ΕΤΕΡΟΖΥΓΩΤΙΑ ΚΑΙ ΑΡΜΟΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΑ ΔΑΣΙΚΑ ΔΕΝΔΡΑ: ΤΑ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΝΟΣ ΚΩΝΟΦΟΡΟΥ ΚΑΙ ΕΝΟΣ ΠΛΑΤΥΦΥΛΛΟΥ Αραβανόπουλος Φ. Α. 1* 1. Εργαστήριο Δασικής Γενετικής και Βελτιώσεως Δασοπονικών Ειδών, Τμήμα Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, 54006 Θεσσαλονίκη ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η σημασία των θετικών συσχετίσεων μεταξύ της ετεροζυγωτίας και χαρακτήρων που σχετίζονται με την αρμοστικότητα ** αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα ερωτήματα της εφαρμοσμένης γενετικής και βελτίωσης σήμερα. Οι δύο κυριότερες εναλλακτικές υποθέσεις εργασίας που ερμηνεύουν θεωρητικώς τη σχέση ετεροζυγωτίας-αρμοστικότητας είναι: (α) η υπόθεση της κυριαρχίας (ή υπόθεση του ομομεικτικού εκφυλισμού) και (β) η υπόθεση της υπερκυριαρχίας. Σύμφωνα με την πρώτη υπόθεση τα υπό μελέτη γονίδια μπορεί να είναι επιλεκτικά ουδέτερα και η παρατηρούμενη ετεροζυγωτία προσδιορίζει ουσιαστικά την ετεροζυγωτία του γενώματος. Σύμφωνα με τη δεύτερη υπόθεση η ετεροζυγωτία στα γονίδια που μελετούνται ή σε άλλα γονίδια, τα οποία βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης με τα παραπάνω, οδηγεί σε αυξημένη αρμοστικότητα (Mitton και Grant, 1984). Η αποδοχή της μιας ή της άλλης υπόθεσης έχει μεγάλη σημασία, καθώς μπορεί να δώσει την κατεύθυνση για την κατάλληλη στρατηγική βελτίωσης. O βελτιωτής επιδιώκει την ετέρωση η οποία με βάση τις παραπάνω υποθέσεις εργασίας μπορεί να είναι το αποτέλεσμα είτε αυξημένης ετεροζυγωτίας σε ένα μεγάλο αριθμό γονιδίων που εμφανίζουν υπερκυριαρχία, είτε μειωμένης έκφρασης ενός μικρού αριθμού επιβλαβών υποτελών αλλημομόρφων (Mitton και Grant, 1984, Τσαυτάρης 1992). Εχει διατυπωθεί η άποψη ότι η γενετική βάση της ετέρωσης ίσως είναι πολυπλοκότερη απ ότι οι παραπάνω υποθέσεις πρεσβεύουν, ωστόσο σε πολλές περιπτώσεις παρατηρήθηκε ότι συγκεκριμένα γονίδια προσδίδουν ετέρωση όταν βρίσκονται στην ετεροζύγωτη κατάσταση εμφανίζουν δηλαδή υπερκυριαρχία (Gardner and Snustad 1981, Panetsos 1989). Ενα από τα κύρια αναπάντητα ερωτήματα της γενετικής και βελτίωσης αποτελεί το κατά πόσον η υπερκυριαρχία μπορεί να θεωρηθεί ως το αίτιο της ετέρωσης (Τσαυτάρης 1992, Zouros και Foltz, 1987). * Μια πρόδρομη μορφή της παρούσας εργασίας παρουσιάστηκε για πρώτη φορά ως διάλεξη προσκεκλημένου ομιλητή στο Τμήμα Εξελικτικής Βιολογίας (Department of Organismic and Evolutionary Biology) της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Academia Sinica), στις 3 Σεπτεμβρίου 1998.
Στην παρούσα εργασία αναλύονται οι συσχετίσεις μεταξύ αρμοστικότητας και ετεροζυγωτίας σε δύο χαρακτηριστικές περιπτώσεις: (α) σε οικογένειες ιτιάς από ελεγχόμενη επικονίαση και (β) στο φυσικό πληθυσμό ενός διειδούς υβριδίου πεύκης. Η διερεύνηση των συσχετίσεων και ο έλεγχος της ισχύος των υποκείμενων υποθέσεων εργασίας που τις ερμηνεύουν παρουσιάζει ενδιαφέρον καθώς: (α) τα δασικά δένδρα (κωνοφόρα και πλατύφυλλα) θεωρούνται ως εξαιρετικά κατάλληλοι οργανισμοί για τη μελέτη των συσχετίσεων ετεροζυγωτίας-αρμοστικότητας διότι παρουσιάζουν υψηλή γενετική παραλλακτικότητα, σημαντική γονιδιακή ροή, απουσία ανισορροπίας σύνδεσης και μεγάλα μεγέθη φυσικών πληθυσμών, (β) πραγματοποιείται η ίδια ανάλυση σε δύο είδη φυτών με σημαντική διαφοροποίηση στην εξελικτική τους πορεία και στη βιολογία τους και (γ) στην πρώτη περίπτωση εξετάζονται οικογένειες από ελεγχόμενη επικονίαση, φυόμενες σε ελεγχόμενο περιβάλλον, ενώ στη δεύτερη περίπτωση εξετάζεται ένας φυσικός πληθυσμός μεγάλου μεγέθους. YΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στην πρώτη περίπτωση μελετήθηκαν οι συσχετίσεις μεταξύ ετεροζυγωτίας και παραγωγής βιομάζας στην ιτιά Salix eriocephala. Χρησιμοποιήθηκαν οι ομοθαλείς οικογένειες ενός εκθετικού σχεδίου διασταυρώσεων 2x2 το οποίο συμπεριλάμβανε τους θηλυκούς κλώνους E16 και E269 και τους αρσενικούς κλώνους E263 και E292 (Aravanopoulos και Zsuffa 1998). Οι οικογένειες εγκαταστάθηκαν στο ύπαιθρο σε πλήρως τυχαιοποιημένες ομάδες με κάθε οικογένεια να αντιπροσωπεύεται από ένα πειραματικό τεμάχιο τεσσάρων ατόμων σε καθεμιά από έξι ομάδες. Η ετεροζυγωτία εκτιμήθηκε με βάση 11 πολυμορφικές ισοενζυμικές γονιδιακές θέσεις: Acp-2, Aco-2, Adh-2, Alp-1, Cto-1, Idh-2, Per-1, Pgd-1, Pgi-2, Ppo-1 και Sdh-2. Το ποσοτικό γνώρισμα με το οποίο συσχετίστηκε η ετεροζυγωτία ήταν η συνολική υπέργεια ξηρή βιομάζα κάθε ατόμου (Aravanopoulos και Zsuffa 1998). Στην δεύτερη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε ο φυσικός υβριδογενής πληθυσμός πεύκης (Pinus brutia x P. halepensis) από την περιοχή της Ολυμπιάδας Χαλκιδικής (Aravanopoulos κ. α. 1998). Η ετεροζυγωτία καταγράφηκε μετά από ανάλυση 10 πολυμορφικών ισοενζυμικών γονιδιακών θέσεων: Gdh-1, G6Pdh-2, Idh- 2, Lap-1, Mdh-1, Mdh-4, Mdr-1, 6Pgd-1, 6Pgd-2 και Pgi-2. Ως ποσοτικά γνωρίσματα που σχετίζονται με την αρμοστικότητα χρησιμοποιήθηκαν το βάρος του κώνου και το βάρος του σπόρου. Για την παράμετρο του βάρους κώνου ενός ατόμου χρησιμοποιήθηκε ο μέσος όρος του βάρους 10 κώνων, ενώ για την αντίστοιχη παράμετρο σπόρου χρησιμοποιήθηκε το βάρος 1000 σπόρων. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του λογισμικού SAS (SAS Institute, 1985). Η κανονικότητα των δεδομένων για τα ποσοτικά γνωρίσματα ελέγχθηκε με το κριτήριο Shapiro-Wilk (Sokal και Rohlf 1981) και στις περιπτώσεις αποκλίσεων χρησιμοποιήθηκε λογαριθμική μετατροπή. Η μηδενική υπόθεση, της απουσίας δηλαδή συσχετίσεων μεταξύ ετεροζυγωτίας και βιομάζας, ελέγχθηκε με τη χρησιμοποίηση δύο προτύπων ανάλυσης (Bush κ. α. 1987, David κ. α. 1995): ** Με την λέξη «αρμοστικότητα» αποδίδεται ο όρος «fitness» (ΕΕΕΓΒΦ 1994).
(α). Ενός προτύπου απλής γραμμικής συμμεταβολής: Υ = α [(Χ + Χ +... + Χ ) / n] + β + ε, 1 2 n όπου Υ το ποσοτικό γνώρισμα που σχετίζεται με την αρμοστικότητα, Χ η ετεροζυγωτία στη i γονιδιακή i θέση (i = 1, 2, 3,..., n), n ο συνολικός αριθμός των γονιδιακών θέσεων που μελετήθηκαν, α και β παράμετροι του προτύπου γραμμικής συμμεταβολής και ε το σφάλμα. Με το συγκεκριμένο πρότυπο, το οποίο βασίζεται ουσιαστικά στη χρήση δείκτη ετεροζυγωτίας, είναι δυνατός ο έλεγχος της υπόθεσης της κυριαρχίας. (β). Ενός προτύπου πολλαπλής γραμμικής συμμεταβολής: Υ = α Χ + α Χ +... + α Χ + β + ε, 1 1 2 2 n n όπου Υ η αρμοστικότητα, n ο συνολικός αριθμός των γονιδιακών θέσεων που μελετήθηκαν, Χ η i ετεροζυγωτία στην i γονιδιακή θέση (i = 1, 2, 3,..., n, X = 0, X, X = 1), με παραμέτρους α, i(ab) i(aa) i(bb) i β και σφάλμα ε. Το πρότυπο αυτό αναδεικνύει τις επιδράσεις κάθε γονιδιακής θέσης ξεχωριστά και παρέχει τη δυνατότητα ελέγχου της υπόθεσης της υπερκυριαρχίας. Η αξιολόγηση των προτύπων συμμεταβολής έγινε με (α) έλεγχο δοκιμών F από τις αναλύσεις διακύμανσης για κάθε πρότυπο και (β) έλεγχο των τιμών του συντελεστή προσδιορισμού (R 2 ), ώστε να εκτιμηθεί το ποσοστό της παραλλακτικότητας κάθε ποσοτικού γνωρίσματος το οποίο επεξηγείται από το αντίστοιχο πρότυπο (Sokal και Rohlf 1981). Στα πρότυπα πολλαπλής συμμεταβολής η υπεροχή των ετεροζύγωτων αναμένεται να έχει ως αποτέλεσμα την αρνητική κλίση της γραμμής συμμεταβολής, η εκτίμηση της οποίας επιβάλλει τον έλεγχο του πρόσημου των μερικών συντελεστών συμμεταβολής (Bush κ. α. 1987). Η σχετική συμβολή κάθε γονιδιακής θέσης στην έκφραση των ποσοτικών γνωρισμάτων εξετάσθηκε με βάση την σειρά με την οποία κάθε θέση συμπεριλήφθηκε στα αντίστοιχα πρότυπα πολλαπλής συμμεταβολής. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση STEPWISE (MAX R 2 IMPROVEMENT) της SAS (SAS Institute, 1985). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα αποτελέσματα της ανάλυσης των συσχετίσεων αρμοστικότητας (βιομάζας) - ετεροζυγωτίας στην ιτιά παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Τα 10 πρότυπα συμμεταβολής που ελέγχθηκαν δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά, ωστόσο τα πρότυπα πολλαπλής συμμεταβολής επεξήγησαν σαφώς μεγαλύτερο μέρος της παραλλακτικότητας της βιομάζας σε όλες τις οικογένειες (Πιν. 1), συγκρινόμενα με τα πρότυπα απλής συμμεταβολής. Οταν στα πρότυπα συμμεταβολής χρησιμοποιήθηκαν τα στοιχεία όλων των οικογενειών, οι τιμές του συντελεστή προσδιορισμού ήταν εξαιρετικά χαμηλές τόσο στην περίπτωση του προτύπου απλής συμμεταβολής όσο και στην αντίστοιχη της πολλαπλής συμμεταβολής. Σημειώνεται ότι στη δεύτερη περίπτωση το πρότυπο που βασίστηκε στο σύνολο των συμψηφισμένων στοιχείων (pooled data)
επεξηγεί μόνο 3.6% της παραλλακτικότητας της βιομάζας, ενώ ο μέσος όρος των προτύπων για κάθε οικογένεια ανέρχεται σε 29% (Πιν. 1). Πίνακας 1. Αποτελέσματα ανάλυσης προτύπων γραμμικής συμμεταβολής σε οικογένειες ιτιάς. Συντελεστής προσδιορισμού (R 2 ) και πιθανότητες P δοκιμών F (τυπικές αποκλίσεις στις παρενθέσεις). Απλή Συμμεταβολή Πολλαπλή Συμμεταβολή Οικογένεια R 2 P R 2 P E269 x E292 0.001 0.868 0.327 0.578 E16 x E263 0.006 0.727 0.431 0.266 E269 x E263 0.131 0.082 0.136 0.837 E16 x E292 0.044 0.323 0.265 0.807 Μέσος Ορος 0.046 (0.060) 0.290 (0.123) Συνολικά δεδομένα (Pooled data) 0.018 0.196 0.036 0.987 Οι μερικοί συντελεστές συμμεταβολής των προτύπων πολλαπλής συμμεταβολής παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Σε όλες τις οικογένειες η πλειονότητα των συντελεστών παρουσίασε αρνητικό πρόσημο, άρα η συνάρτηση αντίδρασης της πολλαπλής συμμεταβολής (multiple regression response function) τεκμαίρεται ότι είναι επίσης αρνητική για κάθε οικογένεια. Τα πρόσημα και οι τιμές των συντελεστών για κάθε γονιδιακή θέση δεν ήταν σταθερά στις διάφορες οικογένειες. Πίνακας 2. Μερικοί συντελεστές συμμεταβολής των προτύπων συμμεταβολής στην ιτιά (η μηδενική τιμή υποδηλώνει απουσία διαχωρισμού της γονιδιακής θέσης στην αντίστοιχη οικογένεια). Οικογένεια E269 x E292 E16 x E263 E269 x E263 E16 x E292 Αθροισμα Σύνολο Δεδομένων Aco-2 0.000-0.005-0.047 0.000-0.004 Acp-2-0.004 0.000 0.000-0.067-0.026 Adh-2 0.000-0.007 0.000 0.016-0.002 Alp-1 0.071 0.000 0.000 0.036 0.019 Cto-1 0.000 0.029-0.048 0.000 0.022 Idh-2-0.036-0.022-0.042-0.008-0.015 Per-1 0.104-0.036-0.016-0.016 0.029 Pgd-1-0.037-0.033 0.000 0.010-0.012 Pgi-2 0.037 0.000 0.000-0.019-0.013 Ppo-1-0.023-0.024-0.035 0.038-0.004 Sdh-2 0.003 0.048-0.088-0.055-0.021 (+) πρόσημα 4 2 0 4 10 3
(-) πρόσημα 4 6 6 5 21 8 Συνολικά ο αριθμός των θετικών προσήμων υπολειπόταν του αριθμού των αρνητικών πρόσημων (10 έναντι 21, Πιν. 2) σε όλες τις οικογένειες. Η σχετική συμβολή κάθε γονιδιακής θέσης στη σχέση ετεροζυγωτίας και βιομάζας σε κάθε οικογένεια και στο σύνολο των στοιχείων, παρουσιάζεται στον Πίνακα 3. Παρατηρείται ότι διαφορετικές γονιδιακές θέσεις αναδεικνύονται ως πλέον σημαντικές σε διαφορετικές οικογένειες (η θέση Sdh-2 αποτελεί εξαίρεση). Οταν χρησιμοποιήθηκε το σύνολο των δεδομένων (pooled data), η σειρά κατάταξης των γονιδιακών θέσεων διέφερε των μέσων όρων σειράς κατάταξης γονιδιακών θέσεων στις οικογένειες. Η συσχέτιση μεταξύ των παραπάνω δεν ήταν σημαντική (συντελεστής συσχέτισης τάξεως Spearman: r s = 0.975, 0.30<P<0.40). Τα αποτελέσματα των αναλύσεων συμμεταβολής των δύο ποσοτικών γνωρισμάτων στην πεύκη παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Ελέγχθηκαν τέσσερα πρότυπα συμμεταβολής από τα οποία ένα πρότυπο απλής και ένα πολλαπλής συμμεταβολής παρουσίασαν στατιστική σημαντικότητα (P<0.05). Τα πρότυπα πολλαπλής συμμεταβολής επεξήγησαν μεγαλύτερο μέρος της παραλλακτικότητας των ποσοτικών γνωρισμάτων, συγκρινόμενα με τα πρότυπα απλής συμμεταβολής. Ο μέσος όρος του συντελεστή προσδιορισμού στην πρώτη περίπτωση ήταν x=0.582, ενώ στη δεύτερη ήταν x=0.059.
Πίνακας 3. Σειρά κατάταξης της συνεισφοράς κάθε γονιδιακής θέσης στην παραγωγή βιομάζας της ιτιάς Salix eriocephala εδραζόμενη στη σειρά με την οποία κάθε γονιδιακή θέση συμπεριλαμβάνεται στα αντίστοιχα πρότυπα συμμεταβολής οικογενειών και στα συνολικά (pooled) δεδομένα. Παρουσιάζονται επίσης οι μέσες τιμές κατάταξης γονιδιακών θέσεων με βάση τα αποτελέσματα ανά οικογένεια. Σειρά κατάταξη ς Συνολικά (pooled) δεδομένα E269 x E292 E16 x E263 E269 x E263 E16 x E292 Μέση σειρά κατάταξης 1 Per-1 Per-1 Sdh-2 Sdh-2 Sdh-2 Sdh-2 = 1.25 2 Aco-2 Sdh-2 Pgd-1* Ppo-1 Acp-2 Per-1 = 3.25 3 Adh-2 Pgd-1 Per-1* Idh-2 Alp-1 Alp-1 = 4.00 4 Pgi-2 Ppo-1 Idh-2 Aco-2 Per-1 Ppo-1 = 4.25 5 Ppo-1 Alp-1 Cto-1 Per-1 Ppo-1 Pgd-1 = 4.33 6 Cto-1 Pgi-2 Ppo-1 Cto-1 Pgi-2 Acp-2 = 4.50 7 Alp-1 Acp-2 Aco-2 Adh-2 Cto-1 = 5.50 8 Idh-2 Idh-2 Adh-2 Pgd-1 Aco-2 = 5.50 9 Pgd-1 Idh-2 Idh-2 = 6.00 10 Acp-2 Pgi-2 = 6.00 11 Sdh-2 Adh-2 = 7.50 P*<0.05 (δοκιμή F). Πίνακας 4. Αποτελέσματα ανάλυσης προτύπων γραμμικής συμμεταβολής για δύο ποσοτικά γνωρίσματα που σχετίζονται με την αρμοστικότητα σε ένα φυσικό υβριδογενή πληθυσμό πεύκης. Συντελεστής προσδιορισμού (R 2 ) και πιθανότητες P (δοκιμή F). Γνώρισμα Βάρος Κώνου (gr) Βάρος 100 Σπόρων (gr) Απλή Συμμεταβολή Πολλαπλή Συμμεταβολή R 2 P R 2 P 0.152 0.009 0.661 0.021 0.029 0.278 0.502 0.191 Οι μερικοί συντελεστές συμμεταβολής των προτύπων πολλαπλής συμμεταβολής παρουσιάζονται στον Πίνακα 5. Η πλειονότητα των συντελεστών παρουσίασε αρνητικό πρόσημο, άρα η συνάρτηση αντίδρασης της πολλαπλής συμμεταβολής (multiple regression response function) τεκμαίρεται ότι είναι επίσης αρνητική για καθένα από αυτά. Γενικά, τα πρόσημα και οι τιμές των συντελεστών για κάθε γονιδιακή θέση δεν παρουσίασαν ομοιομορφία μεταξύ ποσοτικών γνωρισμάτων. Συνολικά ο αριθμός των θετικών προσίμων υπολειπόταν του αριθμού των αρνητικών (6 έναντι 14, Πιν.5).
Πίνακας 5. Μερικοί (partial) συντελεστές συμμεταβολής των προτύπων πολλαπλής συμμεταβολής για βάρος κώνου και σπόρου. Γονιδιακή Θέση Βάρος Κώνου Βάρος Σπόρου Gdh-1-0.367 1.935 G6Pdh-1-0.159-5.803 Idh-1 0.051-0.320 Lap-1 0.067-0.268 Mdh-1-0.479-8.662 Mdh-4-0.197-11.318 Mdr-1-0.211-0.200 6Pgd-1-0.071 9.972 6Pgd-2-0.110-3.138 Pgi-1-0.172 5.820 (+) πρόσημα 2 4 (-) πρόσημα 8 6 Πίνακας 6. Κατάταξη της θεωρητικής συνεισφοράς κάθε γονιδιακής θέσης στην έκφραση του βάρους κώνου και σπόρου, βασισμένη στην σειρά με την οποία η γονιδιακή θέση συμπεριλαμβάνεται στα αντίστοιχα πρότυπα πολλαπλής συμμεταβολής (Γ.Θ.: γονιδιακή θέση, R 2 : συντελεστής προσδιορισμού, *: 0.01 P<0.05, **: 0.001 P<0.01, ***: P<0.001 (δοκιμή F). Κατάταξη Βάρος Κώνου Βάρος Σπόρου Γ. Θ. R 2 Γ. Θ. R 2 1 Mdh-1 0.417*** Mdh-4 0.195* 2 Gdh-1 0.541*** Mdh-1 0.253* 3 Mdh-4 0.567*** 6Pgd-1 0.322* 4 G6Pdh-1 0.598*** G6Pdh-1 0.422* 5 Mdr-1 0.620*** Pgi-1 0.479* 6 Pgi-1 0.645*** 6Pgd-2 0.496* 7 6Pgd-2 0.651** Gdh-1 0.501* 8 Lap-1 0.656** Lap-1 0.502 9 6Pgd-1 0.659* Idh-1 0.502 10 Idh-1 0.661* Mdr-1 0.502 Παρατηρείται ότι διαφορετικές γονιδιακές θέσεις εμφανίζονται να έχουν διαφορετική σημαντικότητα για κάθε ποσοτικό γνώρισμα. Τα δύο πρότυπα παρουσιάζουν στατιστική σημαντικότητα και περιλαμβάνουν από 7 έως 10 γονιδιακές θέσεις (Πιν. 6). Στα πρότυπα αυτά επεξηγείται ένα μεγάλο ποσοστό της συνολικής
παραλλακτικότητας των ποσοτικών γνωρισμάτων που κυμαίνεται από 50%-66%.
ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Από τα αποτελέσματα της σύγκρισης των προτύπων συμμεταβολής στην ιτιά είναι πρόδηλη η αδυναμία των προτύπων απλής συμμεταβολής έναντι αυτών της πολλαπλής συμμεταβολής να επεξηγήσουν την παραλλακτικότητα που παρατηρήθηκε στη βιομάζα. Σημειώνεται ότι τα πρότυπα πολλαπλής συμμεταβολής στην ιτιά έχουν ήδη ανακοινωθεί (Aravanopoulos και Zsuffa 1998) και στην παρούσα εργασία χρησιμοποιούνται κατ αντιδιαστολή των προτύπων απλής συμμεταβολής. Με βάση τη συνάρτηση αντίδρασης των προτύπων πολλαπλής συμμεταβολής, γενικά τεκμαίρεται ότι τα ετεροζύγωτα άτομα υπερέχουν των ομοζύγωτων στην παραγωγή βιομάζας. Τα πρόσημα των μερικών συντελεστών συμμεταβολής δεν παρουσίασαν σταθερότητα από οικογένεια σε οικογένεια για κάθε γονιδιακή θέση. Η σειρά κατάταξης της σημασίας των διαφόρων γονιδιακών θέσεων στα αντίστοιχα πρότυπα πολλαπλής συμμεταβολής έδειξε ότι διαφορετικές γονιδιακές θέσεις αναδείχθηκαν ως πλέον σημαντικές σε διαφορετικές οικογένειες (με εξαίρεση τη θέση Sdh-2.). Η απουσία συσχέτισης μεταξύ του μέσου όρου των σειρών κατάταξης στις οικογένειες και της σειράς κατάταξης των συμψηφισμένων δεδομένων ενισχύει την εκτίμηση για την ύπαρξη θετικών συσχετίσεων μεταξύ ετεροζυγωτίας και βιομάζας, εξειδικευμένων μέσα στις οικογένειες. Η παραπάνω ανάλυση, όπως και άλλες αναλυτικές προσεγγίσεις που έχουν χρησιμοποιηθεί (Aravanopoulos και Zsuffa 1998), οδηγούν σε κάποια συμπεράσματα για τις σχέσεις ετεροζυγωτίας-βιομάζας στην ιτιά. Οι ομοθαλείς οικογένειες, έχουν τον ίδιο συντελεστή ομομειξίας άρα σύμφωνα με την υπόθεση της κυριαρχίας δεν θα αναμενόταν η εμφάνιση θετικών συσχετίσεων ετεροζυγωτίας-βιομάζας (Pierce και Mitton 1982, Leary κ. α. 1987). Το αντίθετο παρατηρήθηκε και η υπόθεση της υπερκυριαρχίας φαίνεται ότι συνάδει περισσότερο με τη φύση των αποτελεσμάτων. Οι θετικές συσχετίσεις ετεροζυγωτίας-βιομάζας έχουν μεγάλη σημασία στη βελτίωση. Με βάση την επεξήγηση της υπερκυριαρχίας, ένα τυπικό άτομο αναμένεται να είναι ετεροζύγωτο για ένα σημαντικό τμήμα του γενώματός του. Επομένως τα περισσότερα κέρδη για τη βελτίωση αναμένεται να προέλθουν από τη δημιουργία κατά το δυνατόν ομοζύγωτων σειρών και στη συνέχεια τη διασταύρωση αυτών για τη δημιουργία υψηλοαποδοτικών υβριδίων (Τσαυτάρης 199?, Zouros και Foltz, 1987). Από την ανάλυση των προτύπων συμμεταβολής στην πεύκη έγινε φανερή η περιορισμένη αξία των προτύπων απλής συμμεταβολής να επεξηγήσουν την παραλλακτικότητα που παρατηρήθηκε στα ποσοτικά γνωρίσματα που σχετίζονται με την αρμοστικότητα. Εάν γίνει δεκτή η ισχύς της υπόθεσης της κυριαρχίας, τότε η χρησιμοποίηση κάθε γονιδιακής θέσης ξεχωριστά δεν θα έδινε περισσότερες πληροφορίες από την χρήση 10 τυχαίων μεταβλητών στο πρότυπο πολλαπλής συμμεταβολής. Το γεγονός ότι η χρήση κάθε γονιδιακής θέσης ξεχωριστά είχε σαν αποτέλεσμα τη βελτίωση της προβλεπτικής αξίας των προτύπων πολλαπλής συμμεταβολής κατά περίπου 10 φορές (Πιν. 4, Πιν.6), είναι ένδειξη ότι η υπόθεση της κυριαρχίας δεν αποτελεί επαρκή εξήγηση των αποτελεσμάτων. Η αρνητική συνάρτηση αντίδρασης της πολλαπλής συμμεταβολής για κάθε ποσοτικό γνώρισμα δείχνει την θετική συσχέτιση μεταξύ ετεροζυγωτίας σε διαφορετικές γονιδιακές θέσεις και υψηλότερων
τιμών βάρους κώνων ή σπόρων. Συνήθως η συμπεριφορά μεμονωμένων γονιδιακών θέσεων διέφερε μεταξύ των δύο γνωρισμάτων σε απόλυτη τιμή και πρόσημο, ωστόσο μερικές από τις γονιδιακές θέσεις που παρουσίασαν στα δύο γνωρίσματα αρνητικό πρόσημο (Mdh-1, Mdh-4, G6Pdh-1, Πιν. 5), βρέθηκαν στην κορυφή των αντίστοιχων σειρών κατάταξης (Πιν. 6). Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα τεκμαίρεται ότι υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ ετεροζυγωτίας και ποσοτικών γνωρισμάτων που σχετίζονται με την αρμοστικότητα στον υβριδογενή πληθυσμό πεύκης. Η θεωρητική επεξήγηση της συσχέτισης αυτής φαίνεται να μην συνδέεται με την υπόθεση της κυριαρχίας. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν παρατηρηθεί και σε άλλα κωνοφόρα και παρουσιάζονται στην ανασκόπηση των Bush και Smouse (1991). Εφόσον το συμπέρασμα αυτό υποστηριχθεί με επιπλέον αναλύσεις, τότε μπορεί να διατυπωθεί η εκτίμηση ότι η προβλεπτική αξία του δείκτη ετεροζυγωτίας για πρακτικούς σκοπούς είναι εξαιρετικά περιορισμένη. Ωστόσο, η έρευνα για την ερμηνεία των συσχετίσεων που παρατηρήθηκαν είναι σημαντική, καθώς το βάρος σπόρων έχει συνδυαστεί με το μήκος και την ζωτικότητα του εμβρύου (Bryand κ. α. 1998) και την ταχύτητα φυτρώσεως (Μουλαλής 1998, προσωπική επικοινωνία * ). Η ανίχνευση των πιθανών ερμηνειών των συσχετίσεων αυτών στο μέλλον θα επικεντρωθεί στην περαιτέρω έρευνα για την ύπαρξη προσθετικών ή υπερκυριαρχικών επιδράσεων (Smouse 1986, David κ. α. 1995). Στη συζήτηση που προηγήθηκε και μέσα από την οποία γίνεται μια αναφορά στα πιθανά αίτια των θετικών συσχετίσεων μεταξύ ετεροζυγωτίας-αρμοστικότητας, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη και τα ιδιάζοντα χαρακτηριστικά αυτής της περιοχής έρευνας. Είναι πασίδηλη η δυσκολία που υπάρχει για την ακριβή εκτίμηση της αρμοστικότητας σε όλες τις πειραματικές προσεγγίσεις. Οι φυσικοί πληθυσμοί χαρακτηρίζονται από διαφορετικά επίπεδα ομομειξίας, ύπαρξη μη ενεργών αλληλομόρφων (nulls), αδυναμία ελέγχου ή πιστοποίησης διαφορών σε μικροπεριβάλλοντα και από μεγάλο εύρος ηλικιών και πυκνότητας ατόμων στη μονάδα επιφανείας. Ωστόσο η μελέτη φυσικών πληθυσμών δίνει την δυνατότητα δειγματοληψίας της γενετικής παραλλακτικότητας από ένα μεγάλο αριθμό γενωμάτων, ανίχνευσης πολλών αλληλομόρφων είτε άμεσα σε γονίδια-δείκτες, είτε έμμεσα από την εκτίμηση των ποσοτικών γνωρισμάτων που σχετίζονται με την αρμοστικότητα, ενώ παρέχεται η δυνατότητα ανάλυσης πολύ μεγάλου αριθμού δειγμάτων. Η ανάλυση ομοθαλών οικογενειών που βρίσκονται εγκατεστημένες σε πλήρως τυχαιοποιημένα πειραματικά τεμάχια από την άλλη πλευρά, παρουσιάζει τα πλεονεκτήματα του γνωστού αναπαραγωγικού ιστορικού (breeding history), της ίδιας ηλικίας και εποχής μεταφύτευσης των ατόμων, σε σταθερό φυτευτικό σύνδεσμο και σε ένα ελεγχόμενο περιβάλλον. Οι συνθήκες αυτές οδηγούν στην εξασθένηση του περιβαλλοντικού θορύβου και στην ανάδειξη του γενετικού σήματος. Μολαταύτα, οι ομοθαλείς οικογένειες χαρακτηρίζονται από τον συνδυασμό ενός περιορισμένου αριθμού πατρικών γενωμάτων, από μικρά γενικά μεγέθη δείγματος (ιδιαίτερα στα δασικά είδη), από περιορισμένο αριθμό αλληλομόρφων (επομένως και συνδυασμών διαφορετικών * Καθ. Δ. Μουλαλής, Εργαστήριο Δασικής Γενετικής και Βελτιώσεως Δασοπονικών Ειδών, Τμήμα Δασολογίας και
ετεροζύγωτων γονιδιακών θέσεων) και από την πιθανή απουσία αλληλομόρφων που σχετίζονται με την αρμοστικότητα ή την αύξηση. Για τους λόγους αυτούς είναι σημαντικό οι προσεγγίσεις που αφορούν στην μελέτη των σχέσεων ετεροζυγωτίας-αρμοστικότητας να συμπεριλαμβάνουν υλικό διαφορετικής προελεύσεως. Η ερμηνεία των συσχετίσεων ετεροζυγωτίας και αρμοστικότητας βασίζεται πάνω σε θεωρητικές υποθέσεις και πρότυπα ερμηνείας της ύπαρξης της γενετικής παραλλακτικότητας στη φύση, τα οποία εφόσον ισχύουν όπως έχουν διατυπωθεί μέχρι στιγμής θα αναμενόταν να έχουν γενική εφαρμογή. Για τον λόγο αυτό η σχετική έρευνα σε δασικά είδη παρουσιάζει ένα επιπλέον ενδιαφέρον. Πέρα από τα πλεονεκτήματα που παρουσιάζει η χρησιμοποίηση των δασικών ειδών στην έρευνα ετεροζυγωτίαςαρμοστικότητας και τα οποία παρουσιάστηκαν περιληπτικά στην εισαγωγή, υπάρχει στα δασικά είδη η εμπειρία ανάλυσης τόσο κωνοφόρων όσο και αγγειοσπέρμων. Καθώς τα κωνοφόρα εμφανίστηκαν περίπου 140 εκατομμύρια χρόνια πριν από τα πρώτα αγγειόσπερμα, είναι ενδιαφέρον να ερευνηθεί με την ίδια μεθοδολογία η συμπεριφορά και των δύο έναντι των υποθέσεων που ερμηνεύουν τις σχέσεις ετεροζυγωτίας-αρμοστικότητας. Η συγκριτική μελέτη απομακρυσμένων εξελικτικά φυτικών οργανισμών (κωνοφόρα έναντι πλατυφύλλων), υλικού που προέρχεται από διαφορετικές συνθήκες πεδίου (πλήρως τυχαιοποιημένα πειράματα στο χωράφι έναντι συστάδων στο δάσος), υλικού από διαφορετικά συστήματα σύζευξης (ομοθαλείς οικογένειες έναντι φυσικών πληθυσμών με τυχαία σύζευξη), εκτιμάται ότι θα προσδώσει μεγαλύτερη αναλυτική και διακριτική ικανότητα στις μέχρι τώρα προσεγγίσεις των συσχετίσεων ετεροζυγωτίας και αρμοστικότητας. EΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ο συγγραφέας επιθυμεί να ευχαριστήσει τους παρακάτω ερευνητές, για τις εποικοδομητικές συζητήσεις που είχε μαζί τους, είτε σχετικά με την συγκεκριμένη εργασία, είτε γενικά πάνω σε θέματα ετεροζυγωτίαςετέρωσης και αρμοστικότητας: R. M. Bush, J. E. Eckenwalder, Δ. Μουλαλή, K. Ritland, Κ. Πανέτσο, P. E. Smouse, Α. Τσαυτάρη, και L. Zsuffa. BIBΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Aravanopoulos, F. A., Panetsos K. P. Moulalis D. and A. Scaltsoyiannes 1998. Ιntrogressive Pinus brutia x. halepensis swarms: a natural laboratory of genetics and breeding. In: Proc. IUFRO International Conference on Forest Genetics and Tree Improvement, 22-28 August, 1998, Beijing, China, The Chinese Academy of Forestry, Beijing, China, p. 58. Aravanopoulos, F. A., and L. Zsuffa 1998. Heteroygosity and biomass production in Salix eriocephala. Heredity (υπό δημοσίευση). Bryand, C.H., Gauthier S., Lemay J.F., Laliberte S. and M.F. Tremblay 1998. Relationship between field performance, family embryo morphology and isozyme heterozygosity, and in vitro reactivity in jack pine. Can. J. For. Res. 28: 98-105. Bush, R.M. and P.E. Smouse 1991. Evidence for the adaptive significance of allozymes in forest trees. New Φυσικού Περιβάλλοντος, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης.
Forests 6: 179-196. Bush, R.M., Smouse P.E. and F.T. Ledig 1987. The fitness consequences of multiple locus heterozygosity: the relationship between heterozygosity and growth rate in pitch pine (Pinus rigida Mill.). Evolution 41(4): 787-798. David, P., Delay B., Berthou P. and Ph. Jarne 1995. Alternative models for allozyme-associated heterosis in the marine bivalve Spisula ovalis. Genetics 139: 1719-1726. ΕΕΕΓΒΦ, 1994. Αγγλοελληνικό Λεξικό Ορολογίας Γενετικής και Βελτίωσης. Eλληνική Εταιρία Γενετικής και Βελτίωσης Φυτών, Θεσσαλονίκη, 96 σελ.. Gardner, J. E. and D. P. Snustad 1981. Principles of Genetics. J. Wiley, Toronto. Leary, R. B., Allendorf, F. W. and Knudsen, K. L. 1987. Differences in inbreeding coefficients do not explain the association between heterozygosity at allozyme loci and developmental stability in rainbow trout. Evolution 41: 1413-1415. Mitton, J. B. and Grant, M. C. 1984. Associations among protein heterozygosity, growth rate and developmental homeostasis. Ann. Rev. Ecol. Syst. 15: 479-499. Panetsos, K. P., 1989. Hybridization and its implications on forest tree breeding. Laboratory of Forest Genetics and Plant Breeding, Department of Forestry and Natural Environment, Aristotle University of Thessaloniki, Bull. No. 11, 19 pp. Pierce, B. A. and Mitton, J. B. 1982. Allozyme heterozygosity and growth in tiger salamander Ambystoma tigrinum. J. Hered. 73: 250-253. SAS Institute, 1985. SAS User's Guide: Statistics. SAS Institute Publ., Cary, NC. Smouse, P. E. 1986. The fitness consequences of multiple locus heterozygosity under the multiplicative overdominance and inbreeding depression models. Evolution, 40: 956-967. Sokal, R. R. and Rohlf, F. J. 1981. Biometry, 2nd ed. W.H. Freeman and Co., New York. Τσαυτάρης, Α., 1992. Βελτίωση Φυτών: Αρχές και Μέθοδοι. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Υπηρεσία Δημοσιευμάτων Θεσσαλονίκη Zouros, E. and Foltz, D. W. 1987. The use of allelic isozyme variation for the study of heterosis. Isozymes, 13, 1-59.
HETEROZYGOSITY AND FITNESS IN FOREST TREES: EXAMPLES FROM AN ANGIOSPERM AND A CONIFER Aravanopoulos F. Α. 1 1. Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding, Department of Forestry and Natural Environment, Aristotle University of Thessaloniki, PO Box 238, Thessaloniki, GR 54006 ABSTRACT The importance of the relationships between heterozygosity and characters related to fitness or adaptation is paramount to the development of breeding strategies. The interpretation of such associations remains one of the most fundamental questions in applied genetics and breeding. The present paper addresses fitness-heterozygosity relationships in two particular cases: (a) in willow (Salix eriocephala) full-sib families established in a completely randomized block design and (b) in a natural introgressive hybrid pine (Pinus brutia x P. halepensis) population. Heterozygosity was estimated after analysis of variable isoenzymic loci. In the former case total above ground oven-dry biomas production was employed as a fitness surrogate. In the latter case seed weight and seed volume index were used as fitness surrogates. Fitness-heterozygosity relationships were evaluated based on (a) linear regression models of heterozygosity index on fitness surrogates and (b) multiple regression models with each locus treated as an independent variable. In general, positive associations of heterozygosity at individuals loci and characters related to fitness were observed. Heterozygosity index and fitness did not seem to be correlated. Discussion focuses on the interpretation of the results observed in light of the hypotheses that have been invoked to account for heterozygosity-fitness associations. The importance of studying such relationships in vastly different organisms (angiosperms vs conifers) under different field conditions (controlled field experiment vs natural forest) and different mating designs (full-sibs vs random mating population), but employing the same lab techniques and the same analytical approaches, is stressed as a means to elucidate further the underlying causal mechanisms of heterozygosity-fitness relationships. Results were considered not to be in favor of the dominance hypothesis. Their potential application in breeding is discussed.