Catedra Biologie moleculară şi Genetică umană www.bimogeum.ucoz.com Cursul Biologie moleculară Semestrul I Prelegeri 34 ore Lucrări practice 51 ore două totalizări (lucrare scrisă + teste la calculator) teste evaluări curente pe compartimente Nota medie componentă a notei finale de la examen Examen Admiterea studenţilor cu două totalizări susţinute fără absenţe Consultaţii curente - tematice Cerc ştiinţific studenţesc 1 2 DORINŢĂ MUNCĂ SISTEMATICĂ INSISTENŢĂ ÎNDRĂZNEALĂ CREATIVITATE DISCIPLINĂ structura BIOLOGIA ŞTIINŢA DESPRE VIAŢĂ funcţia dezvoltarea rel. cu mediul ORGANISMELOR VII = SISTEMELOR BIOLOGICE 3 4 Biologia moleculară Citologia Histologia Revoluţia agricolă sec. XVII-XVIII Genetica BIOLOGIA Anatomia Revoluţia industrială sec. XIX Biochimia Fiziologia Revoluţia informaţională sec. XX Imunologia Ecologia Patologia Revoluţia genetică sec. XXI 5 6 1
Sisteme de organe Obiectul BIOLOGIEI MOLECULARE Organe Ţesuturi Celule Macromolecule Micromolecule 7 46 23 mol 46 mol mol 46 mol 23 ADN ADN ADN ADN 46 mol ADN 46 mol ADN Celule limfatice 374 Celule endoteliale 1031 Ochi 547 gene Glande salivare 17 Oase 904 gene Glanda tiroidă 584 Ţesut adipos 581 gene Glande paratiroide 46 Timus 261 gene Esofag 76 gene Muşchi netezi 127 Plămâni 1887 gene Gene Muşchi implicate striaţi 735 în dezvoltarea şi Inima 1195 gene Glande mamare 696 Ficatul 2091 gene funcţionarea Pancreas 1094 organelor Eritrocite 8 gene şi Splina 1094 Trombocite 22 gene Suprarenale ţesuturilor 658 la Intestinul gros 874 gene Vezica biliară 788 Rinichi 712 gene Intestinul subţire 297 Ovar 504 gene Placenta 1290 Testicul 370 gene Prostata 1283 Leucocite 2164 Piele 620 Creier 3195 gene Uter 1859 gene Embrion 1989 gene Tunica sinovială 813 gene Unităţi de măsură în BM De lungime 1 mm = 10-3 m 1 μm = 10-6 m 1 nm = 10-9 m 1 = Å 10-10 m De greutate 1 Da = 1,66.. X10-24g (1uc) kda = 1000 Da Dimensiuni AN 1 pb = 1pn 1 Kb = 1000 pn 1 Mb = 1 000 000 pn 11 Coeficient de sedimentare la centifugare S 2
Importanţa BM în medicină Unitatea structurală, funcţională a viului - celula Asigură înţelegerea organizării şi funcţionării tuturor organismelor Stă la baza altor ştiinţe bio-medicale Genetica Biochimia Fiziologia Fiziopatologia Farmacologia Asigură înţelegerea mecanismelor de apariţie a maladiilor Stă la baza metodelor contemporane de diagnostic Stă la baza elaborării medicamentelor de generaţie nouă 13 14 ORGANISM VIU CELULA Sistem deschis cu schimb permanent cu mediul de: substanţe; energie; informaţie. Sistem caracterizat prin: autoreproducere autoreglare autoreînnoire Sistem ce are un program: codificat în moleculele ADN realizat prin sinteza ARN şi proteine Compoziţia chimică Structura generală Diversitatea Proprietăţi Funcţii Integralitate 15 16 Compoziţie chimică Organizarea generală a celulei Setul de componente necesare: Aparatul Aparatul superficial metabolic Barieră Sinteză SO Transport Scindare SO Recepţie Detoxifiere Contacte cel. Energetic Apărare Semnalizare Aparatul genetic Material genetic Aparat de replicare Aparat de reparare Aparat de transcripţie 17 Membrana citoplasmatică Citoplasma cu organite Nucleul 18 3
Celula eucariotă Celula procariotă 19 Celula procatiotă Fără nucleu Plasmide mol ADN mici inelare Expresia IG Transcripţie Translaţie Transmiterea IG Replicarea ADN Diviziunea directă a cel (amitoza) Mod de organizare: Organisme monocelulare Celula eucatiotă Cu nucleu bine diferenţiat Membrana celulară glico-lipoproteică Citoplasma compartimentalizată în mai Membrana celulară glico-lipo-proteică multe organite membranare Citoplasma necompartimentalizată Materilalul genetic: mol ADN lineare compactizate sub formă Materilalul genetic: de cromatina sau cromozomi Nucleoidul molecula ADN mol ADN mitocondrial, mici inelare inelară, fixată de membrana Expresia IG plasmatică Transcripţie Processing ARN Transfer ARN din nucleu în citoplasma Translaţie Conformaţia proteinelor Transmiterea IG Replicarea ADN Diviziune indirectă a cel (mitoza, meioza) Mod de organizare: Organisme monocelulare Organisme pluricelulare Diversitatea celulelor organismului uman Diversitatea celulelor organismului uman Organismul uman alcătuit din ~200 tipuri celule Celulele conţin material genetic identic Celulele au structură asemănătoare, dar formă diferită Celulele au proprietăţi şi funcţii diferite, determinate de expresia diferenţiată a informaţiei genetice 21 Diferite celule ale organismului au genom identic + proteinom diferit 22 Tema 1 Macromoleculele = biopolimerii Tipuri Structură Biogeneză Proprietăţi Funcţii Localizare Interacţiuni STRUCTURA PROPRIETĂŢILE FUNCŢIILE celulei bazate pe un substrat molecular ADN conţine informaţia ARN asigură sinteza proteinelor Proteinele asigură vitalitatea 23 24 4
Relaţiile macromoleculelor în celulă Transcripţie Translaţie ADN ARN Proteine Hidraţi de carbon Cataliză - sinteză Lipide 25 26 ADN? ARN? Proteine? Funcţiile principale ale macromoleculelor Hidraţii de carbon (glucide)? Lipide? Complexe supramoleculare ADN + proteine = DNP (dezoxiribonucleooproteide) ex.: cromosomii ARN + proteine = RNP (ribonucleooproteide) ex.: ribosomii Lipide + proteine = lipoproteide ex.: membrana plasmatică Glucide + proteine = glicoproteide ex.: acidul glucuronic 27 DNP RNP 5
Membrane Localizarea macromoleculelor în celulele umane ADN Localizat. Sintetizat. ARN Localizat.. Sintetizat Proteine Localizate.. Sintetizate Lipide Localizate.. Sintetizate.. Glucide Localizate.. Sintetizate.. Structura macromoleculelor Structura primară lanţ de mai mulţi monomeri uniţi prin legături covalente Structura secundară Plicaturarea lanţului polimeric legături de hidrogen Structura terţiară Configuraţia tridimensională funcţională legături de hidrogen, ionice, electrostatice Structura cuaternară, supramoleculară Combinaţia mai multor polimeri legături de hidrogen, ionice, electrostatice Monomer Dimer Trimer Tetramer Pentamer Polimer 33 34 MONOMER dn dezoxiribonucleotid dn POLIMER dn dn dn dn dn Catenă ADN Structura macromoleculelor Monomeri ADN (acid dezoxiribonucleic): 4 tipuri de dezoxiribonucleotide (dntp dnmp) datp (deoxi-adenozin-trifosfat) damp (deoxi-adenozin-monofosfat) dgtp (deoxi-guanozin-trifosfat) dgmp (deoxi-guanozin-monofosfat) dctp (deoxi-cimitidin-trifosfat) dcmp (deoxi-cimitidin-monofosfat) dttp (deoxi-timitidin-trifosfat) dtmp (deoxi-timitidin-monofosfat) Monomeri ARN acid ribonucleic: N ribonucleotid N N N N N N Catenă ARN 4 tipuri de ribonucleotide (NTP NMP) ATP (adenozin-trifosfat) AMP (adenozin-monofosfat) GTP (guanozin-trifosfat) GMP (guanozin-monofosfat) CTP (cimitidin-trifosfat) CMP (cimitidin-monofosfat) UTP (uridin-trifosfat) UMP (uridin-monofosfat) a.a. aminoacid a.a. a.a. a.a. a.a. a.a. a.a. Catenă polipeptidică = proteină Monomeri ai proteinelor: 20 tipuri de aminoacizi (bazici, acizi, neutri) Ala Val Ser His Pro... 6
37 Structura macromoleculelor Structura primară ADN Catena polinucleotidică nucleotidele polimerizează prin legături covalente fosfodiesterice; ordinea nucleotidelor este aleatorie = codul genetic; 5' AGTGCATACGTACGGACATT... 3 Structura primară ARN Catena polinucleotidică nucleotidele polimerizează prin legături covalente fosfodiesterice; ordinea nucleotidelor este copia ADNului; 5' AGUGCAUACGUACGGACAUU... 3 Structura primară a proteinelor Lanţ polipeptidic Aminoacizii polimerizează prin legături covalente peptidice Ordinea aminoacizilor este determinată de ordinea codonilor în ARNm (copia unei secvenţe din ADN) NH2.Ser-Ala-Tyr-Val-Arg-Thr... 7
Structura macromoleculelor Structura secundară ADN Două catene unite prin punţi de H: Complementare AT şi G C; Antiparalele; Dubluspiralate; 5' A T G C A T A C G T A C G A T 3 3 T A C G T A T G C A T G C T A 5' Structura secundară ARN Plierea catenei poliribonucleotidice: bucle prin unirea (punţi de H) complementară a b.a. (AU şi G C) Fiecare buclă = situs funcţional: Conformaţia buclelor, numărul lor este specifică fiecărui ARN în parte. Structura secundară a proteinelor Plierea catenei polipeptidice (punţi de H) -spirale -structuri Structura macromoleculelor Structura terţiară a ADN ADN+proteine histone+proteine non-histone Cromatina cromozomul Structura terţiară a ARN ARN+proteine ARNr+proteine ribozomale??? ARNt+proteine ARNm+proteine Structura terţiară a proteinelor Plierea -spiralelor şi -structurilor prin punţi bis Forma globulară Structura macromoleculelor Structura cuaternară a proteinelor Combinarea funcţională a mai multor polipeptide Ex: 2 -globine + 2 -globine = Hb 2 -peptide + 2 -peptide = receptor insulinic 2 catene L (light) + 2 catene H (heavy) = Ig (Ac) (-tubulia + -tubulina)n = microtubuli.. Acizii nucleici ADN: molecule bicatenare; deţine informaţia genetică codificată despre... ARN molecule monocatenare: ARNm copia IG, matriţa pentru sinteza proteinelor ARNt transportă aminoacizi, translatori ai codului genetic ARNr component al ribozomilor, controlul translaţiei microarn reglarea expresiei IG 47 48 8
ADN acid dezoxiribonucleic Momomerul ADN Monomeri Structura Primară Secundară Terţiară Localizare Proprietăţi Funcţii Sinteză Particularităţile ADN uman Metode de studiu γ P β α P P O N 5 C C C 1 4 C C 3 2 nucleozid dntp nucleotid nucleozid trifosfat N baza azotată -Pu Adenina Guanina -Py Timina Citozina 49 dnmp = monomeri ADN 51 Monomer nucleotidele (dnmp) Structura primară: catena polinucleotidică Structura secundară: bicatenară Structura ADN I catena polinucleotidică II dublul helix = două catene spiralizate unite prin legături de hidrogen III DNP = dezoxiribonucleoproteid 54 9
Structura primară a ADN 5' GCGT... 3 55 56 Complementaritatea ADN asigură: Rosalind Franklin Maurice Wilkins stabilitatea moleculei ADN; mecanismul replicării; mecanismul transcripţiei; mecanismul recombinării; mecanismul reparării leziunilor ADN James Watson şi Francis Crick alături de modelul structurii secundare a ADN. 57 58 Conformaţia spaţială a moleculelor de ADN liniar Tip Lungimea spirei Baze/tur Înclinarea faţă de ax A 24,6 Å ~11 +19 B 33,2 Å ~10-1,2 Z 45,6 Å ~ 12-9 Structura terţiară ADN + proteine = DNP ADN + proteine situs-specifice= complex funcţional ADN nuclear + proteine histone = cromatina cromozomii 59 60 10
Proprietăţile ADN Replicare dublarea IG Reparaţie Identificarea, înlăturarea greşelilor Denaturare ruperea legăturilor de H Renaturare refacerea dublului helix Heterogenitate varietatea secv. nucleotidice Flexibilitate A B Z Fragilitate sensibilitate la factori mutageni Migrare în câmpul electric (ADN are ) Hibridizare molecule de diferită origine formează noi molecule Replicarea = dublarea ADN = dublarea IG = transmiterea IG 62 Funcţiile ADN Deţine IG codificată: succesiunea b.a. în ADN determină succesiunea aminoacizilor în proteină Păstrează IG: de acţiunea nucleazelor de citirea neautorizată de mutaţii Transmite IG prin dublare=replicare: 1ADN replicare 2ADN Realizează IG ADN transcripţie ARN translaţie proteină Exemple globina globina Insulina actina miozina Imunoglobulina Hb Reglează nivelul glucozei Asigură contracţiile musculare Apărare imună 63 Concluzii: Localizarea ADN ADN are secvenţe codante = gene: Gene p/u proteine ARNm ~ 30 000 Gene prearnr ~ 250 Gene ARNr 5S ~ 2000 Gene ARNt ~ 1300 Gene p/u microarn ADN are secvenţe necodante Secv. reglatoare Secv. spaţiatori Secv. satelit (cen, t) Secv. minisatelit (markeri crs) Secv. microsatelit (markeri individuali) În nucleu 95-98% molecule mari liniare de ADN asociate cu proteine histone sub formă de cromatină cromozomi În mitocondrii 2-5% molecule mici inelare 66 11
Particularităţile ADN uman ADN nuclear (nucleul celulei somatice, diploid) cu o lungime de ~ 6,4x10 9 p.n.; 7 picograme fragmentat în 46 de molecule; asociat cu proteine histone; extrem de eterogen: secvenţe codificatoare şi necodificatoare; secvenţe repetitive şi unice; secvenţe active transcripţional şi inactive; secvenţe stabile şi instabile mutaţional; conţine ~ 30000 perechi de gene; se replică numai în perioada S a ciclului celular; 50% este de origine maternă şi 50% de origine paternă. 67 68 A T 17 Anemia cu hematii falciforme Supraactivitatea măduvei osoase Creşterea cantităţii măduvei osoase Distrugerea rapidă a celulelor falciforme Anemie Diminuarea activităţii mintale Dilatarea cordului Indivizii homozigoţi recesivi Hemoglobină anomală Hematii falciforme (în formă de seceră) Defecte cardiace Lipirea celulelor şi blocarea circulaţiei sanguine Dereglări locale în alimentare sanguină Afectarea plămânilor Pneumonie Defecte în activitatea musculară Dereglări cerebrale Defecte în tractul gastrointestinal Paralizie Acumularea celulelor falciforme în splină Defecte renale Dereglări renale 69 Deformări scheletice Dereglări cardiace Dureri nespecifice Fibroza 70 splinei Particularităţile ADN uman ADN mitocondrial Are o lungime de 16,6 kb Este inelar Numărul moleculelor este variabil (2-10) Conţine 37 de gene Genele sunt dispuse compact Se replică în dependenţă de metabolismul celular Este de origine maternă Genomul nuclear n=3,2 Gb / 2n=6,4 Gb (~ 30000 gene/perechi) ADN codant 10% ADN genic 25% Particularităţile genomului uman ADN necodant 90% ADN extragenic 75% Secvenţe unice sau în număr mic de copii 60% Genomul mitocondrial 16,6 kb 37 de gene Secvenţe moderat sau înalt repetitive 40% 71 72 12
Genomul nuclear Secvenţele necodificatoare ale genomului uman SECVENŢE OBLIGATORII -Gene structurale (codificatoare de proteine) -Gene pentru ARNt, ARNr; -Palindromi; - ADN satelit (c,t ) SECVENŢE FACULTATIVE Elemente mobile Pseudogene ADN viral SINEs transpozoni; situsuri de iniţiere a replicării LINEs retrotranspozoni; situsuri de împerechere corectă a crs în timpul meiozei I ADN satelit rol structural, formează regiunile de heterocromatină constitutivă (c, t, h, s) ADN minisatelit markeri genetici ai crs ADN microsatelit markeri genetici individuali SINEs (Short interspersed elements) 11% LINEs (Long interspersed elements) 16% 73 74 Studiul ADN pentru: Stabilirea structurii genelor normale şi mutante Depistarea mutaţiilor Diagnosticul bolilor genice Analiza polimorfismului individual ARN acid ribonucleic Monomeri NTP (ATP, GTP, CTP, UTP); Structura primară catena polinucleotidică; Structura secundară bucle; Structura terţiară RNP (ARN+proteine) 75 76 Monomeri ARN - NTP 77 78 13
1 2 3 4 1 2 3 Transcripţie Transcripţie Processing ARNm ARNr ARNt ARNm Processing ARNm ARNr ARNt!!! Toate tipurile de ARN sunt transcrise de pe ADN!!! ARN - este complementar unei catene de ADN - este identic cu cealaltă catenă ADN transcripţie prearnm prearnr prearnt ARNhn ARNm ARN mesager (informaţional, matricial) ARNr ARNr + proteine ribozomale = ribozomi Sediul sintezei proteinelor ARN precursor processing ARNt f u n c ţ i e Transportă aminoacizi spre ribozomi Translează codul genetic din ARNm ARNm f u n c ţ i e Copia codului genetic despre structura proteinei Matriţă pentru sinteza proteinei în timpul translaţiei Molecule monocatenare, heterogene Se obţin prin transcrierea catenei anticodogene a genei structurale şi processing-ului pre-arnm Conţine informaţia despre un polipeptid şi serveşte ca matriţă p/u sinteza polipeptidului ARNt Molecule monocatenare; Forma 3 bucle funcţionale (anticodon, D, Ѱ); Se sintetizează prin transcripţia genelor ARNt, Conţin nucleotide cu baze azotate obişnuite şi minore (timina, pseudouracil, dihidrouridina) Asigură transportarea aminoacizilor spre locul de sinteză a proteinelor Reprezintă translatori ai codului genetic În celulă se conţin 61 tipuri Structura secundară a ARNr 14
ARNr ARN ribozomal Molecule monocatenare ARNr se sintetizează prin transcripţia genelor ARNr, în regiunea nucleolului Intră în componenţa ribozomilor 18S + 33 proteine = 40S 5S + 5,8S + 28S + 49 proteine = 60S Asigură interacţiunea dintre subunităţile ribozomale, ribozom-arnm, ribozom-arnt. Tipul celulelor Procariote Eucariote, nucleu Eucariote, mitocondrii ARNr Coeficientul de sedimentare 5S 16S 23S 5S 5,8S 18S 28S 12S 16S 86 microarn ARNsn ARN-primer ARN-telomerazic ARN din componenţa spliceosomei ARNsc Ribozime ARN de interferenţă Structura proteinelor Monomeri 20 tipuri de aminoacizi Primară lanţul polipeptidic de aminoacizi (ordinea a-a controlată de codul genetic ADN) Secundară -spirale şi -structuri Terţiară globulară Cuaternară - mai multe polipeptide formează o proteină complexă!!! pot forma complexe cu alte proteine sau alte molecule (AN, glucide, lipide) 87 Formarea legăturilor peptidice Formarea polipeptidului 15
Structura proteinelor Structura primară a ribonucleazei A (RNase A) Structura secundară a ribonucleazei A (RNase A) Arhitectura proteinelor Tranzitii conformationale ale hexokinazei Functii ale proteinelor Clasa Functia Exemple Domeniu: regiune compacta de 100-400 AA, specificata de un exon al genei, care determină o funcţie Proteine dinamice Proteine structurale enzime transport contractia musculara semnale, hormoni protectie reglarea exprimarii genelor matricea tisulara Proteaze, lipaze, nucleaze, polimeraze... Hb, transferina actina, miozina insulina, STH Ig, IFN factori de transcripţie elastina,colagen 16
Proprietăţile majore ale proteinelor Heterogenitate; Pot fi bazice, acide sau neutre; Interacţionează specific cu alte molecule; Catalizatori eficienţi; Adaptabilitate... Relaţia: structură mediu funcţie Structura chimică primară Factorii de mediu t o, ph, P, h, cofactori, etc. Configuraţia spaţială Conformaţia (forma moleculei) Proprietăţile moleculei!!! Substratul moilecular al tuturor structurilor, fucţiilor şi însuşirilor organisnului viu Funcţiile moleculei 99 17