ΙΟΓΕΝΕΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΩΝ ΚΟΚΚΙΩΔΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ XHMEIΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ METAΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕ ΕΜΦΑΣΗ ΣΤΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία ΙΟΓΕΝΕΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΩΝ ΚΟΚΚΙΩΔΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Ευτέρπη Κωσταρέλη Επιβλέπουσα: Επικ. καθηγήτρια Α.Πανταζάκη Θεσσαλονίκη, 2008 0

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Επίκουρη Καθηγήτρια Αναστασία Πανταζάκη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Θεοδώρα Χολή Παπαδοπούλου Επίκουρη Καθηγήτρια Ελένη Νικολακάκη Στο εξώφυλλο: Λευχαιμικά κύτταρα προσβεβλημένα από τον EBV 1

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε κατά το ακαδημαϊκό έτος 2007 2008 στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος του τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με έμφαση στη Βιοχημεία. Ολοκληρώνοντας την πειραματική διαδικασία και τη συγγραφή θα ήθελα πρωτίστως να ευχαριστήσω θερμά την επίκουρη καθηγήτρια κα Αναστασία Πανταζάκη για την επίβλεψη, τις πολύτιμες συμβουλές και διορθώσεις. Την ευχαριστώ ιδιαιτέρως για την άριστη συνεργασία, το ενδιαφέρον και την εμπιστοσύνη της. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω τα μέλη της εξεταστικής επιτροπής της διπλωματικής εργασίας κυρίες Ελένη Νικολακάκη, επίκουρη καθηγήτρια, και Θεοδώρα Χολή Παπαδοπούλου αναπληρώτρια καθηγήτρια, για το ενδιαφέρον και τη στήριξή τους. Θερμές ευχαριστίες οφείλω και στα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου Βιοχημείας και διδάσκοντες στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα για την ευκαιρία που μου έδωσαν να ξεφύγω από τα οριοθετημένα πλαίσια γνώσεων ενός βιολόγου. Επιθυμώ να ευχαριστήσω θερμά τους διευθυντές της Αιματολογικής Κλινικής και της Μονάδος Μεταμόσχευσης Αιμοποιητικών κυττάρων κ. Αθανάσιο Φάσσα και κ. Αχιλλέα Αναγνωστόπουλο οι οποίοι μου επέτρεψαν να εκπονήσω την διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας της Κλινικής. Τέλος, ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Δρ. Κώστα Σταματόπουλο, υπεύθυνο του εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας για την πολύτιμη καθοδήγηση, τις υποδείξεις και διορθώσεις του σε όλες τις φάσεις διεκπεραίωσης της παρούσας εργασίας. Θεσσαλονίκη, 10 Ιουνίου 2008 2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... 3 ΛΙΣΤΑ ΕΙΚΟΝΩΝ... 6 ΛΙΣΤΑ ΠΙΝΑΚΩΝ... 8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 9 ΑBSTRACT... 10 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 11 1.1 Εισαγωγή στο ανοσοποιητικό σύστημα... 11 1.1.1 Δομή και λειτουργία ανοσοποιητικού συστήματος... 11 1.1.2. Έμφυτη ανοσία... 14 1.1.3 Προσαρμοστική ανοσία... 16 1.1.4 Αντιγόνα... 21 1.2 Η κυτταρική ανοσία... 27 1.2.1 T λεμφοκύτταρα... 27 H διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων... 28 Οι κατηγορίες των Τ λεμφοκυττάρων... 32 Ο Τ κυτταρικός υποδοχέας (ΤCR)... 35 1.2.2. Άλλα κύτταρα που συμμετέχουν στην κυτταρική ανοσία... 39 Μονοκύτταρα / Μακροφάγα - Κύτταρα «Αντιγόνο Παρουσιαστές» (APC)... 39 Κύτταρα φυσικοί φονείς (ΝΚ κύτταρα)... 41 Μεγάλα κοκκιώδη λεμφοκύτταρα... 42 1.2.3 Κυτταροκίνες... 42 1.3 Αιματολογικές κακοήθειες λευχαιμίες... 44 1.3.1 Επιδημιολογικά στοιχεία... 45 1.3.2 Παράγοντες κινδύνου... 45 1.3.3 Διάγνωση... 46 1.3.4 Συμπτώματα... 46 1.3.5 Θεραπεία... 46 1.4 Τ LGL Λευχαιμία... 48 1.4.1 Γενικά... 48 1.4.2 Στοιχεία για τη φυσιολογική διαφοροποίηση των Τ κυτταροτοξικών κυττάρων... 49 1.4.3 Τα μεγάλα κοκκιώδη κύτταρα... 50 1.4.4 Επιδημιολογία και κλινικές εκδηλώσεις... 51 3

1.4.5 Διάγνωση... 52 1.4.6 Ανοσοφαινότυπος... 53 1.4.7 Παθογένεση... 53 1.4.8 Τ LGL λευχαιμία και άλλα νοσήματα... 53 1.4.9 Πρόγνωση και Θεραπεία... 55 1.4.10 Ο ρόλος των ιών στην Τ LGL λευχαιμία... 56 1.5 Οι ανθρώπινοι ερπητοϊοί CMV και ΕΒV... 57 1.5.1 Γενικά... 57 1.5.2 Ο ιός Epstein Barr (EBV)... 60 Ιστορική αναδρομή... 60 Tαξινόμηση του EBV... 61 Γενικά χαρακτηριστικά του ιού... 63 Κλινική εικόνα... 66 Διάγνωση και θεραπεία... 68 1.5.3 O μεγαλοκυτταροιός (CMV)... 69 Ταξινόμηση του CMV... 69 Γενικά χαρακτηριστικά του ιού... 70 Επιδημιολογία... 72 Kλινική εικόνα... 73 Διάγνωση και θεραπεία... 74 1.6 Σκοπός μελέτης... 77 2. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ... 78 2.1 Ομάδα ασθενών... 78 2.2 Συλλογή δειγμάτων... 78 2.3 Απομόνωση DNA... 78 2.4 Real Time PCR... 80 2.4.1 Γενικές αρχές της μεθόδου... 80 2.4.2 Τεχνικές PCR πραγματικού χρόνου (RQ PCR)... 80 RQ PCR με τη χρήση της χρωστικής SYBR Green I... 82 Ανάλυση RQ PCR με ανιχνευτές υδρόλυσης (Taqman)... 83 Ανάλυση RQ PCR με ανιχνευτές υβριδισμού... 84 Μοριακός φάρος (Molecular beacon)... 85 Ανιχνευτές Scorpions... 86 2.4.3 Γραφική παράσταση και κινητικής της αντίδρασης... 87 4

2.4.4 Ποσοτικοποίηση... 89 2.4.5 Εφαρμογές της μεθόδου RQ PCR... 89 2.4.6 Πλεονεκτήματα της εφαρμογής RQ PCR... 90 2.4.7 Πρωτόκολλο Real Time PCR για την ανίχνευση των ερπητοϊών EBV και CMV... 90 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 93 3.1 Δημογραφικά χαρακτηριστικά ομάδας μελέτης... 93 3.2 Ανίχνευση του ΕΒV... 94 3.2 Ανίχνευση του CMV... 97 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 100 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 102 5

ΛΙΣΤΑ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1. Α) Προέλευση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος Β) Είδη άνοσων απαντήσεων (Έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία)... 12 Εικόνα 2. Πρωτογενή και δευτερογενή λεμφικά όργανα.... 13 Εικόνα 3. Δομές που περιέχουν μοτίβα PAMPs και οι αντίστοιχοι υποδοχείς της έμφυτης ανοσίας (PRRs) που τους αναγνωρίζουν.... 16 Εικόνα 4. Οι δύο κατηγορίες της προσαρμοστικής ανοσίας:... 19 Εικόνα 5. Αντιγονοπαρουσίαση: ένα βασικό σημείο σύνδεσης της έμφυτης και της προσαρμοστικής ανοσίας...... 20 Εικόνα 6. Aναγνώριση υπεραντιγόνου: Α. Μη συμβατική θέση αναγνώρισης των βακτηριακών και ιικών υπεραντιγόνων από την β αλυσίδα του TCR. Β. Πρόσδεση δύο κοινών υπεραντιγόνων, της σταφυλοκοκκικής πρωτείνης (spa) και της πρωτείνης του P. Magnus (ppl) και συσχέτιση με την θέση σύνδεσης ενός συμβατικού αντιγόνου.... 26 Εικόνα 7. H διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων (Kuby 1998).... 29 Εικόνα 8. Θετική και αρνητική επιλογή... 30 Εικόνα 9. Απόπτωση των θυμοκυττάρων Α). Φυσιολογικά θυμοκύτταρα στο οπτικό μικροσκόπιο Β) Αποπτωτικά θυμοκύτταρα στο οπτικό μικροσκόπιο Γ) Φυσιολογικό θυμοκύτταρο στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης Δ) Αποπτωτικό θυμοκύτταρο στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης [B. A. Osborne and S. Smith, 1997, Journal of NIH Research 9:35; courtesy B. A. Osborne, University of Massachusetts at Amherst.]... 32 Εικόνα 10. Θυμοκύτταρα γδ και αβ κατά την εμβρυική και ενήλικη ζωή (Kuby 1998)... 33 Εικόνα 11. Ο Τ κυτταρικός υποδοχέας... 35 Εικόνα 12. Συγκριτική απεικόνιση γδ TCR και αβ ΤCR... 36 Εικόνα 13. Αλληλεπιδράσεις TCR ΜΗC μορίων.... 36 Εικόνα 14. Διάταξη των γονιδίων για τις α,δ,β και γ αλυσίδες του TCR στους αντίστοιχους γενετικούς τόπους (Kuby 1998).... 37 Εικόνα 15. Ο ανασυνδυασμός των γονιδίων V, D, J για την παραγωγή... 38 Εικόνα 16. Σχηματική αναπαράσταση του σύμπλοκου TCR CDR3 όταν ο TCR αποτελείται από αλυσίδες αβ, γε και εδ αντίστοιχα.... 39 Εικόνα 17. Α. Πολυάριθμα Τ λεμφοκύτταρα που αλληλεπιδρούν με ένα μακροφάγο. Β. Ένα μακροφάγο που καταπολεμά βακτήρια.... 40 Εικόνα 18. Ένα ΝΚ κύτταρο επιτείθεται σε ένα καρκινικό κύτταρο... 41 Εικόνα 19. Δύο μεγάλα κοκκιώδη κύτταρα (LGL).... 42 Εικόνα 20. LGL κύτταρο από ασθενή με T LGL λευχαιμία.... 50 Εικόνα 21. Ταξινόμηση ανθρώπινων ερπητοϊών... 57 Εικόνα 22.Δομή ερπητοϊού τη στιγμή που σπάει ο ιϊκός φάκελος... 58 Εικόνα 23. Σχηματική αναπαράσταση ενός ερπητοϊου... 59 6

Εικόνα 24. To γονιδίωμα κοινών ερπητοϊών.... 60 Εικόνα 25. Γεωγραφική κατανομή της εμφάνισης του Λεμφώματος Burkitt.... 61 Εικόνα 26. Η δομή του ιού Epstein Barr.... 62 Εικόνα 27. Mόλυνση Β λεμφοκυττάρων από τον EBV.... 64 Εικόνα 28. Ιική έκφραση κατά τους τρεις τύπους λανθάνουσας μόλυνσης.... 66 Εικόνα 29. Ανίχνευση του EBV με την τεχνική του ανοσοφθορισμού... 69 Εικόνα 30. Δομή του CMV.... 70 Εικόνα 31. Eνθοθηλιακό κύτταρo προσβεβλημένo από τον CMV. [ Ανοσοφθορισμός Μπλε: DAPI = κυτταρικό DNA. Πράσινο = GFP (green fluorescence protein). Αποχρώσεις του κόκκινου =ιικές πρωτείνες. (Joerg Schroeer, Princeton University online Art Gallery)]... 71 Εικόνα 32.Είσοδος του CMV στα κύτταρα μέσω της μεμβράνης.... 72 Εικόνα 33. Xαρακτηριστικά ενδοπυρηνικά έγκλειστα σε CMV+ κύτταρα.... 75 Εικόνα 34. Ανίχνευση του CMV με ανοσοφθορισμό.... 75 Εικόνα 35. Πρωτόκολλα PCR πραγματικού χρόνου: Ι. Χρωστική SYBR Green. II. Ανιχνευτές υβριδισμού. ΙΙΙ. Ανιχνευτές υδρόλυσης..... 82 Εικόνα 36. Η χρωστική SYBR Green παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA.... 82 Εικόνα 37. A: αποδιάταξη DNA η SYBR Green δεν προσδένεται στο DNA B Γ Δ: φάση επιμήκυνσης η SYBR Green παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA και εκπέμπει φθορισμό που ανιχνεύεται από το μηχάνημα. Το σήμα φθορισμού αυξάνει σταδιακά κατά τη διάρκεια της φάσης επιμήκυνσης, γίνεται μέγιστο στο τέλος της φάσης (Δ)... 82 Εικόνα 38. Αναπαράσταση των βημάτων της δράσης των ανιχνευτών TaqMan : πριν ο ανιχνευτής συναντηθεί με την Taq πολυμεράση ενέργεια μεταφέρεται from a short wavelength fluorophore (green) to a longwavelength fluorophore (red). Όταν η πολυμεράση προσθέτει νουκλεοτίδια στο εκμαγείο του DNA απελευθερώνει το μικρού μήκους κύματος fluorophore, κάνοντας το ανιχνεύσιμο και το μεγάλου μήκους κύματος μη ανιχνεύσιμο.... 83 Εικόνα 39. Α. Ο ανιχνευτής Taqman. Ο κόκκινος κύκλος αναπαριστά το φθορισμόχρωμα καταστολέα που εμποδίζει το παρατηρούμενο σήμα που εκπέμπεται από το φθορισμόχρωμα αναφοράς, όταν το πρώτο βρίσκεται σε κοντινή απόσταση. Β. Ο ανιχνευτής TaqMan προσδένεται στο DNA στόχο και ομοίως και ο εκκινητής. Λόγω της πρόσδεσης του εκκινητή η πολυμεράση Taq μπορεί να συνθέσει ένα συμπληρωματικό κλώνο. Γ. Το φθορισμόχρωμα αναφοράς απελευθερώνεται από το επιμηκισμένο δίκλωνο DNA που συντέθηκε από την Taq πολυμεράση. Σε απόσταση από το φθορισμόχρωμα καταστολέα, το φώς που εκπέμπεται από το φθορισμόχρωμα αναφοράς σε διεγερμένη κατάσταση μπορεί να παρατηρηθεί.... 84 Εικόνα 40. Ανάλυση RQ PCR με το πρωτόκολλο των ανιχνευτών υβριδισμού.... 85 Εικόνα 41. Διέγερση του φθορισμοχρώματος δότη, εκπομπή ακτινοβολίας και διέγερση φθορισμόχρωματοςδέκτη. Η παραπάνω διαδικασία αναφέρετα ως μεταφορά συντονισμένης ενέργειας φθορισμού (fluorescence resonance energy transfer, FRET) και οπδηγεί στην εκπομπή φθορισμού.... 85 Εικόνα 42. Μοριακός φάρος.... 86 7

Εικόνα 43.Δομή των δυο τύπων ανιχνευτών και απεικόνιση της αλλαγής στη δομή τους κατά την πρόσδεση τους στην αλληλουχία στόχο.... 87 Εικόνα 44.Κινητική της αντίδρασης... 88 Εικόνα 45. O εξοπλισμός για την Real Time PCR: Rotor Gene 6000... 91 Εικόνα 46. Aναλογία φύλου στο υπό μελέτη δείγμα ασθενών.... 93 Εικόνα 47. Κατανομή ηλικιών στο υπό μελέτη δείγμα ασθενών.... 93 Εικόνα 48. Οι χαρακτηριστικές καμπύλες των standards QS1 QS2 QS3 QS4 του RealArt EBV PCR. Mε μπλε χρώμα φαίνεται η καμπύλη του νερού.... 95 Εικόνα 49. Χρωστική JOE και καμπύλες εσωτερικού μάρτυρα.... 95 Εικόνα 50. Πρότυπη καμπύλη (Standard Curve)... 96 Εικόνα 51. Οι χαρακτηριστικές καμπύλες των standards QS1 QS2 QS3 QS4 του RealArt CMV PCR με κόκκινο. Mε μπλε χρώμα φαίνεται η καμπύλη του νερού. Τα υπόλοιπα χρώματα αντιστοιχούν σε δείγματα, όλα απέχουν ακόμα και από το πιο μικρό standard (QS4)... 98 Εικόνα 52. Χρωστική JOE και καμπύλες εσωτερικού μάρτυρα.... 98 Εικόνα 53. Πρότυπη καμπύλη (Standard Curve)... 99 ΛΙΣΤΑ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1. Όροι που έχουν χρησιμοποιηθεί για την Τ LGL Λευχαιμία... 48 Πίνακας 2. Συχνές ορολογικές διαταραχές στους Τ LGL ασθενείς... 51 Πίνακας 3. Κλινικές καταστάσεις και καλοήθεις LGL υπερπλασίες... 52 Πίνακας 4. Κριτήρια για τη διάγνωση της T LGL λευχαιμίας... 52 Πίνακας 5. T LGL και άλλα νοσήματα... 54 Πίνακας 6. Πρωτεΐνες του EBV που εκφράζονται κατά τη λανθάνουσα μόλυνση.... 65 Πίνακας 7. Τύποι λανθάνουσας φάσης και αναπτυσσόμενοι όγκοι.... 67 Πίνακας 8.ΕΒV & Ογκογένεση.... 68 Πίνακας 9. Ανίχνευση του EBV σε ασθενείς με T LGL.... 94 Πίνακας 10. Ανίχνευση του CMV σε ασθενείς με T LGL.... 97 8

ΠΕΡΙΛΗΨΗ H Τ-LGL λευχαιμία είναι μια κλωνική διαταραχή των Τ LGL κυττάρων η οποία χαρακτηρίζεται από ουδετεροπενία, αναιμία και θρομβοπενία. Η Τ LGL λευχαιμία συνοδεύεται συχνά από αυτοάνοσες εκδηλώσεις (π.χ.ρευματοειδή αρθρίτιδα) αλλά και από άλλα λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα. Η διάγνωση της T LGL λευχαιμίας γίνεται κυρίως με κυτταρομετρία ροής κατά την οποία αναδεικνύεται κλωνικότητα των CD8+CD57+ Τ κυττάρων ενώ επιβεβαιώνεται και με μοριακή ανάλυση των αναδιατάξεων των γονιδίων του ΤCR υποδοχέα. Στους περισσότερους ασθενείς η κλινική πορεία είναι καλή και τα συμπτώματα ήπια, ενώ επιτυγχάνεται βελτίωση της κυτταροπενίας με ανοσοκατασταλτικούς παράγοντες όπως στεροειδή, μεθοτρεξάτη, κυκλοφωσφαμίδιο και κυκλοσπορίνη Α. Ο παθογενετικός μηχανισμός στην T LGL λευχαιμία δεν έχει πλήρως διευκρινστεί. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η Τ LGL λευχαιμία είναι μια διαταραχή που οφείλεται στην απορρύθμιση των μονοπατιών της απόπτωσης λόγω ανωμαλιών στο Fas/FasL μονοπάτι. Παράλληλα, πολυάριθμα δεδομένα στηρίζουν την άποψη της εξωγενούς αντιγονικής διέγερσης, όπως κάποιος ιός ( π.χ. HTLV). Στα πλαίσια της αναζήτησης του άγνωστου αντιγόνου, εξετάσαμε την υπόθεση συμμετοχής δύο κοινών ερπητοϊών (EBV, CMV) στην παθογένεση της νόσου. Τα αποτελέσματα της μελέτης, υποδηλώνουν πιθανή συσχέτιση του EBV, κάτι το οποίο έχει αναφερθεί και για την NK LGL λευχαιμία, ενώ δεν φαίνεται να υπάρχει καμία συσχέτιση μεταξύ της νόσου και του CMV. 9

ΑBSTRACT T cell large granular lymphocyte (LGL) leukemia is a clonal proliferation of cytotoxic T cells, which causes neutropenia, anemia, and/or thrombocytopenia. This condition is often associated with autoimmune disorders, especially rheumatoid arthritis, and other lymphoproliferative disorders. The diagnosis is suggested by flow cytometry demonstrating an expansion of CD8+CD57+ T cells and is confirmed by T cell receptor gene rearrangement studies. In most patients, this is an indolent disorder, and significant improvement of cytopenias can be achieved with immunosuppressive agents such as steroids, methotrexate, cyclophosphamide, and cyclosporin A. The pathogenetic mechanism lie on the T LGL development and progression remains elusive. Mounting evidence suggests that LGL leukemia is a disorder of dysregulation of apoptosis through abnormalities in the Fas/Fas ligand pathway. Simultaneously, various data support the idea of antigenic stimulus prior to leukemic transformation and indicate an exogenous antigen such as a viral component (i.e. HTLV) or even an autoantigen. In this context, we explore a possible link between common herpesviruses infection (EBV, CMV) and T LGL development. Our results, indicate a weak correlation between EBV and T LGL, while according to our study data CMV is not associate with T LGL. 10

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Εισαγωγή στο ανοσοποιητικό σύστημα 1.1.1 Δομή και λειτουργία ανοσοποιητικού συστήματος Το ανοσοποιητικό σύστημα εξελίχθηκε για να προστατεύει τον οργανισμό από παθογόνους παράγοντες που επιχειρούν να διαταράξουν την απαραίτητη για την επιβίωση ομοιόσταση. Οι παράγοντες αυτοί μπορεί να είναι τόσο εξωτερικοί (παθογόνοι μικροοργανισμοί, τοξίνες, βλαβερές ουσίες) όσο και εσωτερικοί (νεοπλασματικά κύτταρα, κύτταρα που αποπίπτουν). Kάθε τμήμα των παραγόντων αυτών που είναι ικανό να επάγει άνοση απάντηση καλείται αντιγόνο. Η αναγνώριση των αντιγόνων είτε αυτά είναι ξένα είτε είναι αντιγόνα του ίδιου του οργανισμού (αυτοαντιγόνα) και η αμυντική δράση του ανοσοποιητικού συστήματος βασίζονται σε μια σειρά από μηχανισμούς που δρουν παράλληλα και συμπληρωματικά με κοινό στόχο την αποτελεσματική άνοση απάντηση (Janeway et al. 2004). Σε κυτταρικό επίπεδο, η οργάνωση του ανοσοποιητικού συστήματος βασίζεται στη συντονισμένη δράση και αλληλεπίδραση διαφορετικών κυτταρικών πληθυσμών με διακριτούς ρόλους και εξειδίκευση που ποικίλει. Ειδικότερα, στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος περιλαμβάνονται οι διάφορες κατηγορίες λευκοκυττάρων που δρουν είτε ειδικά (Β λεμφοκύτταρα, Τ λεμφοκύτταρα) είτε μη ειδικά (φαγοκύτταρα, ΝΚ κύτταρα φονείς) καθώς και τα αιμοπετάλια που παίρνουν μέρος στην πήξη του αίματος και στη φλεγμονή (Eales 2003). Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος κυκλοφορούν στο αίμα και την λέμφο, βρίσκονται διάσπαρτα σε όλους τους ιστούς εκτός από το κεντρικό νευρικό σύστημα ή συναθροίζονται στα λεμφικά όργανα. Αυτή η κατανομή των κυττάρων και παράλληλα η ικανότητά τους να κυκλοφορούν μεταξύ αίματος, λέμφου και ιστών, είναι ζωτικής σημασίας για την έναρξη άνοσης απάντησης σε κάθε σημείο που δυνητικά αποτελεί πύλη εισόδου παθογόνων εξωτερικών παραγόντων. Όλα τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος είναι λευκοκύτταρα που προέρχονται από έναν κοινό πρόγονο, το πολυδύναμο ή αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο στο μυελό των οστών (Εικόνα 1Α). Διάφοροι αιμοποιητικοί αναπτυξιακοί παράγοντες (κυτταροκίνες) επάγουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. Η διαφοροποίηση απαιτεί την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων που καθορίζουν οριστικά και αμετάκλητα την πορεία διαφοροποίησης (lineage determining genes) σε συνάρτηση με μια σειρά μεταγραφικών παραγόντων (Goldsby et al. 2000). 11

Εικόνα 1. Α) Προέλευση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος Β) Είδη άνοσων απαντήσεων (Έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία) Η δομή του ανοσοποιητικού συστήματος σε επίπεδο ιστών και οργάνων περιλαμβάνει ένα ευρύ δίκτυο δομών που κατέχουν στρατηγικές θέσεις σε όλο το σώμα (Εικόνα 2). Τα όργανα του ανοσοποιητικού συστήματος ή λεμφικά όργανα διακρίνονται σε πρωτογενή όπου γίνεται η διαφοροποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος και δευτερογενή τα οποία παγιδεύουν αντιγόνα και παρέχουν τοποθεσίες όπου τα ώριμα λεμφοκύτταρα μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τα αντιγόνα αυτά. Στα πρωτογενή λεμφικά όργανα κατατάσσονται ο 12

θύμος αδένας και ο μυελός των οστών ενώ στα δευτερογενή λεμφικά όργανα περιλαμβάνονται οι λεμφαδένες, ο σπλήνας, ο διάχυτος λεμφικός ιστός στο σώμα και οι λεμφικοί ιστοί των βλεννογόνων (mucosa associated lymphoid tissue, MALT) (Kuby 1998). Ο ερυθρός μυελός των οστών αποτελεί θέση παραγωγής των πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων από τα οποία θα προκύψουν όλα τα κύτταρα του αίματος. Παράλληλα αποτελεί το μικροπεριβάλλον για τη διαφοροποίηση των κυττάρων της λεμφικής σειράς σε Β και Τ λεμφοκύτταρα. Η ανάπτυξη και ωρίμανση των Β λεμφοκυττάρων γίνεται στον μυελό των οστών, ενώ η ωρίμανση των Τ λεμφοκυττάρων γίνεται στον θύμο αδένα. Στο μικροπεριβάλλον του θύμου αδένα και κάτω από την επίδραση διαλυτών παραγόντων και μορίων επιφανείας, τα Τ λεμφοκύτταρα ωριμάζουν και έπειτα εξέρχονται στην περιφερική κυκλοφορία όπου και θα κατανεμηθούν στα διάφορα άλλα λεμφικά όργανα. Σημαντική επίσης λειτουργία του θύμου αδένα είναι η καταστροφή κυττάρων με υποδοχείς που αναγνωρίζουν αυτοαντιγόνα (Kuby 1998). Εικόνα 2. Πρωτογενή και δευτερογενή λεμφικά όργανα. Οι λεμφαδένες είναι όργανα που συλλέγουν το μεσοκυττάριο υγρό και το επαναφέρουν στο αίμα. Στους λεμφαδένες καταλήγουν τα αντιγόνα από όλες τις πιθανές πύλες εισόδου. Στον λεμφαδένα υπάρχουν Β λεμφοκύτταρα οργανωμένα σε θυλάκια (λεμφοζίδια), στο κέντρο των οποίων παρατηρούνται χαρακτηριστικές εστίες ταχέως διαιρούμενων κυττάρων, που 13

καλούνται βλαστικά κέντρα. Στην εσωτερική μοίρα και περιφεριακά του λεμφαδένα κυριαρχούν τα Τ λεμφοκύτταρα (Kuby 1998). Ο σπλήνας εξειδικεύεται στην διήθηση του αίματος. Σε αντιστοιχία με τους περιφερικούς λεμφαδένες, στον σπλήνα εντοπίζονται νησίδες λεμφικού ιστού όπου κυριαρχούν τα Β λεμφοκύτταρα, ενώ περιφεριακά υπάρχουν κυρίως Τ λεμφοκύτταρα. Τα λεμφοζίδια αποτελούν κατά τόπους αθροίσματα λεμφοκυττάρων στον υποβλεννογόνιο χώρο σε σφαιρικούς σχηματισμούς, χωρίς κάψα που περιβάλλονται από δίκτυο απαγωγών λεμφαγγείων. Λεμφοζίδια είναι διάσπαρτα κάτω από το βλεννογόνο του πεπτικού (λεμφικός ιστός εντέρου gut associated lymphoid tissue, GALT), του αναπνευστικού (λεμφικός ιστός βρόγχων bronchus associated lymphoid tissue, BALT) καθώς και το βλεννογόνο του ουρογεννητικού συστήματος. Τέλος, χαρακτηριστικοί σχηματισμοί λεμφικού ιστού είναι οι πλάκες του Peyer, οι αμυγδαλές και η σκωληκοειδής απόφυση (Kuby 1998). Η οργάνωση του ανοσοποιητικού συστήματος εξυπηρετεί την αύξηση της πιθανότητας επαφής των αντιγόνων με τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται άμεση άνοση απάντηση. Οι άνοσες απαντήσεις διακρίνονται σε δύο κατηγορίες (Εικόνα 1Β) : i) έμφυτες ή φυσικές στις οποίες κεντρικό ρόλο διαδραματίζουν τα φαγοκύτταρα (μονοκύτταρα, μακροφάγα, ουδετερόφιλα) και ii) προσαρμοστικές ή επίκτητες που αφορούν στη δράση των Τ και Β λεμφοκύτταρων. Εκτός από τα κύτταρα και μόρια που χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση των αντιγόνων, οι δύο κατηγορίες άνοσων απαντήσεων διαφέρουν στην ειδικότητα και στο χρόνο έναρξης, καθώς τα κύτταρα της έμφυτης ανοσίας δρουν ταχύτατα αν και μη ειδικά. Τέλος, σημαντική διαφορά ανάμεσα στα δύο είδη ανοσίας, είναι και η «μνήμη» που χαρακτηρίζει την προσαρμοστική ανοσία (Roitt et al. 2001) 1.1.2. Έμφυτη ανοσία Η έμφυτη ή φυσική ανοσία αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού ενάντια στα παθογόνα και χαρακτηρίζεται από μη ειδική δράση. Ο αμυντικός ρόλος των μηχανισμών της έμφυτης ανοσίας είναι καθοριστικής σημασίας, καθώς αποτελεί μια ταχύτατη αντίδραση σε κάθε μόλυνση που πολλές φορές καταλήγει στην πλήρη ανάσχεση του παθογόνου εισβολέα και παράλληλα ένα σήμα κινδύνου που σηματοδοτεί την έναρξη της ειδικής άνοσης απάντησης. Ειδικότερα, οι μηχανισμοί της έμφυτης ανοσίας (Kaufmann et al. 2004): i) προϋπάρχουν της μόλυνσης και έχουν τη δυνατότητα άμεσης δράσης έναντι των μικροβίων ii) λειτουργούν με τον ίδιο τρόπο κατά επαναλαμβανόμενων μολύνσεων και ενεργοποιούνται από δομές που είναι κοινές μεταξύ των διαφόρων μικροβίων iii) προστατεύουν τον οργανισμό 14

από τα εξωγενή παθογόνα μέχρι να αναπτυχθούν και να δράσουν οι μηχανισμοί της ειδικής ανοσίας iv) επηρεάζουν την πορεία της ειδικής άνοσης απάντησης v) συμμετέχουν στην αντιμετώπιση του αντιγόνου κατά τη φάση εκτελεστικής δράσης της ειδικής άνοσης απάντησης. Αυτός ο πολύπλευρος ρόλος της έμφυτης ανοσίας διεκπεραιώνεται χάρη στην ποικιλία των ουσιών, κυττάρων και δομών που συμμετέχουν σε αυτή. Πιο συγκεκριμένα, οι μηχανισμοί της έμφυτης ανοσίας, περιλαμβάνουν (Kaufmann et al. 2004): Ανατομικούς φραγμούς που αποτελούν φυσικό εμπόδιο στην είσοδο των παθογόνων στον οργανισμό όπως το δέρμα, οι βλεννογόνοι και το κροσσωτό επιθήλιο της αναπνευστικής οδού. Φυσιολογικούς φραγμούς που ελέγχουν παραμέτρους όπως η θερμοκρασία, το ph όπως το γαλακτικό οξύ και τα λιπαρά οξέα στον ιδρώτα, το γαστρικό υγρό στο στομάχι, ο πυρετός κ.α. Χυμικούς φραγμούς στους οποίους περιλαμβάνονται το ένζυμο λυσοζύμη στο σάλιο, τον ιδρώτα και τα δάκρυα, τα πρωτεολυτικά ένζυμα ελαστάση, αντιθρυψίνη, καθεψίνη, η μουραμιδάση και διάφοροι άλλοι διαλυτοί παράγοντες (σύστημα συμπληρώματος, προπερδίνη, C δραστική πρωτείνη, προσταγλανδίνες, υπερπεροξειδάσες, νιτρικό οξύ, λευκοτριένες, παράγοντας ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων, ισταμίνη, σεροτονίνη) Τη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης στην οποία συμμετέχουν ειδικά κύτταρα, τα φαγοκύτταρα (μονοκύτταρα, πολυμορφοπύρηνα, μακροφάγα των ιστών). Η φαγοκυττάρωση είναι μία μορφή πέψης και εξουδετέρωσης εξωκυττάριου υλικού που προέρχεται από τα παθογόνα. Τη δράση των ΝΚ κυττάρων (φυσικοί φονείς), τα οποία αφού ενεργοποιηθούν από τις ιντερφερόνες α και β στρέφονται κυρίως έναντι καρκινικών κυττάρων και κυττάρων μολυσμένων με ιούς. Τη φλεγμονώδη αντίδραση, μια πολύπλοκη διαδικασία γεγονότων που ακολουθεί την καταστροφή ιστών είτε λόγω τραυματισμού, είτε λόγω εισόδου παθογόνων. Κατά την φλεγμονώδη αντίδραση συμβαίνουν έκκριση ισταμίνης και αγγειοδιαστολή, αύξηση της διαπερατότητας των τριχοειδών και έξοδος φαγοκυττάρων στους ιστούς. Η μετανάστευση των φαγοκυττάρων είναι μια διαδικασία με πολλά επιμέρους βήματα όπως η προσκόλληση στα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών, η διαπίδυση διαμέσου των ενδοθηλιακών κυττάρων και τελικά η χημειοταξία στο σημείο της φλεγμονής. 15

Εξελικτικά, η έμφυτη ανοσία θεωρείται ότι προϋπήρχε της προσαρμοστικής, ενώ κάποιες δομές της υπάρχουν σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς και βρέθηκε ότι είναι εξαιρετικά συντηρημένες (Janeway et al. 2004). Η αναγνώριση παθογόνων δομών μικροβίων από τους μηχανισμούς της έμφυτης ανοσίας βασίζεται στην ύπαρξη ενός περιορισμένου αριθμού υποδοχέων στην επιφάνεια των κυττάρων της έμφυτης ανοσίας, των οποίων η έκφραση και η ειδικότητα είναι γενετικά προκαθορισμένη. Ωστόσο, η ειδικότητα που εμφανίζουν είναι περιορισμένη σε σχέση με αυτή των υποδοχέων της προσαρμοστικής ανοσίας (Kaufmann et al. 2004). Οι υποδοχείς αυτοί δεν έχουν διακριτική ικανότητα για κάθε πιθανό παθογόνο, αλλά αναγνωρίζουν τις κοινές δομές που υπάρχουν σε πολλά μικρόβια και αναφέρονται ως Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) ενώ αντίστοιχα οι υποδοχείς της φυσικής ανοσίας καλούνται Pattern Recognition Receptors (PRRs). PAMPs είναι ο λιποπολυσακχαρίτης του κυτταρικού τοιχώματος (LPS) των Gram αρνητικών βακτηρίων, οι πεπτιδογλυκάνες, τα τειχοϊκά οξέα και το βακτηριακό DNA ενώ από τους πιο σημαντικούς PRRs είναι οι Toll like υποδοχείς (ΤLRs), το CD14 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων και ο υποδοχέας της μαννόζης (Eικόνα 3). Εικόνα 3. Δομές που περιέχουν μοτίβα PAMPs και οι αντίστοιχοι υποδοχείς της έμφυτης ανοσίας (PRRs) που τους αναγνωρίζουν. 1.1.3 Προσαρμοστική ανοσία Αν η έμφυτη ανοσία δεν κατορθώσει να εξουδετερώσει τη έκθεση του οργανισμού στους ξένους παράγοντες, κινητοποιούνται εξαιρετικά ειδικοί μηχανισμοί οι οποίοι αυξάνουν σημαντικά την αμυντική ικανότητα του οργανισμού σε μελλοντικές επαφές του με τα ίδια αντιγόνα. Οι μηχανισμοί αυτοί συνιστούν την προσαρμοστική ανοσία (adaptive immunity), στην οποία συμμετέχουν τα λεμφοκύτταρα και τα προϊόντα που εκκρίνουν. Η προσαρμοστική ανοσία διακρίνεται στην χυμική ανοσία στην οποία συμμετέχουν τα Β λεμφοκυττάρα και τα 16

προϊόντα τους (τα αντισώματα) και στην κυτταρική ανοσία η οποία στηρίζεται στη δράση των Τ λεμφοκυττάρων (Εικόνα 4)(Colombo et al. 1998). Τα Τ και Β λεμφοκύτταρα δεν είναι ομοιογενείς κυτταρικοί πληθυσμοί αλλά αντίθετα περιλαμβάνουν διάφορους υποπληθυσμούς. Συγκεκριμένα, τα Τ λεμφοκύτταρα διακρίνονται σε (Janeway et al. 2004): i) βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα (Th) τα οποία αλληλεπιδρούν με μονοπύρηνα φαγοκύτταρα προκειμένου να καταστρέψουν ενδοκυττάρια παθογόνα (Th1),με Β λεμφοκύτταρα (Th2) ή με τα κατασταλτικά Τ λεμφοκύτταρα (Th3) προκειμένου να τα ενεργοποιήσουν ii) κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (Τc) τα οποία στρέφονται εναντίον κυττάρων που έχουν μολυνθεί από ιούς ή άλλα ενδοκυττάρια παθογόνα iii) Τ λεμφοκύτταρα μνήμης τα οποία ενεργοποιούνται σε επόμενη έκθεση του οργανισμού στο ίδιο αντιγόνο και συμβάλλουν στην ταχύτερη ειδική άνοση απάντηση iv) κατασταλτικά T λεμφοκύτταρα (Τs) τα οποία καταστέλλουν την άνοση απάντηση όταν εξουδετερωθεί το αντιγόνο και συμμετέχουν στην επαγωγή της ανοχής. Τα Β λεμφοκύτταρα διακρίνονται στα Β λεμφοκύτταρα μνήμης τα οποία ενεργοποιούνται σε επόμενη έκθεση στο ίδιο αντιγόνο και έχουν μεγάλη διάρκεια ζωής και στα πλασματοκύτταρα τα οποία συνθέτουν και εκκρίνουν αντισώματα. Κάθε ειδική άνοση απάντηση διακρίνεται σε τρεις φάσεις, τη φάση αναγνώρισης, τη φάση ενεργοποίησης και τη δραστική φάση (Kuby 1998). Φάση αναγνώρισης: Τα λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν συγκεκριμένες, ανοσολογικά ενεργές περιοχές των αντιγόνων, οι οποίες καλούνται αντιγονικοί επίτοποι. Η αναγνώριση των αντιγονικών επιτόπων γίνεται μέσω των επιφανειακών υποδοχέων των λεμφοκυττάρων (Βκυτταρικός υποδοχέας, ΒCR και Τ κυτταρικός υποδοχέας, TCR). Στην περίπτωση των Τ λεμφοκυττάρων η διαδικασία αναγνώρισης προϋποθέτει τη συμμετοχή των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (Αntigen presenting cells APC) τα οποία εκθέτουν στην επιφάνεια το αντιγόνο σε συνδυασμό με ένα MHC μόριο (Major Histocompatibility Complex, μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας). Τα αντιγόνα MHC I βρίσκονται σε όλα τα εμπύρηνα κύτταρα και τα αντιγόνα MHC II βρίσκονται στην επιφάνεια των APC. Στα APC περιλαμβάνονται τα μονοκύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα κύτταρα του συνδετικού ιστού, τα κύτταρα του Langerhans, τα δενδριτικά κύτταρα και τα Β λεμφοκύτταρα. Φάση ενεργοποίησης: Η επαγωγή τόσο της χυμικής όσο και της κυτταρικής ανοσίας απαιτεί μεταξύ άλλων και την παραγωγή κυτταροκινών από τα βοηθητικά T λεμφοκύτταρα. Η ρύθμιση της ενεργοποίησης των Th λεμφοκυττάρων είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, και οποιοδήποτε λάθος μπορεί να προκαλέσει την ενεργοποίηση μηχανισμών που θα τα στρέφουν εναντίον αυτοαντιγόνων. Για το λόγο αυτό τα Th λεμφοκύτταρα διεγείρονται μόνο αν το 17

αντιγόνο παρουσιαστεί σε συνδυασμό με τα αντιγόνα MHC II στην πλασματική μεμβράνη των APC κυττάρων. Όλα τα APC, με εξαίρεση τα Β λεμφοκύτταρα, εγκολπώνουν το αντιγόνο και το εκφράζουν τροποποιημένο στην πλασματική μεμβράνη μαζί με τα αντιγόνα MHC II. Στη συνέχεια, το μόριο CD4 στην πλασματική μεμβράνη των Τh λεμφοκυττάρων συνδέεται με το αντιγόνο MHC τάξης ΙΙ και ο ΤCR συνδέεται με το σύμπλεγμα αντιγόνο MHC. Το μήνυμα διέγερσης που προέρχεται από τον TCR είναι ζωτικής σημασίας για την ενεργοποίηση των Thλεμφοκυττάρων. Ωστόσο, για να ολοκληρωθεί η ενεργοποίηση απαιτείται παράλληλα ένα συνδιεγερτικό μήνυμα από τα APC, όπως οι κυτταροκίνες (IL 1, IL 6, IFN γ) ή η αλληλεπίδραση μεμβρανικών πρωτεϊνών. Τα ενεργοποιημένα Τh λεμφοκύτταρα συνθέτουν την IL 2 και παράλληλα εκφράζουν υποδοχείς για την συγκεκριμένη κυτταροκίνη (IL 2R). Η IL 2 επιδρώντας στα Τh λεμφοκύτταρα τα ενεργοποιεί περεταίρω και επάγει τον πολλαπλασιασμό τους. Η IL 2 είναι επίσης απαραίτητη για την ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό των Tc λεμφοκυττάρων, ενώ άλλες κυτταροκίνες που εκκρίνουν τα Th λεμφοκυττάρων συμμετέχουν στη διαδικασία διαφοροποίησης των Tc λεμφοκυττάρων σε κυτταροτοξικά κύτταρα δράστες (CTL Cytotoxic Lymphocytes)(Εικόνα 4). Για την ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων απαιτείται η δέσμευση του αντιγόνου, η ενδοκυττάρωσή του, η παρουσίασή του στην επιφάνειά τους ως σύμπλοκο με το MHC II και η αναγνώρισή του από ένα Th λεμφοκύτταρο. Ο σχηματισμός του συμπλέγματος Thλεμφοκύτταρο /Β λεμφοκύτταρο επάγει την παραγωγή διαφόρων κυτταροκινών από το Thλεμφοκύτταρο, που κατευθύνονται στη επιφάνεια αλληλεπίδρασης των πλασματικών μεμβρανών των δύο κυττάρων. Παράλληλα εκφράζονται υποδοχείς για τις κυτταροκίνες αυτές και στο Β λεμφοκύτταρο, που προκαλούν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίησή του σε πλασματοκύτταρο. Δραστική φάση: Στη δραστική φάση της άνοσης απάντησης, τα λεμφοκύτταρα που ενεργοποιήθηκαν από ένα συγκεκριμένο αντιγόνο προκαλούν την εξουδετέρωση του. Τα λεμφοκύτταρα που δρουν στην δραστική φάση ονομάζονται δραστικά κύτταρα. Στην φάση αυτή συμμετέχουν, εκτός από τα λεμφοκύτταρα, διάφοροι άλλοι μεσολαβητές της μη ειδικής ανοσίας. Για παράδειγμα, αντισώματα συνδέονται με ξένα αντιγόνα και προάγουν τη φαγοκυττάρωση τους από τα ουδετερόφιλα και τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα. Επίσης, τα αντισώματα ενεργοποιούν το συμπλήρωμα, το οποίο συμμετέχει στη λύση και την φαγοκυττάρωση των μικροβίων. Τέλος, τα T λεμφοκύτταρα εκκρίνουν κυτταροκίνες που αυξάνουν τη λειτουργία των φαγοκυττάρων και διεγείρουν τη φλεγμονώδη αντίδραση. 18

Εικόνα 4. Οι δύο κατηγορίες της προσαρμοστικής ανοσίας: Κυτταρική και χυμική ανοσία (Kuby 1998). Γίνεται εύκολα αντιληπτό ότι οι δύο μεγάλες κατηγορίες της άνοσης απάντησης, έμφυτη και προσαρμοστική, παρουσιάζουν έντονη αλληλοεπίδραση. Η εξουδετέρωση των αντιγόνων και γενικά, η άμυνα του οργανισμού είναι αποτέλεσμα στενής συνεργασίας των δύο τύπων ανοσίας. Η ειδική άνοση απάντηση ενισχύει, κατευθύνει και εστιάζει τους μηχανισμούς της φυσικής ανοσίας προς τα σημεία εισόδου του καθώς σχετίζονται με την ωρίμανση των APC κυττάρων και καθορίζουν διαφορετικούς τύπους κυτταρικής απάντησης ανάλογα με τo δίδυμο PAMP TLR (Εικόνα 5). 19

Εικόνα 5. Αντιγονοπαρουσίαση: ένα βασικό σημείο σύνδεσης της έμφυτης και της προσαρμοστικής ανοσίας. Αν και οι δύο τύποι ανοσίας είναι στενά συνδεδεμένοι, οι μηχανισμοί της προσαρμοστικής ανοσίας εμφανίζουν ορισμένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά που τους διαχωρίζουν από αυτούς της έμφυτης ανοσίας (Janeway et al. 2004, Roitt et al. 2001): Εξειδίκευση: στην προσαρμοστική ανοσία εξασφαλίζεται ειδική απάντηση όχι απλά για κάθε αντιγόνο αλλά πολύ περισσότερο για καθένα από τα επιμέρους δομικά στοιχεία των πολύπλοκων πρωτεϊνικών αντιγόνων (αντιγονικοί επίτοποι) Ποικιλομορφία: η ιδιότητα αυτή επιτρέπει στο ανοσοποιητικό σύστημα να αντιδρά σε μια τεράστια ποικιλία αντιγόνων Μνήμη: αυξάνει την έκταση και την ικανότητα της άνοσης απάντησης σε επόμενη έκθεση στο αντιγόνο καθώς διατηρεί κύτταρα μνήμης Αυτορύθμιση: επιτρέπει στο ανοσοποιητικό σύστημα να επανέρχεται σε κατάσταση ηρεμίας μετά από την αντιμετώπιση του κάθε αντιγονικού ερεθίσματος και το καθιστά ικανό να ανταπεξέρχεται αποτελεσματικότερα στα διαδοχικά ερεθίσματα που δέχεται Ανοχή : το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ικανό να διακρίνει τα ξένα αντιγόνα από τα αυτοαντιγόνα και αποτρέπει την δυνητική αντίδραση έναντι κυττάρων και ιστών του ίδιου του οργανισμού. Τέλος, από εξελικτική σκοπιά (Janeway et al. 2004), η προσαρμοστική ανοσία είναι ένας σχετικά νέος μηχανισμός άμυνας, που βασίζεται στη γενετική αναπροσαρμογή και 20

αναπαραγωγή κλώνων που αναγνωρίζουν διάφορα αντιγόνα. Μέχρι το 1970 η προσαρμοστική ανοσία θεωρούνταν ιδιότητα μόνο των ανώτερων σπονδυλωτών. Ωστόσο, σήμερα υπάρχουν ενδείξεις για ειδικούς ανοσολογικούς μηχανισμούς σε διάφορα επίπεδα της φυλογένεσης, ακόμα και σε ορισμένα ασπόνδυλα. 1.1.4 Αντιγόνα Με τον όρο αντιγόνα χαρακτηρίζονται εκείνες οι χημικές ενώσεις που μπορούν να αναγνωριστούν από τον BCR υποδοχέα ή τον TCR υποδοχέα σε συνδυασμό με ένα MHC μόριο. Τέσσερις χαρακτηριστικές ιδιότητες έχουν αποδοθεί στα αντιγόνα: η ανοσογονικότητα (immunogenicity), η αντιγονικότητα (antigenicity), η αλλεργιογονικότητα (allerogenicity) και η ικανότητα επαγωγής ανοχής (tolerogenicity) (Kuby 1998). Με τον όρο ανοσογονικότητα αναφερόμαστε στην ικανότητα μιας ουσίας να επάγει χυμική, κυτταρική ή συνδυασμένη άνοση απάντηση όταν εισέρχεται στον οργανισμό. Αντιγονικότητα είναι η ικανότητα μιας ουσίας να συνδέεται ειδικά με τα τελικά προϊόντα της άνοσης απάντησης (αντισώματα ή άλλοι μεμβρανικοί υποδοχείς), ανεξάρτητα αν διαθέτει ή όχι ανοσογονικότητα. Ο όρος αλλεργιογονικότητα αφορά στην ικανότητα επαγωγής διαφόρων τύπων αλλεργικών αντιδράσεων. Τα αντιγόνα που επάγουν ειδικούς τύπους χυμικών ή κυτταρικών απαντήσεων που οδηγούν στην εμφάνιση αλλεργικών εκδηλώσεων καλούνται αλλεργιογόνα (allergen). Τέλος, ικανότητα επαγωγής ανοχής είναι η ιδιότητα των αντιγόνων να καταστέλλουν την ειδική άνοση απάντηση. Κατά τη μελέτη των αντιγόνων, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η διάκριση μεταξύ των όρων αντιγόνο ανοσογόνου. Ως αντιγόνο (antigen) καλείται κάθε ουσία που ερχόμενη σε επαφή με διαλυτά αντισώματα, τον BCR ή με τον ΤCR, μπορεί να αντιδράσει στερεοχημικά και να συνδεθεί μαζί τους με μια σχετικά ισχυρή δύναμη σύνδεσης. Αντίθετα, ανοσογόνο (immunogen) καλείται κάθε ουσία που εισερχόμενη στον οργανισμό προκαλεί παραγωγή ειδικών αντισωμάτων και κυτταροτοξικων Τ λεμφοκυττάρων εναντίον αυτής, να επάγει δηλαδή χυμική ή κυτταρική ανοσολογική απάντηση. Συνεπώς, όλα τα ανοσογόνα είναι αντιγόνα, όλα όμως τα αντιγόνα δεν είναι ανοσογόνα (Kuby 1998). Η έννοια του αντιγόνου αποδίδεται καλύτερα με τον όρο ανοσογόνο (immunogen), όμως στην καθημερινή πράξη, ο όρος αντιγόνο αναφέρεται συνήθως και στις δύο ιδιότητες (ανοσογονικότητα, αντιγονικότητα) (Burmester et al. 2003) Η ανοσογονικότητα του αντιγόνου δεν αποτελεί εγγενές χαρακτηριστικό όπως τα φυσικοχημικά του γνωρίσματα αλλά λειτουργική ιδιότητα που εξαρτάται τόσο από το ίδιο το 21

αντιγόνο όσο και από τις γενικότερες συνθήκες του βιολογικού συστήματος με το οποίο έρχεται σε επαφή. Οι παράγοντες που καθορίζουν την ανοσογονικότητα μιας ουσίας είναι (Eales 2003): Η oμοιότητα μιας ουσίας με αυτόλογες πρωτεΐνες: αυτοαντιγόνων. Η καταστάση αυτή ονομάζεται αυτοανοσία (autoimmunity). Το μοριακό μέγεθος της ουσίας: ουσίες με μοριακό βάρος ΜΒ< 1000 Da δε διαθέτουν ανοσογονικότητα, ενώ αντίθετα είναι ανοσογόνες ουσίες με ΜΒ > 6000 Da. Ουσίες με ΜΒ μεταξύ 1000 και 6000 Da μπορεί να διαθέτουν ή να μην διαθέτουν ανοσογονικότητα. Η χημική της δομή: τα ομοπολυμερή σπάνια είναι ανοσογόνα ενώ αντίθετα τα συμπολυμερή δύο ή περισσότερων αμινοξέων μπορεί να διαθέτουν ισχυρή ανοσογονικότητα. Επίσης, τα αρωματικά αμινοξέα προσδίδουν στις μοριακές δομές πολύ μεγαλύτερη ανοσογονικότητα από τα μη αρωματικά. Δυνατότητα αποδόμησης από τα ένζυμα των μακροφάγων (μακρομόρια που δεν μπορούν να διασπασθούν από τα APC είναι ασθενή ανοσογόνα). Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες. Η γενετική πολυμορφία των αντιγόνων MHC, των ΒCR και ΤCR, καθώς και των υπόλοιπων πρωτεϊνών που συμμετέχουν στους μηχανισμούς ανοσίας, καθορίζουν τον τύπο και επηρεάζουν την ένταση της απάντησης των γενετικά διαφορετικών οργανισμών στα διάφορα ανοσογόνα. Επίσης, η ηλικία όσο και ο τρόπος θρέψης σχετίζονται με την δυνατότητα για άνοση απάντηση σε συγκεκριμένα αντιγόνα. Η δόση και η οδός χορήγησης. Δόσεις μεγαλύτερες του ορίου ουδός (threshold) της συγκεκριμένης ουσίας προκαλούν εντονότερη απάντηση. Οι εξαιρετικά μεγάλες δόσεις είναι δυνατόν να οδηγήσουν σε ανοχή. Η ενδοφλέβια οδός χορήγησης του αντιγόνου δεν προκαλεί την παραγωγή αντισωμάτων. Αντίθετα, η υποδόρια οδός χορήγησης του αντιγόνου οδηγεί στην παραγωγή αντισωμάτων, πολλές φορές με υψηλό τίτλο. Τέλος, η συνδυασμένη χορήγηση μιας ουσίας με ενισχυτές οδηγεί σε έντονη άνοση απάντηση. Τα μόρια που διαθέτουν ανοσογονικότητα και αντιγονικότητα είναι συνήθως μακρομόρια όπως πρωτείνες ή πολυσακχαρίτες, χωρίς ωστόσο να αποκλείονται και άλλες κατηγορίες ουσιών. Ειδικότερα, για την μοριακή φύση των αντιγόνων θα εξετάσουμε την ανοσογονοτικότητα των κυριότερων κατηγοριών μακρομορίων (Kuby 1998). Πρωτεΐνες. Όλες σχεδόν οι πρωτεΐνες είναι ανοσογόνα, με αποτέλεσμα να διεγείρεται συχνότερα η ανοσιακή απάντηση έναντι των πρωτεϊνών. Επιπλέον, όσο πιο πολύπλοκη είναι η δομή τους, τόσο πιο ισχυρή είναι η ανοσιακή απάντηση που διεγείρουν. Τέλος, οι 22

πρωτεΐνες είναι ισχυρότερα ανοσογόνα από τους πολυσακχαρίτες και τα μόνα ανοσογόνα που επάγουν κυτταρική άνοση απάντηση. Πολυσακχαρίτες. Οι πολυσακχαρίτες μπορεί να είναι, σε ορισμένες περιπτώσεις, ανοσογόνα. Έτσι, οι πολυσακχαρίτες που αποτελούν τμήμα ενός πολύπλοκου μορίου, όπως είναι οι γλυκοπρωτεΐνες που εκφράζονται στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης, διεγείρουν την ανοσιακή απάντηση, μέρος της οποίας κατευθύνεται ειδικά έναντι του πολυσακχαριδικού τμήματος των γλυκοπρωτεϊνών. Πολυσακχαρίτες που βρίσκονται σε διάφορους μικροοργανισμούς και ευκαρυωτικά κύτταρα μπορούν να διεγείρουν το χυμικό σκέλος της ανοσιακής απάντησης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα της ανοσογονικότητας των πολυσακχαριτών είναι η ανοσιακή απάντηση που διεγείρεται έναντι των αντιγόνων του συστήματος των ομάδων αίματος ΑΒΟ. Τα αντιγόνα των ομάδων αίματος ΑΒΟ είναι πολυσακχαρίτες που εκφράζονται στην επιφάνεια των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Λιπίδια. Τα λιπίδια σπάνια είναι ανοσογόνα. Η ανοσιακή απάντηση έναντι των λιπιδίων μπορεί να διεγερθεί μόνο στη περίπτωση που αυτά συνδέονται με κάποια πρωτεΐνη φορέα. Νουκλεΐνικά οξέα. Τα νουκλεϊνικά οξέα λειτουργούν ως ανοσογόνα, μόνο αν είναι συνδεδεμένα με πρωτεΐνες φορείς. Έτσι, το DNA δεν είναι συνήθως ανοσογόνο, όταν βρίσκεται στη φυσική ελικοειδή μορφή του. Έχουν όμως αναφερθεί καταστάσεις διέγερσης της ανοσιακής απάντησης από τα νουκλεϊνικά οξέα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ανίχνευση anti DNA αντισωμάτων σε ασθενείς που πάσχουν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus, SLE). Απτίνες. Οι απτίνες (haptens) είναι μικρές χημικές ενώσεις που συνήθως φέρουν στο μόριό τους έναν ή περισσότερους κλειστούς δακτυλίους, συνήθως βενζολικούς ή ιμιδαζολικούς. Οι απτίνες προσκολλώνται εύκολα πάνω σε πρωτεϊνικά μακρομόρια και συνδέονται μαζί τους με χημικό δεσμό που αναπτύσσεται μεταξύ ελεύθερων δραστικών αμινομάδων ή καρβοξυλομάδων του μορίου τους και ορισμένων αμινοξέων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας ιδιαίτερα της λυσίνης. Κατά τις ανοσολογικές αντιδράσεις ιδιαίτερη σημασία έχει το ακριβές τμήμα του αντιγόνου που αναγνωρίζεται ή αντιγονικός επίτοπος. Ως αντιγονικός καθοριστής ή επίτοπος (antigenic determinant or epitope) ορίζεται η ανοσοδραστική περιοχή του αντιγονικού μορίου που έχει την ικανότητα να συνδέεται με τα κυκλοφορούντα αντισώματα, τις επιφανειακές ανοσοσφαιρίνες των Β λεμφοκυττάρων ή τον υποδοχέα των T λεμφοκυττάρων. Δυνητικά, κάθε περιοχή της επιφάνειας ενός μακρομορίου μπορεί να λειτουργήσει ως επίτοπος και, κατά συνέπεια, κάθε μακρομόριο περιέχει μεγάλο αριθμό επιτόπων. 23

Στα πρωτεϊνικής φύσης αντιγόνα διακρίνουμε δύο είδη αντιγονικών επιτόπων (Abbas et al. 2003): i) o διαμορφωτικός ή ασυνεχής επίτοπος (conformational ή discontinuous epitope) αποτελείται από αλληλουχία αμινοξέων που έχουν ασυνεχή διάταξη στην πολυπεπτιδική αλυσίδα, όταν η πρωτεΐνη βρίσκεται σε πρωτοταγή δομή. Αυτή η ασυνεχής διάταξη γίνεται συνεχής και διαμορφώνει τον επίτοπο κατά τη διαδικασία ωρίμανσης της πρωτεΐνης ώστε να αποκτήσει την τελική τρισδιάστατη δομή της (π.χ. μετά από φωσφορυλιώσεις ή πρωτεόλυση, δηλαδή μετά από αντιδράσεις που αλλάζουν τη στερεοδομή των πρωτεϊνών) ii) o συνεχής ή γραμμικός (continuous ή linear epitope) επίτοπος αποτελείται από αλληλουχία αμινοξέων που βρίσκονται σε συνεχή διάταξη στην πολυπεπτιδική αλυσίδα. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι το μέγεθος ενός επιτόπου που συνδέεται με την πλευρά σύνδεσης ενός αντισώματος έχει μήκος περίπου 5 7 αμινοξέα. Αντίθετα, οι επίτοποι που συνδέονται με τα T λεμφοκύτταρα έχουν μεγαλύτερο μέγεθος (περίπου 10 15 αμινοξέα). Στα σακχαρικά αντιγόνα, οι επίτοποι σχηματίζονται από 4 6 μονοσάκχαρα σε συνεχή ή πλευρική σύνδεση. Τα συνηθέστερα μονοσάκχαρα είναι η γλυκόζη, η γαλακτόζη, η φουκόζη, η γλυκοζαμίνη και ηγαλακτοζαμίνη. Τέτοιες μικρές ετεροσακχαρικές άλυσοι βρίσκονται συνήθως πάνω σε άλλα μεγάλα πολυσακχαρικά μόρια ή πάνω σε πρωτεϊνες (γλυκοπρωτεϊνες), ή ακόμη και σε λιπίδια (γλυκολιπίδια)(kuby 1998). Εκτός από τη διάκριση των αντιγόνων βάσει της μοριακής τους σύστασης, τα αντιγόνα διακρίνονται ανάλογα με την προέλευσή τους σε εξωγενή, ενδογενή και αυτοαντιγόνα. Εξωγενή είναι όλα τα αντιγόνα στο εξωτερικό περιβάλλον που εισβάλουν στον οργανισμό και τα οποία ο οργανισμός καταπολεμά με τους μηχανισμούς της έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσίας. Ενδογενή καλούνται τα αντιγόνα που παράγονται μέσα στα φυσιολογικά κύτταρα ως αποτέλεσμα του κυτταρικού μεταβολισμού ή λόγω ιικής ή ενδοκυτταρικής βακτηριακής λοίμωξης. Τμήματα των ενδογενών αντιγόνων παρουσιάζονται στην κυτταρική επιφάνεια σε συνδυασμό με αντιγόνα MHC της τάξης I, αναγνωρίζονται από CTL κύτταρα με αποτέλεσμα την θανάτωση των μολυσμένων κυττάρων. Τα CTL κύτταρα μέσω της ανοχής απομακρύνονται άμεσα από το ρεπερτόριο ώστε να μην στραφούν εναντίον υγιών εαυτών κυττάρων. Τέλος, με τον όρο αυτοαντιγόνα αναφερόμαστε σε κάθε φυσιολογικό μόριο (πρωτεΐνη, DNA, RNA) το οποίο αναγνωρίζεται ως «εαυτό» από το ανοσοποιητικό σύστημα και με ειδικούς μηχανισμούς (ανοχή, κλωνική απαλοιφή, διόρθωση υποδοχέα) αποκλείονται από το φυσιολογικό ρεπερτόριο κύτταρα που θα μπορούσαν να στραφούν εναντίον του (αυτοαντιδραστικά κύτταρα). Οι μηχανισμοί αυτοί επιτήρησης των αυτοαντιδραστικών κυττάρων διαταράσσονται σε παθολογικές καταστάσεις (αυτοάνοσα νοσήματα)(kuby 1998). 24

Επίσης, τα αντιγόνα διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες ανάλογα με τον τύπο της άνοσης απάντησης που επάγουν (Janeway et al. 2004): στα θυμοεξαρτώμενα (TD) και στα θυμοανεξάρτητα (TI). Όλα τα θυμοεξαρτώμενα αντιγόνα, είναι αντιγόνα πρωτεϊνικής φύσεως που επάγουν την παραγωγή αντισωμάτων με προϋποθέση την αναγνώριση και τη μεσολάβηση των Τ λεμφοκυττάρων. Τα θυμοανεξάρτητα αντιγόνα είναι κυρίως μη πρωτεϊνικά αντιγόνα που επάγουν την παραγωγή αντισωμάτων από τα Β κύτταρα χωρίς την παρουσία βοηθητικών Τ κυττάρων. Η απάντηση στα αντιγόνα αυτά είναι ιδιαίτερα χαρακτηριστική σε ορισμένες περιοχές του λεμφικού ιστού όπως η οριακή ζώνη του σπληνός. Επίσης, χαρακτηρισικό των TI αντιγόνων είναι η έκκριση κυρίως IgM αντισωμάτων και η απουσία κυττάρων μνήμης. Τα θυμοανεξάρτητα αντιγόνα διακρίνονται περεταίρω σε δύο τύπους: i) Θυμοανεξάρτητα αντιγόνα τύπου 1, (TI 1) όπως οι βακτηριακοί λιποπολυσακχαρίτες, που είναι πλήρως ανεξάρτητα από τα Τ λεμφοκύτταρα και σε υψηλές συγκεντρώσεις έχουν τη δυνατότητα πολυκλωνικής (μη ειδικής) ενεργοποίησης των Β λεμφοκυττάρων ii) Θυμοανεξάρτητα αντιγόνα τύπου 2, (TI 2) όπως μερικά πολυμερή αντιγόνα (πολυσακχαρίτες, πολυμερή των D αμινοξέων,δεξτράνες, φικόλη) τα οποία απαιτούν την παρουσία μικρού αριθμού Τ κυττάρων και τον σχηματισμό κάποιων κυτταροκινών. Τα T λεμφοκυτταρα προκειμένου να αναγνωρίσουν ένα αντιγόνο θα πρέπει να έχει προηγηθεί επεξεργασία του από ένα APC κύτταρο. Στη συνέχεια, ο «επεξεργασμένος» επίτοπος συνδέεται με ένα αντιγόνο ιστοσυμβατότητας και, τελικά, το σύμπλεγμα αυτό εκφράζεται στην επιφάνεια του APC κυττάρου. Οι «επεξεργασμένοι» επίτοποι αποτελούν μετουσιωμένες εσωτερικές γραμμικές υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνών. Οι τυπικοί πολυσακχαρίτες δεν έχουν τέτοιες περιοχές και έτσι, δεν συνδέονται με τον υποδοχέα των T λεμφοκυττάρων. Για αυτό οι πολυσακχαρίτες περιέχουν επιτόπους που αναγνωρίζονται μόνο από τα Β λεμφοκύτταρα, ενώ αντίθετα, οι πρωτεΐνες περιέχουν επιτόπους που αναγνωρίζονται από τα Β και τα Τ λεμφοκύτταρα. Συνεπώς, η χυμική ανοσία είναι προσαρμοσμένη για την αναγνώριση μιας τεράστιας ποικιλίας επιτοπίων, που βρίσκονται στην επιφάνεια βακτηρίων και ιών, ή είναι τμήματα διαλυτών. Αντίθετα, η κυτταρική ανοσία αναγνωρίζει επιτόπια που παρουσιάζονται μαζί με μόρια MHC στην επιφάνεια των κυττάρων του οργανισμού και είναι μοναδικά προσαρμοσμένη για την αναγνώριση ξένων μοσχευμάτων καθώς και τροποποιημένων εαυτών κυττάρων, όπως κύτταρα μολυσμένα από ιό και καρκινικά κύτταρα. Τέλος, ειδική κατηγορία αντιγόνων είναι και τα υπεραντιγόνα (superantigens) (Editors Kotb et al. 2008, Sundberg et al. 2007). Τα υπεραντιγόνα διαφέρουν από τα συμβατικά αντιγόνα γιατί 25

αναγνωρίζονται από αλληλουχίες έξω από τις συμβατικές θέσεις σύνδεσης τόσο του TCR όσο και του MHC. Η σύνδεση επιτρέπει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων κατά μη ειδικό τρόπο (Εικόνα 6Α). Ειδικότερα, τα υπεραντιγόνα έχουν την ικανότητα να διεγείρουν μαζικά όλα τα Τ + λεμφοκύτταρα που φέρουν μια συγκεκριμένη αλληλουχία της β αλυσίδας του ΤCR (Vβ2 T λεμφοκύτταρα) και όχι μόνο εκείνα των οποίων ο υποδοχέας παρουσιάζει δομική ομοιότητα με το υπεραντιγόνο. H μη ειδική ενεργοποίηση πραγματοποιείται λόγω της άμεσης μη ειδικής σύνδεσης στη συγκεκριμένη περιοχή της Vβ αλυσίδας του TCR. Τα υπεραντιγόνα δρουν ως ισχυρά μιτογόνα και επάγουν τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων ακόμα και σε εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις. Η μαζική διέγερση των Τ λεμφοκυττάρων έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση μεγάλης ποσότητας προφλεγμονωδών κυτταροκινών (TNF a, IL 1β, IL 6) που προκαλούν πυρετό, πτώση της αρτηριακής πίεσης και εκτεταμένη καταστροφή των ιστών. Μελέτες έχουν συνδέσεις υπεραντιγόνα με ασθένειες όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας, ο διαβήτης, το σύνδρομο Kawasaki, το AIDS, o ρευματοειδής πυρετός, τροφικές δηλητηριάσεις και το σύνδρομο του τοξικού shock. Aπό τα καλύτερα χαρακτηρισμένα υπεραντιγόνα είναι οι τοξίνες των βακτηρίων Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes και Peptostreptococcus magnus (Εικόνα 6Β)( Sundberg et al. 2007, Janeway et al. 2004). Εικόνα 6. Aναγνώριση υπεραντιγόνου: Α. Μη συμβατική θέση αναγνώρισης των βακτηριακών και ιικών υπεραντιγόνων από την β αλυσίδα του TCR. Β. Πρόσδεση δύο κοινών υπεραντιγόνων, της σταφυλοκοκκικής πρωτείνης (spa) και της πρωτείνης του P. Magnus (ppl) και συσχέτιση με την θέση σύνδεσης ενός συμβατικού αντιγόνου. 26

1.2 Η κυτταρική ανοσία Η ανοσία, που πραγματοποιείται με την παρέμβαση των κυττάρων, αποτελεί την κύρια άμυνα του οργανισμού, έναντι ενδοκυττάρια αναπτυσσόμενων παθογόνων μικροοργανισμών όπως είναι οι ιοί, μερικά βακτήρια, οι μύκητες και τα πρωτόζωα, αλλά, υπεισέρχεται σε μεγάλο βαθμό στην απόρριψη αλλογενών μοσχευμάτων. Η κυτταρική ανοσία, παίζει, επίσης, βασικό ρόλο στην άμυνα έναντι του καρκίνου τόσο σε επίπεδο ανοσοεπιτήρησης της καρκινογένεσης, όσο και σε επίπεδο κυτταροτοξικής αντίδρασης έναντι των νεοπλασματικών κυττάρων (Colombo et al. 1998, Kuby 1998) Αντίθετα με τη χυμική ανοσία που στηρίζεται στην παραγωγή ειδικών αντισωμάτων από τα Β κύτταρα και πλασματοκύτταρα, η κυτταρική ανοσία περιλαμβάνει τη δράση των αντιγονοειδικών Τ λεμφοκυττάρων καθώς και κυττάρων, που δεν είναι αντιγονοειδικά όπως τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα και τα ΝΚ κύτταρα. Ακόμη μια μεγάλη ποικιλία διαλυτών παραγόντων (κυτταροκίνες) συμμετέχουν στην κυτταρική ανοσία. 1.2.1 T λεμφοκύτταρα Τα Τ κύτταρα είναι λεμφοκύτταρα που προέρχονται από το μυελό των οστών. Κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ζωής οι προβαθμίδες των Τ κυττάρων μεταναστεύουν από το μυελό και φθάνουν με την κυκλοφορία στο θυμό όπου και εγκαθίστανται. Στο θυμικό μικροπεριβάλλον, τα μητρικά αυτά Τ κύτταρα διαφοροποιούνται για να γίνουν τελικά λειτουργικά ώριμα Τ κύτταρα. Οι μηχανισμοί που ελέγχουν τη διαφοροποίηση των Τ κυττάρων μέσα στο θυμό παραμένουν ακόμη κατά μεγάλο μέρος άγνωστοι. Φαίνεται, ωστόσο, ότι στη διαφοροποίηση αυτή εμπλέκονται διάφορες κυτταροκίνες, περιλαμβανομένων των IL 1, IL 2, IL 4 και IL 7. Διαλυτοί θυμικοί παράγοντες έχουν, επίσης, περιγραφεί όπως η θυμοσίνη, η θυμοποιητίνη και ο θυμικός παράγοντας του ορού (facteur thymique serique) (Roitt et al. 2001). Κατά την οντογένεση τα Τ κύτταρα στο θύμο αποκτούν ανοσοανοχή. Μετά την ωρίμανση τους τα λειτουργικά ώριμα Τ κύτταρα αφήνουν το θύμο και μεταναστεύουν με την αιματική κυκλοφορία στις παραφλοιώδεις ζώνες των λεμφαδένων και τον λευκό πολφό του σπλήνα. Τα Τ κύτταρα μπορούν να χωρισθούν σε δυο διακριτές υποκατηγορίες με βάση τη δομή του υποδοχέα τους για το αντιγόνο (ΤCR). Στην πρώτη, όπου ανήκουν και τα περισσότερα, τα Τ κύτταρα εκφράζουν στη μεμβράνη τους έναν 90kD υποδοχέα για το αντιγόνο, τον TCR2, με δυο πολυπεπτιδικές αλυσίδες, των 45kD η καθεμία, τις α και β, συγκρατούμενες μεταξύ τους με δισουλφιδικό δεσμό. Στην άλλη υποκατηγορία, όπου ανήκουν πολύ λιγότερα κύτταρα, τα Τ 27

κύτταρα εκφράζουν στη μεμβράνη τους έναν 80kD υποδοχέα για το αντιγόνο, τον TCR1, με δυο πολυπεπτιδικές αλυσίδες των 45kD και 35kD αντίστοιχα, τις γ και δ. Η λειτουργία αυτής της υποκατηγορίας Τ κυττάρων είναι ακόμη ασαφής (Kuby 1998). H διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων Ο θύμος είναι απαραίτητος για την διαφοροποίηση των ανώριμων προγονικών Τ κυττάρων σε κύτταρα που έχουν τα χαρακτηριστικά των ώριμων Τ λεμφοκυττάρων. Έτσι, παιδιά που γεννιούνται χωρίς θύμο αδένα (σύνδρομο DiGeorge) δεν έχουν ώριμα Τ λεμφοκύτταρα. Η διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων στον θύμο είναι περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια (Goldsby et al. 2000): Προγονικά ανώριμα Τ λεμφοκύτταρα (θυμοκύτταρα, thymocytes) εισέρχονται στον φλοιό του θύμου, όπου αρχίζει ο ανασυνδυασμός των γονιδίων του TCR υποδοχέα (προ Τλεμφοκύτταρα). Επίσης, τα ανώριμα Τ λεμφοκύτταρα, όταν εισέρχονται στον θύμο, δεν εκφράζουν τα περισσότερα από τα μόρια επιφανείας που είναι χαρακτηριστικά των ώριμων Τ λεμφοκυττάρων. Κύτταρα που εκφράζουν το γδ ετεροδιμερές μόριο του TCR υποδοχέα διαχωρίζονται από εκείνα που εκφράζουν το αβ ετεροδιμερές μόριο του TCR υποδοχέα. Δεν είναι ακόμα γνωστές πολλές λεπτομέρειες που αφορούν την διαφοροποίηση των γδ Τ λεμφοκυττάρων, ενώ, αντίθετα, είναι περισσότερα γνωστά για τα στάδια διαφοροποίησης των αβ Τ λεμφοκυττάρων. Τα διαφοροποιημένα Τ λεμφοκύτταρα εισέρχονται στον μυελό του θύμου. Καθώς τα Τ λεμφοκύτταρα μετακινούνται από τον φλοιό στον μυελό γίνονται περισσότερο ώριμα. Δηλαδή, εκφράζουν στην επιφάνεια της κυτταρικής τους μεμβράνης τον TCR υποδοχέα, καθώς και κάποια άλλα μόρια, ενώ παράλληλα, χάνουν αρκετά άλλα μόρια. Τα ώριμα Τ λεμφοκύτταρα εγκαταλείπουν τον θύμο και εισέρχονται στην κυκλοφορία, έτοιμα να αντιμετωπίσουν τα ξένα αντιγόνα. Σε όλα τα στάδια της διαφοροποίησης τους στον θύμο τα Τ λεμφοκύτταρα έρχονται σε στενή επαφή με τα κύτταρα του στρώματος του θύμου (stromal cells of thymus). Τα κυριότερα από αυτά τα κύτταρα είναι τα επιθηλιακά κύτταρα του θύμου και τα διαπλεκόμενα δενδριτικά κύτταρα που είναι APC κύτταρα. Τα προγονικά ανώριμα Τ λεμφοκύτταρα που εισέρχονται στον θύμο δεν εκφράζουν τα περισσότερα από τα χαρακτηριστικά για τα Τ λεμφοκύτταρα μόρια επιφανείας. Αργότερα, κατά την επαφή τους με κύτταρα του στρώματος του θύμου, διεγείρεται ο πολλαπλασιασμό τους, η διαφοροποίηση τους και η έκφραση των πρώτων χαρακτηριστικών για τα Τ 28

λεμφοκύτταρα μορίων επιφανείας. Στο τέλος της φάσης αυτής, περίπου μετά από μια εβδομάδα, τα ανώριμα θυμοκύτταρα δεν εκφράζουν κανένα από τα χαρακτηριστικά μόρια των ώριμων Τ λεμφοκυττάρων, δηλαδή τα μόρια επικουρικά μόρια CD4, CD8 και τον TCR υποδοχέα (CD3 και αβ αλυσίδες). Για το λόγο αυτό ονομάζονται «διπλά αρνητικά» θυμοκύτταρα (Εικόνα 7) (Kuby 1998). Εικόνα 7. H διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων (Kuby 1998). Η ωρίμανση των αβ Τ λεμφοκυττάρων περνάει από διάφορα στάδια, όπου εκφράζονται στο ίδιο κύτταρο και τα δύο μόρια CD4 και CD8, ενώ αργότερα, εκφράζονται χαμηλά επίπεδα του TCR υποδοχέα. Τα κύτταρα αυτά ονομάζονται «διπλά θετικά» κύτταρα. Τα περισσότερα κύτταρα (>95%) πεθαίνουν στον θύμο μόλις γίνουν μικρά «διπλά θετικά» κύτταρα. 29

Τα κύτταρα εκείνα των οποίων οι TCR υποδοχείς συνδέονται με χαμηλή ένταση με το MHC μόριο, χάνουν το CD4 ή CD8 μόριο. Τα κύτταρα αυτά, αφού ωριμάσουν, εισέρχονται στη κυκλοφορία. Συνοπτικά, η ωρίμανση προς αβ Τ λεμφοκύτταρα περιλαμβάνει τις ακόλουθες φάσεις: CD3 CD4 CD8 διπλά αρνητικά κύτταρα CD3 CD4+CD8+διπλά θετικά κύτταρα σε CD3+CD4+CD8+ διπλά θετικά κύτταρα CD3+CD4+CD8 ή CD3+CD4 CD8+ θετικά κύτταρα (Εικόνα 7) (Kuby 1998). Το επόμενο βήμα στην ωρίμανση των Τ λεμφοκυττάρων στον θύμο, ύστερα από την έκφραση στην κυτταρική τους μεμβράνη των μορίων TCR, CD4 και CD8, είναι η επιλογή εκείνων των κυττάρων που θα αποτελέσουν το ρεπερτόριο των ώριμων Τ λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια. Η σύνδεση TCR MHC μπορεί να διευκολύνει την ωρίμανση, την επιβίωση, την διαφοροποίηση ή τον Εικόνα 8. Θετική και αρνητική επιλογή θάνατο των Τ λεμφοκυττάρων. Έτσι, η των θυμοκυττάρων. επιλογή των αβ CD4+CD8+ Τ λεμφοκυττάρων στον θύμο χωρίζεται σε δύο φάσεις, γνωστές σαν θετική επιλογή (positive selection) και αρνητική επιλογή (negative selection) (Εικόνα 8). Θετική επιλογή είναι η διαδικασία κατά την οποία επιβιώνουν μόνο τα Τ λεμφοκύτταρα εκείνα των οποίων ο TCR υποδοχέας τους συνδέεται με χαμηλή ένταση με το σύμπλεγμα «εαυτό» πεπτίδιο/«εαυτό» MHC μόριο (Kuby 1998, Goldsby et al. 2000). Στη περίπτωση που το σύμπλεγμα «εαυτό» πεπτίδιο/ «εαυτό» MHC μόριο δεν αναγνωρίζεται από τον TCR υποδοχέα, αυτό θα έχει σαν συνέπεια τον θάνατο των θυμοκυττάρων, με μια διαδικασία που ονομάζεται απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος. Με τον τρόπο αυτό απομακρύνονται όλα εκείνα τα Τ λεμφοκύτταρα, τα οποία θα ήταν αδύνατο να αναγνωρίσουν 30

τα «εαυτά» MHC μόρια στην περιφέρεια, αφού όλα τα APCs κύτταρα στην περιφέρεια εκφράζουν «εαυτά» MHC μόρια. Κατά την θετική επιλογή επιβιώνουν Τ λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν ξένα αντιγόνα, «εαυτά» MHC μόρια, καθώς και μερικά Τ λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν «εαυτά» αντιγόνα (Kuby 1998). Κατά την αρνητική επιλογή, οι κλώνοι των Τ λεμφοκυττάρων, των οποίων ο TCR υποδοχέας τους συνδέεται με πολύ υψηλή ένταση με το σύμπλεγμα «εαυτό» πεπτίδιο/«εαυτό» MHCμόριο, οδηγούνται σε απόπτωση ή αδρανοποιούνται. Εάν επιτρεπόταν στα κύτταρα αυτά να βγουν από τον θύμο και να μπουν στην κυκλοφορία, αυτό θα είχε σαν αποτέλεσμα την ανάπτυξη αυτοανοσίας. Η διαδικασία της αρνητικής επιλογής γίνεται κατά τη μετάβαση των θυμοκυττάρων από τον φλοιό στον μυελό του θύμου. Τα «εαυτά» πεπτίδια παρουσιάζονται από «εαυτά» MHC μόρια που εκφράζονται από ειδικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (δενδριτικά κύτταρα, μακροφάγα) και όχι από επιθηλιακά κύτταρα, όπως συμβαίνει κατά την θετική επιλογή. Μερικά αυτοδραστικά Τ λεμφοκύτταρα ξεφεύγουν από τη διαδικασία της αρνητικής επιλογής. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι όλα τα «εαυτά» αντιγόνα δεν μπορούν να φτάσουν στον θύμο, επειδή το επιθήλιο του θύμου πιθανώς να δρα σαν φίλτρο που περιορίζει την είσοδο μερικών κυκλοφορούντων «ίδιων» αντιγόνων στον θύμο. Ωστόσο, ο οργανισμός διαθέτει επιπρόσθετους μηχανισμούς για να προλαμβάνει την εκδήλωση αυτοανοσίας. Η αδρανοποίηση των αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στη περιφέρεια μπορεί να γίνει με δύο μηχανισμούς: i) περιορισμός της έκφραση του TCR υποδοχέα και του CD8 μορίου, με αποτέλεσμα τα Τ λεμφοκύτταρα να μην μπορούν να αντιδράσουν με τα αυτοαντιγόνα ii) ανεργία (anergy), εξαιτίας της έλλειψης «δεύτερου σήματος» από τα κύτταρα στόχους (Εικόνα 8) (Kuby 1998, Janeway et al. 2004). Πολύ σημαντικός μηχανισμός για τη ρύθμιση των παραγόμενων Τ κυττάρων είναι και η απόπτωση. Στον θύμο παράγονται με πολλαπλασιασμό πολύ περισσότερα κύτταρα από εκείνα που τελικά εισέρχονται στην κυκλοφορία. Έτσι, υπολογίζεται ότι πεθαίνει το 90% των Τ λεμφοκυττάρων που αναπτύσσονται στον θύμο. Αυτό μπορεί να συμβεί σε διάφορα στάδια διαφοροποίησης στον θύμο, όπως (Eales 2003): i) όταν αποτυγχάνει ο ανασυνδυασμός των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες αβ ή γδ του TCR υποδοχέα, ii) όταν τα πρόδρομα Τ λεμφοκύτταρα δεν επιλέγονται θετικά και iii) όταν ένα κύτταρο αποκλείεται κατά την «αρνητική» επιλογή, επειδή εκφράζει TCR υποδοχέα που συνδέεται με πολύ υψηλή ένταση με το σύμπλεγμα «ίδιο» πεπτίδιο/«ίδιο» MHC μόριο. Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις, τα κύτταρα απομακρύνονται με μια διαδικασία που ονομάζεται προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος ή απόπτωση (Εικόνα 9). 31

Εικόνα 9. Απόπτωση των θυμοκυττάρων Α). Φυσιολογικά θυμοκύτταρα στο οπτικό μικροσκόπιο Β) Αποπτωτικά θυμοκύτταρα στο οπτικό μικροσκόπιο Γ) Φυσιολογικό θυμοκύτταρο στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης Δ) Αποπτωτικό θυμοκύτταρο στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης [B. A. Osborne and S. Smith, 1997, Journal of NIH Research 9:35; courtesy B. A. Osborne, University of Massachusetts at Amherst.] Οι κατηγορίες των Τ λεμφοκυττάρων Όπως έχουμε αναφέρει, τα Τ λεμφοκύτταρα διαφοροποιούνται σε αβ και γδ, ανάλογα με τις αλυσίδες που απαντώνται στον TCR υποδοχέα. Τα γδ Τ λεμφοκύτταρα ανευρίσκονται στον άνθρωπο σε μικρότερη αναλογία, σε σχέση με τα αβ Τ λεμφοκύτταρα. Ειδικότερα, ο αβ TCR εκφράζεται στο 95% των κυκλοφορούντων T λεμφοκυττάρων, καθώς και στα T λεμφοκύτταρα που βρίσκονται στον θύμο. Αντίθετα, τα γδ T λεμφοκύτταρα ανευρίσκονται σε μικρό ποσοστό στον θύμο και στα περιφερικά λεμφικά όργανα ενώ εμφανίζονται στον θύμο πολύ νωρίτερα από τα αβ Τ λεμφοκύτταρα (Εικόνα 10) (Janeway et al. 2004). Τα αβ Τ λεμφοκύτταρα είναι κυρίως υπεύθυνα για την κυτταρική ανοσία και ταξινομούνται περεταίρω σε δύο κατηγορίες ανάλογα με την έκφραση των επικουρικών μορίων (CD4/CD8)σε CD4+ T λεμφοκύτταρα ή Τ βοηθητικά (Th) και σε CD8+ T λεμφοκύτταρα ή κυτταροτοξικά Τ κύτταρα (CTL). Η ενεργοποίηση των CD4+Τ κυττάρων έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μεσολαβητών μηνυμάτων που είναι απαραίτητα για την εκδήλωση των κυτταροεξαρτώμενων ανοσιακών αντιδράσεων, για την διαφοροποίηση των Β κυττάρων σε κύτταρα που παράγουν αντισώματα και, γενικότερα, για τη ρύθμιση της λειτουργίας των Τ και Β κυττάρων, των 32

μονοκυττάρων μακροφάγων καθώς και κυττάρων του ανοσοποητικού συστήματος. Η επίδραση των CD4+Τ κυττάρων στην διαφοροποίηση των Β κυττάρων επιτυγχάνεται, επίσης, και με την άμεση επαφή των δύο κυτταρικών πληθυσμών, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την άμεση διέγερση των υποδοχέων των Β κυττάρων και την έκθεση τους σε υψηλές συγκεντρώσεις κυτταροκινών που παράγονται από τα Τ κύτταρα. Εικόνα 10. Θυμοκύτταρα γδ και αβ κατά την εμβρυική και ενήλικη ζωή (Kuby 1998) Τα κυτταροτοξικά ή κυτταρολυτικά Τ κύτταρα (CD8+, CTL) απαντούν στο αντιγονικό ερέθισμα καταστρέφοντας το κύτταρο που παρουσιάζει το αντιγόνο. Τα CΤL αναγνωρίζουν τα πεπτίδια που παράγονται από την ενδογενή οδό επεξεργασίας του αντιγόνου και παρουσιάζονται σε σύνδεση με τα τάξης Ι MHC μόρια. Αποτελούν βασικό μηχανισμό άμυνας έναντι των ιών αλλά και άλλων ενδοκυττάριων παθογόνων, όπως τα μυκοβακτηρίδια, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην απόρριψη του αλλογενών μοσχευμάτων και συμβάλλουν στην ανοσοεπικράτηση έναντι των κακοήθων κυττάρων. Η ανάπτυξη της κυτταρολυτικής δράσης, κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των κυτταρολυτικών κυττάρων είναι αποτέλεσμα συνδυασμού της αναγνώρισης του αντιγόνου και έκθεση στην IL 2 και χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση κυτταροπλασματικών κοκκίων που περιέχουν περφορίνη και ένζυμα της οικογένειας των πρωτεασών της σερίνης. Κατά τη διάρκεια της αναγνώρισης, το περιεχόμενο των κοκκίων απελευθερώνονται προς την κατεύθυνση του κυττάρου στόχου, πάνω στην μεμβράνη του οποίου η περφορίνη σχηματίζει πόρους 10 20nm. Δια των πόρων αυτών, εισέρχονται στο κύτταρο στόχο τα ένζυμα των 33

κοκκίων που διεγείρουν το μηχανισμό απόπτωσης και το θάνατο του κυττάρου (Janeway et al. 2004). Ένας μικρός αριθμός, τόσο των Τh, όσο και των CTL, μετά την επαφή τους με το αντιγόνο μετατρέπονται σε Τ κύτταρα μνήμης, συμβάλλοντας έτσι καθοριστικά στην εκδήλωση της ανοσιακής μνήμης που αποτελεί βασικό γνώρισμα της προσαρμοστικής ειδικής άνοσης απάντησης. Οι διαφορές των Τ κυττάρων μνήμης από τα παρθένα Τ κύτταρα και τα βοηθητικά κύτταρα είναι (Abbas et al. 2003): τα Τ κύτταρα μνήμης παραμένουν στον οργανισμό επί σειρά ετών (20 30 χρόνια έναντι μερικών εβδομάδων των παρθένων), ως αποτέλεσμα είτε μεγαλύτερης επιβίωσης είτε της ικανότητας τους να αυτοανανεώνονται. τα Τ κύτταρα μνήμης απαντούν στο αντιγονικό ερέθισμα με παρατεταμένη αύξηση του αριθμού των Τ κυττάρων που εκφράζουν TCR ειδικό για το συγκεκριμένο αντιγόνο. τα βοηθητικά Τ κύτταρα μνήμης πολλαπλασιάζονται ταχύτερα, παράγουν ευρύτερο φάσμα κυτταροκινών και εκδηλώνουν αποτελεσματικότερη βοηθητική δράση, μετά την επαφή τους με το αντιγόνο, απ' ότι από τα παρθένα. τα Τ κύτταρα μνήμης παρουσιάζουν έναν ιδιαίτερο τρόπο ματίσματος του mrna του CD45, ο οποίος οδηγεί στην παραγωγή ισοτύπων του μορίου οι οποίοι διαφέρουν από εκείνους που εκφράζουν τα παρθένα Τ κύτταρα, τόσο στο μέγεθος όσο και την σύσταση των εξωκυττάριων πεδίων. Έτσι, ενώ τα παρθένα Τ κύτταρα εκφράζουν ισότυπους 205 220 kd (CD45RA), τα Τ κύτταρα μνήμης εκφράζουν ισότυπους 180 kd (CD45RO). τα Τ κύτταρα μνήμης εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα μορίων προσκόλλησης, που τους επιτρέπουν την ισχυρότερη προσκόλληση τους στα APCs και τα καθιστούν ικανά να απαντούν σε μικρότερες συγκεντρώσεις αντιγόνου. Αναφορικά με την λειτουργία των γδ Τ λεμφοκυττάρων λίγα πράγματα είναι γνωστά. Τα κύτταρα αυτά δεν συμμετέχουν στην άνοση απάντηση έναντι ενός μεγάλου φάσματος πρωτεϊνικών αντιγόνων, λίγα εκφράζουν το CD4 μόριο, ενώ τα περισσότερα εκφράζουν το CD8 και υπάρχουν τουλάχιστο δύο διαφορετικοί υποπληθυσμοί (Pier et al. 2004). Οι υποπληθησμοί αυτοί των γδ Τ λεμφοκυττάρων μεταναστεύουν σε διάφορα σημεία του σώματος: επιθήλιο της επιδερμίδας, του εντέρου, των πνευμόνων, της μήτρας και της γλώσσας. Μερικά γδ Τ λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται από υπεραντιγόνα (superantigens), μερικά άλλα απαντούν στις πρωτεΐνες του θερμικού σοκ (heat shock proteins) ενώ κάποια γδ Τ λεμφοκύτταρα μπορεί να μην απαντούν στο σύμπλεγμα πεπτίδιο/τάξης Ι ή ΙΙ MHC μόριο. 34

Γενικά, τα γδ T λεμφοκύτταρα φαίνεται να αποτελούν την πρώτη γραμμή άμυνας έναντι μερικών βακτηρίων, αναγνωρίζοντας πεπτίδια από βακτήρια που παρουσιάζονται από μηκλασσικά MHC αντιγόνα, όπως είναι τα CD1 αντιγόνα. Πρόσφατα δεδομένα προτείνουν ότι τα γδ Τ λεμφοκύτταρα μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα έναντι μερικών παρασίτων, όπως είναι το πλασμώδιο της ελονοσίας, Plasmodium yoelii (Pier et al. 2004). Ο Τ κυτταρικός υποδοχέας (ΤCR) Κάθε T λεμφοκύτταρο φέρει στην επιφάνεια της κυτταρικής του μεμβράνης περίπου 30.000 υποδοχείς. Κάθε TCR υποδοχέας αποτελείται από τρία τμήματα, το ετεροδιμερές αβ ή γδ μόριο, το CD3 και την αλυσίδα ζζ (Εικόνα 11). i) Ετεροδιμερές αβ ή γδ μόριο. Κάθε ετεροδιμερές (αβ ή γδ) μόριο αποτελείται από δύο ειδών γλυκοπρωτεϊνικές αλυσίδες α και β ή γ και δ που συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Κάθε Τ λεμφοκύτταρο μπορεί να εκφράζει το αβ ή το γδ μόριο, όχι όμως και τα Εικόνα 11. Ο Τ κυτταρικός υποδοχέας δύο. Κατά συνέπεια, ένα Τ λεμφοκύτταρο μπορεί να είναι αβ+γδ ή αβ γδ+, αλλά ποτέ δεν μπορεί να είναι αβ+γδ+. Τα αβ και γδ μόρια είναι διαμεμβρανικά μόρια με ένα μικρό ενδοκυτταροπλασματικό τμήμα. Το εξωκυττάριο τμήμα της κάθε αλυσίδας αποτελείται από δύο τμήματα που αντιστοιχούν στα σταθερά (C) και μεταβλητά (V) τμήματα των ανοσοσφαιρινών (Janeway et al. 2004). Τα σταθερά (C) τμήματα έχουν ένα σφαιρικό μόρφωμα (πεδίο, domain), δομής όμοιας με εκείνο των ανοσοσφαιρινών. Η γωνία που σχηματίζουν τα C και V domains διαφέρει μεταξύ των αβ και γδ Τ κυτταρικών υποδοχέων (Εικόνα 12). Η σύνδεση με το αντιγόνο γίνεται στις μεταβλητές (V) περιοχές του μορίου. Στο κέντρο της υπερμεταβλητής περιοχής του αβ μορίου βρίσκεται η συμπληρωματική καθοριστική περιοχή CDR3 (α3 και β3) που παρουσιάζει μεγάλη πολυμορφία, ενώ στην περιφέρεια της υπερμεταβλητής περιοχής του μορίου βρίσκονται οι συμπληρωματικές καθοριστικές περιοχές CDR1 (α1 και α2) και CDR2 (β1 και β2) που συνδέονται με το εξωτερικό τμήμα των α ελίκων του MHC μορίου (Εικόνα 13) (Kuby 1998). 35

Εικόνα 12. Συγκριτική απεικόνιση γδ TCR και αβ ΤCR Ο TCR υποδοχέας τοποθετείται σε διαγώνια διάταξη πάνω από το σύμπλεγμα πεπτίδιο/mhcμόριο, έτσι ώστε οι υπερμεταβλητές περιοχές της TCRα αλυσίδας CDR1 και CDR2 να βρίσκονται πάνω από το αμινοτελικό άκρο του πεπτιδίου, ενώ οι αντίστοιχες περιοχές της TCRβ αλυσίδας να καλύπτουν το καρβοξυτελικό του άκρο. Οι CDR3 περιοχές του TCRαβ μορίου, που βρίσκονται στο κέντρο των μεταβλητών περιοχών τους, συνδέονται με τις προεξέχουσες περιοχές του πεπτιδίου, εξασφαλίζοντας καλύτερη σύνδεση με το πεπτίδιο (Εικόνα 13).Ένα μικρό τμήμα, ανάλογο με την αρθρωτή περιοχή των ανοσοσφαιρινών, συνδέει την κάθε μια αλυσίδα με την μεμβράνη του κυττάρου. Η σύνδεση των δύο αυτών μικρών τμημάτων γίνεται με ενδοαλυσιδικό δισουλφιδικό δεσμό (Eales 2003). Εικόνα 13. Αλληλεπιδράσεις TCR ΜΗC μορίων. 36

Εικόνα 14. Διάταξη των γονιδίων για τις α,δ,β και γ αλυσίδες του TCR στους αντίστοιχους γενετικούς τόπους (Kuby 1998). Τα γονίδια των αλυσίδων του ΤCR βρίσκονται στους γενετικούς τόπους α δ, β και γ στα χρωμοσώματα 14, 6 και 14 του ποντικού αντίστοιχα (Εικόνα 14).Για την παραγωγή των αβ ή γδ αλυσίδων του ΤCR απαιτείται ο ανασυνδυασμός των γονιδίων της μεταβλητής περιοχής (V D J) και η σύνδεση με τη σταθερή περιοχή (Εικόνα 15) (Kuby 1998). Ο ανασυνδυασμός γίνεται με τη δράση ειδικών ενζύμων των RAG1/2 τα οποία δρουν και στον ανασυνδυασμό των Β λεμφοκυττάρων για την παραγωγή των αλυσίδων των αντισωμάτων. Εκτός από τα RAG ένζυμα πλήθος άλλων παραγόντων συμμετέχουν στον μηχανισμό του ανασυνδυασμού. Η παραγωγή λειτουργικής αναδιάταξης είναι προϋπόθεση για την έκφραση λειτουργικού TCR υποδοχέα, ενώ στην αντίθετη περίπτωση το κύτταρο δεν επιλέγεται και αποπίπτει. O ίδιος ο μηχανισμός του δημιουργεί τεράστια ποικιλότητα Τ κυτταρικών υποδοχέων χάρη στο συνδυασμό διαφορετικών V, D, J γονιδίων και στην προσθήκη/αφαίρεση νουκλεοτιδίων στην περιοχή των συμβολών των γονιδίων. 37

Εικόνα 15. Ο ανασυνδυασμός των γονιδίων V, D, J για την παραγωγή των αλυσίδων του TCR (Kuby 1998). ii) Το σύμπλεγμα CD3 Τα αβ και γδ μόρια αναγνωρίζουν το σύμπλεγμα πεπτίδιο/mhc μόριο, χωρίς όμως να έχουν την ικανότητα να μεταβιβάσουν το μήνυμα στο εσωτερικό του κυττάρου. Η μεταβίβαση του μηνύματος στο εσωτερικό του κυττάρου πραγματοποιείται από ένα σύμπλεγμα διαμεμβρανικών πολυπεπτιδίων που σχηματίζουν το CD3 σύμπλεγμα (CD3 complex), το οποίο συνδέεται σταθερά με τα αβ και γδ μόρια. Ειδικότερα, το CD3 σύμπλεγμα σχηματίζεται από τρεις τύπους πολυπεπτιδίων που ονομάζονται γ, δ και ε (με ΜΒ 25, 20 και 20 kda αντίστοιχα) και έχουν ένα εξωκυττάριο, ένα διαμεμβρανικό και ένα ενδοκυτταροπλασματικό τμήμα. Το ενδοκυτταροπλασματικό τμήμα της κάθε μιας αλυσίδας του CD3 συμπλέγματος έχει μια ακολουθία αμινοξέων που ονομάζεται ανοσουποδοχέας ενεργοποίησης της τυροσίνης (immunoreceptor tyrosinw based activation motifs, ITAMs) Κάθε ΙΤΑΜ ακολουθία παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταβίβαση του μηνύματος και αποτελείται από δύο κατάλοιπα τυροσίνης που απέχουν, περίπου, 13 αμινοξέα (Eικόνα 16) (Kuby 1998, Janeway et al. 2004) 38

Εικόνα 16. Σχηματική αναπαράσταση του σύμπλοκου TCR CDR3 όταν ο TCR αποτελείται από αλυσίδες αβ, γε και εδ αντίστοιχα. iii) Διμερής ζζ αλυσίδα Στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης το σύμπλεγμα αβ ή γδ μόριο/cd3 συνδέεται στενά με μια τέταρτη διμερή ζζ αλυσίδα. Άλλη μορφή της ζ αλυσίδας είναι η η αλυσίδα που μπορεί να σχηματίσει ετεροδιμερή μορφή με την ζ αλυσίδα (ζη) ή με άλλη η αλυσίδα (ηη). Κάθε ζ αλυσίδα μπορεί να έχει μικρό εξωκυττάριο τμήμα, έχει όμως μεγάλο ενδοκυτταροπλασματικό τμήμα που φέρει τρεις ΙΤΑΜs ακολουθίες (Janeway et al. 2004) 1.2.2. Άλλα κύτταρα που συμμετέχουν στην κυτταρική ανοσία Μονοκύτταρα / Μακροφάγα - Κύτταρα «Αντιγόνο Παρουσιαστές» (APC) ο σύστημα φαγοκυττάρωσης των μονοπύρηνων/μακροφάγων κυττάρων περιλαμβάνει τα μονοκύτταρα που κυκλοφορούν στο αίμα και τα μακροφάγα που βρίσκονται στους ιστούς (Kuby 1998, Roitt et al. 2001). Τα κύτταρα αυτά προέρχοναται από τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα του μυελού των οστών και όταν εισέλθουν στην κυκλοφορία του αίματος διαφοροποιούνται πλήρως σε ώριμα μονοκύτταρα. Μετά από 8 ώρες περίπου μεταναστεύουν στους ιστούς, όπου και διαφοροποιούνται σε μακροφάγα, με χαρακτηριστικά που εξαρτώνται από τον εκάστοτε ιστό (Εικόνα 17). 39

Εικόνα 17. Α. Πολυάριθμα Τ λεμφοκύτταρα που αλληλεπιδρούν με ένα μακροφάγο. Β. Ένα μακροφάγο που καταπολεμά βακτήρια. Γενικά, το μονοκυτταρικό / μακροφαγικό σύστημα αποτελεί μια οικογένεια οντογενετικά σχετιζόμενων κυττάρων διεσπαρμένων σε ολόκληρο τον οργανισμό, που λειτουργούν ως κύριοι εκφραστές της κυτταρικής ανοσίας. Τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα δεν λειτουργούν μόνο ως δραστικά κύτταρα της φλεγμονής, αλλά συνιστούν και την κύρια άμυνα έναντι πολλών ενδοκυττάρια αναπτυσσόμενων παθογόνων μικροοργανισμών. Πρόσθετα, λειτουργούν ως κύτταρα «αντιγόνο παρουσιαστές» (APC) στην επαγωγή των ανοσολογικών απαντήσεων, και ακόμη απαλλάσσουν τον οργανισμό από τα κατεστραμμένα ή γηρασμένα κύτταρα. Μέσα στη φλεγμονώδη περιοχή, τα μονοπύρηνα μακροφάγα «ενεργοποιούνται» για να γίνουν λειτουργικά δραστικά. Αν και τα κύτταρα αυτά μπορεί να ενεργοποιηθούν με μη ειδικά ερεθίσματα, όπως είναι η βακτηριακή ενδοτοξίνη και τα ανοσοσυμπλέγματα, φαίνεται ότι ο πιο αποτελεσματικός πυροδότης της ενεργοποίησης τους είναι η IFN γ, που εκκρίνεται από το ενεργοποιημένο Τ κύτταρο (Janeway et al. 2004). Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα έχουν αυξημένη ικανότητα στο να προσκολλώνται πάνω στα νεοπλασματικά κύτταρα και να τα θανατώνουν. Αν και ο μηχανισμός λύσης των νεοπλασματικών κυττάρων δεν έχει εν προκειμένω πλήρως ερευνηθεί και ερμηνευθεί, φαίνεται ότι μερικά εκκριτικά προϊόντα των μακροφάγων συμμετέχουν ή επάγουν αυτή τη δραστηριότητα. Πρόκειται για τους δραστικούς μεταβολίτες του οξυγόνου (υπεροξείδιο του υδρογόνου και οξείδιο του αζώτου) και η κυτταρολυτική πρωτεΐνη CP (σερίνη πρωτεάση με λυτική ικανότητα εκλεκτικά, αν και μη αποκλειστικά, κατευθυνόμενη προς τα νεοπλασματικά κύτταρα). Αναφορικά με τον αντιγονοπαρουσιαστικό τους ρόλο, το αρχικό ερέθισμα για την ενεργοποίηση αποτελεί η φαγοκυττάρωση του αντιγόνου, ενώ αύξηση της δράση τους μπορεί να επιτευχθεί με κυτταροκίνες από ενεργοποιημένα Τh λεμφοκύτταρα, από παράγοντες φλεγμονής και προϊόντα κυτταρικών τοιχωμάτων βακτηρίων. Τα ενεργοποιημένα 40

μονοκύτταρα/μακροφάγα εκφράζουν προϊόντα MHC II και χάρη σε αυτά δρουν ως APC κύτταρα (Abbas et al. 2003). Κύτταρα φυσικοί φονείς (ΝΚ κύτταρα) Τα ΝΚ κύτταρα αποτελούν βασικό μηχανισμό της επαγώγιμης ανοσίας έναντι των ιών και των ενδοκυττάριων βακτηρίων (μυκοβακτήρια, Lysteria monocytogenes). Τα ενδοκυττάρια βακτήρια ενεργοποιούν τα ΝΚ κύτταρα είτε άμεσα είτε με τη μεσολάβηση της IL 12 που παράγεται μετά από προηγούμενη ενεργοποίηση των μακροφάγων. Επιπλέον, η IL 12 σε συνεργασία με τον TNF α, επάγει την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων IFN γ από τα ΝΚκύτταρα, συμβάλλοντας έτσι καθοριστικά στον έλεγχο ορισμένων λοιμώξεων, πριν ακόμη λάβει χώρα η ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και η παραγωγή IFN γ από αυτά (Janeway et al. 2004). Εικόνα 18. Ένα ΝΚ κύτταρο επιτείθεται σε ένα καρκινικό κύτταρο Γενικά τα ΝΚ κύτταρα έχουν την ικανότητα να θανατώνουν μια μεγάλη ποικιλία κυττάρωνστόχων, περιλαμβανομένων των νεοπλασματικών κυττάρων (Εικόνα 18), ορισμένων εμβρυϊκών κυττάρων, των μολυσμένων με ιό κυττάρων καθώς και μερικών φυσιολογικών αιμοποιητικών κυττάρων που παρουσιάζουν χαμηλή πυκνότητα επιφανειακών MHC+ αυτολογων πεπτιδίων. Τα ΝΚ κύτταρα διαθέτουν κυτταροπλασματικά κοκκία που περιέχουν περφορίνες και ένζυμα και καταστρέφουν τα μολυσμένα κύτταρα κατά τρόπο ανάλογο με τα κυτταρολυτικά κύτταρα. Ο τρόπος, όμως, με τον οποίο αναγνωρίζουν τα κύτταρα στόχους, παραμένει ακόμη, σε μεγάλο βαθμό, αδιευκρίνητος. Σε αντίθεση, μάλιστα, με τα κυτταρολυτικά κύτταρα, η δράση των οποίων εξαρτάται από την παρουσίαση του αντιγόνου μέσω των τάξης Ι MHC μορίων, τα ΝΚ κύτταρα καταστρέφουν, εκλεκτικά, αυτόλογα κύτταρα, που έχουν υποστεί μείωση της έκφρασης των MHC μορίων τάξης Ι (Kuby 1998). 41

Μεγάλα κοκκιώδη λεμφοκύτταρα Τα μεγάλα κοκκιώδη λεμφοκύτταρα (large granular lymphocytes, LGLs) (Εικόνα 19) είναι κύτταρα φυσικοί φονείς (natural killers cells NK) ή Τ κύτταρα που έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν τις αλλαγές που συμβαίνουν στην έκφραση των επιφανειακών αντιγόνων στα διάφορα νεοπλασματικά κύτταρα, καθώς και στα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με διάφορους ιούς. Τα LGLs, αντίθετα προς τα CTLs, αναγνωρίζουν κύτταρα τα οποία δεν έχουν ή έχουν χάσει την ικανότητα τους να εκφράζουν αντιγόνα του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (major histocompatibility complex, MHC) στην επιφάνεια της κυτταρικής τους μεμβράνης (Burmester et al. 2003). Εικόνα 19. Δύο μεγάλα κοκκιώδη κύτταρα (LGL). 1.2.3 Κυτταροκίνες Οι κυτταροκίνες (cytokines) είναι μικρού μοριακού βάρους διαλυτές πρωτεΐνες ή γλυκοπρωτεΐνες που παράγονται από ποικιλία κυττάρων και μπορούν να αλλάξουν την συμπεριφορά του ίδιου του κυττάρου που τις εκκρίνει, καθώς και άλλων κυττάρων. Ουσιαστική λειτουργία των κυτταροκινών είναι ο συντονισμός της λειτουργίας πολλών διαφορετικών κυττάρων που συμμετέχουν στην ανοσιακή απάντηση (Thomson et al. 2003). Πολλές κυτταροκίνες μπορεί να παράγονται διάφορα κύτταρα, παρά το γεγονός ότι ένας συγκεκριμένος τύπος κυττάρου μπορεί να αποτελεί την κυριώτερη πηγή μιας συγκεκριμένης κυτταροκίνης. Τα μονοκύτταρα/μακροφάγα και τα Τ λεμφοκύτταρα, ειδικότερα τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα, αποτελούν τις κύριες κατηγορίες κυττάρων που παράγουν κυτταροκίνες. Έτσι, ο γενικός όρος «κυτταροκίνες» έχει καθιερωθεί για: τις λεμφοκίνες (εκκρίνονται από τα λεμφοκύτταρα, lemphokines), τις μονοκίνες (εκκρίνονται από τα μονοκύτταρα, monokines), τις 42

ιντερλευκίνες (interleukins), τις ιντερφερόνες (interferones), καθώς και διάφορους αυξητικούς παράγοντες (growth factors) (Thomson et al. 2003). Ο τρόπος δράσης των κυτταροκινών διακρίνεται σε αυτοκρινή (autocrine) (προσδένεται σε υποδοχείς του ίδιου του κυττάρου που την εκκρίνει), σε παρακρινή (paracrine) (προσδένεται σε υποδοχείς κυττάρων στόχων που βρίσκονται κοντά στο κύτταρο που την εκκρίνει), καθώς και σε ενδοκρινή (endocrine) (προσδένεται σε υποδοχείς κυττάρων στόχων που βρίσκονται σε απομακρυσμένα μέρη, από το κύτταρο έκκρισης της) (Burmester et al. 2003). Οι κυτταροκίνες είναι τα διαλυτά προϊόντα των Τ λεμφοκυττάρων και των κυττάρων αντιγόνοπαρουσιαστών (μονοπύρηνων / μακροφάγων APC). Αποτελούν μια ετερόκλητη ομάδα μικρών πρωτεϊνικών ορμονών, μοριακού βάρους 8 35 kd, με πολυποίκιλη δράση. Δεν αντιδρούν με το αντιγόνο, προάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ελέγχουν την κυτταρική διαφοροποίηση και ρυθμίζουν τις λειτουργίες των Τ και Β λεμφοκύτταρων αλλά και την ανοσολογική απάντηση γενικότερα. Τα CD4+ κύτταρα διαφοροποιούνται σε δυο υποπληθυσμούς με βάση τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν όταν διεγερθούν. Ο ένας υποπληθυσμός ασκεί βοηθητική λειτουργία για τα Τ κύτταρα, ονομάζεται ΤΗ1 (Th 1), και προάγει την κυτταρική ανόσια με την παραγωγή των ονομαζόμενων «φλεγμονωδών κυτταροκινών», τύπου 1, όπως είναι η ιντερλευκίνη 2 (IL 2), η ιντερφερόνη γ (IFN γ) και ο παράγων νέκρωσης όγκου α (TNF α). Η IL 2 είναι ο κύριος αυξητικός παράγοντας και για τους δυο πληθυσμούς CD4+ και CD8+. Η IFN γ είναι ένας φλεγμονώδης διαβιβαστής που προκαλεί ισχυρή ενεργοποίηση του APC και συνεισφέρει στη διαφοροποίηση της κυτταρολυτικής δραστηριότητας των CD8+. Ο TNF α είναι ένας ισχυρός απαγωγέας της παραγωγής IL 1 από το APC με πολλές βιολογικές δραστηριότητες κοινές με την IL 1, φαίνεται να είναι υπεύθυνος για τις κλινικές εκδηλώσεις και τα συμπτώματα της καταπληξίας (shock). Ενώ, ο άλλος υποπληθυσμός ασκεί βοηθητική λειτουργία για τα Β κύτταρα, ονομάζεται ΤΗ2 (Th 2), και προάγει τη χυμική ανόσια με την παραγωγή κυτταροκινών όπως είναι η ιντερλευκίνη 4 (IL 4), η ιντερλευκίνη 5 (IL 5), η ιντερλευκίνη 6 (IL 6) και η ιντερλευκίνη 10 (IL 10). Η IL 6 διεγείρει την παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης στο ήπαρ και προάγει τις ανοσολογικές απαντήσεις των Β κυττάρων. Η IL 4 και η IL 10 αναπτύσσουν αντιφλεγμονώδη δράση με κατασταλτική επίδραση στα ΤΗ1 κύτταρα. Ειδικότερα, η IL 10 αναστέλλει την παραγωγή της IL 2 και καταστέλλει την παραγωγή της IL 12 από μονοκύτταρα μακροφάγα και Β κύτταρα (Thomson et al. 2003). 43

1.3 Αιματολογικές κακοήθειες λευχαιμίες Με τον όρο λευχαιμία αναφερόμαστε σε κάθε κακοήθη νόσο (καρκίνος) του μυελού των οστών και του περιφερικού αίματος. Κάθε λευχαιμία αντιπροσωπεύει μια παθολογική κατάσταση κατά την οποία ο φυσιολογικός μυελός των οστών αντικαθίσταται από έναν κακοήθη πληθυσμό κλώνο κυττάρων αιματικής προέλευσης. Χαρακτηρίζεται από ανεξέλεγκτη παραγωγή λευχαιμικών κυττάρων τα οποία εμποδίζουν την παραγωγή των φυσιολογικών στοιχείων του αίματος (ερυθροκύτταρα, λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια) με αποτέλεσμα την αναστολή των φυσιολογικών λειτουργιών του αίματος. Γενικά οι λευχαιμίες διακρίνονται σε λεμφοβλαστικές και μυελοβλαστικές ανάλογα με τον τύπο των λευκών αιμοσφαιρίων που προσβάλλονται (λεμφικά ή μυελικά αντίστοιχα) ενώ ανάλογα με την χρονική εξέλιξη διακρίνονται σε χρόνιες και οξείες. Οι βασικοί τύποι των πιο κοινών λευχαιμιών είναι (Virella 1998): Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ ή CLL) Χρόνια Μυελογενής Λευχαιμία (ΧΜΛ ή CML) Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία ( ΟΛΛ ή ALL) Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία ( ΟΜΛ ή AML) Η οξεία λευχαιμία είναι ραγδαία εξελισσόμενη νόσος, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση ανώριμων κυττάρων στο μυελό των οστών και στο αίμα. Ο μυελός συχνά δεν μπορεί να παράγει αρκετά φυσιολογικά ερυθρά και λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια. Η χρόνια λευχαιμία εξελίσσεται πιο αργά καθώς επιτρέπει τη δημιουργία περισσότερων και ωριμότερων λειτουργικών κυττάρων. Άλλα σοβαρά αιματολογικά νοσήματα είναι τα λεμφώματα, τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα και το πολλαπλούν μυέλωμα. Τα λεμφώματα είναι τύποι καρκίνου του λεμφικού συστήματος. Διακρίνονται σε Hodgkin και μη Hodgkin λεμφώματα. Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα είναι κλωνικές διαταραχές του αιμοποιητικού προγονικού κυττάρου που παράγει όλα τα κύτταρα του αίματος και χαρακτηρίζονται από μη αποτελεσματική αιμοποίηση και κυτταροπενίες στο περιφερικό αίμα. Το πολλαπλούν μυέλωμα αποτελεί νεοπλασματική νόσο των πλασματοκυττάρων, με αποτέλεσμα την εμφάνιση κλώνου πλασματοκυττάρων που παράγει ένα είδος ανοσοσφαιρίνης. Η μονοκλωνική αυτή ανοσοσφαιρίνη αποτελεί το κύριο χαρακτηριστικό της νόσου και ανιχνεύεται στον ορό ή στα ούρα του ασθενή σε ποσοστό πάνω από 90% (Virella 1998). 44

1.3.1 Επιδημιολογικά στοιχεία Οι οξείες και χρόνιες μορφές της λευχαιμίας εμφανίζονται σε περίπου ίσα ποσοστά. Στις περισσότερες περιπτώσεις προσβάλλονται ηλικιωμένοι ασθενείς (> 60 ετών). Ο πιο συχνός τύπος λευχαιμίας στους ενηλίκους είναι η οξεία μυελογενής λευχαιμία (ΟΜΛ). Η επίπτωση της ΟΜΛ αυξάνει εντυπωσιακά μετά την ηλικία των 40 ετών. Η επίπτωση για όλους τους τύπους λευχαιμίας είναι υψηλότερη για τους άνδρες παρά για τις γυναίκες. Η λευχαιμία είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες άνω των 40 ετών, ενώ για τις γυναίκες είναι η πρώτη αιτία θανάτου από καρκίνο πριν την ηλικία των 20 ετών (Virella 1998). Η λευχαιμία προσβάλλει τους ενηλίκους 10 φορές περισσότερο απ ό,τι τα παιδιά. Ωστόσο, η οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ) είναι η συχνότερη μορφή καρκίνου στα παιδιά. Οι λευχαιμίες αντιπροσωπεύουν περίπου το 31% όλων των μορφών καρκίνου που εκδηλώνονται σε παιδιά νεώτερα των 15 ετών. Η επίπτωση της ΟΛΛ σε παιδιά 2 3 ετών είναι 4 φορές μεγαλύτερη απ ό,τι σε βρέφη και 10 φορές μεγαλύτερη απ ό,τι σε 19χρονα παιδιά. 1.3.2 Παράγοντες κινδύνου Οι παράγοντες κινδύνου για τη λευχαιμία πιστεύεται ότι είναι (Virella 1998): Ηλικία Περίπου 60% με 70% των λευχαιμιών εκδηλώνονται σε ασθενείς μεγαλύτερους των 50 ετών. Ακτινοβολία Ο κίνδυνος για τη χρόνια μυελογενή λευχαιμία αυξάνει για τους ανθρώπους που έχουν δεχτεί υψηλές δόσεις ακτινοβολίας. Χημικά Ο κίνδυνος λευχαιμίας είναι κατά 20 φορές μεγαλύτερος για τους εργαζόμενους που εκτίθενται μακροχρόνια σε βενζόλιο, διαλύτες, εντομοκτόνα, ζιζανιοκτόνα και λιπάσματα. Γενετική Η λευχαιμία είναι 15 φορές πιο συχνή σε παιδιά με σύνδρομο Down. Διάφορες άλλες γενετικές ανωμαλίες εμφανίζουν επίσης αυξημένο κίνδυνο για λευχαιμία (π.χ., αναιμία Fanconi, σύνδρομο Bloom, αταξία τελαγγειεκτασία, σύνδρομο Blackfan Diamond κ.α). Κάπνισμα Στα τσιγάρα υπάρχουν χημικά που μπορεί να αυξήσουν την πιθανότητα για λευχαιμία, όπως βενζόλιο, πολώνιο 210, και πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες. 45

1.3.3 Διάγνωση Από τη στιγμή που ο ιατρός υποψιασθεί ότι ένας ασθενής μπορεί να πάσχει από λευχαιμία πρέπει να γίνουν ορισμένες εξετάσεις: Αιματολογικές εξετάσεις, οι οποίες θα αξιολογήσουν τον τύπο και την ποσότητα των κυττάρων του αίματος, όπως επίσης και τη σχέση και την αναλογία των διαφόρων συστατικών του αίματος. Βιοχημικές εξετάσεις. Εξετάσεις του μυελού των οστών, όπως λήψη δείγματος του μυελού των οστών, μικροσκοπικές, κυτταροχημικές και κυτταρογενετικές εξετάσεις του δείγματος. Μοριακές τεχνικές (PCR, εύρεση αλληλουχίας DNA κλπ) Ακτινογραφία. Αξονική Τομογραφία. Μαγνητική Τομογραφία. Υπερηχογράφημα. 1.3.4 Συμπτώματα Τα συμπτώματα της λευχαιμίας μπορεί να είναι ανεπάρκεια αιμοπεταλίων (που έχει σαν αποτέλεσμα εύκολα μελανιάσματα και αιμορραγίες), αναιμία (με αποτέλεσμα ωχρότητα ή και καταβολή), ανεπαρκής δραστικότητα λευκών αιμοσφαιρίων (με αποτέλεσμα υποτροπιάζουσες λοιμώξεις). Αυτά τα συμπτώματα δεν είναι ειδικά για τη λευχαιμία και μπορεί να προκαλούνται και από άλλες ανωμαλίες. Μερικοί ασθενείς με χρόνια λευχαιμία μπορεί να μην έχουν μείζονα συμπτώματα, οπότε η διάγνωση τίθεται σε εργαστηριακό έλεγχο ρουτίνας. 1.3.5 Θεραπεία Η θεραπεία της λευχαιμίας γίνεται με τη χρήση χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, τα οποία χορηγούνται συνήθως σε συνδυασμό. Περίπου 40 διαφορετικά φάρμακα χρησιμοποιούνται σήμερα για τη θεραπεία των διάφορων τύπων λευχαιμίας. Ο σκοπός της θεραπείας είναι να προκαλέσει πλήρη ύφεση. Πλήρης ύφεση σημαίνει ότι δεν υπάρχει ένδειξη της νόσου και ο ασθενής έχει φυσιολογικές τιμές για τα κύτταρα του μυελού των οστών και του αίματος. Η υποτροπή δείχνει ότι τα λευχαιμικά κύτταρα επιστρέφουν (όπως και τα συμπτώματα της λευχαιμίας). Στην οξεία λευχαιμία, η πλήρης ύφεση που διαρκεί πέντε χρόνια μετά τη θεραπεία συχνά υποδεικνύει ίαση της νόσου. 46

Εκτός από τη συμβατική χημειοθεραπεία, ο ασθενής με λευχαιμία μπορεί να υποβληθεί επίσης και σε ανοσοθεραπεία, δηλαδή θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα. Η μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων εισήχθη στη θεραπεία της λευχαιμίας πριν από 40 περίπου χρόνια. Υπάρχουν δύο τύποι μεταμοσχεύσεων: η αυτόλογη, κατά την οποία χρησιμοποιούνται αιμοποιητικά κύτταρα του ίδιου του ασθενή, και η αλλογενής, κατά την οποία λαμβάνονται αιμοποιητικά κύτταρα από έναν φυσιολογικό δότη, μη συγγενή ή συγγενή, συνήθως αδελφό του ασθενούς. 47

1.4 Τ LGL Λευχαιμία 1.4.1 Γενικά Οι κλωνικές διαταραχές των μεγάλων κοκκιώδων λεμφοκυττάρων (large granular lymphocytes, LGLs) αποτελούν ένα φάσμα βιολογικώς διακριτών λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων που προκύπτουν από την νεοπλασματική εξαλλαγή είτε Τ λεμφοκυττάτων (CD3+) είτε ΝΚ κυττάρων (φυσικοί φονείς) που περιγράφτηκαν για πρώτη φορά το 1977 (McKenna et al. in 1977). Ο όρος «LGL λευχαιμία» εισήχθηκε το 1985 για την περιγραφή της κλωνικής διαταραχής των μεγάλων κοκκιώδων λεμφοκυττάρων στο αίμα, τον μυελό των οστών και τον σπλήνα (Loughran et al. 1985) ενώ τo 1993 έγινε η διάκριση των LGL διαταραχών με βάση της κυτταρικής τους προέλευση (T ή ΝΚ κύτταρα) σε ΝΚ LGL λευχαιμίες και σε Τ LGL λευχαιμίες (Loughran et al. 1993) η οποία ακολουθείται και σήμερα. Η T LGL λευχαιμία είναι μια κλωνική διαταραχή των κυτταροτοξικών (CD8+) Τ λεμφοκυττάρων που χαρακτηρίζεται από ουδετεροπενία, αναιμία και/ή θρομβοπενία καθώς και ήπια λεμφοκυττάρωση. Η Τ LGL λευχαιμία συνοδεύεται συχνά από αυτοάνοσες εκδηλώσεις (π.χ. ρευματοειδής αρθρίτιδα). Στις περισσότερες περιπτώσεις οι ασθενείς με Τ LGL λευχαιμία εμφανίζουν ήπια κλινικά συμπτώματα. Από το 1977 που ανακαλύφθηκε η Τ LGL λευχαιμία μέχρι σήμερα οι γνώσεις μας για τη φυσική ιστορία, τον ανοσοφαινότυπο, την παθοφυσιολογία αλλά και την θεραπευτική αντιμετώπιση της νόσου έχουν σημαντικά διευρυνθεί και πλέον η T LGL λευχαιμία θεωρείται μία καλά καθορισμένη νεοπλασματική οντότητα. Παρόλα αυτά πολλοί όροι έχουν χρησιμοποιηθεί (Πίνακας 1) για την απόδοση της λευχαιμίας αυτής, συμπεριλαμβανομένου του όρου «Τ LGL λευχαιμία» που χρησιμοποιεί πλέον και ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (WHO) στην κατάταξη των αιματολογικών κακοηθειών. Πίνακας 1. Όροι που έχουν χρησιμοποιηθεί για την Τ LGL Λευχαιμία Εναλλακτικά ονόματα για την T LGL λευχαιμία Large granular lymphocytic leukemia T gamma lymphocytosis syndrome (T gamma is the old name for T cells with receptors for the Fc portion of the IgG molecule [CD16]) T gamma lymphoproliferative disorder T suppressor cell chronic lymphocytic leukemia T cell lymphocytosis with neutropenia T suppressor cell leukemia T8 chronic lymphocytic leukemia Granulated T cell lymphocytosis with neutropenia 48

1.4.2 Στοιχεία για τη φυσιολογική διαφοροποίηση των Τ κυτταροτοξικών κυττάρων Τα Τ λεμφοκύτταρα παράγονται στον μυελό των οστών και οι πρόδρομες μορφές τους μεταναστεύουν στον θύμο. Εκεί γίνεται ο ανασυνδυασμός των V, D και J γονιδίων για την έκφραση του Τ κυτταρικού υποδοχέα (TCR) (Schwartz RS 2003) O ΤCR είναι ένα ετεροδιμερές μόριο αποτελούμενο από δύο πολυπεπτίδια τα οποία είναι συνήθως α και β αλυσίδες. Ωστόσο υπάρχουν και Τ λεμφοκύτταρα που εκφράζουν TCR αποτελούμενο από γ και δ αλυσίδες. Κατά την ωρίμανση των Τ κυττάρων στον θύμο μετά τον ανασυνδυασμό των γονιδίων για τις α και τις β αλυσίδες, τα κύτταρα εκφράζουν και CD4 και CD8 (διπλοθετικά). Η αλληλεπίδραση του TCR με αντιγόνα τα οποία προσδένονται στα μόρια MHC επάγουν τη διαφοροποίηση των διπλοθετικών κυττάρων σε κύτταρα που εκφράζουν είτε μόνο CD4 (Τ βοηθητικά) είτε μόνο CD8 (T κυτταροτοξικά). Συνεπώς, τα ώριμα CD3+/CD4+/CD8 κύτταρα επιτελούν τις διαδικασίες των βοηθητικών κυττάρων ενώ τα ώριμα CD3+/CD4+/CD8+ κύτταρα την κυτταροτοξικότητα. Όταν τα CD8+ T κυττάρων ενεργοποιούνται από τα αντιγόνα και τις κυτταροκίνες, διαφοροποιούνται σε δραστικά κυτταροτοξικά κύτταρα και διαδραματίζουν πρωταγωνιστικό ρόλο στην καταπολέμηση των ιικών λοιμώξεων. Ο αντιικός ρόλος των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων περιλαμβάνει τη σύνθεση λυτικών μορίων (π.χ. περφορίνες και τα κοκκιοένζυμα τα οποία στοχεύουν τα μολυσμένα από τον ιό κύτταρα και προκαλώντας τη λύση και το θάνατό τους (Clayberger C, Kerensky A. 2000). Επίσης, τα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα εκφράζουν τον Fas προσδέτη, (Fas L) ο οποίος είναι μέλος της οικογένειας των υποδοχέων ΤΝF παραγόντων (Tumor necrosis factor receptor family). Ο Fas L προσδένεται στον Fas, ένα μόριο με ευρεία κατανομή σε διάφορους φυσιολογικούς ιστούς, και επάγει την απόπτωση των κυττάρων που στοχεύει μέσα από το συγκεκριμένο μονοπάτι ενεργοποίησης. Πολύ λίγα πράγματα είναι γνωστά για τις λειτουργίες των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων που εκφράζουν γδ TCR. Αυτά τα κύτταρα επιδεικνύουν έντονη, γρήγορη και ανεξάρτητη από τα MHC μόρια κυτταροτοξικότητα παρόμοια με αυτή των ΝΚ κυττάρων. Συνήθως, απαντώνται στο επιθήλιο των βλεννογόνων και εκτιμάται ότι παίρνουν μέρος στους μηχανισμούς της πρώτης γραμμής της άμυνας (Clayberger C, Kerensky A. 2000). Τόσο τα ΝΚ κύτταρα όσο και τα Τ κύτταρα προκύπτουν από έναν κοινό πρόγονο, διαφορετικό από τον πρόγονο που δίνει γένεση στα Β λεμφοκύτταρα. Για το λόγο αυτό τα ΝΚ κύτταρα παρουσιάζουν ορισμένες ομοιότητες με τα Τ κυτταροτοξικά κύτταρα, όπως η έκφραση λυτικών μορίων (π.χ. CD8 και ΝΚ υποδοχείς). Ωστόσο, τα ΝΚ κύτταρα δεν έχουν CD3 και ΤCR, τα γονίδια V,D, J του TCR δεν είναι αναδιαταγμένα, δεν απαιτείται ενεργοποίηση από αντιγονικό ερέθισμα και κλωνική επέκταση για την εκτελεστική τους δράση και λύουν τα 49

κύτταρα στόχους ανεξάρτητα από την παρουσία ΜΗC μορίων (Moretta L et al. 2002, Zambello R et al. 2003). 1.4.3 Τα μεγάλα κοκκιώδη κύτταρα Τα μεγάλα κοκκιώδη κύτταρα (Large granular lymphocytes LGLs) αντιπροσωπεύουν το 10 15% των μονοπύρηνων κυττάρων στο περιφερικό αίμα των ενηλίκων. Τα περισσότερα μεγάλα κοκκιώδη κύτταρα (85%) έχουν προέλθει από CD3 ΝΚ κύτταρα (φυσικοί φονείς) ενώ ένα μικρό ποσοστό (15%) έχει προέλθει από CD3+ T κύτταρα (Lamy T, Loughran TP. 1998). Από κυτταρολογικής άποψης, τα LGL κύτταρα είναι μεγάλα κύτταρα, έχουν έκκεντρο πυρήνα και άφθονο κυτταρόπλασμα με μεγάλα αζουρόφιλα κοκκία (Εικόνα 20). Τα Τ LGL κύτταρα είναι κύτταρα που έχουν διέλθει από τον θύμο, έχουν ενεργοποιηθεί από αντιγόνο και έχουν εξελιχθεί σε κυτταροτοξικά CD8+ T κύτταρα. Τα ΝΚ LGL κύτταρα ανήκουν στην φυσική έμφυτη ανοσία και έχουν την ικανότητα της ανεξάρτητης από τα MHC μόρια κυτταροτοξικότητας. Ανοσοφαινοτυπικές μελέτες έχουν δείξει ότι μολονότι στο περιφερικό αίμα η πλειονότητα των μεγάλων κοκκιωδών κυττάρων είναι ΝΚ κύτταρα (CD3 /CD8+) και όχι T κύτταρα (CD3+/CD8+), το 85% των LGL λευχαιμιών προέρχονται από νεοπλασματική εξαλλαγή ενός Τ κυττάρου. Εικόνα 20. LGL κύτταρο από ασθενή με T LGL λευχαιμία. 50

1.4.4 Επιδημιολογία και κλινικές εκδηλώσεις H LGL λευχαιμία είναι ασθένεια που προσβάλει κυρίως ηλικιωμένους με διάμεση ηλικία στη διάγνωση τα 60 έτη αν και έχουν αναφερθεί ασθενείς από όλο το ηλικιακό φάσμα. Η ασθένεια εμφανίζεται με ίδια συχνότητα στις γυναίκες και στους άνδρες (Dhodapkar MV et al. 1994) Οι μισοί περίπου LGL ασθενείς διαγιγνώσκονται κατά την εκδήλωση βακτηριακών λοιμώξεων ως συνέπεια της ουδετεροπενίας. Άλλα συμπτώματα της νόσου είναι η αναιμία, η κόπωση και πιο σπάνια πυρετός, έντονη εφίδρωση και απώλεια βάρους. Περίπου οι μισοί ασθενείς εμφανίζουν σπληνομεγαλία και 25% ηπατομεγαλία. Διογκωμένοι λεμφαδένες απαντώνται σπάνια (Pandolfi F et al. 1990). Συνολικά, η κλινική εκδήλωση και εξέλιξη της LGL λευχαιμίας ποικίλει από ήπια έως πολύ επιθετική. Η πλειοψηφία των Τ LGL εμφανίζει ήπια κλινική πορεία με διάμεσο χρόνο επιβίωσης μεγαλύτερο από δέκα χρόνια. Οι εργαστηριακές αναλύσεις στους ασθενείς με LGL λευχαιμία δείχνουν ουδετεροπενία στο 85% των περιπτώσεων, με απόλυτη τιμή για τα ουδετερόφιλα μικρότερη από 500/μl στο 50% των ασθενών. Περίπου οι μισοί ασθενείς εμφανίζουν αναιμία και ενώ σε ένα ποσοστό της τάξης του 20% εκδηλώνουν ήπια θρομβοπενία. Στα κυτταρικά επιχρίσματα των ασθενών εντοπίζεται μεγάλος αριθμός κοκκιωδών κυττάρων (4000/μl), παρά τoν φυσιολογικό αριθμό λεμφοκυττάρων ή την ήπια λεμφοπενία. Οι ασθενείς με LGL λευχαιμία εμφανίζουν συχνά ορολογικές διαταραχές (Πίνακας 2) όπως ανίχνευση ρευματοειδούς παράγοντα, αντιπυρηνικών αντισωμάτων, αντισωμάτων εναντίον των αιμοπεταλίων και των ουδετερόφιλων, θετικές τιμές στo Coombs test, υπερ και υπο γσφαιριναιμία, μονοκλωνικές γ διαταραχές και υψηλές τιμές β2 μικροσφαιρίνης (Rose M. Berliner N. 2004) Πίνακας 2. Συχνές ορολογικές διαταραχές στους Τ LGL ασθενείς Ορολογικά ευρήματα στην T LGL Αντιπυρηνικά αντισώματα Ρευματοειδής παράγοντας Υπερ γ σφαιριναιμία Υπο γ σφαιριναιμία Αντι αιμοπεταλιακά αντισώματα Αντι ουδετεροφιλικά αντισώματα Μονοκλωνικές γ διαταραχές Κυκλοφορούντα άνοσα σύμπλέγματα 51

1.4.5 Διάγνωση Η διάγνωση στις LGL λευχαιμίες ξεκινά με την παρατήρηση αναιτιολόγητων ουδετεροπενιών και υψηλών ποσοστών LGL κυττάρων στην μοροφολογική εξέταση ή στην κυτταρομετρία ροής. Ωστόσο, δεν είναι όλες οι παρατηρούμενες LGL καταστάσεις κακοήθεις. Αντίθετα, καλοήθεις LGL υπερπλασίες έχουν αναφερθεί σε διάφορες κλινικές καταστάσεις (Πίνακας 3) συμπεριλαμβανομένων των ασθενών με AIDS (Smith et al. 2000), όσους έχουν υποβληθεί σε σπληνεκτομή (Kelemen et al. 1986) και σε αλλογενή μεταμόσχευση (Mohty et al. 2002) Πίνακας 3. Κλινικές καταστάσεις και καλοήθεις LGL υπερπλασίες Kλινικές καταστάσεις που σχετίζονται με καλοήθεις LGL Σπληνεκτομή ΗΙV μόλυνση Αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων Μεταμόσχευση συμπαγών οργάνων Για την πλήρη διάγνωση μιας T LGL λευχαιμίας απαιτείται η επιβεβαιωμένη κλωνικότητα των CD8+ Τ κυττάρων. Κάποιοι T LGL ασθενείς εμφανίζουν επίσης κυτταρογενετικές ανωμαλίες (Wong et al. 2002) ενώ στους περισσότερους ασθενείς η κλωνικότητα επιβεβαιώνεται με αναλύσεις των αναδιατάξεων των γονιδίων του TCR. Tα Τ κύτταρα αναδιατάσσουν τα γονίδια του TCR κατά τη φυσιολογική διαφοροποίηση, και συνεπώς όλα τα κύτταρα που προέρχονται από νεοπλασματική εξαλλαγή ενός Τ λεμφοκυττάρου θα έχουν την ίδια αναδιάταξη στον TCR. Η κλωνικότητα σε επίπεδο TCR επιβεβαιώνεται με τη χρήση υβριδισμού τύπου Southern blot ή με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR). Σήμερα, χρησιμοποιείται κυρίως η τεχνική της PCR αν και η ευαισθησία της κυμαίνεται μεταξύ 70 80%. Η τεχνική του υβριδισμού έχει αυξημένη ευαισθησία όμως απαιτεί μεγάλες ποσότητες και καλή ποιότητα DNA. H κυτταρομετρία ροής βασίζεται στη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων εναντίον της μεταβλητής περιοχής του TCR. Συνοπτικά τα κριτήρια για την διάγνωση της LGL λευχαιμίας (Πινακας 4) συνοψίζονται στην κυτταροροπενία, την κλωνικότητα των T κυττάρων. Πίνακας 4. Κριτήρια για τη διάγνωση της T LGL λευχαιμίας Κριτήρια για τη διάγνωση της Τ LGL λευχαιμίας Αναιμία Ουδετεροπενία και/ή θρομβοπενία Ενδείξεις για κλωνική επέκταση CD3+CD8+CD57+ Τ κυττάρων Κλωνική αναδιάταξη TCR γονιδίων 52

1.4.6 Ανοσοφαινότυπος O κλασικός ανοσοφαινότυπος της κακοήθους T LGL είναι CD3+CD4 CD8+CD16+CD27 CD45R0 CD57+CD94+ (Rose M. Berliner N. 2004). Έχουν ωστόσο αναφερθεί και περιπτώσεις με διπλοθετικές CD4+CD8+ T LGL λευχαιμίες όσο και διπλοαρνητικές CD4 CD8. Το CD56, ένας επιφανειακός δείκτης των ΝΚ κυττάρων περιστασιακά εμφανίζεται και στις Τ LGL λευχαιμίες και συνδέεται με πιο επιθετική κλινική πορεία. Στην πλειοψηφία των Τ LGL ασθενών ο TCR εμφανίζει τον αβ υπότοπο αν και έχουν αναφερθεί και περιπτώσεις με τον γδ υπότυπο του TCR. 1.4.7 Παθογένεση Τα νεοπλασματικά LGL κύτταρα εμφανίζουν χαρακτηριστικά Τ δραστικών κυττάρων που έχουν ενεργοποιηθεί από αντιγόνο. Ειδικότερα, εκφράζουν περφορίνη, κοκκιοένζυμα και τον Fas προσδέτη (FasL). Με μικροσυστοιχίες (microarrays) έχει επίσης βρεθεί ότι στην T LGL λευχαιμία έχουν απορυθμιστεί πολλά γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταροτοξικότητα (καθεψίνη, κασπάση 8, περφορίνη, κοκκιοένζυμα). Ο αντιγονικός στόχος των νεοπλασματικών Τ LGL κυττάρων δεν έχει καθοριστεί, αλλά ορολογικά δεδομένα υποδηλώνουν την αναγνώριση αντιγονικών επιτόπων του Τ λεμφοτρόπου ιού Ι (ΤLVI). Τα δεδομένα αυτά προτείνουν ότι ενδεχομένως μια μόλυνση από ρετροιό ή άλλου τύπου ιό να παίζει κάποιο ρόλο στη διαδικασία της ενεργοποίησης (Kothapalli et al. 2003) H φυσιολογική διαδικασία για τον περιορισμό της δράσης των CTL περιλαμβάνει το μονοπάτι της απόπτωσης που ρυθμίζεται από την αλληλεπίδραση Fas FasL. Στα λευχαιμικά T LGL κύτταρα έχουν βρεθεί υψηλά επίπεδα διαλυτού Fas και επιπρόσθετες ενδείξεις υπέρ ενός μοντέλου που βασίζεται στο απορυθμισμένο Fas εξαρτώμενο αποπτωτικό μονοπάτι (Liu 2002). Γενικά, πολλές μελέτες στηρίζουν την άποψη ότι η LGL λευχαιμία είναι μια ασθένεια που οφείλεται σε απορύθμιση της απόπτωσης. Μελέτες σε ποντίκια έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις στον Fas ή τον FasL οδηγούν σε λεμφοαδενοπάθεια, αυτοάνοσες εκδηλώσεις και κλωνική επέκταση των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων (Nagata et al. 1998). 1.4.8 Τ LGL λευχαιμία και άλλα νοσήματα Ένα πολύ σπουδαίο χαρακτηριστικό της T LGL λευχαιμίας είναι ότι εμφανίζεται παράλληλα με άλλα νοσήματα, κυρίως αυτοάνοσες και αιματολογικές ασθένειες. Πάνω από το 1/3 των ασθενών με T LGL λευχαιμία εμφανίζει ρευματοειδή αρθρίτιδα και ακολουθούν η αυτοάνοση θρομβοπενία,η αυτοάνοση αιμολυτική αναιμία. Επίσης, η T LGL λευχαιμία είναι η πιο κοινή αιτία για την ολική απλασία της ερυθράς σειράς στους ενήλικες και σχετίζεται συχνά και με 53

την απλαστική αναιμία και την μυελοδυσπλασία και πολλές λεμφοϋπερπλασίες των Β λεμφοκυττάρων (Πίνακας 5). Πίνακας 5. T LGL και άλλα νοσήματα Κλινικές καταστάσεις που σχετίζονται με τη Τ LGL Ρευματοειδής αρθρίτιδα και σύνδρομο Felty s Sjogren s σύνδρομο Hashimoto θυροειδίτιδα Συστηματικός ερυθρυματώδης λύκος Θρομβοπενία Αυτοάνοση αιμολυτική αναιμία Απόλυτη απλασία της ερυθράς σειράς Απλαστική αναιμία Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα Λεμφουπερπλασίες των Β λεμφοκυττάρων Πολλαπλούν μυέλωμα Λέμφωμα Hodgkin Ειδικότερα, πολλές μελέτες έχουν αναδείξει ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της T LGL λευχαιμίας και της ολικής απλασίας της ερυθράς σειράς (pure red cell aplasia PRCA). Σε μελέτη που περιλάμβανε 203 ασθενείς (Go et al. 2002) με T LGL 15 ασθενείς (7%) παρουσίαζαν PRCA και λιγότεροι από τους μισούς είχαν απόλυτη λεμφοκυττάρωση, 8 ανέπτυξαν επιπλέον μη Hodking λέμφωμα ή χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία ή ρευματοειδή αρθρίτιδα. Στην T LGL λευχαιμία η διαταραχή της ερυθράς σειράς και η εμφάνιση PRCA μπορεί να οφείλεται σε αντισώματα εναντίον των ερυθροβλαστών τα οποία προσδένονται στον Fc υποδοχέα των νεοπλασματικών κυττάρων ή στην έκφραση ενός μη φυσιολογικού επιφανειακού αντιγόνου που εκφράζει ο πρόγονος της ερυθράς σειράς και αναγνωρίζει ο TCR του κλώνου (Ergas et al. 1996). Η συσχέτιση της T LGL με την απλαστική αναιμία είναι επίσης αρκετά συχνή, αν και όχι τόσο όσο στην περίπτωση της PRCA. Στην μελέτη των Go et. al 9 από τους 203 ασθενείς διαγνώστηκαν με Τ LGL και απλαστική αναιμία. Κανένας από αυτούς δεν εμφάνιζε λεμφοκυττάρωση ενώ μερική ή πλήρης ύφεση επιτεύχθηκε με τη χρήση φαρμάκων που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση της απλαστικής αναιμίας (κυκλοσπορίνη, αντιθυμοκυτταρική σφαιρίνη, πρεντνισόνη κ.α.). Δυο μελέτες (Saunthararajah et al. 2001 και Dhodapkar et al. 1994) αναφέρονται T LGL ασθενείς που εκδηλώνουν μυελοδυσπλασίες σε ένα ποσοστό 5 7%. Παράλληλα, ολιγοκλωνικοί Τ πληθυσμοί έχουν βρεθεί αυξημένοι σε ασθενείς με μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (Kochenderfer et al. 2002). 54

Aσθενείς με T LGL λευχαιμία έχουν αναφερθεί να εμφανίζουν και κλωνικές ασθένειες των Β λεμφοκυττάρων (Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία, πολλαπλούν μυέλωμα, μονοκλωνικές γ σφαιρινοπάθειες λέμφωμα οριακής ζώνης, Hodking λέμφωμα κ.α. (Papadaki et al. 2002, Leserve et al. 2000). Η μοριακή βάση της παράλληλης εκδήλωσης της T LGL με νεοπλασίες των Β λεμφοκυττάρων δεν είναι γνωστή αλλά εκτιμάται ότι οι δύο νεοπλασματικοί κλώνοι προήλθαν από ένα κοινό πρόγονο. Μία άλλη πιθανή εξήγηση είναι ότι η απορύθμιση των άνοσων απαντήσεων που προκύπτει στην T LGL οδηγεί δευτερογενώς σε κλωνικές διαταραχές των Β κυττάρων. Η εμφάνιση αυτοάνοσων νοσημάτων παράλληλα με την T LGL, όπως αναφέραμε είναι ιδιαίτερα συχνή. Το 1924 ο Felty περιέγραψε τους ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, ουδετεροπενία και σπληνομεγαλία ως μια οντότητα που σήμερα καλείται Felty s σύνδρομο (Felty et al. 1924). Από κλινική σκοπιά σε πολλές περιπτώσεις το σύνδρομο Felty s σχετίζεται με την T LGL λευχαιμία. Και οι δύο κλινικές καταστάσεις περιλαμβάνουν συχνά ρευματοειδή αρθρίτιδα, ουδετεροπενία και σπληνομεγαλία. Ένας στους τρεις ασθενείς με Felty s σύνδρομο εμφανίζει παράλληλα και κλωνικές διαταραχές των Τ κυττάρων ενώ πλήθος άλλων στοιχείων υποστηρίζει ότι στην παθογένεση Τ LGL εμπλέκονται οι ίδιοι μοριακοί μηχανισμοί με αυτούς που απαντώνται στην ρευματοειδή αρθρίτιδα και το σύνδρομο Felty s. Πολύ συχνή είναι και η εκδήλωση λεμφοϋπερπλασιών έπειτα από μεταμόσχευση συμπαγών οργάνων ή αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Στις περιπτώσεις αυτές, οι λεμφοϋπερπλασίες αφορούν στην πλειοψηφία τους τα Β λεμφοκύτταρα και σχετίζονται με λοίμωξη από τον ιό Epstein Barr. Σε ό,τι αφορά τις νεοπλασίες των Τ κυττάρων, αυτές αφορούν κυρίως επιθετικές ΝΚ νεοπλασίες. Ωστόσο, κλασικές περιπτώσεις ανάπτυξης Τ LGL λευχαιμίας έχουν αναφερθεί σε περιστατικά μετά από αλλογενή μεταμόσχευση νεφρού και αιμοποιητικών κυττάρων (Gentile et al. 1998, Gorochov et al. 1994) ήπατος, 1.4.9 Πρόγνωση και Θεραπεία Η LGL λευχαιμία είναι κατά κανόνα μια ήπια διαταραχή με διάμεσο χρόνο επιβίωσης πάνω από 10 έτη. Μερικοί ασθενείς διαγιγνώσκονται λόγω της ήπιας ουδετεροπενίας και/ή λεμφοκυττάρωσης και παραμένουν ασυμπτωματικοί για μεγάλες περιόδους χωρίς θεραπεία και οι περιπτώσεις υποτροπής που έχουν αναφερθεί είναι περιορισμένες. Ωστόσο, η πλειοψηφία των ασθενών υπόκειται σε θεραπεία σε κάποιο στάδιο της νόσου. Ανοσοκατασταλτικές θεραπείες με χαμηλές δόσεις μεθοτρεξάτης, κυκλοφωσφαμίδιο ή κυκλοσπορίνη Α συνήθως ρυθμίζουν τα συμπτώματα και την κυτταροπενία σε περισσότερους 55

από τους μισούς ασθενείς, αν και δεν επέρχεται πλήρης ίαση. Πολλές μελέτες αναφέρουν μια επιθετική μορφή (CD3+, CD56+) Τ LGL λευχαιμίας, με κακή πρόγνωση (Rose et al. 2004) Η επιθετική μορφή της ΝΚ LGL λευχαιμίας εξελίσσεται ακόμη πιο γρήγορα και σχετίζεται με την παρουσία του ιού Epstein Barr (ΕΒV). Η επιθετική αυτή μορφή της ΝΚ LGL λευχαιμία ς εμφανίζεται κυρίως στην Ασία και την Λατινική Αμερική, είναι ανθεκτική στη συμβατική χημειοθεραπεία και ο μέσος χρόνος επιβίωσης είναι 2 μήνες. Αντίθετα, η χρόνια ΝΚ LGL λευχαιμία είναι σπάνια, δεν σχετίζεται με τον EBV και έχει ήπια κλινικά συμπτώματα και καλή πρόγνωση (Sokol et al. 2006) 1.4.10 Ο ρόλος των ιών στην Τ LGL λευχαιμία Ο ανθρώπινος ιός HTLV II (T cell leukemia virus II) έχει ανιχνευθεί σε επίπεδο αλληλουχιών σε δύο ασθενείς με ήπια T l LGL (Loughran et al. 1998). Aναφορικά με τα ορολογικά ευρήματα, αντιδραστικότητα εναντίον του αντιγονικού επιτόπου BA21 του φακέλου του ιού HTLV I έχει βρεθεί στους μισούς ασθενείς με CD3+ LGL (T LGL) και στο 73% των CD3 LGL (Sokol et al. 2005). Eκτός από τους ΗΤLV ιούς ο ιός Epstein Barr (EBV) εμπλέκεται στην παθογένεση της επιθετικής μορφής την ΝΚ LGL ενώ δεν υπάρχουν ικανοποιητικά στοιχεία για την Τ LGL λευχαιμία (Rose M. Berliner N. 2004). Ωστόσο, ο μηχανισμός πρόκλησης τη T LGL λευχαιμίας, η παρατηρούμενη απορρυθμισμένη άνοση απάντηση και της απόπτωσης θα μπορούσε να αιτιολογηθεί από την ύπαρξη ενός κοινού ιικού αντιγονικού επιτόπου. 56

1.5 Οι ανθρώπινοι ερπητοϊοί CMV και ΕΒV 1.5.1 Γενικά Οι ιοί EBV και CMV είναι δύο κοινοί ερπητοϊοί. Οι ερπητοϊοί οφείλουν το όνομά τους στην ελληνική λέξη «έρπω», λόγω των λανθανουσών, χρόνιων και υποτροπιαζόντων λοιμώξεων που προκαλούν. Η οικογένεια Herpesviridae περιλαμβάνει περίπου 100 ιούς. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 8 από αυτούς ως υπεύθυνοι για λοιμώξεις στον άνθρωπο. Οι ερπητοϊοί χωρίζονται σε τρεις υποοικογένειες (Εικόνα 21) (White et al. 1994): Εικόνα 21. Ταξινόμηση ανθρώπινων ερπητοϊών Alphaherpesviridae (α ερπητοϊοί) στους οποίους ανήκουν ο ιός του απλού έρπητα τύπου 1 (Herpes simplex virus 1, HSV 1), ο οποίος έχει συσχετιστεί με στοματικά και οφθαλμικά τραύματα (fever blisters) και εγκεφαλίτιδα. ο ιός του απλού έρπητα τύπου 2 (Herpes simplex virus 2, HSV 2), ο οποίος προσβάλει τα γεννητικά και ευθύνεται για πρωκτικά τραύματα (φουσκάλες πυρετού) και σοβαρές μολύνσεις νεογνών. ο ερπητοϊός του ανθρώπου τύπου 3 HSV 3 ή Varicella Zoster (VZV) που ευθύνεται για την ανεμοβλογιά (πρωταρχική μόλυνση) και τον έρπητα ζωστήρα (επανενεργοποίηση). Betaherpesviridae (β ερπητοϊοί) στους οποίους ανήκουν ο HSV 5 ή CMV κυτταρομεγαλοϊός που ευθύνεται για τη λοιμώδη μονοπυρήνωση, για βαριάς μορφής εκ γενετής μόλυνση και μολύνσεις στους δέκτες αλλομοσχευμάτων (πνευμονία). ο ερπητοϊός του ανθρώπου τύπου 6 (HHV 6:Human herpesvirus 6) που προκαλεί την ασθένεια Roseola στα νήπια (αρχική μόλυνση), μολύνσεις στους δέκτες αλλομοσχευμάτων (πνευμονία, αποτυχία μυελού), και πιθανόν εμπλέκεται στην πολλαπλή σκλήρυνση. 57

και ο ερπητοϊός του ανθρώπου τύπου 7 (HHV 7: Human herpesvirus 7), που ευθύνεται για μερικές περιπτώσεις roseola (αρχική μόλυνση) και πιτυρίαση. Gammaherpesviridae (γ ερπητοϊοί) στους οποίους ανήκουν ο ερπητοϊός του ανθρώπου τύπου 4 (ΗΗV 4) ή ιός Epstein Barr (EBV) που προκαλεί λοιμώδη μονοπυρήνωση (αρχική μόλυνση) και σχετίζεται με όγκους Β λεμφοκυττάρων (το λέμφωμα Burkitt, ανοσοβλαστικά λεμφώματα), το ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα, και με μερικούς όγκους Τ λεμφοκυττάρων. και ο ιός του σαρκώματος Kaposi KSHV ή ερπητοϊό του ανθρώπου τύπου 8 (HHV 8 ) που εκτός από το σάρκωμα το Kaposi προκαλεί και κάποια λεμφώματα B λεμφοκυττάρων. Για πολλά χρόνια, η επιδημιολογία των κοινών λοιμώξεων από ερπητοϊούς ήταν ασαφής. Το 1950, οι Burnet και Buddingh έδειξαν ότι ο ιός του απλού έρπητα μετά την πρωτοπαθή λοίμωξη, μπορούσε να μεταπέσει σε λανθάνουσα κατάσταση και να επανενεργοποιηθεί αργότερα μετά από κάποιο εκλυτικό αίτιο. Το 1954 ο Weller απομόνωσε τον ιό του έρπητα ζωστήρα και από την ανεμευλογιά και από τον έρπητα ζωστήρα, δείχνοντας ότι και για τις δύο νόσους υπεύθυνος είναι ο ίδιος ιός. Εικόνα 22. Δομή ερπητοϊού τη στιγμή που σπάει ο ιϊκός φάκελος Η μορφολογία όλων των ερπητοϊών είναι παρόμοια και χαρακτηριστική. Αποτελούνται από ένα φάκελο που περιβάλλει ένα εικοσαεδρικό καψίδιο, το οποίο έχει διάμετρο περίπου 180 200 nm και περιέχει δίκλωνο DNA. Ο φάκελος αποτελείται από λιπιδική διπλοστοιβάδα, με γλυκοπρωτεϊνικές προεξοχές. Ανάμεσα στον πυρηνικό φάκελο και το καψίδιο υπάρχει ένας 58

χώρος με ένζυμα και πρωτεΐνες για την αντιγραφή του ιού (Εικόνα 22). Όπως και οι άλλοι ιοί με έλυτρο, οι ερπητοϊοί είναι ασταθείς σε θερμοκρασία δωματίου και απενεργοποιούνται εύκολα από λιπιδικούς διαλύτες (Arvin et al. 2006). Γενικά τα συστατικά του ιοσωματίου διατάσσονται ως εξής (Εικόνα 23): DNA με ένα εσωτερικό κέλυφος διαμέτρου 75 nm, ένα εικοσαεδρικό καψίδιο διαμέτρου 95 105 nm το οποίο αποτελείται από 162 εξαγωνικά καψομερίδια, μία περιβάλλουσα κοκκιώδη ζώνη αποτελούμενη από σφαιρικές πρωτεΐνες ένα περιβάλλον έλυτρο το οποίο περιέχει γλυκοπρωτεΐνες. Εικόνα 23. Σχηματική αναπαράσταση ενός ερπητοϊού Το γονιδίωμα των ερπητοϊών είναι ένα γραμμικό, δίκλωνο μόριο DNA με μέγεθος 120 220 Κbp το οποίο αποτελείται από γουανίνη και κυτοσίνη (GC) σε ποσοστό 60 %. Γενικά στο γονιδίωμα κάθε ερπητοϊου έχουν αναγνωριστεί (Kieff et al. 2001): Σύντομες ευθείες τερματικές επαναλήψεις και στα δύο άκρα μεγέθους περίπου 0,5Κbp (TR=terminal repeats) Έξι έως δώδεκα ευθείες διαδοχικές εσωτερικές επαναλήψεις μεγέθους 3kbp (ΙR= internal repeats) Μία κύρια κωδικοποιητική αλληλουχία με απλή διευθέτηση γονιδίων η οποία διαχωρίζεται στη σύντομη και την επιμήκη περιοχή μοναδικών αλληλουχιών (US=unique short, UL=unique long). Οι περιοχές US και UL αν και αποτελούνται κατά κύριο λόγο από μοναδικό DNA ωστόσο περικλείουν και κάποιες πλήρεις ή ατελείς διαδοχικές επαναλήψεις. 59

Στην περίπτωση του EBV, μία διπλασιασμένη περιοχή βρίσκεται δίπλα από το αριστερό άκρο της UL περιοχής και καλείται DL. Η περιοχή DL είναι πλούσια σε G C (γουανίνηκυτοσίνη), είναι συντηρημένη και αποτελείται από διαδοχικές επαναλήψεις 125bp και την παρακείμενη αλληλουχία μοναδικού DNA μεγέθους 2 kbp. Ολόκληρη η περιοχή DL παρουσιάζει εκτεταμένη ομολογία με μια περιοχή η οποία ονομάζεται DR βρίσκεται δίπλα στο δεξί άκρο της UL περιοχής αντίστοιχα. και Εικόνα 24. To γονιδίωμα κοινών ερπητοϊών. 1.5.2 Ο ιός Epstein Barr (EBV) Ιστορική αναδρομή O ιός Epstein Barr (EBV) ανακαλύφθηκε το 1964 (Epstein et al. 1964). Από το 1940 ο στρατιωτικός γιατρός Dennis Burkitt μελετούσε ασθενείς οι οποίοι εμφάνιζαν μία ασυνήθη μορφή λεμφώματος. Ο Burkitt περίγραψε τα επιδημιολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά αυτού του τύπου λεμφώματος (Burkitt et al. 1966) η εμφάνιση του οποίου ήταν ιδιαίτερα συχνή στην Αφρική, στην περιοχή του Ισημερινού (Εικόνα 25) όπου εμφανίζονταν και η μαλάρια. Επηρεασμένοι από τις μελέτες του Burkitt, οι Εpstein, Barr και Achong επεξεργάστηκαν όγκους από βιοψίες. Με τα πειράματά τους πέτυχαν την ανάπτυξη κυττάρων λεμφώματος σε καλλιέργεια και την αναγνώριση ενός ερπητοϊού, του Epstein Barr. Ο ερπητοϊός αυτός απέδειξαν ότι διαφέρει από τους υπόλοιπους γνωστούς ερπητοϊούς του 60

ανθρώπου καθώς αδυνατεί να αντιγραφεί σε καλλιέργειες άλλων κυττάρων και δεν αντιδρά με τα κοινά για τους άλλους ερπητοϊούς αντισώματα. Το 1968 οι Klein και συν. με τις μελέτες τους απέδειξαν ότι ο EBV είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της λοιμώδους μονοπυρήνωσης και ήταν οι πρώτοι που παρατήρησαν ότι έχει ικανότητες μετασχηματισμού κυττάρων σε καρκινικά. Το 1969 παρατηρήθηκε ότι ο EBV μπορεί να καθιστά αθάνατα τα λεμφοκύτταρα σε καλλιέργεια. Ήταν ο πρώτος υποψήφιος ογκογόνος ιός του ανθρώπου (Kieff et al 1982). Εικόνα 25. Γεωγραφική κατανομή της εμφάνισης του Λεμφώματος Burkitt. Tαξινόμηση του EBV Ο EBV αποτελεί σήμερα το πρότυπο της υποοικογένειας γ των δυνητικά ογκογόνων ερπητοϊών και παρουσιάζει την χαρακτηριστική δομή των ερπητοϊών (Εικόνα 26). Η υποοικογένεια γ περιλαμβάνει τους Λεμφοκρυπτοϊούς Lymphocryptovirus (LCV) και τους Ραδινοϊούς Rhadinovirus (RDV) (Εικόνα 21). Ο ιός EBV είναι ο μόνος ανθρώπινος LCV ιός και ο ιός του σαρκώματος Κaposi (KSHV) είναι ο μόνος ανθρώπινος RDV ιός. Λεμφοκρυπτοϊοί αντίστοιχοι με τον EBV έχουν βρεθεί και σε άλλα πρωτεύοντα, ενώ Ραδινοϊοί έχουν βρεθεί και σε πολλά θηλαστικά πέρα των πρωτευόντων. Η παρουσία των Ραδινοϊών σε πλήθος θηλαστικών και ο μεγαλύτερος πολυμορφισμός σε επίπεδο γονιδιώματος σε σχέση με τους Λεμφοκρυπτοϊούς στηρίζουν την άποψη ότι οι Ραδινοϊοί εμφανίστηκαν νωρίτερα κατά την εξέλιξη. Είναι δε πιθανό οι Λεμφοκρυπτοϊοί να προέκυψαν από έναν προγονικό Ραδινοϊό πρωτευόντων, 61

γεγονός που εξηγεί και την παρουσία των Λεμφοκρυπτοϊών αποκλειστικά στα πρωτεύοντα (Albrecht 2000). Εικόνα 26. Η δομή του ιού Epstein Barr. Γενικά, τα γονιδιώματα των Λεμφοκρυπτοϊών και Ραδινοϊών μοιάζουν αρκετά μεταξύ τους και διαφέρουν αισθητά από αυτά των ερπητοϊών α ή β. Από τα 75 ανοιχτά αναγνωστικά πλαίσια (ORFs, open reading frames) του ιού του σαρκώματος Κaposi (KSHV) 54 είναι ομόλογα με του EBV και μόνο ένα από αυτά τα 54 ΟRFs βρίσκεται σε διαφορετική περιοχή στους δύο ιούς (Rickinson et al. 2001). Παρόλα αυτά οι Λεμφοκρυπτοϊοί και Ραδινοϊοί είναι δύο ευδιάκριτα γένη. Η ομολογία σε επίπεδο αλληλουχίας νουκλεοτιδίων μεταξύ του KSHV και του ΕBV δεν είναι εκτεταμένη. Τα πρωτεύοντα, συμπεριλαμβανομένου και του ανθρώπου, είναι δυνατόν να μολύνονται κατ επανάληψη από ιούς και των δύο γενών, αλλά μόνο οι Λεμφοκρυπτοϊοί έχουν την ικανότητα να καθιστούν αθάνατα τα Β λεμφοκύτταρα του ξενιστή. Σε επίπεδο γονιδιώματος οι Ραδινοϊοί φέρουν υψηλά επαναλαμβανόμενες ευθείες τελικές επαναλήψεις και στερούνται επιμηκών εσωτερικών ευθείων επαναλήψεων. Οι Ραδινοϊοί φέρουν γονίδια για την δι υδροφολική ρεδουκτάση, για ρυθμιστικούς παράγοντες ιντερφερονών, υποδοχείς G πρωτεϊνών και ανάλογα κυκλινών. Κανένα από αυτά τα γονίδια δεν βρέθηκαν στους Λεμφοκρυπτοϊούς (Kieff et al. 2001). 62

Γενικά χαρακτηριστικά του ιού O EBV παρουσιάζει διπλό κυτταρικό τροπισμό για τα ανθρώπινα Β λεμφοκύτταρα (μη παραγωγική λοίμωξη) και για τα επιθηλιακά κύτταρα (παραγωγική λοίμωξη) (Andersson 2003). Βάσει του πολυμορφισμού του ΕΒΝΑ 2 γονιδίου του διακρίνεται σε δύο τύπους: τον τύπο 1 (ή τύπο Α) και τον τύπο 2 (ή τύπο Β). Έχει αναφερθεί ότι ο τύπος 2 συνδέεται συχνά με Τ λεμφώματα, ακόμα και σε περιοχές όπου ο τύπος 1 παρουσιάζει μεγαλύτερη επίπτωση. H πρωτοπαθής λοίμωξη από τον ΕBV αρχίζει στο επιθήλιο του στοματοφάρυγγα, όπου τα ιοσωμάτια αντιγράφονται και στην συνέχεια απελευθερώνονται από τα επιθηλιακά κύτταρα μέσα στη σίελο. Ακολούθως, τα ιοσωμάτια εισχωρούν στα Β λεμφοκύτταρα τα οποία φέρουν υποδοχείς για τον ιό κοινούς με συστατικά του συμπληρώματος, και παραμένουν εντός του πυρήνα σε επισωματική μορφή (Eικόνα 27). Αν και τα κύρια κύτταρα στόχοι του ιού είναι τα ανθρώπινα Β λεμφοκύτταρα, προσβάλλει επίσης τα επιθηλιακά κύτταρα, τα κύτταρα των πόρων των σιελογόνων αδένων, τα Τ λεμφοκύτταρα, τα ΝΚ κύτταρα, τα μακροφάγα, τα κύτταρα των λείων μυϊκών ινών και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα προσβεβλημένα από τον ιό Β κύτταρα εκφράζουν ποικίλα EBV αντιγόνα τα οποία δρουν ως μόρια στόχοι που αναγνωρίζονται από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, μόνο ένα μικρό ποσοστό των προσβεβλημένων Β κυττάρων παραμένει σε λανθάνουσα κατάσταση χάρη στον ανοσοποιητικό μηχανισμό, ο οποίος δρα μέσω του συστήματος ΜΗC I παράγοντας ειδικά για τα αντιγόνα του EBV κυτταροτοξικά Τ κύτταρα Όταν εξασθενήσει η ανοσοποιητική άμυνα του οργανισμού, επανενεργοποιούνται τα προσβεβλημένα Β κύτταρα με επακόλουθο πολυκλωνικό πολλαπλασιασμό και εξάπλωση του EBV σε άλλους ιστούς (Lopes et al. 2003). Η λανθάνουσα EBV λοίμωξη διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή του κακοήθους φαινοτύπου και την μεταμόρφωση των μολυσμένων κυττάρων. Κάποια παράγωγα ιικών γονιδίων τα οποία συνδέονται με την λανθάνουσα μόλυνση, χαρακτηρίζονται από βιολογικές ιδιότητες που ενέχονται στην κυτταρική αθανατοποίηση). Θεωρείται ότι πολλοί ιοί χρησιμοποιούν μία πλειάδα μηχανισμών που τους επιτρέπει να διαφεύγουν από τους ανοσοποιητικούς μηχανισμούς του ξενιστή και να εγκαταστήσουν λανθάνουσα λοίμωξη. Τέτοιοι μηχανισμοί είναι η αναστολή της έκφρασης των ιικών αντιγόνων, η απάλειψη των ειδικών για τον ιό Τ κυττάρων, η δημιουργία μεταλλαγμένων ιών που παράγουν μηαντιγονικούς επίτοπους, η παρέμβασή τους στην αντιγονική διαδικασία και η ανοσολογική ανοχή λόγω λοίμωξης σε νεαρή ηλικία. 63

Εικόνα 27. Mόλυνση Β λεμφοκυττάρων από τον EBV. Στην λανθάνουσα λοίμωξη, τα ΕΒV πυρηνικά αντιγόνα (EBNA) αποτελούνται από τα EBNA 1, 2, 3A, 3B, 3C. Μετά την έκφραση των ΕΒΝΑ, έπεται η έκφραση των λανθανόντων μεμβρανικών πρωτεϊνών (LMPs), συμπεριλαμβανομένων των LMP 1, 2Α και 2Β. Όλα τα ΕΒΝΑs και LMPs, εκτός από το EBNA 1, είναι μόρια στόχοι για τα ειδικά για τον EBV κυτταροτοξικά Τ κύτταρα (Πίνακας 6) (Lopes et al. 2003). Η LMP 1 έχει ογκογόνο δράση προκαλώντας αυξημένη έκφραση κυτταρικών γονιδίων και αναστέλλοντας την απόπτωση με την επαγωγή του bcl 2.Πρόσφατα διαπιστώθηκε ότι η LMP 1 είναι ένα ιικό ανάλογο της οικογένειας των υποδοχέων του TNF και είναι σημαντικό για την μεταμόρφωση των Β κυττάρων. Η EBNA 1 είναι σημαντικό για την αντιγραφή των επισωματικών μορφών του ΕΒV κατά την λανθάνουσα φάση. Η EBNA 2 μπορεί να επάγει την μεταμόρφωση των Β κυττάρων αυξάνοντας την έκφραση των LMPs. 64

Πίνακας 6. Πρωτεΐνες του EBV που εκφράζονται κατά τη λανθάνουσα μόλυνση. EBNA 1 EBNA 2 EBNA 3 family EBNA LP Πρωτεΐνη που συνδέεται στο DNA και είναι απαραίτητη για την αντιγραφή και τη διατήρηση του επισωματικού παράγοντα του EBV Απαραίτητη για τον μετασχηματισμό των B λεμφοκυττάρων Επάγει την μεταγραφή κυτταρικών και ιικών γονιδίων Ενισχύει την μεταγραφή των : CD21, CD23, LMP1, LMP24,5,c myc Ογκογονιδίο 6 Εμπλέκεται στο Notch μονοπάτι Αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη RBP Jκ8 η οποία συνδέεται στο DNA Oμάδα 3 πρωτεϊνών. Οι EBNA 3A και EBNA 3C είναι απαραίτητες για το μετασχηματισμό των Β λεμφοκυττάρων, ενώ η EBNA 3B δεν είναι απαραίτητη. Όχι απόλυτα αναγκαία για τον μετασχηματισμό κυττάρων in vitro, αλλά απαραίτητη για τη διατήρηση και την αποτελεσματική ανάπτυξη κυτταρικών σειρών B λεμφοκυττάρων. Απαραίτητη για τον μετασχηματισμό των Β λεμφοκυττάρων LMP 1 Επάγει την μεταγραφή του παράγοντα NF B10 και άλλων παραγόντων μεταγωγής σημάτων συμπεριλαμβανομένων και των JNK και p38/mapk Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί δύο πρωτεΐνες, την LMP2A και την LMP2B. Η LMP2A μπλοκάρει τον υποδοχέα των B λεμφοκυττάρων προκαλεί την κινητοποίηση LMP 2 του ασβεστίου,τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης και την ενεργοποίηση του λυτικού κύκλου του EBV. EBV= Epstein Barr virus, EBNA= EBV nuclear antigen, LP= leader protein, LMP= latent membrane protein, JNK, cjun N terminal kinase. Epstein Barr Virus associated Cancers HERPES 10:3 2003 Βασιζόμενοι στα διάφορα πρότυπα έκφρασης των ΕΒV προϊόντων της λανθάνουσας φάσης, διακρίνουμε 3 ξεχωριστούς τύπους λανθάνουσας λοίμωξης in vivo (Εικόνα 28). Στον τύπο Ι εκφράζεται μόνο η EBNA 1. Με αυτόν τον τρόπο, ο ιός παραμένει αόρατος για το ανοσοποιητικό σύστημα γιατί η κυτταρική ανοσία κατευθύνεται έναντι άγνωστων πρωτεϊνών και δεν είναι προγραμματισμένη να αναγνωρίζει το ξένο νουκλεϊκό οξύ. Ο τύπος Ι ισχύει στα νεοπλασματικά κύτταρα ασθενών με λέμφωμα Βurkitt. Στον τύπο ΙΙ, εκφράζονται η EBNA 1 και οι LMPs. Η αναστολή της έκφρασης των υπόλοιπων γονιδίων επιτρέπει στα μολυσμένα κύτταρα να διαφεύγουν από την ανοσοποιητική επιτήρηση, όπως συμβαίνει στα κύτταρα ασθενών με καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα και Τ λεμφώματα. Τέλος, σε ασθενείς με AIDS και Β λεμφώματα καθώς και σε ανοσοκατεσταλμένους εκφράζονται όλα τα αντιγόνα (τύπος ΙΙΙ) αλλά είναι εξασθενημένη η ανοσολογική απάντηση του ξενιστή (Lopes et al. 2003). 65

Εικόνα 28. Ιική έκφραση κατά τους τρεις τύπους λανθάνουσας μόλυνσης. Κλινική εικόνα Ο ιός Epstein Barr απαντάται στο περίπου 90% των ενηλίκων ανεξάρτητα από την γεωγραφική τους προέλευση. Η πρώτη επαφή του ατόμου με τον ιό γίνεται συνήθως κατά τη διάρκεια της πρώτης δεκαετίας της ζωής του. Το μολυσμένο άτομο φέρει τον ιό στο σάλιο του επιτρέποντας τη μετάδοσή του μέσω της στοματικής οδού. Η πρώτη προσβολή του ιού οδηγεί στις περισσότερες περιπτώσεις σε μία αυτοπεριοριζόμενη λεμφοπολλαπλασιαστική ασθένεια που ονομάζεται λοιμώδης μονοπυρήνωση. Ο EBV μετά την πρωτογενή λοίμωξη μεταδίδεται καθόλη την διάρκεια της ζωής του ασθενούς μέσω του σίελου. Έτσι τα μολυσμένα άτομα μεταδίδουν συνεχώς ή κατά περιόδους τον ιό σε μη μολυσμένα άτομα μέσω στενής στοματικής επαφής (Niedobitek et al. 2000). Στα νεαρά άτομα η οξεία λοίμωξη προκαλεί λοιμώδη μονοπυρήνωση, ενώ σπανιότερο είναι το σύνδρομο Gianotti Crosti (Straus et al. 1993). Επειδή η ΕΒV λοίμωξη στην Ασία και την Αφρική λαμβάνει χώρα κατά την παιδική ηλικία, η συμπτωματική λοιμώδης μονοπυρήνωση είναι λιγότερο συχνή σε αυτές τις χώρες από ότι στις δυτικές χώρες και τις ΗΠΑ, όπου η πρωτοπαθής ΕBV λοίμωξη συμβαίνει στην εφηβεία. Κατά την οξεία EBV λοίμωξη, η έντονη ανοσοποιητική αντίδραση από τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα έναντι των προσβεβλημένων Β κυττάρων, προκαλεί χαρακτηριστική κλινική εικόνα με εμπύρετο, κυνάγχη, λεμφαδενοπάθεια και λεμφοκυττάρωση. Στο ήμισυ των περιπτώσεων συνυπάρχει σπληνομεγαλία. Περιστασιακά εμφανίζεται το πετεχειώδες εξάνθημα. Συνήθης 66

εκδήλωση της λοιμώδους μονοπυρήνωσης είναι η ηπατίτιδα με ηπατομεγαλία και ίκτερο. Σπανιότερα υπάρχει προσβολή του ΚΝΣ με κεφαλαλγία και επώδυνη νευρίτιδα. Πίνακας 7. Τύποι λανθάνουσας φάσης και αναπτυσσόμενοι όγκοι. Τύπος λανθάνουσας φάσης Πρωτεΐνες που εκφράζονται Ανάπτυξη όγκων που σχετίζονται με τον EBV TYΠΟΣ Ι ΕΒΝΑ1 Λέμφωμα Burkitt ΤΥΠΟΣ ΙΙ ΤΥΠΟΣ ΙΙΙ ΕΒΝΑ1 LMP1, LMP2 EBNA1, EBNA2, EBNA LP, EBNA3A,3B,3C LMP1, LMP2 Hodgkin s λέμφωμα, Λέμφωμα T κυττάρων, Ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα Λέμφωμα BLPD Μετά μεταμοσχευτικό λέμφωμα Σε ανοσοκατεσταλμένους ή ανοσοανεπαρκείς ασθενείς (ασθενείς με ΑIDS ή με μεταμόσχευση νεφρού) προκαλείται μία πλειάδα νόσων που σχετίζονται με τον λεμφοκυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η λανθάνουσα λοίμωξη από τον ΕBV έχει συνδεθεί με διάφορες κακοήθεις καταστάσεις σε μη ανοσοκατεσταλμένα άτομα. Ειδικότερα, ο EBV έχει ανιχνευτεί σε αρκετές κακοήθειες, με το λέμφωμα του Burkitt να αποτελεί την αφορμή της ανακάλυψης του ιού το 1964. Σε αρκετές από αυτές τις κακοήθειες η συσχέτιση με τον ιό είναι ξεκάθαρη ενώ σε άλλες χρειάζονται περισσότερα πειραματικά δεδομένα για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος του EBV. Παρά το γεγονός όμως ότι η μόλυνση από τον EBV είναι κοινή και εμφανίζει παγκόσμια κατανομή, οι σχετιζόμενες κακοήθειες είναι σπάνιες και εμφανίζονται γεωγραφικά περιορισμένες. Αυτή η παρατήρηση υποδεικνύει ότι για την ανάπτυξη αυτών των κακοηθειών συμβάλλουν και άλλοι παράγοντες και ουσιαστικά μπορεί ο ιός να είναι απαραίτητος για την ογκογένεση αλλά στις περισσότερες των περιπτώσεων δεν είναι επαρκής (Crawford 2001). Οι πρωτεΐνες που εκφράζονται και ο τύπος λανθάνουσας φάσης που εκδηλώνουν τα κύτταρα αναπτυσσόμενων όγκων που σχετίζονται με τον EBV παρουσιάζονται στον πίνακα 7. Ο EBV σχετίζεται τουλάχιστον με τέσσερα λεμφώματα (Πίνακας 8): το λέμφωμα Burkitt, την Β λεμφοπολλαπλασιαστική ασθένεια (BLPD) σε ασθενείς με ανοσοκαταστολή, το λέμφωμα του Hodgking και το Τ κυτταρικό λέμφωμα (Crawford 2001). Τα τρία πρώτα λεμφώματα είναι Β κυτταρικής προέλευσης, διαφέρουν στην έκφραση των αντιγόνων του ιού και εξαρτώνται από διαφορετικούς συμπαράγοντες. Τέλος ο EBV έχει συσχετιστεί και με 2 κακοήθειες των επιθηλιακών κυττάρων: το ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα και το γαστρικό καρκίνωμα (Liu et al. 2004, Hao et al. 2004). 67

Πίνακας 8.ΕΒV & Ογκογένεση. Κακοήθειες σχετιζόμενες με τον EBV Όγκος Λέμφωμα Burkitt Προτεινόμενο κύτταρο προέλευσης Κεντροβλάστες Ποσοστό % συσχετισμών με τον EBV Αφρική 96% Σποραδικά 10 70 % AIDS 30 40% BLPD Β λεμφοβλάστες 90% Λέμφωμα Hodgkin Τ κυτταρικό λέμφωμα Κεντροκύτταρα 40 80% Τ λεμφοκύτταρα 10% Έκφραση ιικών πρωτεϊνών ΕΒΝΑ 1 EBNA 1, 2, 3A, 3B, 3C, LMP 1, 2A, EBNA 1, LMP 1, 2A, 2B EBNA 1, LMP 1, 2A, 2B Συμπαράγοντες ελονοσία, απορύθμιση του c myc, HIV ανοσοκαταστολή, HIV λοιμώδης μονοπυρήνωση χρόνια λοιμώδης μονοπυρήνωση, ανοσοκαταστολή Ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα Φολιδωτά επιθηλιακά κύτταρα 100% EBNA 1, LMP 1, 2A, 2B γενετικοί και διαιτητικοί παράγοντες Γαστρικό καρκίνωμα στομάχου Επιθηλιακά κύτταρα 10% EBNA 1, LMP 2A άγνωστοι Διάγνωση και θεραπεία Στις περιπτώσεις πρωτοπαθούς λοίμωξης, ανιχνεύονται υψηλοί τίτλοι ειδικών για τον ιό IgM και IgG αντισωμάτων κατά των αντιγόνων της κάψας του ιού (Virus Capsid Antigen,VCA). Τα IgG αντισώματα ανιχνεύονται εφ όρου ζωής. Αύξηση των τίτλων των IgG αντισωμάτων υποδηλώνει ενεργοποίηση του EBV. Σε περιπτώσεις χρόνιας λοίμωξης, ανιχνεύονται υψηλοί τίτλοι IgG αντισωμάτων. Τα IgA αντισώματα αυξάνονται σε ασθενείς με καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα. Στις περισσότερες περιπτώσεις ΕΒV λεμφοπολλαπλασιαστικών διαταραχών δεν παρατηρείται σημαντική αύξηση των τίτλων των αντισωμάτων. Η ανίχνευση των EBV αντισωμάτων γίνεται με την δοκιμασία Paul Bunnell (δοκιμασία συγκόλλησης ερυθρών αιμοσφαιρίων προβάτου) και με τεχνικές ανοσοφθορισμού (Eικόνα 29). Η εφαρμογή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) επιτρέπει την ανίχνευση του DNA του ιού ακόμα κι όταν αυτό υπάρχει σε μικρές ποσότητες. Λόγω της υψηλής της ευαισθησίας, τα αποτελέσματα της PCR θα πρέπει να ερμηνεύονται προσεκτικά διότι δείγματα επιμολυσμένα με ΕΒV ή η παρουσία παρακείμενων ΕΒV μολυσμένων κυττάρων μπορούν να 68

δώσουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα (Khanim,1996). Με την PCR μπορεί να προσδιοριστεί και ο υπότυπος του ιού. Τέλος, πολύ ειδική μέθοδος για την ανίχνευση του EBV και τον ποσοτικό προσδιορισμό του ιικού φορτίου είναι και η PCR Πραγματικού χρόνου, για την οποία θα γίνει εκτενής αναφορά στην ενότητα της μεθοδολογίας. Για την οξεία ΕΒV λοίμωξη δεν υπάρχει ειδική θεραπεία. Χρησιμοποιούνται συμπτωματικά μέτρα και χορηγούνται μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη, ενώ σε βαριά πάσχοντες μπορεί να είναι αποτελεσματικά και τα κορτικοστεροειδή. Οι επιπλοκές (ηπατίτιδα, μυοκαρδίτιδα, εγκεφαλίτιδα) αντιμετωπίζονται συμπτωματικά (Lopes et al. 2003). Ως προς τα λεμφώματα που οφείλονται σε ΕΒV, χορηγούνται διάφορα χημειοθεραπευτικά σχήματα που περιλαμβάνουν δοξορουμπικίνη, πρεδνιζόνη και κυκλοφωσφαμίδη. Εν τούτοις, τα επιθετικά ΕΒV λεμφώματα παρουσιάζουν αντίσταση στη συμβατική χημειοθεραπεία. Αυτό πιθανώς οφείλεται στο σύνδρομο συστηματικής αιμοφαγοκυττάρωσης και σε έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με ανθεκτικότητα σε πολλαπλά φάρμακα. Προς το παρόν για αυτές τις περιπτώσεις δεν υπάρχει καθιερωμένο θεραπευτικό πρωτόκολλο. Σε επίπεδο κλινικών δοκιμών χρησιμοποιούνται αντί CD19 μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία σταματούν τον κυτταρικό κύκλο σε κυτταρικές σειρές λεμφώματος Burkitt in vitro (Lopes et al. 2003). Εικόνα 29. Ανίχνευση του EBV με την τεχνική του ανοσοφθορισμού (αριστερά anti EBV CA στη μέση anti EBNA και δεξιά anti EBV EA αντισώματα). 1.5.3 O μεγαλοκυτταροιός (CMV) Ταξινόμηση του CMV Ο κυτταρομεγαλοϊός (CMV) ή ερπητοϊός του ανθρώπου τύπου 5 (HHV 5) ανήκει στους β ερπητοϊούς. Πρόκειται για DNA ιό με πολλαπλό τροπισμό και τη χαρακτηριστική δομή των ερπητοϊών (Εικόνα 30). To όνομά του προέρχεται από τις ελληνικές λέξεις κύτταρο και μεγάλος και οφείλεται στην χαρακτηριστική μεγέθυνση που προκαλεί στα κύτταρα που προσβάλει. Ο CMV κατατάσσεται μόνος του σε ένα ξεχωριστό γένος (Cytomegalovirus) της υποοικογένειας των β ερπητοϊών καθώς μοριακές μελέτες του γονιδιώματός του δείχνουν ότι έχει διαχωριστεί 69

νωρίς τόσο από τους ερπητοϊούς των άλλων υποοικογενειών, όσο και από τους ιούς του γένους Roseolovirus (Eικόνα 21) (Arvin et al. 2006) Εικόνα 30. Δομή του CMV. Γενικά χαρακτηριστικά του ιού O ιός CMV, αντίθετα από τον ιό HSV, δεν αναστέλλει την βιοσύνθεση μακρομορίων στο κύτταρο ξενιστή αλλά διεγείρει την σύνθεση κυτταρικού DNA, RNA και πρωτεϊνών (α ή άμεσα πρώιμες, β ή πρώιμες, γ ή όψιμες). Ένα από τα πιο μελετημένα γονίδια του CMV είναι το άμεσα πρώιμο γονίδιο ΙΕ2 το οποίο ενεργοποιεί τόσο την ιική όσο και την κυτταρική έκφραση γονιδίων, και ταυτόχρονα έχει ικανότητα πρόσδεσης με την πρωτεΐνη του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Rb με τρόπο παρόμοιο με αυτόν των πρωτεϊνών των ογκογόνων ιών (Arvin et al. 2006) Κατά την λοίμωξη με τον CMV, ιικά σωμάτια με έλυτρο παρατηρούνται με την μορφή κενοτοπίων στο κυτταρόπλασμα και συντήκονται με τις κυτταρικές μεμβράνες επιτρέποντας την έξοδο των ώριμων σωματιδίων του ιού (Εικόνα 31). Ιικά σωμάτια ωριμάζουν επίσης στο σύστημα Golgi και εξέρχονται από το μολυσμένο κύτταρο κατά τον ίδιο τρόπο, παρασύροντας κατά την έξοδό τους γλυκοπρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης του κυττάρου ξενιστή, που είναι ειδικές για τον ιό. 70

Εικόνα 31. Eνθοθηλιακό κύτταρo προσβεβλημένo από τον CMV. [ Ανοσοφθορισμός Μπλε: DAPI = κυτταρικό DNA. Πράσινο = GFP (green fluorescence protein). Αποχρώσεις του κόκκινου =ιικές πρωτείνες. (Joerg Schroeer, Princeton University online Art Gallery)] Όταν ο CMV προσβάλει ένα κύτταρο αρχικά προσδένεται στην θειϊκή ηπαράνη, πρωτεογλυκάνη της κυτταρικής μεμβράνης (HSPG) μέσω των γλυκοπρωτεϊνών του φακέλου gμ, gβ (Εικόνα 32). Στη συνέχια προσδένεται και με άλλες πρωτεΐνες υποδοχής του κυττάρου όπως EGFR και ιντεγκρίνες, οι οποίες στέλνουν σήματα στο εσωτερικό του κυττάρου, προετοιμάζοντάς το για την ιϊκή αντιγραφή. Τέλος, ο ιός συντήκεται με την κυτταρική μεμβράνη μέσω της γλυκοπρωτεΐνης του φακέλου gb, gh, gl, go και απελευθερώνεται το καψιδίο στο εσωτερικό του κυττάρου. Μετά την είσοδο του CMV στο κύτταρο, εάν εκφραστούν οι πρωτεΐνες της άμεσης πρώιμης φάσης (immediate early), γίνεται μεταγραφή και μετάφραση των πρωτεϊνών του ιού και αναπαράγεται, μέσω λυτικού κύκλου. Στην αντίθετη περίπτωση, οι μεταγραφικοί παράγοντες του κυττάρου δεν επιτρέπουν την ιική μεταγραφή και ο ιός οδηγείται σε λανθάνουσα κατάσταση. 71

Εικόνα 32.Είσοδος του CMV στα κύτταρα μέσω της μεμβράνης. Επιδημιολογία Πάνω από το 80% των ενηλίκων είναι οροθετικοί, γεγονός που είναι ενδεικτικό προηγηθείσας έκθεσης στον ιό (Kano et al. 2000).O ιός CMV έχει την ικανότητα μόλυνσης τόσο με κάθετη όσο και με οριζόντια μεταφορά του, κατά την πρωτοπαθή μόλυνση, επαναμόλυνση ή επανενεργοποίησή του. Οι σιελογόνοι αδένες, οι νεφροί και τα λευκοκύτταρα είναι οι κύριες θέσεις πολλαπλασιασμού του ιού κατά την πρωτοπαθή λοίμωξη. Ο ιός μπορεί να ανευρεθεί και σε κολπικές εκκρίσεις, σπέρμα, μητρικό γάλα, ούρα και αίμα. Η μετάδοση του ιού γίνεται είτε μέσω της αναπνευστικής οδού και των σεξουαλικών σχέσεων (συχνότερα στην εφηβεία και την πρώιμη ενήλικη ζωή) είτε από τη μητέρα στο έμβρυο κατά τη διάρκεια της κύησης. Ειδικότερα, κάθετη μετάδοση συμβαίνει με ενδομήτρια μόλυνση μέσω του πλακούντα ή λόγω ιαιμίας της εγκύου καθώς και με περιγεννητική μόλυνση από μολυσμένες γεννητικές εκκρίσεις της μητέρας ή κατά τον θηλασμό με μητρικό γάλα που περιέχει τον ιό (Stagno et al. 1983). Η στενή προσωπική επαφή είναι απαραίτητη για την οριζόντια μετάδοση του ιού και οι πιθανότητες μόλυνσης αυξάνονται σε περιβάλλον με μη υγιεινές συνθήκες διαβίωσης και σε κοινωνίες με χαμηλό κοινωνικο οικονομικό επίπεδο (Collier et al. 1995). Πρωτοπαθής μόλυνση μπορεί να προκύψει και μετά από μετάγγιση αίματος ή μεταμόσχευση οργάνων (Ergazaki et al. 1994). Σε ασθενείς με AIDS παρατηρείται σημαντικά αυξημένο ποσοστό παραγωγικής CMV λοίμωξης. 72

Μετά την πρωτοπαθή λοίμωξη το DNA του CMV, όπως συμβαίνει και με τους άλλους ερπητοϊούς, έχει την ικανότητα ενσωμάτωσης στα κύτταρα του ξενιστή και παραμονής σε λανθάνουσα κατάσταση. Ωστόσο, ευκαιριακά ο ιός επανενεργοποιείται από την λανθάνουσα μορφή και τότε μολυσματικά βίρια εμφανίζονται στην σίελο και τα ούρα. Όταν η επανενεργοποίηση συμβεί κατά την διάρκεια της εγκυμοσύνης είναι ιδιαίτερα επικίνδυνο για το έμβρυο. Τελευταίες έρευνες αποδεικνύουν ότι κατά μέσο όρο τα 2/3 περίπου του πληθυσμού παγκοσμίως είναι φορείς του ιού. Για την Ελλάδα οι μελέτες δείχνουν ότι δεν αποκλίνει από τον παραπάνω μέσο όρο. Έτσι, αν σκεφτεί κανείς το μεγάλο αριθμό των γυναικών που έχουν μολυνθεί με τον ιό, είναι προφανές ότι ο κυτταρομεγαλοϊός είναι η συχνότερη ιογενής λοίμωξη κατά τη διάρκεια της κύησης. Kλινική εικόνα Η CMV λοίμωξη συνοδεύεται συχνά από συμπτωματολογία λοιμώδους μονοπυρήνωσης, ενώ ενίοτε εξελίσσεται σε ηπατίτιδα. Παράλληλα, ο ιός ευθύνεται για σημαντικό ποσοστό περιπτώσεων ιογενούς εγκεφαλίτιδας, καθώς και για σοβαρές εμβρυϊκές βλάβες κατά τη διάρκεια της κύησης. Επιπλέον, η παρουσία του έχει συσχετισθεί με την ανάπτυξη όγκων επιθηλιακής προέλευσης. Τα έμβρυα μολύνονται με τον CMV από τη μητέρα τους είτε από λοίμωξη που έπαθε αυτή για πρώτη φορά κατά τη διάρκεια της κύησης είτε από αναζωπύρωση παλαιάς λοίμωξης. Στις περισσότερες περιπτώσεις οφείλεται σε αναζωπύρωση της λοίμωξης. Συνέπεια πάντως της προσβολής των εμβρύων από τον CMV είναι η γέννηση παιδιών με προβλήματα στη λειτουργία του κεντρικού νευρικού συστήματος, δηλαδή με νευροψυχικές ανωμαλίες, όπως ψυχοκινητική καθυστέρηση, απώλεια ακοής, τύφλωση, μικροκεφαλία, πετέχια (εμφάνιση αιμορραγικών κηλίδων στο δέρμα χωρίς τραυματική αφορμή). Περίπου 5% των συγγενώς μολυσμένων νεογνών γεννιούνται με κλινικά συμπτώματα. Η συνδρομή που εμφανίζουν είναι γνωστή ως «νόσος των μεγαλοκυτταρικών εγκλείστων» και η πρόγνωσή τους είναι κακή. Το υπόλοιπο 95% φαίνεται να είναι φυσιολογικό κατά τη γέννηση, όμως ένα μικρό ποσοστό εμφανίζει συμπτώματα με την πρόοδο της ηλικίας (Preece et al. 1984). Συμπτωματικά νεογνά που γεννιούνται με αυτό το σύνδρομο εμφανίζουν αναστολή της ανάπτυξης, ίκτερο, ηπατοσπληνομεγαλία, θρομβοκυττοπενία και εγκεφαλίτιδα, με ή χωρίς μικροκεφαλία. 73

Σε ποσοστό 1% των συγγενώς μολυσμένων βρεφών, ο ιός προκαλεί σοβαρές βλάβες με αποτέλεσμα να πεθαίνουν κατά την νηπιακή ηλικία. Εάν το νεογνό επιζήσει είναι σχεδόν βέβαιο ότι θα εμφανίσει γενετικές ανωμαλίες με την πάροδο των ετών. Η βλάβη του εγκεφάλου δύναται να εκδηλωθεί ως μικροκεφαλία, διανοητική καθυστέρηση, σπαστική παράλυση ή σπασμούς και αισθητή βλάβη του οργάνου, όπως τύφλωση ή κώφωση. Όσον αφορά στα νεογνά που είναι ασυμπτωματικά κατά την γέννηση, το 15 % πιθανόν να εμφανίσει προβλήματα ακοής ή διανοητική καθυστέρηση. Η CMV λοίμωξη σε μη ανοσοκατεσταλμένους ενήλικες συνήθως διαδράμει υποκλινικά. Όμως μπορεί να εκδηλωθεί και ως CMV λοιμώδης μονοπυρήνωση. Αυτό μπορεί να συμβεί και κατά την επανενεργοποίηση του CMV αλλά είναι λιγότερο συχνό από ότι κατά την πρωτοπαθή λοίμωξη. Ο CMV ευθύνεται για το 8% των μονοπυρηνώσεων και η CMV λοιμώδης μονοπυρήνωση μοιάζει με αυτήν που προκαλείται από τον EBV, αλλά τα συμπτώματα είναι λιγότερο σοβαρά και συνίστανται σε επίμονο εμπύρετο, μυαλγία, αμυγδαλίτιδα και τραχηλική λεμφαδενοπάθεια (Watanabe et al. 1997). Μετά την πρόδρομη περίοδο εμφανίζεται δερματικό εξάνθημα το οποίο δύναται να συνδυαστεί με σύνδρομο Guillain Barre, μηνιγγίτιδα, ηπατίτιδα, πνευμονία, αιμολυτική αναιμία και θρομβοκυττοπενία (Cohen et al. 1985). Χαρακτηριστικά εργαστηριακά ευρήματα αποτελούν η παρουσία στο περιφερικό αίμα άτυπων λεμφοκυττάρων και υψηλών τρανσαμινασών. Τα άτυπα λεμφοκύτταρα είναι κυρίως CD8+ T κύτταρα που εκφράζουν CD57 αντιγόνα (Wang et al.1993). Aνοσοκατεσταλμένοι ασθενείς έχουν αυξημένες πιθανότητες να εμφανίσουν μολύνσεις από CMV. Συνήθως παρουσιάζουν δεκατική πυρετική κίνηση η οποία υποχωρεί εντός ολίγων ημερών. Ορισμένοι αναπτύσσουν ιαιμία η οποία μοιάζει με σηψαιμία και μπορεί να συνοδεύεται από ηπατίτιδα και πνευμονία. Στις περιπτώσεις που επιπλέκονται με πνευμονία η πρόγνωση είναι κακή (80 90% θνησιμότητα). Επίσης, το σάρκωμα Kaposi έχει συσχετισθεί ορολογικά και ιολογικά με μόλυνση από CMV. Διάγνωση και θεραπεία Τα ούρα, η σίελος, ηπαρινισμένα δείγματα αίματος και βιοψίες ιστών από τις βλάβες αποτελούν τα καταλληλότερα δείγματα για την απομόνωση του CMV. Ο κυτταρομεγαλοϊός αναγνωρίζεται σε ιστολογικά παρασκευάσματα από τα χαρακτηριστικά ενδοπυρηνικά έγκλειστα, γνωστά ως «μάτια κουκουβάγιας» (Εικόνα 33). Τα έγκλειστα αυτά παρατηρούνται σε κύτταρα των νεφρικών σωληναρίων, των χοληφόρων, στο πνευμονικό και ηπατικό παρέγχυμα αλλά σπάνια σε εγκεφαλικό ιστό. 74

Εικόνα 33. Xαρακτηριστικά ενδοπυρηνικά έγκλειστα σε CMV+ κύτταρα. Η μέθοδος αυτή παρουσιάζει μικρή ευαισθησία (Tong et al. 1997). Βιοψίες ιστών δύνανται να περιέχουν κύτταρα μολυσμένα με CMV τα οποία γίνονται ορατά μετά από χρώση, χρησιμοποιώντας ειδικά για τον ιό μονοκλωνικά αντισώματα. Στην διάγνωση χρησιμοποιούνται και ορολογικές μέθοδοι με την χρήση της δοκιμασίας καθήλωσης του συμπληρώματος και με ανίχνευση ειδικών για τον ιό IgM και IgG αντισωμάτων (Tong et al. 1997). Χρησιμοποιούνται ευρέως για την ανίχνευση παλαιότερης λοίμωξης, αν και η παρουσία στον ορό τετραπλάσιας αύξησης των IgM τίτλων είναι ένδειξη πρωτοπαθούς μόλυνσης. Ανοσοκατεσταλμένοι ασθενείς αδυνατούν να προκαλέσουν τυπική ανοσοαπόκριση και οι περιπτώσεις αυτές δεν μπορούν να ταυτοποιηθούν με ορολογικές μεθόδους. Πολύ συχνά χρησιμοποιείται και ο ανοσοφθορισμός (Εικόνα 34). Εικόνα 34. Ανίχνευση του CMV με ανοσοφθορισμό. 75

Επίσης έχουν χρησιμοποιηθεί και μοριακές τεχνικές όπως είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Λόγω της υψηλής της ευαισθησίας, τα αποτελέσματα της PCR θα πρέπει να ερμηνεύονται προσεκτικά διότι μια τόσο ευαίσθητη τεχνική μπορεί να ανιχνεύσει την παρουσία των ιών, χωρίς να υπάρχει αιτιολογική συσχέτιση με την νόσο. Επίσης θα πρέπει να ληφθούν προφυλάξεις για την αποφυγή της επιμόλυνσης που θα οδηγήσει σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Μεγαλύτερη ακρίβεια και δυνατότητα ποσοτικοποίησης του ιικού φορτίου προσφέρει η PCR πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) για την οποία θα γίνει αναφορά σε ειδικό κεφάλαιο. Πολύ συχνά στην διάγνωση της CMV λοίμωξης χρησιμοποιείται η δοκιμασία άμεσης αντιγοναιμίας pp65 λόγω της ταχύτητάς της. Η τεχνική αυτή συνίσταται στην άμεση ανίχνευση του CMV αντιγόνου στον πυρήνα των λευκοκυττάρων του περιφερικού αίματος, με την χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά της CMV πρωτεΐνης pp65 (Sharma et al. 1997). Αναφορικά με την θεραπεία της CMV λοίμωξης, δύο αντι ιικοί παράγοντες με αποτελεσματική δράση κατά του κυτταρομεγαλοϊού είναι η γκανσικλοβίρη ή DHPG και σε πειραματικό στάδιο ο παράγοντας Foscarnet. Η διάρκεια της θεραπείας είναι 14 21 ημέρες, ενώ για ασθενείς με AIDS η θεραπεία είναι εφ όρου ζωής. Οι επιπλοκές περιλαμβάνουν ουδετεροπενία από την γκανσικλοβίρη και νεφρική δυσλειτουργία λόγω του Foscarnet (Drew et al. 1988). 76

1.6 Σκοπός μελέτης Η Τ LGL λευχαιμία είναι μια κλωνική διαταραχή των Τ LGL κυττάρων η οποία χαρακτηρίζεται από ουδετεροπενία, αναιμία και θρομβοπενία. Η Τ LGL λευχαιμία συνοδεύεται συχνά από αυτοάνοσες εκδηλώσεις αλλά και από άλλα λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα. Η μορφή αυτή λευχαιμίας, είναι σχετικά σπάνια ενώ η αιτιολογία της νόσου δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. Στην προσπάθεια ανεύρεσης των διαφόρων αιτιολογικών παραγόντων, επιστημονικές ομάδες έκαναν διάφορες υποθέσεις. Η επικρατέστερη άποψη είναι ότι ένας εξωγενής παράγοντας, πιθανόν ένας ιός με μεγάλο χρόνο επώασης, προκαλεί σε γενετικά και ανοσολογικά προδιαθετημένα άτομα, μια παθολογική απορρυθμισμένη κυτταρική άνοση απάντηση, που τελικά οδηγεί σε λευχαιμία. Η ύπαρξη ιών ως αιτιολογικών παραγόντων που σχετίζονται με τη νόσο είναι η επικρατέστερη άποψη για την παθογένεση της ΝΚ LGL λευχαιμίας (ΤLVI, EBV κ.α.) ενώ στην περίπτωση της T LGL λευχαιμίας ενδείξεις στηρίζουν την πιθανή συμμετοχή του Τ λεμφοτρόπου ιού Ι (ΤLVI). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η πιθανή σχέση των ερπητοϊών CMV και ΕΒV με την εκδήλωση της T LGL λευχαιμίας. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκαν δείγματα ασθενών με Τ LGL λευχαιμία με τη μέθοδο της Real Time PCR. 77

2. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 2.1 Ομάδα ασθενών Η ομάδα μελέτης περιλαμβάνει 44 ασθενείς με τυπική T LGL λευχαιμία που παρακολουθούνται στην Αιματολογική Κλινική του ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου» και στο Αιματολογικό Τμήμα του ΓΝ Νίκαιας. 2.2 Συλλογή δειγμάτων Από τους ασθενείς συλλέχθηκαν διπλά δείγματα περιφερικού αίματος. Για την ανίχνευση του EBV χρησιμοποιήθηκε ολικό αίμα, ενώ για την ανίχνευση του CMV πλάσμα σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία (Espy et al. 2006). 2.3 Απομόνωση DNA Η απομόνωση DNA βασίζεται στην στην πέψη των πρωτεϊνών των κυτταρικών μεμβρανών και του κυτταροπλάσματος με πρωτεϊνάση Κ και γίνεται με τη βοήθεια του QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας. Οι στήλες (QIAamp Spin Columns) χρησιμοποιούνται για την απομόνωση νουκλεϊκών οξέων. Η απομόνωση βασίζεται στη χρήση μεμβρανών από πηκτή σιλικόνης η οποία δεσμεύει εκλεκτικά νουκλεϊκά οξέα, ενώ είναι διαπερατή από πρωτεΐνες και δισθενή κατιόντα που μπορεί να αναστείλουν την πολυμεράση κατά την αντίδραση PCR. Έτσι δεν είναι αναγκαία η οργανική εκχύλιση των νουκλεϊκών οξέων με την κλασική μέθοδο φαινόλης/χλωροφορμίου. Η απομόνωση του DNA είναι σημαντική για την μετέπειτα πορεία της πειραματικής διαδικασίας. Η παρουσία ουσιών αναστολέων παρεμποδίζουν τη δράση της πολυμεράσης. Τέτοιες συνήθως είναι κατάλοιπα πρωτεϊνών, δισθενή ιόντα που ανταγωνίζονται το μαγνήσιο για δέσμευση, μικρομοριακές οργανικές ενώσεις όπως κατάλοιπα αλογονωμένων υδρογονανθράκων, αλκοολών, εποξικών ενώσεων κ.α. Το QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) περιέχει: Πρωτεινάση Κ: η πρωτεάση αυτή χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με EDTA, απορρυπαντικά και σχετικά υψηλές θερμοκρασίες (56 ο C) ώστε οι περισσότερες πρωτεΐνες υποστρώματα μετουσιώνονται και αποικοδομούνται επιτυχώς από την πρωτεϊνάση Κ. Βuffer AL: το buffer αυτό περιέχει χαοτροπικά άλατα (γουανιδίνη), τα συστατικά αυτά μετουσιώνουν τις πρωτεΐνες καθώς επίσης καταστρέφεται η κυτταρική μεμβράνη. 78

στήλες : η λειτουργία τους βασίζεται στη χρήση σιλικόνης όπου δεσμεύονται εκλεκτικά τα νουκλεϊκά οξέα σε διάλυμα ενώ είναι διαπερατές από πρωτεΐνες και δισθενή κατιόντα που μπορεί να αναστείλουν την Taq πολυμεράση κατά την PCR. Βuffer AW1: διάλυμα έκπλυσης, περιέχει χαοτροπικά άλατα και χρησιμοποιείται για να γίνει έκλουση όλων των άχρηστων υλικών που μπορεί να υπάρχουν μέσα στη στήλη (π.χ. πρωτεΐνες). Προτίθεται αιθανόλη πριν τη χρήση του. Βuffer AW2: διάλυμα έκπλυσης, χρησιμοποιείται για να γίνει έκλουση και των υπολοίπων άχρηστων υλικών που έχουν παραμείνει στη στήλη. Προστίθεται αιθανόλη πριν τη χρήση του. Βuffer AE: διάλυμα απελευθέρωσης και διαλυτοποίησης του DNA που είναι δεσμευμένο στη στήλη, αυτό το buffer ελαττώνει τη χημική συγγένεια του DNA για τη στήλη και πετυχαίνεται η έκλουση του DNA. Κατά τη διαδικασία εκχύλισης ιικού DNA χρησιμοποιούνται επιπρόσθετα τα ακόλουθα υλικα: RNA φορέας (Carrier RNA): Είναι ένα Poly(A) RNA ομοπολυμερές το οποίο συμβάλει στη συγκράτηση των μικρών μορίων DNA, όπως είναι το ιικό, κατά τη διαδικασία της εκχύλισης. Αυτό αυξάνει την ευαισθησία της μεθόδου. Εσωτερικός μάρτυρας (Internal Control): DNA το οποίο ενισχύεται κατά τη διάρκεια της PCR και συμβάλει στον έλεγχο της διαδικασίας της εκχύλισης και τυχόν ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων. Η διαδικασία εκχύλισης του ιικού DNA που ακολουθήθηκε περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα : Προσθήκη 20 μl πρωτεϊνάσης Κ, 200 μl δείγματος (αίμα ή πλάσμα), 5 μl Ιnternal ontrol και 10 μl RNA carrier και 200 μl AL buffer (διάλυμα λύσης) σε σωληνάριο eppendorff (1,5 ml) Ανακίνηση ή vortex. Επώαση του δείγματος σε υδατόλουτρο στους 56 ο C για 10 λεπτά Προσθήκη 200 μl αιθανόλης (96% 100% αιθανόλη) στο σωληνάριο eppendorff και ανάδευση. Μεταφορά του δείγματος σε στήλη QIAamp και φυγοκέντρηση (6000 g, 1min). Αντικατάσταση σωληναρίου συλλογής κάτω από την στήλη. Προσθήκη στην στήλη 500 μl διαλύματος AW1. Φυγοκέντρηση (6000 g, 1min). Αντικατάσταση σωληναρίου συλλογής κάτω από την στήλη. Προσθήκη στην στήλη 500 μl AW2 buffer. Φυγοκέντρηση (20000 g (14000 rpm, 3 min). 79

Τοποθέτηση της στήλης σε σωληνάριο eppendorff (1,5 ml) και προσθήκη στην στήλη 100 μl AE buffer. Φυγοκέντρηση (6000 g,1min). Η στήλη απομακρύνεται. Το σωληνάριο eppendorff περιέχει το DNA και φυλάσσεται για ποιοτική και ποσοτική εκτίμηση με ηλεκτροφόρηση. 2.4 Real Time PCR 2.4.1 Γενικές αρχές της μεθόδου Η ποσοτική εκτίμηση της έκφρασης των γονιδίων συμβάλλει ουσιαστικά στη μελέτη των βιολογικών διεργασιών και στην κατανόηση της παθογένειας των ασθενειών. Για το σκοπό αυτό, πρόσφατα αναπτύχθηκαν μέθοδοι ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (real time PCR, RQ PCR) που αντικατέστησαν την πολύπλοκη και χρονοβόρα ημιποσοτική, συναγωνιστική ανάλυση PCR (competitive PCR). Όπως δηλώνει και το όνομα η real time PCR είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για να παρακολουθεί την πρόοδο μιας αντίδρασης PCR σε πραγματικό χρόνο. Η ποσοτική αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου συνίσταται σε αξιόπιστη ανίχνευση και μέτρηση των προϊόντων που δημιουργούνται κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, τα οποία αντιστοιχούν άμεσα στο ποσό του αρχικού μητρικού μορίου κατά την έναρξη της PCR. Με αυτό τον τρόπο μπορεί να μετρηθεί η ποσότητα του προϊόντος PCR ενώ η αντίδραση βρίσκεται ακόμη στην εκθετική φάση. Για να επιτευχθεί αυτό, χρειάζεται να έχουμε μια μέθοδο για την ανίχνευση της ποσότητας του προϊόντος PCR και ένα μηχάνημα στο οποίο να καταγράφονται τα αποτελέσματα κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου PCR. Απαραίτητη προϋπόθεση για την ποσοτικοποίηση είναι η ανάλυση γονιδίων αναφοράς. Το γονίδιο αναφοράς δεν πρέπει να διαφέρει ως προς τον αριθμό των αντιγράφων ή το επίπεδο έκφρασης σε σχέση με τα υπό μελέτη δείγματα. 2.4.2 Τεχνικές PCR πραγματικού χρόνου (RQ PCR) Στην αντίδραση RQ PCR ένα φθορίζον μόριο χρησιμοποιείται για να παρακολουθείται η πορεία της αντίδρασης. Ανάλογα με το μόριο που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του προϊόντος της αντίδρασης, οι real time PCR τεχνικές μπορούν να διακριθούν σε δυο ομάδες : Μη ειδική ανίχνευση με τη χρήση χρωστικών που προσδένονται στο DNA. Σε αυτή την κατηγορία ανήκει η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική, η SYBR green, όπου μόρια χρωστικής προσδένονται στο δίκλωνο DNA. 80

Ειδική ανίχνευση με τη χρήση ειδικών ανιχνευτών. Η ειδική ανίχνευση πραγματοποιείται με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών που είναι επισημασμένοι με φθορισμόχρωμα αναφοράς και φθορισμόχρωμα καταστολέα. Τεχνικές που ανήκουν σε αυτήν την ομάδα είναι η τεχνική TaqMan (χρήση ανιχνευτών υδρόλυσης), η τεχνική χρήσης μοριακών φάρων (Molecular beacon), η τεχνική χρήσης ανιχνευτών υβριδισμού και η τεχνική εκκινητών Scorpions. Από τις παραπάνω τεχνικές οι πιο εύχρηστες και πιο διαδεδομένες είναι η SYBR Green, η τεχνική ανιχνευτών υβριδισμού και ανιχνευτών υδρόλυσης. Οι τρεις κύριες παραλλαγές διαθέσιμων τεχνικών PCR πραγματικού χρόνου (RQ PCR) παρουσιάζονται στην εικόνα 35. Εικόνα 35. Πρωτόκολλα PCR πραγματικού χρόνου: Ι. Χρωστική SYBR Green. II. Ανιχνευτές υβριδισμού. ΙΙΙ. Ανιχνευτές υδρόλυσης. 81

RQ PCR με τη χρήση της χρωστικής SYBR Green I Η απλούστερη τεχνική RQ PCR βασίζεται στην ανίχνευση των προϊόντων της PCR μετά την ενσωμάτωση της χρωστικής SYBR Green I στο DNA και δεν απαιτείται η χρήση ανιχνευτών (Εικόνα 36). Η χρωστική αυτή μπορεί να προσδένεται στη μικρή αύλακα του δίκλωνου DNA, όπου ενισχύει σημαντικά τον φθορισμό του. Το σήμα φθορισμού αυξάνει σταδιακά κατά τη διάρκεια της φάσης επιμήκυνσης, γίνεται μέγιστο στο τέλος κάθε αντίστοιχης φάσης και μειώνεται ή εκλείπει κατά τη φάση αποδιάταξης (Εικόνα 37). Πρέπει να σημειωθεί ότι αυτή η τεχνική δεν παρουσιάζει απόλυτη εξειδίκευση καθώς η χρωστική προσδένεται σε οποιοδήποτε μόριο δίκλωνου DNA και μπορεί ν ανιχνευθούν διμερή των εκκινητών και μη ειδικά προϊόντα PCR, με αποτέλεσμα να προκύπτουν Εικόνα 36. Η χρωστική SYBR Green παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA. ανακριβή δεδομένα. Προκειμένου να εκτιμηθεί αν έχουν σχηματιστεί ειδικά προϊόντα PCR, πραγματοποιείται ανάλυση της καμπύλης τήξης (melting curve). Aν έχει σχηματιστεί μόνο το ειδικό προϊόν PCR, θα είναι ορατή μόνο μια κορυφή στην εικόνα ενδείξεων των σημείων τήξης. Εικόνα 37. A: Aποδιάταξη DNA η SYBR Green δεν προσδένεται στο DNA B Γ Δ: φάση επιμήκυνσης η SYBR Green παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA και εκπέμπει φθορισμό που ανιχνεύεται από το μηχάνημα. Το σήμα φθορισμού αυξάνει σταδιακά κατά τη διάρκεια της φάσης επιμήκυνσης, γίνεται μέγιστο στο τέλος της φάσης (Δ) 82

Ανάλυση RQ PCR με ανιχνευτές υδρόλυσης (Taqman) Η ανάλυση RQ PCR με ανιχνευτές υδρόλυσης (hydrolysis probes) εκμεταλλεύεται την 5 3 ενεργότητα εξωνουκλεάσης της Taq πολυμεράσης για ν ανιχνεύσει και να ποσοτικοποιήσει τα ειδικά προιόντα PCR που παράγονται καθώς εξελίσσεται η αντίδραση (Eικόνες 38 39). Ο ανιχνευτής υδρόλυσης είναι συζευγμένος με ένα φθορισμόχρωμα αναφοράς (π.χ. FAM, VIC ή JOE) και μ έναν καταστολέα φθορισμοχρώματος (π.χ.tamra), ο οποίος θα βρίσκεται μέσα στην αλληλουχία στόχο. Καθώς τα δύο φθορισμοχρώματα βρίσκονται σε μικρή απόσταση, όσο ο ανιχνευτής είναι άθικτος, ο φθορισμός που εκπέμπεται από το φθορισμόχρωμα αναφοράς απορροφάται από τον καταστολέα φθορισμού. Για το λόγο αυτό, κατά την ενίσχυση της αλληλουχίας στόχου, ο ανιχνευτής υδρόλυσης αντικαθίσταται αρχικά από την αλυσίδα DNA μέσω της Taq πολυμεράσης και σταδιακά υδρολύεται από αυτή λόγω της ενεργότητας εξωνουκλεάσης της Taq πολυμεράσης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το διαχωρισμό του φθορισμοχρώματος αναφοράς και του καταστολέα του και επιτρέπει τη σταδιακή ανίχνευση του φθορισμού που εκπέμπει το φθορισμόχρωμα αναφοράς. Εικόνα 38. Αναπαράσταση των βημάτων της δράσης των ανιχνευτών TaqMan : πριν ο ανιχνευτής συναντηθεί με την Taq πολυμεράση ενέργεια μεταφέρεται from a short wavelength fluorophore (green) to a long wavelength fluorophore (red). Όταν η πολυμεράση προσθέτει νουκλεοτίδια στο εκμαγείο του DNA απελευθερώνει το μικρού μήκους κύματος fluorophore, κάνοντας το ανιχνεύσιμο και το μεγάλου μήκους κύματος μη ανιχνεύσιμο. 83

Εικόνα 39. Α. Ο ανιχνευτής Taqman. Ο κόκκινος κύκλος αναπαριστά το φθορισμόχρωμα καταστολέα που εμποδίζει το παρατηρούμενο σήμα που εκπέμπεται από το φθορισμόχρωμα αναφοράς, όταν το πρώτο βρίσκεται σε κοντινή απόσταση. Β. Ο ανιχνευτής TaqMan προσδένεται στο DNA στόχο και ομοίως και ο εκκινητής. Λόγω της πρόσδεσης του εκκινητή η πολυμεράση Taq μπορεί να συνθέσει ένα συμπληρωματικό κλώνο. Γ. Το φθορισμόχρωμα αναφοράς απελευθερώνεται από το επιμηκισμένο δίκλωνο DNA που συντέθηκε από την Taq πολυμεράση. Σε απόσταση από το φθορισμόχρωμα καταστολέα, το φώς που εκπέμπεται από το φθορισμόχρωμα αναφοράς σε διεγερμένη κατάσταση μπορεί να παρατηρηθεί. Ανάλυση RQ PCR με ανιχνευτές υβριδισμού Η ανάλυση RQ PCR με ανιχνευτή υβριδισμού χρησιμοποιεί δύο αλληλοεπικαλυπτόμενους ανιχνευτές συγκεκριμένης αλληλουχίας, ο ένας σημασμένος στο 3 άκρο μ ένα φθορισμόχρωμα δότη (π.χ. FAM) και ο άλλος σημασμένος στο 5 άκρο μ ένα φθορισμόχρωμαδέκτη (π.χ. LC Red 640, LC Red 705). Οι δύο ανιχνευτές υβριδίζονται σε γειτονικές αλληλουχίεςστόχους στο πολυμερισμένο τμήμα DNA: έτσι τα δύο φθορισμοχρώματα συμπλησιάζουν (η απόσταση μεταξύ τους κυμαίνεται από 1 5 νουκλεοτίδια) (Εικόνα 40). Κατά τη διέγερση του φθορισμοχρώματος δότη, εκπέμπεται ακτινοβολία μεγαλύτερου μήκους κύματος. Όταν τα δύο φθορισμοχρώματα βρίσκονται κοντά, το φως που εκπέμπεται από τον δότη θα διεγείρει το φθορισμόχρωμα δέκτη, διαδικασία που αναφέρεται και ως μεταφορά συντονισμένης ενέργειας φθορισμού (fluorescence resonance energy transfer, FRET) (Εικόνα 41). Αυτό οδηγεί σε εκπομπή του φθορισμού, ο οποίος ανιχνεύεται κατά το στάδιο υβριδοποίησης και στο πρώτο μέρος του σταδίου επιμήκυνσης της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). 84

Εικόνα 40. Ανάλυση RQ PCR με το πρωτόκολλο των ανιχνευτών υβριδισμού. Εικόνα 41. Διέγερση του φθορισμοχρώματος δότη, εκπομπή ακτινοβολίας και διέγερση φθορισμόχρωματος δέκτη. Η παραπάνω διαδικασία αναφέρετα ως μεταφορά συντονισμένης ενέργειας φθορισμού (fluorescence resonance energy transfer, FRET) και οπδηγεί στην εκπομπή φθορισμού. Μοριακός φάρος (Molecular beacon) Μια ακόμη τεχνική RQ PCR που πραγματοποιείται με τη χρήση ειδικών ανιχνευτών «μοριακών φάρων» (Molecular Beacon) (Εικόνα 42). Πρόκειται για DNA ολιγονουκλεοτίδια με δομή φουρκέτας που εκπέμπουν σήμα φθορισμού όταν υβριδίζονται στην αλληλουχία στόχο. 85

Στο ένα άκρο του ολιγονουκλεοτιδίου είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένο ένα φθορισμόχρωμα αναστολέας και στο άλλο ένα φθορισμόχρωμα αναφοράς. Απουσία της αλληλουχίας στόχου, ο καταστολέας βρίσκεται σε εγγύτητα με το φθορισμόχρωμα και δεν παρατηρείται φθορισμός. Όταν, όμως, ο ανιχνευτής προσδεθεί στην αλληλουχία στόχο, τότε προκαλείται ξεδίπλωμα της δομής φουρκέτας, με αποτέλεσμα την απομάκρυνση του καταστολέα και την εκπομπή φωτός. Ένα από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι η δυνατότητα ανάλυσης διαφορετικών αλληλουχιών στόχων στο ίδιο διάλυμα με τη χρήση φθορισμοχρωμάτων διαφορετικού χρώματος. Επίσης, χαρακτηρίζεται από ικανότητα ανίχνευσης παράταιρου ζευγαρώματος ακόμη και σε επίπεδο μιας βάσης. Εικόνα 42. Μοριακός φάρος. Ανιχνευτές Scorpions Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται σε αυτή την τεχνική RQ PCR χαρακτηρίζονται από την υψηλή τους ευαισθησία και την ειδικότητα ως προς την αλληλουχία στόχο. Δυο είναι τα είδη αυτών των ανιχνευτών, μονο ανιχνευτές και δι ανιχνευτές. Στην πρώτη περίπτωση πρόκειται για μονόκλώνα μόρια με επισημασμένο το 5 άκρο τους με φθορισμόχρωμα αναφοράς και το 3 άκρο τους με φθορισμόχρωμα καταστολέα, το οποίο ενώνεται απευθείας με το 5 άκρο του εκκινητή. Οι ανιχνευτές έχουν δομή φουρκέτας, μήκους 20 25 νουκλεοτιδίων και η οποία δομή συγκρατείται με συμπληρωματικές αλληλουχίες 4 5 νουκλεοτιδίων. Κατά τη διάρκεια των αρχικών σταδίων PCR αντίδρασης η Taq πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινητές και συνθέτει την συμπληρωματική αλυσίδα της αλληλουχίας στόχου. Σε έναν από τους επόμενους κύκλους η δομή φουρκέτας του ανιχνευτή ξεδιπλώνει και η περιοχή της θηλιάς υβριδίζεται με την νεοσυντιθέμενη αλληλουχία στόχο. Έτσι, το φθορισμόχρωμα καταστολέας απομακρύνεται από 86

το φθορισμόχρωμα αναφοράς με αποτέλεσμα το φθορισμό του δευτέρου και την εκπομπή φωτός, που ανιχνεύεται. Οι δι ανιχνευτές είναι δυο συμπληρωματικά επισημασμένα ολγονουκλεοτίδια. Το ένα εκ των δυο είναι επισημασμένο στο 5 άκρο με φθορισμόχρωμα αναφοράς και φέρει και τα στοιχεία του εκκινητή, ενώ το άλλο φέρει στο 3 άκρο το φθορισμόχρωμα καταστολέα. Ο μηχανισμός της αντίδρασης είναι ο ίδιος με αυτόν των μονοανιχνευτών. Εικόνα 43.Δομή των δυο τύπων ανιχνευτών και απεικόνιση της αλλαγής στη δομή τους κατά την πρόσδεση τους στην αλληλουχία στόχο. 2.4.3 Γραφική παράσταση και κινητικής της αντίδρασης Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται για την πραγματοποίηση μιας αντίδρασης real time PCR είναι παρόμοια με αυτά που χρησιμοποιούνται σε μια κλασσική αντίδραση PCR. Η βασικότερη διαφορά είναι η ενσωμάτωση ενός παρεμβαλλόμενου παράγοντα όπως η χρωστική SYBR green ή η χρήση φθοριζόντων ανιχνευτών για τον εντοπισμό του PCR προϊόντος. Σε μια αντίδραση PCR το προϊόν παράγεται εκθετικά. Επειδή απαιτούνται πολλοί κύκλοι ώστε το προϊόν να είναι άμεσα ανιχνεύσιμο, η γραφική παράσταση φθορισμός προς αριθμός κύκλων εμφανίζει σιγμοειδή μορφή. Σε μετέπειτα κύκλους, τα υποστρώματα της αντίδρασης μειώνονται, το προϊόν δεν διπλασιάζεται πλέον και η καμπύλη αρχίζει να εμφανίζει πλατώ. (flatten) (Εικόνα 44). 87

Εικόνα 44.Κινητική της αντίδρασης Σε όλους τους προαναφερόμενους τύπους RQ PCR ανάλυσης η ένταση του σήματος φθορισμού αυξάνει εκθετικά κατά την εκθετική φάση της αντίδρασης. Tο σημείο στην καμπύλη όπου το ποσό του φθορίζοντος αρχίζει να αυξάνεται ταχύτατα καλείται κύκλος μετάπτωσης (threshold cycle). Αυτό το όριο (ή γραμμή μετάπτωσης) χρησιμοποιείται για να υπολογιστεί ο κύκλος μετάπτωσης (Ct) κάθε δείγματος, που είναι ο κύκλος της αντίδρασης PCR στον οποίο ο φθορισμός υπερβαίνει για πρώτη φορά τον ουδό μετάβασης. Η τιμή μετάπτωσης είναι ευθέως ανάλογη προς το ποσό της αλληλουχίας στόχου που περιέχεται στο δείγμα. Έτσι, όσο υψηλότερο το αρχικό ποσό του δείγματος, το γρηγορότερο ανιχνεύεται συσσωρευμένο προϊόν ως μια σημαντική αύξηση στο φθορισμό και χαμηλότερη είναι τιμή του κύκλου μετάπτωσης. Η γραφική παράσταση κύκλου μετάπτωσης προς το template είναι γραμμική, ετσι σύγκριση των τιμών Ct μεταξύ πολλαπλών αντιδράσεων δίνει τη δυνατότητα του υπολογισμού της συγκέντρωσης του νουκλεινικού οξέος στόχου. Η κλήση της ευθείας αποτελεί ένα μέτρο της αποδοτικότητας της πψρ αντίδρασης. Μερικά real time PCR όργανα δίνουν τη δυνατότητα δημιουργίας καμπυλών τήξης. Οι καμπύλες αυτές είναι ενδεικτικές της καθαρότητας του προϊόντος και αποκαλύπτουν την παρουσία διμερών των εκκινήτων. Ένα δείγμα μπορεί να θεωρηθεί θετικό, εάν η ελάχιστη τιμή μετάπτωσης ενός ή περισσοτέρων αντιγράφων του δείγματος αυτού είναι καθαρά εκτός κλίμακας των τιμών μετάπτωσης των αρνητικών δειγμάτων (π.χ. τουλάχιστον κατά έναν κύκλο χαμηλότερα από την κατώτερη ένδειξη που παρουσιάζει ένα μη ειδικά πολυμερισμένο δείγμα) και σε ορισμένη απόσταση (π.χ. τέσσερις κύκλοι) από το τελικό στάδιο διάλυσης που χρησιμοποιείται για να εξασφαλίσει μέγιστη ευαισθησία. 88

Ένα δείγμα μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό, εφόσον δεν παρατηρείται καθόλου ενίσχυση και όταν η κατώτερη τιμή μετάπτωσης του συγκεκριμένου δείγματος βρίσκεται εντός ή κοντά στην κλίμακα τιμών μετάπτωσης των αρνητικών δειγμάτων. Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι ανάλυσης με την RQ PCR: η «σχετική» ποσοτικοποίηση και η ποσοτικοποίηση μέσω «πρότυπης καμπύλης» που καλείται επίσης και «απόλυτη» ποσοτικοποίηση. 2.4.4 Ποσοτικοποίηση Τα προϊόντα PCR αντίδρασης μπορούν να ποσοτικοποιηθούν με τη δημιουργία καμπύλης αναφοράς η να γίνει σχετική ποσοτικοποίηση τους με ένα γονίδιο αναφοράς. Στη σχετική ποσοτικοποίηση, που είναι απλούστερη ως μέθοδος, γίνεται σύγκριση ανάμεσα στο δείγμα (DNA ή cdna) που αφορά το γονίδιο που μας ενδιαφέρει και στο αντίστοιχο δείγμα που χρησιμοποιείται ως γονίδιο αναφοράς. Για να ληφθεί μια στρογγυλοποιημένη τιμή για κάθε δείγμα, διαιρείται η συγκέντρωση των μεταγράφων του γονιδίου που μας ενδιαφέρει προς τη συγκέντρωση των μεταγράφων του γονιδίου αναφοράς. Ο λόγος που προκύπτει είναι ο αριθμός των μεταγράφων του γονιδίου προς μελέτη ως προς την έκφραση του γονιδίου αναφοράς. Με τη χρήση καμπύλης αναφοράς η ποσοτικοποίηση μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας πλασμιδιακό DNA ή άλλες μορφές DNA, των οποίων η απόλυτη συγκέντρωση είναι γνωστή. Η μέθοδος ποσοτικοποίησης με χρήση πρότυπης καμπύλης εφαρμόζεται επιτυχώς για να μετρηθεί μικρός αριθμός γονιδίων σε λίγα ή πολλά δείγματα καθώς και για να μετρηθεί ο αριθμός των ιϊκών αντιγράφων σ ένα δεδομένο δείγμα. Για να ποσοτικοποιηθούν οι στόχοι στα δείγματα υπό μελέτη, κατασκευάζεται μια πρότυπη καμπύλη (standard curve) με αραιώσεις (πενταπλάσια ή δεκαπλάσια διαδοχική αραίωση) γνωστών δειγμάτων, συνήθως πλασμιδιακού DNA που φέρει το γονίδιο που μας ενδιαφέρει. 2.4.5 Εφαρμογές της μεθόδου RQ PCR Μια πλειονότητα εφαρμογών προέκυψε ως αποτέλεσμα της ανακάλυψης της real time PCR. Κάποιες από αυτές είναι οι παρακάτω : επιβεβαίωση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης που παρατηρούνται σε αναλύσεις μικροσυστοιχείων DNA μελέτη ποσοτικοποίησης της έκφρασης του RNA μέτρηση του αριθμού αντιγράφων γενωμικού και ιικού DNA 89

ανίχνευση και ποσοτικοποίηση ιικών σωματιδίων και πιθανόν θανατηφόρων μικροοργανισμών ανίχνευση μεταλλάξεων και SNPs ανίχνευση ελάχιστης υπολλειματικής νόσου διάκριση αλληλομόρφων αποτελεσματικότητα φαρμακευτικής αγωγής Οι εφαρμογές της RQ PCR πραγματικού χρόνου είναι πολυάριθμες. Περιλαμβάνουν μελέτες για την έκφραση του mrna, μετρήσεις αριθμού αντιγράφων σε γενωμικό ή ιϊκό DNA, μετρήσεις αριθμού διαγονιδιακών αντιγράφων, αναφορές για διάκριση αλληλομόρφων και επιβεβαίωση δεδομένων από μικροσυστοιχίες, ποσοτικοποίηση χιμαιρικών μεταγράφων για την ανίχνευση ελάχιστης υπολειμματικής νόσου σε ασθενείς με αιματολογικές κακοήθειες και ανάλυση της έκφρασης των κυτταροκινών και πολλών άλλων παραγόντων. 2.4.6 Πλεονεκτήματα της εφαρμογής RQ PCR Κάποια από τα πλεονεκτήματα που χαρακτηρίζουν την PCR πραγματικού χρόνου σε σύγκριση με την παραδοσιακή αντίδραση PCR, εκτός από την παρακολούθηση της κινητικής της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο, είναι η ακρίβεια και η αξιοπιστία στη μέτρηση της ποσότητας των PCR προϊόντων, η σταθερή απόδοση της μεθόδου, η ευελιξία των πρωτοκόλλων ανίχνευσης και η υψηλή ταχύτητα εκτέλεσης της αντίδρασης. Επίσης, δίνεται η δυνατότητα άμεσου χαρακτηρισμού των προϊόντων με ανάλυση του σημείου τήξης τους (melting curve analysis) και ελαχιστοποιούνται οι κίνδυνοι επιμόλυνσης, αφού δεν απαιτείται επιπλέον διαδικασία μετά την PCR. 2.4.7 Πρωτόκολλο Real Time PCR για την ανίχνευση των ερπητοϊών EBV και CMV Για την παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλα εμπορικά διαθέσιμα kit (RealArt EBV PCR Kit & RealArt CMV PCR Kits Qiagen) σε συνδυασμό με τον εξειδικυεμένο για Real Time PCR θερμοκυκλοποιητή RotorGene 6000 (Εικόνα 45) και το σχετικό Software. Τα συγκεκριμένα kit που στηρίζονται στην τεχνική ανιχνευτών υδρόλυσης (Taqman probes) χρησιμοποιούν τις χρωστικές FAM, JOE και ΤΑΜRA αντίστοιχα. 90

Εικόνα 45. O εξοπλισμός για την Real Time PCR: Rotor Gene 6000 Για την διεξαγωγή της Real Time PCR απαιτούνται: Το μόριο DNA που θα χρησιμοποιηθεί ως μήτρα αντιγραφής. Ένα ζεύγος ολιγουνοκλεοτιδικών εκκινητών οι οποίοι οριοθετούν το προς πολλαπλασιασμό τμήμα και είναι συμπληρωματικοί με τα 3 άκρα του τμήματος αυτού. Τα δεοξυ ριβονουκλεοτίδια των τεσσάρων βάσεων του DNA (dntps: datp, dttp, dctp,dgtp ). MgCl 2 το οποίο παρέχει τα ιόντα Mg+ που είναι απαραίτητα για τη δράση της πολυμεράσης. Τaq πολυμεράση η οποία είναι το ένζυμο που καταλύει τον πολυμερισμό. Ένα κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο ρυθμίζει το PH και την ιονική ισχύ του διαλύματος στο οποίο γίνεται η αντίδραση. Συγκεκριμένη ποσότητα ενέσιμου νερού το οποίο αυξάνει τον όγκο της αντίδρασης παρέχοντας στο αρχικό αλλά και στα θυγατρικά μόρια του DNA τον «απαραίτητο χώρο» για να αναδιπλωθούν. Καθένα από τα δύο Kits περιέχει: RG master mix: περιέχει dntps, MgCl 2, Primers, buffer και ένζυμο Taq Polymerase για την ενίσχυση ενός συγκεκριμένου τμήματος του γονιδιώματος του EBV μεγέθους 97bp και την άμεση ανίχνευση αυτού του τμήματος στο Rotor Gene 3000 με τη φθορίζουσα χρωστική Cycling A.FAM. Quantitation Standards: είναι θετικά δείγματα με προκαθορισμένο ιϊκό φορτίο. Είναι απαραίτητα και τα τέσσερα για την δημιουργία της καμπύλης προσδιορισμού 91

(standard curve) στο Rotor Gene 3000 και η οποία είναι καθοριστική για τον καθορισμό του ιϊκού φορτίου των δειγμάτων. RG QS1 (5Χ10 4 cop/μl) RG QS2 (5Χ10 3 cop/μl) RG QS3 (5Χ10 2 cop/μl) RG QS4 (5Χ10 1 cop/μl) RG IC: Προστίθεται μαζί με τα Quantitation standards και τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες ενώ η προσθήκη του στα δείγματα έγινε κατά την εκχύλιση. Ανιχνεύεται εξαιτίας της φθορίζουσας χρωστικής Cycling A. JOE και επιτρέπει όπως προαναφέραμε τον έλεγχο της διαδικασίας. ΝΕΡΟ : χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας. Η διαδικασίας περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα ; Τοποθέτηση της πλάκας στους 4 0 C να κρυώσει. Τοποθέτηση των σωληνάριων PCR στην πλάκα. Vortex και spin τα Quantitation Standards, τα master mix και τα δείγματα που έχουμε εκχυλίσει αφού πρώτα τα έχουμε ξεπαγώσει. Προσθήκη IC στα master mix που θα τοποθετηθούν στα σωληνάρια στα οποία θα προστεθούν τα Quantitation Standards καθώς και οι θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες. Τοποθέτηση σε κάθε σωληνάριο 30 μl master mix και 20 μl Standards στα πρώτα 8 σωληνάρια και στα υπόλοιπα 20 μl δείγμα με ανάδευση. Συνήθως το QS4 χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας και το νερό ως αρνητικός. Κλείσιμο των σωληνάριων και τοποθέτηση στο μηχάνημα. Προγραμματισμός μηχανήματος Ανάλυση αποτελεσμάτων. Η αντίδραση της Real Time PCR περιλαμβάνει: 1. Αποδιάταξη στους 95 0 C για 10 min. 2. Επώαση στους 95 0 C για 15 sec. 3. 55 0 C για 30 sec (στο στάδιο αυτό γίνεται ο υβριδισμός των εκκινητών) και η φωτομέτρηση FAM και JOE. 4. 72 0 C για 20 sec (στο στάδιο αυτό γίνεται η επιμήκυνση των επιθυμητών τμημάτων). 5. Επανάληψη των σταδίων 2 έως και 4 για 45 φορές. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων γίνεται με τη χρήση του σχετικού software του Rotor Gene 6000 και τα αποτελέσματα εκφράζονται σε ιικά copies/ml δείγματος. 92

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Δημογραφικά χαρακτηριστικά ομάδας μελέτης Η ομάδα μελέτης περιλαμβάνει 44 ασθενείς με τυπική T LGL λευχαιμία που παρακολουθούνται στην Αιματολογική Κλινική του ΓΝΘ «Γ. Παπανικολάου» και στο Αιματολογικό Τμήμα του ΓΝ Νίκαιας. Από τους 44 ασθενείς οι 26 ήταν άνδρες και οι 18 γυναίκες (Εικόνα 46) ενώ η διάμεση ηλικία στη διάγνωση ήταν τα 59 έτη (Εικόνα 47). 41% 59% άνδρες γυναίκες Εικόνα 46. Aναλογία φύλου στο υπό μελέτη δείγμα ασθενών. Εικόνα 47. Κατανομή ηλικιών στο υπό μελέτη δείγμα ασθενών. 93