سودوموناس آئروژینوسا در استان گیالن

مجله دنیای میکروبها سال دهم شماره اول )پیاپی 03( بهار 6031 صفحات 61-01 چکیده 1 ارزیابی جهش در ژن و مقاومت به ایمی پنم در جدایه های سودوموناس آئروژینوسا در استان گیالن 6* 6 حسین مطهری طشی نجمه رنجی 2 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه زیست شناسی واحد رشت دانشگاه آزاد اسالمی رشت استادیار گروه زیست شناسی واحد رشت دانشگاه آزاد اسالمی رشت. سابقه و هدف: سودوموناس آئروژینوسا یک پاتوژن فرصت طلب گرم منفی و یکی از عوامل مرگ و میر عفونت های بیمارستانی به خصوص در بیماران با سوختگی های شدید می باشد. یکی از مکانیسم های مقاومت دارویی در سودوموناس آئروژینوسا جهش و یا کاهش بیان ژن می باشد. این مطالعه با هدف بررسی جهش های ژن به ایمی پنم در استان گیالن انجام شد. مواد و روش ها: در این مطالعه مقطعی تعداد 54 در جدایه های سودوموناس آئروژینوسا مقاوم سویه سودوموناس آئروژینوسا از نمونه های بالینی از بیمارستان ها و آزمایشگاه های شهر رشت و الهیجان جداسازی گردید. مقاومت و حساسیت سویه ها نسبت به آنتی بیوتیک با روش های کربی باوئر Bauer( )Kirby و حداقل غلظت مهار کنندگی )) تعیین گردید. سپس به منظور ارزیابی جهش در ژن در جدایه های مقاوم به ایمی پنم از روش واکنش زنجیره ای پلی مراز )PCR( و توالی یابی استفاده شد. یافته ها: در این مطالعه در مجموع 5545 درصد جدایه ها مقاوم به ایمی پنم بودند. باالترین میزان مقاومت در غلظت 412 میکروگرم در میلی لیتر ایمی پنم مشاهده گردید. همچنین توالی یابی نشان داد که 4 جدایه دارای جهش های اشتباه K115T و T103S شناسایی شد. بودند. همچنین جهش های خاموش نتیجه گیری: از آنجایی که L92L در 7 نمونه S100S در 7 نمونه P116P در 4 نمونه و G151G در ژن در 3 نمونه در ورود ایمی پنم به سلول نقش دارد بنابراین ایجاد جهش در این ژن می تواند دلیل مقاومت جدایه های سودوموناس آئروژینوسا نسبت به ایمی پنم باشد. همچنین ممکن است جهش در باعث تغییر تمایل به ایمی پنم در برخی از جدایه ها شود. واژگان کلیدی: ایمی پنم ژن واکنش زنجیره ای پلی مراز سودوموناس آئروژینوسا. دریافت مقاله: مهر ماه 54 پذیرش برای چاپ: آذر ماه 54 مقدمه هور و گسترش مقاومت های د میکروبی باعث مشکال درمانی جدی در م ی های بیمارستانی شده که با میزان م رگ و میر باال در افراد آلوده ه م راه اس ت )1(. س ودوم ون اس آئروژینوسا o o r o ی ک ی از ع وام ل *( آدرس برای مکاتبه: رشت دانشگاه آزاد اسالمی واحد رش ت گ روه زیس ت ش ن اس ی. تلفن: 01333525010 پست الکترونیک: n_ranji@iaurasht.ac.ir بیماری زای بیمارستانی است که از طری مکانیسم های ذاتی و نیز کسب عوامل مقاومت می تواند نسبت به عوامل م ت ع دد دمیکروبی ایجاد مقاومت نماید )2(. سودوموناس آئروژینوسا به عنوان یک باکتری گرم منفی و بیماری زای فرصت ط ل ب توانایی زیستن در تمام م ی ها را داشته و عامل بس ی اری از عفونت ها در انسان همچون اندوکاردیت منن یت سپتی سمی و عفونت های مزمن ریه در بیماران سیست ی ک ف ی ب روزی س

می باشد )3(. افزایش شیوع عفونت های بیمارستانی به وسی ل ه سودوموناس آئروژینوسای مقاوم ب ه چ ن د دارو ان ت درمان های مناسب را به شد اب با مشکل مواجه کرده است )2(. اگر چه کارباپنم ها از آنتی بیوتی ک ه ای م و ر در درم ان عفونت های سودوموناس آئروژینوسای مقاوم ب ه چ ن د دارو می باشند اما مقاومت به این گروه از آنتی ب ی وت ی ک ه ا در سرتاسر دنیا در حال گسترش است )5(. تا به امروز 3 مکانیس م مقاومت نسبت به کارباپ ن م ه ا ش ن اس ای ی ش ده اس ت: 1- کاهش جریان کارباپنم ها به دلی ل ت غ ی ی را در ب ی ان پورین های غشای خارجی )( 2- کارباپنمازه ای آزاد شده از باکتری 3- افزایش بیان پم پروت ین های افالکس. کاهش بیان در ایجاد مقاومت نسبت ب ه ای م ی پ ن م در سودوموناس آئروژینوسا نقش دارد. این در ح ال ی اس ت ک ه افزایش بیان پم های افالکس به همراه کاهش ب ی ان باعث مقاومت باالی سودوموناس آئروژینوسا نه تنها به ای م ی پنم بلکه نسبت به مروپنم و دوری پنم نیز می گردد )4(. یکی از مکانیسم های مقاومت به کارباپنم ها در س وی ه ه ای سودوموناس آئروژینوسا جهش و یا وجود عناصر ال اق ی در پروت ین غشای خارجی )r ) می باشد که نتیجه آن ک اه ش بیان یا غیر فعال شدن این پورین است )1(. r یک پ وری ن غشا سیتوپالسمی سودوموناس آئروژینوسا است. در مطالع ا ساختاری مش شده است که حلقه 2 و 3 پروت ی ن r م ل ورود ایمی پنم و همچنین م ل اتصال آن است. بنابرای ن جهش و تغییر در حلقه 2 و 3 می توان د ب اع ث ت غ ی ی را ساختاری و مقاومت باکتری نسبت به کارباپنم ها شود )7(. جهش هایی که سبب غیر فعال شدن r می شوند بی ش ت ر باعث مقاومت به ایمی پنم و به میزان کمتری ب ه م روپ ن م و دوری پنم می گردند )1(. ب رای درم ان ع ف ون ت ه ای سودوموناس آئروژینوسا به نظر می رسد که استفاده از چن دی ن آنتی بیوتیک م رتر باشد )5(. چرا که سویه ها به سرع ت ب ه انواعی از آنها مقاوم می شوند و درمان این گروه از عفونت ه ا را با مشکل مواجه می کنند. برای درمان مناسب و جلوگیری از مرگ و میر افراد با این گروه از عفونت ها به وی ه در سوختگی ها مبتالیان ب ه س رط ان و سیستیک فیبروزیس الزم است اطالعا کامل و ج ام ع ی از مقاومت های آنتی بیوتیکی در جمعیت ت ت درم ان داش ت ه باشیم. با توجه به این که در مناط م تل ها جغرافیایی می زان و نوع جهش های ایجاد کننده مقاومت در عوامل عفونی مت ف او می باشد بنابراین بررسی نوع جهش ه ای م و ر در ای ج اد مقاومت در سودوموناس آئروژینوسا در هر منطقه حائز اهم ی ت می باشد. هدف از این مطالعه شناسایی جهش های ژن به عنوان یکی از عوامل ایجاد کننده مقاومت نس ب ت ب ه ای م ی پنم در نمونه های سودوموناس آئروژینوسا در استان گیالن ب ود. مواد و رو ال ) جم آوری نمونه و شناسایی باکتری: در ای ن م ط ال ع ه مقطعی تعداد 120 جدایه مشکو به سودوموناس آئروژین وس ا در بازه زمانی یک ساله 55-53 از نم ون ه ه ای ب ال ی ن ی از بیمارستان های سوان و سوختگی والیت قائم و رازی ش ه ر رشت همچنین آزمایشگاه های مهر و رازی اله ی ج ان ج م آوری گردید. جدایه ها بر اساس رن آم ی زی گ رم تس ت اکسیداز تولید رنگدانه و رشد در م ی کشت مک ک ان ک ی و رشد در دمای C 52 مورد بررسی قرار گرفتند. ب( سنجش حساسیت آنتی بیوتیکی: برای ارزیابی حساسیت ی ا مقاومت جدایه ها نسبت به آنتی بیوتیک های ایمی پنم ( )10 )10 آمیکاسین ( جنتامایسین ( ( 4( آمپی سیلی ن ( 30( سیپروفل وکس اس ی ن 10( و س ف ت ازی دی م ( )10 i h Me ia( هند( از روش کرب ی ب اوئ ر و م ط اب استاندارد CLSI استفاده شد )10(. پس از 11 انکوباسیون در دمای C دیسک اندازه گیری و نتای آن بت گردید. ) تعیین حداقل غلظت مهار کنندگی رشد 25 ت ا ب ا س اع ت 37 قطر هاله عدم رش د اط راف ه ر (: ب رای ای ن منظور از آنتی بیوتیک های ایمی پنم سیپ روف ل وکس اس ی ن و سفتازیدیم و روش برا دایلوشن م ط اب اس ت ان دارد CLSI استفاده گردید )10(. جدایه های سودوموناس آئروژی ن وس ا م ی کشت مولر هینتون برا ue ab( در کانادا( در غلظت های 27

PCR 25 م تل دارو کشت داده شدند و ب ه م د س اع ت در با طول تقریبی 1512 جفت باز برای تعیین توالی توس Bioneer 37 نگهداری شدند. سپس اولی ن ل ول ه ای ک ه گرم انه C شرکت تکاپو زیست )تهران ای ران( ب ه ش رک ت کدور قابل مشاهده نداشت و به عبارتی ع دم رش د در آن کره جنوبی ارسال گردیدند. نتای حاصل از توالی یابی به کمک CLC ain or bench 3.5 دیده شد به عنوان در نظر گرفته شد. ن رم اف زار و ن رم اف زار د( است را : D جدایه های سودوموناس آئروژی ن وس ا در آنالین بالست ST( )BL از نظر وجود جهش در نمونه ه ای م ی کشت مول ر ه ی ن ت ون ب را کش ت داده ش دن د مقاوم در مقایسه با ن م ون ه اس ت ان دارد م رج )1 P( 37 انک وب ه ش دن د. و به مد 11 تا 25 ساعت در دمای C موجود در سایت CBI مورد بررسی قرار گرفت. T P Genera Geno ic سپس از کیت Puri ication و( آزمون آماری: تجزیه و ت ل ی ل آم اری داده ه ا ب ا )ش رک ت ت وپ ازژن ای ران( ب رای اس ت را است ف اده از نرم افزار و آزمون آماری مرب ک ای انج ام است ف اده ش د. ن م ون ه ه ای اس ت را ش ده گردید. مرز معن ی داری در 0404 قرار داده ش د. در ژل آگاروز 144 درصد م ورد ب ررس ی ق رار گ رف ت ن د. : ه( واک ن ش و ت ع ی ی ن ت وال ی ژن ب رای یا ته ها 120 ای ن م ن ظ ور از پ رای م ره ای ی ب ا ت وال ی ه ای در این مطالعه 54 جدای ه از ج دای ه س ودوم ون اس و آئروژینوسا تش ی داده شد. این نمونه ها شامل 25 ن م ون ه 5 -CGCCG C G G CT GC-3 R استف اده ش د ادرار 15 نمونه سوختگی 1 نمونه ترش ا تنفسی و 1 نمون ه 5 -GTCG TT C GG TCG C G-3 )11 و 12(. واکنش PCR در حجم نهایی 24 با است ف اده از نکروز بافتی بودند. در این بین 21 بیمار )1242 درص د( زن و 17 بیمار )3741 درصد( مرد بودند. م دوده س ن ی ب ی م اران BI R ccupo er کیت PCR PreMi )ش رک ت 20( و 20 ماهه تا 14 سال بود و میانگین س ن ی آن ه ا 4145 کره جنوبی( با افزودن ژنومی جفت پرایمر س ال ) آب استریل به م لول PreMi )حاوی آنزیم کوفاکتور و ب اف ر تعیین گردید. م صوص( انجام شد. واکنش PCR با استفاده از ترموسای ک ل ر نتای حاصل از آزمون تعیین حساسیت این باکتری نسب ت ب ه طب برنامه ذیل انجام ش د: ی ک م رح ل ه شش آنتی بیوتیک به روش کربی باوئر )انتشار از دیس ک( در na ayti ena 55 به مد 4 دقیقه 30 سی ک ل 1 واسرشت شدن ابتدایی در C ج دول نش ان داده ش ده اس ت. در ای ن آزم ون از 54 نمونه مورد بررسی بیشترین میزان مقاومت نسبت به آن ت ی 10 55 به مد 1 دقیقه C به ترتیب در دمای C ب ه م د 72 به مد 144 دقیقه و یک مرحل ه گس ت رش انیه و C بیوتیک های آمپی سیلی ن )100 درص د( و س ف ت ازی دی م 30 72 به مد 7 دقیقه )13(. م ص وال )10 درصد( بود. همچنین کم ت ری ن م ی زان م ق اوم ت در نهایی در دمای C نام سوختگی جدول 1: ادرار ارزیابی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های سودوموناس آئروژینوزا بر اساس روش.CLSI نکروز با تی ادرار تعداد نمونه های حساس )درصد( تعداد نمونه های نیمه حساس )درصد( تعداد نمونه های مقاوم )درصد( ترشحات تنفسی سوختگی ترشحات تنفسی نکروز با تی سوختگی ادرار ترشحات تنفسی نکروز با تی سیپرو لوکساسین 145( 5 ) 21 5147( ) 2 545( ) - 1 242( ) 2 545( ) - - 5 20( ) - 5 145( ) 242(1 ) آمیکاسین 147( 3 ) 21 5147( ) 4 1141( ) 1 242( ) - - - - 11 2545( ) 3 147( ) 1 242( ) - ایمی پنم 545( 2 ) 11 50( ) 2 545( ) - 1 242( ) 2 545( ) - - 11 2545( ) 5 145( ) 5 145( ) 242(1 ) سفتازیدیم 242( 1 ) 1 242( ) - - - 4 1141( ) 1 242( ) - 13 2145( ) 5 20( ) 4 1141( ) 242(1 ) جنتامایسین 147( 3 ) 15 3141( ) 3 147( ) - 3 147( ) 1 242( ) - - 1 1741( ) 5 20( ) 3 147( ) 242(1 ) آمپی سیلین - - - - - - - - 15 3141( ) 25 4343( ) 1 1343( ) 242(1 ) 28

نمودار 1: میزان در نمونه های سودوموناس آئروژینوسای مقاوم به سیپروفلوکساسین ایمی پنم و سفتازیدیم. آنتی بیوتیک های سیپروفلوکساسین )3141 درصد( آمیکاس ی ن )3141 درصد( جنتامایسین )5545 درص د( و ای م ی پ ن م )5545 درصد( مشاهده گردید. نتای نشان داد که ت ع داد 17 نمونه )3747 درصد( مقاوم به سیپروفلوکساسین و 20 نمون ه )54 درصد( مقاوم به ایمی پنم و 27 نمونه )10 درصد( مق اوم به سفتازیدیم بودند. در این مطالعه باالترین میزان مقاوم ت ب ه ایمی پ ن م 412 1 سیپروفلوکساسین 1025 و ک م ت ری ن م ی زان آن تعیین شد. باالتری ن م ی زان م ق اوم ت ب ه 32 سفتازیدیم 15 و کمتری ن م ی زان آن گزارش گردید. باالترین میزان مقاوم ت ب ه 1025 و ک م ت ری ن م ی زان آن تعیین شد )نمودار 1(. در 1543 درص د از نمونه ها مقاومت به ایمی پن م ب ا 121 741 درصد مقاومت با 1 گزارش شد. و در در حالی که در 3447 درصد موارد مقاومت به سفت ازی دی م ب ا بود. اما 1025 و در 741 درصد موارد 15 سیپروفلوکساسین در 2145 درصد از نم ون ه ه ا 1025 و در 2141 درص د از ن م ون ه ه ا 32 بود. به منظور بررسی مولکولی مقاومت به ایمی پنم ژن در نمونه های جدا شده با روش PCR تک یر گ ردی د )شکل 1(. پس از توالی یابی مش گردید که از م ج م وع 20 نمونه پن نمونه دارای جهش T103S 103 آمینو اسید ترئونین به س ری ن بودند که در ک دون CC Thr) GC Ser) تبدیل شده بود. در ا ر جهش اشتباه تغییر C به G در باز شم اره 301 این ژن ر داده بود )شکل 2(. همچنین هر دارای جهش اشتباه اسید لیزین به ترئونین بود. دلیل آن تغییر باز 4 K115T ن م ون ه نیز بودند که در کدون 114 آمی ن و G Lys) CG Thr) به G در باز شم اره تب دی ل ش ده 355 )شکل 3(. همچنین جهش های خاموشL92L در 7 S100S شناسایی شد. شکل 1: در 7 نمونه P116P در 4 نمونه و G151G ژن ب ود ن م ون ه در 3 نمونه نتای الکتروفورز حاصل از تک یر ژن با روش.PCR ستون 1( مارکر 100 جفت بازی بقیه ستون ها( قطعا با طول مربوط به تک یر ژن در جدایه های مورد مطالعه. 1512 ج ف ت ب از 29

شکل 2: الکتروفروگرام مربوط به تغییر باز به باز :G با تغییر Ser) CC Thr) GC و تغییر آمینواسیدی T103S در ژن. C در موقعیت شماره 301 شکل 3 الکتروفروگرام مربوط به تغییر باز در موقعیت شماره 355 به باز :G با تغییر Thr) G Lys) CG و تغییر آمینواسیدی K115T در ژن بح سودوموناس آئروژینوس ا ب ه دل ی ل م ق اوم ت ب ه ان واع آنتی بیوتیک ها یک باکتری بیماری زای بیم ارس ت ان ی م ه م م سوب می شود. از مکانیسم های مقاومت این باکتری نسب ت به انواع م تل آنتی بیوتیک ها می توان به نف وذپ ذی ری ک م غشا کسب آنزیم های تغییر دهنده ساختار آنتی بیوتیک جهش در آنزیم های هدف آنتی بی وت ی ک ه ا و اف زای ش ب ی ان پم های افالکس چند دارویی اشاره نمود )15(. با توجه به سرعت باالی این باکتری ب ی م اری زا در کس ب مقاومت از طری انتقال افقی و یا جهش های ژنی الزم اس ت روش های مناسبی در راس ت ای ش ن اس ای ی ان واع م ق اوم در بیمارستان ها مورد استفاده قرار داد تا با انت اب داروه ای جایگزین مناسب درمان افراد مبتال با موفقیت بیشتری ه م راه باشد. در این مطالعه از مجموع 54 جدایه سودوموناس آئروژی ن وس ا جداسازی شده از مراکز درمانی و تش یصی شهرهای رشت و الهیجان 20 جدایه مقاوم به ایمی پنم بودند. با روش ت وال ی یابی مستقیم مش گردید که 4 جدایه دارای ج ه ش ه ای بدمعنی K115T و T103S فا لی i( a e اصفهان از در ژن می باشند. در مطال ع ه ) و همکاران بین سال های 2012 تا 14 جدایه سودوموناس آئروژی ن وس ا 3144 در 2013 درص د نمونه های ادراری 2542 درصد نمونه های ت رش ا ن ای 1041 درصد نمونه های خون 741 درصد نمونه های زخ م و بقیه از نمونه های برونش مای مغزی ن اعی آبس ه و م ای شکمی بود )14(. از در مطالعه حسینی پور Pour( osseini ) و ه م ک اران در سال های 2015 تا 2014 در اهواز از 41 جدایه س ودوم ون اس آئروژینوسا تعداد 11 جدایه از زخم های عفونی 4 ج دای ه از عفونت های تنفسی 7 جدایه از عفونت ادراری 1 جدای ه از زخم بستر و 13 جدایه از سوختگی بود )11(. در مطالعه معمار ar( )Me و همکاران در سال 2014 در تبری ز 2545 741 50 جدایه سودوموناس آئروژینوسا 3141 ) a er) نمونه خون 1741 نمونه ادرار 1145 ن م ون ه زخ م نمون ه ن ای و نمونه صفا بود )17(. در مطالعه ای که ت وس اف ر و همکاران در سال 2014 در مصر انجام ش د از 51 جدایه سودوموناس آئروژینوسا 21 نمونه از زخم 12 نمونه از 30

ادرار 5 نمونه از خل 5 نمونه از خون و 2 نمونه از س واپ گوش جدا شد )11(. در مطالعه حا ر نیز تنوع در مو مطالعا عفونت هم ان ن د دی گ ر مشاهده شد که بیشترین آنها از نمون ه ه ای ادراری جدا گردید. از سوی دیگر در مطالعه س ل ی م ی )i )Sa i و همکاران در سال 2001 در کرمانشاه از 10 جدایه سودومون اس آئروژینوسای مورد بررسی میزان مقاومت آنتی بیوتیکی نسب ت به سفتازیدیم 70 و ایمی پنم 7343 بود )15(. در مطالعه نیکوکار ar( i o ) و همکاران در سال ه ای تا 2011 در گیالن از مجموع 112 بیمار بس ت ری در ب سوختگی 2010 ش 11 جدایه سودوموناس آئروژینوسا به دس ت آم د. میزان مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک های سفت ازی دی م )1141 درصد( سیپروفلوکساسین )1143 درصد( آمیک اس ی ن )1451 درصد( و جنتامایسین )3742 درصد( مشاهده شد )20(. در مطالعه همتی ati( e ) و همکاران در زن ج ان از 120 جدایه سودوموناس آئروژینوسا بیشترین و کم ت ری ن م ی زان مقاومت به ترتیب مربوط به سفوتاکسیم )5343 ) و آمیکاس ی ن )2141 ) گزارش شد )21(. در مقایسه با مط ال ع ه س ل ی م ی )i )Sa i و همکاران به نظر می رسد که مقاومت نسب ت ب ه سفتازیدیم و ایمی پنم در استان گیالن رش د ک م ت ری ط ی سال های اخیر داشته است. همچنین نتای این مطالعه نشان می دهد که مقاومت ب ه ان واع آنتی بیوتیک در این ت قی نسبت به مطالعه فا لی )i a e ) و همکاران دارای نر کمتری بوده است. ب ا ای ن وج ود ن ر مقاومت به سفتازیدیم در سال های اخیر در گ ی الن ب ه ن ر مقاومت به آن در اصفهان در سال های پیش نزدیک بوده است. این نتیجه نیز نشان دهنده نر پایین تر مقاومت نسبت به آنت ی بیوتیک های مورد مطالعه در گیالن است. در مطالعه نیکوکار ar( i o ) و همکاران در استان گیالن تنه ا موارد سوختگی گزارش شده که می تواند درص د م ق اوم ت بیشتری نسبت به دیگر موارد عفونی از این باکتری داشته باش د. همچنین تفاو مطالعه همتی ati( e مقاومت به آنتی بیوتیک ها در مطالعه حا ر ب ا ) و همکاران در زنجان م ی ت وان د نشان دهنده افزایش مقاومت دارویی در سال های اخیر باشد. در ت قیقی که توس معمار ar( )Me و هم ک اران در س ال 2014 در تبریز انجام ش د از 50 ج دای ه س ودوم ون اس آئروژینوسا الگوی مقاومت به روش دیسک دی ف ی وژن ب رای آنتی بیوتیک ایمی پنم 5242 بود )17(. در مطالعه ک ات ائ وک ا )a )Katao و همکاران در 57 سویه سودوموناس آئروژی ن وس ا مقاومت نسبت به ایمی پنم 100 درصد گزارش گردید )22(. در مطالعه راجت )Rajat( و همکاران در سال 2014 در هند از 100 جدایه سودوموناس آئروژینوسا میزان م ق اوم ت آن ت ی بیوتیکی نسبت به ایمی پ ن م سیپروفلوکساسین 55 15 س ف ت ازی دی م 53 بود )23(. در مطالعه لی )Lee( و کو )Ko( در س ال 2012 و ب ر روی 213 جدایه سودوموناس آئروژینوسا جدا شده از 10 بیمارست ان کره جنوبی در 23 درصد نمونه ها مقاومت ب ه ای م ی پ ن م گزارش شد )5(. همچنین در مطالعه نیکوکار ar( i o 2011 ت ا 2010 ه ای ) و همک اران در س ال در گ ی الن م و رت ری ن آنتی بیوتیک ایمی پنم با میزان مقاومت 2343 درص د گ زارش گردید. در حالی که در مطالعه حا ر مقاومت به ای م ی پ ن م 5545 درصد مشاهده شد که مشابه با مطالعه معمار و همک اران در تبریز بود. اما نسبت به مطالعا اصفهان و کرمانشاه و خار از کشور )ژاپن و کره جنوبی( به نظر می رسد که نر مقاوم ت به ایمی پنم در درجه پایین تری قرار دارد. اما نسبت به مطالع ه نیکوکار ar( i o نمونه های سوختگی صور ) و همکاران در گیالن که ت ن ه ا ب ر روی گرفته بود ممکن است اف زای ش مقاومت در مطالعه حا ر نتی ج ه مص رف ب ی روی ه ای ن آنتی بیوتیک در عفونت های با موا بافتی م ت ل ب اش د. قابل توجه است که بیشترین درصد مقاومت به ایمی پنم نیز در نمونه های سوختگی در مطالعه حا ر مشاهده شده است. اوکامپو-سوسا o-sosa( ca ) و همکاران در سال 2012 در اسپانیا وجود انواع جهش را در 10 سویه بتاالکتاماز منفی مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه جهش های اشت ب اه ب ه وی ه P 1 6 G 1 5 R 310 315G T 103 S K 115 T 1 0L 31

1 در 9T شناسایی شد. جهش های اشتب اه T103S K115T سبب تغییر ساختار در فعالیت آن ا ر می گذارد )1(. L6 و L و می شود و ب ر لیو )Liu( و همکاران در سال 2013 برای ن ست ی ن ب ار ب ه بررسی ترکیبی از مکانیسم های مقاومت کارباپنم در جدایه های بالینی سودوموناس آئروژینوسا تولیدکننده بتاالکت ام از وس ی الطی SBLs( جهش منجر به غیرفعال سازی ) پرداختند. آنها ترکیب چند مکانیسم ناش ی از و بی ان ب ی ش از ح د سیستم های افالکس را مکانیسم اصلی مقاومت کرباپنم در میان جدایه های سودوموناس آئروژینوسا ت ول ی دک ن ن ده شناسایی کردند. در این م ط ال ع ه ج ه ش ه ای SBLs 4( نمونه( K115T جمله T103S همچنین در دو نمونه هر دو جهش از )5 نمونه( شن اس ای ی ش د. T103S و K115T گردید )25(. در سال 2014 کیم ( گ زارش )Ki و همکاران در کره جنوبی ع ل ت نفوذپذیری کم داروها را غیرفعال شدن ج ه ش ی در جدایه های سودوموناس آئروژینوسای مقاوم به کارب اپ ن م ه ا گزارش کردند. در نمونه های مورد مطالعه آنها دو نمونه جهش اشتباه T103S K115T در ژن مشاهده شد )1(. در سال 2011 کائو )Kao( و همکاران به بررسی مکانیسم ه ای مقاومت در سویه های سودوموناس آئروژینوسای م ق اوم ب ه ایمی پنم جدا شده از خون در تایوان پرداختند. این م ط ال ع ه نشان داد که تغییر در پروت ین و افزای ش ب ی ان پ م افالکس دلیل اصلی مقاومت به ایمی پنم می باشند. از دی گ ر علل ایجاد مقاومت به ایمی پنم افزایش بیان p وجود ژن های الک ت ام از از ن وع S Cs و IM جدایه های سودوموناس آئروژینوسا در تایوان بود. در این مطالعه در و در 15 جدایه سودوموناس آئروژینوسا جهش ه ا از نوع جایگزینی آمینو اسیدی در ژن به وی ه T103S K115T 12 L 1 0L و 1 5 بود که م دوده برای ایمی پنم 11 تا 241 میکرو گرم بر میلی تر تعیی ن ش د. ب ی ش ت ری ن ف راوان ی م رب وط ب ه 32 میکروگرم بر میلی لیتر گزارش گردید )24(. ب راب ر ب ا در سال 2015 فا لی )i ) a e و همکاران مکانی س م اص ل ی مقاومت به کارباپنم ها را غیرفعال شدن جهشی ژن کردند. جهش های 1 5 و 6G P1 نمونه ها در ژن گزارش گردید )14(. در مطالعه حا ر نیز جهش های 1 9T T103S K115T ذک ر در ب رخ ی در ژن در چندین جدایه مقاوم ر داد. این امر ممکن است ه م ان ن د مطالعا قبلی از علل ایجاد کننده مقاومت به ایمی پنم در ای ن جدایه ها باشد. با توجه به اینکه در مطالعا مانند جهش های وK115T T103S قبلی ت غ ی ی رات ی باعث تغییر در س اخ ت ار پروت ین و در نتیجه تغییر در عملکرد در سلول می ش ود به نظر می رسد این جهش ها بتوانند در ایجاد مقاومت به ایم ی پنم در استان گیالن نقش داشته باشند. شایان یادآوری است که جهش های کدون های 103 می تواند با تغییر در ساختار 114 و L و L6 تغییر در عملکرد پورین و در نتیجه مقاومت به ایمی پنم را به دنبال داشته باشد. اما برای تایید این مساله نیاز به مطالعا آزمایشگاهی وجود دارد. نتیجه گیری بیوانفورمات ی ک ی و آن ال ی ز مطالعه حا ر نشان می دهد که می زان م ق اوم ت ب ه ان واع آنتی بیوتیک ها در جدایه های سودوموناس آئروژینوسا در حال افزایش است. به طوری که مقاومت صددرصدی به آمپی سیلین ناکارآمدی این دارو را در درمان بیان می کند. همچنین درصد باالی مقاومت به جنتامایسین به ع ن وان ی ک داروی تزریقی خطر بی ت یر شدن این دارو را در آینده در پ ی خواهد داشت. از سوی دیگر به دلیل جهش پذیری ب االی ژن و وقوع جهش های تغییر دهن ده س اخ ت ار در جدایه های سودوموناس آئروژینوسا به نظ ر م ی رس د ک ه افزایش مقاومت به ایمی پنم در استان گیالن در حال اف زای ش باشد. از این رو به منظور درم ان م رت ر ع ف ون ت ه ای بیمارستانی الزم است دالیل ایجاد کننده مق اوم ت ب ه ان واع آنتی بیوتیک ها در هر استان شناسایی و داروهای مناسب ت ری جای گزی ن گ ردد. 32

تشکر و دردانی این مقاله ت قیقاتی حاصل پایاننامه دانشجویی کارشناسی ارشد میکروب شناسی میباشد. نویسندگان این مقاله از معاون م ترم پ وهشی و فناوری دانشگاه آزاد اسالمی واحد رشت ریاست و پرسنل بیمارستان های والیت قائم و رازی و نیز آزمایشگاه ه ای مهر و رازی الهیجان آشتیانی و رازی رشت و آقایان غ الم ر ا صفری سب ان درویشی و سعید نادر م مد به دلیل ه م ک اری صمیمانه در اجرای این پ وهش کمال امتنان را دارند. References 1. Kim CH, Kang HY, Kim BR, Jeon H, Lee YC, Lee SH, Lee JC. Mutational inactivation of OprD in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from Korean hospitals. J Microbiol. 2016; 54(1): 44-49. 2. Fang Z-l, Zhang L-y, Huang Y-m, Qing Y, Cao K-y, Tian G-b, Huang X. OprD mutations and inactivation in imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from China. Infect Genet Evol. 2014; 21: 124-128. 3. Dashtizadeh Y, Moattari A, Gorzin AA. Phenotypic and genetically evaluation of the prevalence of efflux pumps and antibiotic resistance in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa among burned patients admitted to Ghotbodin Shirazi Hospital. J Microb World. 2014; 7(2): 118-127. 4. Lee J-Y, Ko KS. OprD mutations and inactivation, expression of efflux pumps and AmpC, and metallo-β-lactamases in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from South Korea. Int J Antimicrob Agents. 2012; 40(2): 168-172. 5. Li H, Luo Y-F, Williams BJ, Blackwell TS, Xie C-M. Structure and function of OprD protein in Pseudomonas aeruginosa: from antibiotic resistance to novel therapies. Int J Med Microbiol. 2012; 302(2): 63-68. 6. Ocampo-Sosa AA, Cabot G, Rodríguez C, Roman E, Tubau F, Macia MD, Moya B, Zamorano L, Suárez C, Peña C, Domínguez MA, Moncalián G, Oliver A, Martínez-Martínez L. Alterations of OprD in carbapenem-intermediate and-susceptible strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from patients with bacteremia in a Spanish multicenter study. Antimicrob Agents Chemother. 2012; 56(4): 1703-1713. 7. Arabestani MR, Rajabpour M, Yousefi Mashouf R, Alikhani MY, Mousavi SM. Correlation between the expression of gene and sensitivity to carbapenems of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from clinical samples using qrt-pcr. Arak Univ Med Sci J 2015; 17(11): 70-79. [In Persian] 8. Motaghi N, Najafipour S. Outer membrane protein D gene in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa and its role in antibiotic resistance. J Fasa Univ Med Sci. 2016; 5(4): 501-507. [In Persian] 9. Tamma PD, Cosgrove SE, Maragakis LL. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clin Microbiol Rev. 2012; 25(3): 450-470. 33

10. Cockerill F, Patel J, Alder J, Bradford P, Dudley M, Eliopoulos G, Hardy D, Hecht D, Hindler J, Powell M, Swenson J, Thomson R, Traczewski M, Turnidge J, Weinstein M, Zimmer B. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-third informational supplement; M100-S23: Clinical & Laboratory Standards Institute; 2013. 11. Rodríguez-Martínez J-M, Poirel L, Nordmann P. Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53 (11): 4783-4788. 12. Cabot G, Ocampo-Sosa AA, Domínguez MA, Gago JF, Juan C, Tubau F, Rodríguez C, Moyà B, Peña C, Martínez-Martínez L, Oliver A. Genetic markers of widespread extensively drug-resistant (XDR) Pseudomonas aeruginosa high-risk clones. Antimicrob. Agents Chemother. 2012: 56(12): 6349-6357. 13. Hakimi F, Ranji N, Faezi Ghasemi M. Mutations in nalc gene in ciprofloxacin resistant strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from hospitals and laboratories of Guilan province in 2014-2015 years. Arak Univ Med Sci J. 2016; 19(7): 12-21. [In Persian] 14. Tohidpour A, Najar Peerayeh S, Najafi S. Detection of DNA gyrase mutation and multidrug efflux pumps hyperactivity in ciprofloxacin resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. J Med Microbiol Infec Dis. 2013; 1(1): 1-7. 15. Fazeli H, Solgi H, Havaei SA, Shokri D, Norouzi Barogh M, Zamani FZ. Carbapenem and fluoroquinolone resistance in multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from Al-Zahra hospital, Isfahan, Iran. J Med Microbiol Infec Dis. 2014; 2(4): 147-152. 16. Hosseini Pour P, Momtaz H, Serajyan AA, Tajbakhsh E. Investigating class I, II and III integrons in multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa isolated from hospital infections in Ahvaz. Int J Med Lab. 2015; 2(3): 168-176. 17. Memar MY, Pormehrali R, Alizadeh N, Ghotaslou R, Bannazadeh Baghi H. Colistin, an option for treatment of multiple drug resistant Pseudomonas aeruginosa. Physiol Pharmacol. 2016; 20(2): 130-136. 18. Zafer MM, Al-Agamy MH, El-Mahallawy HA, Amin MA, Ashour SED. Dissemination of VIM-2 producing Pseudomonas aeruginosa ST233 at tertiary care hospitals in Egypt. BMC Infect Dis. 2015; 15(1): 1-7. 19. Salimi A, Akya A, Haidari E. Prevalence of β-lactamases genes of IMP, SHV and PER in Pseudomonas aeruginosa isolated from hospitals in Kermanshah. J Clin Res Paramedical Sci. 2015; 4(2): 152-159. [In Persian] 20. Nikokar I, Tishayar A, Flakiyan Z, Alijani K, Rehana-Banisaeed S, Hossinpour M. Antibiotic resistance and frequency of class 1 integrons among Pseudomonas aeruginosa, isolated from burn patients in Guilan, Iran. Iran J Microbiol. 2013; 5(1): 36-41. 21. Hemmati F, Soroori Zanjani R, Haghi F, Zeighami H. Determination of antibiotic resistance profile and frequency of Metallo-Beta-Lactamases in Pseudomonas aeruginosa isolates. ZUMS Journal. 2014; 22(93): 77-85. [In Persian] 34

22. Kataoka H, Ida T, Ishii Y, Tateda K, Oguri T, Yoshida A, Okuzumi K, Oishi T, Tsukahara M, Mori SI, Yoneyama A, Araoka H, Mitsuda T, Sumitomo M, Moriya K, Goto M, Nakamori Y, Shibayama A, Ohmagari N, Sato T, Yamaguchi K. Analysis of the influence of drug resistance factors on the efficacy of combinations of antibiotics for multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolated from hospitals located in the suburbs of Kanto area, Japan. J Glob Antimicrob Resist. 2013; 1(2): 91-96. 23. Rajat RM, Patel ND, Pateliya UN, Katara RS. Clinical correlation of Pseudomonas aeruginosa isolated from clinical settings at Civil Hospital, Ahmedabad. Int Arch Integrated Med. 2015; 2(5): 5-9. 24. Liu Y, Li X-Y, Wan L-G, Jiang W-Y, Li F-Q, Yang J-H. Efflux system overexpression and decreased OprD contribute to the carbapenem resistance among extended-spectrum beta-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa isolates from a Chinese university hospital. Microbial Drug Resistance. 2013; 19(6): 463-468. 25. Kao C-Y, Chen S-S, Hung K-H, Wu H-M, Hsueh P-R, Yan J-J, Wu J-J. Overproduction of active efflux pump and variations of OprD dominate in imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolated from patients with bloodstream infections in Taiwan. BMC Microbiol. 2016; 16(107): 1-8. 35

Journal of Microbial World Volume 10, No. 1, April 2017 Study on mutation and imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates in Gilan province Hossein Motahhary Tashi 1, Najmeh Ranji 2 1 M.Sc. student, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Rasht branch, Islamic Azad University, Rasht, Iran. 2 Assistant Professor, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Rasht branch, Islamic Azad University, Rasht, Iran. Abstract Background & Objectives: Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative opportunistic pathogen, and one of the mortality causes of nosocomial infections, specifically in patients with severe burns. One of the drug resistance mechanisms in P. aeruginosa is mutation or down-regulation of gene. In this study, we investigated mutations in imipenem-resistant P. aeruginosa isolates in Gilan province. Materials & Methods: In this sectional study, 45 P. aeruginosa strains were isolated from different clinical samples of Rasht and Lahijan hospitals and laboratories. The antibiotic resistance and susceptibility of the strains were determined by Kirby Bauer and minimum inhibitory concentration () methods. Then, PCR and sequencing were performed to evaluate mutation in imipenem-resistant isolates. Results: 44.4% isolates were imipenem- resistant. The highest resistance was shown to 512 µg/ml of imipenem. Sequencing analysis showed that 5 isolates have T103S and K115T missense mutations in the gene. Furthermore, silencing mutations including L92L were detected in 7 samples, S100S in 7 samples, P116P in 5 samples, and G151G in 3 samples. Conclusion: Since plays, a major role in imipenem entry to the cell, mutation can be the cause of imipenem resistance in P. aeruginosa isolates. Furthermore, the mutation might have changed the affinity to imipenem in these isolates. Keywords: Imipenem, gene, PCR, Pseudomonas aeruginosa. Correspondence to: Najmeh Ranji Tel: +98 1333424080 E-mail: n_ranji@iaurasht.ac.ir ourna o Microbia Wor 201 10 1) 26-36. 36