οικογένειας AvβDs στον ωαγωγό της όρνιθας. Συγκεκριµένα, τα AvβD1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 και 14 εκφράζονται στον ωαγωγό των αναπαραγωγικά ώριµων πτηνών. Δεν παρατηρήθηκαν mrna µεταγραφήµατα για τα γονίδια AvβD3, 4 και 13. Στη συνεχεια πραγµατοποιήθηκε ενίσχυση µε PCR, των γονιδίων AvβD3, 4 και 13 σε γενωµικό DNA ορνιθίων, η οποία ήταν επιτυχής, υποστηρίζοντας ότι οι εκκινητές και οι συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν στην PCR για την ενίσχυση των γονιδίων ήταν σωστές και αποδεικνύοντας ότι η απουσία της ζώνης για τα γονίδια AvβD3, 4 και 13 µετά την RT- PCR ήταν ενδεικτική για τη µη έκφραση αυτών των γονιδίων στον ωαγωγό των ορνίθων. Επίδραση της ηλικίας ενήβωσης στην έκφραση των AvβDs Με σκοπό να διαπιστωθεί εάν τα διάφορα στάδια της αναπαραγωγικής ζωής των θηλυκών ορνιθίων, δηλαδή, πριν την ενήβωση (12 εβδοµάδων), στην αρχή της ενήβωσης (26 εβδοµάδων), κατά την αναπαραγωγική ωριµότητα (52 εβδοµάδων) και κατά την αναπαραγωγική γήρανση (104 εβδοµάδων), επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης των AvβDs, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna των 11 γονιδίων που εκφράζονται, µέσω της ποσοτικής PCR σε πραγµατικό χρόνο. Η κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων των γονιδίων στόχων έγινε ως προς τον εσωτερικό µάρτυρα που είναι το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, ενώ όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν στη Real-Time PCR είναι οι ίδιοι µε αυτούς που χρησιµοποιήθηκαν στη συµβατική PCR, µε σκοπό την ενίσχυση των τµηµάτων cdna των υπό εξέταση 84

γονιδίων, καθώς επίσης και του γονιδίου αναφοράς, β-ακτίνη. Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των γονιδίων AvβD1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 και 14 στον ωαγωγό ορνιθίων κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης (ορνίθια ηλικίας 12, 26, 52 και 104 εβδοµάδων), απεικονίζονται στο Διάγραµµα 1. 85

Διάγραµµα 1. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στον ωαγωγό ορνίθων, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των AvβDs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). 86

Όπως απεικονίζεται στο Διάγραµµα 1, τα αποτελέσµατα της ποσοτικής PCR πραγµατικού χρόνου υποδηλώνουν µία στατιστικά σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων της έκφρασης των AvβD2 και 10 στον ωαγωγό των ώριµων αναπαραγωγικά ορνιθίων ηλικίας 52 εβδοµάδων και µία σηµαντική αύξηση (P<0.05) των επιπέδων της έκφρασης των AvβD6, 11 και 12 στον ωαγωγό τόσο των αναπαραγωγικά ώριµων ορνιθίων ηλικίας 52 εβδοµάδων, όσο και εκείνων των αναπαραγωγικά γερασµένων 104 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε τα ορνίθια που βρίσκονταν πριν την ενήβωση και στην αρχή της αναπαραγωγικής ωριµότητας (12 και 26 εβδοµάδων, αντίστοιχα). Επιπρόσθετα, παρατηρείται µία σηµαντική (P<0.05) µείωση των επιπέδων της έκφρασης του AvβD1 στον ωαγωγό των αναπαραγωγικά γερασµένων ορνιθίων ηλικίας 104 εβδοµάδων, ενώ δεν παρατηρείται στατιστικά σηµαντική (P>0.05) διαφορά στην έκφραση των AvβD5, 7, 8, 9 και 14 γονιδίων στα διάφορα αναπαραγωγικά στάδια του ωαγωγού. Επίδραση της µόλυνσης µε SE στην έκφραση των AvβDs Οι επιδράσεις της µόλυνσης µε Salmonella Enteritidis στα επίπεδα της έκφρασης των AvβDs στον ωαγωγό, καθώς και η επίδραση της αναπαραγωγικής ηλικίας στη µόλυνση µέσω της σύνθεσης AvβDs διερευνήθηκαν µέσω της ανάλυσης της ποσοτικής PCR πραγµατικού χρόνου. Για την πραγµατοποίηση αυτών των µετρήσεων αποµονώθηκε RNA από τον ωαγωγό ορνιθίων που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης, ηλικίας 28 εβδοµάδων (Διάγραµµα 2), και αναπαραγωγικά γερασµένων ορνιθίων, ηλικίας 104 εβδοµάδων (Διάγραµµα 3), τόσο µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis, όσο και κατεργασµένων µε PBS. 87

Relative expression 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0-2 * * * * * * Av!D1 Av!D2 Av!D5 Av!D6 Av!D7 Av!D8 Av!D9 Av!D10 Av!D11 Av!D12 Av!D14 Διάγραµµα 2. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στον ωαγωγό µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 28 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των AvβDs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (Ρ <0.05). Relative expression 14 12 10 8 6 4 2 * * 0 Av!D1 Av!D2 Av!D5 Av!D6 Av!D7 Av!D8 Av!D9 Av!D10 Av!D11 Av!D12 Av!D14 Διάγραµµα 3. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στον ωαγωγό µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 104 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των AvβDs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (Ρ <0.05). Όπως φαίνεται στα Διαγράµµατα 2 και 3, η ανάλυση της Real-Time PCR έδειξε µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων της έκφρασης των AvβD5 και 11 γονιδίων 88

στα µολυσµένα µε SE ορνίθια, ηλικίας 28 και 104 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε τους µάρτυρες (PBS) στις ίδιες ηλικίες. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων έκφρασης για τα γονίδια AvβD7, 10, 12 και 14 στον ωαγωγό των µολυσµένων µε SE ορνιθίων που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης, ηλικίας 28 εβδοµάδων, ενώ η µόλυνση µε σαλµονέλα δεν είχε σηµαντικές επιδράσεις στα επίπεδα της έκφρασης αυτών των γονιδίων στον ωαγωγό των αναπαραγωγικά γερασµένων ορνιθίων, 104 εβδοµάδων. Επίσης, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) αλλαγές στην έκφραση των AvβD1, 2, 6, 8 και 9 στον ωαγωγό των µολυσµένων µε σαλµονέλα ορνιθίων 28 και 104 εβδοµάδων. 3.1.2. Έκφραση των AvβDs στους όρχεις Με σκοπό τη διερεύνηση του πρότυπου έκφρασης των 14 AvβDs γονιδίων στους όρχεις, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από τους όρχεις αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ηλικίας 52 εβδοµάδων. Tα αποτελέσµατα των αναλύσεων της RT-PCR απεικονίζονται στην Εικόνα 7. Εικόνα 7. Έκφραση των AvβDs στους όρχεις αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT- PCR. Σύµφωνα µε την Εικόνα 7, mrna µεταγραφήµατα εντοπίστηκαν για 9 γονίδια της 89

οικογένειας AvβDs. Συγκεκριµένα, τα AvβD1, 2, 4, 5, 6, 9, 10, 12 και 14 εκφράζονται στους όρχεις των αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ενώ δεν εκφράζονται τα AvβD3, 7, 8, 11 και 13 γονίδια. Επίδραση της ηλικίας ενήβωσης στην έκφραση των AvβDs Με σκοπό να διαπιστωθεί εάν τα διάφορα στάδια της αναπαραγωγικής ζωής των αρσενικών, πριν την ενήβωση (4 και 12 εβδοµάδων), στην αρχή της ενήβωσης (26 εβδοµάδων), κατά την αναπαραγωγική ωριµότητα (52 εβδοµάδων) και κατά την αναπαραγωγική γήρανση (104 εβδοµάδων), επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης των AvβDs γονιδίων στους όρχεις, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των mrna επιπέδων των 9 γονιδίων που εκφράζονται. Εποµένως, πραγµατοποιήθηκε σχετικός ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων έκφρασης των mrna των µεταγράφων των γονιδίων AvβD1, 2, 4, 5, 6, 9, 10, 12 και 14, τα οποία είναι τα γονίδια στόχοι, σε σχέση µε τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου αναφοράς β-ακτίνη (β-actin), µε την εφαρµογή της µεθόδου 2 -ΔΔCt. Η κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων των γονιδίων στόχων έγινε ως προς τον εσωτερικό µάρτυρα που είναι το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, ενώ όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι αλλαγές των επιπέδων έκφρασης των AvβD1, 2, 4, 5, 6, 9, 10, 12 και 14 γονιδίων στους όρχεις κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωριµότητας (ηλικίας 4, 12, 26, 52 και 104 εβδοµάδων), απεικονίζονται στο Διάγραµµα 4. 90

Διάγραµµα 4. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στους όρχεις αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των AvβDs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Σύµφωνα µε το Διάγραµµα 4, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, τα αποτελέσµατα της Real-Time PCR υποδεικνύουν µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου AvβD4 στους όρχεις των ορνιθίων που βρίσκονταν στην αναπαραγωγική ωριµότητα και γήρανση, σε σύγκριση µε τα υπόλοιπα αναπαραγωγικά στάδια. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική (P<0.05) αύξηση της έκφρασης του AvβD5 στους όρχεις των αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ενώ στο ίδιο στάδιο, σηµειώθηκε µία σηµαντική (P<0.05) µείωση των επιπέδων έκφρασης του AvβD6, σε σύγκριση µε τα αρσενικά που 91

βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης. Επίσης, εντοπίστηκε σηµαντική (P<0.05) µείωση των επιπέδων έκφρασης στο γονίδιο AvβD9 στους όρχεις των αναπαραγωγικά γερασµένων αρσενικών, ενώ παρατηρήθηκε επίσης, σηµαντική (P<0.05) µείωση των επιπέδων έκφρασης για τα γονίδια AvβD10 και 12 στους όρχεις των αρσενικών όλων των ηλικιών σε σύγκριση µε των νεαρών 4 εβδοµάδων. Δεν εντοπίστηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) µεταβολές στην έκφραση των AvβDs 1, 2 και 14, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Επίδραση της µόλυνσης µε SE στην έκφραση των AvβDs Η επίδραση της µόλυνσης της επιδιδυµίδας µε Salmonella Enteritidis στα επίπεδα της έκφρασης των AvβDs στους όρχεις των ορνιθίων, διερευνήθηκε µέσω της ανάλυσης της ποσοτικής PCR πραγµατικού χρόνου. Για την πραγµατοποίηση αυτών των µετρήσεων αποµονώθηκε RNA από όρχεις αρσενικών που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης (28 εβδοµάδων), τόσο µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis, όσο και από τους µάρτυρες (PBS). Τα αποτελέσµατα των αναλύσεων αυτών απεικονίζονται στο Διάγραµµα 5. 10 * 8 * Relative expression 6 4 2 0 * * -2 Av!D1 Av!D2 Av!D4 Av!D5 Av!D6 Av!D9 Av!D10 Av!D12 Av!D14 Διάγραµµα 5. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στους όρχεις µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των 92

mrna µεταγραφηµάτων των AvβDs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (Ρ <0.05). Μετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β- ακτίνη, τα αποτελέσµατα της Real-time PCR έδειξαν, ότι η µόλυνση µε Salmonella Enteritidis στους όρχεις, είχε ως αποτέλεσµα µία σηµαντική (P<0.05) επαγωγή των επιπέδων της έκφρασης των AvβD4, 10, 12 και 14. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) µεταβολές για τα AvβD1, 2, 5, 6 και 9 γονίδια. 3.1.3. Έκφραση των AvβDs στην επιδυµίδα Για τη µελέτη του πρότυπου έκφρασης των AvβDs γονιδίων στην επιδιδυµίδα, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από την επιδιδυµίδα αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ηλικίας 52 εβδοµάδων. Tα αποτελέσµατα των αναλύσεων της RT-PCR απεικονίζονται στην Εικόνα 8. Εικόνα 8. Έκφραση των AvβDs στην επιδιδυµίδα αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR. Σύµφωνα µε την Εικόνα 8, mrna µεταγραφήµατα εντοπίστηκαν για 10 AvβDs γονίδια στην επιδιδυµίδα. Συγκεκριµένα, τα AvβD1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 12 και 14 93

γονίδια εκφράζονται στην επιδιδυµίδα των αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών. Δεν εκφράζονται τα γονίδια AvβD6, 7, 8 και 13. Επίδραση της ηλικίας ενήβωσης στην έκφραση των AvβDs Για να διαπιστωθεί εάν η αναπαραγωγική ηλικία των αρσενικών επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης των AvβDs γονιδίων στην επιδιδυµίδα, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna των 10 γονιδίων που εκφράζονται, µέσω της Real- Time PCR σε αρσενικά ηλικίας 26, 52 και 104 εβδοµάδων. Η κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων των γονιδίων στόχων έγινε ως προς τον εσωτερικό µάρτυρα που είναι το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, ενώ όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των AvβD1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 12 και 14 γονιδίων στην επιδιδυµίδα κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωριµότητας, απεικονίζονται στο Διάγραµµα 6. 94

Διάγραµµα 6. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στην επιδιδυµίδα αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των AvβDs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Όπως απεικονίζεται στο Διάγραµµα 6, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, τα αποτελέσµατα της Real-Time PCR υποδήλωσαν στατιστικά σηµαντικά (P<0.05) υψηλότερα επίπεδα έκφρασης των AvβD1, 4 και 9 στην επιδιδυµίδα των αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ηλικίας 52 εβδοµάδων, ενώ παρατηρήθηκε µία σηµαντική αύξηση (P<0.05) και µία σηµαντική µείωση (P<0.05) των επιπέδων έκφρασης για τα αντιµικροβιακά πεπτίδια AvβD10 και 5, 95

αντίστοιχα, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωριµότητας. Επιπροσθέτως, δεν ανιχνεύτηκαν στατιστικά σηµαντικές µεταβολές στην έκφραση των AvβDs 2, 3, 11, 12 και 14, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ανάπτυξης. Επίδραση της µόλυνσης µε SE στην έκφραση των AvβDs Η επίδραση της µόλυνσης της επιδιδυµίδας µε Salmonella Enteritidis στα επίπεδα της έκφρασης των AvβDs διερευνήθηκαν µέσω της ανάλυσης της ποσοτικής PCR πραγµατικού χρόνου. Για την πραγµατοποίηση αυτών των µετρήσεων αποµονώθηκε RNA από επιδιδυµίδες αρσενικών που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης (28 εβδοµάδων), τόσο µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis, όσο και µαρτύρων (PBS). Τα αποτελέσµατα απεικονίζονται στο Διάγραµµα 7. Διάγραµµα 7. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στην επιδιδυµίδα µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των AvβDs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει ότι η διαφορά στα επίπεδα 96

έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (Ρ <0.05). Μετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β- ακτίνη, η ανάλυση της Real-Time PCR έδειξε µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων της έκφρασης των AvβD1, 9, 10, 12 και 14 γονιδίων στις επιδιδυµίδες των µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε τους µάρτυρες της ίδιας ηλικίας, µε τη µεγαλύτερη αύξηση επιπέδων έκφρασης να παρατηρείται για το AvβD14. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) αλλαγές στα επίπεδα της έκφρασης των AvβD2, 3, 4, 5 και 11 γονιδίων. 3.1.4. Έκφραση των AvβDs στα κύτταρα Sertoli Για τη µελέτη του πρότυπου έκφρασης των AvβDs γονιδίων στα κύτταρα Sertoli, in vitro, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από τα κύτταρα Sertoli, καλλιεργούµενα in vitro. Tα αποτελέσµατα των αναλύσεων της RT-PCR απεικονίζονται στην Εικόνα 9. Εικόνα 9. Έκφραση των AvβDs στα κύτταρα Sertoli, µέσω της RT-PCR. Όπως φαίνεται από την παραπάνω εικόνα, mrna µεταγραφήµατα εντοπίστηκαν για 9 AvβDs γονίδια στα κύτταρα Sertoli. Συγκεκριµένα, τα γονίδια AvβD1, 2, 3, 4, 5, 9, 97

10, 12 και 14 εκφράζονται στα κύτταρα Sertoli, ενώ δεν εκφράζονται τα γονίδια AvβD6, 7, 8, 11 και 13. Επίδραση της επώασης µε LPS στην έκφραση των AvβDs Για να διευκρινιστεί η επίδραση της επεξεργασίας µε LPS, στα επίπεδα της έκφρασης των AvβDs στα κύτταρα Sertoli, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna των AvβDs γονιδίων που εκφράζονται στα κύτταρα αυτά, µέσω της Real-time PCR, µετά από 0, 6, 12, 24 και 48 ωρες επώασης µε LPS. Η κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων των γονιδίων στόχων έγινε ως προς τον εσωτερικό µάρτυρα που είναι το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, ενώ όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των γονιδίων AvβD1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 12 και 14 στα κύτταρα Sertoli, µετά από 0, 6, 12, 24 και 48 ωρες επώασης µε LPS, απεικονίζονται στo Διάγραµµα 8. 98

Διάγραµµα 8. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των AvβDs στα κύτταρα Sertoli σε διαφορετικά χρονικά διαστήµατα επώασης µε LPS. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των AvβDs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Σύµφωνα µε το Διάγραµµα 8, τα αποτελέσµατα της Real-Time PCR, υπέδειξαν ότι η διέγερση µε 1µg/ml LPS, είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση της έκφρασης 6 AvβD γονιδίων, σε σύγκριση µε το µάρτυρα. Συγκεκριµένα, τα επίπεδα της έκφρασης για το γονίδιο AvβD3 αυξήθηκαν σηµαντικά (Ρ <0.05) στις 6-48 ώρες µετά την επώαση µε 1µg/ml LPS. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης των AvβD1, 10 και 12 αυξήθηκαν σηµαντικά (Ρ <0,05) µετά από 24 ώρες επώασης µε LPS, ενώ όσον αφορά στα AvβD2 99

και 9 τα επίπεδα της έκφρασής τους αυξήθηκαν σηµαντικά (Ρ <0.05) µόνο στις 48 ώρες µετά τη διέγερση µε LPS. Επίσης, στις 48 ώρες µετά την επώαση, παρατηρήθηκαν οι υψηλότερες µεταβολές στα επίπεδα έκφρασης για τα γονίδια AvβD1 και 9, µε 11,3 και 10,3 φορές υψηλότερη έκφραση, αντίστοιχα. Τέλος, η επώαση µε LPS δεν επηρεάσε σηµαντικά (Ρ> 0,05) τα επίπεδα έκφρασης των AvβD4, 5 και 15 γονιδίων, σε σύγκριση µε το µάρτυρα. 3.2. Έκφραση των TLRs 3.2.1. Έκφραση των TLRs στους όρχεις Για τη µελέτη του πρότυπου έκφρασης των 10 γονιδίων που ανήκουν στην οικογένεια των Toll-like Receptors (TLRs) στους όρχεις, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από τους όρχεις αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ηλικίας 52 εβδοµάδων. Tα αποτελέσµατα των αναλύσεων της RT- PCR απεικονίζονται στην εικόνα 10. Εικόνα 10. Έκφραση των TLRs στους όρχεις αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT- PCR. Σύµφωνα µε την Εικόνα 10, όλα τα µέλη της οικογένειας των TLRs, εκτός από τον TLR1-1, εκφράζονται στους όρχεις. 100

Για να διαπιστωθεί εάν η αναπαραγωγική ηλικία επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης των TLRs στους όρχεις πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna των 9 TLRs γονιδίων που εκφράζονται στους όρχεις (TLR1-2, 2-1, 2-2, 3, 4, 5, 7, 15 και 21), µέσω της Real-Time PCR, σε RNA αποµονωµένο από αρσενικά ηλικίας 12, 26, 52 και 104 εβδοµάδων. Όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Επίδραση της ηλικίας ενήβωσης στην έκφραση των TLRs Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των γονιδίων TLR1-2, 2-1, 2-2, 3, 4, 5, 7, 15 και 21 στους όρχεις των ορνιθίων κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωριµότητας (ορνίθια ηλικίας 12, 26, 52 και 104 εβδοµάδων), απεικονίζονται στο Διάγραµµα 9. 101

Διάγραµµα 9. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στους όρχεις αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των TLRs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Όπως απεικονίζεται στο Διάγραµµα 9, η ανάλυση της ποσοτικοποίησης, µέσω της Real-Time PCR, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, έδειξε σηµαντικά (P<0.05) αυξηµένα επίπεδα έκφρασης για τα γονίδια TLR2-1 και 5 στους όρχεις των αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ηλικίας 52 102

εβδοµάδων, σε σύγκριση µε εκείνα που βρίσκονται πριν την ενήβωση, στην αρχή της ενήβωσης και µε εκείνα που είναι αναπαραγωγικά γερασµένα, ηλικιών 12, 26 και 104 εβδοµάδων, αντίστοιχα. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική (P<0.05) αύξηση της έκφρασης του TLR2-2 γονιδίου στους όρχεις των ώριµων και γερασµένων αναπαραγωγικά αρσενικών, ηλικίας 52 και 104 εβδοµάδων αντίστοιχα, σε σύγκριση µε εκείνα που βρίσκονται πριν την ενήβωση (12 εβδοµάδων) και στην αρχή της αναπαραγωγικής δραστηριότητας (26 εβδοµάδων). Επιπλέον, διακρίθηκε σηµαντική αύξηση (P<0.05) της έκφρασης του TLR15 στους όρχεις των αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών. Επίσης, παρατηρήθηκε σηµαντική (P<0.05) µείωση της έκφρασης του TLR4 στους όρχεις των αναπαραγωγικά γερασµένων, σε σύγκριση µε των αναπαραγωγικά ώριµα αρσενικών, ενώ όσον αφορά στο γονίδιο TLR3, εντοπίστηκε στατιστικά σηµαντική (P<0.05) αύξηση στους όρχεις των αναπαραγωγικά γερασµένων, σε σύγκριση µε των αναπαραγωγικά ώριµα αρσενικών. Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές µεταβολές (P > 0.05), για τα διάφορα στάδια της αναπαραγωγικής ηλικίας των όρχεων, σχετικά µε τα επίπεδα έκφρασης των TLR1-2, 7 και 21. Επίδραση της µόλυνσης µε SE στην έκφραση των TLRs Για να διερευνηθεί εάν η η έκφραση των TLRs στους όρχεις επάγεται ως αντίδραση στη µόλυνση µε Salmonella enteriditis, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης των TLRs γονιδίων, µέσω της Real-time PCR. Για την πραγµατοποίηση αυτών των µετρήσεων αποµονώθηκε RNA από όρχεις αρσενικών που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης (28 εβδοµάδων), τόσο µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis, όσο και µαρτύρων (PBS). Όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε 103

τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Τα αποτελέσµατα της Real-Time PCR ανάλυσης απεικονίζονται στο Διάγραµµα 10. Διάγραµµα 10. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στους όρχεις µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των TLRs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (*P < 0.05, **P < 0.01). Μετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β- ακτίνη, τα αποτελέσµατα της Real-time PCR υποδήλωσαν, ότι η µόλυνση µε Salmonella Enteritidis στους όρχεις αρσενικών, είχε ως αποτέλεσµα µία σηµαντική (P<0.05) επαγωγή των επιπέδων της έκφρασης των TLR2-1, 4, 5, 15 και 21 στους όρχεις των µολυσµένων αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε των υγιών της ίδιας ηλικίας, µε τη µεγαλύτερη επαγωγή να παρατηρείται για το γονίδιο TLR15 (7,2 φορές 104

υψηλότερη έκφραση). Επιπλέον, παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική (P< 0.05) µείωση της έκφρασης του γονιδίου TLR3, ενώ δεν εντοπίστηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) µεταβολές για τα γονίδια TLR1-2, 2-2 και 7 στα µολυσµένα αρσενικά. 3.2.2. Έκφραση των TLRs στην επιδιδυµίδα Όσον αφορά στο πρότυπο έκφρασης των TLRs γονιδίων στην επιδιδυµίδα, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από την επιδιδυµίδα αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ηλικίας 52 εβδοµάδων. Tα αποτελέσµατα των αναλύσεων της RT-PCR απεικονίζονται στην Εικόνα 11. Εικόνα 11. Έκφραση των TLRs στην επιδιδυµίδα αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR. Σύµφωνα µε την Εικόνα 11, στην επιδιδυµίδα εκφράζονται 9 µέλη της οικογένειας των TLRs, τα οποία είναι τα TLR1-2, 2-1, 2-2, 3, 4, 5, 7, 15 και 21. 105

Επίδραση της ηλικίας ενήβωσης στην έκφραση των TLRs Για να προσδιοριστεί εάν η αναπαραγωγική ηλικία επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης των TLRs στην επιδιδυµίδα, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna των 9 TLRs γονιδίων που εκφράζονται στην επιδιδυµίδα (TLR1-2, 2-1, 2-2, 3, 4, 5, 7, 15 και 21), µέσω της Real-time PCR σε αρσενικά ηλικίας 26, 52 και 104 εβδοµάδων. Όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των γονιδίων TLR1-2, 2-1, 2-2, 3, 4, 5, 7, 15 και 21 στην επιδιδυµίδα κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωριµότητας, απεικονίζονται στο Διάγραµµα 11. Διάγραµµα 11. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στην επιδιδυµίδα αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των TLRs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά 106

γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Σύµφωνα µε το Διάγραµµα 11, η ανάλυση της ποσοτικοποίησης, µέσω της Real- Time PCR, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, έδειξε ότι τα επίπεδα της έκφρασης των TLRs 2-1, 2-2, 4 και 21 µειώθηκαν σηµαντικά (P<0.05) µε την αύξηση της αναπαραγωγικής ηλικίας, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές µεταβολές στα επίπεδα της έκφρασης των υπόλοιπων γονιδίων. Ωστόσο, ανιχνεύτηκε µία µείωση της έκφρασης των TLR1-2 και 15 στην επιδιδυµίδα των ώριµων και αναπαραγωγικά γερασµένων αρσενικών, σε σύγκριση µε εκείνα που βρίσκονται στην αρχή της ενήβωσης. Επίδραση της µόλυνσης µε SE στην έκφραση των TLRs Για να προσδιοριστεί εάν η η έκφραση των TLRs στην επιδιδυµίδα των ορνιθίων επάγεται ως αντίδραση στη µόλυνση µε Salmonella enteriditis, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης των TLRs γονιδίων, µέσω της Real-Time PCR. Για την πραγµατοποίηση αυτών των πειραµάτων αποµονώθηκε RNA από επιδιδυµίδες αρσενικών που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης (28 εβδοµάδων), τόσο µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis, όσο και µαρτύρων (PBS). Τα αποτελέσµατα της ανάλυσης απεικονίζονται στο Διάγραµµα 12. 107

Διάγραµµα 12. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στην επιδιδυµίδα µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των TLRs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (*P < 0.05, **P < 0.01). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της Real-Time PCR, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, η µόλυνση µε Salmonella Enteritidis είχε ως αποτέλεσµα µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων της έκφρασης των TLRs 1-2, 2-1, 2-2, 4, 5 και 7, µε τη µεγαλύτερη επαγωγή να παρατηρείται για το γονίδιο TLR2-1 (10 φορές υψηλότερα επίπεδα έκφρασης). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) µεταβολές για τα υπόλοιπα µέλη της οικογένειας των TLRs στις επιδιδυµίδες των µολυσµένων αρσενικών. 108

3.2.3. Έκφραση των TLRs στα κύτταρα Sertoli Για τη µελέτη του πρότυπου έκφρασης των 10 TLRs γονιδίων στα κύτταρα Sertoli, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από in vitro καλλιέργειες κυττάρων Sertoli. Tα αποτελέσµατα της RT-PCR ανάλύσης απεικονίζονται στην Εικόνα 12. Εικόνα 12. Έκφραση των TLRs στα κύτταρα Sertoli, µέσω της RT-PCR. Σύµφωνα µε την Εικόνα 12, η RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι όλα τα µέλη της οικογένειας των TLRs εκφράζονται στα κύτταρα Sertoli. Επίδραση της επώασης µε LPS στην έκφραση των TLRs Για να προσδιοριστεί η επίδραση της επώασης µε LPS στα επίπεδα της έκφρασης των TLRs στα κύτταρα Sertoli, και ο χρόνος στον οποίο τα κύτταρα αυτά ξεκινούν την ανοσολογική τους ανταπόκριση, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna των 10 TLRs, µέσω της Real-time PCR, µετά από 0, 6, 12, 24 και 48 ώρες επώασης µε LPS. Η κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων των γονιδίων στόχων έγινε ως προς τον εσωτερικό µάρτυρα που είναι το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, ενώ όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. 109

Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των TLR1-1, 1-2, 2-1, 2-2, 3, 4, 5, 7, 15 και 21 γονιδίων στα κύτταρα Sertoli, µετά από 0, 6, 12, 24 και 48 ωρες επώασης µε LPS, απεικονίζονται στο Διάγραµµα 13. Διάγραµµα 13. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των TLRs στα κύτταρα Sertoli σε διαφορετικά χρονικά διαστήµατα επώασης µε LPS. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των TLRs υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Όπως απεικονίζεται στο Διάγραµµα 13, σε 6 µέλη της οικογένειας των TLRs στα 110

κύτταρα Sertoli, παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων της έκφρασής τους, µετά από επώαση µε LPS, σε σύγκριση µε το µάρτυρα. Συγκεκριµένα, τα επίπεδα έκφρασης του TLR15 γονιδίου αυξήθηκαν σηµαντικά 6 ώρες µετά την επώαση µε LPS και η έκφρασή του παρέµεινε σηµαντικά (P<0,05) υψηλότερη σε σύγκριση µε το µάρτυρα και στα υπόλοιπα στάδια της επώασης (12, 24 και 48 ώρες) µε LPS. Όσον αφορά στα γονίδια TLR4 και 7, παρατηρήθηκε σηµαντικά (Ρ<0,05) υψηλότερη έκφραση σε απάντηση προς τη διέγερση µε 1µg/ml LPS στις 24 και 48 ώρες, ενώ τα επίπεδα της έκφρασης των TLR1-1, 2-2 και 21 αυξήθηκαν σηµαντικά (Ρ<0.05) µόνο µετά από 48 ώρες επώασης µε LPS. Οι υψηλότερες µεταβολές στα επίπεδα έκφρασης παρατηρήθηκαν για τα TLR1-1 και 15 στις 48 ώρες µετά την επώαση µε LPS, µε 8,4 και 8 φορές υψηλότερη έκφραση, αντίστοιχα. Σχετικά µε τα γονίδια TLR1-2, 2-1, 3 και 5 η έκφραση τους παρέµεινε στα ίδια επίπεδα στα διεγερµένα, µε LPS, κύτταρα Sertoli, σε όλα τα χρονικά διαστήµατα επώασης. 3.3. Έκφραση των κυτταροκινών 3.3.1. Έκφραση των κυτταροκινών στα έµβρυα Για να διερευνηθεί το πρότυπο έκφρασης των κυτταροκινών στα έµβρυα, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA από έµβρυα από την τρίτη (Ε3) έως την δέκατη (Ε10) ηµέρα της εµβρυικής ανάπτυξης. Tα αποτελέσµατα των RT-PCR αναλύσεων, απεικονίζονται στην Εικόνα 13. 111

Εικόνα 13. Έκφραση των κυτταροκινών σε έµβρυα από την 3 έως τη 10 ηµέρα (Ε3-Ε10) της εµβρυικής ανάπτυξης, µέσω της RT-PCR. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα των RT-PCR αναλύσεων για τα γονίδια IL-1β, IL- 2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFNg και NOX1, όπως φαίνεται στην Εικόνα 8, διαπιστώθηκε ότι mrna µεταγραφήµατα εντοπίστηκαν στα εµβρυϊκά RNA, από την τρίτη έως την δέκατη ηµέρα της εµβρυικής ανάπτυξης για τα γονίδια ΙL-1β, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFNg και NOX1, ενώ δεν 112

εντοπίστηκε έκφραση για τα γονίδια IL-2, IL-4, IL-6 και IL-10, σε κανένα από τα στάδια της εµβρυϊκής ανάπτυξης τα οποία εξετάστηκαν. 3.3.2. Έκφραση των κυτταροκινών στην ωοθήκη Για να διαπιστωθεί εάν οι κυτταροκίνες εκφράζονται στην ωοθήκη, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από την ωοθήκη, αναπαραγωγικά ώριµων ορνίθων, ηλικίας 52 εβδοµάδων. Tα αποτελέσµατα των RT-PCR αναλύσεων απεικονίζονται στην Εικόνα 14. Εικόνα 14. Έκφραση των κυτταροκινών στην ωοθήκη ορνίθων, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR. Σύµφωνα µε την Εικόνα 14, εντοπίστηκαν mrna µεταγραφήµατα στην ωοθήκη για όλα τα γονίδια των κυτταροκινών, εκτός από το γονίδιο IL-2. Επίδραση της ηλικίας ενήβωσης στην έκφραση των κυτταροκινών Για να διερευνηθεί εάν τα διάφορα στάδια της αναπαραγωγικής ζωής των θηλυκών ορνιθίων, πριν την ενήβωση (12 εβδοµάδων), στην αρχή της ενήβωσης (26 εβδοµάδων), κατά την αναπαραγωγική ωριµότητα (52 εβδοµάδων) και κατά την αναπαραγωγική γήρανση (104 εβδοµάδων), επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην ωοθήκη, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna των 113

γονιδίων που εκφράζονται, µέσω της Real-Time PCR. Η κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων των γονιδίων στόχων έγινε ως προς τον εσωτερικό µάρτυρα που είναι το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, ενώ όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των γονιδίων IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL- 10, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFNγ και NOX1 στην ωοθήκη των ορνιθίων κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωριµότητας, απεικονίζονται στο Διάγραµµα 14. Διάγραµµα 14. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην ωοθήκη ορνίθων, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM 114

(n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Σύµφωνα µε το Διάγραµµα 14, η ανάλυση της ποσοτικοποίησης, µέσω της Real- Time PCR, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, έδειξε στατιστικά σηµαντικά (P<0.05) αυξηµένα επίπεδα έκφρασης για τα γονίδια IL-1β, IL-4 και IL-16 στην ωοθήκη των αναπαραγωγικά ώριµων ορνιθίων, ηλικίας 52 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε εκείνα που βρίσκονται στα υπόλοιπα αναπαραγωγικά στάδια. Παρατηρήθηκε επίσης, σηµαντική (P<0.05) αύξηση της έκφρασης των γονιδίων IL-15 και IL-17 στην ωοθήκη των αναπαραγωγικά γερασµένων ορνιθίων, ενώ αντίθετα, στο ίδιο στάδιο, εντοπίστηκε σηµαντική µείωση (P<0.05) των επιπέδων έκφρασης για το γονίδιο IL-12. Επιπρόσθετα, διακρίθηκε σηµαντική επαγωγή (P<0.05) της έκφρασης των IL-18, IFNg και NOX1 στην ωοθήκη των ώριµων και γερασµένων αναπαραγωγικά πτηνών, ηλικίας 52 και 104 εβδοµάδων αντίστοιχα, σε σύγκριση µε εκείνα που βρίσκονται πριν την ενήβωση και στην αρχή της αναπαραγωγικής δραστηριότητας. Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές µεταβολές (P>0.05), για τα διάφορα στάδια της αναπαραγωγικής ηλικίας στις ωοθήκες, σχετικά µε τα επίπεδα έκφρασης των IL-6, IL-8 και IL-10. Επίδραση της µόλυνσης µε SE στην έκφραση των κυτταροκινών Προκειµένου να διαπιστωθεί εάν η έκφραση των κυτταροκινών, στην ωοθήκη, είναι σταθερή ή επαγόµενη σε απάντηση προς τη µόλυνση µε Salmonella enteriditis, και επίσης, για να διερευνηθεί εάν η αναπαραγωγική ηλικία επηρεάζει την ανοσολογική απάντηση προς τη µόλυνση, µέσω της αύξησης της έκφρασης των γονιδίων, 115

πραγµατοποιήθηκε η ανάλυση της Real-Time PCR, χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από την ωοθήκη των ορνιθίων, που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης (ηλικίας 28 εβδοµάδων, Διάγραµµα 15), και αναπαραγωγικά γερασµένων ορνιθίων (ηλικίας 104 εβδοµάδων, Διάγραµµα 16), τόσο µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis, όσο και µαρτύρων (PBS). 8 7 6 * * Relative expression 5 4 3 * * * * 2 1 0 IL-1! IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12 IL-15 IL-16 IL-18 IFNg NOX1 Διάγραµµα 15. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην ωοθήκη µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 28 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (Ρ <0.05). 116

7 6 * Relative expression 5 4 3 2 * * * * 1 0 IL-1! IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12 IL-15 IL-16 IL-18 IFNg NOX1 Διάγραµµα 16. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην ωοθήκη µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 104 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (Ρ <0.05). Όπως απεικονίζεται στα Διαγράµµατα 15 και 16, η Real-Time PCR ανάλυση έδειξε µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων της έκφρασης των γονιδίων IL-1β, IL-6, IL-8 και IL-18 στην ωοθήκη των µολυσµένων µε SE ορνιθίων, ηλικίας 28 και 104 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση της έκφρασης για τα γονίδια IL-10 και NOX1 στην ωοθήκη των µολυσµένων µε SE ορνιθίων που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης, ηλικίας 28 εβδοµάδων, ενώ η µόλυνση µε SE δεν είχε σηµαντικές επιδράσεις στα επίπεδα της έκφρασης αυτών των γονιδίων στην ωοθήκη των αναπαραγωγικά γερασµένων ορνιθίων. Επίσης, εντοπίστηκε σηµαντική (P<0.05) αύξηση της έκφρασης του γονιδίου IL-12 στην ωοθήκη µολυσµένων µε SE και αναπαραγωγικά γερασµένων ορνιθίων, ηλικίας 104 εβδοµάδων, σε αντίθεση µε την ωοθήκη των ορνιθίων ηλικίας 28 εβδοµάδων, στην οποία δεν παρατηρήθηκε καµία 117

µεταβολή σχετικά µε το γονίδιο IL-12. Τέλος, δεν σηµειώθηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) αλλαγές στην έκφραση των IL-4, IL-15, IL-16 και IFNg στην ωοθήκη των µολυσµένων µε SE ορνιθίων ηλικιών 28 και 104 εβδοµάδων. 3.3.3. Έκφραση των κυτταροκινών στον ωαγωγό Όσον αφορά στο πρότυπο έκφρασης των γονιδίων των κυτταροκινών στον ωαγωγό της όρνιθας, πραγµατοποιήθηκε RT-PCR ανάλυση χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από τον ωαγωγό αναπαραγωγικά ώριµων πτηνών, ηλικίας 52 εβδοµάδων. Tα αποτελέσµατα των αναλύσεων της RT-PCR ανάλυσης απεικονίζονται στην Εικόνα 15. Εικόνα 15. Έκφραση των κυτταροκινών στον ωαγωγό ορνίθων, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR. Σύµφωνα µε την Εικόνα 15, mrna µεταγραφήµατα στον ωαγωγό των ορνιθίων εντοπίστηκαν, για όλες τις κυτταροκίνες που εξετάστηκαν, εκτός από τα γονίδια IL-2 και IL-4, για τα οποία δεν ανιχνεύτηκαν προϊόντα µεταγραφής στον ιστό του ωαγωγού. Εποµένως, τα γονίδια που εκφράζονται στον ωαγωγό των ορνιθίων είναι τα IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFNγ και NOX1. 118

Επίδραση της ηλικίας ενήβωσης στην έκφραση των κυτταροκινών Για να προσδιοριστεί εάν τα διάφορα στάδια της αναπαραγωγικής ζωής των θηλυκών ορνίθων, πριν την ενήβωση, στην αρχή της ενήβωσης, κατά την αναπαραγωγική ωριµότητα και κατά την αναπαραγωγική γήρανση, επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna των γονιδίων που εκφράζονται στον ωαγωγό, µέσω της Real-time PCR. Η κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων των γονιδίων στόχων έγινε ως προς τον εσωτερικό µάρτυρα που είναι το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, ενώ όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι µεταβολές των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL- 12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFNγ και NOX1, στον ωαγωγό κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωριµότητας (ηλικίας 12, 26, 52 και 104 εβδοµάδων), απεικονίζονται στο Διάγραµµα 17. 119

Διάγραµµα 17. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στον ωαγωγό ορνίθων, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Σύµφωνα µε το Διάγραµµα 17, η ανάλυση της ποσοτικοποίησης, µέσω της Realtime PCR, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, έδειξε σηµαντικά (P<0.05) αυξηµένα επίπεδα έκφρασης για τα γονίδια IL-10, IL-16, IL-18, IFNg και NOX1 στον ωαγωγό των ορνιθίων που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης (26 εβδοµάδων), κατά την αναπαραγωγική ωριµότητα (52 εβδοµάδων) και 120

όταν είναι αναπαραγωγικά γερασµένα (104 εβδοµάδων), σε σύγκριση µε εκείνα που βρίσκονται στην αρχή της ενήβωσης, ηλικίας 12 εβδοµάδων. Αντιθέτως, σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της Real-Time PCR, παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική (P<0.05) µείωση της έκφρασης για το γονίδιο IL-17 στον ωαγωγό των ορνιθίων ηλικίας 26, 52 και 104 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε τα ορνίθια 12 εβδοµάδων. Όσον αφορά στο γονίδιο IL- 15, εντοπίστηκε σηµαντική αύξηση των επιπέδων της έκφρασης στον ωαγωγό των αναπαραγωγικά ώριµων και γερασµένων ορνίθων, 52 και 104 εβδοµάδων, αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τα υπόλοιπα αναπαραγωγικά στάδια. Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές µεταβολές (P > 0.05), για τα διάφορα στάδια της αναπαραγωγικής ηλικίας στον ωαγωγό των ορνιθίων, σχετικά µε τα επίπεδα έκφρασης των IL-1β, IL-6, IL-8 και IL-12. Επίδραση της µόλυνσης µε SE στην έκφραση των κυτταροκινών Για να προσδιοριστεί εάν η έκφραση των κυτταροκινών που εξετάστηκαν, στον ωαγωγό των ορνίθων, ήταν συνεχής ή επαγόµενη σε απάντηση προς τη µόλυνση µε SE, και επίσης, για να διερευνηθεί εάν η αναπαραγωγική ηλικία επηρεάζει την ανοσολογική απάντηση προς τη µόλυνση, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση της Real-Time PCR, χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από τον ωαγωγό των ορνιθίων, που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης, ηλικίας 28 εβδοµάδων (Διάγραµµα 18), και αναπαραγωγικά γερασµένων ορνιθίων, ηλικίας 104 εβδοµάδων (Διάγραµµα19), τόσο µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis, όσο και µαρτύρων (PBS). 121

10 9 8 ** ** Relative expression 7 6 5 4 3 * * * * * 2 1 0 IL-1! IL-6 IL-8 IL-10 IL-12 IL-15 IL-16 IL-17 IL-18 IFNg NOX1 Διάγραµµα 18. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στον ωαγωγό µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 28 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (*P < 0.05, **P < 0.01). Relative expression 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 * * * 1 0.5 0 IL-1! IL-6 IL-8 IL-10 IL-12 IL-15 IL-16 IL-17 IL-18 IFNg NOX1 Διάγραµµα 19. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στον ωαγωγό µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis ορνίθων, ηλικίας 104 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (Ρ <0.05). Η Real-Time PCR ανάλυση έδειξε µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων 122

της έκφρασης των γονιδίων IL-1β, IFNg και NOX1 στον ωαγωγό των µολυσµένων µε SE ορνιθίων, ηλικίας 28 και 104 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε εκείνα που είναι κατεργασµένα µε PBS στις ίδιες ηλικίες. Στη συνέχεια, παρατηρήθηκε µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση της έκφρασης για τα γονίδια IL-6, IL-8, IL-16 και IL-17 στην ωοθήκη των µολυσµένων µε SE ορνιθίων που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης, ηλικίας 28 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε το µάρτυρα, ενώ η µόλυνση µε σαλµονέλα δεν είχε σηµαντικές επιδράσεις στα επίπεδα της έκφρασης αυτών των γονιδίων στην ωοθήκη των αναπαραγωγικά γερασµένων ορνιθίων. Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) µεταβολές στην έκφραση των IL-10, IL-12, IL-15, IL-18 στον ωαγωγό των µολυσµένων µε σαλµονέλα ορνιθίων, 28 και 104 εβδοµάδων. 3.3.4. Έκφραση των κυτταροκινών στους όρχεις Για να διαπιστωθεί εάν τα γονίδια των κυτταροκινών εκφράζονται στους όρχεις, πραγµατοποιήθηκε ανάλυση µε RT-PCR χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από τους όρχεις, αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ηλικίας 52 εβδοµάδων. Tα αποτελέσµατα των RT-PCR αναλύσεων απεικονίζονται στην Εικόνα 16. Εικόνα 16. Έκφραση των κυτταροκινών στους όρχεις αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR. 123

Σύµφωνα µε την Εικόνα 16, mrna µεταγραφήµατα στους όρχεις εντοπίστηκαν για για τα περισσότερα γονίδια των κυτταροκινών, εκτός από τα γονίδια IL-2, IL-4 και IL-10. Εποµένως, τα γονίδια που εκφράζονται στους όρχεις είναι τα IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFNγ και NOX1. Επίδραση της ηλικίας ενήβωσης στην έκφραση των κυτταροκινών Για να διαπιστωθεί εάν η αναπαραγωγική ηλικία επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στους όρχεις, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna, µέσω της Real-Time PCR στους όρχεις αρσενικών που βρίσκονται στην αρχή της ενήβωσης (26 εβδοµάδων), όταν είναι αναπαραγωγικά ώριµα (52 εβδοµάδων) και όταν είναι αναπαραγωγικά γερασµένα (104 εβδοµάδων). Όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των κυτταροκινών, στους όρχεις κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωριµότητας, απεικονίζονται στο Διάγραµµα 20. 124

Διάγραµµα 20. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στους όρχεις αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Σύµφωνα µε το Διάγραµµα 20, η Real-Time PCR ανάλυση, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, έδειξε µία σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων έκφρασης για τα γονίδια IL-8, IL-12, IL-15, IFNg και NOX1 στους όρχεις των αρσενικών που είναι αναπαραγωγικά ώριµοι και γερασµένοι, ηλικίας 52 και 104 εβδοµάδων, αντιστοιχα, σε σύγκριση µε τα αρσενικά που 125

βρίσκονται στην αρχή της ενήβωσης, ηλικίας 26 εβδοµάδων. Αντιθέτως, σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της Real-Time PCR, παρατηρήθηκε σηµαντική (P<0.05) µείωση των επιπέδων της έκφρασης για το γονίδιο IL-16 στους όρχεις αρσενικών ηλικίας 52 και 104 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε των 26 εβδοµάδων. Σχετικά µε το γονίδιο IL-1β, σηµειώθηκε στατιστικά σηµαντική (P<0.05) µείωση των επιπέδων της έκφρασης στους όρχεις των αναπαραγωγικά γερασµένων 104 εβδοµάδων αρσενικών, σε σύγκριση µε τα υπόλοιπα αναπαραγωγικά στάδια. Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές µεταβολές (P>0.05), για τα διάφορα στάδια της αναπαραγωγικής ηλικίας στους όρχεις, όσον αφορά στα επίπεδα έκφρασης των IL-6, IL-17 και IL-18 γονιδίων. Επίδραση της µόλυνσης µε SE στην έκφραση των κυτταροκινών Για να διερευνηθεί εάν η έκφραση των κυτταροκινών στους όρχεις επάγεται σε απάντηση προς τη µόλυνση µε SE, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικοποίηση της έκφρασης µέσω της Real-Time PCR. Για την πραγµατοποίηση αυτών των µετρήσεων αποµονώθηκε RNA από όρχεις αρσενικών που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης, ηλικίας 28 εβδοµάδων, τόσο µολυσµένων µε SE, όσο και µαρτύρων (PBS). Τα αποτελέσµατα της ανάλυσης απεικονίζονται στο Διάγραµµα 21. 126

14 ** Relative expression 12 10 8 6 4 * * ** ** 2 0 IL-1! IL-6 IL-8 IL-12 IL-15 IL-16 IL-17 IL-18 IFNg NOX1 Διάγραµµα 21. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στους όρχεις µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (*P < 0.05, **P < 0.01). Μετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β- ακτίνη, τα αποτελέσµατα της Real-Time PCR έδειξαν, ότι η µόλυνση µε SE στους όρχεις, είχε ως αποτέλεσµα µία σηµαντική (P<0.05) επαγωγή των επιπέδων της έκφρασης των IL-1β, IL-6, IL-12, IL-18 και IFNg στους όρχεις των µολυσµένων, ηλικίας 28 εβδοµάδων αρσενικών, σε σύγκριση µε των υγιών της ίδιας ηλικίας. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) µεταβολές για τα γονίδια IL-8, IL-15, IL-16, IL-17 και NOX1 στους όρχεις µολυσµένων, ηλικίας 28 εβδοµάδων αρσενικών. 3.3.5. Έκφραση των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα Για να διερευνηθεί το πρότυπο έκφρασης των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα, πραγµατοποιήθηκε RT-PCR ανάλυση χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε από την επιδιδυµίδα αναπαραγωγικά ώριµων αρσενικών, ηλικίας 52 εβδοµάδων. Tα 127

αποτελέσµατα των αναλύσεων της RT-PCR απεικονίζονται στην Εικόνα 17. Εικόνα 17. Έκφραση των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα αρσενικών, 52 εβδοµάδων, µέσω της RT-PCR. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της RT-PCR ανάλυσης στην επιδιδυµίδα εκφράζονται τα γονίδια IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFNγ και NOX1, ενώ δεν εντοπίστηκαν mrna µεταγραφήµατα για τα γονίδια IL-2 και IL-4. Επίδραση της ηλικίας ενήβωσης στην έκφραση των κυτταροκινών Με σκοπό να διαπιστωθεί, εάν η αναπαραγωγική ηλικία επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων mrna των γονιδίων που εκφράζονται, µέσω της Real- Time PCR, στην επιδιδυµίδα αρσενικών, ηλικίας 26, 52 και 104 εβδοµάδων. Όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των κυτταροκινών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωριµότητας, απεικονίζονται στο Διάγραµµα 22. 128

Διάγραµµα 22. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα αρσενικών, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ωρίµανσης. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Τα ίδια γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική. Διαφορετικά γράµµατα υποδεικνύουν ότι η διαφορά είναι στατιστικά σηµαντική (Ρ <0,05). Σύµφωνα µε το Διάγραµµα 22, η ανάλυση της ποσοτικοποίησης, µέσω της Real- Time PCR, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, έδειξε µία σηµαντική (P<0.05) µείωση των επιπέδων έκφρασης για τα γονίδια IL-6, IL-10, IL-17, IFNg και NOX1 στην επιδιδυµίδα των αναπαραγωγικά ώριµων και γερασµένων αρσενικών, ηλικίας 52 και 104 εβδοµάδων αντιστοιχα, σε σύγκριση µε των 129

26 εβδοµάδων. Επίσης, σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της Real-Time PCR, παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική (P<0.05) µείωση των επιπέδων της έκφρασης για τα γονίδια IL-15 και IL-16 στην επιδιδυµίδα των αρσενικών ηλικίας 104 εβδοµάδων, σε σύγκριση µε τα υπόλοιπα αναπαραγωγικά στάδια. Επίσης, εντοπίστηκε σηµαντική (P<0.05) αύξηση των επιπέδων της έκφρασης του γονιδίου IL-18, στην επιδιδυµίδα των αναπαραγωγικά ώριµων και γερασµένων αρσενικών. Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές µεταβολές (P >0.05), για τα διάφορα στάδια της αναπαραγωγικής ηλικίας, σχετικά µε τα επίπεδα έκφρασης των IL-1β, IL-8 και IL-12. Επίδραση της µόλυνσης µε SE στην έκφραση των κυτταροκινών Για να διερευνηθεί εάν η έκφραση των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα επάγεται σε απάντηση προς τη µόλυνση µε Salmonella enteriditis, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικοποίηση µέσω της Real-Time PCR. Για την πραγµατοποίηση αυτών των µετρήσεων αποµονώθηκε RNA από την επιδιδυµίδα αρσενικών που βρίσκονταν στην αρχή της ενήβωσης, ηλικίας 28 εβδοµάδων, τόσο µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis, όσο και κατεργασµένων µε PBS (µάρτυρες). Τα αποτελέσµατα της ανάλυσης απεικονίζονται στο Διάγραµµα 23. 130

8 7 ** ** * Relative expression 6 5 4 3 2 * * 1 0 IL-1! IL-6 IL-8 IL-10 IL-12 IL-15 IL-16 IL-17 IL-18 IFNg NOX1 Διάγραµµα 23. Αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στην επιδιδυµίδα µολυσµένων µε Salmonella Enteritidis αρσενικών, ηλικίας 28 εβδοµάδων. Τα επίπεδα της έκφρασης των mrna µεταγραφηµάτων των κυτταροκινών υπολογίστηκαν, χρησιµοποιώντας την ποσοτική ανάλυση της Real-Time PCR. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τη µέση τιµή ± SEM (n = 4). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν ότι η διαφορά στα επίπεδα έκφρασης είναι στατιστικά σηµαντικά διαφορετική (*P < 0.05, **P < 0.01). Σύµφωνα µε το Διάγραµµα 23, οι µετρήσεις της Real-Time PCR, µετά την κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων ως προς το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, υποδήλωσαν, ότι η µόλυνση µε Salmonella Enteritidis στην επιδιδυµίδα των ορνιθίων, είχε ως αποτέλεσµα µία σηµαντική (P<0.05) επαγωγή των επιπέδων της έκφρασης των IL-1β, IL-6, IL-12, IL-16 και IL-18 στην επιδιδυµίδα των µολυσµένων, ηλικίας 28 εβδοµάδων αρσενικών, σε σύγκριση µε τα υγιή αρσενικά της ίδιας ηλικίας, ενώ δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές (P>0.05) µεταβολές για τα γονίδια IL-8, IL-10, IL-15, IL-17, IFNg και NOX1. 3.3.6. Έκφραση των κυτταροκινών στα κύτταρα Sertoli Με σκοπό τη µελέτη του πρότυπου έκφρασης των κυτταροκινών στα κύτταρα Sertoli, πραγµατοποιήθηκε RT-PCR ανάλυση χρησιµοποιώντας RNA που αποµονώθηκε 131

από in vitro καλλιέργειες κυττάρων Sertoli. Tα αποτελέσµατα των RT-PCR αναλύσεων απεικονίζονται στην Εικόνα 18. Εικόνα 18. Έκφραση των κυτταροκινών στα κύτταρα Sertoli, µέσω της RT-PCR. Σύµφωνα µε την Εικόνα 18, η RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι τα γονίδια IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18 και IFNγ εκφράζονται στα κύτταρα Sertoli, ενώ δεν εντοπίστηκαν mrna µεταγραφήµατα για τα IL-2, IL-4, IL-10, IL-16 και NOX1 γονίδια. Επίδραση της επώασης µε LPS στην έκφραση των κυτταροκινών Για να προσδιοριστεί η επίδραση του LPS στα επίπεδα έκφρασης των κυτταροκινών στα κύτταρα Sertoli, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των επιπέδων έκφρασής τους, µετά από 0, 6, 12, 24 και 48 ώρες επώασης µε LPS. Η κανονικοποίηση των αποτελεσµάτων των γονιδίων στόχων έγινε ως προς τον εσωτερικό µάρτυρα που είναι το γονίδιο αναφοράς, β-ακτίνη, ενώ όλες οι µετρήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε τουλάχιστον τέσσερις επαναλήψεις. Οι αλλαγές των επιπέδων της έκφρασης των γονιδίων IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18 και IFNγ στα κύτταρα Sertoli, µετά από 0, 6, 12, 24 και 48 ώρες επώασης µε LPS, απεικονίζονται στο Διάγραµµα 24. 132