EIMI REAKIJE, KIETIKA I IIBIIJA Visoko specializirani proteini in mala skupina katalitičnih molekul RA biološki katalizatorji Katalizirajo kemijske reakcije v živih organizmih - pospeševanje do 10 6-10 16 x Zmanjšajo E a, ne vplivajo na ΔG 0 Kontrola poteka vitalnih kemijskih reakcij uravnavanje metabolizma Zelo specifični EIMI Pomembni v diagnostiki in različnih industrijskih panogah Kataliza poteka v aktivnem (katalitičnem) mestu ZGRADBA EIMV Aktivni samo v nativni konformaciji M = 12.000 1.000.000 Da Enostavni in sestavljeni proteinski del kofaktor (anorganski ion ali kompleksna (metalo)organska molekula koencim) -prost - kovalentno vezan (prostetična skupina) Apoencim (apoprotein)
ITERAIALA KLASIFIKAIJA EIMV Št. Razred Tip reakcije 1. KSIDREDUKTAZE Prenos elektronov 2. TRASFERAZE Prenos skupin 3. IDRLAZE Reakcije hidrolize 4. LIAZE Adicija skupin na dvojno vez, ali tvorba dvojne vezi z odstranjevanjem skupin 5. IZMERAZE Prenos skupin znotraj molekule 6. LIGAZE Tvorba -, -S, - in - vezi s kondenzacijo in sproščanjem ATP-ja ATP + D-glukoza glukoza fosfotransferaza ADP + D-glukoza-6-fosfat Klasifikacijsko število: 2.7.1.1. Št. razreda (transferaza) Št. podrazreda (fosfotransferaza) Glukoza kot akceptor fosfatne skupine Fosfotransferaze z -skupino kot akceptorjem KSIDREDUKTAZE - PRIMER AD + AD + + 3-3 - laktat AD + AD + + piruvat Laktat dehidrogenaza (L-laktat: AD + oksidoreduktaza) 1.1.2.3.
TRASFERAZE - PRIMER (d-mp) n + d-tp (d-mp) n+1 + PP i DA polimeraza (Deoksinukleotid trifosfat: DA deoksinukleotidiltransferaza) 2.7.7.7. IDRLAZE - PRIMER 3 2 2 + ( 3 ) 3 + 2 + 2 2 + ( 3 ) 3 acetilholin acetat holin 3 Acetilholinesteraza (Acetilholin acetilhidrolaza) 3.1.1.7. LIAZE - PRIMER 2 + 2 2 3 karbonska kislina + 2 Karboanhidraza (Karbonatna hidrolaza) 4.2.1.1.
IZMERAZE - PRIMER 2 P 3 2-2 P 3 2-2 Dihidroksiaceton fosfat Gliceraldehid 3-fosfat Trioza fosfat izomeraza (D-gliceraldehid-3-fosfat ketoizomeraza) 5.3.1.1. LIGAZE- PRIMER 3 - ATP - 2 - + 2 piruvat oksaloacetat Piruvat karboksilaza (Piruvat: 2 ligaza) 6.4.1.1. UVD V EIMSK KIETIK E + S ES E+P itrost reakcije je definirana kot količina produkta ki nastane, ali količina substrata, ki se razgradi v enoti časa. Monomolekularne reakcije: v = ds/dt = k*s k = v/s (s -1 ) reakcija 1. reda. Bimolekularne reakcije: v = k*s 1* S 2 k = v/s 1 S 2 (M -1 s -1 ) reakcija 2. reda. Pri encimih zveza med v in [S] ni linearna pri visokih [S] prihaja do nasičenja - reakcija 0. reda. (Ena od razlik med encimi in kemičnimi katalizatorji!)
SMER I ITRST EIMSKE REAKIJE Razlika med ΔG in ΔE a elotna sprememba proste energije reakcije je povezana z ravnotežno konstanto K r: ΔG 0 = - RT.ln K r (smer reakcije!) Aktivacijska energija je povezana s konstanto hitrosti reakcije: k = k max.e -Ea/RT (hitrost reakcije!) pomba: ni povezave med K r in k!! Encim = katalizator: zmanjša aktivacijsko energijo E a Prehodno stanje Prosta energija, G Aktivacijska energija, E a ΔG nespremnjena! Aktivacijska energija E a z encimom Prosta energija, ΔG Reakcijske koordinate Vpliv temperature na ΔG in E 0 Vpliv encima na ΔG in E 0 Prosta energija, G Prosta energija, G G (S ), T 2 G (S ), T 1 G (S ) G (P ), T 2 G (P ), T 1 Reakc. koordinate Prehodno stanje Prehodno stanje E (nekatalizirano) a nekatal. Prehodno stanje (katalizirano) E a katal. G (P ) Reakc. koordinate
KATALITIČE LASSTI EIMV (PVZETEK) 1. Zvišujejo hitrost reakcije z zniževanjem E a 2. V reakciji se ne porabljajo in/ali spreminjajo 3. e vplivajo na ravnotežje reakcije 4. avadno delujejo tako, da tvorijo prehodni kompleks z reaktantom in stabilizirajo prehodno stanje ČASVI PTEK EIMSK KATALIZIRAE REAKIJE Produkt Koncentracija Substrat ES E Čas MIAELIS-METEVA TERIJA Leonor Michaelis Maud Menten
MIAELIS-METEV GRAF itrost reakcije v 0 (frakcija V max ) 2,0 1,5 1,0 0,5 V max območje reakcij ničelnega reda (nasičenje) območje prehoda območje reakcij prvega reda 0,0 0 1 2 3 4 5 K m Koncentracija substrata (n x K m ) MIAELIS-METEVA EAČBA k 1 k 3 E + S ES E+P k 2 k 4 MM enačba: V max [S] v 0 = K m + [S] E encim S substrat P produkt k 1,2,3,4 - hitrostne konstante Pogoji: - zanemarimo pretvorbo P v E in ES - [ES] je v dinamičnem ravnotežju MIAELIS-METEVA KSTATA K m k 1 E + S ES E+P k 2 k 3 Če je k 2 >> k 3 (k 3 je zanemarljiva), je K m = K d kompleksa ES! K m = k 2 + k 3 k 1 Pri večini encimov: K m = 10-1 10-8 M K m = k 2 k 1 Če je k 2 >> k 3, je K m mera za afiniteto med E in S!
MAKSIMALA ITRST (V max ) V max teoretična maksimalna hitrost encimsko katalizirane reakcije pri določeni koncentraciji encima V max = k 3.[E] t - je konstanta - v se asimptotično približuje V max PRETVRBE ŠTEVIL (k kat ) I KATALITIČA UČIKVITST k kat /K m k kat je število molekul S, ki jih pretvori 1 mol E v časovni enoti (pri nasičenju E s S, to je [S]>>[E]) Je mera za katalitično učinkovitost. Če velja M-M model (nasičenost E z S): k 3 = k kat = V max /E t Katalitična učinkovitost = k kat /K m cena za učinkovitost encima! PRIMERI VREDSTI K m, k kat I k kat /K m EIM: K m (M) k kat (s) k kat /K m (s -1 M -1 ) Katalaza 1.1 40.000.000 40.000.000 Karboanhidraza 0.012 1.000.000 83.000.000 Acetilholinesteraza 0.00009 14.000 160.000.000 PVZETEK: V max, K m in k kat so glavni parametri za vrednotenje učinkovitosti encimsko katalizirane reakcije določamo jih eksperimentalno!
LIEWEAVER-BURKV GRAF (DVJI REIPRČI GRAF) 2,0 1 K m 1 1 =. + V 0 V max [S] V max 1/V 0 (mmol/min) -1 1,5 1,0-1/K m 0,5 1/V max -4-2 0 2 4 6 8 1/[S] (M -1 ) DEJAVIKI, KI VPLIVAJ A EIMSK AKTIVST 1. [S] 2. [E] 3. p 4. T 5. Efektorji: aktivatorji in inhibitorji VPLIV KETRAIJE EIMA 14 12 10 v 0 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [E]
VPLIV p 50 p optimum 40 30 pepsin v 0 20 tripsin 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 p VPLIV TEMPERATURE 50 temperaturni optimum 40 30 v 0 20 10 0 0 20 40 60 80 100 temperatura ( ) EFEKTRJI IIBITRJI AKTIVATRJI Reverzibilni -Kompetitivni -ekompetitivni -Mešani -Antikompetitivni Ireverzibilni
KMPETITIVA IIBIIJA AKTIV MEST SUBSTRAT KMPETITIVI IIBITR EIM KMPETITIVA IIBIIJA 1/V 0 (mmol/min) -1 2,0 S + I S 1,5 1,0-1/K m 0,5-1/K eff. 1/V max = 1/Veff. -4-2 0 2 4 6 8 1/[S] (M -1 ) EKMPETITIVA IIBIIJA AKTIV MEST SUBSTRAT AKTIV MEST SUBSTRAT EIM EIM EKMPETITIVI IIBITR REGULATR MEST EKMPETITIVI IIBITR
EKMPETITIVA IIBIIJA 1/V 0 (mmol/min) -1 2,0 1,5 1,0 1/V eff. S + I S -1/K m = -1/K eff. 0,5 1/V max -4-2 0 2 4 6 8 1/[S] (M -1 ) IREVERZIBILA IIBIIJA Ireverzibilni inhibitor tvori kovalentne ali močne nekovalentne vezi z encimom Acetilholinesteraza 2 3 F P 3 3 3 Acetilholinesteraza 2 3 P 3 3 3 + F DIFP (živčni strup) kovalentna vez AKTIV MEST EIMA Aktivno mesto encima vezavna regija za substrat, tukaj steče razgradnja S v P - specifičnost za substrat (absolutna ali skupinska) - relativno mala, 3D regija v encimu - substrat se na začetku veže v aktivno mesto s šibkimi, nekovalentnimi vezmi produkta encim Kompleks encim-substrat
MDELI VEZAVE EIM-SUBSTRAT 1. Model ključa in ključavnice (E. Fischer, 1890) 2. Model induciranega prileganja (D. Koshland, 1958) 3. Model analoga prehodnega stanja DRG ZLMAZA 1. BREZ EIMA Substrat (železni drog) Prehodno stanje (zviti drog) Produkt (zlomljen drog) 2. EIM, KMPLEMETARE SUBSTRATU 3. EIM, KMPLEMETARE PREDEM STAJU (Drog-zvijazozlomaza) BLIKE KATALIZE Kataliza proces, s katerim se povečuje hitrost dosezanja ravnotežja kemijske reakcije Tipi katalize: 1. Zmanjšanje entropije pri tvorbi ES 2. Vpliv bližine in orientacije 3. apetosti, zvijanje vezi 4. Desolvatacija kompleksa ES 5. Kislinsko-bazna kataliza 6. Kovalentna kataliza 7. Kataliza s kovinskim ionom
REGULAIJA EIMSKE AKTIVSTI Regulacija na genetskem nivoju ormoni Prisotnost koencimov in esencialnih kovinskih ionov Kovalentne modifikacije Izoencimi Proteolitska aktivacija Alosterične interakcije KEIMI Koencimi: snovi, ki sodelujejo v encimsko kataliziranih reakcijah skupaj z encimi ujni, vendar se kemijsko ne spremenijo Mehanizem delovanja: Prosti mobilni prenašalci e - ali funkcionalnih skupin Vezani kovalentno v zgradbo encima (prostetična skupina) sprejemajo in oddajajo e - ali skupine KEIMI I VITAMII Mnogi vitamini so koencimi ali sestavni deli koencimov (prekurzorji) Vitamine in koencime delimo na: "topne v vodi "topne v maščobah" Vitamini topni maščobah (lipofilni) : A, D, E, K Vitamini topni v vodi (hidrofilni): B, Veliko koencimov vsebuje AMP
KEIMI KSID-REDUKTAZ - AD + (nikotinamid adenin dinukleotid) - ADP + (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat) - FAD (flavin adenin dinukleotid) - FM (flavin mononukleotid) - lipoat - vitamin (askorbat) - oq (koencim Q, ubikinon), itd. AD + in ADP + Piridinska nukleotida, prenašata 2 elektrona in en proton Prenašata hidridni anion ( - ) od substrata do substrata AD + in ADP + sta prosta in mobilna P P + 2 2 2 hidridni ion + + AD + AD oksidirana oblika. - 2 reducirana oblika ikotinamid (niacin) 2 ADP + ima tukaj vezan P! VLGA AD + in ADP + Različna vloga vezani so na različne encime: 1) AD + posrednik e - v katabolizmu 2) ADP + posrednik e - v anabolizmu ADP + + = reduktivna moč
FAD I FM 3 3 2 Izoaloksazin (flavin) Ribitol Riboflavin (vitamin B2) FM FAD 2 P P 2 2 AMP FAD I FM Prenašata dva elektrona in dva protona FAD in FM sta trdno vezana na encime 3 + + e - + + e - 3 3 3 3 3 R R R FAD (rumen) FAD + semikinon (rdeč ali moder) FAD 2 (brezbarven) LIPIČA KILSIA (LIPAT) kovalentno vezana na lizin v encimu je univerzalni antioksidant, obnavlja aktivno obliko vitamina ksidirana oblika 2 + 2e - Reducirana oblika S S 2 + 2e - S S Lipoat Lizin Lipoamid
VITAMI (ASKRBISKA KISLIA, ASKRBAT) Sintetizira jo veličina rastlin in živali zanje ni vitamin Vitamin je močan reducent Deluje kot prenašalec elektronov 2 2. 2 2. Askorbat Dehidroaskorbat KEIM Q (UBIKI) ajmanjši in najbolj hidrofoben prenašalec elektronov Del elektronske transportne verige na notranji membrani mitohondrija in v kloroplastih 3 3 3 3 2 2 Ubikinon (oq) + + e - + + e - 3 3 3 3 3 3 R 3 2 2 R 3 2 2 R Semikinonski intermediat (Q. ) Ubikinol (Q 2 ) KEIMI PREAŠALI 1 -ET SAM (S-adenozil-metionin) Metilacija (prenos 3 ) Karboksi-biotin Karboksilacija (prenos ) Folat (tetrahidrofolat, dihidrofolat) Prenos več različnih 1-enot (napr., - 2 -, itd.)
BLIKE 1-SKUPI V BILŠKI SISTEMI R E D U K I J A - 3 Metilna Metilenska idroksimetilenska Karbonilna (okso) Karboksilna 2 K S I D A I J A S-ADEZILMETII (SAM) + 3 3 - - 2 2 S metionin + ATP Pi + Pii + + 3 3 2 2 S + S-adenozilmetionin (SAM) 2 2 Akceptor metilne skupine: Aminokislinski ostanki proteinov ukleotidne baze v DA t-ra oradrenalin Metilirani produkt: metilirane AK v proteinih (Lys, Arg, Asp, Glu) -metiladenin, -metilcitozin metilirane baze v t-ra adrenalin Mobilni prenašalec karboksilne skupine - : nastane -karboksibiotin BITI Kovalentno vezan na lizin Biotinski obroč vezan na encim z dolgo fleksibilno verigo
TETRADRFLAT (F 4 ) 2 5 2 10 2 2 - - pteridinski derivat p-aminobenzojska kislina glutamat Skupine z enim -atomom, ki jih prenaša FT 4 : - 3 (metilna) prenos na 5-2 - (metilenska) prenos na 5, 10 -= (formilna) prenos na 10 Folati so donorji 1- enot vseh oksidacijskih stopenj ogljika, razen za 2 KEIMI PREAŠALI AILI STAKV oa (koencim A) aktivacija maščobnih kislin! Karnitin prenos mašč.kislin v mitohondrij oa (oas) KEIM A Funkcije: Aktivacija acilnih skupin za transfer z nukleofilnim napadom (potreben ATP!) Prenaša acilne ostanke (napr. Ac-SoA, palmitoil-soa, itd.) oa Panteinska skupina (vitamin B 3 ) S 2 2 2 2 2 P 3 3 P 2 ADEZI
KEIMI PREAŠALI GLIKZILI STAKV UDP UDP-Glc, UDP-Gal, itd. GDP GDP-Man MP MP-AA KEIMI ZA PRES SULFATA PAPS (fosfoadenozin-fosfosulfat)= aktivni sulfat S P ADEI P KEIMI ZA PRES AMI SKUPIE Piridoksin in piridoksal-fosfat (vitamin B6) Sodelujeta pri pretvorbah aminokislin Sodelujeta v reakcijah: -transaminacije - dekarboksilacije - eliminacije - racemizacije
PIRIDKSALFSFAT - TRASAMIAIJA Glu Encim + Pirodoksal-P Asp α-ketoglutarat Encim + Piridoksamin-P ksaloacetat KEIMI ZA PRES FSFATE SKUPIE ATP (tudi GTP) bravnava pozneje! STALI KEIMI Tiamin-pirofosfat (TPP, vitamin B 1 ) vitamin B 12 (kobalamin), itd.
RETIL (VITAMI A) Retinol se pretvarja v retinal v očesni retini in se veže na opsin rodopsin-za svetlobo občutljivi pigmentni protein v palčkah in čepkih Vitamin A vpliva na rast in diferenciacijo tkiv 2 retinol 11-cis-retinal Vezava na opsin VITAMI D olekalciferol: nastaja v koži iz 7-dehidroholesterola (UV-svetloba) Ergoholesterol: nastaja iz ergosterola V krvi: 25-hidroksivitamin D (najaktivnejša oblika) Regulira homeostazo kalcija Sodeluje v uravnavanju homeostaze fosfatov olekalciferol 2 VITAMI E (α-tkferl) učinkovit antioksidant preprečuje oksidacijo membranskih lipidov 3 3 3 3 n 3 3
VITAMI K Bistven za strjevanje krvi 3n n vitamin K 1 (filokinon) vitamin K 2 (menakinon) REGULATRI EIMI E1 E2 E3 A B D - številni metabolni procesi potekajo v zaporednih encimsko kataliziranih reakcijah - vsaj eden od encimov v tej verigi je regulatoren in določa hitrost celega procesa Vplivi na regulatorne encime: 1. Končni produkt v zaporedju 2. Začetni substrat v zaporedju 3. Intermediat v zaporedju 4. Znanji faktor (hormon) 5. Vse našteto Metabolna Glavni regulatorni encim: E1. integracija ALSTERIČI EIMI Regulatorni encimi, delovanje katerih je regulirano preko reverzibilne, nekovalentne vezave na malo signalno molekulo EFEKTR. Efektor: 1. Pozitiven (stimulira delovanje encima) 2. egativen (zavira delovanje encima) Efektor = substrat homotropna alosterična interakcija. Efektor = substrat heterotropna alosterična interakcija.
LASTSTI ALSTERIČI EIMV -ne sledijo Michaelis-Mentenovi kinetiki (sigmoidne, ne hiperbolične krivulje) -imajo kompleksnejšo strukturo (več podenot) -razen katalitičnega, imajo še regulatorno mesto za vezavo efektorja VEZAVA I KATALIZA A EEM MESTU VPLIVA A VEZAV I KATALIZ A DRUGEM MESTU! KIETIČE LASTSTI ALSTERIČI EIMV iperbolična kinetika (ni kooperativnosti) v 0 Sigmoidna kinetika Podenote + kooperativnost izka aktivnost Visoka aktivnost