Noi hidrogeluri pe baza de polietilenglicoli

Universitatea Politehnica Bucuresti Noi hidrogeluri pe baza de polietilenglicoli Denumire etapa: Studiul obtinerii hidrogelurilor reticulate covalent sub forma de particule injectabile. Sinteza, purificarea si caracterizarea hidrogelurilor termosensibile, injectabile, pe baza de polietilenglicoli si N-vinilcaprolactama - faza unica - - sinteza lucrarii - PN II- Programul Idei - Proiect de cercetare exploratorie Contract de finantare nr. 389/2007 Termen predare: 15.09.2009 Director proiect, Prof. dr. ing. Mircea Teodorescu 1

Obiectivele etapei Etapa unica din anul 2009 a avut urmatoarele obiective: 1. Studiul obtinerii hidrogelurilor reticulate covalent sub forma de particule injectabile. 2. Sinteza, purificarea si caracterizarea hidrogelurilor termosensibile, injectabile, pe baza de polietilenglicoli (PEG) si N- vinilcaprolactama (NVC). 3. Activitati de diseminare a rezultatelor 4. Activitati de management stiintific si administrativ In cele ce urmeaza vor fi prezentate in rezumat rezultatele obtinute in cadrul primelor doua obiective. 1. Studiul obtinerii hidrogelurilor reticulate covalent sub forma de particule injectabile In cadrul acestui obiectiv a fost studiata obtinerea sub forma de microparticule a hidrogelurilor reticulate covalent pe baza de α,ω-diepoxi polietilenglicoli (DEPEG) si poliamine alifatice (microgeluri injectabile subcutanat pentru eliberarea lenta a diverse principii active). Schema reactiei de obtinere si alte caracteristici intrinseci ale acestor hidrogeluri au fost prezentate in referatul de lucrari pe anul 2008. Microgelurile sintetizate au fost caracterizate dimensional (dimensiuni de particule, indice de polidispersitate) in stare uscata si din punct de vedere reologic sub forma gonflata in apa. 1.1. Sinteza si purificarea microgelurilor Atat DEPEG cat si poliaminele alifatice utilizate sunt solubile in apa si, asa cum am aratat in referatul de lucrari pe anul 2008, obtinerea hidrogelurilor a fost facuta prin reticulare in solutie apoasa. Ca urmare, pentru obtinerea microgelurilor a fost adoptata metoda reticularii in (micro)emulsie/suspensie inversa, prin dispersarea solutiei apoase a reactantilor intr-un lichid organic nemiscibil cu apa, in prezenta unui emulgator/stabilizator. De mentionat ca in literatura de specialitate sunt descrise numeroase exemple de polimerizari reticulante ale unor monomeri vinilici sau reactii polimer analoage de reticulare efectuate in emulsie/suspensie inversa, inclusiv pentru obtinerea de hidrogeluri, dar nu exista niciun exemplu (dupa stiinta noastra) de reactie de poliaditie, cum este cazul nostru, efectuata in astfel de conditii. Pentru stabilirea conditiilor optime de sinteza a microgelurilor au fost realizate experimente in diverse conditii variindu-se natura mediului de dispersie (ciclohexan, toluen, ulei de parafina de uz farmaceutic, heptan), tipul de emulgator (Span 80, amestec Span80/Span 40, amestec Span 80/Tween 60, nonilfenol etoxilat cu 4 moli de etilenoxid, Aerosol OT), raportul solvent organic/faza apoasa (topitura, 4/1, 7/1, 9/1, 10/1 masic), raportul emulgator/faza apoasa (0,35/1, 1/1, 2/1, 3/1, 4/1 masic), modul de agitare, timpul de reactie (24 45 ore). Amina utilizata a fost in toate cazurile trietilentetramina (TETA), ca atare sau sub forma de monoclorhidrat (TETA. HCl pentru micsorarea solubilitatii in mediul organic). Au fost pastrate constante raportul molar atomi de hidrogen aminici/grupe epoxi terminale ale DEPEG (H amina /EG = 1/1), ce reprezinta gruparile reactante propriu-zise, si concentratia fazei apoase (30% masic DEPEG in apa distilata). Rezultatele au fost evaluate din punct de vedere al cantitatii de coagulum, formei particulelor si randamentului lor de obtinere, dimensiunilor de particule. Cele mai bune rezultate au fost obtinute utilizand TETA ca agent de reticulare, Span 80 (sorbitan 2

monooleat) ca emulgator, toluen sau ciclohexan ca mediu de dispersie organic, faza organica/faza apoasa 9-10/1, timp de reactie 45 ore. De mentionat ca randamentul de obtinere al particulelor uscate nu a depasit 50% nici la un timp de reactie de 45 ore. Mai jos este prezentat, ca exemplu, modul de lucru pentru obtinerea microgelurilor pe baza de DEPEG 2000 si TETA. Sinteza si purificarea microgelurilor pe baza de DEPEG 2000 si TETA Intr-un balon de 100 ml cu un singur gat si fund rotund si prevazut cu agitare magnetica, au fost introduse 6,72 g Span 80 si 38,7 ml (33,5 g) toluen si amestecul a fost agitat pentru omogenizare. Separat a fost preparata faza apoasa prin dizolvarea intr-un flacon de sticla de 10 ml a 1 g DEPEG 2000 (functionalitate 1,99 grupe epoxi/mol, M n, PEG2000=2060) in 2,20 ml apa distilata. Dupa dizolvarea completa a DEPEG, au fost adaugati 140 µl solutie apoasa TETA (concentratie 1,1. 10-3 moli TETA/ml, H amina /grupe epoxi DEPEG 2000 = 1/1 molar) si amestecul a fost agitat intens magnetic timp de 5 minute pentru omogenizare. Solutia cu concentratia de 30% masic DEPEG 2000 astfel rezultata a fost adaugata peste faza organica. Vasul de reactie a fost inchis cu un dop de sticla fixat cu ajutorul unei cleme metalice si amestecul a fost agitat timp de 5 minute la turatia de 1200 1300 rpm (agitare magnetica), rezultand un amestec tulbure, omogen. Balonul a fost apoi introdus intr-o baie de ulei termostatata la 60 C si agitarea magnetica a fost redusa la 500 rpm. Dupa 18 ore de reactie agitarea a fost redusa la 300 rpm, iar dupa alte 11 ore, la 200 rpm. Reducerea intensitatii agitarii a avut drept scop reducerea cantitatii de coagulum depusa pe peretii vasului de reactie. Timpul de reactie total a fost de 45 ore. La final, amestecul de reactie a fost racit si transvazat in doua tuburi de centrifuga de 50 ml. Cantitatea de coagulum ramasa a fost relativ scazuta. Pentru separarea purificarea microgelurilor amestecul final de reactie a fost centrifugat la 4000 rpm, 2x30 minute, urmata de decantarea fazei lichide superioare. Fazele inferioare cu aspect de gel au fost reunite si spalate cu 2x30 ml ciclohexan si 1x30ml acetona pentru indepartarea excesului de emulgator. Spalarea a fost realizata prin redispersarea microgelurilor in solvent cu agitare magnetica timp de 30 minute, urmata de separare prin centrifugare, decantarea solventului (faza superioara) si reluarea operatiei. Pentru indepartarea oligomerilor de DEPEG nelegati in reteaua tridimensionala a particulei, microgelurile au fost agitate cu 3x30 ml apa distilata, cate 24 ore/portie, cu separare prin centrifugare intre 2 portii de apa distilata. Microgelurile astfel purificate au fost liofilizate rezultand o pulbere alba (0,49 grame). 1.2. Caracterizarea microgelurilor Microgelurile rezultate au fost caracterizate din punct de vedere al dimensiunii de particule si polidispersitatii in stare uscata, cu ajutorul microscopiei electronice de baleiaj sau microscopiei optice, si comportarii reologice sub forma gonflata in apa. Estimarea diametrului mediu al particulelor (diametrul mediu numeric D n, diametrul mediu gravimetric D w ) si indicelui de polidispersitate (D w /D n ) s-a facut prin masurarea a cel putin 100 de particule pe fiecare micrografie SEM sau optica, valorile obtinute introducandu-se in formulele de calcul 1si 2: D n = ΣN i xd i /ΣN i (1) D w = ΣN i xd 4 3 i /ΣN i xd i (2) unde N i reprezinta numarul de particule care au diametru D i. 3

In conditiile de lucru utilizate au fost obtinute microgeluri cu diametrul mediu numeric in intervalul 10 20 µm. Cresterea concentratiei de Span 80, in scopul scaderii dimensiunii particulelor, a avut un efect relativ redus asupra D n, insa a diminuat apreciabil polidispersitatea particulelor rezultate. Concentratiile de Span 80 in raport mai mare de 2/1 masic fata de faza apoasa (3-4/1) au determinat o scadere apreciabila a randamentului de obtinere a microgelurilor, la timp de reactie constant. Figura 1 prezinta spre exemplificare micrografii SEM ale unor microgeluri pe baza de DEPEG 2000 reticulat cu TETA obtinute la doua concentratii diferite de emulgator. Se observa ca microgelurile obtinute la raport Span 80/faza apoasa = 1/1 au o polidispersitate mai mare decat cele obtinute la raport 2/1, demonstrata si de curbele de distributie prezentate in figura 2. A B Figura 1. Micrografii SEM ale unor microgeluri obtinute prin reticularea DEPEG 2000 cu TETA: H amina /EG = 1/1 molar, solvent toluen, concentratie faza apoasa = 30% DEPEG, toluen/faza apoasa = 10/1 masic, emulgator Span 80; A) Span 80/faza apoasa=1/1 masic; D n =18,3 µm, D w = 45,8 µm; D w /D n =2,50 ; B) Span 80/faza apoasa=2/1 masic; D n =14,6 µm, D w = 22,4 µm; D w /D n =1,54 Numar de particule 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Dimensiune particule, um Numar de particule 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Dimensiune particule, um A B Figura 2. Curbe de distributie ale microgelurilor prezentate in figura 1. 4

Solutiile apoase ale microgelurilor prezentate in figura 1B au trecut fara probleme prin acul (dimensiune 26Gx1/2) unei siringi de 1 ml pentru injectie subcutanata. Microgelurile gonflate in apa, separate de faza apoasa prin centrifugare au avut aspect de gel moale, translucid, fara proprietati de curgere. Continutul de apa al gelului respectiv a fost determinat gravimetric, prin uscare, iar proprietatile sale reologice au fost determinate cu ajutorul unui reometru Bohlin Gemini 150. O exemplificare a rezultatelor obtinute este prezentata in figura 3. G' 40 G' 40 35 G', G'' (Pa) 10 3 G'' 30 20 10 Unghiul de pierdere ( o ) G', G" (Pa) 10 3 G" 30 25 20 15 10 Unghiul de pierdere ( o ) Unghiul de pierdere Unghiul de pierdere 5 10 1 0 0.001 0.01 0.1 Deformare A) 0.01 0.1 1 10 Frecventa (Hz) B) 0 G' G' G', G" (Pa) 10 3 G', G" (Pa) 10 3 G" G" 0 100 200 300 400 500 Timp (sec) C) 20 25 30 35 40 45 50 Temperatura ( o C) D) Figura 3. Exemplu de rezultate ale testarii reologice a microgelurilor gonflate in apa. DEPEG 600 ; TETA; H amina /EG = 1/1 molar, solvent ciclohexan, concentratie faza apoasa = 30%; CHX/faza apoasa = 9/1 masic, emulgator Span 80; Span 80/faza apoasa=1/1 masic; 60 C; 27 ore; continut apa 4,8 g apa/g xerogel. A) 1 rad/s; 25 C; B) 25 C; C) 1 rad/s; 25 C; D) 1 rad/s. In cazul tuturor probelor a fost efectuat initial un test de baleiaj de amplitudine (amplitude sweep test, fig. 3A) pentru determinarea regiunii liniare de viscoelasticitate 5

(LVR) in interiorul careia au fost efectuate determinarile urmatoare. Testele au aratat ca materialul a avut in toate cazurile un comportament de gel, (fig. 2B), asa cum era de asteptat judecand dupa aspectul sau si este stabil in timp (pe intervalul de timp investigat, Fig. 3C). In toate cazurile dependenta de temperatura a fost una cu minim pentru G si crescatoare pentru G (Fig. 3D). 2. Sinteza, purificarea si caracterizarea hidrogelurilor termosensibile, injectabile, pe baza de polietilenglicoli si N-vinil caprolactama (NVC) In cadrul acestui obiectiv au fost sintetizate hidrogeluri termosensibile, cu reticulare reversibila prin legaturi fizice, cu structura de bloccopolimeri, avand un bloc central de polietilenglicol si blocuri laterale de polinvc. PoliNVC este un polimer hidrosolubil ce prezinta temperatura critica inferioara de solubilitate. Sinteza tri si pentabloccopolimerilor PEG PNVC a fost realizata prin polimerizare radicalica controlata de tip ATRP (atom transfer radical polymerization, Schema 1), pornind de la macroinitiatori PEG, a caror sinteza a fost pusa la punct pe parcursul lucrarilor desfasurate in anul 2007. OOCCH(CH 3 )Cl CH 2 CH PEG OOCCH(CH 3 )Cl OOCCH(CH 3 )Cl CH CH 2 OOCCH(CH 3 )Cl = CH 2 CH R N O + R ATRP PEG bloccopolimer termosensibil NVC Schema 1. Sinteza pentabloccopolimerilor (PNVC) 2 PEG(PNVC) 2 2.1. Sinteza bloccopolimerilor PEG-PNIPAM NVC este un monomer neconjugat, a carui polimerizare prin ATRP nu a fost raportata inca in literatura. Incercarile initiale de a polimeriza acest monomer cu un sistem catalitic tris(2-dimetilaminoetil)amina (Me 6 TREN)/CuCl (cel mai eficace sistem catalitic ATRP raportat in literatura) au esuat si ca atare s-a trecut la utilizarea unui alt sistem catalitic, alcatuit din 5,7,7,12,14,14-hexametil-1,4,8,11 tetraazaciclotetradecan (Me 6 Ciclam) si CuCl, descris in literatura ca fiind activ in polimerizarea controlata a N- vinyl pirolidonei, un monomer similar ca structura cu NVC. Utilizarea acestui sistem catalitic a permis obtinerea bloccopolimerilor doriti. Investigatiile experimentale efectuate a permis stabilirea faptului ca nu este vorba totusi de un sistem de polimerizare vie (dupa cum demonstreaza valorile indicilor de polidispersitate-vezi mai jos), ci doar de un sistem bazat pe initiere si dezactivare lenta a macroradicalilor. Reglarea masei moleculare a blocurilor a fost facuta prin varierea solventului sau prin adaugare de cantitati variabile de CuCl 2 in calitate de agent de dezactivare. Mai jos este prezentat modul de lucru general pentru obtinerea bloccopolimerilor PEG-PNVC. 6

Mod de lucru pentru sinteza tri si pentabloccopolimerilor PNVC-PEG Intr-un balon cu un gat, cu fund rotund si cu volumul de 15 ml, prevazut cu agitator magnetic, au fost introduse aproximativ 1,8-2,4 g NVC, cantitatea calculata de macroinitiator PEG cu grupe cloropropionat (corespunzatoare masei moleculare dorite pentru blocul PVCL), si 8 ml solvent. (DMF apa 1/1 sau dioxan apa 9/1 vol/vol) si balonul a fost etansat cu un septum de cauciuc. Dupa omogenizarea amestecului, solutia rezultata a fost barbotata cu azot timp de 80 minute pentru eliminarea oxigenului. Separat, intr-un balon de 5 ml cu un gat si brat lateral si prevazut cu agitator magnetic, a fost preparata solutia de catalizator prin cantarirea cantitatilor corespunzatoare de CuCl, CuCl 2 si Me 6 Ciclam. Balonul a fost apoi etansat cu un septum de cauciuc si umplut cu azot prin vidare compensare cu azot (4x). In balonul de catalizator au fost introdusi apoi cu o siringa purjata cu azot, 2 ml solvent deoxigenat anterior prin barbotare cu azot timp de 40 minute. Amestecul a fost agitat cateva minute la temperatura camerei, dupa care solutia de catalizator a fost preluata integral cu o siringa purjata in prelabil cu azot si injectata in balonul de polimerizare, peste solutia de monomer si macroinitiator. Amestecul a fost lasat la polimerizat periode variable de timp (6 22 h) functie de proba, la 20 0 C. Dupa terminarea reactiei, balonul a fost deschis si masa de reactie, viscoasa, a fost agitata in prezenta aerului, timp de 12 ore, pentru dezactivarea catalizatorului. Solventul a fost apoi evaporat complet in vid. Reziduul solid rezultat a fost dizolvat in clorura de metilen/cloroform si apoi agitat cu cateva spatule de rasina schibatoare de ioni de tip cationit puternic acid, in forma acida, pentru indepartarea complexului catalizator. Solutia rezultata a fost uscata pe sulfat de sodiu anhidru si apoi microfiltrata, daca a fost cazul. Solutia incolora rezultata a fost concentrata la rotavapor si apoi turnata in exces de eter etilic rece. Polimerul precipitat, in cele mai multe cazuri aglomerat, a fost colectat, uscat si maruntit, obtinandu-se la final o pulbere alba. 2.2. Caracterizarea blocopolimerilor obtinuti si hidrogelurilor corespunzatoare Blocopolimerii obtinuti au fost analizati prin spectrometrie 1 H RMN (Fig.3), punandu-se in evidenta maximele caracteristice celor doua tipuri de blocuri. Masa moleculara a blocurilor de PNVC a fost calculata pe baza spectrului RMN prin compararea ariilor maximelor de la 4,4 ppm (CH-N-, a) in cazul VCL si respectiv de la 3,6 ppm (-OCH 2 CH 2 -, f) in cazul PEG (Figura 4), tinand cont de masa moleculara a PEG, cunoscuta din determinari anterioare. Tot pe baza spectrelor 1 H RMN a fost calculata si compozitia bloccopolimerilor sintetizati. Indicele de polidispersitate al bloccopolimerilor a fost determinat prin cromatografie pe gel permeabil, in DMF, cu standarde de PSt. Acesta a fost mai mare de 1,8 in toate cazurile, valoarea lui depinzand de natura solventului folosit si de cantitatea de CuCl 2 introdusa in reactie. Bloccopolimerii sintetizati au fost caracterizati din punct de vedere al temperaturii de agregare, temperaturii de gelifiere si proprietatilor reologice functie de temperatura. Pentru determinarea temperaturii de agregare (T agr ) au fost utilizate solutii de polimer in apa cu concentratia 0,5%, iar temperatura de gelifiere (T gel ) a fost determinata prin metoda inversiei tubului pentru solutii cu concentratia de 5%, 10%, 15% si 20%. In toate cazurile, T gel a fost mai mare decat T agr, crescand cu scaderea masei moleculare a blocului de PNVC (in concordanta cu datele de literatura) si a concentratiei (Figura 5). 7

f f -OCH 2 CH 2 O- f c a -CH 2 -CHb N O e d e e apa c,e a b d 5 4 3 ppm Figura 4. Spectrul 1 H RMN al unui pentabloccopolimer cu blocul central de PEG 4000 si blocuri laterale de PNVC cu M n =13500. Cl:CuCl:CuCl 2 :Me 6 Ciclam = 1:1:0,2:1,2, solvent- amestec DMF/apa=1/1; timp reactie 20,5 ore 2 1 60 T gel ( o C) 55 50 45 M=3620 M=8600 M=18400 M=22500 G' (Pa) 10 6 M n,bloc PVCL=3620 M n,bloc PVCL=8600 M n,bloc PVCL=18400 M n,bloc PVCL=22500 40 10 0 35 0 5 10 15 20 25 Concentratie (%) Fig. 5. Dependenta T gel de masa moleculara si concentratia solutiei apoase de polimer. Cl:CuCl:Me 6 Ciclam = 1:1:1 Solvent = dioxan/apa 9/1 10-2 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Temperatura ( o C) Fig. 6. Variatia lui G cu temperatura si masa moleculara a blocului de PVCL. Cl:CuCl:Me 6 Ciclam = 1:1:1 Solvent = dioxan/apa 9/1 Temperaturi de gelifiere mai mici de 37 C au fost obtinute in cazul bloccopolimerilor cu mase moleculare ale blocului de PNVC mai mari de 17000 Da, sintetizati in amestec DMF/apa, la concentratii ale solutiilor apoase de 15% si 20%. Comparativ cu sintezele in amestec dioxan/apa, amestecul DMF/apa a condus la polidispersitati mai mari ale blocului de PNVC (la M n similare), si deci la un continut mai ridicat de fractie cu masa moleculara mai mare, ce conduce la T gel mai scazute (Tabelul 1). T gel a fost influentata si de masa blocului central de PEG, fiind mai scazuta pentru mase moleculare mai scazute ale PEG, in cazul bloccopolimerilor sintetizati in aceleasi conditii. 8

Tabelul 1. Temperaturi de gel si agregare ale pentabloccopolimerilor PEG-PNVC Proba M PEG M n, bloc PVCL * T agr Gelifiere C Conc. sol. aq. % T gel C 5-10 38,5 TV-1 2000 16100 33 15 37 20 36 5-0,5 TV-2 4000 13400 34 15 37 20 36 5-1,5 TV-3 6000 13500 34 15 37 20 35 Concluziile determinarilor de T gel au fost confirmate si de masuratorile reologice functie de temperatura efectuate asupra solutiilor cu concentratia 20%. Temperatura corespunzatoare momentului de crestere a valorii modulului de stocare G corespunde inceputului agregarii. Figura 6 arata ca momentul inceperii cresterii lui G depinde de masa moleculara a blocului de PVCL, fiind cu atat mai mica cu cat masa blocului de PVCL este mai mare. Tot aceasta figura arata ca gelul ce se obtine in cazul PVCL cu mase moleculare mai mari are valori G mai mari si deci proprietati mecanice mai bune. Cresterea in doua trepte a G se datoreaza probabil faptului, mentionat in literatura, ca gelurile de PVCL prezinta doua tranzitii induse de temperatura, o tranzitie la temperatura mai joasa, atribuita microsegregarii domeniilor hidrofobe si alta la temperatura mai ridicata corespunzand contractiei de volum propriu-zise a gelului. In cazul blocopolimerilor cu T gel mai mica de 37ºC, hidrogelurile corespunzatoare au fost caracterizate prin determinarea gradului de gonflare maxim in apa si G si G la 37ºC. 3. Concluzii 1. Au fost sintetizate microgeluri injectabile (D n =10 20 µm) prin reticularea DEPEG cu TETA in emulsie/suspensie inversa. Microgelurile respective au fost caracterizate din punct de vedere al dimensiunii de particule si polidispersitatii in stare uscata si comportarii reologice sub forma gonflata in apa. 2. Au fost preparate hidrogeluri termosensibile, injectabile, pe baza de tri si penta bloccopolimeri PEG - PNVC, sintetizati prin ATRP in solvent DMF:apa 1/1 vol/vol cu diverse mase moleculare ale blocurilor componente. Blocopolimerii sintetizati au fost caracterizati din punct de vedere al maselor moleculare, compozitiei si proprietatilor reologice functie de temperatura, iar hidrogelurile cu T agr <37ºC, din punct de vedere al gradului de gonflare la echilibru in apa si proprietatilor elastice (80% continut de apa) la 37ºC. 9