ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ «Ο ρόλος του Υπεροξειδίου του Υδρογόνου κι της ρίζς του Σουπεροξειδίου στην σκληρωτική διφοροποίηση των μυκήτων» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ιωάννης Ππποστόλου ΠΑΤΡΑ, 27

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η προύσ διδκτορική διτριβή διεκπεριώθηκε στο εργστήριο Βιοχημείς του τομέ Γενετικής, Βιολογίς κυττάρου κι Ανάπτυξης, του τμήμτος Βιολογίς, του Πνεπιστημίου Πτρών, κτά το χρονικό διάστημ 21-27. Θ ήθελ ν ευχριστήσω τον επιβλέποντ της διτριβής νπληρωτή κθηγητή κ. Χρήστο Γεωργίου, ο οποίος μέσ πο την γάπη του γι την επιστήμη, μου δίδξε την ψύχριμη κι ντικειμενική προσέγγιση κάθε επιστημονικού προβλήμτος. Οι συμβουλές του μέσ πό την νοικτή μετξύ μς συζήτηση, νέδειξν ότι ο τρόπος σκέψης που βσίζετι στη κριτική ικνότητ κι έχει σν φετηρί την σωστή οργάνωση της πληροφορίς είνι πρωτίστης σημσίς στην επιστημονική έρευν. Επίσης, θ ήθελ ν τον ευχριστήσω γι το πλήθος των συμμετοχών μου σε διεθνή κι ελληνικά συνέδρι, κθώς κι σε δημοσιεύσεις διεθνών επιστημονικών περιοδικών. Τέλος, η ρωγή του στην συλλογή της σχετικής επιστημονικής ρθρογρφίς λλά κι στην συγγρφή της διδκτορικής μου διτριβής ήτν πολύ σημντική. Θ ήθελ επίσης, ν ευχριστήσω τον κθηγητή του τμήμτος Βιολογίς του Πνεπιστημίου Πτρών κ. Ζάγκρη Νικόλο, τον κθηγητή του τμήμτος Ιτρικής του Πνεπιστημίου Πτρών κ. Συνετό Διονύσιο, τον κθηγητή του τμήμτος Χημείς του Πνεπιστημίου Πτρών κ. Θεόδωρο Τσεγενίδη, τους νπληρωτές κθηγητές του τμήμτος Βιολογίς του Πνεπιστημίου Πτρών κ. Αγγελή Γεώργιο κι κ. Μτσώκη Νικόλο κι τον λέκτορ του τμήμτος Βιολογίς του Πνεπιστημίου Πτρών κ. Πνγόπουλο Νικόλο, γι την πρόθυμη συμμετοχή τους στη επτμελή εξετστική επιτροπή, κθώς κι γι τις εύστοχες υποδείξεις τους κτά την συγγρφή της διτριβής. Επιπλέον, ευχριστώ τον κθηγητή του τμήμτος Χημείς του Πνεπιστημίου Πτρών κ. Θεόδωρο Τσεγενίδη γι τις συμβουλές του κτά την νάπτυξη της νέ μεθόδου γι τον ποσοτικό προσδιορισμό της ρίζς του σουπεροξειδίου που προυσιάζετι στη διτριβή υτή, κθώς επίσης κι τον νπληρωτή κθηγητή του τμήμτος Βιολογίς του Πνεπιστημίου Πτρών κ. Μτσώκη Νικόλο, τον λέκτορ του Πνεπιστημίου Πτρών κ. Πνγόπουλο Νικόλο κι τον κθηγητή του τμήμτος Ιτρικής του Πνεπιστημίου Πτρών κ. Συνετό Διονύσιο γι την ευγενική προσφορά του πειρμτικού υλικού στο οποίο δοκιμάστηκε η νέ μέθοδος. Δεν θ μπορούσ ν πρβλέψω ν ευχριστήσω τους τρεις πολύ κλούς φίλους κι συνεργάτες Γιώργο Ζερβουδάκη, Νίκο Πτσούκη, κι Ντίνο Γκρίντζλη γι την ευχάριστη διάθεση κι συνεργσί που είχμε κθ όλη τη διάρκει της διτριβής μου. Κτά το διάστημ 22-25 υπήρξ υπότροφος του Ερευνητικού Προγράμμτος Ηράκλειτος του οποίου η οικονομική ενίσχυση ήτν σημντική. Κλείνοντς, θ ήθελ ολόψυχ ν πω έν πολύ μεγάλο ευχριστώ στην οικογένει μου γι την μέριστη κι πολύπλευρη υποστήριξή τους κθ όλη τη διάρκει της διτριβής μου. 2

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γεωργίου Χρήστος Επιβλέπων Συνετός Διονύσιος Μρμάρς Βσίλειος Ανπληρωτής Κθηγητής Τμήμτος Βιολογίς Πνεπιστημίου Πτρών Κθηγητής Τμήμτος Βιολογίς Πνεπιστημίου Πτρών Κθηγητής Τμήμτος Βιολογίς Πνεπιστημίου Πτρών ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Γεωργίου Χρήστος Επιβλέπων Συνετός Διονύσιος Ζάγκρης Νικόλος Τσεγενίδης Θεόδωρος Αγγελής Γεώργιος Μτσώκης Νικόλος Πνγόπουλος Νικόλος Ανπληρωτής Κθηγητής Τμήμτος Βιολογίς Πνεπιστημίου Πτρών Κθηγητής Τμήμτος Ιτρικής Πνεπιστημίου Πτρών Κθηγητής Τμήμτος Βιολογίς Πνεπιστημίου Πτρών Κθηγητής Τμήμτος Χημείς Πνεπιστημίου Πτρών Ανπληρωτής Κθηγητής Τμήμτος Βιολογίς Πνεπιστημίου Πτρών Ανπληρωτής Κθηγητής Τμήμτος Βιολογίς Πνεπιστημίου Πτρών Λέκτορς Τμήμτος Βιολογίς Πνεπιστημίου Πτρών 3

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ACN: Acetonitrile (Ακετονιτρίλιο) BHA: Butylated hydroxyanisole (Βουτυλιωμένη υδροξυνισόλη) CAT: Catalase (Κτλάση) CHP: Cumene hydroperoxide (Υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου) E + : Ethidium (Eθίδιο) EC-SOD: Extracellular superoxide dismutase (Εξωκυτττική δισμουτάση της ρίζς του σουπεροξειδίου) EC-H 2 O 2 : Extracellular hydrogen peroxide (Εξωκυττάριο H 2 O 2 ) EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid (Αιθυλενοδιμινοτετρκετικό οξύ) EndUD: End of undifferentiated state (τελευτί ημέρ πριν το στάδιο SI) DMSO: Dimethyl sulfoxide (Διμεθυλικό σουλφοξείδιο) Η 2 Ο 2 : Hydrogen peroxide (Υπεροξείδιο του υδρογόνου) HRP: Horseradish peroxidase (Υπεροξειδάση των γριορφνίδων) HE: Hydroethidine (Υδροεθίδιο) MDA: Malodialdehyde (Μλονδιλδεΰδη) MetOH: Methanol (Mεθνόλη) MidUD: Middle undifferentiated state (δύο ημέρες πριν το στάδιο SI) NSPX: Non specific peroxidases (Μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες) O 2 - : Superoxide radical (Ρίζ του σουπεροξειδίου) 2-OH-E + : 2-hydroxyethidium (2-υδροξυεθίδιο) PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride (Φινυλομεθυλοσουλφόνυλο φθόριο) PUFAs: Polyunsaturated fatty acids (Πολυκόρεστ λιπρά οξέ) RNS: Reactive nitrogen species (Δρστικές μορφές ζώτου) ROS: Reactive oxygen species (Δρστικές μορφές οξυγόνου) SD: Sclerotial development stage (Στάδιο νάπτυξης των σκληρωτίων) SI: Sclerotial initiation stage (Στάδιο ένρξης πργωγής σκληρωτίων) SM: Sclerotial maturation stage (Στάδιο ωρίμνσης των σκληρωτίων) SOD: Superoxide dismutase (Δισμουτάση της ρίζς του σουπεροξειδίου) TBA: Thiobarbituric acid (Θειοβρβιτουρικό οξύ) TBARS: TBA Reactive Substances (Ενώσεις ντιδρούσες με TBA) UD: Undifferentiated stage (Αδιφοροποίητο στάδιο) ΑΣ: Άγριο στέλεχος (μυκητικό στέλεχος) ΔΜΟ: Δρστικές μορφές οξυγόνου Θ.Δ.: Θερμοκρσί δωμτίου ΜΣ: Μη σκληρωτιογόνο (μυκητικό στέλεχος) ΡΔΟ: Ρυθμιστικό διάλυμ ομογενοποίησης 4

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ H προύσ Διδκτορική Διτριβή στοχεύει στη διερεύνηση της σχέσης του οξειδωτικού στρες με τη διφοροποίηση (σκληρωτική) φυτοπθογόνων μυκηλικών μυκήτων. Συγκεκριμέν, διερευνάτι ο ρόλος του υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) κι της ελεύθερης ρίζς του σουπεροξειδίου (O 2 -), κεντρικών πργόντων πρόκλησης οξειδωτικού στρες, στη βιογένεση των σκληρωτίων, μελετώντς την επγωγή κι την νστολή της κι σε σχέση με τ ντιοξειδωτικά ένζυμ δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD), κτλάση (CAT), μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες (NSPX) κι το οξειδωτικό ένζυμο οξειδάση της ξνθίνης (XO), προυσί ή πουσί νστολέων κι υποστρωμάτων τους. Ο ρόλος του O 2 - στη διφοροποίηση μελετήθηκε μέσω της νάπτυξης μεθόδου ποσοτικοποίησής του, ενώ η σχέση του με τη SOD μελετήθηκε με μόρι μιμητές της κτλυτικής δράσης της. Επίσης, το οξειδωτικό στρες διερευνήθηκε σε σχέση με τη διφοροποίηση κι με τον ρόλο που πίζουν τ υδροϋπεροξείδι των λιπιδίων λλά κι τ λδεϋδικά πράγωγ της περιτέρω οξειδωτικής ποικοδόμησής τους. 5

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Συντομογρφίες 4 Σκοπός της Διτριβής 5 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 9 1. Βιοχημεί του οξειδωτικού στρες 9 1.1. Ορισμός κι χημεί των ελευθέρων ριζών 9 1.2. Δρστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) 9 1.3. Ορισμός του οξειδωτικού στρες 12 1.4. Aντιοξειδωτική άμυν των οργνισμών 16 2. Βιοχημεί της ρίζς του σουπεροξειδίου κι του υπεροξειδίου του 17 υδρογόνου 2.1. Ρίζ του σουπεροξειδίου (O 2 - ) 17 2.2. Υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) 19 2.3. Ένζυμ σχετιζόμεν με O 2 - κι H 2 O 2 2 2.3.1. Δισμουτάση της O 2 - (SOD) 2 2.3.2. Κτλάση (CAT) 23 2.3.3. Μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες (NSPX) 24 2.3.4. Οξειδάση της ξνθίνης (XO) 25 3. Μύκητες κι φυτοπθογόν είδη τους 27 3.1. Χρκτηριστικά κι τξινόμηση των μυκήτων 27 3.2. Περιγρφή των μυκηλικών μυκήτων κι των σκληρωτίων τους 29 3.3. Το φινόμενο της διφοροποίησης στους μύκητες 31 4. Οξειδωτικό στρες κι διφοροποίηση μικροοργνισμών 31 4.1. Συσχέτιση οξειδωτικού στρες κι διφοροποίησης ευκρυωτικών μικροοργνισμών 33 4.2. Πράγοντες που ελέγχουν τη διφοροποίηση μέσω οξειδωτικού στρες 35 4.3. Μετβίβση κυττρικού σήμτος κι σκληρωτιογένεση: Ο ρόλος των δρστικών μορφών 35 οξυγόνου 4.3.1. Υποδοχείς διμεσολβητές/προωθητές των ποκρίσεων στις ΔΜΟ 35 4.3.2. Μόρι σημτοδότες ως στόχοι των ΔΜΟ 36 4.3.3. Διδικσίες μετμόρφωσης ρυθμιζόμενες πό ΔΜΟ 37 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 41 1. Ανάπτυξη νέων μεθόδων 41 1.1. Ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού του O 2 - στους οργνισμούς 41 1.2. Εφρμογή της μεθόδου προσδιορισμού του O 2 - γι την νίχνευση της ΧΟ 47 2. Εφρμογή μεθόδων που υπάρχουν ήδη στη διεθνή βιβλιογρφί 48 2.1. Δειγμτοληψί κι ομογενοποίηση μυκητικών ιστών 48 2.2. Φθορισμομετρικός προσδιορισμός του H 2 O 2 48 2.3. Φωτομετρικός προσδιορισμός των λιπιδικών υδροϋπεροξειδίων (LOOH) 5 2.4. Προσδιορισμός της ειδικής ενεργότητς ενζύμων που σχετίζοντι με O 2 - κι H 2 O 2 52 2.4.1. SOD 52 2.4.2. CAT 54 2.4.3. NSPX 55 2.4.4. XO 56 2.5. Δείκτες οξειδωτικού στρες 58 2.5.1. Φθορισμομετρικός προσδιορισμός των λδεϋδικών πργώγων της υπεροξείδωσης 6

των λιπιδίων (ισοδύνμ MDA) 58 2.6. Ποσοτικοποίηση του κυττρικού πολλπλσισμού (cell proliferation) 59 2.7. Σττιστική νάλυση των ποτελεσμάτων 59 3. Στελέχη μυκήτων, θρεπτικά υλικά κι μέθοδοι κλλιέργεις 6 3.1. Πειρμτικά στελέχη μυκήτων 6 3.2. Θρεπτικά υλικά 61 3.2.1. PDA (Potato-Dextrose-Agar) 61 3.2.2. Joham s Yeast Medium (JYM) 62 3.3. Στάδι νάπτυξης των σκληρωτιογόνων μυκηλικών μυκήτων 63 3.4. Συνθήκες κλλιέργεις των σκληρωτιογόνων μυκηλικών μυκήτων 64 3.4.1. Βσικές συνθήκες κλλιέργεις 64 3.4.2. Χορήγηση ουσιών κτά την νάπτυξη των σκληρωτιογόνων μυκηλικών μυκήτων 64 3.5. Μέτρηση της σκληρωτικής διφοροποίησης 65 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 66 1. Βσικά περιγράμμτ δεικτών οξειδωτικού στρες κι εμπλεκομένων ενζύμων στους μύκητες S. rolfsii, S. sclerotiorum, R. solani κι S. minor 66 1.1. Υπεροξείδι 67 1.1.1. O 2-67 1.1.2. H 2 O 2 69 1.1.3. LOOH 72 1.2. Ένζυμ σχετιζόμεν με O 2 - κι H 2 O 2 74 1.2.1. SOD 74 1.2.2. CAT 77 1.2.3. NSPX 79 1.2.4. XO 81 1.3. Δείκτες οξειδωτικού στρες 83 1.3.1 Ισοδύνμ MDA 83 2. Διερεύνηση του ρόλου των δεικτών οξειδωτικού στρες κι εμπλεκομένων ενζύμων στους μύκητες S. rolfsii, S. sclerotiorum, R. solani κι S. minor με τη χρήση εξωγενώς χορηγούμενων χημικών ενώσεων 85 2.1. Επίδρση χορηγούμενων ουσιών στη διφοροποίηση των μυκήτων 87 2.1.1. Μιμητές του ενζύμου δισμουτάση του O 2-87 2.1.2. H 2 O 2 89 2.1.3. Αμινοτριζόλη 91 2.1.4. Υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου 93 2.2. Επίδρση των χορηγούμενων ουσιών σε δείκτες οξειδωτικού στρες κι στ ένζυμ που σχετίζοντι με O 2 - κι H 2 O 2 95 2.3. Υπεροξείδι 95 2.3.1. O 2-95 2.3.2. H 2 O 2 99 2.3.3. LOOH 12 2.4. Ένζυμ σχετιζόμεν με O 2 - κι H 2 O 2 14 2.4.1. SOD 14 2.4.2. CAT 18 2.4.3. NSPX 11 2.4.4. XO 112 2.5. Δείκτες οξειδωτικού στρες 114 2.5.1 Ισοδύνμ MDA 114 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 116 1. Συσχέτιση O 2 - /H 2 O 2 /SOD/ΧΟ κι διφοροποίηση 117 7

2. Συσχέτιση H 2 O 2 /SOD/CAT/NSPX κι διφοροποίηση 125 3. Συσχέτιση LOOH κι διφοροποίηση 128 4. Τελικά συμπεράσμτ 131 Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 132 Ζ. SUMMARY 134 H. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 135 8

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Βιοχημεί του οξειδωτικού στρες 1.1. Ορισμός κι χημεί των ελευθέρων ριζών Ελεύθερη ρίζ (free radical) είνι κάθε είδος τόμου ή μορίου που μπορεί ν είνι υθύπρκτο κι περιέχει έν ή περισσότερ σύζευκτ ηλεκτρόνι. Ασύζευκτο ηλεκτρόνιο κλείτι υτό που κτλμβάνει μόνο του έν τομικό ή μορικό τροχικό. Οι ελεύθερες ρίζες πριστάνοντι με μί τελεί πάνω κι δεξιά πό το χημικό τύπο του τόμου ή μορίου. Μερικά πρδείγμτ των πιο γνωστών ελευθέρων ριζών ποτελούν: το άτομο του υδρογόνου (H ), η ρίζ του σουπεροξειδίου (O 2 -), η ρίζ υδροξυλίου (OH ), οι υπεροξυλικές ρίζες (RO 2 ), οι λκοξυλικές ρίζες (RO ) κι τ οξείδι του ζώτου (NO κι NO 2 ). Ο σχημτισμός των ελευθέρων ριζών μπορεί ν γίνει με τους εξής τρόπους: 1. Με πώλει ενός ηλεκτρονίου πό έν μόριο ή άτομο: Χ e - + X + 2. Με προσθήκη ενός ηλεκτρονίου πό έν μόριο ή άτομο: Y + e - Y - 3. Με ομολυτική σχάση ομοιοπολικού δεσμού: Α:Β Α + Β Η δρστικότητ των ελευθέρων ριζών εξρτάτι τόσο πό την ελεύθερη ρίζ όσο κι πό το μόριο με το οποίο υτή η ρίζ ντιδρά. Oι ελεύθερες ρίζες μπορούν ν ντιδράσουν με μόρι ή άτομ με διάφορους τρόπους: 1. Μι ελεύθερη ρίζ μπορεί ν συνδεθεί με έν μόριο ή άτομο: Χ +Υ [Χ-Υ] 2. Μι ελεύθερη ρίζ μπορεί ν δράσει σν νγωγικός πράγοντς, πρχωρώντς το σύζευκτό της ηλεκτρόνιο σε έν μόριο ή άτομο: Χ +Υ Χ + + Y - 3. Μι ελεύθερη ρίζ μπορεί ν δράσει σν οξειδωτικός πράγοντς, δεχόμενη έν ηλεκτρόνιο πό έν μόριο ή άτομο: X + Y X - + Y + 4. Μι ελεύθερη ρίζ μπορεί ν ποσπάσει έν άτομο υδρογόνου πό τον νθρκικό σκελετό μις οργνικής ένωσης: >CH + OH >C + H 2 O (Parsons, 2). 1.2. Δρστικές μορφές οξυγόνου Η ζωή στη Γη προυσιάζει μκρόχρονη εξελικτική πορεί, που σύμφων με πολιθώμτ ξεκίνησε πριν περίπου 3,7 δισεκτομμύρι χρόνι, όπως δείχνουν ρκετές έρευνες. Αρχικά σχημτίσθηκν πλές προβιοτικές οργνικές ουσίες κάτω πό συνθήκες υψηλών ενεργειών 9

(θερμότητ πό ηφίστει, ηλεκτρικές εκκενώσεις, υπεριώδεις κτινοβολίες) πό ουσίες όπως μεθάνιο, μμωνί, υδρόθειο, διοξείδιο κι μονοξείδιο του άνθρκ, φορμλδεϋδη, υδροκυάνιο κι υδρτμούς. Το νερό ποτελεί το σημντικότερο πράγοντ της ζωής κι η φθονί του στη Γη ευνόησε τη χημική εξέλιξη κι την επιβίωση των προβιοτικών οργνισμών. Αρκετές ντιδράσεις γι τη σύνθεση πλών μινοξέων (γλυκίνη, λνίνη κλπ.), λδεϋδών, κρβοξυλικών οξέων κι άλλων οργνικών μορίων έγινν μέσω μηχνισμών ελευθέρων ριζών σε υδτικά διλύμτ με ενέργει που προέρχοντν πό θερμές πηγές, κτινοβολίες κι ηλεκτρικές εκκενώσεις. Η προβιοτική υτή «πρωτόγονη σούπ» οργνικών ουσιών πέρσε σημντικές νκττάξεις κι μετμορφώσεις με τη δημιουργί μυκηλίων-μικροσφιριδίων, όπως κι «οργνικών στγονιδίων» ποικίλων οργνικών ουσιών. Ακολούθησν πολυάριθμες κι σύνθετες κτλυτικές δράσεις μετάλλων (κυρίως οξειδονγωγικές), πυριτικών ορυκτών κι των λάτων τους στις όχθες λιμνών, ποτμών κι σε υδτικά συστήμτ που δημιούργησν πιο σύνθετες προβιοτικές οργνικές συσσωρεύεις. Οι προβιοτικοί «οργνισμοί» πρέπει ν είχν πρωτόγονη δομή με πλές μετβολικές ενδογενείς διεργσίες κι υδτοδιλυτή διτροφική επφή με το περιβάλλον. Αρχικά υπήρξν προκρυωτικοί οργνισμοί χωρίς πυρήν που εξελίχθηκν σε ευκρυωτικούς. Τ στάδι υτά είνι σχετικά άγνωστ λόγω της έλλειψης πλιοντολογικών υπολειμμάτων ή πολιθωμάτων. Οι ρχικοί οργνισμοί ζωής πρέπει ν ήτν νερόβιοι λόγω της έλλειψης οξυγόνου κι μπορούσν ν πράγουν πρπροϊόντ όπως σουλφίδι, νιτρώδη κι λκοόλες. Περίπου πριν 2,5 δισεκτομμύρι χρόνι πρέπει ν εμφνίστηκν τ κυνοβκτήρι που πέκτησν εξελικτικά την ικνότητ ν δισπούν το νερό σε υδρογόνο κι οξυγόνο. Το οξυγόνο πελευθερώθηκε στην τμόσφιρ κι έφτσε πριν 1,3 δισεκτομμύρι χρόνι στην τμόσφιρ σε συγκέντρωση 1%. Πολλοί νερόβιοι οργνισμοί εξφνίζοντι κι τη θέση τους κτλμβάνουν περισσότερο πολύπλοκοι κυττρικοί οργνισμοί, με ξεχωριστό πυρήν που περιβάλλετι πό μεμβράνη (ευκρυωτικοί). Ευκρυωτικοί οργνισμοί κι κυνοβκτήρι ρχίζουν ν νπτύσσοντι σε πράσιν τμήμτ φυτών. Ευκρυωτικοί κι προκρυωτικοί οργνισμοί ποκτούν την ικνότητ ν νάγουν το οξυγόνο σε νερό κι ν εξελιχθούν σε πρωτόγον ζωικά είδη. Πολλοί πρωτόγονοι νερόβιοι οργνισμοί επιβίωσν, ενώ οι περισσότεροι εξφνίστηκν με την ύξηση της συγκέντρωσης του O 2 στην τμόσφιρ. Οι σημερινοί νερόβιοι οργνισμοί υποθέτουμε ότι είνι πόγονοι των ρχικών προβιοτικών κι πρωτόγονων σε πλότητ κι δομή βκτηρίων, οι οποίοι με την εξέλιξη προσρμόστηκν στις συνθήκες κι περιορίσθηκν σε περιβάλλον όπου το O 2 δεν διεισδύει σε μεγάλο βθμό. Στο στάδιο υτό πιστεύετι ότι ορισμένοι οργνισμοί πρέπει ν εξελίχθηκν με τη δημιουργί ντιοξειδωτικών μυντικών μηχνισμών γι ν προφυλχθούν πό την τοξικότητ του O 2. Συγχρόνως, πολλοί οργνισμοί πρέπει ν χρησιμοποίησν τους μηχνισμούς υτούς κι γι το μετβολικό τους μετσχημτισμό (ένζυμ όπως οξειδάσες, οξυγενάσες κλπ.). Ότν το επίπεδο της συγκέντρωσης του O 2 έφθσε το 1% (υπολογίζετι πριν 5 εκτομμύρι χρόνι) άρχισε ν σχημτίζετι το πρώτο στρώμ του όζοντος στη στρτόσφιρ που πορρόφησε ικνοποιητικά το τμήμ της βλβερής υπεριώδους κτινοβολίς κι επέτρεψε την έξοδο πό το νερό κι την εμφάνιση των πρώτων ζωντνών οργνισμών στην ξηρά. Με την 1

ύξηση της συγκέντρωσης του O 2 στην τμόσφιρ κι το διλυμένο μέρος του στ νερά, οι οργνισμοί άρχισν ν προσρμόζοντι στη χρήση του γι μετβολικούς μηχνισμούς κι ενέργει λλά συγχρόνως προώθησν τη δημιουργί ενδοκυττρικών ντιοξειδωτικών μηχνισμών γι την προστσί τους πό την τοξικότητά του. Με τον τρόπο υτό δημιουργήθηκν ερόβιοι οργνισμοί που χρησιμοποιούν το O 2 λλά κι προσττεύοντι σε σημντικό βθμό πό τις τοξικές δράσεις. Το φινόμενο υτό ονομάζετι κι «πράδοξο του Οξυγόνου». Ο συνδυσμός ντιοξειδωτικών δράσεων κι μετβολισμού του O 2 με χμηλή τοξικότητ πρέπει ν συνέβλε σε σημντικό βθμό στη μκροβιότητ του νθρώπου κι άλλων ζώων. Η συγκέντρωση O 2 στην τμόσφιρ ήτν κτά περιόδους κι μεγλύτερη λλά τελικά στθεροποιήθηκε στη σημερινή που είνι 21%. Το O 2 είνι διπλή ελεύθερη ρίζ φού έχει δύο σύζευκτ ηλεκτρόνι σε ξεχώριστ τροχικά (Εικ. 1.2.1.). Τ ηλεκτρόνι υτά κτλμβάνουν το κθέν έν διφορετικό μορικό τροχικό κι έχουν στροφορμές (spin) ίδις κτεύθυνσης. Αυτή είνι η βσική (μη διεγερμένη) κτάστση του O 2 (ground-state O 2 ) κι είνι πολύ στθερή. Γι ν οξειδώσει το O 2 έν άλλο άτομο ή μόριο ποσπώντς του δύο ηλεκτρόνι θ πρέπει κι τ δύο υτά ηλεκτρόνι ν έχουν ντίθετη στροφορμή ως προς υτή των σύζευκτων ηλεκτρονίων του Ο 2. Η προϋπόθεση υτή εξηγεί γιτί το Ο 2 δεν ντιδρά πευθείς με μόρι που δεν είνι ελεύθερες ρίζες. Πρόλ υτά είνι εφικτός ο σχημτισμός δρστικότερων μορφών Ο 2 με τους εξής δύο τρόπους: ) Το Ο 2 πό τη βσική του κτάστση μπορεί ν μετπέσει στη διεγερμένη κτάστση του μονήρους οξυγόνου (singlet oxygen) με πρόσληψη ενέργεις. Στο πρώτο στάδιο (ενδιάμεση μορφή μονήρους οξυγόνου, 1 Σg + O 2 ), τ δύο σύζευκτ ηλεκτρόνι ποκτούν ντίθετη στροφορμή λόγω της πορροφούμενης ενέργεις. Στη δεύτερη φάση σχημτίζετι η τελική μορφή μονήρους οξυγόνου ( 1 ΔgO 2 ) φού τ δύο σύζευκτ ηλεκτρόνι με τις ντίθετες στροφορμές κι την κτάλληλη ενέργει κτλήξουν στο ίδιο τροχικό. Γι τη μετάπτωση του Ο 2 πό τη βσική στη μονήρη κτάστση πιτείτι η ποδιέγερση ενός μορίου, το οποίο είχε προηγουμένως διεγερθεί με την πορρόφηση φωτεινής κτινοβολίς (ντίδρση φωτοευισθητοποίησης). β) Το Ο 2 πό τη βσική του κτάστση μπορεί ν μεττρπεί σε O 2 - με προσθήκη ενός ηλεκτρονίου (νγωγή του μορικού οξυγόνου). Προσθήκη ενός κόμη ηλεκτρονίου στο O 2 - δίνει 2-2- O 2 ή Η2 Ο 2 (πρωτονιομένη μορφή του O 2 ). Τέλος, προσθήκη δύο κόμη ηλεκτρονίων κτλήγει στο σχημτισμό O 2- ή σε 2Η 2 Ο (πρωτονιομένη μορφή του O 2- ). Με τον όρο δρστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ) εννοούμε τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (π.χ. O 2 -, OH, RO 2, RO ), κθώς κι όλ τ πράγωγ του οξυγόνου που δεν είνι ελεύθερες ρίζες (π.χ. 1 2 ΔgO 2, Ο - 2, O 3, ONOO - ) κι προκύπτουν δευτερογενώς κτά τις διάφορες χημικές ντιδράσεις με στοιχεί του κυττρικού περιβάλλοντος. Οι ΔΜΟ συμμετέχουν ενεργά σε διάφορες ενζυμικές κι μη ενζυμικές διεργσίες. Οι ερόβιοι οργνισμοί λοιπόν πό τη μι μεριά χρειάζοντι τις ΔΜΟ γενικά γι τις φυσιολογικές τους λειτουργίες, λλά κι τους ντιοξειδωτικούς 11

προσττευτικούς μηχνισμούς γι την εξισορρόπηση της κτάστσης (Halliwell and Gutteridge, 1999). Εικ. 1.2.1. Ηλεκτρονική κτνομή του μορικού οξυγόνου βσικής κτάστσης κι των πργώγων του (Halliwell and Gutteridge, 1999). 1.3. Ορισμός του Οξειδωτικού στρες Ο όρος «οξειδωτικό στρες» νφέρετι στην ειδική κτάστση που βρίσκοντι τ κύττρ ενός ιστού ότν ντρέπετι η ισορροπί μετξύ οξειδωτών κι ντιοξειδωτών προς όφελος των πρώτων. Οι κυριότερες βλάβες πό τις ΔΜΟ σε βιολογικούς οργνισμούς είνι: () η υπεροξείδωση των λιπιδίων (β) οι οξειδωτικές βλάβες στη δομή των πρωτεϊνών κι (γ) οι οξειδωτικές βλάβες στο DNA. () η υπεροξείδωση λιπιδίων. οι ερόβιοι οργνισμοί περιέχουν σημντικές ποσότητες πολυκόρεστων λιπρών οξέων (PUFAs) που είνι βσικά συσττικά των μεμβρνών κι προσφέρουν στη δομή τους υψηλή ευκμψί κι ρευστότητ. Το γεγονός υτό προσδίδει στ κύττρ εξιρετικές ιδιότητες που πιτούντι γι το συνεχές ενλλσσόμενο περιβάλλον των μεμβρνών. Αλλά τ PUFAs είνι συγχρόνως πολύ ευάλωτ σε οξειδωτικές δράσεις ελευθέρων ριζών, ιδιίτερ σε υπεροξειδώσεις. Πρά την προυσί στ PUFAs ντιοξειδωτικών λιποδιλυτών ουσιών κι ενζύμων που δρουν μυντικά σε περιπτώσεις υπεροξειδώσεων, οι ΔΜΟ προκλούν την εξάντλησή τους. Οι κυττρικές μεμβράνες των ερόβιων οργνισμών ποτελούντι κτά 4-5% πό λιπίδι, ενώ το υπόλοιπο ποσοστό είνι πρωτεΐνες. Το λιπιδικό τμήμ ποτελείτι πό λιπίδι που σχημτίζουν δύο στρώμτ διμορικών φύλλων, που κλείτι διπλοστοιβάδ. Το εσωτερικό τμήμ της διπλοστοιβάδς είνι υδρόφοβο κι το εξωτερικό υδρόφιλο. Η λιπιδική διπλοστοιβάδ ποτελεί φργμό στη ροή πολικών μορίων, ενώ οι πρωτεΐνες λειτουργούν ως ντλίες, πύλες, υποδοχείς, μεττροπείς ενέργεις κι ένζυμ. Οι λληλεπιδράσεις μετξύ των λιπιδικών στοιβάδων είνι ρκετά σύνθετες λλά σχημτίζοντι με τρόπο που ν μη διτράσετι η κυττρική λειτουργί. Τ PUFAs μετβολίζοντι φυσιολογικά στην εσωτερική 12

μεμβράνη των κυττρικών μιτοχονδρίων σε μονάδες του κετυλο-συνενζύμου Α μέσω ενζυμικής διεργσίς, η οποί είνι μεγάλης σημσίς γι τους ερόβιους οργνισμούς κι κλείτι β- οξείδωση (beta oxidation). Συγχρόνως στις κυττρικές μεμβράνες συμβίνουν κι μη ρυθμιζόμενες διεργσίες ελευθέρων ριζών που οξειδώνουν κι δισπούν τ PUFAs. Τ στάδι της διεργσίς υτής ξεκινούν ρχικά με τη δράση ριζών υδροξυλίου (OH ) που προσβάλλουν τη μεθυλενική ομάδ των PUFAs, που βρίσκετι μετξύ δύο διπλών δεσμών. Οι διπλοί δεσμοί δρουν ως δότες ηλεκτρονίων, ελκύουν την OH στο σημείο της λυσίδς με το -CH 2 -, ποσπώντς έν υδρογόνο κι σχημτίζοντς νέ ελεύθερη ρίζ, -CH 2 -. Στο σημείο υτό της λυσίδς γίνετι μετάθεση ενός διπλού δεσμού σχημτίζοντς έν συζυγικό διένιο με χμηλότερη εντροπί πό την ρχική ελεύθερη ρίζ των PUFAs. Στο επόμενο στάδιο έν μόριο οξυγόνου ντιδρά κι σχημτίζει τη ρίζ του λιπιδικού υπεροξειδίου (LOO ). Οι ντιδράσεις της λιπιδικής υπεροξείδωσης συνεχίζοντι με την λυσιδωτή ντίδρση των δρστικών λιπιδικών υπεροξειδίων που ποσπούν έν υδρογόνο πό νέ λιπίδι με το σχημτισμό υδροϋπεροξειδίων (LOOH). Η πορεί υτή γι έν λιπίδιο που συμβολίζετι ως LH, περιγράφετι πό τις ντιδράσεις 1-3: LH + ΟΗ L + H 2 O (1) L + O 2 LOO (2) LOO + LH L + LOOH (3) Έτσι, ο κύκλος των λιπιδικών υπεροξειδώσεων συνεχίζετι φού η ρίζ L η οποί μπορεί ν ντιδράσει με Ο 2 κι ν δώσει εκ νέου υπεροξυλική ρίζ, που με τη σειρά της μπορεί ν ποσπάσει έν υδρογόνο πό άλλο μόριο PUFAs, συνεχίζοντς έτσι την λυσίδ ντιδράσεων που ξεκίνησε πό την προσβολή ενός ρχικού μορίου PUFAs πό ΟΗ. Στο τελικό στάδιο, τ PUFAs δισπώντι σε διάφορ προϊόντ, όπως κρβονυλικές ενώσεις, λκενάλες κι λκάνι (ιθάνιο, πεντάνιο, κλπ.). Η σημντικότερη πηγή σχημτισμού υπεροξειδίων PUFAs (LOO ) είνι η ενδογενής νπνευστική λυσίδ των εσωτερικών μεμβρνών των μιτοχονδρίων. Η φύση έχει σχεδιάσει τις μιτοχονδρικές εσωτερικές μεμβράνες με τρόπο ώστε ν ντιστέκοντι στην υπεροξείδωση κι στις βλάβες πό ΔΜΟ (Lehninger, 1975). Η ενζυμική υτή διεργσί κτλύετι πό έν σύστημ κυτοχρωμικών ενζύμων με κεντρικό άτομο σιδήρου. Το άτομο υτό του σιδήρου κι άλλων μετλλικών ιόντων σε άλλ ένζυμ (ψευδάργυρος, χλκός, μγγάνιο) είνι βσική βιολογική μονάδ γι τις μετφορές ηλεκτρονίων σε ρκετά υψηλές τχύτητες, ώστε ν διτηρήσουν το φυσιολογικό μετβολισμό στους ερόβιους οργνισμούς. Επειδή τ μετλλικά ιόντ είνι επίσης υπεύθυν γι ντιδράσεις πργωγής ελευθέρων ριζών κι υπεροξειδώσεις, νπόφευκτ οι ερόβιοι οργνισμοί υφίστντι μερικώς τις τοξικές επιδράσεις του είδους υτού του μετβολισμού στο κυττρικό περιβάλλον τους. Οι πιο σημντικοί μηχνισμοί πργωγής ΔΜΟ που υπεισέρχοντι στην υπεροξείδωση λιπιδίων, φορούν ρχικά το σχημτισμό σουπεροξειδίου (O 2 -) πό το οξυγόνο του ερόβιου μετβολισμού κτά τη μετφορά ηλεκτρονίων, κολουθούν η 13

μεττροπή του σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) κι τελικά η διάσπσή του πό μετλλικά ιόντ (M n ) με ντίστοιχη πργωγή της ρίζς υδροξυλίου (ΟΗ ) (Minssen and Munkres, 1973). Η πορεί υτή περιγράφετι πό τις ντιδράσεις 4-6: Ο 2 + e - O 2 - (4) O 2 - + 2H + H 2 O 2 (5) H 2 O 2 + M n ΟΗ + ΟΗ - + M n+1 (6) Η ρίζ ΟΗ προκλεί στη συνέχει τη λιπιδική υπεροξείδωση όπως περιγράφτηκε πρπάνω κι χρησιμοποιείτι συχνά ως δείκτης οξειδωτικού στρες γι την ξιολόγηση διφόρων πθολογικών κτστάσεων (De Zwart et al., 1999; Kaschnitz and Hatefi, 1975; Nowak et al., 21). (β) Οξειδωτικές βλάβες στη δομή των πρωτεϊνών. Πολυάριθμες έρευνες δείχνουν ότι οι ΔΜΟ κι το οξειδωτικό στρες στους βιολογικούς οργνισμούς οδηγεί στην οξείδωση κι λλοίωση των πρωτεϊνών. Οι οξειδωμένες πρωτεΐνες χάνουν τη λειτουργική τους ξί κι με την υδρόλυσή τους κθίστντι επιβλβείς γι τη φυσιολογική λειτουργί του κυττάρου. Οι οξειδωτικές δράσεις ξεκινούν συνήθως με τη ρίζ υδροξυλίου που φιρεί έν υδρογόνο πό τον πολυπεπτιδικό σκελετό δημιουργώντς σε έν μινοξύ μι ρίζ άνθρκ (carbon-centered radical): R R R R R ΟΗ Ο 2 RH -NH-CH-CO-- ---- -NH-C -CO-- ---- -NH-C-CO-- ή -NH-C-CO-- ---- -NH-C-CO-- + R + OO O OOH Όπως συμβίνει κι με τη λιπιδική υπεροξείδωση, έν μόριο οξυγόνου ντιδρά τχύττ με την ρίζ του άνθρκ κι σχημτίζει μι λκυλοϋπεροξυλο- ρίζ, η οποί με τη σειρά της λόγω υψηλής δρστικότητς ποσπά υδρογόνο σχημτίζοντς λκυλοϋπεροξείδιο. Η λυσιδωτή ντίδρση δημιουργεί νέες ρίζες. Στις ντιδράσεις υτές δημιουργούντι ενδιάμεσες λκυλο- (R ), λκυλοϋπεροξυλο- (RΟΟ ) κι λκοξυ- (RΟ ) ρίζες, που υπόκειντι σε πράπλευρες ντιδράσεις με άλλ μινοξέ του ίδιου ή διφορετικού πρωτεϊνικού μορίου. Απουσί οξυγόνου η ρχική ρίζ του άνθρκ μπορεί ν ντιδράσει με άλλη τέτοι ρίζ σχημτίζοντς δισυνδέσεις πρωτεΐνηςπρωτεΐνης. Ο μηχνισμός ελευθέρων ριζών σε πρωτεΐνες κι ο σχημτισμός της λκοξυλο- ρίζς οδηγεί στη σχάση του πεπτιδικού δεσμού είτε μέσω της διμιδικής πορείς είτε μέσω της - μίδωσης. Σημντικό ρόλο στις οξειδώσεις πρωτεϊνών πίζουν κι οι οξειδονγωγικές ντιδράσεις μετάλλων μετάπτωσης με το H 2 O 2 κι άλλων οξειδωτών. Όλ τ μινοξέ των πρωτεϊνών μπορούν ν οξειδωθούν κι τ προϊόντ οξείδωσης έχουν χρκτηρισθεί. Η κυστεΐνη κι η μεθειονίνη, που περιέχουν θείο, είνι πολύ ευίσθητ σε οξειδώσεις μινοξέ, σχημτίζοντς δισουλφίδι κι σουλφοξείδι, ντίστοιχ. Αυτές είνι κι οι μόνες οξειδωτικές λλγές που μπορούν ν επιδιορθωθούν ενζυμικά. Οι ρωμτικοί δκτύλιοι των μινοξέων είνι ένς άλλος στόχος των ΔΜΟ. Η τρυπτοφάνη οξειδώνετι εύκολ σε κυνουρενικά πράγωγ κι υδροξυ- 14

ενώσεις, η φινυλλνίνη κι η τυροσίνη δίνουν υδροξυ-πράγωγ, ενώ η ιστιδίνη μεττρέπετι σε 2-οξο-ιστιδίνη. Το υπεροξυνιτρώδες νιόν (ONOO - προϊόν της ντίδρσης ΝΟ κι O 2 -) δρ ως πράγοντς οξείδωσης κι νίτρωσης των πρωτεϊνών. Η μεθειονίνη κι η κυστεΐνη είνι ιδιίτερ ευίσθητες στην οξείδωση, ενώ η τυροσίνη κι η τρυπτοφάνη υπόκειντι σε νίτρωση. Η νίτρωση της τυροσίνης θεωρείτι πολύ σημντική στους βιολογικούς οργνισμούς γιτί νκόπτει την ικνότητ των πργώγων της τυροσίνης ν λληλομεττρπούν μετξύ φωσφορυλιωμένων κι ποφωσφορυλιωμένων δομών ή μετξύ νουκλεοτιδυλιωμένων κι πλών μορφών. Η νίτρωση επιδρά ρνητικά σε μηχνισμούς κυττρικού μετβολισμού πό κρίσιμ ένζυμ κι στη μετγωγή μηνυμάτων σε ενδοκυττρικά δίκτυ. Η νίτρωση της τυροσίνης είνι μη ντιστρεπτή διεργσί κι κθιστά το ένζυμο νενεργό. Η οξειδωτική διάσπση των πρωτεϊνών οδηγεί είτε στην -μίδωση είτε με την οξείδωση της γλουτμυλο-πλευρικής λυσίδς σε έν πεπτίδιο όπου το Ν-τελικό μινοξύ δεσμεύετι με έν -κετοκυλο-πράγωγο. Οι πρωτεΐνες που περιέχουν λυσίνη, ργινίνη, προλίνη κι θρεονίνη μπορούν ν σχημτίσουν επίσης κρβονυλο- πράγωγ, τ οποί όμως μπορούν ν δημιουργηθούν κι με την ντίδρση λδεϋδών (πό την υπεροξείδωση λιπιδίων) κι με δρστικά κρβονυλικά πράγωγ (κετομίνες, κετολδεΰδες, κλπ.) που είνι το ποτέλεσμ ντιδράσεων νγωγής σκχάρων ή προϊόντ οξείδωσης λυσίνης (ντιδράσεις γλύκωσης κι γλυκοξείδωσης, glycation ή glycoxidation reactions). Η συσσώρευση των οξειδωμένων πρωτεϊνών ή πρωτεϊνών που έχουν υποστεί νίτρωση, κρβονυλίωση κι άλλες βλάβες στη δομή τους, επιτχύνετι κι με τη μείωση της ικνότητς γι πρωτεόλυση. Η πρωτεόλυση διεξάγετι στ ενδοκυττρικά συστήμτ των λυσοσωμτίων (lysosomes) κι του πρωτεσώμτος (proteasome) που περιέχουν ειδικά υδρολυτικά ένζυμ. Είνι μι κρίσιμη φυσιολογική λειτουργί γι την πομάκρυνση οξειδωμένων, λλοιωμένων κι νώμλ διπλωμένων πρωτεϊνών, όπως κι άλλες λειτουργίες (πόπτωση, ενεργοποίηση γονιδικής έκφρσης, επιδιόρθωση DNA, κλπ.) που συμβάλλουν στη ζωτικότητ των κυττάρων (Creighton, 1984; Crews, 23; Levine et al., 1994; Reinheckel et al., 1998). (γ) Οξειδωτικές βλάβες στο DNA. Οι οξειδωτικές κι άλλες βλάβες που συμβίνουν πό ενδογενείς κι εξωγενείς πράγοντες πργωγής ελευθέρων ριζών στ λιπίδι, πρωτεΐνες κι υδτάνθρκες προκλούν κι μεγάλη ποικιλί βλβών στ νουκλεϊκά οξέ. Υπάρχουν διάφορ πειρμτικά ποσοτικά ποτελέσμτ που δείχνουν ότι οι οργνισμοί, νάλογ με το ρυθμό μετβολισμού τους, δέχοντι κθημερινά «χτυπήμτ» ενδογενών οξειδωτικών βλβών στο κυττρικό DNA της τάξης των 5-1, (νά κύττρο την ημέρ) στον άνθρωπο. Οι ντιδράσεις των ΔΜΟ κι των διφόρων τμημάτων του DNA έχουν μελετηθεί σε πειρμτόζω κι τ ποτελέσμτ έδειξν ότι οι βλάβες που συσσωρεύοντι σε μυικά κύττρ, ήπτος κι εγκεφάλου είνι κυρίως: μονόκλωνες θρύσεις (single strand breaks), μονόκλωνες περιοχές (single stranded regions), σχημτισμός του πργώγου 8-υδροξυ-2 -δεοξυγουνοσίνη (8-OHdG) στη νουκλεοβάση δεοξυγουνοσίνη, οξείδωση άλλων νουκλεοβάσεων, μεθυλίωση νουκλεοβάσεων, δισυνδέσεις σε βάσεις, 7-μεθυλογουνίνη κι άλλ πράγωγ. Μελέτες έχουν δείξει ότι η συσσώρευση βλβών στο DNA έχει ως ποτέλεσμ λλγές στη σύνθεση ειδικών mrnas που κωδικοποιούν 15

πρωτεϊνικά προϊόντ γι τους ιστούς των ζώων. Επίσης, πολυάριθμες έρευνες έδειξν ότι υπάρχει ισχυρή συσχέτιση μετξύ των επιδιορθωτικών μηχνισμών των βλβών του DNA των διφόρων ζώων κι της διάρκεις ζωής τους. Ορισμέν σύνδρομ πρώιμης γήρνσης ή κρκινογένεσης που εμφνίζοντι στον άνθρωπο όπως το xeroderma pigmentosum (μετάλλξη σε γονίδι που κωδικοποιούν πρωτεΐνες χρήσιμες γι επιδιόρθωση του DNA σε βλάβες πό υπεριώδη κτινοβολί) κι το σύνδρομο Cockayne (νευροεκφυλιστική σθένει) οφείλοντι σε μετλλάξεις που λλοιώνουν τους επιδιορθωτικούς μηχνισμούς του DNA (Sonntag and Schuchmann, 199; Barbouti et al., 21; Cacciuttolo et al., 1993; Gavrieli et al., 1992; Helbock et al., 1998). 1.4. Aντιοξειδωτική άμυν των οργνισμών Οι ερόβιοι βιολογικοί οργνισμοί δημιουργήθηκν σε τμόσφιρ οξυγόνου κι κτά τη διάρκει της εξελικτικής πορείς νέπτυξν κτάλληλους μηχνισμούς ντιοξειδωτικής προστσίς, οι οποίοι ποτελούντι κυρίως πό ενζυμικές ουσίες κι μικρού μορικού βάρους ντιοξειδωτικές ενώσεις που κυκλοφορούν στ βιολογικά υγρά. Πολλοί βιολογικοί μηχνισμοί που χρησιμοποιούν το οξυγόνο γι μετβολικές κι ενεργεικές διεργσίες προσπθούν ν περιορίσουν τη διρροή Ο 2 ή ΔΜΟ. Στη βιολογί, ντιοξειδωτής θεωρείτι κάθε ουσί που βρίσκετι σε χμηλή συγκέντρωση σε σχέση με κάποιο ευίσθητο στην οξείδωση μόριο, κι κθυστερεί ή ποτρέπει σημντικά την οξείδωση υτού του μορίου. Οι μηχνισμοί της ντιοξειδωτικής άμυνς των βιολογικών οργνισμών μπορούν ν χωριστούν σε τέσσερις κτηγορίες: 1. Ένζυμ που πομκρύνουν τις ΔΜΟ. Στη κτηγορί υτή νήκουν ένζυμ όπως η δισμουτάση του O 2 - (SOD), η κτλάση (CAT), οι υπεροξειδάσες κι ένζυμ που ρυθμίζουν τη θειολική οξειδονγωγική κτάστση του κυττάρου (π.χ. υπεροξειδάση της γλουτθειόνης κι νγωγάση της οξειδωμένης γλουτθειόνης) (Little et al., 197; Wendel, 1981). 2. Πρωτεΐνες που περιορίζουν τη διθεσιμότητ των ιόντων σιδήρου κι χλκού τ οποί είνι προ-οξειδωτές. Οι προ-οξειδωτές είνι μόρι που μπορούν ν οδηγήσουν σε σχημτισμό ελευθέρων ριζών. Γι πράδειγμ, στη κτηγορί υτή νήκουν η τρνσφερίνη (transferin) γι τη δέσμευση ιόντων σιδήρου κι η σερουλοπλσμίνη (caeruloplasmin) γι τη δέσμευση ιόντων χλκού. 3. Πρωτεΐνες, όπως είνι οι θερμοεπγόμενες πρωτεΐνες (heat shock proteins), που προσττεύουν τ βιομόρι πό οξειδωτικές βλάβες με άλλους μηχνισμούς. 4. Μόρι χμηλού μορικού βάρους που ντιδρούν με ΔΜΟ, κι σχημτίζουν προϊόντ που δεν είνι επιβλβή γι τ κύττρ. Στην κτηγορί υτή των εκκθριστών των ΔΜΟ νήκουν γι πράδειγμ η γλουτθειόνη, η -τοκοφερόλη (βιτμίνη Ε), το ουρικό οξύ, το λιποϊκό οξύ κι οι μελνίνες. 16

Αξίζει ν σημειωθεί ότι η διθεσιμότητ των πρπάνω μηχνισμών άμυνς διφέρει τόσο μετξύ των διφόρων ιστών όσο κι μετξύ των διφόρων τύπων κυττάρου. Επιπλέον οι ντιοξειδωτικοί υτοί μηχνισμοί δεν εξσφλίζουν πόλυτη άμυν ενντίον του οξειδωτικού στρες άρ κι ενάντι της οξειδωτικής βλάβης του DNA, των λιπιδίων κι των πρωτεϊνών. Όμως οι οργνισμοί διθέτουν μι επιπλέον γρμμή άμυνς, στο επίπεδο της επιδιόρθωσης των οξειδωτικά τροποποιημένων υτών μκρομορίων. Δύο τέτοι πρδείγμτ είνι οι μηχνισμοί επιδιόρθωσης του DNA πό τις DNA-γλυκοζυλάσες. Εάν δεν υπήρχν κι τέτοιου είδους μηχνισμοί η συνεχής συσσώρευση οξειδωτικών βλβών θ ήτν τόσο ργδί που θ έθετε σε σοβρό κίνδυνο την επιβίωση κθώς κι τη διιώνιση των οργνισμών (Liu et al., 2; Nordberg and Arner, 21). 2. Βιοχημεί των O 2 - κι H2 O 2 2.1. Ρίζ του σουπεροξειδίου (O 2 - ) Το Ο 2 πό τη βσική του κτάστση μεττρέπετι σε O 2 - με προσθήκη ενός ηλεκτρονίου (νγωγή του μορικού οξυγόνου). Το O 2 -, σε σύγκριση με την ΟΗ, είνι ρκετά λιγότερο δρστικό με μόρι που δεν είνι ελεύθερες ρίζες σε υδτικό περιβάλλον. Πρά όλ υτά ντιδρά γρήγορ με άλλ μόρι που είνι ελεύθερες ρίζες όπως το NO, με φινοξυλικές ρίζες (π.χ. που έχουν δημιουργηθεί πό την πώλει ενός Η πό την ΟΗ ομάδ της τυροσίνης, ή κόμη κι με τ σιδηρο-θειούχ κέντρ κάποιων ενζύμων. Η δρστικότητ του O 2 - με μόρι που δεν είνι ελεύθερες ρίζες διφέρει σημντικά νάλογ με το ν το περιβάλλον στο οποίο μελετάτι η δρστικότητά του είνι υδτικό ή οργνικό κι το ph του περιβάλλοντος υτού. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι γι ν πρχθεί το O 2 - στο εργστήριο. Οι κυριότεροι πό υτούς είνι : 1) με ηλεκτροχημική νγωγή του O 2 σε διμέθυλοσουλφοξείδιο ή κετονιτρίλιο, 2) το τετρμεθυλμμωνικό σουπεροξείδιο, (CH 3 )N + O 2 -, μπορεί ν διλυθεί σε διάφορους οργνικούς διλύτες, 3) πό την κύση του κλίου προυσί O 2 το οποίο σχημτίζει το σουπεροξείδιο του κλίου ΚΟ 2. Η ένωση υτή είνι ρκετά ευδιάλυτη σε οργνικούς διλύτες όπως το διμέθυλοσουλφοξείδιο κι το κετονιτρίλιο, 4) με το ενζυμικό σύστημ ξνθίνης ή υποξνθίνης κι οξειδάση της ξνθίνης, κι 5) με την ποικοδόμηση κάποιων ζωτούχων ενώσεων σύμφων με τις πρκάτω ντιδράσεις: X-N=N-Y X + N 2 + Y X (Y ) + O 2 X + (Y + ) + O 2 - Η ργδί κτστροφή του O 2 - σε υδτικό περιβάλλον οφείλετι στην ντίδρση υτοοξειδονγωγής του. Κτά τις ντιδράσεις υτοοξειδονγωγής το ίδιο μόριο υφίσττι κι 17

οξείδωση κι νγωγή. Η ντίδρση υτοοξειδονγωγής του O 2 - πρκάτω ντίδρση: περιγράφετι πό τη O 2 - + O 2 - + 2H + H 2 O 2 + O 2 Πρόλ υτά είνι δύσκολο ν βρεθούν τόσο κοντά ώστε ν ντιδράσουν τέσσερ μόρι (2O 2 - κι 2Η + ) κι η τχύτητ της ντίδρσης υτής είνι πολύ μικρή (.3 Μ -1 s -1 ) σε σχέση με την ντίδρση: HO 2 - + O 2 - + H + H 2 O 2 + O 2 η οποί έχει τχύτητ περίπου 9.7 x 1 7 Μ -1 s -1, ενώ η ντίδρση : HO 2 - + HO 2 - H 2 O 2 + O 2 έχει τχύτητ 8.3 x 1 7 Μ -1 s -1. Γι υτό το λόγο η υτοοξειδονγωγή κάτω πό φυσιολογικές συνθήκες λμβάνει χώρ μετά πό πρωτονίωση του O 2 - κι στη συνέχει κολουθεί η ντίδρση του HO 2 - με του O 2 -. Η υτοοξειδονγωγή είνι πολύ πιο γρήγορη σε όξιν ph όπου γίνετι εύκολ πρωτονίωση του O 2 - κι γίνετι όλο κι πιο ργή σε λκλικά ph. Οποιδήποτε λοιπόν ντίδρση ενός μορίου κι του O 2 - σε υδτικό διάλυμ ντγωνίζετι με την ντίδρση υτοοξειδονγωγής γι το O 2 -. Επίσης, είνι νμενόμενο ότι κάθε υδτικό σύστημ πργωγής O 2 - πράγει κι Η 2 Ο 2, εκτός ν όλο το O 2 - ντιδράσει με κάποιο άλλο μόριο. Το O 2 - σε υδτικό διάλυμ μπορεί ν δράσει σν οξειδωτής, δηλδή σν δέκτης ηλεκτρονίων. Γι πράδειγμ, οξειδώνει το σκορβικό οξύ σύμφων με την ντίδρση: ΑΗ 2 + O 2 - Α + Η 2 Ο 2 Το O 2 - σε υδτικό διάλυμ μπορεί επίσης ν δράσει σν νγωγές, δηλδή σν δότης ηλεκτρονίων. Γι πράδειγμ, νάγει την ίμη του κυτοχρώμτος c σύμφων με την ντίδρση: κυτόχρωμ c (Fe +3 ) + O 2 - O 2 + κυτόχρωμ c (Fe +2 ) κθώς κι την πλστοκυνίνη που περιέχει χλκό κι βρίσκετι στους χλωροπλάστες : πλστοκυνίνη (Cu +2 ) + O 2 - O 2 + πλστοκυνίνη (Cu + ) 18

Η νγωγή του (Fe +3 ) πό το O 2 - μπορεί ν επιτχύνει την ντίδρση κτά Fenton όπως φίνετι κι στις πρκάτω ντιδράσεις: Fe +2 + H 2 O 2 OH + OH - + Fe(III) Fe(III) + O 2 - Fe +2 + O 2 Άθροισμ: H 2 O 2 + O 2 - OH + OH - + O 2 Fe cat Τέλος, το O 2 - σε οργνικούς διλύτες δρ συνήθως μόνο σν οξειδωτής διφόρων ενώσεων όπως το σκορβικό οξύ, η κτεχόλη κι η -τοκοφερόλη. Οι ντιδράσεις του O 2 - με την - τοκοφερόλη φίνοντι πρκάτω: O 2 - + TocH Toc - + HO 2 - HO 2 - + TocH H 2 O 2 + Toc O 2 + Toc - O 2 - + Toc 2Toc διμερή κι άλλ προϊόντ Πρά όλ υτά, σε υδτικό διάλυμ το O 2 - δεν ντιδρά με την -τοκοφερόλη σε σημντική τχύτητ (Fridovich, 1986; Halliwell and Gutteridge, 1999). 2.2. Υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) 2- Το H 2 O 2 είνι η πρωτονιομένη μορφή του O 2 κι είνι έν σχετικά πχύρευστο υγρό χρώμτος νοιχτού μπλε κι με σημείο βρσμού τους 15 o C. Είνι τοξικό γι τ περισσότερ κύττρ σε συγκεντρώσεις πό 1 έως 1 μμ. Ανμιγνύετι πολύ εύκολ με το νερό κι διχέετι εξιρετικά εύκολ νάμεσ κι μέσ στ κύττρ in vivo. Διάφορ ένζυμ που υπάρχουν in vivo όπως η οξειδάση της ξνθίνης, του ουρικού κι των D-μινοξέων μπορούν ν πράγουν H 2 O 2. Επιπλέον, οποιοδήποτε βιολογικό σύστημ πράγει O 2 -, πράγει κι H 2 O 2 μέσω υτοοξειδονγωγής. Το H 2 O 2 είνι γενικά ένς σθενής οξειδωτικός κι νγωγικός πράγοντς κι έχει μικρή δρστικότητ. Γι πράδειγμ κόμ κι σε επίπεδ mμ η επώση του H 2 O 2 με DNA, λιπίδι κι ρκετές πρωτεΐνες δεν έχει σν συνέπει την οξείδωσή τους. Το H 2 O 2 φίνετι όμως ότι είνι ικνό ν δρνοποιήσει κάποι ένζυμ με την οξείδωση που προκλεί στις θειολικές ομάδες (-SH groups) του ενεργού κέντρου. Πρδείγμτ πενεργοποίησης ενζύμων πό το H 2 O 2 είνι υτά της φυδρογονάσης της 3-φωσφορικής-γλυκερλδεΰδης που συμμετέχει στο μονοπάτι της γλυκόλυσης κι της διφωσφτάσης της φρουκτόζης των χλωροπλστών. Το H 2 O 2 μπορεί επίσης ν οξειδώσει συγκεκριμέν κετο-οξέ όπως το πυρουβικό οξύ (CH 3 COCOOΗ) 19

κι το 2-οξογλουτρικό. Πράγμτι, η προσθήκη τέτοιων κετο-οξέων σε θρεπτικά μέσ χρησιμοποιείτι γι την προστσί της κλλιέργεις των κυττάρων πό την τοξική δράση του H 2 O 2. Πρά τη μικρή του δρστικότητ, πό ορισμένες συγκεντρώσεις κι πάνω είνι κυττροτοξικό κι σε υψηλότερες κόμη συγκεντρώσεις χρησιμοποιείτι κι ως ντισηπτικό. Το H 2 O 2 περνάει εύκολ τις κυττρικές μεμβράνες κι μπορεί άμεσ στο εσωτερικό των κυττάρων ν ντιδράσει με ιόντ σιδήρου ή χλκού σχημτίζοντς πολύ δρστικές κι κτστροφικές μορφές οξυγόνου όπως το OH. Συγκεκριμέν, οι υδροξυλικές ρίζες έχει βρεθεί ότι είνι οι ρίζες που προκλούν τις περισσότερες κτστροφές στο DNA κυττάρων τ οποί έχουν επωστεί με H 2 O 2. Επιπρόσθετ, η μεττροπή του H 2 O 2 σε OH μπορεί ν συμβεί με την επίδρση υπεριώδους κτινοβολίς σύμφων με την ντίδρση: H 2 O 2 2OH (ομολυτική σχάση) Το H 2 O 2 μπορεί ν ποικοδομήσει πρωτεΐνες που έχουν ίμη όπως η ιμοσφιρίνη, η μυοσφιρίνη κι το κυτόχρωμ c πελευθερώνοντς ιόντ σιδήρου. Τέλος, σε ενεργοποιημέν ουδετερόφιλ πό H 2 O 2 κι με το ένζυμο μυελοπεροξειδάση (MPO) πράγετι το υποχλωριώδες οξύ (HOCl) σύμφων με την ντίδρση: H 2 O 2 + Cl - HOCl + OH - MPO Το HOCl συγκεντρώνει όλο κι περισσότερο το ενδιφέρον των επιστημόνων λόγω της υψηλής δρστικότητς κι των βλβών που μπορεί ν προκλέσει σε βιομόρι είτε άμεσ είτε μετά πό διάσπση σε χλώριο (Blum and Fridovich, 1983; Aruoma et al., 1989; Halliwell and Gutteridge, 1999). 2.3. Ένζυμ σχετιζόμεν με O 2 - κι H2 O 2 2.3.1. Δισμουτάση του O 2 - (SOD) Η νκάλυψη των ενζύμων της δισμουτάσης του O 2 - κι η ενζυμική τους δράση θεωρείτι ότι είνι μι πό τις πιο σημντικές νκλύψεις της Βιοχημείς. Το 1969 οι Fridovich κι McCord νκοίνωσν ότι η πρωτεϊνική SOD των ερυθροκυττάρων πομκρύνει κτλυτικά το O 2 - (Beauchamp and Fridovich, 1971; Misra and Fridovich, 1972; Marklund, 1976; Hassan and Fridovich, 1977; Misra and Fridovich, 1977). Τ ένζυμ της δισμουτάσης του O 2 - είνι σύμπλοκ πρωτεϊνών με μέτλλ: χλκού-ψευδργύρου SOD (CuZnSOD), μγγνίου SOD (MnSOD) κι σιδήρου SOD (FeSOD). Το O 2 - όπως προνφέρθηκε, έχει μικρότερη δρστικότητ πό την 2

υδροξυλική ρίζ κι γι υτό είνι πιο εκλεκτικό στις βλάβες που προκλεί, ενώ διχέετι σε μεγλύτερη πόστση μέσ στο βιολογικό περιβάλλον όπου πράγετι. Η ντίδρση υτοοξειδονγωγής που κτλύετι πό τη SOD είνι η κόλουθη: O 2 - + O 2 - + 2H + H 2 O 2 + O 2 κι κθώς η SOD υπάρχει σε φθονί σε όλ τ ερόβι κύττρ, διτηρεί τη συγκέντρωση του σουπεροξειδίου σε 1-1 mol -1. Οι δισμουτάσες (CuZnSOD) του O 2 - είνι ένζυμ ρκετά στθερά στη θερμοκρσί, σε προσβολή πό πρωτεάσες κι σε μετουσίωση πό διάφορες ουσίες. Οι διμουτάσες υτές βρίσκοντι σε όλ τ ευκρυωτικά κύττρ, ιδιίτερ στο κυττρόπλσμ, στ λυσοσωμάτι, στον πυρήν κι στο διάστημ μετξύ των μεμβρνών των μιτοχονδρίων. Επίσης, ενώ ρχικά θεωρείτο ότι οι CuZnSOD δεν υπήρχν σε προκρυωτικά κύττρ (βκτήρι κι κυνοβκτήρι), ργότερ βρέθηκε ότι υπήρχν σε ρκετά πό υτά. Η δομή κι η κτλυτική δράση των CuZnSOD που έχουν πομονωθεί πό ευκρυωτικούς οργνισμούς έχουν μελετηθεί συστημτικά. Έχουν σχετικές μάζες, περίπου, 32. D κι περιέχουν δύο υπομονάδες, κθεμί πό τις οποίες έχει μι ενεργό θέση με έν ιόν χλκού κι έν ψευδργύρου. Όλες οι CuZnSODs κτλύουν την ίδι ντίδρση συνένωσης δύο σουπεροξειδίων προς σχημτισμό υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η τχύτητ της ντίδρσης εξρτάτι πό το ph. Τ ιόντ χλκού κτά την ντίδρση δείχνουν ότι υπόκειντι σε ενλλσσόμενη οξείδωση κι νγωγή: ένζυμο-cu +2 + O 2 - ένζυμο-cu + + O 2 κι ένζυμο-cu + + O 2 - + 2H + ένζυμο-cu +2 + Η 2 O 2 Το ιόν ψευδργύρου, (Zn +2 ), δε φίνετι ν έχει κτλυτική δράση λλά βοηθάει στη στθερότητ του ενζύμου. Η δομή των CuZnSOD έχει προσδιορισθεί με υψηλής δικριτικότητς κρυστλλογρφί κτίνων-χ. Επίσης, έχει προσδιορισθεί η ολοκληρωμένη λληλουχί των μινοξέων των CuZnSOD σε ρκετά φυτά κι ζώ κι έχει βρεθεί ότι είνι πρόμοι. Στις CuZnSOD η επιφάνει των υπομονάδων είνι ρνητικά φορτισμένη κι πωθεί το σουπεροξείδιο, ενώ θετικά φορτισμέν σημεί διδρομής οδηγούν στο ενεργό κέντρο όπου γίνετι η κτλυτική δράση. Χημικές μεττροπές που λλάζουν το φορτίο των λυσίδων των μινοξέων μειώνουν τη δρστικότητ του ενζύμου. Έχουν πρσκευσθεί πρλλγές των CuZnSOD στο εργστήριο που κτλύουν τχύτερ τις ντιδράσεις συνένωσης. Χημικές ενώσεις που δρνοποιούν τις CuZnSOD είνι τ κυνιούχ άλτ κι το διθυλοδιθειοκρβμίδιο. Το δεύτερο ενώνετι με το χλκό κι τον πομκρύνει πό την ενεργό θέση του. Έχει βρεθεί ότι υπάρχει επίσης κι εξωκυττρική SOD (EC-SOD), η οποί δρ γι την εξουδετέρωση του O 2 - που έχει ξεφύγει πό την επιφάνει των κυττάρων (Fattman et al., 23). Από τη γνώση που έχει συγκεντρωθεί μέχρι σήμερ γι το σπουδίο ρόλο του ΝΟ ως νευροδιβιβστή κι την τχύτητ ντίδρσης ΝΟ κι O 2 - μπορούμε ν κτλάβουμε το σημντικό ρόλο της εξωκυττρικής SOD. Μετλλάξεις στην κυττροπλσμτική CuZnSOD έχουν συσχετισθεί με την νάπτυξη της μυλοτροφικής πλευρικής 21

σκλήρυνσης. Η άλλη κτηγορί ενζύμων δισμουτάσης του σουπεροξειδίου περιέχει μγγάνιο. Οι MnSODs είνι τόσο ενεργές όσο κι οι CuZnSODs λλά έχουν διφορετική λληλουχί μινοξέων, συνήθως σε διμερή ή τετρμερή μορφή. Περιέχουν έν ιόν Mn(III) νά υπομονάδ κι η δομή τους έχει προσδιορισθεί με κρυστλλογρφί κτίνων-χ. Τ ένζυμ MnSODs είνι διδεδομέν σε βκτήρι, φυτά κι ζώ. Στους ζωικούς ιστούς κι σε ζυμομύκητες οι MnSODs κτλύουν ουσιστικά την ίδι ντίδρση όπως οι CuZnSODs. Οι MnSODs έχουν σχετική μάζ 4. D. Είνι πιο ευίσθητες στην επίδρση χημικών ουσιών όπως το χλωροφόρμιο κι η ιθνόλη, κθώς κι στη θέρμνση. Απομάκρυνση του μγγνίου πό την ενεργό θέση κτστρέφει την κτλυτική δράση κι δεν μπορεί ν ντικτστθεί πό άλλ μετλλικά ιόντ. Οι MnSODs που βρίσκοντι στ μιτοχόνδρι σχετίζοντι ως προς την λληλουχί μινοξέων με το προκρυωτικό ένζυμο. Το γεγονός υτό προυσιάζει εξιρετικό ενδιφέρον, γιτί τ ευκρυωτικά υτά οργνίδι περιέχουν SOD πρόμοι με το προκρυωτικό ένζυμο κι εντελώς διφορετικό πό τη SOD του κυττροπλάσμτος. Το γεγονός υτό υποστηρίζει την ενδοσυμβιωτική προέλευση των μιτοχονδρίων, οργνίδι τ οποί μάλλον εξελίχθηκν πό τη συμβίωση μετξύ ενός πρωτόγονου ευκρυωτικού μιτοχονδρίου με CuZnSOD κι ενός προκρυωτικού με MnSOD κι τ οποί τελικά ενσωμτώθηκν στο ευκρυωτικό κυττρόπλσμ περιτυλιγμέν πό μι μεμβράνη. Μύες που δεν μπορούν ν δημιουργήσουν τη μιτοχονδρική MnSOD δεν ζουν πρά μερικές ημέρες (Grankvist et al., 1981). Η δισμουτάση του σουπεροξειδίου με σίδηρο (FeSOD) βρέθηκε ρχικά στο βκτήριο E.coli, εκτός πό τ άλλ είδη ενζύμων SOD. Αργότερ οι FeSODs βρέθηκν σε άλλ βκτήρι, μύκητες κι νώτερ φυτά. Οι FeSODs περιέχουν συνήθως δύο πρωτεϊνικές υπομονάδες λλά υπάρχουν κι τετρμερή ένζυμ. Στ διμερή ένζυμ περιέχοντι συνήθως έν ή δύο ιόντ σιδήρου νά μόριο ενζύμου. Οι FeSOD νστέλλοντι πό την προυσί κυνιούχων λάτων. Η λληλουχί μινοξέων στις FeSODs είνι πρόμοι με τις MnSODs κι διφορετική πό τις CuZnSODs. Σε μερικά βκτήρι τ ένζυμ σιδήρου μπορούν ν λειτουργήσουν κτλυτικά κι ότν το μέτλλο ντικτστθεί με μγγάνιο. Οι FeSOD δεν έχουν βρεθεί σε ζωικούς ιστούς, λλά μόνο σε βκτήρι κι στους χλωροπλάστες μερικών νώτερων φυτών (De Rosa et al., 1979). Η βιολογική σημσί κι ο ρόλος των SODs γι την ντιμετώπιση της τοξικότητς του O 2 - που πράγετι in vivo, θεωρείτι ότι είνι κρογωνιί στην μυντική προστσί των κυττρικών βιομορίων ζωντνών οργνισμών πό βλβερές οξειδώσεις. Πειράμτ με διγονιδικά ζώ, στ οποί έχουν εφρμοσθεί γονιδικές τεχνικές πομάκρυνσης γονιδίων που εκφράζουν τις SODs, δείχνουν ότι η έλλειψη των ενζύμων MnSODs δημιουργεί κρδικά προβλήμτ, υπερσυσσώρευση λίπους στο ήπρ κι στους μύς κθώς κι θάντο εντός 1 ημερών στ πειρμτόζω. Επίσης, η έλλειψή τους προκλεί βλάβες στ μιτοχόνδρι της κρδιάς (μειωμένη δρστηριότητ δεϋδρογονσών), γεγονός που επισημίνει το σημντικό ρόλο των MnSODs στη φυσιολογική λειτουργί των μιτοχονδρίων. Αντίθετ, ύξηση της έκφρσης γονιδίων γι SODs σε μύες (ενίσχυση της έκφρσης νθρώπινων CuZnSODs σε μύς) περιόρισε την τοξικότητ του O 2, έκνε τ πειρμτόζω νθεκτικότερ σε τοξίνες τυτόχρον με άλλες βελτιώσεις σε διάφορ 22

όργν, λλά συγχρόνως επέφερε κι κάποιες πρενέργειες. Η υπερβολική ή νεξέλεγκτη πργωγή O 2 - σίγουρ επιφέρει οξειδωτικό στρες σε βιολογικούς οργνισμούς, λλά η σημντικότερη πλευρά της κυττροτοξικότητς του O 2 - φίνετι ότι οφείλετι στη πργωγή δευτερευόντων ελευθέρων ριζών κι ΔΜΟ, όπως η υδροξυλική ρίζ, σύμφων με την ντίδρση κτά Haber-Weiss (Yim et al., 199; McCord and Day, 1978). Σε υδτικό διάλυμ η τχύτητ της ντίδρσης υτής είνι σχεδόν μηδενική, ενώ επιτυγχάνετι τχύτερ με την κτλυτική δράση στοιχείων (μετάλλων) μετάπτωσης: Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 + OH + OH - Fe +3 + O 2 - O 2 + Fe +2 Άθροισμ: H 2 O 2 + O 2 - O 2 + OH + OH - (ντίδρση κτά Haber-Weiss) ενώ κι το υπεροξυνιτρώδες νιόν που πράγετι πό την ντίδρση: NO + O 2 - ONOO - είνι επίσης ιδιίτερ τοξικό γι τ κύττρ. Αξίζει ν σημειωθεί ότι όλο κι μεγλύτερο ενδιφέρον συγκεντρώνουν τ μιμητικά μόρι της SOD που είνι συνθετικά μόρι μικρού μορικού βάρους ικνά ν διπερνούν τις κυττρικές μεμβράνες. Πολλά πό υτά ήδη χρησιμοποιούντι ως φάρμκ στην ντιμετώπιση διφόρων πθολογικών κτστάσεων που σχετίζοντι με το οξειδωτικό στρες. Διάφορες κτηγορίες τέτοιων μορίων είνι το Tiron που είνι δεσμευτής του O 2 -, το Tempol που είνι δεσμευτής νιτροξειδίων κι μόρι που περιέχουν κι μέτλλ όπως το CuDIPS, το MnTBAP που μιμούντι την κτλυτική περιοχή των Cu/ZnSOD κι MnSOD ντίστοιχ (Day et al., 1995; Kubota and Yang, 1984; MacKenzie and Martin, 1998; Mok et al., 1998; Gardner et al., 1996; Yamada et al., 23). 2.3.2. Κτλάση (CAT) Η πργωγή H 2 O 2 σε βιολογικούς οργνισμούς είνι ρκετά διδεδομένη κι η δράση του είνι ρκετά οξειδωτική. Το H 2 O 2 πομκρύνετι σε ερόβιους οργνισμούς με τη δράση δύο τύπων ενζύμων: τις κτλάσες κι τις υπεροξειδάσες. Οι κτλάσες δρουν κτλυτικά μέσω της ποσύνθεσής του H 2 O 2 σε οξυγόνο κι νερό: 2H 2 O 2 ------κτλάσες 2H 2 O + O 2 Τ περισσότερ ερόβι κύττρ περιέχουν ενεργό κτλάση. Στ ζώ τ ένζυμ κτλάσης είνι πρόντ στ κυριότερ όργν κι ειδικά στο ήπρ (Sumner and Dounce, 1955; Aronoff, 1965). Στ ερυθροκύττρ η κτλάση προσττεύει πό την οξειδωτική δράση του H 2 O 2 (πό το 23

σουπεροξείδιο) ως ποτέλεσμ της υτοοξείδωσης της ιμοσφιρίνης. Επειδή το H 2 O 2 διχέετι εύκολ, τ ερυθροκύττρ με υτό τον τρόπο προσττεύουν κι άλλους ιστούς πό οξειδωτικές βλάβες, όπως τον εγκέφλο, την κρδιά κι τους μύς του σκελετού που περιέχουν μικρότερες συγκεντρώσεις κτλάσης π ότι το ήπρ. Οι κτλάσες των ζώων ποτελούντι πό πρωτεΐνες με 4 υπομονάδες (κθεμί με μάζ περίπου 6 kd που φέρουν στο ενεργό κέντρο μι σιδηροίμη. Κάθε πρωτεϊνική υπομονάδ έχει έν μόριο NADPH ενωμένο με υτό (Cohen and Somerson 1969; Grankvist et al., 1981; Blum and Fridovich, 1983). Η τρισδιάσττη δομή των ενζύμων κτλάσης έχει προσδιορισθεί με κρυστλλογρφί κτίνων-χ. Η σιδηροίμη της κτλάσης είνι βθιά μέσ στο πρωτεϊνικό υπόβθρο, ώστε μόνο μικρού μορικού βάρους υποστρώμτ ν μπορούν ν πλησιάσουν. Το NADPH είνι ενωμένο σφικτά στην κτλάση κι λειτουργεί γι ν προσλμβάνει τη συσσώρευση νενεργού μορφής Fe(IV). Οι μηχνισμοί με τους οποίους κτλύουν οι κτλάσες το H 2 O 2 είνι πρόμοιοι με των SODs, όπου το έν μόριο νάγετι σε νερό κι το άλλο οξειδώνετι σε O 2 : κτλάση-fe +3 + H 2 O 2 ένωση Ι + H 2 O ένωση Ι + H 2 O 2 κτλάση---fe +3 + H 2 O + O 2 Η κριβής δομή της ένωσης Ι δεν είνι γνωστή. Η δρστικότητ της κτλάσης πρεμποδίζετι πό ζίδι, κυνιούχ άλτ κι HOCl, λλά ένς πιο χρήσιμος νστολές της κτλάσης είνι η μινοτριζόλη, η οποί χρησιμοποιείτι σε πειράμτ in vitro κι in vivo γι τη μέτρηση πργωγής του H 2 O 2. Η δρστικότητ της κτλάσης βρίσκετι στους ιστούς ζώων κι φυτών κι βρίσκετι κυρίως σε υποκυττρικά οργνίδι, όπου δεσμεύετι πό πλές μεμβράνες που είνι γνωστές ως υπεροξεισώμτ (peroxisomes). Τ υπεροξεισώμτ περιέχουν ρκετά κυττρικά ένζυμ που πράγουν H 2 O 2 όπως η γλυκολική οξειδάση, η ουρική οξειδάση κι οι φλβινοπρωτεϊνικές δεϋδρογονάσες (συμμετέχουν στην οξείδωση των λιπρών οξέων). Τ μιτοχόνδρι, οι χλωροπλάστες κι το ενδοπλσμτικό δίκτυο περιέχουν ελάχιστη κτλάση. Στη περίπτωση που έχει σχημτισθεί H 2 O 2 στις περιοχές υτές δεν μπορεί ν ντιμετωπιστεί με κτλάση, εκτός ν υπάρχει διρροή στ υπεροξεισώμτ. Αρκετοί μικροοργνισμοί περιέχουν ένζυμ που κλούντι ψευδοκτλάσες. Οι κτλάσες υτές δισπούν το H 2 O 2 λλά δεν είνι ευίσθητες στ ζίδι ή στ κυνιούχ άλτ κι δεν περιέχουν ίμη (Halliwell and Gutteridge, 1999). 2.3.3. Μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες (NSPX) Υπάρχουν υπεροξειδάσες που χρησιμοποιούν το H 2 O 2 γι ν οξειδώσουν κάποιο οργνικό υπόστρωμ, το οποίο μπορεί ν είνι εξειδικευμένο ή ν νήκει σε ευρύ φάσμ υποστρωμάτων. Στ πρώτ νήκει η υπεροξειδάση του κυτοχρώμτος c, ένζυμο που περιέχει ίμη. Το ένζυμο υτό βρίσκετι νάμεσ στην εσωτερική κι εξωτερική μεμβράνη στ μιτοχόνδρι του ζυμομύκητ κι 24

σε ορισμέν βκτήρι. Κτά την ντίδρση με το H 2 O 2, ο Fe +3 της ίμης οξειδώνετι σε Fe +4, ενώ το νηγμένο κυτόχρωμ c (Fe +2 ) μπορεί ν επνοξειδωθεί σε τρισθενή σίδηρο κι το ένζυμο επνέρχετι στην ρχική του κτάστση. Σε ρκετά βκτήρι περιέχοντι φλβινοπρωτεϊνικές υπεροξειδάσες, οι οποίες χρησιμοποιούν το H 2 O 2 γι ν οξειδώσουν το NADH σε NAD +. Τ φυτά κι τ βκτήρι έχουν υπεροξειδάσες που φέρουν ίμη ώστε ν χρησιμοποιούν το H 2 O 2 στην οξείδωση διφόρων υποστρωμάτων. Ορισμέν μη εξειδικευμέν ένζυμ υπεροξειδσών έχουν βρεθεί κι στ ζώ. Πρδείγμτ είνι η λκτοπεροξειδάση που βρίσκετι στο γάλ κι στο σάλιο γι την ντιμετώπιση βκτηρίων. Η μυελοϋπεροξειδάση (στ φγοκύττρ), η υπεροξειδάση του θυρεοειδή που εξυπηρετεί στην οξείδωση του ιωδιούχου νιόντος (Ι - ) σε μόρι ιωδίου κι προσθήκη του στις ορμόνες του θυρεοειδούς. Η πιο μελετημένη μη εξειδικευμένη υπεροξειδάση είνι η horseradish peroxidase (HRP). Υπάρχουν διάφορες μορφές HRP που περιέχουν υδτάνθρκ κι ιόντ σβεστίου. Οι υπεροξειδάσες HRP οξειδώνουν διάφορες ενώσεις όπως η γουϊκόλη, η πυρογλλόλη, τ ιόντ κυνίου, το NADH, θειόλες, φινόλες κλπ. Οι ντιδράσεις οξείδωσης της HRP κι γι τις άλλες μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες με υπόστρωμ SH 2 είνι: υπεροξειδάση + H 2 O 2 ουσί Ι ουσί Ι + SH 2 SH + ουσί ΙΙ ουσί ΙΙ + SH 2 SH + υπεροξειδάση Οι ρίζες του υποστρώμτος που προκύπτουν (SH ) ντιδρούν μετξύ τους λλά μπορεί ν ντιδράσουν κι με το οξυγόνο νάγοντάς το προς O 2 - το οποίο με την ντίδρση υτοοξειδονγωγής δίνει H 2 O 2. Άλλ είδη μη εξειδικευμένων ενζυμικών υπεροξειδσών που συνντώντι σε βιολογικούς οργνισμούς είνι η λογονοϋπεροξειδάση (μύκητες κι θλάσσιους οργνισμούς). Σε μερικές βρωμοϋπεροξειδάσες πό μύκητες, θλάσσι φύκη κι λειχήνες έχει βρεθεί βνάδιο στο ενεργό κέντρο. Οι χλωροπλάστες κι μερικά κυνοφύκη που δεν περιέχουν κτλάση, υπεροξειδάση της γλουτθειόνης ή υπεροξειδάσες, φέρουν το ρκετά ενεργό ένζυμο σκορβική υπεροξειδάση, το οποίο κτλύει την ντίδρση: σκορβικό μονονιόν + H 2 O 2 2H 2 O + δεϋδροσκορβικό μονονιόν Η δράση του ενζύμου έχει νφερθεί σε ορισμέν πράσιτ, βκτήρι κι στους οφθλμούς των βοειδών (Halliwell and Gutteridge, 1999). 2.3.4. Οξειδάση της ξνθίνης (XO) Η οξειδάση της ξνθίνης (XO) κι η φυδρογονάση της ξνθίνης (XDH) είνι οι δύο μορφές ενός ενζύμου γνωστό ως οξειδονγωγάση της ξνθίνης (XOR). Τ δύο υτά μόλυβδο-ένζυμ περιέχουν φλβοπρωτεΐνες οι οποίες ποτελούντι πό δύο πνομοιότυπες μονάδες των 145 25