ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ. ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΙΤΛΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΦΥΣΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ ΚΑΙ ΛΟΙΜΩΞΗ ΟΝΟΜΑ ΦΟΙΤΗΤΗ ΓΚΟΥΓΚΟΥΡΕΛΑΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΟΝΟΜΑ ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΑ ΚΑΘΗΓΗΤΗ Αναπλ. Καθηγήτρια ΠΑΝ. ΜΠΟΥΡΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΜΗΝΑΣ ΕΤΟΣ ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ 2006

2

ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΜΠΟΥΡΑ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ Αναπλ. Καθηγήτρια Παθολογίας-Κλινικής Ανοσολογίας ΔΑΝΙΗΛΙΔΗΣ ΜΙΧΑΛΗΣ Αναπλ. Καθηγήτης Παθολογίας ΚΥΡΙΑΖΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ Αναπλ. Καθηγήτης Βιοπαθολογίας 3

4

Ευχαριστώ τον Αλέξανδρο, τον Κώστα,τον Παναγιώτη, την Σοφία για την πολύτιμη βοήθεια τους. 5

6

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή 9-10 Εξέλιξη του ανοσιακού συστήματος 10-14 Στοιχεία φυσικής ανοσίας Φυσικοί και χυμικοί φραγμοί Επιθηλιακοί φραγμοί 14-16 Αντιβιοτικά μόρια 16-17 Κύτταρα της φυσικής ανοσίας Ενδοεπιθηλιακά κύτταρα 18-20 Πολυμορφοπύρηνα 20-21 Αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα 21-25 Μακροφάγα 26-28 Φυσικά κυτταροκτόνα 28-31 Χημειοκίνες 31-33 Συμπλήρωμα 33-35 Πρωτεΐνες οξείας φάσης 35-38 Κυτταροκίνες 38-41 Μόρια προσκόλλησης 41-45 Ο ρόλος της φυσικής ανοσίας στην λοίμωξη 45-47 Μοντέλα λοίμωξης 47-49 Αναγνώριση παθογόνου 49-54 Επεξεργασία και παρουσίαση παθογόνου 54-56 Εξόντωση-βακτηριογόνος δράση 56-58 Ενεργοποίηση Τ λεμφοκυττάρου 58-60 Ο ρόλος της συνδιέγερσης 60-65 7

Υλικό και μέθοδοι Ομάδες μελέτης 66-67 Ερευνητικό πρωτόκολλο 67-69 Προετοιμασία δείγματος ολικού αίματος 69-70 Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής 70-75 Στατιστική μεθοδολογία 75 Αποτελέσματα 76-80 Συζήτηση 81-83 Περίληψη 84 Abstract 85 Βιβλιογραφία 86-89 8

ΦΥΣΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ ΚΑΙ ΛΟΙΜΩΞΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η άμυνα του ανθρώπινου οργανισμού εναντίον των παθογόνων (μικροβίων, ιών, παρασίτων) πραγματοποιείται αρχικά με τη διαμεσολάβηση της φυσικής ανοσίας που αντιδρά πρώιμα και σε δεύτερο χρόνο με την αντίδραση της ειδικής ανοσίας. Η φυσική ανοσία (ονομάζεται και έμφυτη ή μη ειδική ανοσία) αποτελείται από κυτταρικές ομάδες και βιοχημικά συστήματα τα οποία υφίστανται και πριν την επαφή με τα παθογόνα. Ενεργοποιούνται άμεσα όταν έρθουν σε επαφή με μικρόβια χωρίς όμως να δείχνουν εξειδίκευση ή ανάμνηση του επιβλαβούς παράγοντα μετά την επαφή. Οι μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας δηλαδή είναι η πρώτη γραμμή άμυνας έναντι των λοιμώξεων και είναι αυτοί που απαντώνται ως το πρωιμότερο ανοσιακό σύστημα κατά την εξέλιξη των οργανισμών. Το φάσμα των πιθανών μοριακών δομών στα οποία μπορεί να αντιδράσει η φυσική ανοσία είναι σχετικά περιορισμένο (μερικές εκατοντάδες). Πιο συγκεκριμένα, οι υποδοχείς της φυσικής ανοσίας μπορούν να αναγνωρίζουν μια ομάδα συντηρημένων μοριακών πρότυπων δομών, βασικών για την επιβίωση των παθογόνων με δομή εντελώς διαφορετική από τα μόρια του ανθρώπινου οργανισμού, που ονομάζονται PAMPs (pathogen associated molecular patterns). Οι υποδοχείς αυτοί καλούνται υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων PRRs (pattern recognition receptors). Οι πιο καλά μελετημένοι PRRs είναι οι TLRs (Toll like receptors), οι οποίοι ονομάστηκαν έτσι εξαιτίας της ομολογίας τους με τους Toll υποδοχείς της δροσόφυλλα και θα περιγραφούν αναλυτικότερα παρακάτω. Τα χαρακτηριστικά της μη ειδικής ανοσίας είναι η έλλειψη ειδικότητας στην απάντηση σε διαφορετικά μοριακά συμπλέγματα και η αδυναμία πιο αποτελεσματικής και γρήγορης απάντησης σε περίπτωση επαναλοίμωξης. Επιπλέον, οι υποδοχείς της φυσικής ανοσίας παράγονται από αρχέγονα γονιδιακά στοιχεία που δεν ανασυνδυάζονται στον πυρήνα των κυττάρων. Σε αντίθεση, η ειδική ανοσία, στον ανθρώπινο οργανισμό και στα αλλά ανώτερα θηλαστικά αναπτύσσει αντιδράσεις οι 9

οποίες γίνονται ολοένα και πιο αποτελεσματικές σε κάθε διαδοχική επαφή με το μολυσματικό παράγοντα. Επειδή αυτή η μορφή ανοσιακής απάντησης κατευθύνεται ειδικά έναντι του παθογόνου / μη εαυτού καλείται ειδική ανοσία και χαρακτηρίζεται από την ικανότητα ανάμνησης του λοιμογόνου παράγοντα. Οι υποδοχείς της ειδικής ανοσίας (T cell receptors: TCRs) προέρχονται από τον σωματικό ανασυνδυασμό των γονιδίων (V, D, J, στοιχείων των ανοσοσφαιρινών) στον πυρήνα του Τ λεμφοκυττάρου και εμφανίζουν κλωνική κατανομή. Σε αντίθεση με τους PRRs που αναγνωρίζουν πρωτεΐνες, υδατάνθρακες και απλές χημικές δομές, ο TCR αναγνωρίζει μόνο (με εξαίρεση τα γδ Τ λεμφοκύτταρα) πεπτίδια που προέρχονται από πρωτεϊνικά αντιγόνα, συνδεδεμένα με ΜHC μόρια στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. Βέβαια αξίζει να τονιστεί ότι ο διαχωρισμός φυσικής και ειδικής ανοσίας είναι περιγραφικός για λόγους κατανόησης, μιας και οι δυο τύποι ανοσιακής απάντησης είναι τμήματα ενός πολύπλοκου, καλά ενορχηστρωμένου αμυντικού μηχανισμού. Η φυσική ανοσία είναι αυτή που ξεκινά, διεγείρει και κατευθύνει την ειδική απόκριση ενώ η ειδική ανοσία χρησιμοποιεί τους εκτελεστικούς δρόμους της μη ειδικής ανοσίας για να έρθει σε επαφή και να καταστρέψει τους εισβολείς (Puledran B 2005, Hume D, Hertzog P 2006, Abbas A K 2003). Συνοπτικά τα διαφορετικά χαρακτηριστικά της ειδικής και μη ειδικής ανοσίας παρουσιάζονται στον πίνακα 1. ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΟΥ ΑΝΟΣΙΑΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Μηχανισμοί άμυνας του ξενιστή έναντι των μικροβίων ανευρίσκονται σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς. Αυτοί οι μηχανισμοί προσομοιάζουν στην φυσική ανοσία ενώ η πιο εξειδικευμένη άμυνα που αποτελεί την ειδική ανοσία ανευρίσκεται μόνο στα σπονδυλωτά. Από την μελέτη του ζωικού βασιλείου φαίνεται ότι οι μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας (φαγοκυττάρωση, αντιμικροβιακή δράση πρωτεϊνών) εξελίχθηκαν πρώτοι (δισεκατομμύρια χρόνια πριν) και αποτέλεσαν την βάση για την ανάπτυξη των πολύπλοκων μηχανισμών της ειδικής ανοσίας (περίπου 400 εκατομμύρια χρόνια πριν, κατά των διαχωρισμό σπονδυλωτών ασπόνδυλων) μέσω της φυσικής επιλογής και του ανταγωνισμού ξενιστή-μικροβίου. 10

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Φυλογέννηση Ταχύτητα απόκρισης Μη ειδική ανοσία Σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς Άμεση απάντηση (εντός ωρών) Ειδική ανοσία Στα χονδρωτά Καθυστερημένη (εντός ημερών) Ποικιλότητα Περιορισμένη Μεγάλη, οι υποδοχείς παράγονται από σωματικό ανασυνδυασμό γονιδίων (10 11 διαφορετικοί κλώνοι Τ και Β λεμφοκυττάρων) Συνδεσιμότητα Για βασικές, κοινές δομές που Για ποικίλα, ειδικά μικροβιακά μοιράζονται συγγενικά και μη μικροβιακά αντιγόνα μικρόβια Μνήμη Καμία Ναι Υποδοχείς Εμβρυικά κωδικοποιούμενοι Μη κλωνικοί Σωματικά ανασυνδυασμένοι Κλωνικοί Ένα κύτταρο - πολλοί Κάθε λεμφοκύτταρο - ένας υποδοχείς υποδοχέας ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ Φραγμοί Δέρμα, βλεννογόνοι, αντιμικροβιακές ουσίες Λεμφοκύτταρα στα επιθήλια Αντισώματα εκκρινόμενα Πρωτεΐνες αίματος Συμπλήρωμα Αντισώματα Κύτταρα Φαγοκύτταρα (ΝΚ, μακροφάγα) Λεμφοκύτταρα Πίνακας 1: Διαφορές της φυσικής και της ειδικής ανοσίας ( Abbas A K 2003). 11

Οι Medzhitov και Janeway προτείνουν δύο εναλλακτικά εξελικτικά μοντέλα για την διαμόρφωση των σχέσεων ξενιστή παθογόνου με την πάροδο του χρόνου. Σύμφωνα με το πρώτο μοντέλο, στον ξενιστή δημιουργήθηκαν υποδοχείς για να επιτελέσουν διαφορετικές φυσιολογικές λειτουργίες από την αναγνώριση του παθογόνου. Όσα από τα επιφανειακά μόρια παρουσίαζαν συμπτωματικά ομολογία με μόρια των παθογόνων, λειτούργησαν ως οι πρώτοι υποδοχείς της φυσικής ανοσίας και ευνοήθηκαν από την φυσική επιλογή. Τυπικό παράδειγμα αποτελεί ένας PRR και ένας PAMP ή προκειμένου για ανώτερα θηλαστικά ένας αντιγονικός υποδοχέας και ένα μικροβιακό αντιγόνο (Medzhitov R, Janeway A C 2002). Η Matzinger κάνει την εκπληκτική πρόταση ότι οι PRRs εξελίχθηκαν για λόγους άσχετους με την ανίχνευση του περιβάλλοντος και όχι παράλληλα με τα μικρόβια. Σύμφωνα με το δεύτερο μοντέλο το μικρόβιο εξελίχθηκε για να αναγνωρίζει υποδοχείς του ξενιστή οι οποίοι εξελίχθηκαν ανεξάρτητα (Matzinger Ρ 2002). Κατά αυτήν την εκδοχή το βακτήριο αλληλεπιδρά με τον οργανισμό προς όφελος του και προκαλεί λοίμωξη. Παράδειγμα είναι η αναγνώριση της ανθρώπινης Ε καθερίνης από την ιντερναλλίνη Α (internallin A, ένας λοιμογόνος παράγων-pamp της λιστέρρια) και η αναγνώριση του CD4 υποδοχέα από τον ιό της επίκτητης ανοσιακής ανεπάρκειας (ΗΙV). Στον παρασιτισμό παρατηρείται το φαινόμενο της συμβίωσης κατά το οποίο είναι δυνατό να επωφελούνται και o ξενιστής και το μικρόβιο. Τα δυο αυτά μοντέλα προσπαθούν να εξηγήσουν με εξελικτικούς μηχανισμούς την εκπληκτική λειτουργικότητα που παρουσιάζουν οι PAMPs και οι PRRs στην εξυπηρέτηση του μικροοργανισμού και του ξενιστή αντίστοιχα. Όπως και σε άλλους χώρους της συστηματικής βιολογίας έτσι και στην μελέτη του ανοσιακού συστήματος κεντρικό ρόλο κατέχει η μελέτη της μύγας δροσόφυλλα. Η διαθεσιμότητα μεγάλου αριθμού μεταλλαγμένων στελεχών και η δυνατότητα εύκολων γενετικών αναλύσεων κατέστησαν το είδος αυτό πρότυπο μοντέλο στην ανοσολογία των εντόμων και όχι μόνο. Στη δροσόφυλλα ανακαλύφθηκε ο Τοll υποδοχέας, ο οποίος εκτός από την εμβρυογένεση παίζει σπουδαίο ρόλο στην άμυνα εναντίον μυκήτων. Η ανακάλυψη του Toll υποδοχέα έφερε επανάσταση στην ανοσολογία, αφού αποτελεί τον πιο καλά μελετημένο υποδοχέα προτύπων δομών. Μέχρι σήμερα έχουν ανακαλυφθεί 10 Toll υποδοχείς οι οποίοι παρουσιάζουν και σχετική ειδικότητα για διάφορους PAMPs. 12

Εν γένει η άμυνα του ξενιστή στους κατώτερους ασπόνδυλους οργανισμούς μεσολαβείται από κύτταρα και πρωτεΐνες τα οποία προσομοιάζουν στα στοιχεία της φυσικής ανοσίας των ανώτερων οργανισμών. Έχουν βρεθεί ποικίλα κύτταρα των ασπόνδυλων που αναγνωρίζουν, περικυκλώνουν και καταστρέφουν μικροβιακά κύτταρα, ενώ κάποιες φορές φαίνονται ικανά να εκκρίνουν έναν αριθμό διαλυτών μορίων που προσκολλώνται και λύουν τα βακτήρια. Θεωρείται ότι τα κύτταρα αυτά αποτελούν τους προγόνους των μακροφάγων και των ουδετερόφιλων. Στα έντομα η απάντηση στη λοίμωξη πραγματοποιείται με την περικύκλωση των μικροβίων από αιμοκύτταρα τα οποία φαγοκυτταρώνουν τα μικρόβια και προκαλούν την τοπική πήξη της αιμολύμφης. Επίσης κατά τη διάρκεια της λοίμωξης παρατηρείται μια γρήγορη και παροδική σύνθεση αντιμικροβιακών πεπτιδίων που παράγονται από το λίπος και τα αιμοκύτταρα. Οι ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων που παράγουν αυτά τα πεπτίδια περιέχουν πολλές μεταγραφικές περιοχές οι οποίες παρουσιάζουν κοινές νουκλεοτιδικές αλληλουχίες με τις αντίστοιχες μεταγραφικές περιοχές της NFκΒ οδού στον άνθρωπο. Η ομολογία των κυτταροπλασματικών περιοχών των ΤLR (Toll-like receptor) και του ΙL 1 υποδοχέα είναι ένα ακόμα στοιχείο που στηρίζει την υπόθεση για την κοινή καταγωγή των δύο λειτουργικών συστημάτων (Hoffmann J A 1999). Στα φυτά κάθε γονίδιο που προσφέρει αντίσταση σε κάποια πάθηση και έχει κλωνοποιηθεί μέχρι στιγμής, περιέχει τουλάχιστον μια περιοχή που ανευρίσκεται και σε αμυντικές πρωτεΐνες των εντόμων ή των σπονδυλωτών. Τα φυτά φέρουν υποδοχείς για την αναγνώριση μικροβίων οι οποίοι μοιάζουν με τους PRRs υποδοχείς των θηλαστικών. Τα εξωμεμβρανικά τμήματα τους είναι πλούσια σε λευκίνη, όπως η LRR (leukine rich repeat) περιοχή των TLR, ενώ τα ενδομεμβρανικά τμήματα έχουν ίδιο ρόλο με τις κινάσες σερίνης/θρεονίνης. Ως γνωστό, οι περιοχές αυτές είναι παρούσες στον Toll υποδοχέα των ανώτερων θηλαστικών, γεγονός που αποδεικνύει ότι οι ενδοκυττάριοι οδοί σηματοδότησης δημιουργήθηκαν πριν τον διαχωρισμό φυτών και ζώων (Medzhitov, Janeway 1998). Όσον αφορά στην εξέλιξη της χημικής ανοσίας, παρατηρείται ότι στα ψάρια υπάρχει ένας μόνο τύπος αντισωμάτων (IgΜ), ενώ ο αριθμός αυτός αυξάνεται σε δύο στα αμφίβια και σε επτά ή οκτώ στα θηλαστικά. Λεμφοκύτταρα που έχουν χαρακτηριστικά Β κυττάρων ανακαλύφθηκαν σε μικρά θηλαστικά ενώ στα αμφίβια ομοιάζουν ακόμα περισσότερο με αυτά του ανθρώπου, φαινοτυπικά και λειτουργικά. Στα πτηνά τα λεμφοκύτταρα λαμβάνουν εκείνα τα μορφολογικά και λειτουργικά 13

χαρακτηριστικά που ανευρίσκονται στους εξελικτικά μεταγενέστερους ανώτερους οργανισμούς, όπως ο άνθρωπος. Οι λεμφικοί ιστοί πρωτοεμφανίζονται σε λεμφικά οζίδια του γαστρεντερικού σωλήνα των αμφιβίων ενώ ο σπλήνας, ο θυμός και οι λεμφαδένες βρίσκονται σε ανώτερα σπονδυλωτά. Σε τελική ανάλυση γίνεται φανερό ότι τα διάφορα συστατικά του ανοσιακού συστήματος των θηλαστικών έχουν προκύψει μαζί φυλογενετικά και απέκτησαν αυξανόμενη εξειδίκευση κατά την διάρκεια της εξέλιξης. Έτσι, τα κυρίαρχα χαρακτηριστικά της ειδικής ανόσιας, η μνήμη, η εξειδίκευση, η διάκριση εαυτού μη εαυτού και ο αυτο-περιορισμός ανευρίσκονται στα ανώτερα σπονδυλωτά και η ποικιλία των αντιγόνων που αναγνωρίζονται από αυτήν αυξάνει προοδευτικά έως τον άνθρωπο (Medzhitov R, Janeway A C 1998, Hoffmann J A 1999). ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ Η φυσική ανοσία αποτελείται καταρχήν από τους φυσικούς και χυμικούς φραγμούς, όπως τα επιθήλια του σώματος (δέρμα, βλεννογόνοι) και οι αντιμικροβιακές ουσίες που παράγονται από αυτά. Τα κυτταρικά στοιχεία είναι κυρίως τα φαγοκύτταρα του οργανισμού, δηλαδή τα ουδετερόφιλα, τα μακροφάγα καθώς και τα ΝΚ κύτταρα. Στην φυσική ανοσία ανήκουν επίσης πρωτεΐνες, όπως το σύστημα του συμπληρώματος και άλλοι μεσολαβητές της φλεγμονής με αυτοκρινή, παρακρινή ή ενδοκρινή δράση όπως οι κυτταροκίνες, οι οποίες ρυθμίζουν και συντονίζουν πολλές από τις δραστηριότητες των κυττάρων της φυσικής ανοσίας. Παρακάτω θα περιγράφουν αναλυτικά τα στοιχεία αυτά. Επιθηλιακοί φραγμοί Οι ακέραιες επιθηλιακές επιφάνειες σχηματίζουν ένα φυσικό φραγμό ανάμεσα στα μικρόβια, στο εξωτερικό περιβάλλον και στους ιστούς του ξενιστή. Οι κύριες επιφάνειες του ανθρώπινου σώματος ανάμεσα στο περιβάλλον και στον οργανισμό είναι το δέρμα και οι βλεννογόνοι (π.χ. του γαστρεντερικού, του ουροποιητικού, του αναπνευστικού). Τα επιθήλια είναι συνεχή, οργανωμένα με κύτταρα στενά συνδεδεμένα μεταξύ τους και θεμέλιο ουσία που παρεμποδίζει την οποιαδήποτε διείσδυση παθογόνων. Τα επιθηλιακά κύτταρα έχουν τη μοναδική ιδιότητα να βρίσκονται σε συνεχή επαφή με μικρόβια και μικροβιακά προϊόντα τα 14

οποία ενώ σε άλλους ιστούς επάγουν φλεγμονή, στα κύτταρα των επιθηλίων δεν κινητοποιούν αμυντικές αντιδράσεις (Philpott D J 2001, Puledran B 2005). Η ικανότητα να διακρίνουν τα παθογόνα από τα μη παθογόνα στελέχη είναι εξαιρετικά σημαντική για τα κύτταρα των βλεννογόνων. Συσσωρευμένες ενδείξεις καταδεικνύουν ότι οι μηχανισμοί της βακτηριακής αναγνώρισης, που χρησιμοποιούν τα επιθηλιακά κύτταρα είναι πολύ διαφορετικοί από αυτούς των κυττάρων της μυελικής σειράς και εξελίχθηκαν έτσι για τη διατήρηση της ομοιόστασης του επιθηλίου. Σε αντίθεση, όμως με τον καλά μελετημένο ρόλο των TLR και των CD14 μορίων στην αναγνώριση των λιποπολυσακχαριδών (LPS) και πρωτεογλυκανών (PG) και την επακόλουθη ενεργοποίηση NFκB και JNK οδών, οι τρόποι αλληλεπίδρασης των επιθηλιακών κυττάρων με τα μικρόβια δεν έχει πλήρως κατανοηθεί. Από τα έως τώρα γνωστά προκύπτει ότι τα επιθηλιακά κύτταρα παραμένουν "απαθή" στην επαφή τους με παθογόνα όταν αυτά παρουσιάζονται στην κορυφαία/αυλική τους επιφάνεια. Αυτό συμβαίνει γιατί η αυλική επιφάνεια δεν διαθέτει TLR υποδοχείς για την αναγνώριση των PAMPs των μικροβίων. Απεναντίας φλεγμονώδη φαινόμενα επάγονται όταν ενδοκυττάριοι υποδοχείς GARD4/NOD1 αναγνωρίζουν λιποπολυσακχαριδικά μόρια LPS, όπως στην περίπτωση κυτταροπαθογόνων στελεχών π.χ. Shigella Flexeneri τα οποία εισβάλλουν μέσα στο κύτταρο ή όταν βακτηριακά μόρια π.χ. η flagellin παρουσιάζονται στην πλαγιοβασική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης. Φαίνεται όμως ότι σε χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις PRRs εκφράζονται και στην κορυφαία πλευρά της μεμβράνης των επιθηλιακών κυττάρων. Πράγματι, ενώ σε δείγματα εντερικών βιοψιών φυσιολογικών ατόμων, η έκφραση των TLR2 και TLR4 είναι σχεδόν μη ανιχνεύσιμη, παρουσιάζεται πολύ υψηλή στην αυλική επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου σε ασθενείς με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου. Ίσως η ικανότητα διάκρισης παθογόνων-μη παθογόνων να βρίσκεται στην ενδοκυττάρια κατανομή των υποδοχέων και στην ετερότοπη έκφραση PRR μορίων σε παθολογικές καταστάσεις (Philpott D J 2001). Η συνεχιζόμενη έρευνα σε αυτόν τον τομέα θα βοηθήσει στην κατανόηση των φλεγμονωδών φαινομένων στην ιδιοπαθή φλεγμονώδη νόσο του εντέρου. 15

Αντιβιοτικά μόρια (natural antibiotic molecules) Ο οργανισμός παράγει ένα μεγάλο αριθμό μορίων που δρουν ως αντιβιοτικά, τα οποία και καταστρέφουν τα μικρόβια χωρίς να δείχνουν καμία ειδικότητα. Παράγονται από τα κύτταρα της φυσικής ανοσίας κατά τη διάρκεια της λοίμωξης και διακρίνονται σε δυο μεγάλες κατηγορίες, τα κατιονικά αμφίφιλα μόρια και τις ντεφενσίνες. Κατιονικά, αμφίφιλα, βακτηριοκτόνα μόρια ανευρίσκονται σε κάθε πολυκύτταρο οργανισμό. Γενικώς ορίζονται ως πρωτεϊνικά μόρια 12-50 αμινοξέων με 2-9 θετικά φορτισμένες θέσεις λυσίνης ή αργινίνης και φέρουν σε ποσοστό >50% υδροφοβικά αμινοξέα. Oι Oppenheim και De Yang προτείνουν την εισαγωγή του νέου όρου συναγερμίνες (alarmins) για να χαρακτηρίσουν την ομάδα αυτή των πρωτεϊνών, που μπορούν να κινητοποιήσουν το ανοσιακό σύστημα. Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν τα εξής χαρακτηριστικά: Άμεσες αντιμικροβιακές ιδιότητες που οφείλονται στην ικανότητα διάσπασης της κυτταρικής μεμβράνης και δημιουργίας ιοντοδιαπερατών καναλιών και ωσμωτκών φαινόμενων Ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες, είτε διέγερσης των διαδικασιών της φλεγμονής (έκκριση χημειοκινών, χημειοταξία, απελευθέρωση ισταμίνης) είτε καταστολής της έκκρισης κυτταροκινών που οδηγεί σε προστασία από τα καταστροφικά φαινόμενα της υπερπαραγωγής TNF, IL-1. Διέγερσης της ειδικής ανοσίας, τροποποιώντας τη δράση των δενδριτικών κυττάρων και επάγοντας τη διαφοροποίηση των μονοκυτταρικών αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων και την έκφραση συνδιεγερτικών μορίων στην επιφάνεια τους (Oppenheim J J, De Yang 2005). Τα πιο σημαντικά από αυτά τα δυνητικά ανοσοενισχυτικά μόρια είναι οι ντεφενσίνες, η καθελισιδίνη, η νευροτοξίνη των εωσινοφίλων, η πρωτεΐνη 1 του υψηλής κινητικότητας γονιδιακού συμπλέγματος, η γκρανουλοκίνη, η ινδολισιδίνη κ.α. Συνθετικά κατιοντικά μόρια με βιοχημικά χαρακτηριστικά ινδολισιδίνης βρίσκονται ήδη στην τρίτη φάση μελέτης, με σκοπό να χρησιμοποιηθούν στην πρόληψη λοιμώξεων από καθετήρες (Brown L K, Hancock E W 2006, Lehrer I R 2002). Οι ντεφενσίνες αποτελούνται από μια οικογένεια μικρών πρωτεϊνών (3-6 Κda) με αντιμικροβιακές ιδιότητες και β-πτυχωτή μοριακή δομή. Το χαρακτηριστικό είναι ότι έχουν τρία μόρια κυστεΐνης που σχηματίζουν τρεις ενδοπεπτιδιακούς 16

δισουλφιδικούς δεσμούς και ταξινομούνται σε τρεις υπoκατηγορίες (α, β, θ). Οι α ντεφενσίνες του ανθρώπου αποθηκεύονται σε κοκκία των λευκοκυττάρων και στα κύτταρα του Paneth και παρουσιάζουν συγγένεια με τον TLR υποδοχέα. Οι β ντεφενσίνες παρουσιάζουν τέσσερις τύπους εκ των οποίων η τύπου 1 εκφράζεται συνέχεια στα κερατινοκύτταρα και στα επιθηλιακά κύτταρα και έχει βρεθεί επίσης στους μαστικούς πόρους και στο μητρικό γάλα. Η τύπου 2 ανακαλύφθηκε στα απολεπισμένα κύτταρα ασθενών με ψωρίαση. Παράγεται και από αλλά επιθηλιακά κύτταρα και είναι δυνητικά τοξική για τα Gram αρνητικά βακτήρια και την κάντιντα, αλλά όχι για τον χρυσίζοντα σταφυλόκοκκο. H σύνθεση της επάγεται από μικροοργανισμούς και από κυτταροκίνες (ΤΝF, ΙL-1). H ντεφενσίνη τύπου 3 εκφράζεται στην καρδιά, στους σκελετικούς μύες και στον πλακούντα και η IL-1α αυξάνει την παραγωγή της. Είναι ισχυρά κατιονική (σθένος +11) και μπορεί και συνδέεται στέρεα με τα ανιονικά μόρια των μικροβίων, όπως τα φωσφολιπίδια, τα λιποτειχοΐκά οξέα και ο πυρήνας Α των LPS. Οι ντεφενσίνες, αλλά και όλες οι υπόλοιπες συναγερμίνες, ενισχύουν την πρώτη μη ειδική απόκριση, επάγοντας τους μεσολαβητές της φλεγμονής όπως η ισταμίνη, οι προσταγλανδίνες, οι χημειοκίνες (π.χ. CCL2/ΜΙP-2, CXCL8/IL-8, CXCL5/ENA78, CCL2/MCP-1) και ο TNF-α, καταστέλλουν την IL-10 και ενισχύουν την φαγοκυτταρική ικανότητα. Η δεξαμεθαζόνη δεν αναστέλλει την έκφραση των ντεφενσινών 1 και 2, αλλά μειώνει τα επίπεδα της 3 κατά 70%. Η επαγωγή της σύνθεσης της β ντεφενσίνης και η απελευθέρωση της α από τα πολυμορφοπύρηνα γίνονται μέσα σε λίγες ώρες από τη μόλυνση. Η κύρια δράση τους είναι η χημειοταξία των δενδριτικών κυττάρων και των μακροφάγων και η άμεση καταστροφή των εισβολέων. Το τελευταίο επιτυγχάνεται με την δημιουργία πόρων στην κυτταρική μεμβράνη και την οσμωτική λύση των βακτηρίων (Lehrer R I, Ganz T 2002). 17

ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ Ενδοεπιθηλιακά κύτταρα Οι επιθηλιακοί φραγμοί και οι ορογόνες κοιλότητες περιέχουν ενδοεπιθηλιακά Τ και Β λεμφοκύτταρα της Β1 υποομάδας (υποομάδα Β λεμφοκυττάρων που απαντώνται στα επιθήλια και εμφανίζουν ιδιαίτερα χαρακτηριστικά ως προς τους υποδοχείς) που μπορούν να αναγνωρίζουν και να εξουδετερώνουν μικρόβια. Η μοναδική θέση και οι ιδιότητες των ενδοεπιθηλιακών λεμφοκυττάρων δηλώνουν ότι λειτουργούν ως φρουροί απέναντι σε παθογόνους εισβολείς. Τα ενδοεπιθηλιακά Τ -λεμφοκύτταρα είναι παρόντα στο δέρμα και στους βλεννογόνους και φέρουν (ΤCR) μεμβρανικό υποδοχέα όπως και τα άλλα Τ λεμφοκύτταρα. Όμως εμφανίζουν περιορισμένη ποικιλότητα αντιγονικών υποδοχέων, οι οποίοι σχηματίζονται από γονιδιακές αλληλουχίες που δεν ανασυνδυάζονται και δεν φέρουν το πλήθος των συμπληρωματικών περιοχών που συναντάται στα άλλα λεμφοκύτταρα. Σε κάποια είδη, ανάμεσα στα oποία και ο άνθρωπος, η πλειοψηφία των ενδοεπιθηλιακών Τ λεμφοκύτταρων εκφράζουν γδ TCR υποδοχείς (δηλαδή σχηματίζονται από την Vγ και Vδ υπομονάδα και όχι τις αντίστοιχες α και β). Πρόσφατες έρευνες τονίζουν ότι τα χαρακτηριστικά αυτών των κυττάρων παρουσιάζουν αρκετές διαφορές από τα χαρακτηριστικά των υπόλοιπων λεμφοκυττάρων. Τα χαρακτηριστικά αυτά αφορούν κυρίως στη δυνατότητα τους να παρουσιάζουν αντιγόνα και να αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα της φυσικής ανοσίας σε πολλαπλά επίπεδα. Επιπλέον, τα γονιδιακά στοιχεία που παράγουν τους υποδοχείς τους κληρονομούνται αυτούσια (germ-line) και διακρίνονται σε λειτουργικά διαφορετικές ομάδες όσον αφορά στην έκφραση αυτή των υποδοχέων. Πολλοί ερευνητές πιστεύουν ότι τα γδ Τ λεμφοκύτταρα βρίσκονται στο μεταίχμιο μεταξύ της έμφυτης και της ειδικής ανοσίας (Born W K 2006, MacDonald H R 2002, Abbas A K 2003). Σε αντίθεση με τα αβ, τα γδ Τ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν "άτυπα" αντιγόνα, δηλαδή γλυκολιπιδιακά μη πρωτεϊνικά μόρια που βρίσκονται στην επιφάνεια ορισμένων μικροβίων. Τα αντιγόνα αυτά παρουσιάζονται από τα CD1 μόρια, μια οικογένεια πρωτεϊνών που έχει ομολογία με τα MHC μόρια και βρίσκονται στην πλασματική μεμβράνη των επιθηλιακών κυττάρων. Δεν υφίστανται 18

την επεξεργασία που συμβαίνει στα πρωτεϊνικά αντιγόνα, παρουσιάζονται όμως από τα επιθηλιακά κύτταρα για λόγους ενίσχυσης της ανοσιακής απόκρισης (συνδιέγερση). Τα γδ λεμφοκύτταρα πολλαπλασιάζονται και αποτελούν ένα σημαντικό κλάσμα του Τ κυτταρικού πληθυσμού (ανευρίσκονται σε ποσοστό 10% στο πλάσμα). Σε παθήσεις όπως η φυματίωση, η βρουκέλλωση, η λεϊσμανίαση, η ιλαρά κ.α. αυξάνουν το ποσοστό τους στο περιφερικό αίμα. Στην επιφάνεια τους έχει καταδειχθεί η παρουσία TLR και NK υποδοχέων (ενεργοποιητικοί και ανασταλτικοί). Με βάση την φύση των υποδοχέων τους και την λειτουργία τους τα γδ Τ κατατάσσονται περισσότερο σαν εκτελεστικά κύτταρα της φυσικής ανοσίας παρά της ειδικής (Born K W 2006, Hume D, Hertzog P 2006). Η περιτοναϊκή και υπεζοκωτική κοιλότητα περιέχουν έναν αριθμό Β ενδοεπιθηλιακών λεμφοκύτταρων που καλούνται Β1 τα οποία φέρουν μεμβρανικούς υποδοχείς της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών όπως τα συμβατικά Β2 με περιορισμένο όμως ρεπερτόριο συνδετών. Παρόμοια κύτταρα έχουν βρεθεί και στις παραφλοιώδεις περιοχές των λεμφοζιδίων του σπλήνα. Δεδομένου της κανονικότητας των υποδοχέων τους, είναι πολύ πιθανό η διαφορετική κατανομή των κυττάρων στο σώμα να εξαρτάται από τις παραμέτρους του μικροπεριβάλλοντος και να είναι αντιγονοεξαρτώμενη. Πολλά Β1 λεμφοκύτταρα είναι CD5+ και παράγουν IgM αντισώματα ειδικά για πολυσακχαριτιδικά και λιπιδιακά αντιγόνα, όπως η φωσφορυλοχολίνη και η λιποπολυσακχαρίδη, μόρια κοινά σε πολλά είδη βακτηρίων. Στην πραγματικότητα οι φυσιολογικοί ενήλικες παράγουν κυκλοφορούντα αντισώματα χωρίς να συνυπάρχει λοίμωξη. Αυτά τα αντισώματα ονομάζονται φυσικά αντισώματα η παραγωγή τους είναι ανεξάρτητη από τα Τ, αλλά η δράση τους εξαρτάται από το συμπλήρωμα και είναι παράγωγα των Β1 λεμφοκυττάρων. Τα φυσικά αντισώματα χρησιμεύουν ως ένας προϋπάρχων φραγμός έναντι τυχών εισβολέων εξηγώντας έτσι το σπουδαίο ρόλο του σπλήνα. Όλα αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι πέρα από το κλασσικό μοντέλο της ειδικής και μη ειδικής ανοσίας υπάρχουν Τ και Β σειράς πληθυσμοί που συμμετέχουν στην πρώιμη ανοσιακή απόκριση. Ένας τρίτος πληθυσμός είναι τα μαστοκύτταρα τα οποία είναι εκτελεστικά κύτταρα της φυσικής ανοσίας και κατά κύριο λόγο υπεύθυνα για την εκδήλωση φαινομένων άμεσης υπερευαισθησίας. Προέρχονται από τον μυελό των οστών από προγεννήτορες που μεταναστεύουν και ωριμάζουν in situ. Φυσιολογικά δεν ανευρίσκονται στην κυκλοφορία αλλά κυρίως κοντά σε αγγεία, νεύρα και 19

επιθήλια. Ποικίλουν σε σχήμα και το κυτταρόπλασμα τους περιέχει μεγάλο αριθμό κοκκίων και λιπιδιακών σωμάτων που περικλείουν όξινες πρωτεογλυκάνες. Υπάρχουν δύο τύποι μαστοκυττάρων ανάλογα με την ανατομική εντόπιση, το περιεχόμενο των κοκκίων και τη δράση τους. Η πρώτη υποομάδα βρίσκεται στο γαστρεντερικό σωλήνα (ΓΕΣ), παράγουν άφθονη χονδροϊτίνη και εξαρτώνται από τα Τ λεμφοκύτταρα όπως αποδεικνύουν πειραματικές μελέτες. Συμμετέχουν στις αλλεργικές αντιδράσεις των βλεννογόνων και των αεραγωγών. Η δεύτερη υποομάδα είναι παρούσα στους πνεύμονες και στις ορογόνες κοιλότητες και καλούνται μαστοκύτταρα του συνδετικού ιστού. Η κύρια πρωτεογλυκάνη είναι η ηπαρίνη καθώς επίσης και η ισταμίνη και φαίνεται να είναι υπεύθυνα για αλλεργικά φαινόμενα στο δέρμα (Abbas A K 2003). Πολυμορφοπύρηνα Στο φαγοκυτταρικό σύστημα ανήκουν τα πολυμορφοπύρηνα (ΠΜΠ) ουδετερόφιλα των οποίων η πρωτογενής λειτουργία είναι να αναγνωρίζουν, να πέπτουν και να καταστρέφουν τα μικρόβια και τα μακροφάγα. Τα ουδετερόφιλα είναι ο μεγαλύτερος πληθυσμός στο περιφερικό αίμα και η πρώτη γραμμή άμυνας εναντίον των λοιμώξεων. Είναι σφαιρικά στο σχήμα με διάμετρο περίπου 12 με 15 μ και φέρουν κοκκία που περικλείουν ένζυμα όπως η λυσοζύμη, η κολλαγενάση, η καθεψίνη, ελαστάση, οι ντεφενσίνες κ.α. και πολυάριθμες μεμβρανώδεις προεκβολές. Παράγονται από το μυελό των οστών υπό την επίδραση του G-CSF με ρυθμό 1000000/ημέρα και κυκλοφορούν για 6 ώρες. Εάν δεν στρατολογηθούν σε φλεγμένουσες περιοχές υφίστανται προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο στο ήπαρ και στο σπλήνα. Η προσέλκυση των ουδετερόφιλων στις περιοχές της φλεγμονής γίνεται με την χημειοτακτική δράση πληθώρας παραγόντων, όπως των CXC χημειοκινών, των φορμυλιομεθυλιομένων πεπτιδίων και του κλάσματος του συμπληρώματος C5α. Η στρατολόγηση τους γίνεται αρχικά με την προσκόλληση τους στο ενδοθήλιο και την διαπίδυση τους μέσα από αυτό. Σε σημεία φλεγμονής τα μακροφάγα που έχουν ήδη έρθει σε επαφή με τα μικρόβια παράγουν κυτταροκίνες (όπως ΤΝF, ΙL-1) που ενεργοποιούν τα παρακείμενα ενδοθηλιακά κύτταρα να παράγουν μόρια προσκόλλησης όπως: σελεκτίνες, συνδέτες για τις ιντεγκρίνες και χημειοκίνες. Οι σελεκτίνες προκαλούν ασθενή σύνδεση των ΠΜΠ με το ενδοθήλιο και το σταμάτημα του κυλίσματος των ΠΜΠ, οι ιντεγκρίνες μεσολαβούν για την 20

στέρεα σύνδεση των ΠΜΠ και οι χημειοκίνες αυξάνουν την διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος. Αφού τα ΠΜΠ διαπεράσουν το τοίχωμα του αγγείου βρίσκονται στο μεσοκυττάριο χώρο όπου αρχίζει η καταστροφή των μικροβίων μέσω της φαγοκυττάρωσης τους και της αναπνευστικής έκρηξης που επιτελείται στο κυτταρόπλασμα. Τα ΠΜΠ σε αντίθεση με τα μακροφάγα δεν δρουν αντιγονοπαρουσιαστικά. Αποκλειστική τους δράση είναι η φαγοκυττάρωση των οψωνινοποιημένων συνήθως μικροβίων και η καταστροφή τους μέσα σε αυτά από υδρολυτικά ένζυμα ή από οξυγονοεξαρτώμενους μηχανισμούς που παράγουν τοξικά προϊόντα οξυγόνου (Ο2, Η2Ο2, ΗΟCΙ) ή αζώτου (ΝΟ) τα οποία θα αναλυθούν στην συνέχεια (Fleischer A T, Rich R R 2001, Abbas AK 2003). Αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα Η απάντηση των αντιγονοειδικών Τ λεμφοκυττάρων στις αντιγονικές μοριακές δομές προϋποθέτει τη σύλληψη και παρουσίαση του αντιγόνου στα Τ λεμφοκύτταρα από τα αντιγονοπαρουσιαστικά (ΑΠΚ) κύτταρα. Η γνώση αυτή προήλθε από πειράματα σε καλλιέργειες Τ λεμφοκυττάρων τα οποία δεν αντιδρούσαν στην παρουσία του αντίστοιχου αντιγόνου αν στη καλλιέργεια δεν συμμετείχαν δενδριτικά, μακροφάγα ή Β κύτταρα. Σήμερα, τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα αποκτούν ολοένα και μεγαλύτερη σημασία όχι μόνο στην αναγνώριση του παθογόνου και στον καθορισμό της έναρξης ή μη της ανοσιακής αντίδρασης αλλά και της κατεύθυνσης που αυτή θα πάρει καθώς επίσης και στο εκτελεστικό της σκέλος. Δυο προϋποθέσεις για να δράσουν τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα είναι η δυνατότητα να ενδοκυτταρώνουν και να επεξεργάζονται το αντιγόνο και επίσης να το συνδέουν με ΜΗC τάξης ΙΙ μόρια. Όλοι οι ιστοί των θηλαστικών είναι ικανοί να ενδοκυτταρώσουν και να πέψουν πρωτεολυτικά μια πρωτεΐνη αλλά δεν εκφράζουν ΜΗC ΙΙ μόρια. Έτσι την λειτουργία αυτή αναλαμβάνουν τα εξής κύτταρα: δενδριτικά, Β κύτταρα, μακροφάγα, ενδοθηλιακά, μεσεγχυματικά. Τα τρία πρώτα ονομάζονται και επαγγελματικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα έχουν δυο σπουδαίες λειτουργίες. Πρώτον, αφού φαγοκυτταρώσουν το αντιγόνο, το μετατρέπουν ενδοκυττάρια σε μικρά πεπτίδια και το παρουσιάζουν στην επιφάνεια τους στα Τ λεμφοκύτταρα. Η 21

διαδικασία αυτή η οποία μετατρέπει τα αντιγονικά μόρια σε πεπτιδιακά κλάσματα συνδεόμενα με MHC μόρια, καλείται αντιγονική επεξεργασία. Δεύτερον, τα ΑΠΚ παρέχουν ερεθίσματα στα Τ κύτταρα πέρα από την παρουσίαση του ίδιου του αντιγόνου, φαινόμενο που καλείται συνδιέγερση. Τα κυριότερα συνδιεγερτικά μόρια είναι το Β7-1 (CD80) και B7-2 (CD86), τα οποία αλληλεπιδρούν με το CD28 των Τ λεμφοκυττάρων και το CD40, το οποίο αλληλεπιδρά με το CD40L των Τ λεμφοκυττάρων. Ο CD40L στην επιφάνεια των Τ λεμφοκύτταρων ενισχύει με την ενεργοποίηση του την απάντηση των κυττάρων. Τα χαρακτηριστικά των κυττάρων που δρουν ως αντιγονοπαρουσιαστικά φαίνονται συνοπτικά στον πίνακα: Τύπος κυττάρων Έκφραση των MHC II Έκφραση συνδιεγερτικών Κύρια λειτουργία μορίων Δενδριτικά κύτταρα Συνεχής, αυξάνει Συνεχής, αυξάνει Έναρξη των Τ με την ωρίμανση με την ωρίμανση κυτταρικών επάγεται από IFN-γ Επάγεται από IFN-γ αποκρίσεων σε CD40-CD40L σύνδεση πρωτεϊνικά αντιγόνα (priming) Μακροφάγα Χαμηλή ή καθόλου Επάγεται από IFNγ Επαγωγή εκτελεστικών επάγεται από IFN-γ CD40-CD40L, LPS κύτταρων της κύτταροεξαρτώμενης Β7-1-CD28, B7-2 CD28 κύτταρο- τοξικότητας Καθορίζουν σε μεγάλο βαθμό την Τh1/Th2 απάντηση Β-λεμφοκύτταρα Συνεχής, αυξάνεται από την Επάγεται από Αντιγονοπαρουσίαση IL-4 CD40-CD40L στα CD4 Παραγωγή αντισωμάτων Ενδοθηλιακά Συνεχής, Συνεχής Προαγωγή της επάγεται από IFN-γ, ενεργοποίησης των Τ στα σημεία της παρουσίασης του αντιγόνου Ποικίλα επιθηλιακά Επάγεται από IFN-γ Επαγόμενη Μη σημαντική και μεσεγχυματικά Πίνακας 2: Κατηγορίες αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. 22

Δενδριτικά κύτταρα Τα δενδριτικά κύτταρα είναι παρόντα στα λεμφικά όργανα, στα επιθήλια του δέρματος, του ΓΕΣ και του αναπνευστικού. Χαρακτηρίζονται μορφολογικά από τις πολλαπλές αμοιβαδοειδείς προεκβολές τους. Όλα τα δενδριτικά κύτταρα προέρχονται από τον μυελό των οστών (CD11, CD14) είτε από την λεμφική (που ονομάζονται πλασματοκυττοειδή ή τύπου 2) ή την μυελική σειρά (που διακρίνονται στα δενδριτικά του διάμεσου και του επιθηλιακού ιστού). Τα πρώτα σχετίζονται με την επαγωγή της Τh1 ειδικής ανοσίας ενώ τα δεύτερα παράγουν κυρίως ΙFΝ-γ και συμμετέχουν στην φυσική ανοσία έναντι των ιών. Τα άωρα δενδριτικά κύτταρα βρίσκονται στα επιθήλια και στο δέρμα (ονομάζονται και Langerhans). Όταν έρθουν σε επαφή με το αντιγόνο χάνουν την ικανότητα προσκόλλησης στα επιθήλια και αυξάνουν την έκφραση του CCR7 υποδοχέα των χημειοκινών στην επιφάνεια τους. Αυτά τα CCR7+ δενδριτικά εισέρχονται στους λεμφαδένες διαμέσου των προσαγωγών λεμφαγγείων και χρησιμοποιώντας την κλίση συγκέντρωσης των CCL19 και CCL21 χημειοτακτικών χημειοκινών (που έχουν εκκριθεί από τα τοπικά μακροφάγα) κατευθύνονται στο σημείο της φλεγμονής. Τα αδαή-μη ευαισθητοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα ή τα Τ κύτταρα μνήμης εισέρχονται στους εγχώριους αδένες μέσω των φλεβιδίων με υψηλό ενδοθήλιο χρησιμοποιώντας τον ίδιο τρόπο. Όταν βρεθούν μέσα στους λεμφαδένες τα CCR7+ δενδριτικά και Τ κύτταρα ακολουθούν τις διαβαθμίσεις (πρανή συγκέντρωσης) των CCL19 και CCL21 προς στις παραφλοιώδεις περιοχές για να έρθουν σε επαφή μεταξύ τους. Εκεί, κάτω από τον έλεγχο των Τ κυττάρων, τα δενδριτικά κύτταρα υφίστανται μια σειρά μη αναστρέψιμων αλλαγών, που χαρακτηρίζει την διαδικασία ωρίμανσης τους. Συγκεκριμένα, τα ανώριμα δενδριτικά έχουν μεγάλη φαγοκυτταρική ικανότητα και δυνατότητα πρόσληψηςενδοκυττάρωσης και χωρίς την διαμεσολάβηση υποδοχέων. Εκφράζουν χαμηλά επίπεδα συνδιεγερτικών μορίων CD80 και καθόλου CD86 (δείκτης ωρίμανσης), HLA II και I και έχουν γενικά μικρή ικανότητα παρουσίασης αντιγόνων. Η διαδικασία της ωρίμανσης ξεκινά με την επίδραση μορίων που προέρχονται από τα παθογόνα (LPS, CpG DNA, dsrna) ή από τα Τ λεμφοκύτταρα (IFN-γ και CD40L). Στη συνέχεια, τα δενδριτικά κύτταρα εμφανίζουν προεκβολές, εκφράζουν στην επιφάνεια τους ΜΗC Ι και ΙΙ, συνδιεγερτικά μόρια Β7-1, Β7-2 και μετατρέπονται σε ώριμα κύτταρα. Ταυτόχρονα μπορούν και εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες χημειοκινών όπως ΜΙΡ-1, ΜΙΡ-2 που προσελκύουν τα υπόλοιπα κύτταρα της φλεγμονής. Τα ώριμα 23

κύτταρα στην συνέχεια μεταναστεύουν και εγκαθίστανται στις Τ ζώνες των λεμφαδένων, έτοιμα να συναντήσουν τα ειδικά για το αντίστοιχο αντιγόνο Τ λεμφοκύτταρα (Spisek R 2004, Fleischer A T, Rich R R 2001, Abbas AK 2003). Υπάρχουν διαφορετικές υποομάδες των εν λόγω κυττάρων τα οποία μπορούν να κατευθύνουν διαφορετικά την Τ απάντηση ακόμα και να την αναστείλουν. Ο τρόπος αλληλεπίδρασης μεταξύ των δενδριτικών και των Τ κυττάρων επηρεάζεται από το στάδιο ωρίμανσης και διαφοροποίησης των ΔΚ. Το τελευταίο εξαρτάται από την καταγωγή των ΔΚ (μυελοειδή ή πλασματοκυττοειδή) και από σήματα του περιβάλλοντος, τα οποία δέχονται τα ΔΚ κατά την ανάπτυξη τους. Τα τύπου 2 ΔΚ επάγουν την Τh2 κυτταρική απόκριση, η οποία ως γνωστό παράγει αντιδράσεις υπερευαισθησίας τύπου Ι (αλλεργίες και άσθμα). Σε πνεύμονες ποντικιών, μελέτες με υποομάδες ΔK έδειξαν ότι τα μυελοειδή ΔΚ επάγουν τις Th2 αποκρίσεις ενώ τα πλασματοκυττοειδή αναστέλλουν τις ασθματικές απαντήσεις και την Τh2 διαμεσολαβούμενη φλεγμονή (Lambrechtet 2000, De Heer 2004). Έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον υπάρχει επίσης και για τις δυνατότητες φαρμακολογικής παρέμβασης στα ΔΚ2 κύτταρα, μιας και γίνεται ορατό ότι παίζουν ρόλο από την ανοχή και την προστασία από την αυτοανοσία μέχρι την προστασία από κακοήθειες και λοιμώξεις. Τα κορτικοειδή αναστέλλουν την ανάπτυξη ΔΚ ενώ ποντίκια υπό κορτιζόνη εμφανίζουν μειωμένες αποικίες ΔΚ στο σπλήνα. Σε in vitro μελέτες η κυκλοσπορίνη μειώνει την παραγωγή ΤΝF-α από τα ΔΚ καθώς και την ικανότητα φαγοκυττάρωσης, ενώ η ραπαμυκίνη επάγει την απόπτωση των μυελοειδών ΔΚ (Cees van Kooten 2006). Ακόμα και στο τομέα των μεταμοσχεύσεων τα ΔΚ έχουν χρησιμοποιηθεί για θεραπείες που στοχεύουν στην επιβίωση του μοσχεύματος και στην ειδική για το μόσχευμα ανοχή. Πειράματα έδειξαν ότι ποντίκια που είχαν δεχθεί ανώριμα δενδριτικά κύτταρα από τον δότη έδειξαν παρατεταμένη ανοχή σε παγκρεατικά και καρδιακά μοσχεύματα. Πρόσφατες έρευνες ανέδειξαν ένα νέο τύπο ΔΚ διακριτό από τα μυελοειδή και πλασματοκυττοειδή ΔΚ που εμφανίζει μοριακό προφίλ αλλά και μορφολογία στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο παρόμοια με τα ΝΚ, γι αυτό και του δόθηκε η ονομασία φονικό δενδριτικό κύτταρο που παράγει ιντερφερόνη (interferon producing killer dendritic cell) (Chan CW 2006). Σαν ΔΚ εκκρίνει IL-12, IFN- α κατά την ενεργοποίηση του αλλά και σαν ΝΚ παράγει IFN-γ όταν διεγείρεται. Έτσι, μπορεί να παράγει τύπου Ι (IFN-α, IFN-β) και τύπου ΙΙ (IFN-γ) ιντερφερόνες ανάλογα με το ερέθισμα. Το πλεονέκτημα αυτών των ΔΚ δεν είναι απόλυτα 24

κατανοητό αλλά η δυνατότητα να σκοτώνει τα μικρόβια και μετά να παρουσιάζει αντιγόνα ίσως να ενισχύει τον δεσμό της φυσικής και ειδικής ανοσίας. Ανώριμα δενδριτικά Ώριμα δενδριτικά Κύρια λειτουργία Σύλληψη αντιγόνου Παρουσίαση αντιγόνου στα Τ λεμφοκύτταρα Έκφραση Fc υποδοχέων υποδοχέων μαννόζης ++ - Έκφραση μορίων - ή χαμηλή ++ σχετιζόμενων με την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων Τάξης ΙΙ MHC μόρια Ημιπερίοδος ζωής 10 ώρες >100 ώρες Αριθμός επιφανειακών ένα εκατομμύριο 7 εκατομμύρια μορίων Πίνακας 3: Διαφορές ανώριμων-ώριμων δενδριτικών κυττάρων. δενδριτικό κύτταρο αντιγόνο μικρόβιο ΜΗC ΤCR Τh IL-2 T λεμφοκύτταρο συνδιέγερση Σχήμα 1: Η παρουσίαση του αντιγόνου από το δενδριτικό κύτταρο στο βοηθητικό Τ λεμφοκύτταρο. 25

Μακροφάγα Τα μακροφάγα και οι κυκλοφορούσες πρώιμες μορφές τους, τα μονοκύτταρα, παίζουν καθοριστικό ρόλο στις διαδικασίες της φλεγμονής και είναι τα κύρια εκτελεστικά κύτταρα της φυσικής ανοσίας. Επιπρόσθετα συμμετέχουν στις διαδικασίες επούλωσης και αναδιαμόρφωσης των ιστών (tissue remodeling), καθώς και στην κάθαρση νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων. Τα μονοπύρηνα του αίματος παράγονται στο μυελό των οστών και μπορούν να παραμείνουν στην κυκλοφορία για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Μετά την είσοδο τους στους ιστούς, τα μονοπύρηνα διαφοροποιούνται σε μακροφάγα, το μέγεθος τους αυξάνεται και η φαγοκυτταρική τους δυνατότητα ενισχύεται. Είναι παρόντα στους υποεπιθηλιακούς ιστούς, στο διάμεσο ιστό παρεγχυματικών οργάνων, στα αγγειακά κολποειδή του ήπατος και του σπληνός και στους λεμφαδένες. Απαντούν στην παρουσία μικροβίων εξίσου γρήγορα με τα ουδετερόφιλα αλλά παραμένουν στο χώρο της λοίμωξης για περισσότερο χρόνο και έχουν την ικανότητα περαιτέρω πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης (Hume A D 2006). Τα μακροφάγα διαθέτουν επιφανειακούς υποδοχείς που αναγνωρίζουν τα μικρόβια και μεσολαβούν για την φαγοκυττάρωση και την καταστροφή τους. Ορισμένοι μεμβρανικοί υποδοχείς, διεγειρόμενοι, προκαλούν την παραγωγή κυτταροκινών και αντιμικροβιακών πεπτιδίων, ενώ άλλοι διεγείρουν την μετανάστευση των κυττάρων στους χώρους φλεγμονής. Υπάρχουν οι εξής οικογένειες υποδοχέων (Abbas A K 2003) : Υποδοχείς μαννόζης (mannose binding receptors) Οι υποδοχείς μαννόζης είναι λεκτίνες που συνδέονται με τα τελικά μόρια μαννόζης και φουκόζης των γλυκοπρωτεϊνών και γλυκολιπιδίων των βακτηρίων. Τα μόρια αυτά υπάρχουν μόνο στην επιφάνεια των βακτηρίων ενώ τα κύτταρα των θηλαστικών περιέχουν γλυκοπρωτεΐνες και γλυκολιπίδια που φέρουν σιαλικό οξύ και Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη και γι αυτό δεν γίνονται αντιληπτά από τα μακροφάγα. Υποδοχείς ρακοσυλλέκτες (scavenger receptors) Οι υποδοχείς ρακοσυλλέκτες αρχικά ορίστηκαν ως μόρια που συνδέουν και μεσολαβούν την ενδοκυττάρωση της οξειδωμένης και ακετυλιωμένης χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης. Αργότερα βρέθηκε ότι οι υποδοχείς αυτοί συνδέονται με Gram(+)/Gram(-) μικρόβια και με την κάθαρση αποπτωτικών κυττάρων. 26

Οψωνικοί υποδοχείς: Προάγουν τη φαγοκυττάρωση κυττάρων ή πρωτεϊνών που καλύπτονται με διάφορες πρωτεΐνες. Η διαδικασία λέγεται οψωνοποίηση και τα μόρια που καλύπτουν τα μικρόβια οψωνίνες. Οι οψωνίνες μπορεί να είναι αντισώματα, στοιχεία του συμπληρώματος ή και λεκτίνες. Η φαγοκυττάρωση μικροβίων καλυμμένων με IgG αντισώματα γίνεται μέσω του Fcγ υποδοχέα ενώ κλάσματα του C3 συνδεόμενα με μικρόβια ενδοκυτταρώνονται γρήγορα μέσω του CR1 υποδοχέα. Ένας αριθμός πρωτεϊνών του πλάσματος όπως η ινονεκτίνη, το ινωδογόνο, η CRP, η MBL καλύπτουν βακτήρια και αναγνωρίζονται από υποδοχείς φαγοκυττάρων, λειτουργώντας ως οψωνίνες. Άλλοι υποδοχείς των μακροφάγων που δεν μεσολαβούν άμεσα στην ενδοκυττάρωση είναι: Toll like υποδοχείς Είναι ομόλογος με τον υποδοχέα της δροσόφυλλα και ενεργοποιείται από διαφορετικούς τύπους και συστατικά των μικροβίων. Μέχρι σήμερα έχουν ανακαλυφθεί 10 TLR στα θηλαστικά και ο καθένας εμφανίζεται να έχει κάποια ειδικότητα για διαφορετικό είδος εισβολέα. Αυτοί οι υποδοχείς ενεργοποιούν σηματοδοτικές κινάσες που προκαλούν την παραγωγή κυτταροκινών και αντιμικροβιακών πεπτιδίων. Χημειοκινικοί υποδοχείς Η δομή τους χαρακτηρίζεται από 7 διαμεμβρανικές α-έλικες και την σύνδεση με G πρωτεΐνες. Μετά την σύνδεση της χημειοκίνης με τον υποδοχέα, το δευτερογενές ενδογενές μήνυμα μεταφέρεται μέσω της φωσφορυλίωσης της G υπομονάδος του υποδοχέα από ένα μόριο GTP. Κύριο ερέθισμα είναι οι χημειοκίνες και το C5α κλάσμα του συμπληρώματος. Υποδοχείς κυτταροκινών Ο πιο σπουδαίος υποδοχέας είναι της IFN-γ η οποία εκκρίνεται από τα ΝΚ και Τ λεμφοκύτταρα. Είναι ο κύριος ενεργοποιητής των μακροφάγων. Μετά την αναγνώριση του μικροβίου ακολουθεί η πέψη του και ο σχηματισμός φαγοσώματος. Η φαγοκυττάρωση είναι μια διαδικασία του κυτταροσκελετού, όπου αρχικά αποπολυμερίζονται και στην συνέχεια επαναδομούνται τα ινίδια της ακτίνης. Το φαγοκύτταρο χρησιμοποιεί τους επιφανειακούς υποδοχείς για να εγκολπώσει το μικρόβιο και να το συντήξει σε ένα κυστίδιο, το οποίο στη συνέχεια θα ενωθεί με λυσοσσώματα και θα μεταφερθεί στο 27

κέντρο του κυττάρου, περιπυρηνικά. Η διαδικασία αυτή έχει λέγεται ωρίμανση του φαγοσώματος και καταλήγει στην καταστροφή των μικροβίων από τα υδρολυτικά ένζυμα και το όξινο ph (Hume A D 2006). Οι μηχανισμοί θα αναλυθούν παρακάτω. Υποδοχέας Συνδέτης Ενδοκυττάρια οδός ενεργοποίησης TLR 1 Τριακυλ- λιποπρωτεΐνες MyD88/MAL TLR 2 Λιποπρωτεΐνες, gram θετικές πεπτιδογλυκάνες, λιποτειχοϊκά οξέα, MyD88/MAL μύκητες, ιϊκές γλυκοπρωτεΐνες TLR 3 Διπλής έλικας RNA, TRIF TLR 4 Λιποπολυσακχαρίδες, ιϊκές γλυκοπρωτεΐνες MyD88/MAL/TRIF/TRAM TLR 5 Φλαγγελίνη MyD88 TLR 6 Διακυλ- λιποπρωτεΐνες MyD88/MAL TLR 7 Απλά συνθετικά μόρια, απλής έλικας RNA MyD88 TLR 8 Απλά συνθετικά μόρια, απλής έλικας RNA MyD88 TLR 9 Μη μεθυλιωμένο CpG DNA MyD88 TLR 10 Άγνωστος Άγνωστη TLR 11 Προφιλλίνη MyD88 TLR 12 Άγνωστος Άγνωστη TLR 13 Άγνωστος Άγνωστη Πίνακας 4 : Οι γνωστοί Toll-like υποδοχείς των θηλαστικών, τα μόρια τα οποία συνδέουν και η ενδοκυττάρια οδός που ενεργοποιούν Φυσικά κυτταροκτόνα ΝΚ (natural killers) κύτταρα Είναι μια υποομάδα λεμφοκυττάρων, αποστολή των οποίων είναι η φόνευση μολυσμένων κυττάρων και κυττάρων που έχουν χάσει την έκφραση MHC τάξης Ι μορίων. Η κύρια λειτουργία των ΝΚ είναι η άμυνα εναντίον ιών και κάποιων ενδοκυττάριων μικροβίων. Ο όρος φυσικά κυτταροκτόνα προέρχεται από το δεδομένο ότι έχουν την δυνατότητα φόνευσης κυττάρων στόχων χωρίς την προηγούμενη ενεργοποίηση, σε αντίθεση με τα κυτταροτοξικά CD8 + Τ 28

λεμφοκύτταρα. Τα ΝΚ προέρχονται από τον μυελό των οστών και έχουν την μορφολογία μεγάλων κοκκωδών λεμφοκυττάρων με πολυάριθμα κυτταροπλασματικά κοκκία. Ο ανοσοφαινότυπος τους (CD2+CD3-CD16+CD56+) δείχνει ότι δεν είναι ούτε Τ ούτε Β λεμφοκύτταρα και δεν φέρουν σωματικά ανασυνδυασμένους ή κλωνικά κατανεμημένους υποδοχείς. Αποτελούν το 5-20% των μονοκυττάρων του αίματος και ανευρίσκονται σπάνια στα λεμφοειδή όργανα (Rich R R 2001, Moretta A 2005, Κυριαζής Γ 2002). Υποδοχείς Λεκτίνες : Υποδοχέας μαννόζης Πρωτεΐνες πλούσιες σε λευκίνη : CD14 TLR Υποδοχείς ρακοσυλλέκτες SR : SR-A (CD36),C, D E Λιπιδιακές τρανσφεράσες : LPS -συνδέουσα πρωτεΐνη Πεντραξίνες : CRP Αμυλοειδές πλάσματος Ρ Υποδοχείς συμπληρώματος : CR1 (CD35)3 CR2 (CD21) CR3 (CD11b,CD18) Fc υποδοχείς : Fc RI (,II,III (CD64,32,16) Fc R (CD89) Fc RI Fc RII (CD23) Συνδέτες Μαννόζη, φουκόζη στους μύκητες Βακτηριακοί λιποπολυσακχαρίτες Προϊόντα βακτηρίων και μυκήτων Πολυανιονικοί συνδέτες, λιποτειχοϊκά οξέα, φωσφατιδυλοσερίνη, τροποποιημένη LDL, αποπεπτοκώτα κύτταρα Βακτηριακοί λιποπολυσακχαρίτες Βακτηριακοί λιποπολυσακχαρίδες, Εξωκυττάριες πρωτεΐνες θεμελίου ουσίας, υδατάνθρακες κυτταρικού τοιχώματος C3b, 4b ic3b, C3dg, C3d ic3b, LPS IgG IgA IgE IgE Πίνακας 5: Υποδοχείς μακροφάγων 29

Η ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων εξαρτάται από την ισορροπία μεταξύ διεγερτικών και ανασταλτικών μηνυμάτων από μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα μέσω της ενεργοποίησης αντίστοιχων μεμβρανικών πρωτεϊνών. Στους ενεργοποιητικούς υποδοχείς των ΝΚ κυττάρων συμπεριλαμβάνονται ορισμένες δομικά διαφορετικές ομάδες μορίων, οι συνδέτες των οποίων δεν είναι γνωστοί σε όλη τους την έκταση. Ένα κοινό στοιχείο των ενεργοποιητικών υποδοχέων είναι η παρουσία σηματοδοτικών μορίων βασισμένων στην φωσφορυλίωση της τυροσίνης στην κυτταροπλασματική πλευρά της ανοσοσφαιρίνης (ΙΤΑΜ: immunoreceptor tyrosine based activation motifs). Όπως συμβαίνει στα Τ και Β λεμφοκύτταρα, ο καταρράκτης αυτός των φωσφορυλιώσεων τυροσινικών κινασών οδηγεί σε μεταγραφή γονιδίων, στην αναδιοργάνωση κυτταροσκελετού και στην αλλαγή της λειτουργίας του κυττάρου. Oι πιο γνωστοί υποδοχείς που ανήκουν σε αυτήν την ομάδα είναι: ο FcεRI γ, ζ, η DAP12 πρωτεΐνη και ο CD16. Επιπροσθέτως άλλοι επιφανειακοί υποδοχείς μη άμεσα συνδεόμενοι με ΙΤΑΜs ενεργοποιούν τα ΝΚ κύτταρα όπως ο NKG2D υποδοχέας ο οποίος συνδέεται με την DAP10 διαμεμβρανική πρωτεΐνη, τις ιντεγκρίνες και κυτταροκινικούς υποδοχείς (Vivier E 2004). Οι ανασταλτικοί υποδοχείς ενώνονται με τα MHC μόρια των φυσιολογικών κυττάρων και αποτρέπουν τα ΝΚ να στραφούν εναντίον των κυττάρων του οργανισμού, ενώ αντίθετα μολυσμένα κύτταρα που έχουν χάσει την ικανότητα έκφρασης τάξης Ι μορίων ιστοσυμβατότητας δέχονται επίθεση από τα ΝΚ. Σε αντίθεση με τους ενεργοποιητικούς, οι ανασταλτικοί υποδοχείς φέρουν στην κυτταροπλασματική τους επιφάνεια μια διαφορετική αλληλουχία (ITIM: immunoreceptor tyrosine based inhibitory motifs) η οποία συνδέεται με τυροσινικές φωσφατάσες όπως η SHP1 οι οποίες αποφωσφορυλιώνουν τα σηματοδοτικά μόρια. Επίσης τα ΝΚ κύτταρα αναγνωρίζουν κύτταρα στόχους καλυμμένα με αντισώματα μέσω του FcγRΙΙΙα (CD16) υποδοχέα τους, έναν χαμηλής συγγένειας υποδοχέα για το Fc τμήμα των IgG1 και IgG3 αντισωμάτων. Η διαδικασία αυτή καλείται αντισωματο εξαρτώμενη κυτταρικά διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα. Οι ανασταλτικοί υποδοχείς διακρίνονται σε τρεις οικογένειες. Η πρώτη οικογένεια είναι οι KIR (Killer Ig Receptors) η δεύτερη αποτελείται από τους ILTs (Ig like transcripts) που περιέχουν επίσης μόρια ανοσοσφαιρινών, ενώ η τρίτη κατηγορία αποτελείται από ετεροδιμερή των NKGB2A, NKG2B και CD94. 30

Ο πολλαπλασιασμός και η ενεργοποίηση των ΝΚ διεγείρεται από κυτταροκίνες κυρίως την IL-12 και την IL-15. Η ιντερλευκίνη 15 παράγεται από τα μακροφάγα και είναι τροφικός παράγων για τα ΝΚ. Στο πειραματόζωο έχει δειχθεί ότι απουσία του γονίδιου της εν λόγω κυτταροκίνης ή του υποδοχέα της οδηγεί σε παντελή έλλειψη ΝΚ κύτταρων. Η IL12 είναι ένας ισχυρός επαγωγέας της κυτταρολυτικής ικανότητας των ΝΚ και της παραγωγής IFN γ από αυτά (Moretta A 2005, Κυριαζής Γ 2002). Οι εκτελεστικές λειτουργίες των ΝΚ είναι η φόνεύση των μολυσμένων κυττάρων και η ενίσχυση της φαγοκυτταρικής ικανότητας των μακροφάγων. Ο μηχανισμός με τον οποίο τα ΝΚ λύουν τα κύτταρα είναι ο ίδιος με αυτόν με τον οποίο τα Τc πετυχαίνουν το ίδιο αποτέλεσμα. Τα κύτταρα αυτά περιέχουν κοκκία περφορίνης και κοκκοενζύμων τα οποία και όταν απελευθερώνονται δημιουργούν πόρους στις κυτταρικές μεμβράνες ή/και επάγουν την απόπτωση. Τελευταία, μελέτες υποστηρίζουν ότι τα ΝΚ κύτταρα ασκούν την δράση τους επίσης και μέσω κυτταροτοξικών μηχανισμών και μη εξαρτώμενων από κοκκία (απόπτωση διαμεσολαβούμενη από υποδοχείς θανάτου FASL, TNFR). Συμπερασματικά, ο ρόλος των ΝΚ στην άμυνα εναντίον ενδοκυττάριων παθογόνων πριν την ενεργοποίηση των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων είναι πολύ σημαντικός. Τα ΝΚ μπορούν να σκοτώσουν τα προσβεβλημένα κύτταρα λίγες μέρες μετά την ιογενή μόλυνση ενώ μπορούν να ενεργοποιήσουν τα μακροφάγα και να ελέγξουν μια λοίμωξη από ενδοκυττάριο βακτήριο μέχρι, μετά από εβδομάδες, να αναλάβει η ειδική ανοσία. Τα ΝΚ φονεύουν κύτταρα που διαφεύγουν από τα CD8 + T λεμφοκύτταρα μειώνοντας την έκφραση των MHC μορίων, όπως για παράδειγμα τα καρκινικά (Abbas AK 2003). Χημειοκίνες Οι χημειοκίνες ή χημειοτακτικές κυτταροκίνες είναι μικρές πρωτεΐνες συνδεόμενες με ηπαρίνη οι οποίες κατευθύνουν τα λευκοκύτταρα στα σημεία φλεγμονής. Αρχικά μελετήθηκαν για τον ρόλο τους στην φλεγμονή, σήμερα όμως οι χημειοκίνες και οι υποδοχείς τους είναι γνωστό ότι παίζουν τεράστιο ρόλο στην ρύθμιση της κίνησης των φαγοκυττάρων, στον έλεγχο της ειδικής ανοσιακής απάντησης και στην παθογένεση πολλών νοσημάτων. Ιδιαίτερα τα τελευταία χρόνια το ερευνητικό ενδιαφέρον στρέφεται στο ρόλο των χημειοκινών στην αθηροσκλήρωση ή σε αυτοάνοσες παθήσεις. 31

Οι περίπου 50 χημειοκίνες του ανθρώπου που έχουν αναγνωρισθεί χωρίζονται σε 4 κατηγορίες με βάση τις διαφορές στη δομή και στη λειτουργία (βλ. πίνακα 3). Η μεγαλύτερη οικογένεια είναι η CC (λέγεται έτσι γιατί οι πρώτες δύο από τις συνολικά τέσσερις κυστεΐνες του μορίου είναι διαδοχικές). Κυριότεροι αντιπρόσωποι είναι MCP, RANTES, MIP-1 και η δράση τους εξασκείται στα μακροφάγα τα οποία και προσελκύουν στο σημείο της έκκρισης τους. Η δεύτερη οικογένεια αποτελείται από CXC χημειοκίνες στις οποίες ένα αμινοξύ παρεμβάλλεται στα δυο αμινοξέα της κυστεΐνης. Οι χημειοκίνες αυτές, εκ των οποίων η IL-8 είναι η γνωστότερη, προσελκύουν τα ΠΜΠ. Στην τρίτη οικογένεια (CX3C) ανήκει η φρακταλήνη και στην τέταρτη η λυμφοταξίνη (XC1) με μόνο ένα αμινοξύ κυστεΐνης (Charo R, Ransohoff M 2006, Von Andrian U H 2001, Luster A D 1998). Οι χημειοκίνες δρουν πάνω στα κύτταρα ενεργοποιώντας επιφανειακούς υποδοχείς που ονομάζονται χημειοκινικοί υποδοχείς. Αποτελούνται από επτά διαμεμβρανικές περιοχές, συνδεόμενες ενδοκυτταροπλασματικά με G πρωτεΐνη. Η σύνδεση της χημειοκίνης με τον υποδοχέα ενεργοποιεί οδούς σηματοδότησης που καταλήγουν σε αναδιάταξη των ινιδίων της ακτίνης, αλλαγή του σχήματος και κίνησης του κυττάρου καθώς επίσης την εξωκύττωση των κοκκίων και την αναπνευστική έκρηξη στα κύτταρα της φυσικής ανοσίας. Οι μεσολαβητές της φλεγμονής IL-1, TNF-a, και βακτηριακά προϊόντα προκαλούν την παραγωγή CXC χημειοκινών (Charo R 2006). Οι χημειοκίνες εμπλέκονται στην ερμηνεία παθογένεσης πολλών φλεγμονωδών παθήσεων. Για παράδειγμα, υψηλά επίπεδα CCL2, CCL3, CCL5 στις αρθρώσεις ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα προκαλεί την στρατολόγηση Τ λεμφοκυττάρων και μονοπύρηνων στους συνοβιακούς ιστούς, ενώ στο άσθμα η CFCL11 προκαλεί την συγκέντρωση των εοσινοφίλων στους αεραγωγούς. Ως εκ τούτου, μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον υπάρχει για την ερμηνεία των αλληλεπιδράσεων των χημειοκινών με τους υποδοχείς τους και την πιθανότητα φαρμακευτικής παρέμβασης στους μηχανισμούς της φλεγμονής (Rossi D 2000, Luster A D 1998). Ένας άλλος τομέας έρευνας των χημειοκινών είναι στη μελέτη του AIDS. Ως γνωστό για να εισέλθει στα κύτταρα ο HIV1 απαιτούνται δυο στοιχεία:το CD4 μόριο και ο CΧCR4 υποδοχέας των Τ κύτταρων ή ο CCR5 που είναι υποδοχέας των μακροφάγων. Αποδείξεις για τον κεντρικό ρόλο τους προήλθαν από τις παρατηρήσεις ότι πολλά μολυσμένα άτομα που έφεραν μεταλλαγμένο μη λειτουργικό 32

υποδοχέα των παραπάνω χημειοκινών παρέμεναν ανθεκτικά στη λοίμωξη. Φάρμακα τα οποία θα στοχεύουν σε αυτόν τον χημειοκινικό υποδοχέα βρίσκονται ήδη σε κλινικό στάδιο έρευνας. Η ταξινόμηση των χημειοκινών και των υποδοχέων τους φαίνεται στον πίνακα 6 (Μπούρα Π. 2003). Συμπλήρωμα Το σύστημα του συμπληρώματος είναι μέρος της φυσικής ανοσίας και είναι ένας από τους κυριότερους εκτελεστικούς μηχανισμούς της αντισωματοεξαρτώμενης κυτταροτοξικότητας. Έχει τρεις αλληλοεπικαλυπτόμενες φυσιολογικές λειτουργίες: την άμυνα εναντίον των πυογόνων βακτηρίων, τη σύνδεση της φυσικής και ειδικής ανοσίας και την εξαφάνιση των ανοσοσυμπλεγμάτων και των προϊόντων της φλεγμονής. Το συμπλήρωμα αρχικά ταυτοποιήθηκε ως μια θερμοευαίσθητη ουσία στον ορό, που συμπλήρωνε τη βακτηριοκτόνο δράση των αντισωμάτων. Σήμερα ξέρουμε ότι το σύστημα του συμπληρώματος αποτελείται από 30 τουλάχιστον πρωτεΐνες, οι περισσότερες από τις οποίες παράγονται από το ήπαρ. Η ποσότητα των πρωτεϊνών αυτών είναι πάνω από 3 gr το λίτρο και αποτελούν περίπου το 15 % των σφαιρινών. Υπάρχουν τρεις οδοί ενεργοποίησης του συμπληρώματος: η κλασσική, η οδός της μαννόζης και η εναλλακτική. Οι οδοί αυτές είναι ουσιαστικά καταρράκτες πρωτεολυτικών αντιδράσεων, που ενεργοποιούνται από διαφορετικά ερεθίσματα (βλ. πίνακα 7 και 8 ) και καταλήγουν στην C3 κονβερτάση, ένα ένζυμο που διασπά το κεντρικό μόριο του καταρράκτη, το C3. Η παραγωγή του ενεργού τμήματος C3b πάνω στην επιφάνεια των μικροβίων προκαλεί την τελική ενεργοποίηση και την παραγωγή αναφυλατοξινών. Η τελική οδός του συμπληρώματος είναι κοινή και οδηγεί στον σχηματισμό του συμπλέγματος C56789, ένα μοναδικό λιποφιλικό σύστημα το οποίο δημιουργεί πόρους στην κυτταρική μεμβράνη. Υπάρχουν ρυθμιστικοί μηχανισμοί ελέγχου ώστε από τη μια πλευρά η ενεργοποίηση του να εστιάζεται στην επιφάνεια των εισβολέων και από την άλλη η καταστροφή των ζώντων ιστών να είναι η ελάχιστη. Όταν οι μηχανισμοί αυτοί δεν καταφέρνουν να ελέγξουν την δράση των παραπάνω παραγόντων παρατηρείται αυτόλογη καταστροφή με κάθε φορά διαφορετικά συμπτώματα. 33

Πίνακας.Οι 4 υποοικογένειες των χημειοκινών και οι κυριότεροι εκπρόσωποί τους α ) CXC: Στα μέλη αυτής της υποοικογένειας τα 2 πρώτα κυστεϊνικά μόρια χωρίζονται από ένα αμινοξύ CXCL1 έως 14 π.χ. CXCL1 (GRO-α / growth related oncogene-α) CXCL2 (GRO-β / GRO-α- growth related oncogene- β, ΜΡΙ2α ) CXCL3 (GRO-γ / growth related oncogene -γ) CXCL4 (PF-4 / platelet factor 4) CXL8 (IL-8) β ) CC: Σε αυτή την υποοικογένεια τα 2 πρώτα κυστεϊνικά μόρια βρίσκονται το ένα δίπλα στο άλλο χωρίς την παρεμβολή αμινοξέος CCL1 CCL2 ( MCP-1 / monocyte chemoattractant protein -1 ) CCL3 (MIP-1α / macrophage inflammatory protein 1α ) CCL4 (MIP-1β / macrophage inflammatory protein 1β ) CCL5 ( RANTES /regulated on activation of normal T cells expressed and secreted ) CCL11 (Eotaxin ) γ) XC: Σε αυτή την υποοικογένεια κάθε χημειοκίνη έχει μόνο 2 κυστεϊνικά μόρια, την 2 και 4 και σχηματίζουν έναν δισουλφιδικό δεσμό XCL1 ( Lemphotactin, ATAC / activation-induced, T-cell derived chemokine related ) XCL2 ( SCM-1β / single cysteine motif-1β ) δ) CX3C: Κάθε μέλος αυτής της υποοικογένειας δέχεται παρεμβολή τριών αμινοξέων μεταξύ των πρώτων 2 κυστεϊνικών μορίων CX3CL1 (Fractaline) 34

Περιγράφονται τρεις τύποι ανεπάρκειας του συμπληρώματος που αυξάνουν την πιθανότητα λοίμωξης: η μειωμένη οψωνική δραστηριότητα που αυξάνει την ευαισθησία σε βακτήρια με κάψα, η μειωμένη λυτική δραστηριότητα που αυξάνει την ευαισθησία στις ναϊσσέριες και η ανεπάρκεια του συστήματος της μαννόζης. Όλα τα παραπάνω καταδεικνύουν τον κρίσιμο ρόλο που έχει το συμπλήρωμα στην καταπολέμηση των μικρόβιων (Walport M J 2001, Γερμενής A. 1993, Schroeder W H, Rich R R 2001, Abbas AK 2003 ). Νεότερες μελέτες δείχνουν ότι το συμπλήρωμα έχει δράσεις φλεγμονώδεις αλλά και αντιφλεγμονώδεις μέσω της κάθαρσης των ανοσοσυμπλεγμάτων από την κυκλοφορία και της απομάκρυνσης τους από τους ιστούς Η ενδιαφέρουσα παρατήρηση ότι το 90% των ατόμων με ανεπάρκεια του C1 κλάσματος εμφανίζουν Σ.Ε.Λ. οδήγησε στην διατύπωση της θεωρίας της ανεπιτυχούς κάθαρσης (defective waste disposal), η οποία παρουσιάζει την ανεπιτυχή κάθαρση των αποπεπτοκώτων κυττάρων ως το αρχικό βήμα της αυτοάνοσης απάντησης. Ολοένα και περισσότερες ενδείξεις δημοσιεύονται ότι το συμπλήρωμα συμμετέχει στην εσωτερική ομοιόσταση του οργανισμού, ενώ ανεπαρκής ρύθμιση τυπικά συνδέεται με σπειραματονεφρίτιδες (Walport M J 2001). Πρωτεΐνες οξείας φάσης Σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις όπως λοιμώξεις, τραύματα, καταστροφή ιστών και μη ειδικές φλεγμονές παρατηρείται αύξηση ή μείωση (>25%) των συγκεντρώσεων ορισμένων πρωτεϊνών του αίματος. Οι μεταβολές αυτές προηγούνται των κλινικών συμπτωμάτων και οι πρωτεΐνες επανέρχονται στα φυσιολογικά επίπεδα τους κατά την σταδιακή επούλωση ή ανάρρωση. Επειδή οι μεταβολές αυτές συμπίπτουν με την οξεία εμφάνιση των εκδηλώσεων της νόσου, ονομάζονται πρωτεΐνες οξείας φάσης. Οι πρωτεΐνες οξείας φάσης παράγονται ως αποτέλεσμα της επίδρασης διαφόρων κυτταροκινών στον ηπατικό μεταβολισμό. Αυτές οι φλεγμονώδεις κυτταροκίνες είναι κυρίως η IL-1, ο TNF-α, η IL-1β, ο TGF-β και η IFN-γ. Παράγονται από πολλά κύτταρα κατά τις φλεγμονώδεις διαδικασίες αλλά η κύρια προέλευση τους είναι τα μακροφάγα. Καταστάσεις που οδηγούν σε σημαντικές μεταβολές στη συγκέντρωση πρωτεϊνών οξείας φάσης είναι οι λοιμώξεις, τα τραύματα, τα εγκαύματα, οι ανοσολογικές παθήσεις και ο καρκίνος. Ήπιες αυξήσεις 35

ακολουθούν την άσκηση, την θερμοπληξία και τον τοκετό και ακόμα μικρότερες το ψυχολογικό στρες και ψυχιατρικές παθήσεις (Gabay C, Kushner I 1999) Εκκινητές των τριών οδών ενεργοποίησης του συμπληρώματος Οδός Κλασσική Εκκινητές Ανοσοσυμπλέγματα Αποπτωτικά κύτταρα Ορισμένοι ιοί και Gram(-) βακτήρια. C-αντιδρώσα πρωτεΐνη Λεκτίνη που συνδέεται με μαννόζη Εναλλακτική Μικρόβια με τελικές ομάδες μαννόζης Πολλά βακτήρια, μύκητες, ιοί, καρκινικά κύτταρα Πίνακας 7: Οι οδοί του συμπληρώματος και οι τρόποι ενεργοποίησης τους. Δράση Άμυνα του ξενιστή έναντι της λοίμωξης Μηχανισμοί δράσης Οψωνοποίηση Χημειοταξία και ενεργοποίηση των λευκοκυττάρων Λύση βακτηρίων και κυττάρων Ομοιοπολικά συνδεδεμένα τμήματα του C 3 και του C 4 Αναφυλατοξίνες (C 5a,C 3a και C 4a ) Υποδοχείς αναφυλατοξινών στα λευκοκύτταρα Σύμπλεγμα προσβολής μεμβράνης (C 5β C 9 ) Αλληλεπίδραση μεταξύ της φυσικής και της επίκτητης ανοσίας Ενίσχυση της δράσης των αντισωμάτων Προαγωγή της ανοσιακής μνήμης Απομάκρυνση των αχρήστων Εκκαθάριση των ανοσοσυμπλεγμάτων από τους ιστούς Εκκαθάριση των αποπτωτικών κυττάρων C 3β και C 4β συνδεδεμένα στα ανοσοσυμπλέγματα και στο αντιγόνο. Υποδοχείς του C 3 στα Β κύτταρα και στα ΑΠΚ C 3β και C 4β συνδεδεμένα στα ανοσοσυμπλέγματα και στο αντιγόνο. Υποδοχείς του C 3 στα follicular δενδριτικά κύτταρα C 1q : Ομοιοπολικά συνδεδεμένα τμήματα του C 3 και του C 4 C 1q : Ομοιοπολικά συνδεδεμένα τμήματα του C 3 και του C 4 Πίνακας 8: Οι κύριες δράσεις επιτελούν. του συμπληρώματος και οι πρωτεΐνες που τις 36

Το 1930 ανακαλύφθηκε μια πρωτεΐνη, η C αντιδρώσα πρωτεΐνη (ονομάστηκε έτσι γιατί αντιδρούσε με την κάψα του πνευμονιόκοκκου), τα επίπεδα της οποίας αυξανόταν σε πολλαπλάσιο βαθμό στο πλάσμα ασθενών με πνευμονιοκοκκική πνευμονία. Η CRP ήταν η πρώτη πρωτεΐνη οξείας φάσης που ανακαλύφθηκε και 70 χρόνια μετά εξακολουθούν να περιγράφονται και να ερμηνεύονται άγνωστα μέχρι προσφάτως φαινόμενα οξείας φάσης. Η CRP ανήκει στην οικογένεια των πεντραξινών, πρωτεΐνες που αποτελούνται από πέντε όμοιες σφαιρινικές υπομονάδες. Συνδέεται με τα βακτηριακά φωσφολιπίδια και λειτουργεί σαν οψωνίνη αλληλεπιδρώντας με τον C1q ή τον Fcγ υποδοχέα των φαγοκυττάρων. Συμβάλλει στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος μέσω του C1q και μπορεί και επάγει την παραγωγή κυτταροκινών. Σε διαγονιδιακά ζώα φάνηκε ότι η αθροιστική της δράση είναι τελικά αντιφλεγμονώδης, αφού παρεμποδίζει την προσκόλληση των ουδετερόφιλων στο ενδοθήλιο, αναστέλλει την παραγωγή υπεροξειδίων και διεγείρει την σύνθεση του ανταγωνιστή της IL-1 υποδοχέα. Συμπερασματικά οι δράσεις της είναι: Σύνδεση με τη μεμβράνη των μικροβίων Προαγωγή της οψωνινοποίησης και της φαγοκυττάρωσης Σύνδεση με χρωματίνη, ιστόνες, snrnps => κάθαρση αποπτωτικού υλικού Ρύθμιση των λιπιδίων Μη δημιουργία MAC (C5-C9) Ελάττωση της δράσης των ουδετερόφιλων, λόγω ελάττωσης της L-σελεκτίνης, ελάττωση του υπεροξειδίου Ρύθμιση της ανοσίας, συμμετοχή στην κάθαρση αποπτωτικού υλικού Η CRP είναι βασικά αντιφλεγμονώδης πρωτεΐνη Στην οικογένεια των πεντραξινών ανήκει και η πεντραξίνη PTX3 η οποία παρουσιάζει αρκετές ομοιότητες με τις κλασσικές πεντραξίνες, αλλά εμφανίζει παράλληλα και μια μακριά αμινοτελική περιοχή και διαφορετική λειτουργική αποστολή. Η PTX3 είναι μια συντηρημένη εξελικτικά πρωτεΐνη που παράγεται άμεσα από διαφορετικούς τύπους κυττάρων όπως τα μακροφάγα, οι ινοβλάστες και τα μυελοειδή (αλλά όχι τα πλασμακυττοειδή ) δενδριτικά κύτταρα μετά από την επίδραση TNF-a και IL-1b και δρα πάνω σε διάφορους υποδοχείς της φυσικής ανοσίας όπως ο C1q. Πειράματα έδειξαν ότι η PTX3 παίζει ρόλο στη άμυνα του οργανισμού αλλά και στις διαδικασίες αναδόμησης και επούλωσης. Συνδέεται με τα 37

κύτταρα που έχουν αποπέσει και αναστέλλει την αναγνώριση τους από τα δενδριτικά. Η in vivo δράση της PTX3 δεν έχει πλήρως καθoριστεί (Bottazzi B 2006). Η λεκτίνη συνδέουσα την μαννόζη (MBL) είναι μια πρωτεΐνη του πλάσματος που λειτουργεί σαν οψωνίνη. Ανήκει στην οικογένεια των κολλεκτινών, η οποία χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι η βασική δομή των μορίων της περιέχει μια περιοχή ομοιάζουσα με κολλαγόνο και μια άλλη συνδέουσα το ασβέστιο. Η MBL του πλάσματος όπως και οι υποδοχείς των μακροφάγων έχουν στενή συγγένεια σύνδεσης με την μαννόζη ή την φουκόζη, μόρια που βρίσκονται στα γλυκολιπίδια ή τις γλυκοπρωτεΐνες των μικροβίων. Δηλαδή η MBL είναι ένας διαλυτός PRR που κατευθύνεται στα βακτηριακά και όχι στα ανθρώπινα κύτταρα. Βιοχημικά πρόκειται για ένα εξαμερές μόριο με δομή παρόμοια με το C1q συστατικό του συμπληρώματος. Η MBL συνδέεται με τον C1q υποδοχέα των μακροφάγων, ο οποίος μεσολαβεί τη φαγοκυττάρωση των οψωνοποιημένων μικροβίων και με αυτόν τον τρόπο μπορεί να ενεργοποιήσει το συμπλήρωμα. Τελευταία αναφέρονται περιπτώσεις φαινομενικά ανοσοικανών ατόμων στους οποίους τα χαμηλά επίπεδα MBL προσδίδουν μεγαλύτερη ευπάθεια σε λοιμώξεις από μηνιγγιτιδόκοκκο, σταφυλόκοκκο και στρεπτόκοκκο (Takahashi et al 2006). Σχήμα 2: Η πενταμερής δομή της CRP. Κυτταροκίνες Οι κυτταροκίνες είναι πρωτεΐνες που εκκρίνονται από τα κύτταρα της φυσικής και ειδικής ανοσίας και πραγματοποιούν πολλές από τις δράσεις αυτών των κυττάρων. Παράγονται σαν απάντηση σε μικροβιακή εισβολή και σε άλλα αντιγονικά 38

ερεθίσματα. Διαφορετικές κυτταροκίνες διεγείρουν διαφορετικές ανοσιακές απαντήσεις των κυττάρων αυτών. Επιγραμματικά οι κυτταροκίνες εμφανίζουν τις εξής ιδιότητες (Kotzin L B, Rich R R 2001): η έκκριση τους είναι σύντομη και αυτοπεριοριζόμενη οι κυτταροκίνες δεν αποθηκεύονται και η έκκριση τους εξαρτάται από την άμεση γονιδιακή μεταγραφή και την μεταμεταγραφική τροποποίηση οι δράσεις τους είναι πλειοτροπικές και πλεονάζουσες ο πλειοτροπισμός αναφέρεται στην δυνατότητα μιας κυτταροκίνης να δρα σε διαφορετικά κύτταρα, παράγοντας άλλο αποτέλεσμα ενώ η πλεονάζουσα δράση τους οφείλεται στο ότι πολλές κυτταροκίνες προκαλούν το ίδιο αποτέλεσμα. οι κυτταροκίνες προκαλούν την παραγωγή άλλων κυτταροκινών οι δράσεις τους μπορεί να είναι αυτοκρινείς, παρακρινείς ή και ενδοκρινείς οι δράσεις τους μεσολαβούνται μέσω της σύνδεσης τους με μεμβρανικούς υποδοχείς των κυττάρων στόχων η συγγένεια των κυτταροκινών με τους υποδοχείς τους είναι αρκετά υψηλή (σταθερά διάσπασης 10 10 έως 10 12 ) εξωτερικά ερεθίσματα ρυθμίζουν την έκφραση των υποδοχέων και την απαντητικότητα των κυττάρων στις κυτταροκίνες, για παράδειγμα, η διέγερση των Τ ή Β λεμφοκυττάρων οδηγεί σε αυξημένη έκφραση κυτταροκινικών υποδοχέων γεγονός που συμβάλει στην αντιγονο-ειδικότητα της ανοσιακής απάντησης. οι κυτταρικές απαντήσεις στις κυτταροκίνες αφορούν σε αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση, στην ενεργοποίηση νέων λειτουργιών και κάποιες φορές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Η ενδοκυττάρια σηματοδότηση γίνεται με ενδιάμεσες πρωτεϊνικές κινάσες (JAK, STAT) με απώτερο σκοπό την ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων. Πιο συγκεκριμένα, η ενεργοποίηση κυτταροκινικών υποδοχέων οδηγεί σε φωσφορυλίωση της τυροσίνης σε μια οικογένεια τεσσάρων κυτταροπλασματικών κινασών, γνωστών ως janus kinases (JAKs). Ακολουθεί η φωσφορυλίωση και η ενεργοποίηση κυτταροπλασματικών παραγόντων STAT (Signal Transducers And Activators Of Transcription ή μεταγωγείς σημάτων και ενεργοποιητές της μεταγραφής) που σηματοδοτούν τη μεταγραφή πολλών γονιδίων, με τελικό σκοπό την ενεργοποίηση των κυττάρων. 39

Λειτουργική κατηγοριοποίηση των κυτταροκινών (Panayi S G 2004) μεσολαβητές και ρυθμιστές της φυσικής ανοσίας παράγονται κυρίως από τα μακροφάγα όταν έρθουν σε επαφή με μικροβιακά στοιχεία όπως LPS, RNA. Οι περισσότερες δρουν στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στα λευκοκύτταρα στις πρώιμες αντιδράσεις φλεγμονής. Παραδείγματα τέτοιων κυτταροκινών είναι οι: IL-1, IL-12, TNF-α μεσολαβητές και ρυθμιστές της ειδικής ανοσίας παράγονται κυρίως από τα Τ λεμφοκύτταρα ως απάντηση σε αντιγόνα και δρουν σε λεμφοκύτταρα ρυθμίζοντας τη δράση εκτελεστικών κυττάρων με κύριο παράδειγμα της IFN-γ διεγέρτες της αιματοποίησης όπως οι GM-CSF, G-CSF Χαρακτηριστικά Φυσική ανοσία Ειδική ανοσία Κυτταροκίνες TNF-a, IL-1, IL-12, IFN-γ IL-2, IL4, IL-5, IFN-γ Κύτταρα Μακροφάγα, ΝΚ κύτταρα Τ-λεμφοκύτταρα Λειτουργίες Μεσολαβητές της φυσικής Ρύθμιση του πολλαπλασιασμού ανοσίας και της φλεγμονής και της ανάπτυξης των λεμφοκυττάρων, ενεργοποίηση εκτελεστικών κυττάρων Ερεθίσματα LPS (ενδοτοξίνη), Πρωτεϊνικά κυρίως ιϊκό RNA, αντιγόνα Τ-εκκρινόμενη IFN-γ, πεπτιδογλυκάνες Ποσότητα Μεγάλη, ανιχνεύσιμες Γενικά μικρή, μη στον ορό ανιχνεύσιμες στον ορό Τοπικά ή συστηματικά Αμφότερα Συνήθως τοπικά φαινόμενα Ρόλος Γενικευμένες αντιδράσεις Δρουν κυρίως τοπικά (σηπτικό σοκ) (Κοκκιωματώδης φλεγμονή) Αναστολείς Κορτικοστεροειδή Κυκλοσπορίνη, FK-506 Πίνακας 9: Κυτταροκίνες της φυσικής και ειδικής ανοσίας 40

Υποδοχείς κυτταροκινών Όλοι οι κυτταροκινικοί υποδοχείς αποτελούνται από μια ή περισσότερες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, η εξωκυττάρια περιοχή των οποίων είναι υπεύθυνη για την σύνδεση με την κυτταροκίνη και η ενδοκυττάρια για ενεργοποίηση των οδών σηματοδότησης. Οι οδοί αυτές ενεργοποιούνται όταν η σύνδεση κυτταροκίνηςυποδοχέα προκαλεί την αλλαγή της διαμόρφωσης των κυτταροπλασματικών τμημάτων του τελευταίου και την φωσφωρυλίωση τους. Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη κατηγοριοποίηση κυτταροκινικών υποδοχέων είναι η εξής (Kotzin L B, Rich R R 2001, Panayi S G 2004): Τύπου Ι (καλούνται και αιμοποιητικοί) αποτελούνται από μια ή περισσότερες καλά συντηρημένες περιοχές κυστεΐνης και μια διαμεμβρανική περιοχή τρυπτοφάνης-σερίνης (WSXWS). Συνδέουν τις IL-4, IL-5, IL-6 IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, G-CSF Τύπου ΙΙ Είναι δομικά παρόμοιες με την προηγούμενη κατηγορία. Συνδέουν τις IFNa/β, IFN-γ, IL-10 Της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών Συνδέουν IL-1, M-CSF, stem cell factor ΤΝF υποδοχείς Περιέχουν μια εξωκυτταρική περιοχή πλούσια σε κυστεΐνη ενώ η ενδοκυτταρική περιοχή ενεργοποιεί πρωτεΐνες που επάγουν την απόπτωση ή την έκφραση των γονιδίων. Συνδέουν τον TNF, LT, CD40L, FasL, OX-40L. Με επτά διαμεμβρανικές α έλικες συνδεόμενες με G πρωτεΐνες ή χημειοκινικοί υποδοχείς. Στον πίνακα 8 φαίνονται οι κυριότερες κυτταροκίνες και οι δράσεις τους. Μόρια προσκόλλησης Για να αναπτυχθεί και να εξελιχθεί η ανοσιακή απόκριση, τα ανοσοϊκανά κύτταρα χρησιμοποιούν ορισμένα μόρια τα οποία διευκολύνουν την επαφή τους αλλά και με τους γύρω ιστούς, τα οποία ονομάζονται μόρια προσκόλλησης (adhesion molecules). Πρόκειται για διαμεμβρανικούς υποδοχείς που συνδέουν τα κύτταρα της άμυνας προς άλλα κύτταρα ή μεταξύ τους και προς τη θεμέλιο ουσία. Οι δομές αυτές 41

με τις οποίες συνδέονται τα μόρια προσκόλλησης ονομάζονται μόρια σύνδεσης. Το αποτέλεσμα σύνδεσης μορίου προσκόλλησης- μορίου σύνδεσης είναι η σταθερή προσκόλληση των κυττάρων μεταξύ τους ή με τη θεμέλιο ουσία και η μεταβίβαση πληροφοριών. Η ικανότητα να επιτηρεί συνεχώς το αντιγονικό περιβάλλον είναι ένα βασικό στοιχείο της λειτουργίας του ανοσολογικού συστήματος. Τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και τα λεμφοκύτταρα πρέπει να είναι ικανά να βρουν το αντιγόνο όπου και αν αυτό βρίσκεται μέσα στον οργανισμό. Η επιτήρηση αυτή εκπληρώνεται μέσα από ένα δαιδαλώδες και διαπλεκόμενο σύστημα αιμοφόρων αγγείων και λεμφαγγείων που συνδέουν τους ιστούς με τα συμπαγή όργανα του περιφερικού ανοσιακού συστήματος (λεμφαδένες, σπλήνας). Η κυκλοφορία και η κατανομή των ανοσοϊκανών κυττάρων ελέγχεται σε μεγάλο βαθμό από τις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε μόρια της επιφάνειας των κυττάρων και σε συνδέτες τους στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα μόρια αυτά ανήκουν στις διάφορες κατηγορίες των μορίων προσκόλλησης. Τα μόρια προσκόλλησης είναι γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες εκφράζονται στην επιφάνεια πολλών κυττάρων και παίζουν σπουδαίο ρόλο σε φλεγμονώδεις και νεοπολασματικές παθήσεις. Η κύρια φυσιολογική τους λειτουργία είναι η χημειοταξία (η μετακίνηση δηλαδή των κυττάρων στον χώρο φλεγμονής) και η διαπίδυση των λευκοκυττάρων διαμέσου του ενδοθηλίου και της βασικής μεμβράνης που αποτελούν το πρώτο στάδιο της στρατολόγησης των εν λόγω κυττάρων στο χώρο της φλεγμονής. Οι διαδικασίες αυτές διαμεσολαβούνται μέσω της αλληλεπίδρασης και της αυξημένης έκφρασης των διαφόρων μορίων προσκόλλησης στα λευκά αιμοσφαίρια και το ενδοθήλιο. Υπάρχουν 5 κατηγορίες: οι ιντεγκρίνες, η οικογένεια των ανοσοσφαιρινών, οι σελεκτίνες, οι καθχερίνες και οι σιαλοβλεννίνες. Οι συγκεκριμένες λειτουργίες των μορίων προσκόλλησης και των συνδετών τους σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις και οι πιθανές θεραπευτικές παρεμβάσεις αποτελούν αντικείμενα έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος (Shearer T W. 2001). 42

Κυτταροκίνες Μέγεθος Κύρια πηγή Κύρια λειτουργία TNF-α IL1 17-51KD ομοτριμερές 17KD ώριμη μορφή 33KD πρόδρομα Μακροφάγα, Τ λεμφοκύτταρα Μακροφάγα, ενδοθηλιακά κάποια επιθηλιακά Χημειοκίνες 8-12KD Μακροφάγα, Τ λεμφοκύτταρα ενδοθηλιακά, ινοβλάστες αιμοπετάλια IL12 IFN IL10 35KD ετεροτριμερές IFN α: 15-21KD IFN β : 20-25 KD IFN-γ 25-35KD 34-40KD ομοτριμερές 18KD Μακροφάγα, δενδριτικά Μακροφάγα ινοβλάστες Μακροφάγα ινοβλάστες Τh 1 NK T-κυτταροτοξικά Μακροφάγα, Τh 2 IL6 19-26KD Μακροφάγα, Ενδοθηλιακά κύτταρα : ενεργοποίηση (φλεγμονή, πήξη) Ενεργοποίηση ουδετερόφιλων Υποθάλαμος: πυρετός Ήπαρ:πρωτεΐνες οξείας φάσης Μύες, λίπος: καταβολισμός Ποικίλα κύτταρα: απόπτωση Ενδοθηλιακά κύτταρα : ενεργοποίηση (φλεγμονή, πήξη) Υποθάλαμος: πυρετός Ήπαρ: πρωτεΐνες οξείας φάσης Λευκά: χημειοταξία, ενεργοποίηση, μετανάστευση Τ: Th1 διαφοροποίηση ΝΚ και Τ: IFN-γ σύνθεση Αυξημένη κυτταρολυτική δραστηριότητα Όλα τα κύτταρα :αυξημένη αντϊική δράση, έκφραση MHC Ι ΝΚ: ενεργοποίηση Αναστολή ιϊκού πολ/σμού, αύξηση έκφρασης MHCI, II, αναστολή Τh 2 πολ/σμού, αύξηση ΙgG2,IgE Μακροφάγα, δενδριτικά:αναστολή έκφρασης IL12 και συνδιεγερτικών μορίων και κλάσης MHC ΙΙ μορίων Ήπαρ: πρωτεΐνες οξείας φάσης Τ λεμφοκύτταρα Β κύτταρα: πολλαπλασιασμός ενδοθηλιακά IL15 13KD Μακροφάγα, ΝΚ: πολλαπλασιασμός Τ λεμφοκύτταρα: πολλαπλασιασμός κυττάρων μνήμης IL18 17KD Μακροφάγα ΝΚ και Τ: IFN-γ σύνθεση Πίνακας 8: Οι κυριότερες κυτταροκίνες και η δράση τους. 43

Οι ιντεγκρίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην εμβρυογένεση, στην επούλωση τραυμάτων, στην ανοσιακή απάντηση και στις νεοπολασματικές μεταστάσεις. Εμπλέκονται στις διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις και στις συνδέσεις κυττάρου και θεμέλιας ουσίας. Είναι μεγάλες μεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες που αποτελούνται από μια α και μια β αλυσίδα. Διάφοροι συνδυασμοί των 15 α και 8 β αλυσίδων δημιουργούν τα 19 μόρια, των ως τώρα γνωστών ιντεγκρινών. Οι πιο καλά μελετημένες είναι β1(cd29) β2 (CD18) β3 (CD61) που προσκολλούν τα κύτταρα στην θεμέλια ουσία (Elangbam S 1997). Η οικογένεια των ανοσοσφαιρινών χαρακτηρίζεται από την ανάλογη δομή και συμπεριλαμβάνει το λευκοκυτταρικό αντιγόνο LFA2 (Leukocyte function antigen ή CD2) και LFA3 (CD58) διακυτταρικά μόρια προσκόλλησης (ICAMs), ενδοθηλιακά μόρια προσκόλλησης (VCAM), μόρια προσκόλλησης αιμοπεταλίωνενδοθηλίου (PE-CAM1) και βλεννογονικά μόρια (MAdCAM-1). Η σύνδεση των Τ με το ενδοθήλιο μεσολαβείται εν μέρει από την αλληλεπίδραση LFA 2 και LFA 3, η οποία γίνεται και χωρίς αντιγονική ευαισθητοποίηση. Τα ΙCAM μόρια βοηθούν στην εντόπιση των σημείων φλεγμονής από τα λευκοκύτταρα. Πολλές κυτταροκίνες όπως IFN-γ, IL-1, TNF-a επάγουν την έκφραση των μορίων αυτών. Οι σελεκτίνες, γνωστές και ως προσκολλητικά μόρια λεκτίνης αποτελούν μια κλάση μορίων προσκόλλησης που εκφράζονται στα λευκά στο ενδοθήλιο και στα αιμοπετάλια. Τα μόρια αυτά παίζουν ρόλο στον καθορισμό του σημείου στο οποίο τα αιμοσφαίρια θα διαπεράσουν το τοίχωμα του αγγείου για να βρεθούν στο μεσοκυττάριο χώρο. Τα μέλη της οικογένειας των σελεκτινών είναι: Ε (CD62), P (CD62), L (CD62), LAM-1 (Frenette P 1996, Elangbam S C 1997). Είναι υπεύθυνα για το κύλισμα των λευκοκυττάρων που είναι ένα ενδιάμεσο στάδιο της προσκόλλησης των λευκών στο ενδοθήλιο. Συγκεκριμένα, αρχικά τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα συνδέονται χαλαρά στο ενεργοποιημένο ενδοθήλιο της φλεγμένουσας περιοχής, μειώνοντας ολοένα και περισσότερο την ταχύτητα κίνησης τους (κύλισμα). Εν συνεχεία εκφράζουν μόρια ιντεγκρινών με υψηλή ικανότητα σύνδεσης στο ενδοθήλιο. Έτσι οι LFA-1 και Mac 1 ιντεγκρίνες στα ουδετερόφιλα συνδέονται με τα ICAM- 1, 2, 3 στο ενδοθήλιο. Αυτή η ισχυρή σύνδεση των ΠΜΠ μέσω ιντεγκρινών, έχει ως αποτέλεσμα την λήξη του κυλίσματος τους στο ενδοθήλιο και εν συνεχεία τη διαπίδυση τους μέσω των χαλαρών τοπικά διακυτταρικών συνάψεων. Τέλος, η διατήρηση της αρχιτεκτονικής των ιστών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την δομική και λειτουργική ακεραιότητα των καθχερινών. Οι καθχερίνες 44

αποτελούν μια υπεροικογένεια εξαρτώμενων από το ασβέστιο μορίων προσκόλλησης που συμμετέχουν στην διατήρηση των διακυτταρικών συνδέσεων. Αναγνωρίζονται τρεις υποκατηγορίες: οι επιθηλιακές, οι πλακουντιακές και οι νευρωνικές, σύμφωνα με την εμβρυολογική τους προέλευση. Σήμερα, καινούργια μόρια προσκόλλησης εξακολουθούν να ανακαλύπτονται (CD44, GP330) με την ελπίδα ότι το ταχέως αναπτυσσόμενο ερευνητικό πεδίο θα προσφέρει στο μέλλον νέα προληπτικά και θεραπευτικά εργαλεία στην αντιμετώπιση φλεγμονωδών και νεοπλασματικών παθήσεων (Martin F 2003). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η απόδειξη κλινικής αποτελεσματικότητας του μονοκλωνικού αντισώματος natalizumab στην πολλαπλή σκλήρυνση. Το natalizumab κατευθύνεται εναντίον των α4 ιντεγκρινών παρεμποδίζοντας την διαπίδυση των ΠΜΠ διαμέσου των μικροαγγείων του εγκεφάλου (Miller D 2003). Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΛΟΙΜΩΞΗ Η πρώιμη και τοπική απάντηση της φυσικής ανοσίας στην εισβολή των παθογόνων συνίσταται στην φλεγμονώδη αντίδραση, κατά την οποία τα λευκοκύτταρα και τα μακροφάγα επιστρατεύονται στο σημείο της λοίμωξης με σκοπό την καταστροφή τους. Τα μικρόβια εισβάλλουν στον ανθρώπινο οργανισμό διαμέσου των βλεννογόνων και φαγοκυτταρώνονται από τα επαγγελματικά φαγοκύτταρα που βρίσκονται στον υποβλεννογόνιο χώρο. Η φαγοκυττάρωση διευκολύνεται από την οψωνοποίηση των μικροβίων από αντισώματα ή στοιχεία του συμπληρώματος και λαμβάνει χώρα μέσω του υποδοχέα του Fc κλάσματος των ανοσοσφαιρινών ή υποδοχέων συμπληρώματος αντίστοιχα αλλά και ιντεγκρινών και άλλων PRRs. Τα φλεγμονώδη φαινόμενα (οίδημα, πόνος, θερμότητα, ερυθρότητα, δυσλειτουργία) προκαλούνται από την δράση κυτταροκινών όπως ο TNF, IL-1 και χημειοκινών οι οποίες δρουν πάνω στα κύτταρα της φυσικής και ειδικής ανοσίας με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση τους. Μικροβιακά προϊόντα, όπως ο LPS ενεργοποιούν τους παράγοντες πήξης όπως η θρομβίνη και δρουν πάνω στα ενδοθηλιακά κύτταρα αυξάνουν την έκφραση των προσκολλητικών μορίων και την διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος στα ΠΜΠ. Τα Ν-φορμυλμεθυλιωμένα πεπτίδια των βακτηρίων, οι χημειοκίνες και τα στοιχεία του συμπληρώματος δρουν 45

στα ΠΜΠ χημειοτακτικά και τα ενεργοποιούν παράλληλα ενισχύοντας την βακτηριοκτόνο τους ικανότητα. Ορισμένα βακτήρια έχουν την ικανότητα να επιβιώσουν στα ΠΜΠ γεγονός που δηλώνει ότι έχουν αναπτύξει μηχανισμούς αντοχής στους οξειδωτικούς (ROIs, RNIs) και ενζυμικούς (περφορίνη) αντιβακτηριδιακούς μηχανισμούς των ΠΜΠ. Ο κυριότερος παράγοντας της λοιμογόνου δύναμης των βακτηρίων είναι ο LPS ο οποίος αναγνωρίζεται από την CD14/TLR4 οδό με αποτέλεσμα την παραγωγή της IL-12, IL-6, TNF-a, IL-10. Η αναγνώριση των διαφόρων μικροβίων από τα ΑΠΚ και η επακόλουθη διέγερση της φυσικής ανοσιακής απάντησης σχετίζεται κάθε φορά με άλλους PAMPs που αναγνωρίζονται από άλλοτε άλλο PRR. Από τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν τα μακροφάγα καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό η κατεύθυνση ( Th1/Th2 ) της ειδικής ανοσιακης απάντησης. Οι κυτταροκίνες που εκκρίνονται στην Τh1 απάντηση είναι οι IFN γ, TNF-α, η λυμφοταξίνη, που επάγουν την παραγωγή ΝΟ στα μακροφάγα, την ισοτυπική μετατροπή των αντισωμάτων σε ΙgG1 και ενεργοποιούν την κλασσική οδό του συμπληρώματος και τη Fas οδό. Η Τh1 αντιδράσεις διαμεσολαβούνται κυρίως από τα μακροφάγα και περιλαμβάνουν την φαγοκυττάρωση και την ενδοκυττάρια φόνευση των παθογόνων. Η Τh2 οδός διαμεσολαβείται από τις κυτταροκίνες IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 και IL-13, την IgE και χαρακτηρίζεται από την αναστολή της λειτουργίας των μακροφάγων.δηλαδή, οι Τh2 αντιδράσεις είναι ανεξάρτητες από τα μακροφάγα και επιτελούνται κυρίως από μη κυτταροτοξικά αντισώματα, μαστοκύτταρα και εωσινόφιλα. Στην περίπτωση ενδοκυττάριων παθογόνων (βρουκέλλα, λεγγιονέλλα, μυκοβακτηρίδιο) κυριαρχούν η IL-12, TNF-α τα οποία κατευθύνουν την ειδική ανοσία προς την Th1 απάντηση, η οποία είναι καθοριστική για την οριστική εκρίζωση της λοίμωξης. Ο TNF ενισχύει άμεσα την βακτηριδιοκτόνο δράση των φαγοκυττάρων, ενώ συγχρόνως ενεργοποιεί τα ΝΚ κύτταρα προς την παραγωγή IFNγ, η οποία αποτελεί δυναμικό διεγέρτη της αντιμικροβιακής δραστηριότητας των μακροφάγων. Σε αντίθεση σε παρασιτικές λοιμώξεις από έλμινθες η ανοσιακή απόκριση κατευθύνεται προς την Τh2 οδό με την έκκριση IL-4, IL-5 IL-10. Ίσως η διέγερση του εκάστοτε PRR να καθορίζει το βαθμό έκκρισης της κάθε κυτταροκίνης. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ΑΠΚ που εκφράζουν Β7-2 ή συνδέτη για το CD30 προάγουν την παραγωγή IL-4, ενώ χημειοκίνες της C-C οικογένειας κινητοποιούν 46

πρωτίστως Τh2 κύτταρα (Unanue ER 2002, Swain SL 1999, Rich R R 2001, Jiang H 2006, Σκένδρος 2006). Βέβαια σε κοινές λοιμώξεις μπορούν να μετρηθούν όλες οι επάγουσες την φλεγμονή κυτταροκίνες σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και στην ειδική κυτταρική απάντηση συμμετέχουν Τ λεμφοκύτταρα και από τους δυο υποπλυθυσμούς βοηθητικών Τh κυττάρων σε διαφορετικό βαθμό. Όμως στις περιπτώσεις χρόνιων λοιμώξεων όπως για παράδειγμα από έλμινθες, από το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης και τη λεϊσμάνια παρατηρείται ισχυρώς πολωμένη Th1/Th2 απόκριση. Η επιτυχής εκρίζωση ή η διασπορά της λοίμωξης και η σηπτική καταπληξία καθορίζονται από την κατάλληλη για κάθε περίπτωση αρχική ενεργοποίηση των Th1/Th2 κυττάρων. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η λεϊσμανίαση. Έχει αποδειχθεί ότι ασθενείς που παρουσιάζουν Th1 φαινότυπο είναι πολύ πιο πιθανό να απαλλαχθούν από τη λοίμωξη με λεϊσμάνια σε αντίθεση με ασθενείς που απαντούν μέσω Th2 οδού οι οποίοι κατά πάσα πιθανότητα καταλήγουν. Κατά παρόμοιο τρόπο μετά την μόλυνση με μυκοβακτηρίδιο της λέπρας μπορεί να εκδηλωθεί λεπρωματώδης μορφή με εκτεταμένες δερματικές βλάβες και αντιδράσεις καθυστερημένης υπερευαισθησίας και η φυματιώδης μορφή με περιορισμένη κοκκιωματώδη αντίδραση περινευρικά. Ιστοχημική ανάλυση με RT-PCR από ασθενείς με λεπρωματώδη μορφή ανέδειξε αυξημένα επίπεδα mrna των ιντερλευκινών IL-4 και IL-5 ενώ στην φυματιώδη μορφή ανευρίσκονται κυρίως οι κυτταροκίνες IL-2 και IFN-γ. Το ίδιο ισχύει και για αυτοάνοσες παθήσεις και χρόνιες αλλεργικές καταστάσεις (Unanue ER 2002, Romagnani S 2004). Δείγματα από οσφυονωτιαία παρακέντηση από ασθενείς με πολλαπλή σκλήρυνση αποκάλυψαν λεμφοκυττάρωση Th1 τύπου. Στον πίνακα 9 φαίνονται οι Τh απαντήσεις σε διάφορα παθογόνα. (Shearer T W 2001, Abbas A K 2003). ΜΟΝΤΕΛΑ ΛΟΙΜΩΞΗΣ Μοντέλο «Διάκρισης ίδιου /μη ίδιου» Το 1960 οι Burnet και Medawar μοιράστηκαν το βραβείο Nόμπελ για την θεωρία της διάκρισης «εαυτού /μη εαυτού». Το αρχικό μοντέλο βασιζόταν στις εξής παραδοχές: (α) κάθε λεμφοκύτταρο εκφράζει πολλαπλά αντίγραφα ενός μοναδικού υποδοχέα, ειδικού για ένα ξένο μόριο (β) η σηματοδότηση μέσω του επιφανειακού υποδοχέα αποτελεί αφελτήριο για την ανοσιακή απόκριση (γ) τα αυτοαντιδρώντα 47

λεμφοκύτταρα εξαλείφονται κατά την εμβρυϊκή ζωή. Αργότερα οι Lafferty και Cunningham πρότειναν ότι τα Τ κύτταρα χρειάζονται ένα δεύτερο σήμα (συνδιέγερση) που δέχονται από "διεγερτικά" κύτταρα (ΑΠΚ) το οποίο είναι ξεχωριστό για κάθε είδος. Μοντέλο «Διάκριση λοιμώδους μη ίδιου /μη λοιμώδες ίδιο» Το 1989 ο Janeway μελετώντας τα ΑΠΚ πρότεινε ότι αυτά βρίσκονται σε ανενεργό κατάσταση και ενεργοποιούνται μέσω γονιδιακά (germ-line) καθοριζόμενων υποδοχέων πρότυπων δομών (PRR) που αναγνωρίζουν συντηρημένες μοριακές δομές των μικροβίων (PAMP). Κατά την ενεργοποίηση τα ΑΠΚ παρουσιάζουν το αντιγόνο και συνδιεγερτικά μόρια στα Τ κύτταρα. Οι PRRs επιτρέπουν την διάκριση του λοιμώδους παράγοντα από τον ίδιο τον εαυτό. Η θεωρία αυτή όμως άφηνε αναπάντητα ερωτήματα όπως πως οι οργανισμοί διέρχονται από φάση μεταμόρφωσης π.χ. εφηβεία και κύηση χωρίς αυτοανοσία, γιατί οι μητέρες δεν απορρίπτουν τα κυήματα ή τους μαστούς κατά την λοχεία ή γιατί δεν απορρίπτονται οι όγκοι και γιατί αποτυγχάνουν τα εμβόλια. Μοντέλο του κινδύνου Στηριζόμενη στο προηγούμενο μοντέλο η Matzinger εισάγει ένα πρώιμο επίπεδο κυτταρικών αλληλεπιδράσεων και σημάτων προτείνοντας ότι τα ΑΠΚ ενεργοποιούνται από σήματα κίνδυνου που προέρχονται από κύτταρα που έχουν υποστεί βλάβη από παθογόνα, τοξίνες, μηχανική βλάβη κ.λ.π. Τα σήματα κινδύνου μπορεί είναι συνεχή ή επαγώγιμα, ενδοκυττάρια ή εκκρινόμενα ή να αποτελούν σήματα τμήματα της εξωκυττάριας θεμελίου ουσίας. Πριν το προγραμματισμένο θάνατο των κύτταρων (απόπτωση) μακροφάγα ρακοσυλλέκτες τα φαγοκυτταρώνουν χωρίς τη έκλυση των μορίων που περιέχουν. Όταν συμβαίνει νέκρωση των κυττάρων κάθε ενδοκυττάριο προϊόν δυνητικά μπορεί να αποτελέσει σήμα κινδύνου DAMP (Damage Associated Molecular Patterns). Η θεωρία του κινδύνου θέτει στο επίκεντρο την με οποιαδήποτε τρόπο ιστική βλάβη και καταρρίπτει την υπόθεση ότι η ιδιότητα του "ξένου" ενός μικροβίου είναι σημαντική για την ανοσιακή απόκριση ή ότι η ιδιότητα του εαυτού εγγυάται την μη απάντηση (P. Matzzinger 2001, Skoberne M 2004). Μοντέλο της υδροφοβίας Ο S. Y. Seong επεκτείνοντας το μοντέλο της Matzinger έκανε την καταπληκτική υπόθεση ότι τα ίδια σήματα κινδύνου χρησιμοποιούνται από όλους τους οργανισμούς και ότι σημασία έχει όχι η προέλευση ενός μορίου αλλά ο 48

υδρόφοβος χαρακτήρας του. Στο βαθμό που η ζωή εξελίχθηκε μέσα στην θάλασσα κάθε υδρόφοβο τμήμα (Hyppos) των πρωτεϊνικών μορίων θάβεται στο εσωτερικό τους ή στην κυτταρική μεμβράνη. Η έκθεση αυτών των τμημάτων στους επιφανειακούς υποδοχείς μπορεί να αποτελεί το πρώτο σήμα της φλεγμονής. Κατά την πρωτεϊνική σύνθεση, οι πρωτεΐνες του θερμικού σοκ και οι άλλες τσαπερόνες (πρωτεΐνες του συστήματος Golgi που ενώνονται με τις νεοσχηματιζόμενες πολυπεπτιδικές αλυσίδες και αποτρέπουν την "μη φυσιολογική" αναδίπλωση τους) συνδέονται με τα Hyppos και αποτρέπουν της συσσώρευση των νεοσχηματιζόμενων μορίων. Τα PAMPs επομένως είναι υποσύνολο των DAMPs, ενώ κυρίαρχο ρόλο αποκτούν τα λιπίδια που επάγονται από το stress. ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΤΟΥ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥ Όπως έχει αναφερθεί, τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα αναγνωρίζουν στην επιφάνεια των μικροβίων μια ομάδα οντογενετικά συντηρημένων δομών, χωρίς αντιγονική μεταβλητότητα, που σχετίζεται με την επιβίωση και την λοιμογόνο δύναμη των παθογόνων και καλούνται PAMPs (pathogen associated molecular patterns). Τα PAMPs είναι πρωτεΐνες που δεν έχουν καμία χημική και αντιγονική ομοιότητα με τα μόρια του ανθρώπινου οργανισμού. Τέτοια είναι: οι λιποπολυσακχαρίτες, οι λιποπρωτεΐνες των Gram αρνητικών, το τειχοκό οξύ Gram θετικών, οι μανάνες των ζυμών, το μεθυλιωμένο CpG DNA και το διπλής έλικας dsrna. Η αναγνώριση του παθογόνου γίνεται με μια σειρά υποδοχέων που ονομάζονται υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων δομών (pattern recognition receptors). Oι PRRs ανήκουν σε διάφορες πρωτεϊνικές ομάδες, κωδικοποιούνται από αρχέγονα γονιδιακά στοιχεία που δεν ανασυνδυάζονται σωματικά και δεν εμφανίζουν κλωνική ανακατανομή. Το κύριο χαρακτηριστικό τους είναι ότι αναγνωρίζουν τους PAMPs και μπορεί να βρίσκονται διαλυτοί στο πλάσμα ή στο μεσοκυττάριο υγρό ή να βρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη ή στο κυτταρόπλασμα. Σε αντιδιαστολή, ο Τ κυτταρικός υποδοχέας παράγεται μετά από αναδιατάξεις των γονιδίων της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών, εμφανίζει κλωνική κατανομή και ενεργοποιείται όταν έρθει σε επαφή με το αντιγονικό πεπτίδιο. Γίνεται συνεπώς φανερό ότι οι υποδοχείς της φυσικής ανοσίας αναγνωρίζουν μη αντιγονοειδικά το παθογόνο. Ο λειτουργικός τους ρόλος είναι να γνωστοποιήσουν στο ανοσιακό 49

σύστημα την παρουσία του παθογόνου και να διακρίνουν το λοιμώδες μη ίδιο από το μη λοιμώδες ίδιο. Στους PRRs ανήκουν πέντε ομάδες πρωτεϊνών:c-λεκτίνες (C-type lectins), πρωτεΐνες πλούσιες σε λευκίνη (Leucine-rich proteins), υποδοχείς ρακοσυλλέκτες (Scavenger Receptors), λιπιδιακές τρανσφεράσες (Lipid tranferases) και πεντατραξίνες (Pentraxins), με πιο γνωστές την CRP και το αμυλοειδές Α. Έχουν βρεθεί PRRs που εκφράζονται στο κυτταρόπλασμα και έχουν ως σκοπό να παρεμποδίσουν τον ιΐκό πολλαπλασιασμό. Τέτοιοι είναι το σύστημα της PKR κινάσης και η οδός της 2-5 ολιγοαδενιλυκής συνθετάσης (OAS)/RNA άσης. Οι κύριες δράσεις των υποδοχέων προτύπων δομών είναι η οψωνοποίηση, η ενεργοποίηση του συμπληρώματος και του καταρράκτη της πήξης, η ενίσχυση της φαγοκυτταρικής ικανότητας, η επαγωγή των φλεγμονωδών φαινομένων και της απόπτωσης. Toll υποδοχείς Οι Toll υποδοχείς είναι μια οικογένεια μεμβρανικών πρωτεϊνών που λειτουργούν σαν PRRs και εκφράζονται σε μια ποικιλία κυττάρων όπως τα μακροφάγα, τα δενδριτικά, τα ουδετερόφιλα, τα επιθηλιακά και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η πρώτη πρωτεΐνη που ανακαλύφθηκε στην οικογένεια ήταν στην δροσόφυλλα, όπου βρέθηκε ότι παίζει ρόλο και στην διαδικασία της εμβρυογένεσης. Μέχρι σήμερα έχουν ανακαλυφθεί στα θηλαστικά 13 παρόμοιοι υποδοχείς TLR που έχουν πάρει και την αντίστοιχη αρίθμηση. Όλοι αυτοί οι υποδοχείς περιέχουν μια εξωκυττάρια περιοχή αναγνώρισης πλούσια σε λευκίνη (leukine rich repeats) και μια κυτταροπλασματική περιοχή (Toll/IL1 receptor) σηματοδότησης. Από τον TLR ξεκινά οδός σηματοδότησης που περιλαμβάνει μια σειρά διαδοχικών φωσφορυλιώσεων, χρησιμοποιώντας αρχικά την My88 πρωτεΐνη. Η δεύτερη πρωτεΐνη είναι η IRAK η οποία είναι μια κινάση σερίνης/θρεονίνης. Η φωσφορυλίωση της ενεργοποιεί τον TRAF6 (TNF Receptor Associated Factor 6) ο οποίος με την σειρά του ενεργοποιεί τον καταρράκτη της ΙκΒ οδού που καταλήγει στην είσοδο του ΝF κβ στον πυρήνα (Barnes P J 1997). Σε κάποια κύτταρα οι Toll υποδοχείς συνδέονται με αλλά μονοπάτια, όπως η MAP κινάση, τα οποία καταλήγουν στην ενεργοποίηση του AP1(Adaptor protein 1) μεταγραφικού παράγοντα. Στην εικόνα 1 φαίνεται συνοπτικά η TLR/IL-1 R οδός. 50

Οργανισμός Βακτήρια Μπορέλλια Χλαμύδια Ελικοβακτηρίδιο Λεγγιονέλλα Λιστέρρια Μυκοβακτηρίδιο λέπρας Μυκοβακτηρίδιο φυματίωσης Τρεπόνημα το ωχρά Υερσίνια Μύκητες Ασπέργιλλος Βλαστομύκητες Κάντιντα Κρυπτόκοκκος Παρακοκκιοειδές Χαρακτήρας της ανοσιακης απάντησης Th1 απάντηση σχετίζεται με προστασία και αρθρίτιδες Th απάντηση σχετίζεται με προστασία και αρθρίτιδες Th1 σχετίζεται με τον σχηματισμό έλκους Th1 καταλείπει ανοσία Th1 ειναι προστατευτική,η παραγωγή IFNγ από τα γδ CD8 είναι σημαντική Η σοβαρότητα εξαρτάται από Th1/Τh2 αναλογία Th1 ελέγχει την λοίμωξη Th1 εκριζώνει την λοίμωξη, Th2 χρόνια Th1 σχετίζεται με ανοσία Th2 επικρατεί, άγνωστο αν η Th1 προστατεύει Th1 είναι προστατευτική, Th2 σε εξελισσόμενη νόσο Th1 είναι προστατευτική Η ευπάθεια σχετίζεται μεth2,th1 είναι προστατευτική Η μόλυνση διεγείρει τηνth2 Th1ειναι προστατευτική Παράσιτα Λεϊσμάνια Φιλάρια Σχιστόσωμα Τρυπανόσωμα Γιάρδια λάμβλια Ιοί Ιλαρά Ηπατίτιδα Β Ιός επίκτητης ανοσοανεπάρκειας Αναπνευστικός συγκυτιακός ιός Th1 προστατευτική, Th2 επιτρέπει την χρόνια λοίμωξη Th1 προστατευτική, αρχικά Th2 Th1 και τα αντισώματα προστατεύουν, Th2 κατευθύνεται κατά των αυγών Th1 αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό του παρασίτου αν και προστασία δεν είναι αποκλειστικά Th1 εξαρτώμενη Th1 και Th2 προστατεύουν Th1ειναι προστατευτική Th1 παρουσιάζονται σε αυτοϊαθέντες ασθενείς Αλλαγή από Th1σε Th2 σχετίζεται με εμφάνιση ευκαιριακών λοιμώξεων Th1 προστατεύει, Th2 καταστροφική Πίνακας 9 : Χαρακτηριστικά ανοσιακής απόκρισης κατά παθογόνο. 51

Σαν PRRs, οι Toll υποδοχείς ενεργοποιούνται από PAMPs όπως οι LPS dsrna, μη μεθυλιωμένο DNA, λιποαραβινομανάνες, πρωτεΐνες θερμικού σοκ, πεπτιδογλυκάνες κ.α. Σε πολλές περιπτώσεις ένας μοναδικός TLR είναι υπεύθυνος για την κινητοποίηση φλεγμονωδών αντιδράσεων έναντι συγκεκριμένων μικροβιακών παραγόντων όπως για παράδειγμα ο TLR9 στην CpG αλληλουχία. Το φάσμα όμως των αντιδράσεων τους επεκτείνεται ανάλογα με την ικανότητα τους να ετεροδιμερίζονται. Διάφοροι μεσολαβητές της φλεγμονής και κυτταροκίνες ρυθμίζουν θετικά ή αρνητικά την έκφραση των TLR. Ο GSF-1 μειώνει την έκφραση του TLR9 στα μακροφάγα ενώ ο MIF, η IL18, η IFN-γ επάγουν την έκφραση του TLR4. Εικ1: Kύριες ενδοκυττάριες οδοί σηματοδότησης του συμπλέγματος ενεργοποίησης CD14 και σύμπλεγμα υποδοχέα του LPS Ο CD14 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος 55Kda που εκφράζεται κυρίως στην μεμβράνη των μακροφάγων και ανήκει στην ομάδα των PRR πλούσιων σε λευκίνη. Ο CD14 στερείται διαμεμβρανικού ή ενδοκυττάριου τμήματος ενώ το εξωκυττάριο τμήμα του αγκυροβολείται στην μεμβράνη μέσω ενός μορίου γλυκοσυλοφωσφατιδυλοινοσιτόλης. Ανιχνεύεται και διαλυτή μορφή του 52

CD14 στον ορό. Η κύρια λειτουργία του είναι η ενεργοποίηση του μακροφάγου μέσω της ανίχνευσης του LPS και η κάθαρση του από την κυκλοφορία. Η έκφραση του CD14 στα μακροφάγα επάγεται από τον TNF-a και την IFN-γ καθώς και από διάφορους PAMPs με κυριότερο τον LPS. Αντιθέτως η IL-4, η IL-10 και η δεξαμεθαζόνη ελαττώνουν την έκφραση του CD14. Αρχικά, ο LPS συνδέεται με μια πρωτεΐνη του πλάσματος, την LBP (LPS binding protein) η οποία και μεταφέρει τον LPS στην επιφάνεια των μακροφάγων. Ακολουθεί η σύνδεση του LPS με τον CD14 και μια σειρά διαδοχικών αντιδράσεων που οδηγούν στην ενεργοποίηση του μακροφάγου. Η σειρά αυτών των αντιδράσεων δεν έχει διευκρινισθεί πλήρως. Από ότι είναι ως τώρα γνωστό, ένα σύνολο επιφανειακών μορίων κινητοποιείται και μέσω της σύγκλισης των λιπιδιακών κανό σχηματίζεται ένα σύμπλεγμα ενεργοποίησης από το οποίο και σηματοδοτεί ενδοκυττάρια την παρουσία των παθογόνων. Ουσιαστικά δηλαδή, πρόκειται για μια ετερογενή συνάθροιση υποδοχέων που αποτελείται από την πρωτεΐνη MD2 (myeloid differentiation protein-2) τον υποδοχέα 4 της CXC (CXCR4), τις πρωτεΐνες του θερμικού σοκ (HSP-70/90) και τον παράγοντα διαφοροποίησης της ανάπτυξης 5 (GDF5). Κάθε συνυποδοχέας δύναται να επάγει διαφορετική ενδοκυττάρια οδό, η οποία συνήθως τελικά καταλήγει στην ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NFκΒ και ΜΑΡ κινασών. Οι παράγοντες αυτοί εισέρχονται στον πυρήνα και συνδέονται με τους προαγωγείς διαφόρων γονιδίων που αφορούν την παραγωγή κυτταροκινών, (TNFa, IL-1, IL-6, GM-CSF, M-CSF), χημειοκινών (IL-8, MCP-1) ελευθέρων ριζών (inos), μεταγραφικών παραγόντων (p50, c-rel, Erg-1) και συνδιεγερτικών μορίων (B7-1, B7-2) (βλέπε εικόνα 2). Σε κλινικό επίπεδο οι υποκυτταρικές αυτές διεργασίες εκδηλώνονται με τα τοπικά και συστηματικά σημεία της φλεγμονώδους αντίδρασης (O Neil A J 2006). 53

LPS LBP TLR4 MD-2 CD14 LBP LPS LPS TLR4 MD-2 LPS LPS CD11 CD18 LPS Hsp90 Hsp70 GDF5 CD55 GDF5 Hsp90 Hsp70 CD55 CXCR4 NF-κB, ERK1/2, JNK, p38 TNFα, IL-1, IL-6 IL-8, MCP-1 CD80, CD86 IL-2R 2Rα inos Εικ2:Οι μεταγραφικοί παράγοντες που επάγονται από το σύμπλεγμα ενεργοποίησης και οι πρωτεΐνες που παράγουν Επεξεργασία και παρουσίαση του αντιγόνου Η επεξεργασία του αντιγόνου από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (μακροφάγα, δενδριτικά, Β-λεμφοκύτταρα) και η παρουσίαση του στην επιφάνεια τους για να αναγνωριστεί από τα Τ λεμφοκύτταρα, ακολουθεί δυο διαφορετικές οδούς, την εξωγενή και την ενδογενή οδό. Με την εξωγενή οδό το μακροφάγο επεξεργάζεται αντιγόνα που παραλαμβάνει από το εξωτερικό του περιβάλλον με φαγοκυττάρωση ή ενδοκυττάρωση. Τέτοια αντιγόνα μπορεί να είναι προϊόντα βακτηρίων, παρασίτων ή μυκήτων. Το αντιγόνο αφού συνδεδεί με τους PRR υποδοχείς ενδοκυτταρώνεται και στην συνέχεια περνά από το πρωτογενές ενδοσωμάτιο στο λυσσοσωμάτιο και υφίσταται σταδιακή υδρόλυση σε διαδοχικά μειούμενο ph. Τελικά διασπάται σε ολιγοπεπτίδια (13-18 αμινοξέα). Για να παρουσιαστεί όμως στην επιφάνεια του μακροφάγου πρέπει να συνδεδεί με ένα μόριο MHC τάξης ΙΙ και ένα πεπτίδιο την καλνεξίνη (calnexin), που δρα ως τσαπερόνη προστατεύοντας την δομή του συμπλέγματος. Ο σχηματισμός του συμπλέγματος γίνεται στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο. Ακολούθως το σύμπλεγμα συνδέεται με την Ιi (Invariant chain) πρωτεϊνική 54

αλυσίδα για να προστατευθεί από την άσκοπη σύνδεση του με ακατάλληλες πρωτεΐνες. Από το ενδοπλασματικό δίκτυο μέσω της συσκευής Golgi, μεταφέρεται στα διαμερίσματα των όψιμων ενδολυσοσωματικών κυστιδίων όπου ενώνεται με την καλνεξίνη. Με μια σειρά ενζυμικών διασπάσεων στις οποίες παίζουν ρόλο οι καθεψίνες, απομακρύνεται η Ιi αλυσίδα ενώ προηγουμένως είχε αποκοπεί και η καλνεξίνη. Σε αυτήν την φάση το πεπτίδιο ενσωματώνεται μέσα στην σχισμή του MHC μορίου και έτσι παρουσιάζεται και στην επιφάνεια (Porcelli A 2006, Abbas AK 2003). Με την ενδογενή οδό τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα επεξεργάζονται αντιγονικά μόρια που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα τους όπως ιούς, ενδοκυττάρια βακτήρια, καρκινικά αντιγόνα κ.α. Τις περισσότερες φορές, η διάσπαση των αντιγονικών πρωτεϊνών αρχίζει στο κυτταρόπλασμα με την δράση μιας μικρού μοριακού βάρους πρωτεΐνης του θερμικού σοκ, της ουμπικουιτίνης. Τα πεπτίδια συνδεόμενα με την ουμπικουιτίνη, υφίστανται διάσπαση στο 26S προτεάσωμα, ένα πολυκαταλυτικό σωματίδιο κυλινδρικής μορφής που διαθέτει θέσεις ικανές για πρωτεόλυση. Στο προτεάσωμα τα αντιγονικά πεπτίδια, παρουσία τριών πρωτεϊνικών υπομονάδων που ενεργοποιούνται από την IFN-γ, την LMP2, την LMP7, την LMP10 διαμορφώνονται κατάλληλα έτσι ώστε να συνδεδούν με τα μόρια τάξης Ι. Τα τελικά πεπτίδια οδηγούνται στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο μέσω ενός πρωτεϊνικού συστήματος μεταφοράς που αποτελείται από τις TAP1 και TAP2 πρωτεΐνες (Transporters associated with antigen processing). Στο ενδοπλασματικό δίκτυο συντίθενται οι δυο αλυσίδες του MHC I παρουσία μιας χαπερόνης, της καλνεξινης, που διευκολύνει και προστατεύει την σύνθεση του MHC I. Το σύμπλεγμα MHC τάξης I και πεπτιδίου μεταφέρεται μέσω της συσκευής Golgi στην επιφάνεια του κυττάρου για να παρουσιαστεί στο CD8 + T λεμφοκύτταρο. Στις παραπάνω περιγραφές της εξωγενούς και ενδογενούς οδού επεξεργασίας υπάρχουν εξαιρέσεις που αφορούν τις ενδοκυττάριες διαδικασίες της πρωτεόλυσης, της σύνδεσης με τις τσαπερόνες και της μεταφοράς στην επιφάνεια του κυττάρου. Εξωγενή αντιγόνα είναι δυνατόν να παρουσιαστούν με την ενδογενή οδό, μέσω μορίων τάξης Ι. Η διαδικασία αυτή οφείλεται στην μετακίνηση του αντιγόνου, από το φαγόσωμα του ΑΠΚ στο κυτταρόπλασμα, με αποτέλεσμα να συμπεριφέρεται σαν ενδοκυττάριο και να εξακολουθεί η επεξεργασία του μέσω των πρωτεϊνών ΤΑΡ και του πρωτεασώματος. Η διαδικασία αυτή λέγεται διασταυρούμενη παρουσίαση (cross presentation), έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση CD8 λεμφοκυττάρων, και 55

χαρακτηρίζεται ως διασταυρούμενη ευαισθητοποίηση (cross priming) ( Schaible UE 1999, Porcelli A 2006, Norbury C C 2003, Abbas AK 2003). Eξόντωση-Βακτηριοκτόνος δράση Μετά την αναγνώριση του παθογόνου τα κύτταρα της φυσικής ανοσίας το προσλαμβάνουν και το καταστρέφουν μέσω της διαδικασίας της φαγοκυττάρωσης. Η φαγοκυττάρωση είναι μια διαδικασία διαμεσολαβούμενη από υποδοχείς και εξαρτάται από την ακτίνη με την οποία τα μακροφάγα και τα πολυμορφοπύρηνα εγκολπώνουν αδιάλυτα σωματίδια μεγαλύτερα από 0.5μΜ. Σύμφωνα με την υπόθεση του μηχανισμού zipper (αρχικά σχηματίζεται ψευδοπόδιο το οποίο περικυκλώνει το μικρόβιο και στην συνέχεια το εγκολπώνει) η αρχική αλληλεπίδραση είναι μεταξύ του Fcγ υποδοχέα και των καλυμμένων με IgG μικρόβιων η οποία προκαλεί περαιτέρω συγκέντρωση τέτοιων υποδοχέων στην επιφάνεια του μακροφάγου. Έτσι ολοένα και περισσότεροι υποδοχείς συνδέονται με τα ΙgG μόρια που βρίσκονται προσκολλημένα στα αντιγόνα των μικροβίων. Η γεφύρωση Fc υποδοχέων οδηγεί σε φωσφορυλίωση των τυροσινικών τμημάτων του υποδοχέα και στην ενεργοποίηση Syk κινασών. Τα γεγονότα αυτά οδηγούν σε πολυμερισμό των ινιδίων ακτίνης και σχηματισμό ψευδοποδίων. Τα αναπτυσσόμενα ψευδοπόδια σχηματίζουν μια κυπελλοειδή δομή που ενδοκυτταρώνει το μικρόβιο μέσα σε ένα κυστίδιο που ονομάζεται φαγόσωμα. Αφού αναγνωρίσουν και φαγοκυτταρώσουν τα μικρόβια, τα μακροφάγα μπορούν και καταστρέφουν τα περισσότερα βακτήρια χωρίς κάψα. Τα ενδοκυττάρια γεγονότα που οδηγούν στην φόνευση των μικροοργανισμών λαμβάνουν χώρα μέσα σε λίγα λεπτά ή σε ώρες από την ενδοκυττάρωση του μικροβίου. H διαδικασία της σύντηξης ενεργοποιείται από κάποιες από τις βιοχημικές οδούς της TLR σηματοδότησης (Watts C 2004, Wright D S 2001). Κεντρικής σημασίας στην διαδικασία στης εξόντωσης είναι η σύντηξη του φαγοσώματος με ένα λυσσόσωμα που περιέχει πρωτεολυτικά ένζυμα και ο σχηματισμός του φαγολυσσοσώματος. Μέσα στο φαγολυσόσωμα το μικρόβιο καταστρέφεται από οξυγονοεξαρτώμενους και μη οξυγονοεξαρτώμενους μηχανισμούς (Abbas AK 2003). Συνοπτικά οι μηχανισμοί αυτοί περιγράφονται στον πίνακα 10. 56

Αντιβακτηριακοί μηχανισμοί μακροφάγων Μηχανισμοί διαφυγής ενδοκυτταρίων βακτηρίων Παραγωγή ROIs- πρόσληψη μέσω υποδοχέων συμπληρώματος (CR) παραγωγή αντιοξειδωτικών μορίων (υπεροξείδιo δισμουτάσης, καταλάση, περοξειρεδοξίνη κά) παραγωγή βακτηριακών ρακοσυλλεκτών των ROΙs (φαινολικά γλυκολιπίδια, σουλφατίδες, λιποαραβινομαννάνες). Παραγωγή RNIs Άλλοι τρόποι ενδοφαγοσωμικής φόνευσης Οξινοποίηση φαγοσώματος Φαγολυσοσωμική σύντηξη Ντεφενσίνες Τροφική αποστέρηση (ελαττωμένη παροχή Fe, αποδόμηση τρυπτοφάνης) Αντιγονοπαρουσίαση στα CD4+ κύτταρα Συνδιέγερση Τ-λεμφοκυττάρων Παραγωγή κυτταροκινών/χημειοκινών αντιοξειδωτικά μόρια (αλκυλ-υπεροξειδική ρεδουκτάση, γλουταθειόνη, ομοκυστεϊνη κά) διαφυγή στο πρωτόπλασμα ανθιστάμενο κυτταρικό τοίχωμα παρεμπόδιση με παραγωγή αμμωνίας παρεμπόδιση (σουλφατίδες, γλυκολιπίδια) τροποποίηση του λιπιδίου Α του LPS αυτόνομη μικροβιακή θρέψη μείωση έκφρασης MHC II (λιποπρωτεΐνες) μείωση έκφρασης Β7 καταστολή σύνθεσης φλεγμονοπροαγωγικών επαγωγή σύνθεσης αντιφλεγμονωδών (πχ IL-10) Πίνακας 10: Αντιβακτηριδιακοί μηχανισμοί ενεργοποιημένων μακροφάγων και μηχανισμοί διαφυγής των μικροβίων (Σκένδρος 2006 με την έγκριση του συγγραφέα). Τα μακροφάγα παράγουν τοξικές ρίζες οξυγόνου, χλωραμίνες και ενδιάμεσα προϊόντα αζώτου τα οποία έχουν πολύ ισχυρή αντιμικροβιακή δράση. Η παραγωγή προϊόντων οξυγόνου ξεκινά από την NADPH οξειδάση, η οποία ενεργοποιείται από την IFN, τον TNF-α και τον GM-CSF. Η ενεργοποιημένη οξειδάση επάγει την αναπνευστική έκρηξη και την παραγωγή ανιόντος του υπεροξειδίου το οποίο γρήγορα καταλύεται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου. Τα μακροφάγα επίσης παράγουν υποχλωριώδες οξύ HOCL και χλωραμίνες από αντιδράσεις καταλυόμενες από την μυελουπεροξιδάση. Τα προϊόντα μεταβολισμού του αζώτου παράγονται από το ένζυμο της ΝΟ συνθετάσης. Το ένζυμο αυτό καταλύει την οξείδωση του αμινοξέος L αργινίνη σε L- κιτρουλίνη και ΝΟ. To NO είναι ένα αέριο με μικρή διάρκεια ζωής, το οποίο επειδή έχει ελεύθερο ηλεκτρόνιο, αντιδρά γρήγορα για να παράγει άλλα προϊόντα, τα οποία τελικά καταστρέφουν τα βακτήρια. Ο μηχανισμός αυτός παραγωγής RΝΙ (Reactive Nitrogen Ingredients) είναι ο πιο γνωστός αντι-μυκοβακτηριδιακός μηχανισμός. Πειραματόζωα με έλλειψη της NOS2 (της συνθετάσης 2 του ΝΟ) εμφανίζουν ευαισθησία στην μυκοβακτηριδιακή λοίμωξη (Flynn J, Chan 2003, Wright D S 2001, Roop MR 2004, Kotzin L B, Rich R R 2001). Τα βακτήρια έχουν αναπτύξει μηχανισμούς για να αποφεύγουν την καταστροφή τους από τα μακροφάγα. Κάποια εξωκυττάρια βακτήρια όπως ο 57

στρεπτόκοκκος της πνευμονίας δημιουργούν μια πολυσακχαριδική κάψα που τα προστατεύει από την φαγοκυττάρωση διάμεσου των PRRs. Τα βακτήρια αυτά μπορούν να φονευθούν όταν οψωνοποιούνται από IgG μόρια. Άλλοι μικροοργανισμοί λαθροβιούν ενδοκυττάρια προκειμένου να αποφύγουν τους εκτελεστικούς μηχανισμούς του ανοσιακού συστήματος. Τέτοια είναι το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης, η λιστέρια η μονοκυτταρογόνος, η λεγγιονέλλα. Αυτά έχουν αναπτύξει στρατηγικές που συμπεριλαμβάνουν την αναστολή της σύντηξης φαγοσώματος λυσσοσώματος, την λύση του φαγολυσσοσώματος, την παρεμπόδιση της αναπνευστικής έκρηξης (φαίνονται αναλυτικότερα στον πίνακα 10). Σαν αντιστάθμισμα, τα Τh1 κύτταρα ενεργοποιούν τα μολυσμένα μακροφάγα είτε μέσω διακυτταρικής επαφής είτε μέσω IFN-γ, με αποτέλεσμα μεγαλύτερη ικανότητα παραγωγής τοξικών προϊόντων και αντιμικροβιακών πεπτιδίων όπως οι ντεφενσίνες και οι κατιονικές πρωτεΐνες. Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα είναι ικανά να αντιπαρέλθουν τις αμυντικές στρατηγικές των μικροοργανισμών και να προστατέψουν τον οργανισμό από την λοίμωξη. H ίδιοι μηχανισμοί χρησιμοποιούνται και στην περίπτωση των αποπεπτοκώτων κύτταρων, με την διάφορα ότι ο υποδοχέας της κυτταρικής μεμβράνης είναι ένας υποδοχέας φωσφατιδυλοσερίνης και όχι ένας TLR. Η διαδικασία της φαγοκυττάρωσης είναι πολύ πιο αργή και φυσιολογικά δεν καταλήγει στην παραγωγή φλεγμονωδών φαινομένων (Watts C 2004). Ενεργοποίηση Τ λεμφοκυττάρου Ο ειδικός υποδοχέας αναγνώρισης του αντιγόνου εκ μέρους του Τ κυττάρου είναι ο TCR (T cell antigen receptor). Αποτελείται από δυο πολυπεπτιδικές αλυσίδες, συνήθως α και β και σπάνια γ και δ που φέρουν μια μεταβλητή V (variable) περιοχή και μια σταθερή C (constant) περιοχή με δομή όμοια με τα μόρια των ανοσοσφαιρινών. Οι αλυσίδες α, β ή γ, δ ενώνονται ομοιοπολικά με την πρωτεΐνη CD3 που αποτελείται από τις αλυσίδες γ, δ, ε, ανά ζεύγη (γε, δε) καθώς επίσης και από τις αλυσίδες ζζ ή ζη. Οι αλυσίδες του συμπλέγματος CD3 δεν παρουσιάζουν ποικιλομορφία, είναι όμως απαραίτητες για τον σχηματισμό του πλήρους μορίου του TCR και λειτουργούν ως εκκινητές της ενδοκυττάριας οδού που οδηγεί τελικά στην ενεργοποίηση του λεμφοκυττάρου από το αντιγόνο. Οι ενδοκυττάριες αυτές οδοί που ξεκινούν από το τριμοριακό σύμπλεγμα (TCR-Ag-MHCII) ουσιαστικά αποτελούνται 58

από διαδοχικούς καταρράκτες φωσφορυλιώσεων και αποφωσφορυλιώσεων που συμβαίνουν πάνω σε κυτταροπλασματικά σηματοδοτικά μόρια από την δράση τυροσινικών κινασών ή φωσφατασών αντίστοιχα. Η παραπάνω διαδικασία καταλήγει στην ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων όπως ο NFκB, NFAT, AP-1 οι οποίοι εισέρχονται στον πυρήνα και επάγουν την μεταγραφή πολλών γονιδίων αλλά και την σύνθεση του DNA γεγονός που οδηγεί στον πολλαπλασιασμό του κυττάρου. Πρόσφατα δεδομένα συνηγορούν ότι τα προαναφερθέντα μόρια βρίσκονται οργανωμένα στην κυτταρική μεμβράνη μέσα σε διακριτές, αυτόνομα μετακινούμενες περιοχές, πλούσιες σε γλυκολιπίδια που λέγονται λιπιδιακά κανό (lipid rafts) ή GEMs (Glycolipid Enriched Membrane Microdomains). H συνάθροιση των λιπιδιακών κανό οδηγεί στον σχηματισμό της ανοσολογικής σύναψης. Η προσέγγιση δηλαδή του TCR και των συνυποδοχέων του στην μεμβράνη του Τ λεμφοκυττάρου οδηγεί στην ενεργοποίηση των PTΚ (protein tyrosine kinases) που συνδέονται με την κυτταροπλασματική περιοχή του CD3 και της ζ αλυσίδας που καλούνται ΙΤΑΜ. Οι φωσφορυλιωμένες τυροσινικές περιοχές των ΙΤΑΜ στην ζ αλυσίδα αποτελούν τις περιοχές πρόσδεσης για την τυροσινική κινάση ΖΑΡ70 (καλείται έτσι γιατί έχει βάρος 70Κda και ανήκει στην οικογένεια των Src κινασών). Η ΖΑΡ70 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην διατήρηση του καταρράκτη σηματοδότησης, φωσφορυλιώνοντας μια σειρά από πρωτεϊνικά υποστρώματα σύνδεσης /προσαρμογής (linker/adaptor proteins) όπως to LAT (Linker for activation of T cells) GADS/SLP- 76 και Vav (Σκένδρος 2006). Επιπλέον η ΖΑΡ70 φωσφορυλιώνει την PLCy-1 που διασπά με την σειρά της την διφωσφορική φωσφατιδιλοινοσιτόλη σε διακυλογλυκερόλη και τριφωσφωρική ινοσιτόλη. Η τελευταία κινητοποιεί το ασβέστιο από το ενδοπλασματικό δίκτυο προκαλώντας αύξηση του κυτταροπλασματικού ελεύθερου ασβεστίου. Η αύξηση του ασβεστίου ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση C και την οδό ras, γεγονός το οποίο αυξάνει τη μεταγραφή των γονίδιων των κυτταροκινών. Το ασβέστιο με την καλμοδουλίνη ενεργοποιούν τη φωσφατάση καλσινευρίνη. Η καλσινευρίνη αποφοσφωρυλιώνει την κυτταροπλασματική υπομονάδα του NFAT που μετακινείται προς τον πυρήνα και παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του γόνου για την μεταγραφική ρύθμιση της IL-2. Η δράση της IL-2 είναι βραχεία και ασκείται σε πολλούς κυτταρικούς πληθυσμούς. Είναι σημαντικός αυξητικός παράγων τόσο για τα Τ λεμφοκύτταρα που τον παράγουν (αυτοκρινής λειτουργία) όσο και για τα παρακείμενα (παρακρινής λειτουργία). Είναι υπεύθυνη για την μετάβαση του κυττάρου από την G0 στην S 59

φάση του κυτταρικού κύκλου, επάγοντας έτσι την κλωνική έκπτυξη και διαφοροποίηση προς Τh1 απάντηση (Σκένδρος 2006, O Neil AJ 2006). Τα Τ- λεμφοκύτταρα που δεν παράγουν IL-2 και δεν πολλαπλασιάζονται όταν δεχθούν αντιγονικό ερεθισμό καλούνται ανεργικά. Γενικότερα, ως ανέργια χαρακτηρίζεται η έλλειψη κυτταρικής απόκρισης σε αντιγονικό ερεθισμό. Η ανέργια στα Τ- λεμφοκύτταρα αποδίδεται, είτε στη έλλειψη σημάτων που επάγονται από κυτταροκίνες, είτε στην έλλειψη σημάτων που επάγονται από την αλληλεπίδραση συνδιεγερτικών υποδοχέων στα Τ-κύτταρα με τους συνδέτες τους στα ΑΠΚ (Roitt 1998, Appleman και Boussiotis 2003). Στην εικόνα 3 φαίνεται περιληπτικά η ενδοκυττάρια οδός ενεργοποίησης του Τ λεμφοκυττάρου και τα φάρμακα που την επηρεάζουν. Εικόνα 3 : Οι ενδοκυττάριοι οδοί σηματοδότησης κατά την ενεργοποίηση του Τ- λεμφοκυττάρου. 60

Ο ρόλος της συνδιέγερσης Ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των Τ και Β λεμφοκύτταρων προαπαιτεί, πέρα από την παρουσίαση του αντιγόνου, την δράση σημάτων που παρέρχονται από μόρια των ΑΠΚ, που καλούνται συνδιεγέρτες. Το πρώτο σήμα παρέχεται από την σύνδεση του αντιγόνου με τους αντιγονικούς υποδοχείς, δηλαδή τον σχηματισμό του τριμοριακού συμπλέγματος από το αντιγόνο Ag τα μόρια του συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας MHC και του Τ κυτταρικού υποδοχέα (μαζί με το CD4 και CD8 συνυποδοχέα). Το δεύτερο σήμα παρέχεται από μόρια στην επιφάνεια των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (συνδιεγερτικά μόρια). Επί απουσίας των συνδιεγερτών τα Τ κύτταρα που έρχονται σε επαφή με αντιγόνα είτε αποτυγχάνουν να απαντήσουν και πεθαίνουν με απόπτωση είτε εισέρχονται σε μια κατάσταση μη απαντητικότητας που καλείται ανέργια (Appleman L J 2003, Kamradt T 2001). Πρώτοι οι Lafferty και Cunningham το 1975 εισήγαγαν το μοντέλο της συνδιέγερσης (costimulation model) και πρότειναν ότι το Τ λεμφοκύτταρο βρίσκεται σε κατάσταση ανοχής ή πεθαίνει όταν απλώς αναγνωρίσει το αντιγόνο (σήμα 1) εκτός αν διασωθεί από την συνδιέγερση (σήμα 2) που επάγει στο βοηθητικό κύτταρο, το μακροφάγο. Σε in vitro μελέτες αμιγείς πληθυσμοί Τ λεμφοκυττάρων απαντούν στην παρουσία του αντιγόνου όταν παρουσιάζεται από ΑΠΚ που φέρει συνδιεγερτικά μόρια αλλά όχι όταν τα ΑΠΚ χάσουν τα μόρια αυτά. Τα συνδιεγερτικά μόρια είναι ζωτικής σημασίας για την έναρξη, την διατήρηση και τον τερματισμό των ειδικών ανοσιακών απαντήσεων ή στην επαγωγή της ανοχής στα ίδια αντιγόνα του ξενιστή. Η καλύτερα χαρακτηρισμένη οδός συνδιέγερσης περιλαμβάνει το μόριο επιφανείας των Τ λεμφοκυττάρων CD28, το οποίο συνδέεται με τα συνδιεγερτικά μόρια B7-1, B7-2 τα οποία εκφράζονται στην πλασματική μεμβράνη των ΑΠΚ. Στον πίνακα 11 φαίνονται όλες οι γνωστές οικογένειες συνδιεγερτικών υποδοχέων και οι αντίστοιχοι συνδέτες τους. Τα CD28 μόρια προωθούν σήματα στο εσωτερικό του Τ κυττάρου που ενισχύουν την απάντηση του στο αντιγόνο, τα οποία αφορούν την επιβίωση, την ικανότητα παραγωγής IL-2 και διαφοροποίησης προς εκτελεστικά και κύτταρα μνήμης. Αποτελείται από ένα διαμεμβρανικό ομοδιμερές δυο πρωτεϊνικών αλυσίδων. Το εξωτερικό τμήμα αποτελούν δυο Ig-V αλυσίδες, ενώ το ενδοκυττάριο τμήμα αποτελείται από τυροσινικά μοτίβα και χρησιμοποιούνται σαν θέσεις πρόσδεσης των PI-3 και Grb-1 κινασών. Υπάρχει σταθερά έκφραση του CD28 στα παρθένα λεμφοκύτταρα η οποία αυξάνεται με την ενεργοποίηση του λεμφοκύτταρου. 61

Συγκεκριμένα υπολογίζεται ότι το 90% των Τ λεμφοκυττάρων και το 50% των CD8 κυττάρων φέρουν των υποδοχέα CD28 στην επιφάνεια τους (Σκένδρος 2006, Bour- Jordan H 2006, Sayegh M 1998). Τα Β7-1 και Β7-2 μόρια είναι δομικά παρόμοια μόρια που αποτελούνται από μονή γλυκοπρωτεϊνική άλυσο. Το εξωμεμβρανικό τμήμα ομοιάζει με την σταθερή C και την μεταβλητή V ενός ανοσοσφαιρινικού μορίου. Τα μόρια αυτά εκφράζονται από τα ΑΠΚ (δενδριτικά, μακροφάγα και Β λεμφοκύτταρα) καθώς επίσης και από Τ λεμφοκύτταρα σε συνθήκες διέγερσης. Το Β7-2 μόριο εκφράζεται συνέχεια σε χαμηλά επίπεδα και επάγεται αμέσως μετά την ενεργοποίηση ενώ το Β7-1 δεν εκφράζεται σταθερά και επάγεται ώρες ή μέρες μετά την δράση του αντιγόνου. Η έκφραση τους είναι πολύ χαμηλή ή απούσα σε συνθήκες ηρεμίας ενώ επάγεται μετά από την δράση ορισμένων παραγόντων. Το γεγονός αυτό εξασφαλίζει το ότι η ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων γίνεται στο σωστό χρόνο και σημείο. Η έκφραση, λοιπόν των Β7 μορίων αυξάνεται με την δράση μικροβιακών προϊόντων όπως οι λιποπολυσακχαρίδες, κυτταροκινών όπως η IL-12, η IL-2, η IFN-γ, μιτογόνων και των μορίων CD40-CD40L. Ο CD40 είναι ένας υποδοχέας των Τ λεμφοκυττάρων, ο οποίος μέσω του συνδέτη του CD40 στα ΑΠΚ επάγει την έκφραση περισσότερων Β7 μορίων από αυτά. Υποστηρίζεται ότι οι συνθήκες που μειώνουν τις απαιτήσεις των παρθένων λεμφοκυττάρων για B7/CD28 συνδιέγερση, είναι οι υψηλές δόσεις του αντιγόνου, η υψηλή συγγένεια του αντιγόνου με τον TCR, η μεγάλη ισχύς και η παρατεταμένη διάρκεια σήματος μέσω του TCR. Τα ήδη ενεργοποιημένα και τα κύτταρα μνήμης εξαρτώνται λιγότερο από τη συνδιέγερση μέσω του B7/CD28 μονοπατιού από ότι τα παρθένα κύτταρα. Αυτή η ιδιότητα των μνημονικών κυττάρων τα επιτρέπει να διεγείρονται από ΑΠΚ που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα Β7 και σε μη λεμφικούς ιστούς (Allison P 1995, Anton van der Merwe P 2002). 62

Έκφραση Σήμα Υποδοχέας Συνδέτης Υπεροικογένεια Σταθερή Θετικό CD28 CD28 CD27 HVEM B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) CD70 LIGHT CD28/B7 CD28/B7 TNF/TNFR TNF/TNFR Επαγομένη Θετικό ICOS CD30 OX40 (CD134) 4-1BB (CD137) SLAM (CD150) Eπαγομένη Aρνητικό CTLA-4 (CD152) CTLA-4 (CD152) PD-1 PD-1 Άγνωστος Άγνωστος ICOSL CD30L (CD153) OX40L 4-1BBL SLAM (CD150) B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) PD-L1 PDL-2 B7-H3 B7-H4 CD28/B7 TNF/TNFR TNF/TNFR TNF/TNFR Ig CD28/B7 CD28/B7 CD28/B7 CD28/B7 CD28/B7 CD28/B7 Πίνακας 11: Οι συνδιεγερτικοί υποδοχείς των Τ-λεμφοκυττάρων και οι αντίστοιχοι συνδέτες τους στα αντιγοπαρουσιαστικά κύτταρα. Ταξινόμηση σύμφωνα με την έκφραση τους και τα ενδοκυττάρια σήματα που επάγουν (Σκένδρος 2006). Ο βιοχημικός μηχανισμός με τον οποίο η αλληλεπίδραση B7/CD28 οδηγεί στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων δεν είναι πλήρως γνωστός. Τα σηματοδοτικά ερεθίσματα από τα μόρια αυξάνουν την παραγωγή κυτταροκινών ειδικά του αυτοκρινούς αυξητικού παράγοντα ΙL-2. Αυτό συμβαίνει λόγω της αυξημένης μεταγραφής του γονιδίου αλλά και της σταθεροποίησης του ΙL-2 mrna. Επιπροσθέτως, τα CD28 σηματοδοτικά μόρια προάγουν την επιβίωση των Τ λεμφοκυττάρων αυξάνοντας την έκφραση της αντί-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-x. 63

Η B7/CD28 οδός είναι το πρότυπο συνδιεγερτικών μορίων μιας μεγαλύτερης οικογένειας υποδοχέων και συνδετών που διεγείρουν ή αναστέλλουν την κυτταρική απάντηση. Η πρωτεΐνη ICOS (Inducible Costimulator) είναι ομόλογη με τον CD28 και ονομάζεται έτσι γιατί επάγεται κατά την ενεργοποίηση. Κατά αναλογία οι συνδέτες του είναι ανάλογοι με τα Β7-1 Β7-2 μόρια. Φαίνεται, ότι η πρωτεΐνη ICOS παίζει ρόλο στην παραγωγή συγκεκριμένων κυτταροκινών όπως η IL10 και κατευθύνει την κυτταρική απάντηση προς την Th2 οδό (Σκένδρος 2006, Reiser H 1996). Ο CTLA 4 είναι ένας ακόμη υποδοχέας, ομόλογος του CD28. Συνδέεται με τα Β7-1 και B7-2 συνδιεγερτικά μόρια με τον ίδιο τρόπο, αλλά 10-100 φορές ισχυρότερα. Πρόκειται για μια διμερική διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη βάρους 41-43 Κda,η οποία ανήκει στην οικογένεια των ανοσοσφαιρινών. Η έκφραση του CTLA 4 είναι επαγομένη και έπεται της ενεργοποίησης του Τ λεμφοκυττάρου. Η δράση του σηματοδοτείται μέσω των κυτταροπλασματικών τυροσινικών περιοχών ITΙMs τα οποία μεταφέρουν ανασταλτικά μηνύματα όσον αφορά την παραγωγή IL2 και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον άλλοι μηχανισμοί δράσης του CTLA 4 είναι ο ανταγωνισμός με το CD28 για την σύνδεση του Β7 μορίου, η απελευθέρωση του ανοσοτροποποιητικού ενζύμου ινδολεαμίνη 2-3-δεοξυγενάση και λιγότερο διευκρινισμένες δράσεις είναι αυτές που ασκούνται στα λιπιδιακά κανό και στην κινητικότητα των Τ λεμφοκυττάρων (Subudhi S K 2005). Φαίνεται δηλαδή ότι η σύνδεση του CTLA 4 είναι αυτή που τερματίζει την ανοσιακή απάντηση και συμβάλλει στην ομοιοστασία του ανοσιακού συστήματος. Αυτό επιβεβαιώνεται και από πειράματα σε ζώα στα οποία αφαιρέθηκε με γενετική μηχανική το γονίδιο που παράγει τον CTLA 4 υποδοχέα, τα οποία και αναπτύσσουν καταστροφικές αυτοάνοσες αντιδράσεις σε πολλά όργανα, ενώ παράλληλα επιδημιολογικές μελέτες συνδέουν πολυμορφισμούς του γονιδίου CTLA 4 με αυτοάνοσες παθήσεις όπως ο σακχαρώδεις διαβήτης τύπου Ι. Τα ενεργοποιημένα από το αντιγόνο και την B7/CD28 συνδιέγερση Τ λεμφοκύτταρα εκφράζουν στην επιφάνεια τους ένα μόριο το οποίο καλείται CD40 συνδέτης. Η σύνδεση του μορίου αυτού με το ομόλογο στα Β λεμφοκύτταρα και στα υπόλοιπα ΑΠΚ CD40 προκαλεί α) αύξηση της έκφρασης Β7-1, Β7-2 και άλλων συνδιεγερτικών μορίων β) αύξηση στης έκφρασης IL-12. Έτσι παρέχεται μια αγκύλη θετικής ανάδρασης για τον CD28 και τους υπόλοιπους συνδιεγερτικούς υποδοχείς,η οποία ρυθμίζει σε σταθερή βάση την λειτουργία των Τ λεμφοκυττάρων. 64

Ο CD40 είναι γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος 48Kda, μέλος μιας οικογένειας μεμβρανικών υποδοχέων, που χαρακτηρίζονται από την δομική και λειτουργική ομοιότητα με τον TNF (Tumor Necrosis Factor) υποδοχέα. Ο CD40L (CD154) είναι μια μεμβρανική πρωτεΐνη του Τ κυττάρου που είναι δομικά ομόλογη με τον ΤNF και τον Fas συνδέτη. Ο CD40 εκφράζεται συνεχώς στα ΑΠΚ (δενδριτικά, μακροφάγα, Β λεμφοκύτταρα αλλά όχι στα πλασματοκύτταρα) ενώ ο CD40L εκφράζεται στην επιφάνεια των Τ κύτταρων μετά την ενεργοποίηση τους. Όταν ο CD40 έρχεται σε επαφή με τον CD40L ενεργοποιούνται κυτταροπλασματικοί παράγοντες, oι οποίοι καλούνται TRAF (παράγοντες συνδεόμενοι με τον υποδοχέα του ΤΝF). Οι TRAFs ενεργοποιούν βιοχημικούς καταρράκτες οι οποίοι οδηγούν στην μετατόπιση των μεταγραφικών παραγόντων NFκB και AP1 στον πυρήνα. Επιπλέον η σύνδεση CD40-CD40L προκαλεί αύξηση της έκφρασης των Β7 μορίων στα μακροφάγα η οποία προκαλεί περαιτέρω ενεργοποίηση των Τ κύτταρων. Βέβαια αξίζει να τονιστεί ότι η έκφραση Β7 στα ΑΠΚ και CD40L στα βοηθητικά Τ κύτταρα συμβαίνει κατόπιν της επαφής και διεγέρσεως των κύτταρων από το αντιγόνο και είναι αμφίδρομη γεγονός που συμβάλλει στην ειδικότητα της ανοσιακής απάντησης. Πειράματα σε επίμυες στους οποίους έχει αφαιρεθεί το γονίδιο του CD40 υποδοχέα, εμφανίζουν φυσιολογικό ανοσοφαινότυπο, φυσιολογική απάντηση των Β κυττάρων στην IL-4 και σε θυμοανεξάρτητα αντιγόνα, παρουσιάζουν όμως αδυναμία σχηματισμού λεμφοζιδίων στον σπλήνα και κατά επέκταση αδυναμία παραγωγής ειδικών αντισωμάτων. Οι CD40 knockout επίμυες αδυνατούν να παράγουν IgG, IgE (antibody switching). Στον άνθρωπο έχουν βρεθεί δυο ισομορφές του CD40 από εναλλακτική συρραφή του mrna. Πέρα από το ρόλο της CD40-CD40L αλληλεπίδρασης στην λοίμωξη πρόσφατες μελέτες καταδεικνύουν την συμμετοχή των μορίων και σε άλλα φαινόμενα όπως στο σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας και στην πήξη (Heeschen C 2003). Η παρεμπόδιση της CD40-CD40L αλληλεπίδρασης με αντί-cd40l αντίσωμα μείωσε το μέγεθος της αθηρωματικής πλάκας σε LDL Receptor knockout ποντίκια ενώ ο διαλυτός CD40L θεωρείται ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για στεφανιαία νόσο (Mach F 1998, Freedman J A 2003, Arlene H, Sharpe Η 2006). 65

I. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Α. Ομάδες μελέτης Μελετήθηκαν συνολικά 16 άτομα. Οι 8 ήταν ενήλικες ασθενείς με βρουκέλλωση (οξεία ή χρόνια) και οι 8 ήταν υγιείς ενήλικες που χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Το φύλο και οι ηλικίες των ασθενών και των μαρτύρων φαίνονται στον πίνακα 12. ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΑΡΙΘΜΟ 8 8 ΓΥΝΑΙΚΕΣ 3 2 ΑΝΔΡΕΣ 5 6 ΗΛΙΚΙΑ(μτ ± SD) 32± 3,3 43± 12,8 Πίνακας 12:Φύλο, ηλικίες των ατόμων που συμμετείχαν στη μελέτη (SD=σταθερή απόκλιση, μτ=μέση τιμή). ΟΝΟΜΑ ΦΥΛΟ /ΗΛΙΚΙΑ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑ/ΤΡΟΠΟΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ ΙΣΤΟΡΙΚΟ 1.Σ.A. Α/42 ΚΤΗΝΟΤΡΟΦΟΣ Οξεία βρουκέλλωση 2.N.A. Α/32 ΠΟΔΟΣΦΑΙΡΙΣΤΗΣ 3.Π.Α. Θ/33 ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ Χρόνια εμμένουσα βρουκέλλωση (Αρθρίτιδα ΔΕ γόνατος, εφιδρώσεις, οσφυαλγία. Επιμονή συμπτωμάτων) Χρόνια ενεργός βρουκέλλωση. Ενεργός ιερολαγονίτιδα. Χρόνια εμμένουσα βρουκέλλωση 4.Τ.Α. Θ/36 ΥΠ.ΚΤΗΝΙΑΤΡΕΙΟΥ (Άτυπες μυαλγίες, κόπωση) Υποτροπή (οξεία βρουκέλλωση) 5.Δ.Ε. Α/44 ΚΤΗΝΟΤΡΟΦΟΣ Εμπύρετο, αρθραλγίες 6.Χ.Γ. Α/25 ΑΜΕΛΚΤΗΣ Οξεία βρουκέλλωση Χρόνια ενεργός βρουκέλλωση 7.Β.Α. Θ/47 ΕΠΑΦΗ ΜΕ ΥΠΟΠΤΗ ΚΟΠΡΙΑ Ενεργός σπονδυλίτιδα 8.Ν.Ι. Α/29 ΣΦΑΓΕΑΣ Καρδίτιδα, οσφυαλγία Πίνακας 13: Ηλικία, φύλο, πιθανός τρόπος μόλυνσης και κλινική εικόνα των ασθενών με βρουκέλλωση. Οι ασθενείς που πήραν μέρος στην μελέτη είναι ασθενείς του εξωτερικού Ιατρείου βρουκέλλωσης του Νοσ. Ειδικών Παθήσεων (Λοιμωδών). 66

Την ομάδα των μαρτύρων αποτέλεσαν 8 φυσιολογικά άτομα, ανεξαρτήτου φύλου και ηλικίας, χωρίς προηγούμενο ιστορικό βρουκέλλωσης ή διαμονής σε ενδημική περιοχή. Β. Ερευνητικό πρωτόκολλο Το ερευνητικό πρωτόκολλο εκπονήθηκε εξ ολοκλήρου στο εργαστήριο Κλινικής Ανοσολογίας της Β Παθολογικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Σε όλες τις ομάδες μελέτης πραγματοποιήθηκε μέτρηση: Α) του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων στο περιφερικό αίμα και ο απόλυτος αριθμός των μονοπύρηνων-μακροφάγων (γενική αίματος). Β) η εκατοστιαία έκφραση του CD40 στα μονοπύρηνα του αίματος (CD14 + ) και η μέση ένταση φθορισμού σε σύγκριση με τον μη ειδικό ανοσοφθορισμό (CD14/IgG). Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε ολικό περιφερικό αίμα. Για όλες τις μετρήσεις των υποπληθυσμών και της έκφρασης υποδοχέων ή συνδιεγερτικών μορίων χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία της κυτταρομετρία ροής (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS). Η κυτταρομετρία ροής είναι μια σύγχρονη τεχνoλογία, που επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση ποικίλων φυσικοχημικών χαρακτηριστικών ενός κυττάρου ή άλλου σωματιδίου (π.χ. κυτταρικού οργανιδίου, διαλυτής πρωτεΐνης, βακτηρίου κ.ά.). Τα κύτταρα εξετάζονται υπό τη μορφή εναιωρήματος, αφού προηγουμένως έχουν σημανθεί με μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία είναι συζευγμένα με φθορίζουσα χρωστική (φθοριόχρωμα). Τα μονοκλωνικά αντισώματα συνδέονται με τα αντίστοιχα αντιγόνα στην επιφάνεια των κυττάρων. Στη συνέχεια, ενώ τα κύτταρα ρέουν σε μονήρη στήλη, διεγείρονται από ακτίνα LASER, με αποτέλεσμα να εκπέμπουν διαφόρων εντάσεων φθορίζουσα ακτινοβολία (σκέδαση), η οποία προσλαμβάνεται από ειδικά φίλτρα, ενισχύεται από φωτοπολλαπλασιαστές και αναλύεται από τον 67

ηλεκτρονικό υπολογιστή του κυτταρομετρητή ροής (Carter και Meyer 1996, Μαλισιόβας 1999). Οι κυτταρομετρητές ροής έχουν τη δυνατότητα να αναλύουν συγχρόνως δύο παραμέτρους σκέδασης: την οριζόντια (Forward Scatter, FS) και την πλάγια (90 Ο, Side Scatter, SS) καθώς επίσης και δύο ή περισσότερα είδη φθορίζουσας ακτινοβολίας. Οι παράμετροι FS και SS δίνουν αντίστοιχα πληροφορίες σχετικά με το μέγεθος και την εσωτερική δομή των κυττάρων (κοκκίωση), ώστε να επιτυγχάνεται η διάκριση των κυττάρων σε πληθυσμούς (λεμφοκύτταρα, μονοπύρηνα μακροφάγα, πολυμορφοπύρηνα). Η ανάλυση των παραμέτρων FS και SS, από το λογισμικό (software) του ηλεκτρονικού υπολογιστή του κυτταρομετρητή ροής, αποδίδεται οπτικά με τα σημειακά γραφήματα κυτταροδιαγράμματος (dot plots) (Carter και Meyer 1996, Μαλισιόβας 1999, Σκένδρος 2005). Η φθορίζουσα ακτινοβολία επιτρέπει την αναγνώριση των κυττάρων βάσει της έκφρασης συγκεκριμένων αντιγόνων (CD μόρια) στην επιφάνειά τους. Τα βασικά είδη εκπεμπόμενου φθορισμού είναι δύο: ο πράσινος φθορισμός, ο οποίος παράγεται από τη θετική αντίδραση των σημασμένων με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (Fluorescein isothiocyanate, FITC) μονοκλωνικών αντισωμάτων με τα κύτταρα του δείγματος και ο κόκκινος φθορισμός, που παράγεται από τη θετική αντίδραση των σημασμένων με φυκοερυθρίνη (Phycoerythrin, PE) μονοκλωνικών αντισωμάτων με τα κύτταρα του δείγματος. Η ένταση της φθορίζουσας ακτινοβολίας εξαρτάται από τη συγκέντρωση του υπό εξέταση αντιγόνου στην επιφάνεια του κυττάρου. Οι εκπεμπόμενοι φθορισμοί, προσλαμβανόμενοι από τον οπτικό μετρητή του κυτταρομετρητή, παράγουν αντιστοίχως δύο σήματα: το FL1 (Forward Light 1, πράσινος φθορισμός, FITC) και το FL2 (Forward Light 2, κόκκινος φθορισμός, PE), τα οποία αναλύονται στο λογισμικό του ηλεκτρονικού υπολογιστή του κυτταρομετρητή και αποδίδονται οπτικά ως ιστογράμματα φθορισμού ή σημειακά γραφήματα (Carter και Meyer1996, Μαλισιόβας 1999, Σκένδρος 2005). Στα αποτελέσματα του κυτταρομετρητή παρουσιάζονται: το εκάστοτε ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν στην επιφάνεια τους το υπό μελέτη μόριο στο σύνολο του προεπιλεγμένου πληθυσμού. η μέση ένταση φθορισμού (MFI: mean fluorescence intensity) των σημασμένων μορίων στο σύνολο των κυττάρων που μελετώνται. Η παράμετρος αυτή προσφέρει και μια ποσοτική εκτίμηση της έκφρασης του υπό μελέτη μορίου στα κύτταρα. 68

από τις παραπάνω τιμές υπολογίζεται και ο δείκτης PI που ορίζεται ως ο λόγος της μέσης έντασης φθορισμού των επιλεγμένων κυττάρων (CD14 +, CD40 +, CD14 + CD40 + ) προς την ένταση του μη ειδικού φθορισμού (στη συγκεκριμένη μελέτη IgG). Οι δύο κύριες κλινικές εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής είναι ο προσδιορισμός του ανοσοφαινότυπου και η μελέτη DNA. Ο ανοσοφαινότυπος αποτελεί την ευρύτερα χρησιμοποιούμενη εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής και περιλαμβάνει τον προσδιορισμό αντιγόνων επιφανείας, βάσει των οποίων προσδιορίζεται το είδος και το στάδιο διαφοροποιήσεως του κυττάρου (Carter και Meyer 1996, Μαλισιόβας 1999, Σκένδρος 2005). Γ. Μέθοδοι Προετοιμασία δείγματος ολικού αίματος Αρχικά γινόταν λήψη 2 ml φλεβικού αίματος σε αποστειρωμένο φιαλίδιο που περιείχε το αντιπηκτικό EDTA (ethylene-diamine-tetraacetic-acid). Στην συνέχεια αναμειγνύονταν 100 μl περιφερικού αίματος με 10 μl μονοκλωνικού αντισώματος CD14 σημασμένου με FITC και με 20 μl IgG σημασμένου με PE μονοκλωνικού αντισώματος, σε πλαστικό σωληνάριο RIA των 5 ml για την μέτρηση του μη ειδικού ανοσοφθορισμού. Παράλληλα 100 μl περιφερικου αίματος αναμειγνύονταν με 20 μl CD14 και 20 μl CD40 σε δεύτερο δοκιμαστικό σωληνάριο. Ακολουθούσε επώαση των δειγμάτων σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 ο C), σε σκοτεινό περιβάλλον για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, ακολουθούσε επεξεργασία του δείγματος με το λυτικό σύστημα αντιδραστηρίων Immunoprep (Beckman Coulter). Τo Immunoprep αποτελείται από τρία ξεχωριστά διαλύματα: Α, Β και C (πίνακας 14). Το Α προκαλεί λύση των ερυθρών του δείγματος, το Β ρυθμίζει του ph του δείγματος (buffer) και τερματίζει τη λυτική διαδικασία, ενώ το C μονιμοποιεί τα μονοκλωνικά αντισώματα στην κυτταρική μεμβράνη του λευκοκυττάρου (fixation). Η προσθήκη των διαλυμάτων του Immunoprep, σε κάθε σωληνάριο δείγματος, γινόταν με αυτοματοποιημένη συσκευή (Q-PREP, Beckman Coulter). Συγκεκριμένα, σταθερή ποσότητα από κάθε διάλυμα προστίθετο κατά διαδοχικό τρόπο στο δείγμα (600 μl A 265 μl B 100 μl C), με 69

ενδιάμεσες αναδεύσεις, σε κύκλο συνολικής διάρκειας 35 δευτερολέπτων. Με αυτό τον τρόπο εξασφαλίζονταν, τόσο η μικρότερη δυνατή καταστροφή, απώλεια και επιμόλυνση των κυττάρων του δείγματος, όσο και η επαναληψιμότητα στην προετοιμασία, αφού παρακάμπτονταν οι επαναλαμβανόμενες φυγοκεντρήσεις και ανασυστάσεις που απαιτούν οι κλασσικές μέθοδοι επεξεργασίας με τα λυτικά και μονιμοποιητικά διαλύματα (π.χ. χλωριούχο αμμώνιο, παραφορμαλδεϋδη 1%). Μετά την επεξεργασία με Immunoprep, το δείγμα αναλυόταν στον κυτταρομετρητή ροής είτε άμεσα, είτε εντός 24 ωρών, αφού είχε αποθηκευτεί σε σκοτεινό περιβάλλον στους 6-8 ο C. Διάλυμα Α (600 μl) Διάλυμα B (265 μl) Διάλυμα C (100 μl) Μυρμηκικό οξύ 1,2 μl/ml Ανθρακικό νάτριο 6 mg/ml Παραφορμαλδεΰδη 10 mg/ml Χλωριούχο νάτριο 14,5 mg/ml Θεϊκό νάτριο 31,3 mg/ml Πίνακας 14: Η σύσταση των διαλυμάτων του συστήματος αντιδραστηρίων Immunoprep και οι ποσότητες από κάθε διάλυμα (παρενθέσεις) που χρησιμοποιούνται στο δείγμα. Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής Η περίφραξη των μονοκυττάρων (gating) έγινε χρησιμοποιώντας τη συσχέτιση FS (μέγεθος κυττάρου) και SS (κυτταροπλασματική κοκκίωση) (εικόνα 4α). Στη συνέχεια, για τον έλεγχο της καθαρότητας της περίφραξης των μονοκυττάρων, χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι των μονοπύρηνων μακροφάγων (CD14-FITC). Η καθαρότητα του μονοπυρηνικού παραθύρου ήταν >90% και ο αριθμός των κυττάρων τουλάχιστον 2000. Τα μονοπύρηνα μακροφάγα ήταν εντόνως θετικά έναντι του CD14, ενώ εμφάνιζαν τιμές FS και SS μεγαλύτερες από τα λεμφοκύτταρα και μικρότερες από τα πολυμορφοπύρηνα. (Loken και Wells 1996). Η ανάλυση των δειγμάτων του ολικού αίματος και των διεγερμένων μονοπυρήνων πραγματοποιήθηκε με πρωτόκολλο κυτταρομετρίας ροής διπλού φθορισμού. Για τη βαθμονόμηση (calibration) του κυτταρομετρητή χρησιμοποιούνταν πρότυπο (standard) σφαιριδίων φθορισμού (Flow-Check Fluorospheres, Beckman Coulter), ενώ για την εξάλειψη της 70

αλληλοεπικάλυψης των φθοριοχρωμάτων γινόταν αντιστάθμιση FITC με PE (FL2- %FL1) και PE με FITC (FL1-%FL2) με ειδικά σφαιρίδια φθορισμού (Cyto-Comp 1, BeckmanCoulter). Στις μετρήσεις χρησιμοποιούνταν ισοτυπικό δείγμα ελέγχου (control), προκειμένου να εκτιμηθεί η μη ειδική σύνδεση των μονοκλωνικών αντισωμάτων και να τεθεί το «κατώφλι» μεταξύ θετικά και αρνητικά σημασμένων πληθυσμών. To ισοτυπικό δείγμα ελέγχου ορίσθηκε στο 1,5-2% (θετικός ουδός, cutoff). Τα ζεύγη των μονοκλωνικών αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για τις μετρήσεις στoν πληθυσμό των μονοκυττάρων ήταν τα εξής: Σωληνάριο 1: CD14-FITC/IgG1-PE (ισοτυπικό δείγμα ελέγχου, control) Σωληνάριο 2: CD14-FITC/CD40-PE Τα σημειακά γραφήματα κυτταροδιαγράμματος (dot plots), τα ιστογράμματα φθορισμού καθώς και τα περιγράμματα διάκρισης των θετικών και αρνητικών υποπληθυσμών (two colour contour plots) επεξεργάσθηκαν με το λογισμικό System II (Beckman Coulter) (εικόνες 3, 4, 5, 6). 71

Εικόνα 3 : το σύνολο των σημειακών γραφημάτων ασθενούς με βρουκέλλωση 72

(α) (β) μονοκύτταρα ΠΜΠ μονοκύτταρα Λεμφοκύτταρα Εικόνα 4 :σημειακά γραφήματα (dot plots)περιφερικού αίματος σε ασθενή με βρουκέλλωση. (α) περίφραξη του μονοκυτταρικού πληθυσμού με FS/SS συσχέτιση (β) περίφραξη του πληθυσμού των μονοπύρηνων μακροφάγων με συσχέτιση SS/CD14-PE Εικόνα 5 : μέτρηση των CD40 + μονοκυττάρων σε ασθενή με βρουκέλλωση. 73