ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΠΑΣΙΑΡΗΣ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΣΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΧΗΜΕΙΟΤΑΞΙΑΣ ΣΕ ΣΗΠΤΙΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΥΞΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΕ ΟΥΔΕΤΕΡΟΠΕΝΙΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΗΨΗ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΔΙΟΝ. ΔΑΝΙΚΑ ΙΑΤΡΟΥ-ΠΑΘΟΛΟΓΟΥ ΠΑΤΡΑ 2010

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γώγος Χαράλαμπος, Καθηγητής Παθολογίας Καλόφωνος Χαράλαμπος, Καθηγητής Παθολογίας Ογκολογίας Καρακάντζα Μαρίνα, Αν. Καθηγήτρια Αιματολογίας ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γώγος Χαράλαμπος, Καθηγητής Παθολογίας Καλόφωνος Χαράλαμπος, Καθηγητής Παθολογίας Ογκολογίας Καρακάντζα Μαρίνα, Αν. Καθηγήτρια Αιματολογίας Χρυσανθόπουλος Κωνσταντίνος, Καθηγητής Παθολογίας Κυριαζοπούλου Βενετσάνα, Καθηγήτρια Ενδοκρινολογίας Μαραγκός Μάρκος, Αν. Καθηγητής Λοιμωξιολογίας Πάνος Γεώργιος, Επ. Καθηγητής Λοιμωξιολογίας 2

Πρόλογος Πρωτίστως, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Παθολογίας κ. Χαράλαμπο Γώγο, αφενός για την τιμή που μου έκανε αφετέρου για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε στην ανάθεση της διατριβής αυτής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Καθηγητή Παθολογίας Ογκολογίας κ. Χαράλαμπο Καλόφωνο για την συνεχή καθοδήγηση και συμπαράσταση καθόλη την διάρκεια της έρευνας. Όλη η ερευνητική δουλειά πραγματοποιήθηκε στο Αιματολογικό εργαστήριο Κυτταρομετρίας - Pοής του Τμήματος Κλινικής Αιματολογίας με υπεύθυνη την Αν. Καθηγήτρια κ. Μαρίνα Καρακάντζα, την οποία ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που έδειξε στο άτομό μου. Οι συνεχείς συμβουλές της, η καθοδήγησή της και η αμέριστη ηθική συμπαράστασή της στην διάρκεια αυτών των ετών υπήρξαν για μένα τεράστιας σημασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Γεώργιο Θεοδώρου, Χημικό συνεργάτη του Αιματολογικού τμήματος και του Εργαστηρίου Κυτταρομετρίας ροής που με μύησε στον χώρο της έρευνας, για τη συνεχή καθοδήγηση και φιλία του. Τα υπόλοιπα μέλη της Επταμελούς Επιτροπής για τις πολύτιμες συμβουλές τους κατά τη συγγραφή της διδακτορικής μου διατριβής. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την αγάπη, την ηθική υποστήριξη και την αγόγγυστη συμπαράσταση που μου παρείχε καθόλη τη διάρκεια της μελέτης. 3

Στον πατέρα μου Στη μητέρα μου 4

«ην γάρ παρή φιλανθρωπίη, πάρεστι καί φιλοτεχνίη» «γιατί εκεί που υπάρχει αγάπη για τον άνθρωπο, υπάρχει και αγάπη για την επιστήμη» «Ιπποκράτης» 5

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ..... 3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ..... 6 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ.....9 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ...10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ..... 12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ -ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ... 14 ΟΝΟΜΑΤΟΛΟΓΙΑ... 15 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ...... 18 Φάσεις ειδικής ανοσολογικής απάντησης...... 20 Κύτταρα ανοσοποιητικού συστήματος...... 21 Τ-κύτταρα μνήμης..... 22 Ν-Κ κύτταρα..... 22 Χυμική ανοσιακή απάντηση... 24 H ΣΥΝΕΡΓΑΣΊΑ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ 29 ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗ ΤΟΥ ΞΕΝΙΣΤΗ ΣΤΗ ΣΗΨΗ Σήψη από εξωκυττάρια βακτήρια... 32 Σήψη από ενδοκυττάρια βακτήρια.. 33 ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΣΗΨΗ Επεξεργασία και παρουσίαση του αντιγόνου.. 35 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΟΥΔΕΤΕΡΟΦΙΛΩΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΟΠΥΡΗΝΩΝ ΣΤΗ ΣΗΨΗ. 37 Ο ρόλος του αγγειακού ενδοθηλίου στην σήψη.. 40 6

Ο ρόλος του νιτρικού οξειδίου στην σήψη. 42 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΣΗΨΗ 45 scd14.. 46 Toll-Like receptors..47 ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ Ταξινόμηση-βιολογικός ρόλος 52 ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΣΗΨΗ. 55 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΑΥΞΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΤΗΝ ΕΜΠΥΡΕΤΟ ΟΥΔΕΤΕΡΟΠΕΝΙΑ ΚΑΙ ΣΤΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ Δομή-βιολογική δράση 58 Η χρήση των αυξητικών παραγόντων στις λοιμώξεις. 61 Τοξικότητα - παρενέργειες.. 63 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ Επιλογή των ασθενών. 65 Εκτίμηση και παρακολούθηση των ασθενών.. 68 ΜΕΘΟΔΟΙ Μέθοδος προσδιορισμού φαγοκυτταρικής ικανότητας.. 70 Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής... 71 Μέθοδος προσδιορισμού της έκφρασης των αντιγόνων επιφανείας CD14 και CD64 στα μονοκύτταρα.. 71 Μέθοδος προσδιορισμού χημειοτακτικής δραστηριότητας 72 Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής... 74 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ... 76 7

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χαρακτηριστικά των μελετηθέντων ασθενών 77 Φαγοκυτταρική δραστηριότητα σε ασθενείς με βαριά σήψη.. 81 Χημειοτακτική δραστηριότητα σε ασθενείς με βαριά σήψη.. 81 Έκφραση του CD64 στα πολυμορφοπύρηνα και στα μονοκύτταρα σε ασθενείς με βαρειά σήψη.. 85 Έκφραση του CD14 στα μονοκύτταρα σε ασθενείς με βαρειά σήψη. 85 Η φαγοκυτταρική δραστηριότητα σε ουδετεροπενικούς ασθενείς με σήψη 85 Συσχετίσεις...... 86 Κλινική σημασία των ανοσολογικών παραμέτρων. 89 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 91 ΠΕΡΙΛΗΨΗ.... 97 SUMMARY.........98 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.. 100 8

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1. Μονοκλωνικά αντισώματα για την μελέτη του ανοσοφαινότυπου επιφανείας...72 Πίνακας 2. Χαρακτηριστικά επιβιωσάντων και αποβιωσάντων ασθενών με βαρειά σήψη.79 Πίνακας 3. Απομονωθέντες μικροοργανισμοί σε ασθενείς με βαρειά σήψη....80 Πίνακας 4. Χαρακτηριστικά ογκολογικών ασθενών με εμπύρετο ουδετεροπενία και σήψη..80 Πίνακας 5. Απομονωθέντες μικροοργανισμοί σε ογκολογικούς ασθενείς με εμπύρετο ουδετεροπενία.....81 Πίνακας 6. Φαγοκυτταρική δραστηριότητα των PMN και των μονοκυττάρων καθώς και έκφραση των CD14, CD64 στα μακροφάγα στους επιβιώσαντες ασθενείς, στους αποβιώσαντες και στην ομάδα ελέγχου κατά την εισαγωγή τους στο Νοσοκομείο.. 83 Πίνακας 7. Η αντιγονική έκφραση των δεικτών επιφανείας καθώς και η φαγοκυτταρική δραστηριότητα των μακροφάγων στους επιζήσαντες ασθενείς την ημέρα εισαγωγής και την ημέρα εξιτηρίου..... 84 Πίνακας 8. ROC curve ανάλυση για την εκτίμηση της προγνωστικής αξίας, όσον αφορά την τελική έκβαση, των σημαντικότερων παραμέτρων (έκφρασης του CD64 στα πολυμορφοπύρηνα και στα μονοκύτταρα καθώς και της φαγοκυτταρικής δραστηριότητας των PMN)..... 88 9

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 1. Η ενεργοποίηση του Β - κυττάρου παρόμοια με εκείνη του Τ - κυττάρου.....25 Σχήμα 2. Η παρουσίαση του Ag μέσω του Β κυττάρου στα ΤΗ. Ο ρόλος του CD4-/CD40L...27 Σχήμα 3. Ενεργοποίηση του Β-κυττάρου μέσω APCs ο ρόλος της IL-10, IL-13.......28 Σχήμα 4. Η έναρξη της ανοσολογικής απάντησης στα gram (+) και gram (-) βακτήρια και ο ρόλος του CD-14 σε αυτήν...50 Σχήμα 5. Ο ρόλος των TLRs στην ανοσολογική απόκριση....51 Σχήμα 6. Η έκφραση των CD-14, CD-64 στα μονοκύτταρα & PMN σε επιζώντα ασθενή και στο ισοτυπικό control 75 Σχήμα 7. Η φαγοκυτταρική δραστηριότητα των PMN και των μονοκυττάρων στους επιζώντες, στους αποβιώσαντες, και στην ομάδα ελέγχου. 82 Σχήμα 8Α,Β. Συσχέτιση ανάμεσα στην φαγοκυτταρική δραστηριότητα των PMN και της αντιγονικής έκφρασης του CD64 στα μονοκύτταρα και στα PMN.. 87 Σχήμα 9. Συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του αντιγονικού δείκτη CD64 στα μονοκύτταρα και στα πολυμορφοπύρηνα την ημέρα εισαγωγής.... 88 10

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η σήψη είναι μία συστηματική φλεγμονώδη διαδικασία ως απάντηση σε ιογενείς ή μικροβιακές λοιμώξεις και η οποία διακρίνεται ανάλογα με την βαρύτητά της σε σήψη, βαριά σήψη και σηπτικό shock (1). Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι η σήψη χαρακτηρίζεται αρχικά από μία φάση όπου απελευθερώνονται κυττοκίνες που επάγουν την φλεγμονή (SIRS), για να ακολουθήσει στην συνέχεια η απελευθέρωση κυτταροκινών τύπου Ι και II (MARS) και τέλος το στάδιο της αντιρροπιστικής αντιφλεγμονώδους απάντησης (CARS,Compensatory antiinflammation response syndrome) που χαρακτηρίζεται από την απελευθέρωση αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών (typeii) (2). Η συστηματική απελευθέρωση των φλεγμονωδών κυτταροκινών ευθύνεται γαι τα συστηματικά συμπτώματα ασθενών με σήψη ενώ έχει συνδεθεί επίσης με την έκπτωση της λειτουργίας διαφόρων οργάνων και την υποογκαιμία (3,4). Χαρακτηριστικό της όλης της διεργασίας της σήψης είναι ότι η φάση της αντιφλεγμονώδους απόκρισης οδηγεί σε ανοσοπάρεση υπεύθυνη για την εμφάνιση δευτεροπαθών λοιμώξεων απειλητικών για τη ζωή αλλά και για την αύξηση της θνητότητας. Οι ανοσολογικές μεταβολές κατά την διάρκεια του CARS προκαλούνται κυρίως από IL-10 και περιλαμβάνουν έκπτωση της λειτουργίας των μονοκυττάρων καθώς και ελαττωμένη έκφραση των αντιγόνων ιστοσυμβατότητας HLA- DR (4, 5,6). Τα τελευταία χρόνια έγιναν διάφορες προσπάθειες εκτίμησης της προγνωστικής ικανότητας των διαφόρων κυτταροκινών που εμπλέκονται στα διάφορα στάδια της σήψης. Ο λόγος IL-10/TNF-α φαίνεται ότι αφενός μπορεί να διακρίνει το SIRS από το CARS αφετέρου αποτελεί περισσότερο αξιόπιστο δείκτη για την έκβαση ασθενών με σήψη απ ότι η μέτρηση των κυτταροκινών (7-12). Ωστόσο η μέτρηση των κυτταροκινών δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ευρέως στην κλινική πράξη για τεχνικούς λόγους ενώ επιπλέον κλινικές μελέτες αναφέρουν ότι η χρήση αντι-tnf-α και αντι- IL-1 δεν βελτίωσε την πρόγνωση των ασθενών (13-14). Πρόσφατα δεδομένα δηλώνουν ότι κατά την διάρκεια της φλεγμονώδους απόκρισης υπάρχει αύξηση της έκφρασης του CD64 στην επιφάνεια των πολυμορφοπυρήνων(15,16) που επάγεται μέσω της σύνδεσης του λιποπολυσακχαρίτη 12

LPS ή της πεπτιδογλυκάνης με το CD14 της επιφάνειας των μονοκυττάρων,όπως και μέσω της IFN-γ, G-CSF κ.ά. (17-21). Έχει δε παρατηρηθεί ότι αύξηση της έκφρασης του υποδοχέα CD64 στην επιφάνεια των πολυμορφοπυρήνων μετά από χορήγηση G-CSF σε μη σηπτικούς ασθενείς, έχει συνδεθεί με αυξημένη φαγοκυτταρική δραστηριότητα, ενώ σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία ευνοεί την προσκόλληση στο αγγειακό ενδοθήλιο (15, 22). Μέχρι τώρα δεν έχει διευκρινισθεί αν η αύξηση της έκφρασης του CD64 στα PMNs και στα μονοκύτταρα μπορεί να συνδεθεί με αύξηση της φαγοκυτταρικής δραστηριότητας. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η εκτίμηση της φαγοκυτταρικής και χημειοτακτικής δραστηριότητας σε σηπτικούς ασθενείς και η προγνωστική τους αξία όσον αφορά την επιβίωση. Ασθενείς με βαριά σήψη εκτιμήθηκαν εντός 24 ωρών από την είσοδό τους στο νοσοκομείο για 1) την φαγοκυτταρική δραστηριότητα των μονοκυττάρων και των ουδετεροφίλων 2) την χημειοτακτική ικανότητα των πολυμορφοπυρήνων 3) την έκφραση του CD64 στα μονοκύτταρα και στα ουδετερόφιλα και 4) την έκφραση του αντιγόνου επιφανείας CD14 στα μονοκύτταρα. Οι επιβιώσαντες ασθενείς εκτιμήθηκαν και κατά την έξοδό τους. Επίσης, διερευνήθηκε πιθανή συσχέτιση των αποτελεσμάτων τόσο μεταξύ τους όσο και με την επιβίωση των ασθενών. Επιπλέον διευρενήθηκε η επίδραση της χορήγησης αυξητικού παράγοντα GM-CSF σε ογκολογικούς ασθενείς με σοβαρή εμπύρετο ουδετεροπενία εντός 24 ωρών από την έναρξη των συμπτωμάτων και μελετήθηκε η φαγοκυτταρική δραστηριότητα πριν και μετά την χορήγηση του αυξητικού παράγοντα. 13

ΕΙΣΑΓΩΓΗ - ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Η σήψη είναι ένα πολύπλοκο σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από την παρουσία λοίμωξης και συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης, αποτελώντας ένα συστηματικό παράγοντα θνητότητας και θνησιμότητας. 750.000 νέες περιπτώσεις καταγράφονται ετησίως στις ΗΠΑ τοποθετώντας την σήψη ανάμεσα στις δέκα κυριότερες αιτίες θανάτου στις μονάδες εντατικής θεραπείας με ποσοστό θνητότητας 30-50% (23-26). Η επίπτωση της σήψης έχει αυξηθεί πάνω από 135% στο διάστημα των τελευταίων 10 ετών και συνεχίζει να αυξάνεται, γεγονός που οφείλεται εν μέρει στην αύξηση της αντοχής στα αντιβιωτικά.(23, 24, 27). Επιδημιολογική μελέτη της βαριάς σήψης στις ΗΠΑ σε όλες τις ηλικιακές ομάδες του πληθυσμού ανέδειξε το ποσοστό προσβολής των παιδιών σε 0.2 (θνητότητα 10%) ενώ σε άτομα >85 ετών, το ποσοστό προσβολής ανέρχεται σε 26.2 (θνητότητα 38.4%). Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα, το ετήσιο κόστος υπολογίζεται σε 22.100$/ασθενή επιβαρύνοντας τον ετήσιο προυπολογισμό κατά σχεδόν 17 δις δολλάρια.(28). Η υψηλή θνητότητα και το μεγάλο κόστος των υπηρεσιών υγείας που συνεπάγεται η σήψη, καθιστούν επιτακτική την ανάγκη για έγκαιρη διάγνωση και επιτυχή αντιμετώπιση. Παρόλα αυτά αδιαμφισβήτητο παραμένει το γεγονός ότι παρά την προσπάθεια κατανόησης των υποκείμενων παθοφυσιολογικών μηχανισμών και την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων, η εφαρμογή τους στην κλινική πράξη ελάχιστα έχει επηρεάσει την έκβαση των ασθενών. 14

ΟΝΟΜΑΤΟΛΟΓΙΑ Η πολυπλοκότητα του συνδρόμου της σήψης σε συνδυασμό με την ανάγκη της περιγραφής και της απόδοσης ενός ορισμού τόσο στην σήψη όσο και στα διάφορα στάδια της, οδήγησε το 1991 την Αμερικάνικη Πνευμονολογική Εταιρεία (American College Chest Physicians/ACCP) και την Εταιρεία Εντατικής Θεραπείας (Society of Critical Care Medicine/SCCM) να συγκαλέσουν συνάντηση συναίνεσης (Consensus Conference) με σκοπό την εισαγωγή ορισμών για την καλύτερη εννοιολογική και επιστημονική προσέγγιση της συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης του οργανισμού στην λοίμωξη (29). Με τη συνάντηση αυτή, ο Bone και η ομάδα του εισάγουν για πρώτη φορά τον όρο σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης (Systemic Inflammatory Reponse Syndrome/SIRS) που χαρακτηρίζεται ως γενικευμένη φλεγμονώδη αντίδραση του οργανισμού ανεξάρτητα από την αιτία που το προκαλεί, οφειλόμενη σε εντοπισμένη ή γενικευμένη λοίμωξη, τραύμα, θερμική βλάβη ή στείρα φλεγμονώδη βλάβη όπως η παγκρεατίτιδα. Παράλληλα προκύπτουν και άλλοι ορισμοί μαζί με τον επαναπροσδιορισμό ήδη γνωστών όρων όπως λοίμωξη, βακτηριαιμία, σήψη, βαρειά σήψη, σηπτικό shock, σήψη που προκαλεί υπόταση, σύνδρομο ανεπάρκειας πολλών οργάνων (MODS). Παραταύτα η αλληλεπικάλυψη των όρων οδήγησε όχι σπάνια σε σύγχυση καθιστώντας δυσχερή την κατανόηση τόσο της σήψης όσο και των σχετιζομένων με αυτή διαταραχών. Το 1997 εισάγονται οι ορισμοί CARS (Compensatory Antiinflammatory response syndrome, σύνδρομο αντισταθμιστικής αντιφλεγμονώδους απάντησης) και MARS (Mixed Antagonistic Response Syndrome, σύνδρομο μικτής ανταγωνιστικής αντίδρασης). Οι νέοι όροι ανταποκρίνονται στα νεότερα ερευνητικά δεδομένα που έδειξαν ότι αμέσως μετά την αρχική ανταπόκριση προφλεγμονωδών του ξενιστή, κυτταροκινών, που τίθεται περιλαμβάνει σε ενέργεια την απελευθέρωση μία αντιρροπιστική αντιφλεγμονώδη διαδικασία με σκοπό τον περιορισμό της προφλεγμονώδους απάντησης (CARS). Στην φάση αυτή παρατηρείται μείωση της έκφρασης των HLADR στα μονοκύτταρα (<30%) καθώς και ελαττωμένη παραγωγή των κυτταροκινών που επάγουν την φλεγμονή όπως TNF-a ή IL-6 (30). Η ισορροπία, αν επιτευχθεί, 15

μεταξύ φλεγμονώδους και αντιφλεγμονώδους αντίδρασης ονομάζεται MARS (mixed antagonistic response syndrome) (31). Το 2001 διοργανώθηκε ένα νέο Συνέδριο συναίνεσης από την Ευρωπαικη Εταιρεία Εντατικής Θεραπείας (ESICM), την Αμερικάνικη Πνευμονολογική Εταιρεία (ACCP), την Εταιρεία Εντατικής Θεραπείας (SCCM), την Εταιρεία Χειρουργικών Λοιμώξεων (SIS) και την Αμερικάνικη Εταιρεία Θώρακος (ΑTS) με σκοπό την επανεκτίμηση των κριτηρίων του προηγούμενου συνεδρίου, χωρίς τελικά να διαπιστωθεί ανάγκη αλλαγής των ορισμών. Επίσης στο συνέδριο προτάθηκε ένα νέο σύστημα ταξινόμησης των ασθενών με σήψη (PIRO), με βάση τους προδιαθεσικούς παράγοντες (Predisposition), τα χαρακτηριστικά της λοίμωξης (Infection), την απάντηση του οργανισμού (Response) και τον βαθμό της συνυπάρχουσας δυσλειτουργίας των οργάνων (Organ dysfunction) (32). Τα διαγνωστικά κριτήρια της σήψης όπως έχουν προσδιορισθεί είναι: Τεκμηριωμένη λοίμωξη ή πιθανή λοίμωξη και μερικά από τα ακόλουθα: Α) Γενικές μεταβλητές 1. θερμοκρασία >38.3 ή <36 2. σφύξεις >90/min 3. ταχύπνοια 4. πτώση επιπέδου συνείδησης 5. οίδημα ή ισοζύγιο υγρών θετικό (>20ml/kg το 24ωρο) 6. υπεργλυκαιμία (γλυκόζη πλάσματος>120mg/dl ή 7.7mmol/l) επί απουσίας σακχαρώδη διαβήτη Β) Φλεγμονώδεις μεταβλητές 1. λευκά αιμοσφαίρια.12.000/mm3 ή λευκά <4000/mm3 ή άωρες μορφές >10% 2. CRP(C- αντιδρώσα πρωτεΐνη >2 SDτης φυσιολογικής τιμής 3. προκαλσιτονίνη >2SD της φυσιολογικής τιμής Γ) Αιμοδυναμικές μεταβλητές 1. αρτηριακή υπόταση (συστολική ΑΠ<90mmHg, μέση ΑΠ<70mmHg ή μείωση της συστολικής αρτηριακής πίεσης ΑΠ>40mmHg) 2. κορεσμός οξυγόνου σε μεικτό φλεβικό αίμα >70% 3. καρδιακός δείκτης >3.5l/min Δ) Μεταβλητές δυσλειτουργίας οργάνων 1. αρτηριακή υποξαιμία (PαΟ2/FiO2 <300) 16

2. ελαττωμένη αποβολή ούρων (αποβολή ούρων <0.5ml/kg/hr ή 45mmol/l σε 2 h τουλάχιστον) 3. αύξηση κρεατινίνης >0.5mg/dl 4. διαταραχές πηκτικότητας 5. ειλεός 6. θρομβοπενία (αιμοπετάλια<100000/mm3) 7. αύξηση χολερυθρίνης πλάσματος >4mg/dl ή 70 mmol/l. Ε) Μεταβλητές ιστικής αιμάτωσης 1. υψηλό γαλακτικό οξύ(>1mmol/l) 2. μειωμένη ή διάστικτη τριχοειδική επαναιμάτωση. 17

ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ Η ανοσολογική απάντηση έχει ως πρωταρχικό σκοπό την αναγνώριση του ξένου παράγοντα-εισβολέα που μπορεί να είναι εξωγενής (μικρόβια) ή ενδογενής (καρκινωματώδες κύτταρο) και την αντίδραση εναντίον του μέσω διάφορων μηχανισμών, με σκοπό την εξάλειψή του. Η διάκριση της ανοσολογικής απόκρισης σε μη ειδική-φυσική ανοσία και ειδική-επίκτητη ανοσία, βασίζεται ουσιαστικά στην ειδικότητα και μνήμη που χαρακτηρίζει την δεύτερη. Η λειτουργία της φυσικής ανοσίας εξελίσσεται σε δύο (2) φάσεις: 1) την άμεση φάση (τις πρώτες 4 ώρες) και 2) πρώιμη (4 έως 96 ώρες) φάση που ακολουθεί. Η άμεση ανοσία ευθύνεται για την άμυνα του οργανισμού κατά τις πρώτες 4 περίπου ώρες από την εισβολή των παθογόνων και εξυπηρετείται κατά κύριο λόγο από τα επιθήλια τα οποία δεν αποτελούν μόνο απλούς φυσικούς φραγμούς έναντι των λοιμώξεων αλλά εκκρίνουν χημικές ουσίες με μικροβιοκτόνο δράση ή ουσίες που αναστέλλουν την ανάπτυξη των μικροβίων με χαρακτηριστικό παράδειγμα την λυσοζύμη. Η λυσοζύμη, μία ενδογλυκοσιδάση που υπάρχει στη σίελο, στη βλέννη και στα δάκρυα, προκαλεί διάσπαση της πεπτιδογλυκάνης, μιάς δικτυωτής μοριακής δομής που σχηματίζεται από εναλλασσόμενες Ν-ακετυλομουραμικές και Νακετυλογλυκοζαμινικές ρίζες συνδεόμενες με ομοιοπολικούς δεσμούς με τη βοήθεια βραχειών ολιγοπεπτιδικών πλευρικών αλυσίδων και που είναι το κύριο συστατικό του τοιχώματος όλων των βακτηρίων. Κατά αυτόν τον τρόπο η λυσοζύμη χαλαρώνει το βακτηριακό τοίχωμα καθιστώντας τα βακτήρια ευαίσθητα στην ωσμωτική λύση. Αντιβακτηριακά πεπτίδια, όπως οι ντιφενσίνες α, β στοχεύουν επίσης έναντι της μεμβράνης των μικροβιακών κυττάρων. Οι α-ντιφενσίνες HD-5, 6 παράγονται από τα κύτταρα του Paneth που βρίσκονται στη βάση των κρυπτών του λεπτού εντέρου ενώ οι β-ντιφενσίνες ανευρίσκονται σε διάφορα επιθήλια, κυρίως του αναπνευστικού συστήματος. Τα παθογόνα που επιτυγχάνουν να διαπεράσουν τον επιθηλιακό φραγμό, αναγνωρίζονται από τους υποδοχείς της φυσικής ανοσίας, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος και την ενεργοποίηση των φαγοκυττάρων και των ΝΚ-κυττάρων. Το σύνολο των μηχανισμών της φάσης αυτής 18

συνιστούν την πρώιμη ανοσία. Κατά τη διάρκεια της φάσεως αυτής παράγονται προϊόντα που επηρεάζουν και καθορίζουν την εξέλιξη της ειδικής ανοσιακής απάντησης, ενώ παράλληλα επιτυγχάνεται προσωρινή αναχαίτιση της λοίμωξης ώστε να δοθούν τα απαραίτητα χρονικά περιθώρια (περίπου 4 ημέρες) για την ανάπτυξη του ειδικού λεμφοκυτταρικού κλώνου. Αν η φυσική ανοσία δεν κατορθώσει να εξουδετερώσει την έκθεση του οργανισμού στις ξένες ουσίες, κινητοποιούνται οι μηχανισμοί της επίκτητης ή ειδικής ανοσίας. Η ειδική ανοσολογική απάντηση, εκδηλώνεται περίπου 4 ημέρες μετά από την επαφή με το αντιγόνο. Ανάλογα με τα στοιχεία του ανοσολογικού συστήματος που συμμετέχουν στην εκδήλωση της ανοσολογικής απάντησης, η ειδική ανοσία διακρίνεται σε χυμική(humoral) και κυτταρική ανοσία (cellular or cell-mediated immunity). Η χυμική ανοσία (humoral immunity), μεσολαβείται από τα αντισώματα που παράγονται από τα Β-λεμφοκύτταρα, έναν ειδικό υποπληθυσμό των λεμφοκυττάρων που μετά την επαφή τους με το αντιγόνο, μετατρέπονται σε πλασματοκύτταρα. Η χυμική ανοσία είναι ο κατ εξοχήν προστατευτικός μηχανισμός έναντι των εξωκυττάριων μικροβίων και των τοξινών τους. Στην κυτταρική ανοσία μεσολαβητές είναι ένας άλλος υποπληθυσμός των λεμφοκυττάρων, τα Τ λεμφοκύτταρα, που συνεργάζονται με τα φαγοκύτταρα για την εξουδετέρωση των μικροβίων. Η καταστροφή των ενδοκυττάριων βακτηρίων και ιών εξυπηρετείται από την κυτταρική ανοσία.(33). 19

Φάσεις ειδικής ανοσολογικής απάντησης Α) Η φάση αναγνώρισης όπου το ξένο αντιγόνο συνδέεται με ειδικούς υποδοχείς που φέρουν τα λεμφοκύτταρα στην επιφάνειά τους, πριν την ενεργοποίησή τους. Τα Β-κύτταρα φέρουν στην μεμβράνη τους μόρια αντισωμάτων που μπορούν να συνδέονται με ξένες πρωτεΐνες πολυσακχαρίτες ή λιπίδια, ενώ τα Τλεμφοκύτταρα, τα κατ εξοχήν κύτταρα της κυτταρικής ανοσίας εκφράζουν υποδοχείς που αναγνωρίζουν αποκλειστικά μόνο μικρές πεπτιδικές αλληλουχίες των πρωτεϊνικών αντιγόνων που φέρονται στην επιφάνεια άλλων κυττάρων. Β) Η φάση ενεργοποίησης περιλαμβάνει τον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των λεμφοκυττάρων. Συγκεκριμένα τα Β-κύτταρα που αναγνωρίζουν το αντιγόνο, διαφοροποιούνται σε κύτταρα που παράγουν αντισώματα για να συνδεθούν στη συνέχεια με τα αντίστοιχα διαλυτά (εξωκυττάρια) αντιγόνα και κινητοποιούν τους μηχανισμούς που τα εξουδετερώνουν. Αντίστοιχα, τα Τ-κύτταρα διαφοροποιούνται σε κύτταρα που ενεργοποιούν τα φαγοκύτταρα προς εξουδετέρωση των ενδοκυττάριων μικροβίων, ενώ άλλα Τ-κύτταρα προκαλούν άμεση λύση των κυττάρων. Χαρακτηριστικό της ενεργοποίησης των λεμφοκυττάρων είναι ότι συνήθως προϋποθέτει την ύπαρξη δύο μηνυμάτων ενός που παρέχεται από το αντιγόνο και ενός δευτέρου που παρέχεται από τα Τ helper κύτταρα (υποπληθυσμός των Τ-λεμφοκυττάρων) ή τα accessory cells (συνοδά κύτταρα) που είναι κύτταρα μη λεμφικής προέλευσης. Γ) Η δραστική φάση χαρακτηρίζεται από την εκδήλωση της δράσης απέναντι από αντιγόνο κυρίως μέσω των ανοσοδραστικών λεμφοκυττάρων (effector cells). Επίσης, ενεργοποιούνται μηχανισμοί φυσικής ανοσίας ενώ συμμετέχουν και κύτταρα μη λεμφικής σειράς. Τα αντισώματα συνδεόμενα με τα αντιγόνα, υποβοηθούν τη φαγοκυττάρωσή τους από τα ουδετερόφιλα και μονοπύρηνα φαγοκύτταρα ενώ παράλληλα ενεργοποιούν το σύστημα του συμπληρώματος που με τη σειρά του υποβοηθεί τη φαγοκυττάρωση. Άλλα αντισώματα διεγείρουν την αποκοκκίωση των ιστοκυττάρων και την απελευθέρωση μεσολαβητών της φλεγμονής, ενώ τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα εκκρίνουν τις κυτταροκίνες ενισχύοντας τη δράση των φαγοκυττάρων και κινητοποιώντας τη φλεγμονώδη αντίδραση (34). 20

Κύτταρα ανοσοποιητικού συστήματος Η διάκριση των υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων επιτυγχάνεται μέσω συγκεκριμένων συνδυασμών πρωτεϊνών (clusters of differentiation, CD) που εκφράζουν στην μεμβράνη τους. Οι παραπάνω συνδυασμοί χρησιμοποιούνται ως φαινοτυπικοί δείκτες για το διαχωρισμό τους στους δύο μεγάλους υποπληθυσμούς, τα Β και Τ λεμφοκύτταρα. Στα Β λεμφοκύτταρα, που παράγονται και ωριμάζουν στο μυελό των οστών, η αλληλεπίδραση των αντιγόνων με τις μεμβρανικές ανοσοσφαιρίνες προκαλεί την ενεργοποίησή τους και διαφοροποίησή τους στα πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν διαλυτές ανοσοσφαιρίνες. Όσον αφορά τα Τλεμφοκύτταρα, οι υποδοχείς τους για τα Ag (T-cell receptors), είναι ειδικά μεμβρανικά μόρια, δομικά ανάλογα με τις ανοσοσφαιρίνες. Διακρίνονται στα Τhelper(ΤH) κύτταρα που φέρουν στην επιφάνειά τους το μόριο CD4 και τα Τ- κυτταροτοξικά κύτταρα που χαρακτηρίζονται από το CD8. Τα Τ-λεμφοκύτταρα δεν αναγνωρίζουν διαλυτά Ag αλλά μόνο αντιγονικά πεπτίδια που φέρονται στην επιφάνεια των αντιγονοπαρουσιαστών κυττάρων μέσω σύνδεσης με πρωτεΐνες του MHC. Η ανταπόκριση των ΤH στον αντιγονικό ερεθισμό έχει ως αποτελέσματα την έκκριση κυτταροκινών, οι οποίες προάγουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση τόσο των Τ-λεμφοκυττάρων όσο και των Β-λεμφοκυττάρων και των μακροφάγων (35). Συγκεκριμένα μετά την ενεργοποίησή τους, τα ώριμα Τ-κύτταρα διακρίνονται σε ΤH1 και ΤH2 ανάλογα με τις κυτταροκίνες που παράγουν.τα ΤH1 παράγουν IL-2, IFN-γ και TNF-B. Tα ΤΗ2 εκκρίνουν IL-4, 5, 6, 10, 13 οι οποίες δρουν ως χημειοτακτικοί παράγοντες των Β-κυττάρων, των ιστοκυττάρων και των βασεόφιλων, ενώ προάγουν ταυτόχρονα την ωρίμανση και τη διαφοροποίησή τους (36). Επιπλέον οι κυτταροκίνες που παράγονται από κάθε έναν από τους δύο υποπληθυσμούς ΤH1 και ΤH2 κυττάρων, προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης του άλλου. Η παραγόμενη από τα Τ helper -1 κύτταρα IFN-γ, αναστέλλει την ανάπτυξη TH2 ενώ η IL-4 αναστέλλει την ανάπτυξη των ΤΗ1 κυττάρων με αποτέλεσμα να επικρατεί τελικά ένας συγκεκριμένος υποπληθυσμός ΤΗ κυττάρων (37). Τα κυτταρολυτικά (CTLs) κύτταρα εμφανίζουν κατά κανόνα το μόριο CD8, αναγνωρίζουν πεπτίδια που παράγονται από την ενδογενή οδό επεξεργασίας του 21

αντιγόνου και παρουσιάζονται σε σύνδεση με τα MHC-I μόρια αποτελώντας το βασικό μηχανισμό άμυνας έναντι ιών αλλά και άλλων ενδοκυττάριων παθογόνων, όπως τα μυκοβακτηρίδια και η Listeria. Η ανάπτυξη της κυτταροτοξικής τους δράσης χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση κυτταροπλασματικών κοκκίων που περιέχουν περφορίνη και ένζυμα της οικογένειας των πρωτεασών σερίνης για να ακολουθήσει στη συνέχεια η απελευθέρωση του περιεχομένου των κοκκίων προς το κύτταρο στόχο (38). Τ-κύτταρα μνήμης Ενας μικρός αριθμός τόσο των βοηθητικών όσο και των κυτταρολυτικών Τκυττάρων μετά από την επαφή τους με το Ag μετατρέπονται σε Τ-κύτταρα μνήμης. Τα Τ-κύτταρα μνήμης παραμένουν στον οργανισμό επί σειρά ετών, πολλαπλασιάζονται ταχύτερα, απαντούν στο αντιγονικό ερέθισμα με παρατεταμένη αύξηση του αριθμού των Τ-κυττάρων που εκφράζουν ειδικό TCR και παράγουν ευρύτερο φάσμα κυτταροκινών. Επίσης, τα Τ-κύτταρα μνήμης εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα μορίων προσκόλλησης, με αποτέλεσμα ισχυρότερη προσκόλληση στα APCs, γεγονός που τα καθιστά ικανά να απαντούν σε μικρότερη συγκέντρωση αντιγόνου (39). Ν-Κ κύτταρα Τα Ν-Κ κύτταρα αποτελούν βασικό μηχανισμό άμυνας έναντι ιών και των ενδοκυττάριων βακτηρίων (μυκοβακτήρια, listeria monocytogenes). Τα Ν-Κ κύτταρα ενεργοποιούνται είτε άμεσα, είτε μέσω IL-12, η οποία σε συνεργεία με τον TNF-α επάγει την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων IFN-γ από τα ΝΚ-κύτταρα. Τα ΝΚκύτταρα διαθέτουν κυτταροπλασματικά κοκκία που περιέχουν περφορίνες και ένζυμα που καταστρέφουν εκλεκτικά, αυτόλογα κύτταρα που έχουν υποστεί μείωση της έκφρασης των MHC μορίων τάξης Ι (39). Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του CD16 (FcγRIII) χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση των ΝΚ κυττάρων σε παρθένους λεμφοκυτταρικούς πληθυσμούς. Τα CD16 εμπλέκονται στην ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων και εκφράζονται επίσης σε ουδετερόφιλα, μερικά μακροφάγα και μερικά γδ-τ κύτταρα. Το CD56 μόριο προσκόλλησης, μέλος της υπεροικογένειας Ιg (N-CAM), είναι ένας άλλος σημαντικός δείκτης των ΝΚ κυττάρων. Η απουσία του CD3 αλλά και η ύπαρξη 22

CD56±CD16 είναι χαρακτηριστικά των ΝΚ κυττάρων στον άνθρωπο, αν και οι δύο δείκτες απαντώνται σε ένα μικρό πληθυσμό των Τ-κυττάρων (CD3+/CD8+ φαινότυπος) (40). Απ ευθείας διέγερση με IL-2 οδήγησε ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων καθώς φέρουν υποδοχέα για IL-2 (IL-2 receptor, β-chain). Ο υποδοχέας αυτός απαντάται σε όλα τα Τ-κύτταρα που είχαν κοκκιώδη μορφολογία λεμφοκυττάρων (large granular morphology, LGL) και συγκεκριμένα σε ποσοστό < 5% των CD4+ Tκυττάρων και σε ποσοστό 30-50% CD8+ T-κυττάρων. Όλα τα παραπάνω κύτταρα που αναπαράγονται σε διέγερση με ΙL-2 είναι γνωστά και ως LAK cells (lymphokine activated killer cells)(40). Σημαντική επίσης είναι η δομή και η δράση των ανασταλτικών υποδοχέων των ΝΚ-κυττάρων οι οποίοι διακρίνονται σε δύο κυρίως τύπους: α) γλυκοπρωτείνες μεμβράνης τύπου 2 με μία περιοχή λεκτίνης C-type β) μέλη της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών αναφερόμενα και ως KIRs (killer immunoglobulin-like receptors). (41). Τα μέλη της β οικογένειας, αναλόγως αν έχουν δύο ή τρείς Ig περιοχές (KIR2D ή KIR3D) ορίζονται ως CDI58 και ως p70 αντίστοιχα. (42). Δύο μέλη της KIR2D οικογένειας αναγνωρίζουν πολυμορφικούς καθοριστές των HLA-C μορίων και έχουν ανασταλτική δράση, ενώ άλλοι ισότυποι KIRS διακρίνουν τα αλληλόμορφα γονίδια των HLA μορίων με μικρότερη συγγένεια από ότι αυτοί με ανασταλτική δράση. Ο CDR4 lectin like receptor είναι χαρακτηριστικός υποδοχέας των ΝΚ κυττάρων και συνδέεται με δισουλφιδικούς δεσμούς με μόρια της NKG2 οικογένειας (ΝΚG2A έως ΝΚG2F) σχηματίζοντας δημερή που έχουν είτε ανασταλτική (CD94 NK-G2a) δράση μπλοκάροντας έτσι την μέσω ΝΚ κυττάρων κυτταροτοξικότητα, είτε υποδοχείς ενεργοποιητές των ΝΚ κυττάρων (CD94-NK G2C) (41). 23

Χυμική ανοσιακή απάντηση Η χυμική ανοσολογική απάντηση μεσολαβείται από τα αντισώματα που παράγονται από κύτταρα της Β-λεμφοκυτταρικής σειράς με στόχο την εξουδετέρωση και την καταστροφή των αντιγόνων που προκάλεσαν την παραγωγή τους. Βασικό χαρακτηριστικό της χυμικής ανοσολογικής απάντησης είναι η αλληλεπίδραση των αντιγόνων με μικρό αριθμό ωρίμων, ειδικών για το κάθε αντιγόνο, Β-κυττάρων που εκφράζουν στη μεμβράνη της IgM και IgD. Αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης των αντιγόνων με τα Β-κύτταρα είναι η ενεργοποίηση των τελευταίων και η παραγωγή των αντίστοιχων αντισωμάτων. Τα θυμοεξαρτώμενα πρωτεϊνικά Ag επάγουν δύο τύπους απάντησης των Βκυττάρων. 1) Διεγείρουν ενδοκυττάριους μεταβιβαστές μηνυμάτων, οι οποίοι κινητοποιούν τον κυτταρικό κύκλο στα ήρεμα Β-κύτταρα, προετοιμάζοντάς τα ταυτόχρονα να απαντήσουν στα μηνύματα των ΤH κυττάρων. 2) Τα αντιγόνα ενδοκυτταρώνονται από τα Β-κύτταρα, τα οποία τα επεξεργάζονται και τα παρουσιάζουν στα ειδικά ΤH που ενεργοποιούνται με τη σειρά τους στο σημείο αλληλεπίδρασης του αντιγόνου με το Β-κύτταρο. Ο παραπέρα πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση των Β-κυττάρων είναι αποτέλεσμα της διέγερσής τους από τα ΤΗ και τα προϊόντα που εκκρίνουν. Η σύνδεση του αντιγόνου με το σύμπλεγμα του BCR, (B-cell receptor), που προκύπτει από τη σύνδεση των μεμβρανικών ανοσοσφαιρινών IgM και IgD με τα ετεροδιμερή Igα/Igβ, αποτελεί το έναυσμα της ενεργοποίησης των Β-κυττάρων και κατά συνέπεια της χυμικής ανοσολογικής απάντησης. Cross-linking των μεμβρανικών ανοσοσφαιρινών ενεργοποεί τις Fyn, Lyn και Blk κινάσες, μέλη της οικογένειας των src κινασών, οι οποίες οδηγούν στην φωσφορυλίωση των ΙΤΑΜ περιοχών των Igα και Ιgβ ανοσοσφαιρινών του BCR συμπλέγματος για να συνδεθούν στη συνέχεια με τις Syk κινάσες. Οι παραπάνω αντιδράσεις ενεργοποιούν ένα καταρράκτη κινασών και οδηγούν στην μετατόπιση (translocation) των πυρηνικών μεταγραφικών παραγόντων όπως συμβαίνει και με το Τ-κύτταρο(43). Στην ενεργοποίηση του Β-κυττάρου συμμετέχει επίσης και το σύμπλεγμα του συνυποδοχέα το οποίο αποτελείται από 3 πρωτεϊνικά μόρια, το CD21 (υποδοχέας-2 συμπληρώματος CR2), το CDI9 και το CD81. Κατά αυτόν τον τρόπο, το αντιγόνο 24

μπορεί να συνδεθεί με το CD21 μέσω του C3d μορίου συμπληρώματος και με τις μεμβρανικές ανοσοσφαιρίνες των Β-κυττάρων. Η φωσφορυλίωση του κυτταροπλασματικού τμήματος του CD19 οδηγεί σε δραστηριοποίηση των Lyn κινασών μετέχοντας στην ενίσχυση του μηνύματος που επάγει την ενεργοποίησητου Β-κυττάρου μέσω της φωσφολιπάσης C και της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης ειδικά όταν η συγκέντρωση του Ag είναι μικρή (Σχήμα 1),(43). Σχήμα 1. Η ενεργοποίηση του Β - κυττάρου είναι παρόμοια με εκείνη του Τ κυττάρου. Cross-linking των μεμβρανικών ανοσοσφαιρινών ενεργοποεί τις Fyn, Lyn και Blk κινάσες, μέλη της οικογένειας των src κινασών, οι οποίες οδηγούν στην φωσφορυλίωση των ΙΤΑΜ περιοχών των Igα και Ιgβ ανοσοσφαιρινών του BcR συμπλέγματος για να συνδεθούν στη συνέχεια με τις Syk κινάσες. Στη συνέχεια οι Syk κινάσες ενεργοποιούν την φωσφολιπάση C η οποία δρα στο μεμβρανικό μόριο PIP2 προς σχηματισμό IP3 και DAG (διακυλγλυκερόλη). Ακολουθεί η ενεργοποίηση της πρωτεινικής κινάσης C. Οι παραπάνω αντιδράσεις ενεργοποιούν ένα καταρράκτη κινασών και οδηγούν σε μετατόπιση των πυρηνικών μεταγραφικών παραγόντων. (Ανατύπωση από Roitt, Immunology 2001.) 25

Στη συνέχεια, τα Β-κύτταρα παρουσιάζουν τα επεξεργασμένα αντιγονικά πεπτίδια συνδεδεμένα με MHC μόρια τάξης ΙΙ στα ΤΗ (αντίδραση μεταξύ MHC τάξης ΙΙ αντιγονικού συμπλέγματος και ΤCR) μέσω μίας σειράς αλληλεπιδράσεων μεταξύ LFA-3 και CD2, ICΑΜ-1 ή ICΑΜ-3 και LFA-1. Βασικό ρόλο διαδραματίζουν επίσης τα CD80 (B7-1) και CD86 (B7-2) μόρια επιφανείας των Β-κυττάρων που αντιδρούν με τα CD28 και CTLA-4 των T-κυττάρων οδηγώντας σε σταθεροποίηση του mrna της IL-2 αλλά και άλλων κυτταροκινών στα Τ-κύτταρα.(44). Από τις συνδέσεις που ενισχύουν την επαφή με το Β-κύτταρο, έχει αναγνωρισθεί ως βασικής σημασίας η σύνδεσης του CD40-συνδέτη (CD-40 ligand), τον οποίο εκφράζει το ενεργοποιημένο Τ-κύτταρο, με το μόριο CD40 (μέλος της οικογένειας των ΤΝF υποδοχέων) που εκφράζεται στη μεμβράνη του Β-κυττάρου. Η αλληλεπίδραση CD40/CD40L οδηγεί το Β-κύτταρο μέσα στον κυτταρικό κύκλο, αυξάνει την έκφραση των CD80/CD86 μορίων επιφανείας του Β-κυττάρου υποβοηθώντας κατά αυτόν τον τρόπο την διέγερση του Τ-κυττάρου (Σχήμα 2) (44, 45). Οι κυτταροκίνες που παράγονται στη συνέχεια από τα Τ-κύτταρα (TΗ1-TΗ2TΗ0) ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασής τους με τα Β-κύτταρα, ασκούν δυναμική δράση με τη σειρά τους στα Β-κύτταρα. Οι IL-2 και IFN-γ που παράγονται από τα ΤH1, ευθύνονται για τις αντιδράσεις υπερευαισθησίας επιβραδυνόμενου τύπου, ενώ παράλληλα βοηθούν τα Β-κύτταρα να παράγουν ΙgG2α αλλά όχι αρκετή IgG1 ή ΙgE. Οι κυτταροκίνες πάλι με την σειρά τους που παράγονται από τα ΤH2, (IL-4, IL-5, Il-6, IL-10, IL-13) επιδρούν στο B-κύτταρο. Η IL-4 α) προάγει την ενεργοποίηση και τη διαροροποίηση του Β-κυττάρου β) επιδρά στο Τ-κύτταρο ως αυξητικός παράγοντας προάγοντας την διαφοροποίησή του, ενώ ασκεί ανασταλτική δράση στην παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών από τα μακροφάγα όπως IL-1 και TNFα. 26

Σχήμα 2. Τα Β-κύτταρα παρουσιάζουν τα επεξεργασμένα αντιγονικά πεπτίδια συνδεδεμένα με MHC μόρια τάξης ΙΙ στα ΤΗ μέσω μίας σειράς αλληλεπιδράσεων μεταξύ LFA-3 και CD2, IΚΑΜ-1 ή IΚΑΜ-3 και LFA-1. Βασικό ρόλο διαδραματίζουν επίσης τα CD80 (B7-1) και CD86 (B7-2) μόρια επιφανείας των Β-κυττάρων που αντιδρούν με τα CD28 και CTLA-4 των Tκυττάρων. Από τις συνδέσεις που ενισχύουν την επαφή με το Β-κύτταρο, καθοριστική σημασία έχει η σύνδεση του CD40-συνδέτη (CD-40 ligand), τον οποίο εκφράζει το ενεργοποιημένο Τ-κύτταρο, με το μόριο CD40 (μέλος της οικογένειας των ΤΝF υποδοχέων) που εκφράζεται στη μεμβράνη του Βκυττάρου. (Ανατύπωση από Roitt,Immunology 2001) H εκσεσημασμένη παραγωγή IL-4 παίζει ρόλο στις αλλεργικές αντιδράσεις παράγοντας IgE ενώ η IL-5 ευθύνεται για την ηωσινοφιλία στις παρασιτικές νόσους. Η IL-6 προάγει τη διαφοροποίηση των Β-κυττάρων σε AFCs (antibody forming 27

cells), ενώ στο ήπαρ συμμετέχει στην παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης. Η IL-10 ενεργεί ως αυξητικός παράγοντας, προάγοντας την διαφοροποίηση του Β-κυττάρου και η IL-13 βοηθά στην παραγωγή IgE (Σχήμα 3) (46). Σχήμα 3. Τα Β-κύτταρα ενεργοποιούνται από τα Ag μέσω των APCs, όπως είναι τα μακροφάγα, παρουσία IL-1και IL4. Ακολουθεί έκφραση των υποδοχέων IL-2 και άλλων κυτταροκινών.οι IL-2,4,5 προάγουν την διαίρεση του κυττάρου. (Ανατύπωση από Roitt,Immunology 2001) 28

Η ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΕΙΔΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ Η διάκριση των παθογόνων από τις «ίδιες» ουσίες του οργανισμού, που επιτυγχάνεται με την μεσολάβηση των υποδοχέων της φυσικής ανοσιακής αναγνώρισης (PRRs), δεν αποσκοπεί μόνο στην άμεση εξουδετέρωσή τους αλλά οδηγεί στην ενεργοποίηση μίας σειράς μηχανισμών που κατευθύνουν αποτελεσματικά την ειδική ανοσία έναντι των βλαπτικών παραγόντων. Η ειδική ανοσιακή απάντηση μεσολαβείται από τα Τ και τα Β-κύτταρα και εκδηλώνεται μετά από αναγνώριση του αντιγονικού πεπτιδίου από τους αντίστοιχους κλωνικούς υποδοχείς (ΤCR και BCR). Η ετερογένεια, όμως, των λεμφοκυτταρικών υποδοχέων, δεν τυγχάνει ανάλογης ειδικότητας, και κατά συνέπεια είναι τυχαία και παραμένει απρόβλεπτη, φτάνοντας στο βαθμό να στρέφεται ακόμη και έναντι «ιδίων» αντιγόνων. Το γεγονός αυτό καθιστά αδύνατη την ειδική ανοσολογική απάντηση χωρίς την παράλληλη ή ταυτόχρονη ύπαρξη συνδιεγερτικών μηνυμάτων. Επιπλέον, το τεράστιο εύρος των παθογόνων επιβάλλει την ύπαρξη και κινητοποίηση επιπρόσθετων μηχανισμών για επαρκή και ειδική ανοσολογική απόκριση. Η φυσική ανοσία αναπληρώνει αυτές τις αμυντικές αδυναμίες, με δύο βασικούς τρόπους. Αφενός με την επαγωγή της έκφρασης των συνδιεγερτικών μορίων, η οποία συνοδεύει τη φυσική αναγνώριση των παθογόνων, και αφετέρου μέσω μηνυμάτων που επάγουν τη διαφοροποίηση των ειδικών ανοσιακών μηχανισμών, ώστε να εκδηλώσουν την κατάλληλη για το κάθε παθογόνο δραστική αντίδραση. Η φυσική αναγνώριση μιας σειράς μοριακών σχηματισμών συνδεόμενων με την παθογονικότητα (pathogen-associated molecular patters, PAMPs) όπως το βακτηριακό DNA, το ιϊκό RNA, οι LPS, κ.α., επάγει την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων, όπως των Β7.1 και Β7.2. Καθώς τα «ίδια» αντιγόνα δεν διαθέτουν ανάλογα PAMPs, η αναγνώρισή τους δεν επάγει την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων και την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων, γεγονός που επιτρέπει στην φυσική ανοσία να λειτουργεί ως μηχανισμός αναγνώρισης του «ιδίου». Παράλληλα με την έκφραση των Β7-μορίων στην επιφάνεια του APC, η αναγνώριση του συμπλέγματος MHC/αντιγονικού πεπτιδίου οδηγεί στην έκφραση του CD28, δηλαδή του συνδέτη 29

των Β7, στη μεμβράνη του Τ-κυττάρου. Η ταυτόχρονη παρουσία των δύο μηνυμάτων προκαλεί την ενεργοποίηση του Τ-κυττάρου,την έκφραση επιφανειακών μορίων (TNF-α και TNF β, FasL, CD40L, CD30L, CD27L) και την έκκριση κυτταροκινών. Αν το κύτταρο στόχος είναι σωματικό κύτταρο, τα CD8+ T-κύτταρα επιφέρουν την καταστροφή του, μέσω κάποιας από τις οδούς της απόπτωσης (οδός ΤΝF, οδός FasL, oδός περφορίνης). Αντίθετα, αν πρόκειται για APC (B-κύτταρο, μακροφάγο, δενδριτικό κύτταρο), επάγεται η ενεργοποίησή του, μέσω του CD40L, με αποτέλεσμα την επίταση της έκφρασης των Β7-μορίων. Ουσιαστικά, δηλαδή, κινητοποιείται ένας μηχανισμός θετικής αυτορρύθμισης της ανοσιακής απάντησης, ο οποίος τελικά ενεργοποιεί τα Β-κύτταρα προς παραγωγή αντισωμάτων ή τα μακροφάγα για την καταστροφή των βακτηρίων που έχουν φαγοκυτταρώσει. Η φυσική ανοσία συνεχίζει να ασκεί επίδραση έναντι των εκάστοτε παθογόνων, κινητοποιώντας μία σειρά μηχανισμών με κύριους μεσολαβητές τις κυτταροκίνες που παράγονται κατά τη διάρκεια της μη ειδικής, φλεγμονώδους αντίδρασης. Η ενεργοποίηση των ιστικών μακροφάγων, την οποία συνεπάγεται η σύνδεση των PRRs(υποδοχείς αναγνώρισης μοριακών σχηματισμών, pattern-recognition receptors)-pamps, έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή IL-12 και TNF-α. H IL-12 επάγει τη διαφοροποίηση των παρθένων βοηθητικών Τ-κυττάρων (ΤΗ) προς ΤΗ1κύτταρα (αντίδραση τύπου 1), τα οποία, μέσω της έκκρισης κυρίως IFN-γ, TNF-α και β, προάγουν τη φαγοκυττάρωση και την ενδοκυττάρια καταστροφή των μικροοργανισμών. Η διαφοροποίηση προς αυτή την κατεύθυνση είναι αποτέλεσμα της ικανότητας της IL-12 να μεγιστοποιεί την παραγωγή της IFN-γ και να αναστέλλει την παραγωγή της IL-4 από τα διηγερμένα ΤΗ κύτταρα. Η παραγωγή IL-12 και ΤΝFα από τα μακροφάγα επιτείνεται, στη συνέχεια, μετά από την αναγνώριση του αντιγόνου από τα ΤΗ-κύτταρα, μέσω της σύνδεσης CD40-CD40L. Οι κυτταροκίνες αυτές λειτουργούν συνεργικά με την IL-2 των Τ-κυττάρων και με την IL-15 των μακροφάγων και επάγουν την παραγωγή IFN-γ από τα ΝΚ-κύτταρα. Ακολούθως, η INF-γ επιτείνει την παραγωγή και τη δράση της IL-12 συνιστώντας έναν αυτοκρινή μηχανισμό θετικής αλληλορρύθμισης, ο οποίος ενισχύει αφενός την παραγωγή της INF-γ, με αποτέλεσμα την επίταση της ενεργοποίησης των μακροφάγων, και αφετέρου την παραγωγή της IL-12, με συνέπεια τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των ΝΚ και των ΤΗ1-κυττάρων. 30

Ορισμένοι Τ-λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί φέρουν ΤCR, οι οποίοι παρουσιάζουν ικανότητα αναγνώρισης ανάλογη εκείνης των PRRs. Συγκεκριμένα, αναγνωρίζουν συστατικά της μικροβιακής μεμβράνης (φαινυλ-πυροφωσφορικά), χωρίς προηγούμενη ενδοκυττάρια επεξεργασία ή σύνδεση με MHC-μόρια. Αυτά τα Τ-κύτταρα εκκρίνουν INF-γ και TNF-α που επάγουν τη διαφοροποίηση των TH1κυττάρων. Άλλες κυτταροκίνες, επίσης που παράγονται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα και τα ΝΚ-κύτταρα (GM-CSF), επάγουν στα μακροφάγα την έκφραση CD1-μορίων. Αυτά τα MHC-ανάλογα μόρια παρουσιάζουν μη πεπτιδικά μικροβιακά αντιγόνα (μυκολικά οξέα και λιπογλυκάνες) στα CD4- CD8- T-κύτταρα και στα CD8+ α/β Τ-κύτταρα, με αποτέλεσμα την παραγωγή INF-γ και την εκδήλωση κυτταρολυτικής δραστηριότητας. Η ενεργοποίηση άλλων κυτταρικών πληθυσμών, μετά από τη φυσική αναγνώριση των παθογόνων, οδηγεί στη διαφοροποίηση των παρθένων Τ Η προς ΤΗ2κύτταρα (αντίδραση τύπου 2), τα οποία, μέσω της έκκρισης IL-A, IL-5, IL-6, IL10 και IL-13,προάγουν τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των ιστιοκυττάρων και των ηωσινοφίλων, καθώς και την παραγωγή IgE και IgG4, ενώ αναστέλλουν την ενεργοποίηση των μακροφάγων. Η παραγωγή των ΤΗ2-κυττάρων προϋποθέτει την επί των παρθένων ΤΗ επίδραση της IL-4, η έκκριση της οποίας, κατά τη διάρκεια της φυσικής ανοσίας, είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη και αρκετά αδιευκρίνητη. Η παραγωγή β-χημειοκινών από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα φαίνεται ότι προκαλεί συνάθροιση ΤΗ2-κυττάρων, ενώ η έκφραση του Β7.2 και του CD30L επάνει την παραγωγή IL-4 από τα Τ-κύτταρα. Επίσης, ορισμένοι υποπληθυσμοί CD4-CD8- αλλά και CD4+ Tκυττάρων, οι οποίοι φέρουν ανασταλτικούς ΝΚ-υποδοχείς (ΝΚ Τ-κύτταρα), παράγουν μεγάλες ποσότητες IL-4, αμέσως μετά από τη σύνδεση του CD1 με μη πεπτιδικά αντιγόνα. Οι κυτταροκίνες της φυσικής ανοσίας ασκούν, επίσης, άμεση επαγωγική δράση στους δραστικούς μηχανισμούς της ειδικής ανοσίας, σε διάφορα επίπεδα. Oι IFNs τύπου Ι (α και β), η παραγωγή των οποίων επάγεται από διάφορους ιούς, ενεργοποιούν (upregulate) τα τάξης I MHC-μόρια και, κατ αυτό τον τρόπο, αυξάνουν την ικανότητα παρουσίασης των ιικών πεπτιδίων στα κυτταρολυτικά Τκύτταρα. Η IL-1, o TNF-a και οι χημειοκίνες προκαλούν μετακίνηση των ειδικών για το αντιγόνο Τ-κυττάρων, καθώς και άλλων ανοσοδραστικών κυττάρων, προς το σημείο της ιστικής βλάβης, είτε επάγοντας την έκφραση μορίων προσκόλλησης στα 31

ενδοθηλιακά κύτταρα είτε διεγείροντας τη χημειοταξία. Τέλος, η IL-6 προάγει τη διαφοροποίηση των Β-κυττάρων προς πλασματοκύτταρα.(47). 32

ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗ ΤΟΥ ΞΕΝΙΣΤΗ ΣΤΗ ΣΗΨΗ Σήψη από εξωκυττάρια βακτήρια Αμέσως μετά την εισβολή των εξωγενών παθογόνων κινητοποιείται μία σειρά αμυντικών μηχανισμών που βρίσκεται σε άμεση ετοιμότητα που αποτελούν τη μη ειδική ή φυσική ανοσία. Η φαγοκυττάρωση από τα ουδετερόφυλα, τα μαστοκύτταρα και τα ιστικά μακροφάγα αποτελεί το βασικό μηχανισμό της φυσικής ανοσίας έναντι των εξωκυττάριων βακτηρίων μέχρι να αναπτυχθεί η ειδική ανοσιακή απάντηση. Σημαντικό ρόλο διαδραματίζει επίσης η ενεργοποίηση του συμπληρώματος που προάγει την κυτταρόλυση με σχηματισμό του MAC (membrane attack complex), την οψονινοποίηση και κατά συνέπεια την φαγοκυττάρωση των εξωκυττάριων βακτηρίων και την μη παραγωγή αναφυλατοξινών C4α, C3α, C5α. Η χυμική ανοσία φαίνεται ότι αποτελεί τον κύριο ανοσολογικό μηχανισμό άμυνας έναντι των εξωκυττάριων βακτηρίων. Τα μονοκύτταρα επιτελούν δύο βασικές λειτουργίας: Α) Την φαγοκυττάρωση των βακτηρίων, και Β) Την παραγωγή IgM αντισωμάτων ενώ τα περισσότερα βακτήρια που προκαλούν οξείες λοιμώξεις επάγουν την παραγωγή IgM αντισωμάτων που συνεισφέρουν με τη σειρά τους στην οψονινοποίηση των βακτηρίων και στην αύξηση της φαγοκυτταρικής δραστηριότητας μέσω των υποδοχέων FcγR. Η φαγοκυττάρωση πραγματοποιείται ουσιαστικώτερα μέσω FcγRI (CD64) υποδοχέων που βρίσκονται στην επιφάνεια των μακροφάγων και μέσω FcγΙΙ (CD32) που εκφράζονται στα Β-κύτταρα, στα μονοπύρηνα και στα κοκκιοκύτταρα. Επιπλέον στα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα/μακροφάγα απελευθερώνουν μία σειρά μεταβιβαστών που κινητοποιούν την ανοσολογική απάντηση. Τέτοιοι μεταβιβαστές είναι ο TNF-α (μπορεί να θεωρηθεί ο κύριος μεσολαβητής), η IL-1, IL6, τα εικοσανοειδή, ο παράγοντας ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (platelet actuating Factor, PAF) και το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) (48,49). 33

Σήψη από ενδοκυττάρια βακτήρια Τα ενδοκυττάρια βακτήρια εισέρχονται στον οργανισμό μέσω βλεννογόνων του εντέρου και των αναπνευστικών οδών. Η εισβολή τους επιτυγχάνεται είτε με διακκυτταρική δίοδο (transcutosis) μέσω των επιθηλιακών κυττάρων είτε με την μεταφορά τους μέσω των μακροφάγων από τα οποία φαγοκυτταρώνονται με μεσολάβηση υποδοχέων φυσικής ανοσίας. Αντοχή των ενδοκυττάριων βακτηρίων στους μηχανισμούς καταστροφής των φαγοκυττάρων καθιστά την φαγοκυττάρωση ανεπαρκή μηχανισμό αντιμετώπισης της εγκατάστασης και της διασποράς στον οργανισμό με αποτέλεσμα την επιβίωση των βακτηρίων και τον πολλαπλασιασμό τους. Αντίθετα για τα παθογόνα που διαπερνούν τελικά τον επιθηλιακό φραγμό (496 ώρες), τα κύτταρα φυσικοί φονείς (Natural Killer-NK) αντιπροσωπεύουν τους κύριους μεσολαβητές της φυσικής ανοσίας. Τα ΝΚ κύτταρα ενεργοποιούνται είτε άμεσα από τα βακτήρια είτε από την IL-12 που παράγεται από τα διεγερμένα μακροφάγα για να παράγουν στη συνέχεια IFN-γ που με την σειρά της επιτείνει την ενεργοποίηση των μακροφάγων στην προσπάθεια καταστροφής των βακτηρίων. Μετά την δραστηριοποίησης της φυσικής ανοσίας στα πρώτα στάδια της λοίμωξης, ρόλο αναλαμβάνει η κυτταροεξαρτώμενη ανοσολογική απάντηση έναντι των ενδοκυττάριων βακτηρίων με την μεσολάβηση είτε των μακροφάγων είτε των κυτταρολυτικών Τ-κυττάρων (CTLs). Kαθώς τα μακροφάγα κατορθώνουν να καταστρέψουν ένα μέρος από τα ενδοκκυττάρια βακτήρια που φαγοκυτταρώνουν, τα επεξεργασμένα αντιγόνα αυτών των βακτηρίων παρουσιάζονται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα μέσω των μορίων MHC-II. Έτσι διεγείρουν τη διαφοροποίηση των CD4+ Τ-κυττάρων και παρουσία IFN-γ (που παράγεται από τα ΝΚ-κύτταρα και της ΙL-12 που παράγεται από τα μακροφάγα, η διαφοροποίηση εξελίσσεται προς TH1 κυτταρική αντίδραση. Στη συνέχεια, η IFN-γ που παράγεται από τα ΤH1 κύτταρα επάγει την παραγωγή Abs τα οποία ενεργοποιούν το συμπλήρωμα και οψωνινοποιούν τα βακτήρια. Επίσης επιτυγχάνεται ενεργοποίηση των μακροφάγων καθιστώντας αποτελεσματικότερη την φαγοκυττάρωση. Τα βακτήρια που ζούν και επιβιώνουν εντός μακροφάγων, προκαλούν την απελευθέρωση και παρουσίας Ag μέσω μορίων MHC-I στα CD8+ CTL, με 34

αποτέλεσμα τη λύση των μολυσμένων κυττάρων και παραγωγής IFN-γ. Πάντως, ένα μέρος από τα ενδοκυττάρια βακτήρια επιτυγχάνουν να εκτρέψουν τη διαφοροποίηση των CD4 T-κυττάρων προς την εκδήλωσης της ΤΗ2 κυτταρικής αντίδρασης. Η συνεργασία των ΤH2 κυττάρων με τα Β-κύτταρα οδηγεί στην πρώϊμη παραγωγή IgA αντισωμάτων τα οποία εμποδίζουν την προσκόλληση των βακτηρίων στο βλεννογόνο και την προσβολή των επιθηλιακών κυττάρων (50,51). 35

ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΤΗΝ ΣΗΨΗ Επεξεργασία και παρουσίαση του αντιγόνου Το πρώτο βήμα της διαδικασίας επεξεργασίας και παρουσίασης των εξωγενών αντιγόνων, είναι η σύνδεσή τους με τη μεμβράνη των APCs είτε με τη βοήθεια ειδικών υποδοχέων είτε με αδιευκρίνιστους μέχρι στιγμής τρόπους. Μετά την σύνδεσή τους στην κυτταρική μεμβράνη ακολουθεί η είσοδος του αντιγόνου στο εσωτερικό του κυττάρου είτε με φαγοκυττάρωση είτε με μεσολαβούμενη από υποδοχείς ενδοκυττάρωση. Με τη διαδικασία της πινοκύττωσης δύναται να εισέλθουν στο κύτταρο τα διαλυτά αντιγόνα.(52). Τα εισερχόμενα στα APCs αντιγόνα περιέχονται μέσα σε ενδοκυττάρια κυστίδια που συντήκονται με τα ενδοσωμάτια και τα λυσοσωμάτια. Στη συνέχεια τα αντιγόνα καταβολίζονται σε απλά αμινοξέα λόγω του χαμηλού Ph (ph=4) και με τη βοήθεια πρωτεασών και πεπτιδασών. Μερικές όμως περιοχές των αντιγόνων είναι περισσότερο ανθεκτικές στην αποδόμηση, με αποτέλεσμα να μην καταβολίζονται πλήρως αλλά να διασπώνται και να παραμένουν για αρκετό χρόνο ως πεπτίδια, τα οποία έχουν μέγεθος 10-30 α.α., όσο δηλαδή απαιτείται για να συνδεθούν με τη σχισμοειδή θήκη της τάξης ΙΙ-MHC μορίων. Από τη διάσπαση των πολύπλοκων πρωτεϊνών προκύπτει μικρός αριθμός τέτοιων πεπτιδίων, τα οποία συνιστούν τους επιτόπους που αναγνωρίζονται και οδηγούν στην ενεργοποίση των ΤΗ κυττάρων, είναι δε χαρακτηριστικοί του αντιγόνου (52). Τα τάξης ΙΙ MHC-μόρια συντίθενται στα ριβοσωμάτια του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου, από όπου μεταφέρονται μέσα σε κυστίδια, μέσω της συσκευής Golgi, προς την επιφάνεια του κυττάρου. Σε κάποιο σημείο της ενδοκυττάριας πορείας τους, τα κυστίδια που περιέχουν τα MHC-μόρια, συναντώνται και συντήκονται με τα ενδοσωμάτια, με αποτέλεσμα τη σύνδεση των αντιγονικών πεπτιδίων με τα τάξης ΙΙ-MHC μόρια, τα οποία μεταφέρουν πλέον και παρουσιάζουν στην επιφάνεια του APC το αντιγόνο (52). Η σύνδεση των τάξης ΙΙ-MHC μορίων με τα ενδογενή πεπτίδια που μεταφέρονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο με τη βοήθεια της πρωτεϊνης ΤAP, αποφεύγεται, επειδή αμέσως μετά τη σύνθεσή τους, οι α και β αλυσίδες των τάξης ΙΙ MHC μορίων συνδέονται με μία τρίτη αλυσίδα που φέρεται ως li-αλυσίδα ή CLIP 36

(class+ii associated invariant-chain peptide). Τρεις li-αλυσίδες συνδέονται με αντίστοιχο αριθμό α και β αλυσίδων και σχηματίζουν ενεαμερές σύμπλεγμα, με το οποίο δεν είναι δυνατή η σύνδεση των πεπτιδίων. Η li-αλυσίδα αποσπάται από το σύμπλεγμα α:β:li στο ενδοσωμάτιο, οπότε απελευθερώνεται το MHC μόριο, για να συνδεθεί με τα εξωγενή αντιγονικά πεπτίδια. Η σύνδεση του πεπτιδίου με το MHCμόρια μεταβάλλει πιθανά τη στερεοταξική διαμόρφωση και σταθεροποιεί τη δομή του. Βοηθητικό και ρυθμιστικό ρόλο ως προς την απελευθέρωση και τη σύνδεση μερικών πεπτιδίων με τα τάξης ΙΙ-MHC μόρια έχουν κάποια συνοδά μόρια που ονομάζονται σαπερόνες(chaperones) (52,53). Στη συνέχεια, το σύμπλεγμα αντιγόνου HLA μορίου αναγνωρίζεται σαν ενιαίο σύνολο από τον υποδοχέα των Τ-κυττάρων (TCR) συνδεόμενο μαζί του με τη βοήθεια των CD4 και CD8 μορίων για να ακολουθήσει στην συνέχεια η μεταγραφή ενός πλήθους γονιδίων (περισσότερα από 70), των οποίων τα προϊόντα είναι απαραίτητα για την ενεργοποίηση του Τ-κυττάρου (54). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι εκτός από τη μέσω MHC-μορίων αντιγονοπαρουσίασης, τα APCs παρουσιάζουν στα CD4-, CD8-, T-κύτταρα μη πεπτιδικά αντιγόνα μέσω CD1 μορίων τα οποία διακρίνονται στην ομάδα 1 που περιλαμβάνει τα CDd1a,b,c και η ομάδα 2 που περιλαμβάνει τα CDd2 μόρια. Όλα τα CD1-μόρια κωδικοποιούνται από γονίδια που βρίσκονται εκτός του xρωματοσώματος 6 αλλά με δομή ανάλογη εκείνης των γονιδίων τάξης Ι του MHC. Tα CD1 μόρια της ομάδας 1, εκφράζονται στα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα στα Β-κύτταρα των λεμφαδένων και των δενδριτικών κυττάρων ενώ τα CD1 μόρια της ομάδας 2 έχουν περιορισμένη ιστική κατανομή. Ανεξάρτητα από την αντιγονοπαρουσιαστική λειτουργία τους, τα μη συνδεδεμένα με ξένο αντιγόνο CD1-μόρια αποτελούν στόχο αναγνώρισης από τα Τ-κύτταρα τα οποία εκκρίνουν IL-4, που με τη σειρά της προάγει την εκλεκτική διαφοροποίηση των TH2 κυττάρων και την έκφραση των CD1μορίων, γεγονός που καταδεικνύει την ύπαρξη ενός άγνωστου μέχρι στιγμής ρυθμιστικού μηχανισμού (53). Η συμμετοχή των φαγοκυττάρων του ανθρώπινου οργανισμού στην διεργασία της σήψης καθώς και ο ενεργός ρόλος των μεμβρανικών υποδοχέων τους θα αναλυθεί παρακάτω. 37

Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΟΥΔΕΤΕΡΟΦΙΛΩΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΟΠΥΡΗΝΩΝ ΣΤΗ ΣΗΨΗ Τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα αποτελούν τον επικρατέστερο κυτταρικό πληθυσμό του αίματος και είναι τα πρώτα φαγοκύτταρα που εξαγγείωνονται στο σημείο της βλάβης. Η μετανάστευση των φαγοκυττάρων στο σημείο της ιστικής καταστροφής εξελίσσεται σε τρείς φάσεις. Η πρώτη φάση μεσολαβείται από τις σελεκτίνες των ενεργοποιημένων ενδοθηλίου και από την L-σελεκτίνη. Συνδέτες των σελεκτινών είναι οι μουκίνες που εκφράζονται στη κυτταρική μεμβράνη των ουδετροφίλων και του ενδοθηλίου. Οι κυτταρικές συνδέσεις που επιτυγχάνονται με την μεσολάβηση των σελεκτινών έχουν ως αποτέλεσμα τη χαλαρή προσωρινή πρόσδεση (tethering) και τη βραδεία κύλιση (rolling) των ουδετεροφίλων πάνω στην επιφάνεια του ενδοθηλίου που επιτρέπει την επαφή τους με μία ανομοιογενή ομάδα ουσιών, τους χημειοτακτικούς παράγοντες (55). Οι χημειοτακτικοί παράγοντες συνδέονται με υποδοχείς των ουδετεροφίλων και εξυπηρετούν τη δεύτερη φάση της μετακίνησης τους δια μέσου του αγγειακού τοιχώματος. Στη συνέχεια αναγνωρίζονται από ειδικούς υποδοχείς της λευκοκυτταρικής μεμβράνης (οικογένεια των 7-διαμεμβρανικών υποδοχέων), γεγονός που επιφέρει μεταβολές στις προσκολλητικές ιδιότητες των ουδετεροφίλων. Σημαντικότερη είναι η αναδιάταξη των μεμβρανικών ιντεγκρινών (Mac-1,LFA-1) που επιτρέπει τη σύνδεσή τους με τα ICAM-1 μόρια που εκφράζονται στο ενεργοποιημένο ενδοθήλιο. Αμέσως μετά, τα ουδετερόφιλα διολισθαίνουν ενεργητικά δια των ενδοθηλιακών κυττάρων και με αμοιβαδοειδή κίνηση μετακινούνται πρός την εστία της ιστικής βλάβης (μετανάστευση,migration), διαδικασία που, όπως και η χημειοταξία, διευκολύνεται από τη σύνδεση των ιντεγκτινών με τη φιμπρονεκτίνη καθώς και με άλλα συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας (55,56). Αμέσως μετά την εξαγγείωσή τους, τα ουδετερόφιλα αρχίζουν να ενσωματώνουν τα βακτήρια, τα κυτταρικά υπολείμματα και κάθε ξένο σωμάτιο με τρείς βασικούς μηχανισμούς α) με τη διαδικασία της πινοκύττωσης, αν πρόκειται για μη ειδική αναγνώριση (άνευ κάψας βακτήρια, κλπ), β) με τη μεσολαβούμενη μέσω υποδοχέα ενδοκύττωση για μακρομόρια, ιούς κλπ) και γ) με τη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης προκειμένου για μεγάλες (δ>100nm) πολυσθενείς ουσίες που 38

φέρουν στην επιφάνειά τους μεγάλο αριθμό συνδετών. Στην αντίθετη περίπτωση η φαγοκυττάρωση προϋποθέτει την οψωνινοποίησή τους. Τα αντισώματα αποτελούν τις σημαντικότερες οψωνίνες και τα ουδετερόφιλα είναι ιδιαίτερα δραστικά αναφορικά με τη φαγοκυττάρωση μικροβίων καλυμμένων με ειδικά αντισώματα, με τη μεσολάβηση των αντίστοιχων FcR τους. Τα σωμάτια που εγκολπώνονται με τη φαγοκυττάρωση, ανευρίσκονται στο κυτταρόπλασμα μέσα σε υπομεμβρανικούς σχηματισμούς που ονομάζονται φαγοσώματα. Τα φαγοσώματα συντήκονται με τα αποθηκευτκά κοκκία των ουδετεροφίλων σχηματίζοντας τα φαγολυσοσώματα και έτσι επιτυγχάνεται η καταστροφή του φαγοκυτταρωμένου υλικού. Τα κοκκία των ουδετεροφίλων περιέχουν μεγάλο αριθμό ενζύμων και άλλων παραγόντων, οι οποίοι προκαλούν το θάνατο και την αποδόμηση των μικροβίων, καθώς και τη διάσπαση των διαφόρων άλλων ουσιών που φαγοκυτταρώνονται. Κυριότεροι από αυτούς τους παράγοντες είναι οι ντιφενσίνες που αποτελούν το 30-50% της ολικής πρωτεΐνης των κοκκίων και οι καθελισιδίνες. Μεταξύ των υπολοίπων παραγόντων είναι η λυσοζύμη (βακτηριοκτόνο ένζυμο), και η λακτοφερίνη (χηλικός παράγοντας) η οποία συνδεδεμένη με το σίδηρο αναστέλλει την ανάπτυξη των βακτηρίων. Στη συνέχεια, κινητοποιείται ένας μηχανισμός αντλίας ιόντων υδρογόνου με αποτέλεσμα την εισροή ιόντων υδρογόνου και την ελλάτωση του ph στο εσωτερικό του φαγοσώματος, γεγονός που προάγει την υδρόλυση των βακτηριακών στοιχείων και αυξάνει την δραστικότητα των ουδετεροφιλικών ενζύμων (57). Ιδιαίτερο ρόλο κατέχουν οι NADPH-εξαρτώμενες οξειδάσες που υπάρχουν στα κοκκία των ουδετεροφίλων υπό την επίδραση των οποίων το μοριακό οξυγόνο μετατρέπεται αρχικά σε απλομοριακό οξυγόνο και μετά σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2). Παρουσία της μυελουπεροξειδάσης το υπεροξείδιο του υδρογόνου ενώνεται με ιόντα Cl- σχηματίζοντας το υποχλωριώδες οξύ, το μεγαλύτερο μέρος του οποίου καταναλώνεται οξειδώνοντας διάφορα βιολογικά μόρια των φαγοκυτταρούμενων στόχων ενώ το υπόλοιπο συμμετέχει στο σχηματισμό χλωραμινών (R-NCl) (58). Άλλη οξειδωτική διεργασία καταστροφής είναι η οδός του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ). Τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα εκφράζουν το επαγώγιμο ένζυμο NO-συνθετάση που καταλύει την αντίδραση του μοριακού οξυγόνου με αργινίνη και 39

κιτρουλίνη προς σχηματισμό NO που μέσα στα φαγοκυτταρικά κυστίδια μετατρέπεται σε υπεροξυνιτρίδιο και άλλα δραστικά τοξικά συστατικά. Οι παραπάνω μηχανισμοί συνιστούν την λεγόμενη οξειδωτική ή μεταβολική έκρηξη (respiratory or metabolic burst) (58). Παρά την κατανόηση των μηχανισμών κινητοποίησης των κυττάρων κατά την διάρκεια της φλεγμονής, υπό συζήτηση παραμένουν οι αιτίες της έκπτωσης της μεταναστευτικής ικανότητας των ουδετεροφίλων κατά την σήψη. Είναι γεγονός όμως ότι η μετανάστευση των ουδετεροφίλων στο σημείο της βλάβης καταστέλλεται από μία πληθώρα φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως η IL-10, το NO και το CO. Το ΝΟ, ο ρόλος του οποίου θα αναλυθεί λεπτομερώς παρακάτω, παράγεται από το ένζυμο νιτρική οξειδο-συνθετάση (ΝΟS). Έχουν αναφερθεί τρείς ισότυποι της NOS: 1) η νευρωνική μορφή (η-nos), 2) η ενδοθηλιακή μορφή (e-nos) και 3) η επαγώγιμη μορφή (i-nos) (59). Εκλεκτικοί αναστολείς τόσο της i-nos όσο και της e-nos ισομορφής αυξάνουν την προσκόλληση των πολυμορφοπυρήνων στο αγγειακό ενδοθήλιο (60,61). Τελευταία δεδομένα δείχνουν ότι η αντίδραση του NO με το ανιόν του υπεροξειδίου (Ο2) και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ΟΝΟΟ- που αναστέλλει την χημειοτακτική δραστηριότητα των λευκοκυττάρων(62,63,64). Διάφορες μελέτες αναφέρουν την επίδραση του ενζύμου οξυγενάση της αίμης (ΗΟ) στην φλεγμονώδη διαδικασία που καταστέλλει την μετανάστευση των λευκοκυττάρων, την απελευθέρωση του TNF-α, την έκφραση των μορίων προσκόλλησης ενώ αυξάνει τα επίπεδα της IL-10 (65,66). Επίσης η α1-acid γλυκοπρωτεΐνη που απομονώθηκε από τον ορό ασθενών με βαριά σήψη φαίνεται ότι καταστέλλει την μεταναστευτική διαδικασία ενώ επιπλέον η επαγωγή των GPCR κινασών(gpk) και η φωσφορυλίωση των υποδοχέων των χημειοκινών(gpcrs,gprotein-coupled receptors) ευθύνονται επίσης για την ελαττωμένη ανταπόκριση των PMN στους χημειοτακτικούς παράγοντες (67). Παρακάτω θα προσπαθήσουμε να αναλύσουμε τον ακριβή ρόλο του αγγειακού ενδοθηλίου και του NO στην διεργασία της σήψης. 40

Ο ρόλος του αγγειακού ενδοθηλίου στην σήψη Το αγγειακό ενδοθήλιο παίζει σημαντικό ρόλο στην μικροκυκλοφορία, μεσολαβεί στην τοπική φλεγμονώδη απάντηση μέσω ρύθμισης του αγγειακού τόνου, αυξάνει την αιματική ροή και την αγγειακή διαπερατότητα, συντελεί στην σχηματισμό της θρομβογόνου επιφάνειας και στην εξαγγείωση των λευκών (68). Η καταστροφή του αγγειακού ενδοθηλίου περιγράφει μία κατάσταση στην οποία μικροσκοπικά ορατά ενδοθηλιακά κύτταρα αλλάζουν σχήμα ή καταστρέφονται καθώς επίσης παρατηρείται αύξηση των δεικτών της επιθηλιακής βλάβης (69). Προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες αυξάνουν την διαπερατότητα του ενδοθηλίου, περίπου 6 ώρες αφού έχει αρχίσει η διαδικασία ης φλεγμονής και η δράση τους μεγιστοποιείται μέσα στις επόμενες 12-24 ώρες. Αυξημένα επίπεδα θρομβομοδουλίνης, intracellular adhesion molecule (ICAM-1), von Willenbrand factor (vwf) και Ε-σελεκτίνης έχουν αναφερθεί σε πολλές φλεγμονώδεις νόσους, συμπεριλαμβανομένης της σήψης, όπου υπήρχε σημαντική ενδοθηλιακή βλάβη (7074). Κανονικά η εξωτερική μεμβράνη του ενδοθηλίου εκφράζει διάφορα μόρια με αντιθρομβωτικές ιδιότητες ανάμεσα στα οποία είναι μόρια της κυτταρικής επιφάνειας, παρόμοιας δομής με την ηπαρίνη (heparin-like cell surface molecules), υπεύθυνα για την απενεργοποίηση των πρωτεασών πήξης. Τα μόρια αυτά αντιπροσωπεύουν έναν αναστολέα του ιστικού παράγοντα (Tissue factor pathway inhibitor) (75). Κανονικά η θρομβομοδουλίνη είναι υπεύθυνη για την απενεργοποίηση της θρομβίνης, καθότι συνδεόμενη μαζί της ενεργοποιεί την πρωτείνη C. Καθώς τα ενδοθηλιακά κύτταρα διαθέτουν αντιθρομβωτικές ιδιότητες, η έκθεσή τους απέναντι στον φλεγμονώδη παράγοντα οδηγεί ταχύτατα σε ελάττωση του ιστικού ενεργοποιητή του πλασμινογόνου λόγω αύξησης της συγκέντρωσης του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (PAI, plasminogen activator inhibitor). Καθώς στην σήψη αυξάνεται η δραστηριότητα του ιστικού παράγοντα με αύξηση της έκφρασης του τόσο στα μονοκύτταρα όσο και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, συμβαίνει διάσπαση της θρομβομοδουλίνης και απενεργοποίησή της. Στην διεργασία αυτή πιθανότατα συνεισφέρει και η αποδόμηση της θρομβομοδουλίνης απο την ουδετεροφιλική ελαστάση καθώς και από άλλες πρωτεάσες (76). 41

Η μετανάστευση των μονοκυττάρων και των λευκοκυττάρων στις εξωαγγειακές θέσεις μέσω του ενδοθηλίου και η προσκόλλησή τους στο ενδοθήλιο γίνεται με την βοήθεια μορίων προσκόλλησης που βρίσκονται στα πολυμορφοπύρηνα και στο ενδοθήλιο (77) και των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται από βιολογικούς μεσολαβητές όπως ο παράγοντας ενεργοποιητής των αιμοπεταλίων, IL-8, TNF και η IL-1 (78). Κατά το αρχικό στάδιο τα κυκλοφορούντα ουδετερόφιλα έρχονται σε επαφή με το ενδοθήλιο μέσω της οικογένειας των σελεκτινών. Οι σελεκτίνες είναι μόρια που εκφράζονται στα λευκά αιμοσφαίρια (L-selectin), στα αιμοπετάλια (P-selectin) και στα ενδοθηλιακά κύτταρα (E-selectin) και δρούν ως υποδοχείς που επιτρέπουν μία χαλαρή πρόσφυση. Η προσκόλληση που γίνεται μέσω των σελεκτινών σε συνδυασμό με την αιματική ροή οδηγεί στο λεγόμενο κύλισμα (rolling) των πολυμορφοπυρήνων στο ενδοθήλιο (79). Το κύλισμα ακολουθείται από διέγερση των β2 ιντεγκρινών. Τρία ετεροδιμερή των β2 ιντεγκρινών βρίσκονται στην εξωτερική κυτταρική μεμβράνη των ενεργοποιημένων πολυμορφοπυρήνων αποτελώντας το CD11/CD18 complex. Η διέγερση των ιντεγκρινών γίνεται από την προηγούμενη δέσμευση των σελεκτινών και την παρουσία ουσιών, όπως ο PAF και η IL-8. Στη συνέχεια ακολουθεί η σύνδεσή τους με τους αντίστοιχους υποδοχείς, τα ενδοκυττάρια μόρια προσκόλλησης (intracellular adhesion molecules 1 και 2) που αποτελούν μέλη της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών και βρίσκονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα ενδοκυττάρια μόρια προσκόλλησης περιλαμβάνουν τα ICAMs, E-σελεκτίνες, PECAMs (platelet EC adhesion molecules) και VCAMs (vascular cell adhesion molecules). Η προσκόλληση μέσω ιντεγκρινών βοηθά τα πολυμορφοπύρηνα να έρθουν σε συνάφεια με το ενδοθήλιο αυξάνοντας την ικανότητά τους για επακόλουθη μετανάστευση και φαγοκυττάρωση. Παράλληλα οι εξωκυτταρικές περιοχές των L-,Eκαι P- σελεκτινών απελευθερώνονται ως διαλυτές μορφές στο αίμα.(80,81). 42

Ο ρόλος του νιτρικού οξειδίου στην σήψη. Το ΝΟ παράγεται από το ένζυμο νιτρική οξειδο συνθετάση (NOS), ένα σύμπλοκο ένζυμο (Μ.Β ~140 kd) με σημαντική ομολογία πρός το κυτόχρωμα P450. Έχουν αναφερθεί 8 ακολουθίες DNA από τρία γνωστά γονίδια της νιτρικής οξειδο συνθετάσης, έτσι ώστε να αναφερόμαστε τελικά σε τρείς ισότυπους της ΝΟS: την νευρωνική μορφή (n-nos), την ενδοθηλιακή μορφή (e-nos) και την επαγώγιμη μορφή( i-nos). Οι n-nos και η e-nos αναφέρονται μαζί ως c NOS (συστατική μορφή του ενζύμου) ενώ η i-nos επάγεται από διάφορα ερεθίσματα και αποτελεί την επαγώγιμη μορφή (82). Ο σχηματισμός του ΝΟ απαιτεί εκτός από την ΝΟS, οξυγόνο και τη συμμετοχή της NADPH (nicitinamine adenine dinucleotide synthase) ως υπόστρωμα, που συντελούν στην οξείδωση της L-αργινίνης και στον σχηματισμό επιπλέον L-κιτρουλίνης(82). Η ΝΟS έχει την ικανότητα επίσης της παραγωγής υπεροξειδίου (83). Το υπεροξείδιο παράγεται κατά την απουσία της L-αργινίνης καθότι η L-αργινίνη αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα σχηματισμού του. Επιπλέον το ίδιο το NO ασκεί αρνητική παλίνδρομη δράση στον σχηματισμό του (84). Επίσης υπάρχουν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στην συστατική και στην επαγώγιμη μορφή της NOS. Η δραστηριότητα της c-nos εξαρτάται από τα ενδοκυττάρια επίπεδα ασβεστίου, οδηγεί σε παραγωγή χαμηλών ποσοτήτων NO και βρίσκεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα αιμοπετάλια και στους νευρώνες. Αντίθετα, η επαγώγιμη μορφή του ενζύμου i-nos, είναι ανεξάρτητη της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης ασβεστίου, παράγει NO σε εκατονταπλάσιες συγκεντρώσεις συγκρινόμενη με την συστατική μορφή του ενζύμου, ανιχνεύεται στα λευκά αιμοσφαίρια, μακροφάγα, κύτταρα Κupffer, στο μεσάγγειο και στα λεία μυικά κύτταρα ενώ η δράση της προάγεται μέσω φλεγμονωδών παραγόντων όπως ενδοτοξινών και κυτταροκινών (TNF-a, IL-1β, IL-2, IL-6, IFN-γ) (85). Αντίθετα η παραγωγή i-nos φαίνεται να αναστέλλεται από την δράση των αντι-φλεγμονωδών κυτταροκινών IL-4, IL-8, IL-10, TGF-β-1,-2,-3 (86). Η ενεργότητα και των δύο μορφών αναστέλλεται από ανάλογα της L-αργινίνης ενώ μόνο η επαγωγική μορφή του ενζύμου i-nos αναστέλλεται απο την δράση των γλυκοκορτικοειδών. Ενδογενείς αναστολείς της έχουν ανιχνευθεί στο ανθρώπινο πλάσμα και ούρα, ενώ η συγκέντρωσή τους φαίνεται να αυξάνεται σε ασθενείς με νεφρική ανεπάρκεια. (87). 43

Οι περισσότερες από τις δράσεις του NO επιτελούνται μέσω του κυκλικού GMP. Έτσι η αύξηση του c-gmp προκαλεί με τη σειρά του ελάττωση της συγκέντρωσης του ενδοκυττάριου ασβεστίου. Αναλυτικότερα, όσον αφορά την νευρωνική μορφή του ΝΟ, το ΝΟ δρα τόσο στο κεντρικό όσο και στο περιφερικό νευρικό σύστημα ως νευρομεταβιβαστής, ενώ η απελευθέρωσή του επάγεται από αμινοξέα. Στον εγκέφαλο, η n-nos βρίσκεται σε ποσοστό 2% στα νευρικά κύτταρα του φλοιού, είναι παρούσα στους δενδρίτες και στους νευράξονες και λαμβάνει μέρος σε μία σειρά λειτουργιών από την περιφερική μη-αδρενεργική μη χολινεργική νευρομεταβίβαση έως την λειτουργία των νευρώνων, την μάθηση και την μνήμη. Η ενδοθηλιακή μορφή του ενζύμου εμπλέκεται αρχικά στην ρύθμιση του αγγειακού τόνου στα διάφορα όργανα προκαλώντας κατά αυτόν τον τρόπο χάλαση και αγγειοδιαστολή των λείων μυικών ινών. Η απελευθέρωση του ΝΟ προάγεται από αγωνιστές είτε υποδοχεο-εξαρτώμενοι (όπως ακετυλοχολίνη, βραδυκινίνη, ισταμίνη και σεροτονίνη) είτε υποδοχεο-ανεξάρτητοι (ελεύθερα λιπαρά οξέα) (88). Επίσης σημαντική είναι η επίδραση του ΝΟ στα ερυθρά αιμοσφαίρια και στα αιμοπετάλια. Συγκεκριμένα το ΝΟ αναστέλλει την συσσώρευση, προσκόλληση και ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και των λευκών αιμοσφαιρίων (82, 89, 90-92). Σε πειραματικά μοντέλα φαίνεται ότι η εκσεσημασμένη παραγωγή ΝΟ ευθύνεται για την παρατηρούμενη αγγειοδιαστολή και την υπόταση που εκδηλώνονται στην βαρειά σήψη και το σηπτικό shock (93-95). Καθώς οι περισσότερες μελέτες χρησιμοποίησαν ενδοτοξίνη, LPS, έγινε φανερό ότι η ενδοτοξίνη προάγει την σύνθεση i-nos στο ήπαρ και στο έντερο, με αποτέλεσμα αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας του εντερικού επιθηλίου, αναστολή της πρωτεινικής σύνθεσης στο ήπαρ αλλά και σημαντική ηπατική βλάβη με αύξηση των ηπατικών ενζύμων. Επίσης η αύξηση του i-nos στην καρδιά, προκαλεί ελάττωση της συσταλτικότητας του καρδιακού μυός (96-98) ενώ στους νεφρούς προκαλεί μείωση τη νεφρικής αιματικής ροής και της σπειραματικής διήθησης (99). Ιδιαίτερα στους νεφρούς, καταδείχθηκε ότι τα αποτελέσματα της αναστολής της παραγωγής της i-nos είναι αυστηρά δοσοεξαρτώμενα (100). Έτσι μικρές δόσεις LNAME (ανάλογο της L-αργινίνης) οδηγούν σε αποκατάσταση της μέσης αρτηριακής πίεσης με φυσιολογική παραγωγή ούρων, χωρίς να προκαλούν ελάττωση της αιματικής ροής στην φλοιώδη και μυελώδη μοίρα του νεφρού (100). 44

Σε ανθρώπινες μελέτες, η αυξημένη παραγωγή ΝΟ προκαλεί αγγειοδιαστολή, ελαττωμένη ανταπόκριση στα συνήθη αγγειοσυσπαστικά και δυσλειτουργία του μυοκαρδίου σε άτομα με σηπτικό shock. Η χορήγηση γλυκοκορτικοειδών, μονοκλωνικά αντισώματα έναντι TNF-a, IL-1, IFN-γ καθώς και η αναστολή της παραγωγής συνενζύμων όπως ΒΗ4 είναι μερικές από τις θεραπευτικές προσεγγίσεις με σκοπό την ελάττωση του ΝΟ μέσω αναστολής της παραγωγής inos (101,102). Τελευταία έδαφος φαίνεται να κερδίζει η χρήση των αναλόγων της L-αργινίνης και κυρίως η LNMMA προκαλώντας αιμοδυναμικές μεταβολές κατά την διάρκεια του σηπτικού shock (103-106). Τέλος, η αναστολή της δράσης της cnos θα μπορούσε θεωρητικά να είχε κάποια αποτελέσματα ακόμη και όταν δεν υπήρχε αυξημένη παραγωγή του i-nos, έχοντας υπόψιν όμως την δράση της c NOS στην ρύθμιση του αγγειακού τόνου (102). 45

Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΣΗΨΗ Τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα αποτελούν το δεύτερο μεγάλο φαγοκυτταρικό πληθυσμό του οργανισμού. Η προσέλκυση και μετανάστευση των μονοκυττάρων στο σημείο της βλάβης ακολουθεί τα ίδια βασικά στάδια που ακολουθεί η μετανάστευση των PMN με τη διαφορά ότι οι χημειοκίνες που αναγνωρίζονται από τα μονοκύτταρα είναι διαφορετικές από εκείνες που συνδέονται με τους υποδοχείς των ουδετεροφίλων. Η αναγνώριση των παθογόνων από τα μονοπύρηνα μακροφάγα επιτυγχάνεται μέσω των μεμβρανικών υποδοχέων (PRRs) που διαθέτουν τα μονοπύρηνα για την επιφάνεια των μικροβίων (PAMPs). Σημαντικότεροι από αυτούς είναι το CD14, ο υποδοχέας της μαννόζης και οι scavenger receptors(υποδοχείς καθαριστών), οι οποίοι φαίνεται ότι μεσολαβούν και στην απομάκρυνση των αποπτωτικών κυττάρων που καταστρέφονται στην περιοχή της βλάβης. Εκτός από τους υποδοχείς αυτούς, στην μεμβράνη των μακροφάγων υπάρχει μεγάλος αριθμός υποδοχέων για μία μεγάλη σειρά συνδετών, που τους επιτρέπει τόσο την αναγνώριση οψωνινοποιημένων παθογόνων όσο και την απάντηση σε μία μεγάλη σειρά ερεθισμάτων. Η ενεργοποίηση των μακροφάγων οδηγεί σε αύξηση του μεταβολικού ρυθμού τους, στης κινητικότητάς τους, της φαγοκυτταρικής δραστηριότητας και τέλος της εκκριτικής δραστηριότητας (107). Μεταξύ των ουσιών που εκκρίνονται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα, ιδιαίτερη σημασία έχουν οι κυτταροκίνες (IL-1, 6, 10, 12) που συμμετέχουν στη εκδήλωση της αντίδρασης οξείας φάσης ενώ παράλληλα επάγουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και τη δραστική λειτουργία των λεμφοκυττάρων (108). Ο ρόλος των κυριοτέρων υποδοχεών των μονοκυττάρων και η συμμετοχή τους στον καταρράκτη της σήψης θα αναλυθεί διεξοδικά παρακάτω. 46

scd14 Το 1986 παρατηρήθηκε για πρώτη φορά η excretion του αντιγόνου ΜΥ-4 antigen (CD14) από τα μονοκύτταρα που αργότερα όπως διαπιστώθηκε επρόκειτο για την διαλυτή μορφή του CD14 (scd14) (109,110). Η έκκριση του CD14 από τα μονοκύτταρα και τα πολυμορφοπύρηνα φαίνεται να είναι δοσοεξαρτώμενη και να επάγεται από την παρουσία του λιποπολυσακχαρίτη LPS και από τον TNF-α ενώ αντίθετα η IL-4 και IFN-γ αναστέλλουν την απελευθέρωσή του (111,112).Υπό σταθερές συνθήκες, η συγκέντρωση του CD14 στον ανθρώπινο ορό είναι 2-6μg/ml, ενώ η συγκέντρωσή του στο σηπτικό shock αυξάνεται και συσχετίζεται με την θνητότητα.(113). Τα ενδοθηλιακά και τα επιθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν τον μεμβρανικό CD14 και γίνονται μέχρι 10000 φορές πιο ευαίσθητοι στην παρουσία του LPS. Η παρουσίαση του συμπλέγματος scd14-lps στο ενδοθήλιο ή στα επιθηλιακά κύτταρα οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης των μορίων προσκόλλησης, απέκριση της IL-6, IL-8 και λύση των ενδοθηλιακών κυττάρων(114-117). Ο ρόλος των LPS συνδεδεμένων πρωτεϊνών (LPS-binding protein-lbp) όσον αφορά την μεταφορά του λιποπολυσακχαρίτη στο scd14 δεν έχει ξεκαθαρισθεί(115). In vitro πειράματα έδειξαν ότι μέτριες συγκεντρώσεις του scd14 αυξάνουν την μέσω LPS ενεργοποίηση των μονοκυττάρων, μακροφάγων και των πολυμορφοπυρήνων, ενώ αντίθετα υψηλότερες συγκεντρώσεις προκαλούν αναστολή της ενεργοποίησης (112,118,119). 47

Toll-Like receptors Είναι γενικά αποδεκτό ότι οι TLRs αποτελούν τον σύνδεσμο μεταξύ της δέσμευσης των μικροβιακών συστατικών στην επιφάνεια του μονοκυττάρου και της ενεργοποίησης του καταρράκτη της ενδοκυττάριας μετάδοσης του σήματος ενεργοποίησης του κυττάρου. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 10 μέλη της οικογένειας των TLRs και όλα συμμετέχουν στην ανοσολογική απόκριση (120-122). Οι TLRs, οι υποδοχείς της IL-1 και της IL-18 εκφράζουν μία αναλογία πρός την περιοχή του υποδοχέα της IL-1 (Toll/IL-1 receptor domain, TIR) και αποτελούν την ονομαζόμενη TIR οικογένεια.(122). Έχουν καθορισθεί μέχρις στιγμής τρείς κύριες υποομάδες: η υποομάδα που περιλαμβάνει τον υποδοχέα της IL-1και IL-18, την υποομάδα πλούσια σε λευκίνη που περιλαμβάνει τους TLRs και τέλος την ομάδα που περιέχει την πρωτείνη MyD88 ειδική για την μετάδοση του ενδοκυττάριου σήματος μέσω TLR-2 και TLR-4 (122). Πιο συγκεκριμένα ο TLR-4 ευθύνεται για την αναγνώριση του LPS των gram(-) βακτηρίων, o TLR-2 είναι ο υποδοχέας για τα συστατικά της εξωτερικής μεμβράνης των gram(+) βακτηρίων, όπως LTA και PGN, ο TLR-3 είναι ο υποδοχέας για το ιϊκό RNA διπλής αλύσου, ο TLR-5 αναγνωρίζει την βακτηριακή φλαγγελίνη και ο TLR-9 εμπλέκεται στην αναγνώριση του CpG βακτηριακού DNA. Επίσης ο TLR-7 λειτουργεί ως υποδοχέας των ετεροκυκλικών αντιικών/ανοσοδιεγερτικών συνθέσεων. Tέλος ο TLR-1 πιθανά συνεργεί με τον TLR-2 στην αναγνώριση των συστατικών του κυτταρικού τοιχώματος της Neisseria meningitides ενώ επίσης αναφέρεται από άλλους ερευνητές η πιθανή συνέργεια του TLR-2 με τουςtlr1/tlr-6 μερικών λιποπεπτιδίων της κυτταρικής μεμβράνης όπως της ζυμοσάνης, του διαλυτού παράγοντα της στρεπτοκοκκικής ομάδας B, gram(+) λιποπεπτιδίων και λιποπρωτεινών (123-126). Αξιοσημείωτο είναι ότι έχουν αναφερθεί μερικά αποτελέσματα αντίθετα με τα ισχύοντα δεδομένα όσον αφορά την εξειδικευμένη δράση των TLRs. Έτσι έχει αναφερθεί αναγνώριση του LTA από τον TLR-4 αντί του TLR-2 καθώς και ενεργοποίηση του TLR-2 από τον LPS αντί του TLR4 (127-130). Πρόσφατα έχει περιγραφεί ένα ακόμη μόριο της επιφάνειας των μονοκυττάρων η πρωτείνη MD-2, η οποία είναι απαραίτητη για την μετάδοση του σήματος μέσω TLR-4 ενώ η πρωτείνη MD-1 έχει καθοριστικό ρόλο στον 48

πολλαπλασιασμό των Β-κυττάρων και παραγωγή αντισωμάτων μέσω RP105 (131136). Η ενεργοποίηση των κυττάρων από τα μικροβιακά παράγωγα εξαρτάται από το CD14 (μυελική σειρά) ή από το scd14 (ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα). Έχει καταδειχθεί πλέον ότι τόσο ο LPS (gram αρνητικά βακτήρια) όσο και οι LTA, PGN (gram θετικά βακτήρια) αντιδρούν πρώτα με τον υποδοχέα CD14 και μετά με τους TLRs (137).(Σχήμα 4) Όλοι οι TLRs συνδέονται με την MyD88, η οποία δρα σαν προσαρμοστική πρωτείνη για τον σχηματισμό των κυτταροκινών που επάγουν την φλεγμονή. Το μεσοδιάστημα μεταξύ της TLR-TIR και της MyD88-TIR περιοχής περιλαμβάνει την Β-Β αγκύλη που περιέχει τις ββ ίνες και την έλικα αβ. Ολοι οι TLRs περιέχουν την αγκύλη αυτή και η οποία είναι βασική για την μετάδοση του σήματος (138). Στη συνέχεια της μετάδοσης του σήματος παίζει σημαντικό ρόλο η IRAK (σχετιζόμενες κινάσες με τον υποδοχέα της IL-1) οικογένεια. Η MyD-88 συνδέεται με την IRAK, IRAK 2 οι οποίες ενεργοποιούνται μετά την σύνδεσή τους αυτή, αυτοφωσφορυλιώνονται και αντιδρούν με τον παράγοντα TRAF6 (παράγοντας-6 σχετιζόμενος με τον υποδοχέα του παράγοντα νέκρωσης των όγκων, tumor necrosis factor receptor-associated factor 6). Ο παράγοντας TRAF6 διασπάται σε ολιγομερή ενώ δημιουργείται ένα πρωτεινικό σύμπλοκο που αποτελείται από τις TAK1 (κινάση 1 που ενεργοποιείται από τον TGF (transforming growth factor) β) και τις πρωτείνες 1,2 που συνδέονται με την ενεργοποιημένη από τον TGF-β κινάση (TGF-β activated kinase binding proteins 1 and 2) (139). Τελικό αποτέλεσμα είναι η ενεργοποίηση της κινάσης που επάγει τον πυρηνικό παράγοντα NF-Κb (nuclear factor- κβ inducing kinase) και η οποία αποτελεί μέλος της οικογένειας της πρωτεινικής- ενεργοποιημένης από το μιτογόνο (mitogen-activated protein/map) κινάση κινάση κινάση (MAP3 K family)(140). Η ενεργοποίηση της οδηγεί στην φωσφορυλίωση της Ικ-Β-α κινασών (ΙΚΚ, Ικ-Β kinase) στις θέσεις σερίνης 32 και 36 (140,141) για να οδηγήσει στη συνέχεια στην ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα NF-Κb προάγοντας την έκφραση του mrna αντιδρώντας άμεσα με τα γονίδια που παράγουν τις ΕΦ κυτταροκίνες (Σχήμα 5). Η Rel/NF-κΒ οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων είναι ένα πολυπρωτεινικό σύμπλεγμα που ευθύνεται για τη γρήγορη ανταπόκριση του κυττάρου μετά από διέγερση με φυσιολογικά ή παθολογικά ερεθίσματα συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εμπλέκονται στην παθογένεση του SIRS, MODS 49

και ARDS,όπως ενδοτοξαιμία, ισχαιμία, IL-1β, TNF-α, ROS (142). NF-κB είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από ένα πολυπεπτίδιο 50 kd, το ονομαζόμενο NF-κB1ή p50 και ένα πολυπεπτίδιο 65 kd που ονομάζεται RelΑ ή p65 (143, 144). Τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας των Rel πρωτεινών περιλαμβάνουν τους παράγοντες c-rel, RelB και p52(nf-κb2). Στα αδρανή κύτταρα, NF-κΒ είναι στο κυττταρόπλασμα αντιδρώντας με τους αναστολείς ΙκΒ-α, ΙκΒ-β ή ΙκΒ-ε. Η ενεργοποίηση του ΝF-κΒ έχει ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση των αναστολέων ΙκΒ-α,ΙκΒ-β και ΙκΒ-ε και στην συνέχεια την μεταφορά του παράγοντα NF-κΒ στον πυρήνα του κυττάρου όπου τα p50 και p65 διμερή είναι έτοιμα να ενωθούν με εκείνα τα μόρια του DNA που περιέχουν την αλληλουχία (5 -GGGPuNNPyPyCC-3 ). Η ενεργοποίηση του NF-κΒ δεν οδηγεί σε συνεχή παραγωγή ΕΦ μεταβιβαστών καθώς τόσο ενδοκυττάριοι όσο και εξωκυττάριοι μηχανισμοί είναι υπεύθυνοι για την απενεργοποίηση του. Η ενδοκυττάρια μεταγραφή των ΙκΒ-α και p105 γονιδίων που ακολουθούν την ενεργοποίηση του παράγοντα ΝF-κB έχει πιθανά ως αποτέλεσμα την αναστολή της λειτουργίας του, μέσω αρνητικής τροφοδότησης (feedback), οδηγώντας σε τερματισμό της μεταγραφής των κυττοκινών και περιορίζοντας κατά συνέπεια την διαδικασία της φλεγμονής (145-147). Επιπρόσθετα, παράγοντες που επάγουν την φλεγμονή όπως η ενδοτοξίνη, ο TNF-α και η IL-1β διεγείρουν την παραγωγή κυττοκινών, όπως η IL-10, που με την σειρά τους καταστέλλουν την παραγωγή των προφλεγμονωδών κυττοκινών. Πρόσφατα φάνηκε ότι η IL-10 μπορεί να αναστείλει την παραγωγή των κυτοκινών στα μονοκύτταρα μέσω απενεργοποίησης του παράγοντα NF-Κβ αλλά ο μηχανισμός παραμένει άγνωστος (148). 50

Σχήμα 4. Η σύνδεση των συστατικών του βακτηριακού τοιχώματος με το CD14 και το scd14. Φαίνεται η συμμετοχή των LBP, (s)cd14,tlr2, και TLR4 στην ενεργοποίηση τόσο των κυττάρων που εκφράζουν το CD14 όσο και αυτών που δεν το εκφράζουν. (Ανατύπωση από Edwin S.Van Amersfoot. Receptors, mediators and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Cl.Microb.Rev. July 2003) 51

Σχήμα 5. Tόσο ο LPS (gram αρνητικά βακτήρια) όσο και οι LTA, PGN (gram θετικά βακτήρια) αντιδρούν πρώτα με τον υποδοχέα CD14 και μετά με τους TLRs. Οι TLRs συνδεόμενοι με την MyD88, ενεργοποιούν τα μέλη της IRAK οικογένειας οδηγώντας μέσα από μία σειρά αντιδράσεων στην ενεργοποίηση της κινάσης που επάγει τον πυρηνικό παράγοντα NF-Κb. (Ανατύπωση από Edwin S.Van Amersfoot. Receptors, mediators and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock. Cl.Microb.Rev. July 2003) 52