ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ - ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: «ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ»

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ - ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: «ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ» Επιβλέπων: Αστέριος Σ. Τσιφτσόγλου, Καθηγητής Φαρμακολογίας Α.Π.Θ. ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Μελέτη αλληλεπιδράσεων λευχαιμικών κυττάρων στο μικρο-περιβάλλον του μυελού των οστών: μία in culture μελέτη ΑΘΑΝΑΣΙΑ Σ. ΞΑΝΘΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΦΟΙΤΗΤΡΙΑ Θεσσαλονίκη, Σεπτέμβριος 2010 1

Η συγκεκριμένη Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακολογίας του τομέα Φαρμακογνωσίας Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.), στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών (Κατεύθυνση: Φαρμακολογία και Θεραπευτική ) ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αστέριος Σ. Τσιφτσόγλου, Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμ. Φαρμακευτικής Α.Π.Θ (επιβλέπων) Ιωάννης Σ. Βιζιριανάκης, Αναπλ. Καθηγητής Φαρμακολογίας και Φαρμακογονιδιωματικής, Τμ. Φαρμακευτικής Α.Π.Θ. Λευκοθέα Χ. Παπαδοπούλου, Επίκ. Καθηγήτρια Φαρμακολογίας, Τμ. Φαρμακευτικής Α.Π.Θ. 2

Ευχαριστίες Η παρούσα Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τομέα Φαρμακογνωσίας Φαρμακολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.), στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών της κατεύθυνσης Φαρμακολογία και Θεραπευτική, υπό την επίβλεψη του Καθηγητή Φαρμακολογίας Αστέριου Σ. Τσιφτσόγλου. Σε αυτό το σημείο, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα Καθηγητή μου Αστέριο Σ. Τσιφτσόγλου για ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω τη διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριο Φαρμακολογίας και για τη συνεχή υποστήριξη και ορθή καθοδήγησή του, τόσο στην παρούσα εργασία, όσο και καθ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον Αναπλ. Καθηγητή Ιωάννη Βιζιριανάκη καθώς και την Επίκ. Καθηγήτρια Λευκοθέα Παπαδοπούλου για τις εποικοδομητικές παρατηρήσεις και την ενθάρρυνση που μου προσέφεραν. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στη Dr. Ιωάννα Τριβιάη, που με καθοδήγησε και μου συμπαραστάθηκε αμέριστα στα πρώτα εργαστηριακά μου βήματα, αλλά και καθ όλη τη διάρκεια της ερευνητικής μου δραστηριότητας, μεταδίδοντας τόσο τις γνώσεις όσο και τον ενθουσιασμό της για ουσιαστικό και εις βάθος ερευνητικό έργο. Τέλος, ευχαριστώ όλους τους συναδέλφους και τα μέλη των εργαστηρίων Φαρμακολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής, ιδιαιτέρως τους Dr. Ιωάννη Μπονοβόλια και Βασίλη Κέννη, για το υψηλό επίπεδο συνεργασίας και ανταλλαγής ιδεών σ ένα ευχάριστο και δημιουργικό περιβάλλον εργασίας. Επίσης, ευχαριστώ θερμά τη Dr. Μπακοπούλου Αθηνά για τη διάθεση των MSCs προκειμένου να ολοκληρωθεί η παρούσα εργασία. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για την οικονομική και ψυχολογική υποστήριξη που μου παρείχαν, καθώς και τους φίλους μου, οι οποίοι στάθηκαν δίπλα μου καθ όλη τη διάρκεια αυτής της πορείας. Θεσσαλονίκη, Σεπτέμβριος 2010 3

Πίνακας Περιεχομένων Ευχαριστίες... 3 Συντμήσεις... 6 Περίληψη... 9 Abstract... 11 1 Εισαγωγή... 12 1.1 Αρχέγονα βλαστικά κύτταρα (Stem Cells)... 12 1.2 Αιμοποίηση... 15 1.3 Κυτοκίνες... 19 1.4 Ερυθροποίηση... 21 1.5 Αναπτυξιακοί παράγοντες και σηματοδοτικά μονοπάτια... 25 1.6 Μεταγραφικοί παράγοντες στην ερυθροποίηση... 28 1.7 Μεταγραφικοί συμπαράγοντες στην ερυθροποίηση... 29 1.8 Δείκτες επιφανείας... 30 1.9 Γήρανση (Stem Cells Aging)... 32 1.10 Μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών (Stem Cell Niche)... 33 1.11 Χρόνια μυελογενής λευχαιμία (CML)... 36 1.12 Καρκινικά βλαστικά κύτταρα (Cancer Stem Cells)... 39 1.13 Φωλεές λευχαιμικών βλαστικών κυττάρων (LSCs niches)... 41 1.14 Βλαστικά κύτταρα και προγεννήτορες στη CML... 44 1.15 Διαταραχή σηματοδοτικών μονοπατιών στη χρόνια μυελογενή λευχαιμία... 45 1.16 Αυτοκρινής μηχανισμός ελέγχου των λευχαιμικών κυττάρων και απόπτωση... 48 2 Σκοπός της Μεταπτυχιακής Διπλωματικής Εργασίας... 50 3 Υλικά Μέθοδοι... 52 3.1 Βιολογικά υλικά Κυτταρικές σειρές... 52 3.2 Θρεπτικά υγρά Οροί Αντιβιοτικά... 59 3.3 Προσδιορισμός ρυθμού κυτταρικής ανάπτυξης... 60 3.4 Έλεγχος ζωτικότητας των κυττάρων με χρώση Trypan Blue... 60 4

3.5 Καλλιέργεια κυττάρων σε ημιστερεό υπόστρωμα ανάπτυξης (agar clots clonal assay) 61 3.6 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πηκτή αγαρόζης... 64 3.7 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)... 66 3.8 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription PCR / RT-PCR)... 68 3.9 Απομόνωση ολικού κυτταροπλασματικού RNA... 72 3.10 Φασματοφωτομετρικός ποσοτικός προσδιορισμός RNA... 72 3.11 Χρωματομετρική μέθοδος προσδιορισμού πρωτεινών κατά Bradford... 73 3.12 Ηλεκτροφόρηση πρωτεινών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE)... 74 4 Πειραματικά Αποτελέσματα... 76 4.1 Απομόνωση αναπτυξιακών παραγόντων από τα K-562 ανθρώπιν α ερυθρολευχαιμικά κύτταρα... 76 4.2 Μελέτη της επίδραση του sfcm από Κ-562 κύτταρα σε αποικίες των MEL κυττάρων... 80 4.3 Μελέτη της επίδρασης του sfcm 24h σε MEL κυτταροκαλλιέργειες... 86 4.4 Μελέτη της επίδρασης του sfcm 24h στα WEHI 13VAR κύτταρα... 88 4.5 Μελέτη της επίδρασης του sfcm 24h στα MSCs οδοντικού πολφού... 91 4.6 Μελέτη της έκφρασης των JAK2 και STAT3 γονιδίων σε MEL κύτταρα... 95 4.7 Εκτίμηση της πρωτεϊνικής σύστασης του sfcm 24h από τα K-562 κύτταρα... 104 5 Συμπεράσματα... 105 6 Βιβλιογραφία... 108 5

Συντμήσεις aa: Αμινοξύ (Amino Acid) AML: Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία (Acute Myeloid Leukemia) ASCs: Αρχέγονα Ενήλικα Βλαστικά Κύτταρα (Adult Stem Cells) bp: Ζεύγος βάσεων (Base pairs) BFU: Μονάδα Ανάπτυξης Αποικιών (Burst Forming Unit) Bz: Βενζιδίνη (Benzidine) CFU: Μονάδα Ανάπτυξης Πρόδρομων Ερυθροβλαστών (Colony Forming Unit) CLP: Κοινός Προγεννήτορας Λεμφογενούς Κυτταρικής Σειράς (Common Lymphocyte Progenitor) CM: Μέσο Καλλιέργειας (Condition Medium) CML: Χρόνια Μυελογενής Λευχαιμία (Chronic Myelogenous Leukemia) CMP: Κοινός Προγεννήτορας Μυελογενούς Κυτταρικής Σειράς (Common Myeloid Progenitor) CSCs: Καρκινικά Αρχέγονα Βλαστικά Κύτταρα (Cancer Stem Cells) CSF: Αναπτυξιακός παράγοντας αιμοποίησης (Colony Stimulating Factor) DMEM: Θρεπτικό υγρό (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) DNA: Δεοξυ-ριβονουκλεϊνικό οξύ ddh 2 O: Δις-απεσταγμένο νερό DEPC: Πυροανθρακικός διαιθυλεστέρας DMSO: Διμέθυλο-σουλφοξείδιο (Dimethyl-Sulfoxide) dntp: Τριφωσφορικός εστέρας δεοξυ-ριβονουκλεοζίτη EDTA: Αιθυλενο-διαμινο-τετρα-οξικό οξύ EGF: Επιδερμικός Αυξητικός Παράγοντας (Εpidermal Growth Factor) EGFR: Υποδοχέας Επιδερμικού Αυξητικού Παράγοντα (Εpidermal Growth Factor Receptor) EPO: Ερυθροποιητίνη (Erythropoietin) ESCs: Αρχέγονα εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα (Embryonic Stem Cells) FBS: Ορός εμβρύου μόσχου (Fetal Bovine Serum) FDF: Ταχέως Διαιρούμενο Τμήμα (Fast-Dividing Fraction) FGF: Αυξητικός Παράγοντας Ινοβλαστών (Fibroblast Growth Factor) 6

GFs: Αναπτυξιακοί παράγοντες (Growth Factors) GMP: Προγεννήτορας Κοκκιοκυττάρων Μονοκυττάρων (Granulocyte Monocyte Progenitor) GSCs: Γαμετικά βλαστικά κύτταρα (Germ Line Stem Sells) Hb: Αιμοσφαιρίνη (Hemoglobin) He: Αίμη (Heme) HSCs: Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (Hematopoietic Stem Cells) IC 50 : Συγκέντρωση 50% αναστολής (Inhibition Concentration 50%) IL: Ιντερλευκίνη (Interleukine) IFN: Ιντερφερόνη (Interferone) K-562: Ανθρώπινα Ερυθρολευχαιμικά Κύτταρα (Human Erythroleukemia cells) Kb: Κιλοβάσεις νουκλεοτιδίων (1000 νουκλεοτίδια) LT-HSCs: Μακράς-διάρκειας Αρχέγονα Αιμοποιητικά Κύτταρα (Long-Term Hematopoietic Stem Cells) LSCs: Λευχαιμικά Αρχέγονα Βλαστικά Κύτταρα (Leukemia Stem Cells) MEL: Ερυθρολευχαιμικά Κύτταρα Ποντικού (Murine Erythroleukemia cells) MEP: Προγεννήτορας Μεγακαρυοκυττάρων Ερυθροκυττάρων (Megakaryocyte Erythrocyte Progenitor) MDR: Πολλαπλή Αντίσταση στα Φάρμακα (Multidrug Resistance) MPs: Πολυδύναμοι Προγεννήτορες (Μultipotent Progenitors) mrna: Αγγελιοφόρο Ριβονουκλεϊνικό Οξύ MSCs: Μεσεγχυματικά κύτταρα στρώματος (Mesenchymal Stem Cells) NTFs: Πυρηνικοί Μεταγραφικοί Παράγοντες (Nuclear Transcription Factors) OD 260nm, OD 280nm : Οπτική πυκνότητα στα 260nm, 280nm (Optical Density) PBS: Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (Phosphate Buffer Saline) PDGF: Αναπτυξιακός Παράγοντας Αιμοπεταλίων (Platelet-Derived Growth Factor) PS: Αντιβιοτικό (Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη) RBCs: Ερυθρά αιμοσφαίρια (Red Blood Cells) RNA: Ριβονουκλεϊνικό οξύ rpm: Στροφές ανά λεπτό (Rounds per Minute) RPMI-1640-1640: Θρεπτικό υγρό (Rooswell Park Memorial Institute-1640 Medium) RTK: Υποδοχέας κινάσης τυροσίνης (Receptor Tyrosine Kinase) 7

RT-PCR: Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για προϊόντα αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) SCs: Αρχέγονα βλαστικά ή στελεχιαία κύτταρα (Stem Cells) SCF ή SF: Παράγοντας Βλαστικών Κυττάρων (Stem Cell Factor ή Steel Factor) SDF: Αργά Διαιούρωμενο Τμήμα (Slow-Dividing Fraction) SDF-1: Stromal Derived Factor-1 SDS: Μετα νατρίου άλας του θειϊκού δωδεκυλίου sfcm: Μέσο Καλλιέργειας χωρίς ορό (serum-free Condition Medium) SSCs: Σωματικά βλαστικά κύτταρα (Somatic Stem Cells) ST-HSCs: Μικρής-διάρκειας Αρχέγονα Αιμοποιητικά Κύτταρα (Short-Term Hematopoietic Stem Cells) TAE: Ρυθμιστικό διάλυμα (Tris / Οξικό οξύ / EDTA) Tris: Τρις-(υδροξυ-μεθυλο)-αμινομεθάνιο TGFβ: Transforming Growth Factor-β VEGF: Αναπτυξιακός Παράγοντας των Αγγείων (Vascular Endothelial Growth Factor) UV: Υπεριώδης ακτινοβολία (Ultra-Violet) 8

Περίληψη Η αιμοποίηση είναι η διαδικασία παραγωγής όλων των κυττάρων του αίματος από αρχέγονα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSCs). Η άμεση επαφή των ΗSCs με τα κύτταρα του στρώματος του μυελού των οστών διαδραματίζει πρωτεύοντα ρόλο στη ρύθμιση της αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησής τους. Ειδικές περιοχές, οι «φωλεές» (niches) αποτελούν το διακριτό μικροπεριβάλλον, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση των ΗSCs. Οποιαδήποτε βλάβη στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών μπορεί να οδηγήσει σε αποτυχία της διαδικασίας της αιμοποίησης. Τα καρκινικά κύτταρα δημιουργούν ένα ευνοϊκό μικροπεριβάλλον γύρω τους, βιοσυνθέτοντας και εκκρίνοντας αναπτυξιακούς παράγοντες που τροποποιούν το στρώμα (stroma-modulating growth factors). Το μικροπεριβάλλον επηρρεάζει τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων, αλλά ελάχιστα είναι γνωστά για τις αλλαγές που προκαλούν τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα στο καλοήθες κυτταρικό περιβάλλον. Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία αποτελεί μία πειραματική προσέγγιση στις μεταβολές που προκαλούν τα ανθρώπινα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα στο μικρο-περιβάλλον ανάπτυξής τους. Το γεγονός αυτό οφείλεται κατά βάση στην έκκριση αναπτυξιακών παράγοντων, οι οποίοι επιδρούν τόσο στα ίδια τα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα (αυτοκρινής μηχανισμός δράσης), όσο και στα κύτταρα του περιβάλοντός τους (παρακρινής μηχανισμός δράσης). Παρατηρήθηκε ότι η καλλιέργεια των Κ-562 κυττάρων απουσία ορού, καθιστά τα κύτταρα ικανά να λειτουργήσουν υπό συνθήκες στρες, αναγκάζοντάς τα να εκκρίνουν μεγαλύτερα ποσά αναπτυξιακών παραγόντων ώστε να μπορέσουν να επιβιώσουν. Το υγρό της καλλιέργειας συλλέχθηκε και μελετήθηκε η ικανότητα αύξησης του κλωνογενετικού δυναμικού των MEL κυττάρων σε agar clots, έπειτα από προσθήκη του sfcm. Μελετήθηκε επίσης, η επίδραση του sfcm 24h σε καλλιέργειες άλλων κυττάρων, αιμοποιητικής σειράς (MEL), καθώς και σε κύτταρα στρώματος (MSCs και WEHI). Συμπέρασμα: Το sfcm 24h διαθέτει έναν ισχυρό συνδυασμό αναπτυξιακών παραγόντων που δρα τόσο στα ίδια τα Κ-562 κύτταρα, επιτρέποντάς τους να 9

επιβιώσουν απουσία ορού, όσο και σε άλλες κυτταρικές σειρές. Διαθέτει παράγοντες αυτο-ανανέωσης που προσδίδουν κλωνογενετικό δυναμικό στα λευχαιμικά κύτταρα, ενώ σε συνθήκες αποστέρησης ορού μπορεί να διατηρεί ζωντανούς τους ινοβλάστες, οι οποίοι διαφορετικά δεν μπορούν να επιβιώσουν. Στα MSCs οδοντικού πολφού ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά κατά την ανάπτυξή τους παρουσία ή απουσία του sfcm 24h. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων JAK2 και STAT3. Τα επίπεδα έκφρασης και των δύο γονιδίων είναι σταθερά τόσο στα MEL, όσο και στα WEHI κύτταρα, ανεξαρτήτως της παρουσίας του sfcm 24h στην κυτταροκαλλιέργεια. 10

Abstract Haematopoiesis (or hematopoiesis) is the formation of blood cellular components. All cellular blood components are derived from hematopoietic stem cells (HSCs). For normal HSCs, the fundamental decision process to self-renew or to differentiate is governed by interactions between HSCs and their niche in the bone marrow. Any disorder in the bone marrow microenvironment can result in failure of hemopoiesis. Leukemic cells can modify their microenvironment by producing and secreting stroma-modulating growth factors. The microenvironment influences malignant cell proliferation and metastasis, but little is known about how tumorinduced changes in the microenvironment affect benign cellular ecosystems. The purpose of this study was an experimental approach to the changes that K-562 cells (human erythroleukemia cells) induce to their microenvironment. These changes are due to the secretion of growth factors that act on the same cells (autocrine regulation) but also on the other cells in their environment (paracrine regulation). K-562 cells were cultured under serum free conditions (stress conditions), so that they were forced to secrete greater amounts of growth factors in order to survive. Condition medium (CM) was isolated from K-562 cells and it was then studied whether it could enhance MEL s clonogenetic ability in agar clots. Besides that, we studied whether it could affect the expansion of other cells such as hemopoietic cells (MEL cells) and stromal cells (MSCs and WEHI cells). Conclusion: The sfcm 24h of K-562 cells consists of a powerful combination of growth factors which affect their own expansion, allowing them to survive in serumfree conditions, but can also affect other cell lines. It consists of self-renewal factors that enhance the clonogenetic ability of MEL cells and besides that, they enhance the expansion of MEL cells in suspension cultures. Furthermore, it is able to maintain the fibroblasts alive in serum-free conditions in culture, but it didn t affect the expansion of MSCs of dental pulp. Finally, the expression of JAK2 and STAT3 genes was studied when sfcm 24h was added in the culture, but no differences were detectected in contrast to the control sample. 11

1 Εισαγωγή 1.1 Αρχέγονα βλαστικά κύτταρα (Stem Cells) Τα βλαστικά κύτταρα (Stem Cells SCs) χαρακτηρίζονται από μοναδικές ικανότητες αυτο-ανανέωσης, ωριμάζουν με ακαθόριστο τρόπο και διαφοροποιούνται δίνοντας διαφόρων ειδών κύτταρα και ιστούς. Λόγω αυτών των χαρακτηριστικών τους διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην οργανογένεση κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και στη δημιουργία των ιστών. Υπάρχουν δύο βασικοί τύποι βλαστικών κυττάρων: τα εβρυονικά (ΕSCs - Embryonic Stem Cells) και τα βλαστικά κύτταρα ενηλίκων (ASCs -Adult Stem Cells). Τα πολυδύναμα (pluripotent) ΕSCs προέρχονται από την εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης και έχουν την ικανότητα να δίνουν και τις τρεις βλαστικές στοιβάδες: εξώδερμα, μεσόδερμα και ενδόδερμα. Καθώς η ανάπτυξη ενός εμβρύου προχωρά, δημιουργείται η ανάγκη οργανογένεσης και έτσι σχηματίζονται γαμετικά βλαστικά κύτταρα (germ line stem cells, GSCs) για την αναπαραγωγή και σωματικά βλαστικά κύτταρα (somatic stem cells, SSCs) για την οργανογένεση. Αν και τα κύτταρα αυτά είναι ικανά να διαφοροποιηθούν, εξακολουθούν να διατηρούν την ικανότητα αυτόανανέωσής τους. Είτε περιορίζονται σταδιακά κατά την ανάπτυξη, δημιουργώντας διάφορες γενεές κυττάρων, είτε είναι μονοδύναμα (unipotent), δημιουργώντας μία γενιά κυττάρων ικανή να δώσει συγκεκριμένους μόνο ιστούς (Linheng L. & Ting X., 2005). Τα ASCs λειτουργούν ως σύστημα επιδιόρθωσης των κυττάρων του σώματος και θεωρητικά μπορούν να διαιρούνται χωρίς περιορισμούς, με σκοπό να αναπληρώσουν άλλα κύτταρα κατά τη διάρκεια της ζωής του οργανισμού. Όταν ένα βλαστικό κύτταρο διαιρεθεί, κάθε νέο που προκύπτει έχει το δυναμικό είτε να παραμείνει βλαστικό είτε να διαφοροποιηθεί σε κάποιο άλλο είδος κυττάρου με πιο εξειδικευμένη λειτουργία. Έρευνες που αφορούν στα ASCs, έδειξαν πως συναντώνται σε πολλούς ιστούς, όπως στον εγκέφαλο, στο μυελό των οστών, στο περιφερικό αίμα, στα αιμοφόρα αγγεία, στους σκελετικούς μύες, στο δέρμα και στο ήπαρ. Αν και υπάρχουν πολλοί διαφορετικοί τύποι SCs, όλοι βρίσκονται σε πολύ μικρά ποσοστά στο ανθρώπινο σώμα, όπως στην περίπτωση της συστηματική 12

κυκλοφορίας (1:100.000). Ο μυελός των οστών διαθέτει αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSCs-Hematopoietic Stem Cells), από τα οποία προκύπτουν τελικά όλα τα είδη των κυττάρων του αίματος, ακόμη και τα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών, ένας ανάμικτος κυτταρικός πληθυσμός που δημιουργεί οστά, χόνδρους, λιποκύτταρα και ινώδη συνδετικό ιστό (Εικόνα 1). Εικόνα 1: Τα στάδια της αιμοποίησης στο μυελό των οστών (http://stemcells.nih.gov) Τα ASCs θεωρούνται πολυδύναμα (multipotent), όχι όπως τα ESCs (pluripotent), ωστόσο, διαθέτουν αναπτυξιακή ικανότητα η οποία μοιάζει με αυτή των ESCs. Πρόσφατα πειραματικά δεδομένα έχουν δείξει πως τα SSCs έχουν την ικανότητα να δίνουν διαφοροποιημένα κύτταρα άλλων ιστών πλην του ιστού προέλευσής τους, εμφανίζουν δηλαδή αναπτυξιακή πλαστικότητα (developmental plasticity) (Εικόνα 2). Με βάση τη θεωρία της πλαστικότητας, η δέσμευση των SCs σε κάποια κυτταρική σειρά δεν είναι διαδικασία αυστηρά καθορισμένη και μη αντιστρεπτή, αντιθέτως χαρακτηρίζεται από ελαστικότητα επιτρέποντάς τα να ανταποκρίνονται σε ερεθίσματα από το μικροπεριβάλλον, τα οποία σχετίζονται άμεσα με την ιστική αναγέννηση. 13

Εικόνα 2: Αναπτυξιακή πλαστικότητα βλαστικών κυττάρων (Developmental plasticity of stem cells) (http://stemcells.nih.gov) Στις περισσότερες των περιπτώσεων, η συμβολή του μυελού των οστών στο σχηματισμό μη αιμοποιητικών ιστών απαιτεί την παρουσία κάποιου είδους βλάβης στους συγκεκριμένους ιστούς, όπως αυτής που προκαλείται από την ακτινοβόληση. Μελέτες έδειξαν ότι μυϊκά SCs μπορούν να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος ή ότι νευρικά SCs μπορούν να διαφοροποιηθούν σε μυϊκά (Gritti 2002, Clarke 2000). Επίσης, έχει βρεθεί ότι και κυκλοφορούντα SCs τα οποία κινητοποιούνται μετά από χορήγηση κυτοκινών, συμβάλουν στο σχηματισμό μη λεμφοαιμοποιητικών ιστών. Παραδείγματος χάριν, κινητοποίηση ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων μετά από χορήγηση ανασυνδυασμένου ανθρώπινου GM-CSF και G-CSF συνέβαλαν στη νεοαγγείωση του οφθαλμού και του μυοκαρδίου σε ποντίκια και αρουραίους, αντίστοιχα (Lemoli et al 2005). Οι μηχανισμοί στρατολόγησης των SCs που προέρχονται από το μυελό των οστών και την κυκλοφορία, καθώς κι η ακόλουθη «εμφώλευσή» (engraftment) τους στους διάφορους ιστούς δεν έχουν πλήρως αποσαφηνιστεί ακόμη. Ωστόσο, σημαντικό ρόλο φαίνεται πως παίζει η ιστική βλάβη, η οποία προκαλεί μεταβολές στο μικροπεριβάλλον, απαραίτητες για τη στρατολόγηση των SCs. Οι μεταβολές αυτές, αφορούν κυρίως στην απελευθέρωση χημειοκινών από τον ιστό που έχει 14

υποστεί τη βλάβη και στην αντίδρασή τους με ειδικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των SCs. Ο κυριότερος υποδοχέας στην επιφάνεια τόσο των αιμοποιητικών όσο και των μη αιμοποιητικών κυττάρων για την «εμφώλευσή» τους είναι ο CXCR4. O CXCR4 είναι ο υποδοχέας της χημειοκίνης CXCL12 (stromal derived factor-1 SDF-1), η διαφορική έκφραση της οποίας δημιουργεί βαθμίδωση απαραίτητη για την εμφώλευση των CXCR4 + κυττάρων (Lemoli et al 2005). Εκτός από τον CXCR4 κι άλλοι υποδοχείς χημειοκινών φαίνεται πως συμμετέχουν στη διαδικασία στρατολόγησης των SCs, όπως ο CCR7, η χημειοκίνη-προσδέτης secondary-lymphoid tissue chemokine (SLC) και ο CCR2 (Vermeulen 1998, www.biomedresearch.gr). 1.2 Αιμοποίηση Aιμοποίηση ονομάζεται η διαδικασία παραγωγής όλων των κυττάρων του αίματος από αρχέγονα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSCs). Τα ώριμα κύτταρα του αίματος δεν διαιρούνται, έχουν μικρή διάρκεια ζωής, ενώ η συνεχής αντικατάστασή τους από τα HSCs στα αιμοποιητικά όργανα είναι απαραίτητη. Τα HSCs βρίσκονται σε πολύ μικρό ποσοστό στις θέσεις παραγωγής των κυττάρων του αίματος και ακόμη λιγότερα βρίσκονται στο περιφερικό αίμα, ενώ αξίζει να σημειωθεί πως αντιπροσωπεύουν περίπου το 0.05% του συνόλου των αιμοποιητικών κυττάρων (περίπου 10 6 έως 10 7 αρχέγονα κύτταρα). Επίσης είναι ικανά για αυτοανανέωση, ώστε να διατηρείται πάντα μια σταθερή δεξαμενή αρχέγονων κυττάρων. Χωρίζονται περαιτέρω σε δύο πληθυσμούς: έναν με μακράςδιάρκειας (Long-Term Hematopoietic Stem Cells LT-HSCs) (συχνότητα εμφάνισης στο μυελό των οστών 1:10.000) και έναν με μικρής-διάρκειας ικανότητα δημιουργίας πληθυσμών (Short-Term Hematopoietic Stem Cells ST-HSCs) (συχνότητα εμφάνισης στο μυελό των οστών 1:2.000). Ενώ και τα δύο προσφέρουν ανασύσταση της αιμοποίησης έπειτα από ακτινοβόληση, μόνο τα LT-HSCs είναι ικανά να ανταπεξέλθουν για διάστημα μεγαλύτερο των 10 εβδομάδων (Reya, 2003). 15

Εικόνα 3: Μονοπάτια διαφοροποίηση των HSCs. (CLP: common lymphocyte progenitor), (CMP: common myeloid progenitor), (GMP: granulocyte monocyte progenitor), (MEP megakaryocyte erythrocyte progenitor) (Reya, 2003) Όταν γίνει μια ασύμμετρη διαίρεση, τα HSCs δημιουργoύν δύο θυγατρικά κυττάρα, από τα οποία το ένα παραμένει ως αρχέγονο πολυδύναμο αιμοποιητικό κύτταρο και το άλλο διαφοροποιείται, ώστε να σχηματίσει ένα δεσμευμένο προγονικό κύτταρο με περιορισμένη δυνατότητα σχηματισμού διαφόρων κυτταρικών τύπων του αίματος. Έτσι, με διαφοροποίηση των HSCs προκύπτουν οι πολυδύναμοι προγεννήτορες (ΜultiPotent Progenitors MPPs), όπου με περαιτέρω διαδικασίες δέσμευσης, προκύπτουν τα πρόδρομα (βλάστες) και τα λειτουργικά ώριμα κύτταρα. Η πλειοψηφία των LT-HSCs στους ενηλίκους βρίσκεται στη φάση G 0, ενώ ένα μεγάλο μέρος από τους προγεννήτορες διέρχεται από τα άλλα στάδια του κυτταρικού κύκλου. Οι in vivo τεχνικές μελέτης των HSCs περιλαμβάνουν την έγχυση εναιωρήματος μικρού αριθμού κυττάρων του μυελού των οστών από φυσιολογικά ποντίκια-δότες σε ποντίκια στα οποία έχει καταστραφεί με θανατηφόρες δόσεις ακτινοβολίας ο μυελός των οστών τους. Στα πειραματόζωα αυτά τα κύτταρα του μυελού των οστών που μεταμοσχεύτηκαν ανέπτυξαν αποικίες αιμοποιητικών κυττάρων στο σπλήνα. Ο μισός αριθμός από αυτές τις αποικίες αποτελείται από κύτταρα της ερυθράς σειράς, ενώ οι υπόλοιπες είναι μικτές (περιέχουν όλους τους τύπους των κυττάρων του αίματος), μυελοειδείς ή μεγακαρυοκυτταρικές. Με 16

χρωμοσωμικές μελέτες βρέθηκε ότι κάθε αποικία προέρχεται από την ανάπτυξη και διαφοροποίηση ενός μοναδικού πολυδύναμου αρχέγονου κυττάρου. Οι in vitrο τεχνικές μελέτης των HSCs περιλαμβάνουν τη χρήση ημίρρευστων καλλιεργητικών υλικών, που αποτελούνται από μια στιβάδα κυττάρων με προέλευση τον μυελό των οστών. Το καλλιεργητικό αυτό μέσο δημιουργεί το κατάλληλο μικροπεριβάλλον για την αιμοποίηση. Η χρησιμοποίηση ειδικών αυξητικών παραγόντων (growth factors) διεγείρει την ανάπτυξη των διαφόρων κυτταρικών τύπων (http://emed.med.uoa.gr). Στους αναπτυξιακούς παράγοντες που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη των HSCs in vitro περιλαμβάνονται οι: Flt-3 Ligand, TPO, IL-6 και IL-11, IL-3, TPO, SCF και Flt-3 Ligand, IL-3, SCF, G-CSF και MGDF (Ema 2000). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν πως σημαντικό ρόλο έχει και ο LIF στην ex vivo ανάπτυξη των HSCs ποντικού και ανθρώπου. Τα πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα διαφοροποιούνται: Α. Στους μυελοειδείς προγεννήτορες (CMPs: common myeloid progenitors), οι οποίοι αναγνωρίστηκαν αρχικά σε κυτταρικές αποικίες στο σπλήνα. Από το κύτταρο αυτό προκύπτουν πέντε κατηγορίες προγονικών κυττάρων, τα οποία λόγω της ικανότητάς τους να σχηματίζουν αποικίες σε κυτταροκαλλιέργεια ονομάζονται κύτταρα που σχηματίζουν αποικίες (colony forming cells - CFCs) ή μονάδες σχηματισμού αποικιών (colony forming units - CFUs). Έτσι, από τα μυελοειδή αρχέγονα κύτταρα προκύπτουν τα CFCs για την παραγωγή 1. των ερυθρών κυττάρων (ECFCs), 2. των αιμοπεταλίων (Meg CFCs), 3. των βασεόφιλων (BCFCs), 4. των ηωσινόφιλων (EoCFCs) και 5. των μονοκυττάρων-ουδετερόφιλων ( MGCFC ). Από τον CMP, προκύπτουν ο μεγακαρυοτικός/ερυθροειδής προγεννήτορας (megakaryocytic/erythroid progenitor - MEP) και ο κοκκιοκυτταρικός-μυελοειδής προγεννήτορας (granulocyte-myeloid progenitor-gmp). Τα MEP κύτταρα υπό την επίδραση αναπτυξιακών παραγόντων διαφοροποιούνται σε αποκρινόμενες στην ερυθροποιητίνη μονάδες «εκρηκτικής αύξησης» ερυθροειδών κυττάρων (Bursts 17

Forming Units-E ή BFU-Es) και σε κύτταρα που σχηματίζουν αποικίες-ερυθρών κυττάρων (CFU-Es). Β. Στους λεμφοειδείς προγεννήτορες (CLPs: common lymphocyte progenitors), από τους οποίους προκύπτουν τα Β και Τ λεμφοκύτταρα, τα κύτταρα φυσικοί φονιάδες (natural killers - NKs) και ίσως και τα δενδριτικά κύτταρα (dendritic cells - DCs). Η αναγέννηση των κυττάρων της λεμφοειδούς σειράς λαμβάνει χώρα στο μυελό των οστών, στο θύμο αδένα και στα περιφερικά λεμφικά όργανα. Η αιμοποίηση εξαρτάται από την ύπαρξη των κατάλληλων συνθηκών στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών, όπου επάγονται ερεθίσματα μέσω διακυτταρικών αλληλεπιδράσεων, αλλά κι από την παρουσία κατάλληλων αυξητικών παραγόντων (διαλυτά μακρομόρια), τα οποία δρουν σε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας και ενεργοποιούν διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια. Οι αυξητικοί αυτοί παράγοντες εκκρίνονται συστηματικά ή τοπικά και ελέγχουν τρεις πλευρές της κυτταρικής αύξησης: τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την ωρίμανση. Κάθε παράγοντας έχει περισσότερο από μία δράση, ενώ μερικοί είναι δυνατόν να δρουν συνεργικά, για να προωθήσουν μια ειδική πλευρά της κυτταρικής ανάπτυξης. 18

1.3 Κυτοκίνες Οι κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των Colony Stimulating Factors (CSFs), άλλων αναπτυξιακών παραγόντων, ιντερφερονών (interferons IFNs) και ιντερλευκινών (interleukins ILs), σχηματίζουν ένα δίκτυο μέσω του οποίου ρυθμίζεται ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος. Οι κυτοκίνες έχουν τόσο πλειοτροπικές δράσεις, δηλαδή μία κυτοκίνη μπορεί να δρα πάνω σε πολλά είδη κυττάρων και να προκαλεί διάφορες αποκρίσεις (Εικόνα 4), όσο και πλεοναστικές δράσεις, δηλαδή πολλές κυτοκίνες μπορεί να δρουν σε ένα κύτταρο, καθώς επίσης συνεργιστικές και ανταγωνιστικές (Moqattash S. & Lutton J.D., 2004). Εικόνα 4: Πλειοτροπική δράση των κυτοκινών του αιμοποιητικού συστήματος Α) Ειδική για συγκεκριμένη γενεά Β) Δράση σε πολλαπλές γενεές (οι διακεκομένες γραμμές συμβολίζουν δράση μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις) (Metcalf D., 2008) Οι κυτοκίνες είτε βρίσκονται στην κυκλοφορία του αίματος και δρουν ως ορμόνες, είτε δρουν στο μυελό των οστών και εκκρίνονται τοπικά. Οι κυτταροπλασματικές δομές των υποδοχέων έχουν ειδικές περιοχές στις οποίες οφείλονται οι διαφορετικές επιδράσεις τους στο κύτταρο. Έτσι, παρουσιάζονται διάφορες αποκρίσεις: επιβίωση, πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση, ωρίμανση και λειτουργική ενεργοποίηση. Οι ίδιες κυτοκίνες ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των αιμοποιητικών κυττάρων τόσο σε φυσιολογική κατάσταση όσο και σε περιπτώσεις έκτακτης ανάγκης. Σε περιοχές όπου παρατηρείται κάποια μόλυνση από παθογόνο εισβολέα, παραδείγματος χάριν, οι βακτηριακές τοξίνες άμεσα ενεργοποιούν τα γονίδια των μονοκυττάρων, των μακροφάγων και των Τ-λεμφοκυττάρων για τη 19

σύνθεση των CSFs. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων των CSFs και την ενεργοποίηση της παραγωγής κυτταρικών τύπων υπεύθυνων για την άμυνα του οργανισμού έναντι των βακτηρίων. Μερικοί CSFs (όπως ο GM CSF) δρουν ως χημειοτακτικές ουσίες και προσελκύουν ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα, μακροφάγα και ηωσινόφιλα στη περιοχή της βακτηριακής μόλυνσης, αυξάνοντας έτσι τη λειτουργική δραστηριότητα των κυττάρων αυτών (Metcalf D., 2008, Sato et al, 1993, Sartini et al, 2003). Εικόνα 5: Πολυλειτουργικότητα του granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) (Metcalf D., 2008) Όσον αφορά στο ρόλο τους στην αιμοποίηση, τα σήματα που μεταδίδονται μπορεί να είναι αρνητικά ή θετικά, παραδείγματος χάριν η Epo, ο SCF και η IL-3 επάγουν τη διαφοροποίηση των CD34+ κυττάρων προς την ερυθροειδή γενεά, ενώ ο TNF-α καταστέλλει την ερυθροποίηση ακόμη και παρουσία των τριών αυτών κυτοκινών. Σε γενικές γραμμές, ILs και CSFs δρουν συνεργιστικά για την παραγωγή κυττάρων συγκεκριμένων γενεών. Συγκεκριμένα, ο GM-CSF, ο G-CSF και ο M-CSF ρυθμίζουν τα πρώιμα στάδια της μυελοειδούς σειράς (Vellenga 1998, Sutherland 1991). Όμως, υπάρχουν κι άλλες κυτοκίνες που συμβάλλουν στη ρύθμιση της μυελοποίησης, όπως ο SCF, o TNF-α και ο Flt3. Η σηματοδότηση μέσω Flt3 φαίνεται πως έχει σημαντικό ρόλο στην εκδήλωση AML. Μία μεταλλαγμένη μορφή του Flt3 σε ασθενείς με AML σχετίζεται με αντίσταση στη απόπτωση και λευκοκκυττάρωση (Reindl 2006, Gilliland and Griffin 2002). Οι κυτοκίνες λοιπόν, ενεργοποιούν υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων και αυτοί με τη σειρά τους ενεργοποιούν ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια, 20

τα οποία τελικά προκαλούν την ενεργοποίηση γονιδίων, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση. Η οικογένεια των κινασών Janus (JAK), περιλαμβάνει κινάσες οι οποίες είναι συνδεδεμένες με τους υποδοχείς τους και είναι οι πρώτες που ενεργοποιούνται (Ihle 1995). Η STAT οικογένεια (Signal Transducers and Activators of Trancription) σχετίζεται επίσης με την μετάδοση σήματος από κυτοκίνες. Το JAK-STAT μονοπάτι συνδέει άμεσα τους υποδοχείς με την έκφραση γονιδίων (Rawlings 2004). Τέλος, οι ιντερφερόνες είναι πλειοτροπικές κυτοκίνες με αρνητικό ρυθμιστικό αποτέλεσμα στην ανάπτυξη φυσιολογικών και λευχαιμικών κυττάρων. Η σηματοδότηση μέσω ιντερφερονών στα αιμοποιητικά κύτταρα ενέχει επίσης την ενεργοποίηση των JAK και STAT κινασών τυροσίνης (Moqattash S., Lutton. J.D., 2004). 1.4 Ερυθροποίηση Κατά την ανάπτυξη του ανθρώπου, η ερυθροποίηση λαμβάνει χώρα σε δύο στάδια: α) πρώιμη (εμβρυονική) αιμοποίηση στον εμβρυικό σάκο σε νησίδες αίματος, όπου παράγονται απύρηνα ερυθρά αιμοσφαίρια (RBCs) που εκφράζουν τις εμβρυικές αιμοσφαιρίνες (Hemoglobins - Hbs) β) τελική αιμοποίηση η οποία γίνεται στο εμβρυικό ήπαρ, όπου παράγονται απύρηνα RBCs με αιμοσφαιρίνη F (HbF) και τελική αιμοποίηση (εμβρυϊκή/ενηλίκων) η οποία πραγματοποιείται στο μυελό των οστών, όπου απύρηνα RBCs παράγουν την αιμοσφαιρίνη ενηλίκων (HbA). Η ερυθροποίηση στους ενηλίκους είναι μία διαδικασία κατά την οποία οι MPPs διαφοροποιούνται προς ερυθρά αιμοσφαίρια (red blood cells - RBCs). Από τον CMP προκύπτει τόσο ο προγεννήτορας μεγακαρυοτικών/ερυθροειδών κυττάρων (megakaryotic/erythroid progenitor-mep), όσο και ο προγεννήτορας κοκκιοκυττάρων (granulocyte-myeloid progenitor-gmp). 21

Εικόνα 6: Στάδια ερυθροποίησης (Tsiftsoglou et al., 2009) Συγκεκριμένα, τα πολυδύναμα αρχέγονα κύτταρα CFU-S (colony-forming units - spleen) δίνουν BFU-E προγονικά κύτταρα. Τα προγονικά αυτά κύτταρα σχηματίζουν με τη σειρά τους μια άλλη προγονική δεσμευμένη κυτταρική σειρά, την CFU-E, με απόκριση στην ερυθροποιητίνη. Τα CFU-Es είναι ολιγάριθμα και δεν αναγνωρίζονται μορφολογικά στο μυελό των οστών. Κατά τα στάδια της διαφοροποίησης διακρίνονται μορφολογικά οι παρακάτω κυτταρικοί τύποι: Προερυθροβλάστης (προμονοβλάστης), Βασεόφιλος ερυθροβλάστης (πρώιμος νορμοβλάστης), Πολυχρωματόφιλος ερυθροβλάστης (ενδιάμεσος νορμοβλάστης), Ορθοχρωματικός ερυθροβλάστης (όψιμος νορμοβλάστης), Δικτυοερυθροκύτταρο, Ώριμο ερυθρό αιμοσφαίριο. Η ερυθροποίηση στο μυελό των οστών γίνεται σε ειδικές νησίδες όπου βρίσκονται ερυθροβλάστες γύρω από ένα κεντρικό μακροφάγο, το οποίο φαγοκυτταρώνει τον πυρήνα που απομακρύνεται από τον ορθροχρωματικό ερυθροβλάστη, ενώ στο σημείο αυτό τους παρέχεται και ο απαραίτητος για την ερυθροποίηση σίδηρος (Bessis M., 1958). Οι ερυθροβλάστες αλληλεπιδρούν μεταξύ 22

τους αλλά και με το κεντρικό μακροφάγο μέσω μορίων προσκόλλησης συμπεριλαμβανομένων των ιντεγκρινών, όπως της α4β1. Όλο και περισσότερα πειραματικά δεδομένα δείχνουν πως η ερυθροποίηση ρυθμίζεται με αρνητικούς και θετικούς μηχανισμούς εντός των νησίδων των ερυθροβλαστών κι αυτό γίνεται μέσων διακυτταρικών αλληλεπιδράσεων και διαλυτών παραγόντων όπως ο Stem Cell Factor (SCF) και ο υποδοχέας του c-kit, η ερυθροποιητίνη (Epo), o VEGF, αλλά κι άλλοι που παράγονται από τους ερυθροβλάστες και τα μακροφάγα. Οι παραπάνω αποτελούν θετικούς ρυθμιστές της ερυθροποίησης, ενώ υπάρχουν και παράγοντες που δρουν αρνητικά, όπως η IL-6, ο TGF-β, ο TNFα και η INFγ, οι οποίοι αναστέλλουν την ερυθροποίηση και προωθούν το θάνατο των ερυθροβλαστών. Επίσης, στοιχεία του εξωκυττάριου στρώματος, όπως η φιμπρονεκτίνη και η λαμινίνη, επηρρεάζουν την ερυθροποίηση ως προς την τελική διαφοροποίηση και τη μετανάστευση των ερυθροκυττάρων μέσω ειδικών υποδοχέων φιμπρονεκτίνης, ιντεγκρινών και πιθανόν κι άλλων μορίων (Eshghi et al., 2007). Καθώς προχωρά η διαδικασία της ερυθροποίησης, τα κύτταρα σταδιακά χάνουν την ικανότητα του πολλαπλασιασμού τους, ενώ σχηματίζονται τα ώριμα απύρηνα κύτταρα. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια έχουν σχήμα αμφίκοιλου δίσκου, υστερούν της ύπαρξης μιτοχονδρίων κι άλλων οργανιδίων, αλλά είναι πλούσια σε αιμοσφαιρίνη για να μπορούν να δεσμεύουν και να μεταφέρουν το οξυγόνο. Έχουν περιορισμένη διάρκεια ζωής, περίπου 120 ημέρες τα ανθρώπινα ή 50 ημέρες τα ποντικίσια. Τα γερασμένα ερυθροκύτταρα φαγοκυτταρώνονται και καταστρέφονται από τα μακροφάγα στο ήπαρ και στο σπλήνα, όπου εξαλείφονται περισσότερα από 10 11 γερασμένα ερυθροκύτταρα καθημερινά σε κάθε άτομο. Τα νέα ερυθροκύτταρα προστατεύουν τον εαυτό τους από την καταστροφή, καθώς έχουν μία πρωτεΐνη επιφάνείας που συνδέεται με έναν υποδοχέα των μακροφάγων για να ανασταλλεί η φαγοκυττάρωση. Η έλλειψη οξυγόνου ή η μείωση των ερυθροκυττάρων διεγείρει τα κύτταρα των νεφρών να συνθέσουν και να εκκρίνουν στην κυκλοφορία του αίματος μεγάλη ποσότητα ερυθροποιητίνης, η οποία με τη σειρά της διεγείρει την παραγωγή ερυθροκυττάρων. Τα νέα ερυθροκύτταρα βγαίνουν στην κυκλοφορία 1-2 ημέρες μετά την ενεργοποίηση, γεγονός το οποίο σημαίνει ότι η ορμόνη προφανώς δρα σε πρόδρομα κύτταρα που είναι πολύ κοντά στο να γίνουν ώριμα, δηλαδή στα 23

CFC-Es ή CFU-Es. Τα CFC-Es δεν περιέχουν ακόμα αιμοσφαιρίνη και η επιβίωσή τους εξαρτάται από την παρουσία της ερυθροποιητίνης. Η ερυθροποίηση είναι μία δυναμική διαδικασία που ρυθμίζεται τόσο από τη συγκέντρωση του οξυγόνου όσο και από ένα σύνολο μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν αυστηρά τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε συγκεκριμένο στάδιο και την ωρίμανση. Επίσης, η ομοιόσταση του σιδήρου και το stress επηρρεάζουν μεταγραφικούς παράγοντες που παίζουν ρόλο στην ερυθροποίηση. Η υποξία επάγει την ερυθροποίηση μέσω αύξησης της παραγωγής Epo. Η Epo παράγεται από τους νεφρούς, όταν η συγκέντρωση του οξυγόνου είναι χαμηλή (υποξία). Η διαδικασία αυτή ρυθμίζεται από τον hypoxia-inducible factor (HIF) και από τον πυρηνικό παράγοντα κβ (nuclear factor kappa B - NF-κB). Ο VCAM-1 (vascular adhension molecule-1) ενέχεται στην αλληλεπίδραση αιμοποιητικών και ενδοθηλιακών κυττάρων στο μυελό των οστών και είναι απαραίτητος για την ωρίμανση των κυττάρων της ερυθροειδούς σειράς. Η έκφρασή του επάγεται υπό συνθήκες υποξίας. Η πρόσδεση της Epo στον υποδοχέα της Epo-R, οδηγεί στην ενεργοποίηση της JAK2, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί πολλαπλά μονοπάτια, όπως το STAT5, την PI-3K/Akt και την mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Tong et al, 2005). Η μετάδοση των μηνυμάτων καθοδικά μέσω EpoR/Jak2/Stat5 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση των κυττάρων. Μάλιστα, υπάρχει μία σύνδεση μεταξύ της σηματοδότησης μέσω EpoR/Jak2/Stat5 και του μεταβολισμού του σιδήρου που είναι απολύτως βασική για την ερυθροποίηση και την επιβίωση. Ποντίκια με πλήρη έλλειψη του Stat5 υπέστησαν μείωση των επιπέδων του υποδοχέα τρανσφερίνης-1 (transferring receptor-1, TfR-1) στα ερυθροκύτταρα. Αυτό αποδόθηκε στο χαμηλό επίπεδο μεταγραφής του mrna του TfR-1 και της πρωτεΐνης ρυθμιστή του σιδήρου-2 (iron regulatory protein 2, IRP-2), του κύριου ρυθμιστή της σταθερότητας του mrna του TfR-1 στα ερυθροκύτταρα. Έχει αποδειχθεί πως και τα δύο αυτά γονίδια είναι άμεσοι μεταγραφικοί στόχοι του Stat5 (Kerenyi M.A., 2008). Παρά το γεγονός ότι η EpoR ασκεί τη δράση της μέσω της κινάσης Jak2, ερευνάται η συμβολή και ανεξάρτητων EpoR/Jak2-επαγώμενων μονοπατιών (MAPK, PI-3 και Stat5) στην ερυθροποίηση (Tsiftsoglou et.al., 2009). 24

Ένας ακόμα παράγοντας διέγερσης αποικιών (CSF) είναι η ιντερλευκίνη 3 (IL- 3) που προάγει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των πρώιμων προγονικών ερυθροκυττάρων. Η παρουσία του σε καλλιέργεια μυελού των οστών προκαλεί μεγάλη παραγωγή ερυθροκυττάρων μέσα σε 7-10 ημέρες περίπου από τα BFC-Es προγονικά ερυθροκύτταρα (Klingmuller 1997). 1.5 Αναπτυξιακοί παράγοντες και σηματοδοτικά μονοπάτια Τα συντηρημένα αναπτυξιακά μονοπάτια διατηρούν μία ισορροπία στο αιμοποιητικό σύστημα. Επιπλέον, συμβάλλουν στη διατήσηση του σταθερού αριθμού των HSCs, εξασφαλίζοντας την ισορροπία επιβίωσης και επαγώμενης αυτόανανέωσης. Σ αυτά τα μονοπάτια συμπεριλαμβάνονται τα: SCF/c-kitR, Wnt (wingless type), Notch, sonic hedgehog (Shh) και Smad [οικογένειες των TGF-β, ακτιβίνες και bone morphogenetic proteins (BMPs)] (Tsiftsoglou et al., 2009). Ο SCF (ή διαφορετικά Mast cell growth factor, c-kit ligand, Steel factor) παράγεται και εκκρίνεται από ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες και από κύτταρα μυελικού στρώματος. Bρίσκεται συνδεδεμένος στη μεμβράνη αλλά και σε διαλυτή μορφή στο κυτταρόπλασμα. Υποδοχέας του είναι ο c-kit (CD117), μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το πρωτο-ογκογονίδιο c-kit και ανήκει στην οικογένεια υποδοχέων κινάσης τυροσίνης (RTK, receptor tyrosine kinase). Oι SCF/c-kitR διαδραματίζουν σπουδαίο ρόλο στην αιμοποίηση, στη γαμετογένεση και στη γένεση των μελανοκυττάρων. Επίσης, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των διάμεσων κυττάρων του Cajal στο έντερο και στις λειτουργίες μάθησης της περιοχής του ιππόκαμπου (Linnekin D., 1999). Μεταλλάξεις του c-kit και αυτοκρινής/παρακρινής ενεργοποίηση των στοιχείων του SCF/c-kit μονοπατιού έχουν αναφερθεί σε πολλές κακοήθειες. Ο c-kit έχει βρεθεί μεταλλαγμένος κι ενεργοποιημένος σε όγκους του γαστρεντερικού και σε καρκίνωμα των πνευμόνων (Krystal 1996, Hirota 1998). Η ερυθροποίηση επηρρεάζεται από την ύπαρξη μη φυσιολογικών μορφών SCF ή c-kit. Μία διαρκώς ενεργή μορφή του ανθρώπινου c-kit (D816V), παραδείγματος χάριν, βρέθηκε σε υψηλή συχνότητα σε ασθενείς με μαστοκύττωση και σχετίστηκε με αιματολογικές 25

διαταραχές, που κυμαίνονταν από μυελοδυσπλασία μέχρι μυελοπολλαπλασιαστικά σύνδρομα. Επίσης, σε αυτούς τους ασθενείς αναπτύχθηκε λευχαιμία σε υψηλή συχνότητα (Linnekin D., 1999). O SCF αποτελεί έναν σημαντικό παράγοντα ρύθμισης των HSCs in vivo. Προάγει τον πολλαπλασιασμό τόσο των πρώιμων, όσο και των δεσμευμένων προγονικών κυττάρων. Τόσο η διαλυτή όσο και η προσδεδεμένη στη μεμβράνη μορφή που είναι δραστικές αλλά, in vivo, η συνδεδεμένη στη μεμβράνη μορφή είναι πιο αποτελεσματική στην επαγωγή της αιμοποίησης, αναδεικνύοντας έτσι το ρόλο των διακυτταρικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ αιμοποιητικών κυττάρων και κυττάρων του στρώματος. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των HSCs, πολλές ιδιότητές τους τροποποιούνται, μία εκ των οποίων είναι και η ευαισθησία τους στον SCF (Kent et al., 2008). Ποντίκια με ελλείψεις στη γενωμική αλληλουχία του SCF εμφανίζουν προβλήματα στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών. Τα HSCs ποντικού εκφράζουν στην επιφάνειά τους τα ίδια επίπεδα του c-kitr καθ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξής τους, ανεξαρτήτως σταδίου κυτταρικού κύκλου (Ikuta K. & Weissman IL. 1992, Miller et al., 2007, Ashman LK., 1999). Επίσης, έχει παρατηρηθεί πως η σύνδεση του SCF με τον c-kit στα αιμοποιητικά κύτταρα προκαλεί ενεργοποίηση των Erk και PKB σε κάποιες περιπτώσεις. Η διαφοροποίηση των HSCs οδηγεί σε μία αλλαγή στη σηματοδότηση, από εξαρτώμενη απ την PI3-κινάση σε μη εξαρτώμενη από την PI3 κινάση, ενεργοποίηση του Erk. Αυτή η τρροποποίηση του μοριακού μηχανισμού πιθανόν οφείλεται σε εναλλακτική ενδοπαρεμβολή (crosstalk) της PI3 κινάσης στα Erk μονοπάτια στο επίπεδο του Raf, ανάλογα με το στάδιο της διαφοροποίησης. Υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν πως η σηματοδότηση μέσω PI3-κινάσης/PKB διαδραματίζει σημαντικό και περίπλοκο ρόλο στην διατήρηση της πολυδυναμίας των HSCs (Wandzioch et. al., 2009). Ο SCF έχει μεγάλη σημασία στην κλινική πράξη, χάρη στην ικανότητά του να επάγει τη διαφοροποίηση λεμφοειδών και ερυθροειδών προγεννητόρων και σιτευτικών κυττάρων. Από τη στιγμή που δρά σε κάθε αιμοποιητικό προγεννήτορα, ο συνδυασμός του με άλλες κυτοκίνες ίσως αποδειχθεί ωφέλιμος στη θεραπεία μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων κι έπειτα από μεταμόσχευση μυελού των οστών. Παρουσιάζει συνεργιστική δράση με άλλους αυξητικούς παράγοντες. Σε συνδυασμό 26

με GM-CSF, G-CSF, IL-3 και EPO αυξάνει αποικίες της κοκκιώδους και ερυθράς σειράς, ενώ σε συνδυασμό με GM-CSF και IL-3 αυξάνει της αποικίες μεγακαρυοκυτταρικής σειράς, με αποτέλεσμα την αύξηση της κυτταροβρίθειας του μυελού και την αύξηση στο περιφερικό αίμα των ερυθρών αιμοσφαιρίων, των πολυμορφοπύρηνων, των μονοκύτταρων, των ηωσινόφιλων, των βασεόφιλων και των λεμφοκυττάρων. Επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση και στον πολλαπλασιασμό των εμβρυϊκών αρχέγονων κυττάρων. Έχει αποδειχθεί in vitro ότι επάγει την ερυθροποίηση σε διαφόρων τύπων σύνδρομα του μυελού των οστών, όπως αναιμία Diamond-Blackfan (Abkowitz 1991), αναιμία Fanconi s, συγγενή δυσκεράτωση κ.α. Η in vivo χορήγηση ανασυδυασμένου SCF οδηγεί σε ανάπτυξη των HSCs και των προγεννητόρων στο μυελό. Υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν ότι συνδυασμός SCF και IL-11 ίσως είναι ωφέλιμος σε ασθενείς που λαμβάνουν υψηλές δόσεις χημειοθεραπείας. Σημαντικός φαίνεται πως είναι κι ο ρόλος της σηματοδότησης μέσω Wnt στην αιμοποίηση, η οποία επηρρεάζει την ανάπτυξη των HSCs ρυθμίζοντας το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών, δηλαδή τη niche (Nemeth, M. J. and Bodine, D.M., 2007). Έχει επίσης παρατηρηθεί ότι η ενεργοποίηση του Wnt μονοπατιού συμβάλλει στη διατήρηση και στον πολλαπλασιασμό των HSCs, αυξάνοντας την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την αυτό-ανανέωση, όπως το HoxB4 και το Notch1 (Reya et al., 2003, Tsiftsoglou et al., 2009). Ένα ακόμη σημαντικό σηματοδοτικό μονοπάτι είναι και αυτό του Notch, που επηρρεάζει την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την τύχη των κυττάρων σε διάφορα στάδια της αιμοποίησης, συμπεριλαμβανομένων της αυτό-ανανέωσης και της διαφοροποίησης (Ohishi et al., 2002). Τα δεδομένα δείχνουν πως η σηματοδότηση μέσω Notch έχει κυρίαρχο ρόλο στην καταστολή της διαφοροποίησης και στη διατήρηση της κατάστασης των SCs (Dunkan et.al., 2005). 27

Εικόνα 7: Σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Οι προσδέτες του Notch, όπως οι Jagged 1/2 προσδένονται στο εξωκυττάριο τμήμα του Notch υποδοχέα. Ακολουθεί αποκοπή του ενδοκυττάριου τμήματος από τη γ- σεκρετάση και μετατόπισή του στον πυρήνα, όπου ενεργοποιεί τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων. Η γ-σεκρετάση αποτελεί ένα στόχο θεραπείας (Chumsri et al., 2007) Παρατηρήθηκε μάλιστα ότι η συντονισμένη αλληλεπίδραση των Wnt και Notch μονοπατιών ρυθμίζει σε ένα βάθμό την πρώιμη ερυθροποίηση και διατηρεί την ισορροπία μεταξύ αυτό-ανανέωσης και διαφοροποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (Cheng et al., 2008, Tsiftsoglou et al., 2009). 1.6 Μεταγραφικοί παράγοντες στην ερυθροποίηση Οι αναπτυξιακοί παράγοντες, ενεργοποιούν σηματοδοτικά μονοπάτια με αποτέλεσμα την τροποποίηση μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι με τη σειρά τους ενεργοποιούν γονίδια καθορίζοντας με τον τρόπο αυτο τη διαφοροποίηση των κυττάρων του αίματος. Η δράση των μεταγραφικών παραγόντων κατά τη διαδικασία ερυθροποίησης δεν ενέχει μόνο την ενεργοποίηση γονιδίων ειδικών της ερυθροειδούς σειράς, αλλά και την καταστολή των γονιδίων που σχετίζονται με πολλαπλές γενεές (multilineage) και εκφράζονται σε HSCs και πολυδύναμους αιμοποιητικούς προγεννήτορες, καθώς και την καταστολή της κυτταρικής διαίρεσης. 28

Επομένως, οι μεταγραφικοί παράγοντες δρουν τόσο ως ενεργοποιητές όσο και ως καταστολείς, ώστε να επιτευχθεί η ερυθροποίηση (Tsiftsoglou et al., 2009) Οι πρόωρα δεσμευμένοι προγενήτορες εκφράζουν συγκεκριμένα ποσά μεταγραφικών παραγόντων που τα οδηγούν σε διακριτές κυτταρικές γενεές. Ποια κυτταρική σειρά θα επιλεχθεί για διαφοροποίηση εξαρτάται από την τύχη και από εξωτερικά σήματα του μικροπεριβάλλοντος που λαμβάνουν οι προγενήτορες. Στους μεταγραφικούς παράγοντες που ρυθμίζουν τη διαφοροποίηση περιλαμβάνονται: Η GATA-1. Κατέχει κύριο ρόλο στη διαφοροποίηση των ερυθροκυττάρων και των μεγακαρυοκυττάρων. Εκφράζεται σε ερυθροκύτταρα, μεγακαρυοκύτταρα, σιτευτικά κύτταρα, ηωσινόφιλα και δενδριτικά κύτταρα (Ferreira et al., 2005, Gutierrez et al., 2007). H GATA-2 εκφράζεται κυρίως σε HSCs και προγεννήτορες, ενώ η GATA-3 εκράζεται σε δεσμευμένα T-κύτταρα. Η GATA-1 προσδένεται στον υποκινητή της β-σφαιρίνης, καθώς και στα περισσότερα γονίδια της ερυθροειδούς σειράς. Η έκφραση της GATA-1 είναι απαραίτητη για να ξεκινήσει φυσιολογικά η αιμοποίηση, ενώ knock-out πειράματα σε ποντίκια έδειξαν πως παίζει βασικό αντιαποπτωτικό ρόλο κατά την εξέλιξη της ερυθροποίησης. Το σύμπλοκο TAL-1/SCL προσδένεται σε ένα ειδικό μοτίβο στο DNA, που λέγεται E-box. Εκφράζεται στα κύτταρα της ερυθροειδούς σειράς, στα μεγακαρυοκύτταρα και στα σιτευτικά κύτταρα. Πειράματα knock-out έδειξαν αποτυχία αιμοποίησης, αναδεικνύοντας τον κύριο ρόλο του στην ερυθροποίηση. Ο EKLF (erythroid Krüppel-like factor) μεταγραφικός παράγοντας είναι βασικός για τη ρύθμιση των γονιδίων των σφαιρινών και για την ερυθροποίηση γενικότερα. Άλλα παραδείγματα είναι ο FOG-1, που εκφράζεται σε υψηλό ποσοστό στα ερυθροκύτταρα και στα μεγακαρυοκύτταρα και η PU.1, ένας μεταγραφικός παράγοντας που δεσμεύει τα κύτταρα σε μυελοειδή σειρά. 1.7 Μεταγραφικοί συμπαράγοντες στην ερυθροποίηση Οι μεταγραφικοί παράγοντες της αιμοποίησης αλληλεπιδρούν με πολλούς συμπαράγοντες. Κάποιοι από αυτούς εκφράζονται μόνιμα, όπως ο Ε2Α που 29

αλληλεπιδρά με τον TAL-1/SCL, κι εμπλέκονται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, στην αναδιάταξη της χρωματίνης και σε σύμπλοκα τροποποίησης των ιστόνων. Η ακετυλίωση των μεταγραφικών παραγόντων ενισχύει την μεταγραφική τους ενεργότητα και σε ορισμένες περιπτώσεις επηρρεάζει την ικανότητα πρόσδεσής τους στο DNA. Έχει παρατηρηθεί πως απαιτείται ακετυλίωση της GATA-1 για να προσδεθεί στη χρωματίνη και να ολοκληρωθεί η ερυθροποίηση (Lamonica et al., 2006). Πολλοί αιμοποιητικοί αναπτυξιακοί παράγοντες αλληλεπιδρούν με σύμπλοκα αναδιάταξης της χρωματίνης, παραδείγματος χάριν ο Brg1, η καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου SWI/SNF, αλληλεπιδρά με την GATA-1, τον EKLF, τον TAL-1/SCL και ενισχύει την ενεργοποίησή τους, αλλάζοντας τη δομή της χρωματίνης στα γονίδια - στόχους τους (Tsiftsoglou et al., 2009). 1.8 Δείκτες επιφανείας Η διάκριση των SCs στηρίζεται στην ύπαρξη συγκεκριμένων δεικτών στην επιφάνειά τους. Πρόκειται για ειδικές πρωτεΐνες-υποδοχείς που έχουν την ικανότητα ειδικής πρόσδεσης ή προσκόλλησης σε άλλες πρωτεΐνες. Υπάρχουν πολλοί τύποι υποδοχέων, οι οποίοι διαφέρουν στη δομή και στη συγγένεια με τους διάφορους προσδέτες. Κάθε τύπος κυττάρου διαθέτει ένα συγκεκριμένο συνδυασμό τέτοιων υποδοχέων στην επιφάνειά του, που το διακρίνει από τα υπόλοιπα είδη κυττάρων (http://stemcells.nih.gov). Ωστόσο, μελέτες στα HSCs έδειξαν πως τα αντιγόνα επιφανείας δεν επαρκούν για τον πλήρη χαρακτηρισμό ενός SC. Απαιτούνται κινητικές διαιρέσεων, γονοτυπικοί δείκτες και μοντέλα ξενογενούς μεταμόσχευσης. 30

Πίνακας 1: Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα δεικτών επιφανείας HSCs, MSCs και WBCs Marker Name Cell Type Significance CD34 (σιαλομυκίνη 105-120kD) CD34+Sca1+Linprofile CD38 Hematopoietic stem cell (HSC), satellite, endothelial progenitor Mesencyhmal stem cell (MSC) Absent on HSC Present on WBC lineages Cell-surface protein on bone marrow cell, indicative of a HSC and endothelial progenitor; CD34 also identifies muscle satellite, a muscle stem cell Identifies MSCs, which can differentiate into adipocyte, osteocyte, chondrocyte, and myocyte Cell-surface molecule that identifies WBC lineages. Selection of CD34+/CD38- cells allows for purification of HSC populations Η σιαλομυκίνη κυτταρικής επιφάνειας CD34 υπήρξε αντικείμενο ενδιαφέροντος από τη στιγμή που ανακαλύφθηκε σε ένα μικρό τμήμα ανθρώπινων κυττάρων του μυελού των οστών. Ο CD34 + κυτταρικός πληθυσμός του μυελού των οστών ή του περιφερικού αίματος είναι υπεύθυνος για το μεγαλύτερο μέρος της αιμοποιητικής δραστηριότητας. Γι αυτό το λόγο, το CD34 θεωρείται καθοριστικός δείκτης των HSCs. Η έκφραση του CD34 σταματά καθώς τα αρχέγονα κύτταρα διαφοροποιούνται σε ώριμα κύτταρα. Ωστόσο, έχει βρεθεί τόσο σε προγεννήτορες που δίνουν κλώνους, όσο και σε ορισμένα πιο δεσμευμένα κύτταρα. Αν κι η δράση των CD34 + κυττάρων δεν είναι πλήρως ταυτοποιημένη, είναι γνωστό πως διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην πρώιμη αιμοποίηση. Ωστόσο, ο Osawa et al πρώτος παρατήρησε πως τα HSCs ποντικού μπορεί να είναι CD34 - (Osawa et al., 1996). Επίσης, παρατηρήθηκε χαμηλό επίπεδο αιμοποιητικής ικανότητας σε ανθρώπινα CD34 - κύτταρα. Μελέτες μεταμοσχεύσεων έδειξαν πως CD34 - κύτταρα είχαν τη δυνατότητα δημιουργίας πληθυσμών σε έμβρυα προβάτου, αλλά και πως CD34 + κύτταρα τόσο ποντικού όσο και ανθρώπου είναι δυνατόν να προήλθαν από CD34 - κύτταρα. Παρ όλ αυτά, σχεδόν όλα τα κλινικά και πειραματικά πρωτόκολλα που περιλαμβάνουν ex vivo καλλιέργειες, γονιδιακή θεραπεία και μεταμόσχευση HSCs, είναι σχεδιασμένα για CD34 + κυτταρικούς πληθυσμούς. Για τη διάκριση των 31

CD34 + κυτταρικών πληθυσμών σε lineage committed προγεννήτορες και HSCs (lineage negative, Lin ), χρησιμοποιούνται επιπλέον δείκτες. Τα ανθρώπινα CD34 + /CD38 - κύτταρα διαχωρίζονται σε κύτταρα που διαιρούνται αργά (Slow-dividing fraction SDF) και σε κύτταρα δεσμευμένα που διαιρούνται γρήγορα (Fast-dividing fraction FDF). Οι μοριακοί μηχανισμοί που ελέγχουν τις ασσύμετρες διαιρέσεις των HSCs δεν έχουν πλήρως διαλευκανθεί. Τα SDF κύτταρα σχετίζονται με διαδικασίες αυτό-αναέωσης, ενώ τα FDF κυρίως διαφοροποιούνται. Αναλύοντας τα προφίλ της γονιδιακής έκφρασης των παραπάνω ομάδων από κύτταρα που προήλθαν από τον ίδιο πληθυσμό, ο Wagner και οι συνεργάτες του, ανακάλυψαν αρκετά γονίδια που υπερεκφράζονται στα SDF κύτταρα: το Prominin (CD133), το οποίο σχετίζεται με την κινητικότητα και τις πρώιμες λειτουργίες, το multi drug resistance gene 1 (MDR1), το JAK3, το frizzled 6 (υποδοχέας του Wnt μονοπατιού) και τη Hoxa9 (homeodomain protein). Επιπλέον, βρέθηκαν και πρωτεΐνες προσκόλλησης, συμπεριλαμβανομένων των: pecam-1, protocadherin beta 4, icam3, lfa-1, και integrin beta 2, οι οποίες υπερεκφράζονται, γεγονός που πιθανόν δείχνει τη σημασία τους στην διατήρηση των SCs στην αδιαφοροποίητη κατάσταση (Wagner et al., 2004, Ηο et al., 2007). 1.9 Γήρανση (Stem Cells Aging) Η ικανότητα των HSCs να διατηρούν σταθερό τον αριθμό τους και να παράγουν τα κύτταρα του αίματος καθ όλη τη διάρκεια της ζωής ενός οργανισμού, οδήγησε τους ερευνητές στο συμπέρασμα πως τα κύτταρα αυτά δε γερνάνε, παρ όλα αυτά, υπάρχουν αρκετά στοιχεία που αποδεικνύουν πως ο χρόνος ζωής τους είναι πιθανόν περιορισμένος. Συγκριτικές μελέτες μεταμόσχευσης HSCs στο μυελό των οστών ποντικών από κύτταρα νεότερων ή γηραιότερων ποντικών, έδειξαν ότι τα HSCs από τα γηραιότερα ποντίκια δεν κατάφεραν να προάγουν τη φυσιολογική αιμοποίηση στους δέκτες στο βαθμό που κατάφεραν εκείνα που προέρχονταν από νεότερα ποντίκια. Επιπλέον, μελέτες σε ανθρώπινα HSCs έδειξαν παρόμοιες διαφορές σχετικές με την ηλικία. Διάφοροι παράγοντες συμβάλουν στις παρατηρούμενες 32