طراحي ژن stxa موتانت -G234E) (R170L A231D شيگلا ديسانتري و بهينه سازي بيانو تخليص پروتي ين نوتركيب آن

Transcript

1 Archive of SID مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 13 شماره 5/ آذر و دي / مقاله پژوهشي طراحي ژن stxa موتانت -G234E) (R170L A231D شيگلا ديسانتري و بهينه دكتر غلامرضا سازي بيانو تخليص پروتي ين نوتركيب آن تولايي 2 زهير محمد حسن 3 فيروز ابراهيمي 1 جعفر سليميان 1 شهرام 1 نظريان 1 علي اصغر رحيمي اولاد* 1 محمود 3 2 (ع) 1 مركز تحقيقات زيست شناسي -دانشگاه امام حسين تهران ايران مركز تحقيقات ژنتيك دانشگاه علوم پزشكي بقيه اله تهران ايران گروه چكيده: زمينه و هدف: تاريخ دريافت: 90/2/25 ايمنولوژي - دانشگاه تربيت مدرس تهران ايران اصلاح نهايي: 90/3/15 تاريخ پذيرش: 90/4/14 شيگلا ديسانتري يكي از مهمترين باكتري هاي بيماريزاي رودهاي انسان است. شيگاتوكسين (سم اين باكتري) با ورود به سلول هاي اپيتليال باعث مهار سنتز پروتي ين و مرگ سلولي مي شود. عليرغم مطالعات فراوان جهت توليد واكسن عليه آن هنوز ضرورت تداوم مطالعه در حصول به پروتي ين نوتركيب شيگاتوكسين نوع (stxa) A وجود دارد. اين مطالعه با هدف بررسي و تعيين جايگاه هاي مناسب جهش و طراحي ژن سينتتيك زير واحد stxa و سپس بيان و بهينه سازي آن و در نهايت بررسي روش تخليص آن جهت مطالعات بعدي ايمني زايي انجام شد. در اين مطالعه توصيفي-آزمايشگاهي پس از طراحي و تهيه ژن صناعي pet28a/stxa موتانت G234E) (R170L -A231D واكنش PCR جهت كنترل صحت حضور اين ژن انجام گرديد. پس از انتقال اين وكتور به سلول ميزبان Bl21 DE3 بيان بهينه سازي و نهايتا تخليص پروتي ين حاصل بررسي گرديد. ها: نتيجه مطالعات اوليه منجر به طراحي ژن stxa موتانت گرديد. نتايج واكنش PCR با استفاده از پلاسميد سنتتيك نشان از صحت ژن مورد مطالعه داشت. پس از بيان اين ژن در سلول ميزبان Bl21 DE3 بهينه سازي آن نيز بررسي گرديد. در نتيجه توليد مقادير زيادي از اين پروتي ين به شكل اجسام توده اي نشان داده شد. تخليص انكلوژن بادي و سپس محلول سازي پروتي ين هاي مربوطه با استفاده از روش هاي تلفيقي صورت گرفت. گيري: با توجه به مكانيسم اثر شيگاتوكسين و طراحي جهش هاي انتخابي با آرايش جديد در اين ژن پيش بيني مي شود كه اين پروتي ين بياني داراي اثر سميت كمتري نسبت به ساير موتانت هاي قبلي داشته باشد در نتيجه مي تواند به عنوان كانديد واكسن برتر مطرح گردد. روش بررسي: يافته نتيجه stxa موتانت واكسن نوتركيب شيگاتوكسين شيگلا ديسانتري واژه هاي كليدي: بهينه سازي بيان مقدمه: باكتري شيگلا ديسانتري يكي از مهمترين باكتري هاي بيماريزاي روده اي انسان مي باشد (1-3). علت اصلي همه گيري اسهال ناشي از شيگلوزيس در يك قرن اخير اين باكتري بوده است. مهمترين فاكتور بيماريزا در اين باكتري اگزوتوكسين =Shigatoxin) (stx (با دو زير واحد A و B) با سميت فوق العاده بالا و كشنده µg/kg) %) LD50 = 8.5 يك مولكول هگزامري با وزن مولكولي در حدود 70kD است كه با اتصال به رسپتورهاي سطحي سلول هاي هدف (Globotriaosglceramide) (Gb3: α Gal (1-4) β Gal (1-4) βglc ceramid=gb3 باعث اپوپتوزيس و مرگ سلول خواهد شد( 4-6 ). اين توكسين را باكتري شيگلا ديسانتري نوع 1 توليد مي نمايد همچنين توكسيني مشابه با آن با نام Stx1 و Stx2 توسط E.coli O 157 نيز توليد ميگردد كه مشابهت آنها 98 درصد است (7-9). حساسيت سلول هاي (ع) * نويسنده مسي ول: تهران- دانشگاه امام حسين - مركز تحقيقات زيست شناسي -تلفن: grolad@gmail.com 93

2 طراحي ژن شيگاتوكسين A دكتر غلامرضا اولاد و همكاران Archive of SID 94 اندوتليال كليه انسان به Stx در مقايسه با Stx1 تا 1000 برابر بيشتر است (10). به همين دليل عامل اصلي ايجاد كننده بيماري خون ادراري (Hemolytic Uremic Syndrom) HUS معرفي گرديده است (11). سميت و قدرت ايمني زايي شيگاتوكسين (Stx) بسيار بالا است به شكلي كه حدود 28 نانوگرم آن باعث مرگ يك موش ميگردد و همچنين بدليل قدرت آنتي ژني بالا داراي پتانسيل ايجاد پاسخ ايمني و توليد آنتي بادي عليه توكسين در بدن ميزبان مي باشد (12 5 4). زير واحد StxB با 69 اسيدآمينه و وزن مولكولي حدود 7/7 كيلو دالتون به صورت پنتامر به زير واحد StxA با حدود در مولكولي وزن با آمينه اسيد kd متصل است. شيگاتوكسين ابتدا بواسطه زير واحد B به اپيتليال سلول غشاء در مستقر Gb3 سطحي رسپتور متصل شده و تشكيل يك كمپلكس پوشيده از مولكول كلاترين ميدهد و به صورت يك وزيكول طي فرآيند اندوسيتوز انتقال داخل سلولي انجام ميگردد (13-15). سپس يك آنزيم سرين پروتي از به نام Furin در گلژي باعث برش پيوند پپتيدي ميان دو بخش 28) kd) A1 و 4) kd) A2 مي گردد. متعاقب آن اين مجموعه بواسطه رسپتورهاي KDEL موجود در غشاء شبكه آندوپلاسمي به شبكه آندوپلاسمي وارد و در نتيجه احياي پيوند دي سولفيدي باقيمانده ميان A1 و A2 آنها را كاملا از هم جدا مي نمايد( ). نهايتا پروتي ين خطي A1 با واسطه پروتي ين Sec61 غشاء شبكه آندوپلاسمي به سيتوزول منتقل مي گردد و StxB نيز به غشاء سلول بر ميگردد. A1 ضمن فعاليت آنزيمي N- گليكوزيدازي با حذف از آدنين باز يك 28S rrna 60S واحد زير در ريبوزوم و در نتيجه مهار عملكرد فاكتورهاي EF-1 و EF-2 و نهايتا جلوگيري از طويل شدن زنجيره پپتيدي پروتي ين سنتز مهار موجبات فراهم آورد ( ). اين را ميزبان سلول مرگ و تاكنون مطالعات فراواني بر روي انواع واكسن واكسن اخيرا و عامل نوتركيب انجام موتانت گرديده است. محققين همواره به دنبال اين بوده اند كه دريابند براي طراحي اين واكسن نوتركيب كدام يك از دو زير واحد stxb يا stxa بصورت مجزا و يا همزمان ميتواند تر مناسب طراحي در اصل مهمترين باشند. واكسن حصول پروتي يني نوتركيب با حداقل اثر سميت و بهترين اثر ايمني زايي براي ميزبان و در عين ح لا نزديك ترين ساختار مولكولي به پروتي ين Native است. چرا كه توكسين طبيعي علاوه بر دارا بودن سميت به صورت براي ذاتي خود ذاتي ميزبان داراي مي نيز بالاترين باشد درجه.(23 22) ايمني توجه با زايي به مكانيسم و مسير اثر توكسين بر سلول هاي هدف جهت پروتي ين يك طراحي عليه نوتركيب به شيگاتوكسين عنوان كانديد واكسن تاكنون سه مسير معرفي و مورد استفاده واقع شده است كه عبارتند از: مسير اول مبتني بر ايجاد اختلال در روند اتصال سم به رسپتور نوتركيب (stxb) ايمنوژن است. عليه صورت در بر زير ميزبان اساس واحد ميگيرد منجر اين اتصال و به روش استفاده توليد دهنده طراحي از واكسن شيگاتوكسين آن آنتي عنوان به باديهايي مي گردد كه در صورت حضور توكسين در بدن آن را خنثي نموده و در نتيجه مانع اتصال توكسين به سلول توكسين حذف و مهار به منجر نهايت در و هدف ميگردد. بديهي است كه اين ايمنوژن فاقد هر گونه اثر سميت بر ميزبان مي باشد. ليكن هيچگونه مصونيتي بر واحد زير عليه كاتاليتيك توكسين ايجاد (StxA) نمي نمايد. تاكنون مطالعات متعددي در استفاده از اين زير حتي واحد به (stxb) عنوان بعنوان واكسن كانديد نوع گزارش گرديده است (24-28). ژني واكسن عليه و نوتركيب شيگاتوكسين مسير دوم مبتني بر ايجاد اختلال در روند انتقال داخل سلولي توكسين است. در اين روش از طراحي واكسن بر اساس stxa موتانت استفاده مي شود كه اولا اين زير واحد نوتركيب به تنهايي و در غياب stxb توانايي اتصال به رسپتور سلول هدف را ندارد و ثانيا به فرض محال ورود آن به درون سلول به دليل عدم اتصال آن به غشاء اندوزوميك به ناحيه اي كه اين زير واحد را به

3 Archive of SID مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 13 شماره 5/ آذر و دي 1390 مولكول A1 فعال با خاصيت آنزيمي تبديل مي نمايد منتقل نخواهد شد. فلذا ايجاد جهش در اين نواحي از ژن باعث كاهش شديد سميت آن مي گردد. تاكنون جهش ه يا آن از مناسب به ميان با تر مختلفي از آن بررسي گرديده است. ليكن G234E A231D F226Y معرفي پروتي ين بالاي پايداري جهشهاي اند. شده پروتي ين موتانت اين زير واحد در مقايسه با نوع وحشي انفرادي صورت (A231D) يا (G234E) باعث كاهش تمايل آن به غشاء ER تا 50 درصد مي گردد. در حالي كه استفاده همزمان از اين دو جهش باعث حذف كامل تمايل زير واحد A1 به غشاء ER و در نتيجه كاهش 225 برابري سميت آن نسبت به توكسين طبيعي مي شود ( ). مسير سوم مبتني بر ايجاد اختلال در عملكرد آنزيمي فعال جايگاه در واكسن نوع اين در است. StxA site) (Active زير واحد A ايجاد جهش ميگردد. به شكلي اين زير واحد موتانت اولا بدون حضور StxB به تنهايي به رسپتور سلول هدف Gb3 متصل نمي شود. ثانيا بفرض اتصال و طي شدن پروسه انتقال داخل سلولي و حتي بفرض تبديل به A1 فعال بدليل ايجاد تغييرات تمايل شديد كاهش و جهش اين از ناشي ساختاري آنزيم به سوبستراي خود rrna) 28s) قادر به اتصال به آن نخواهد بود. در نتيجه باعث حذف اثر سميت آن بر سلول ميزبان و همچنين پاسخ ايمني مناسب و بالايي عليه توكسين مي گردد (30). جهش Basu در و جايگاه همكارانش R170L توانستند (جايگزيني ايجاد ضمن آسپارتات بجاي گلوتامات) اثر سميت پروتي ين نوتركيب StxA حاصل از آن را تا 300 برابر نسبت به توكسين طبيعي دوم نوع جهش با مقايسه در را آن و داده كاهش G234E) (A231D نيز مورد ارزيابي قرار دهند (29). در مطالعه اي ديگر با استفاده از تكنيك جهش سازي مستقيم در نقطهاي (Site- Directed Mutagenesis) SDM جايگاه همين در جهش ايجاد با توانستند PCR و از در زايي و كاهش سميت اين ايمنوژن ها را مورد بررسي قرار دهند. در اين مطالعه آرژنين (R) 170 با لوسين (L) گلايسين با ديگر نوبت جايگزين (G) گرديد. نتايج حاصل از تيتر آنتي بادي در تست الايزا و تست خنثي سازي سم بوسيله آنتي بادي هاي حاصل از اين دو گروه و نتايج چالش حيوان ايمن نشان داد كه يكي مي بهترين باشد آرايشها لوكوس در جهش R170L و بررسي ابتدا مطالعه اين از هدف (30). معرفي ترادفي از ژن زير واحد stxa بوده است كه واجد لوكوس هاي مناسب جهش با آرايش جديد باشد. سپس بيان و بهينه سازي ژن صناعي آن توليد پروتي ين نوتركيب تخليص اين پروتي ين جهت ادامه مطالعه اثر ايمني زايي آن به عنوان كانديد واكسن بوده است. روش بررسي: در اين مطالعه توصيفي-آزمايشگاهي در پس از جستجوي اينترنتي پيرامون مطالعات قبلي ديگر محققين در استفاده از جهش هاي مختلف در اين زير واحد طراحي ژن صناعي موتانت stxa واجد جهش نقطه اي در سه لوكوس A231D,G234E) (R170L, اين ژن به صورت اپتيمايز شده در وكتور بياني pet28a از شركت چيني (ShineGene) تهيه گرديد. بوسيله ميزبان پس ژل از آگاروز بررسي انتقال E.coli BL21 DE3 پلاسميد اين از حامل وكتور طريق در ژن شوك سلول صناعي هاي حرارتي صورت پذيرفت. سپس كلنيهاي غربالگري شده كشت داده شد وپس از آن بيان ژن stxa موتانت در شرايط پايه انجام و محصولات آن بوسيله SDS-PAGE بررسي گرديد. با توجه به عدم بيان در بررسي هاي اوليه ضمن انجام واكنش (35 PCR سيكل و دماي اتصال 58 درجه صحت بخش) هر براي ثانيه 60 زمان و سانتيگراد حضور ژن مورد مطالعه با استفاده از وكتور تخليص شده از اين نمونه ها بررسي گرديد. آغازگر (Primer) ترادف با پيشرو 5 3 ATG CCA TGG CGA AGG AAT TTA CCT TAG و 95 (170) و جايگزيني اسيد آمينه هاي مختلف اثر ايمني

4 طراحي ژن شيگاتوكسين A دكتر غلامرضا اولاد و همكاران Archive of SID 96 آغازگر با پيرو ترادف 5 CAT TGA ATT CCC TCA ACT GCT AAT AGT TC3 شركت سيناژن) مورد استفاده قرار گرفت. زا( ضمن استفاده از ژل الكتروفورز و سنجش پروتي ين به روش برادفورد براي عصاره سلولي و فاز محلول حاصل از آن و مشاهده عدم بيان در نمونه حاصل از ترار يخت مرحله اول جهت بهينه سازي بيان و توليد پروتي ين StxA موتانت در وكتور pet28a براي 3 كميت زمان ( ساعت) دما ( درجه سانتيگراد) و غلظت ماده القاء كننده (0/25 0/5 1/5 1 0/75 ميلي مولار) تست و بررسي نتايج آن تكرار گرديد ولي مكررا بيان در تمام شرايط فوق منفي گرديد. از يكي از اين نمونه ها (بصورت راندوم) پاساژ مجدد بر روي يك پليت محيط كشت LB جامد داراي آنتي بيوتيك انجام گرديد. سپس بيان براي 4 كلني تك رشد يافته از پليت اخير با شرايط پايه 150rpm) (IPTG 1 mm, 37 C, 6h, اجرا گرديد. نظر به مشاهده نتايج خوب بيان بهينه سازي بيان و توليد پروتي ين مورد نظر با تغيير در 3 كميت زمان دما و غلظت ماده القاء كننده (IPTG) تكرار گرديد. بررسي استخراج و تخليص پروتي ين بياني StxA موتانت نشان داد كه اين پروتي ين در فاز غير محلول (انكلوژن بادي) سلول قرار دارد. جهت تخليص انكلوژن بادي از ساير اجزا سلول از روش زير استفاده گرديد. ابتدا سلول هاي بياني بوسيله سانتريفيوژ (بمدت 30 دقيقه در دور 6000) جداسازي شد. رسوب حاصل در بافر حاوي تريس كلرايد 50 ميلي مولار و 5 EDTA ميلي و مولار سانتريفيوژ مولار ميلي (ph=8) گرديد. سديم و حل به شده رسوب د اكسي پس و حاصل كولات از بافر سونيكيت 50 تريس اضافه درصد 1 گرديد و پس از حل نمودن سونيكيت و سانتريفيوژ داكسي سديم محلول در باقيمانده رسوب گرديد. كولات 1 درصد به مدت 12 ساعت در دماي اتاق تيمار شده و سپس سونيكيت و سانتريفيوژ گرديد. سپس به اضافه و بمدت 30 دقيقه در دماي محيط نگهداري و سپس سانتريفيوژ گرديد. رسوب انكلوژن بادي تخايص شده براي ادامه مطالعات در مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت (32). سپس تخليص پروتي ين با استفاده ازستون نيكل- نيتريلوتري استيك اسيد (Ni-NTA) ساخت شركت كياژن و روش واسرشتي اراي ه شده از همين شركت ادامه يافت. پايه تمام بافرها شامل اوره 8 مولار تريس كلرايد 10 ميلي مولار و سديم دي هيدروژن فسفات 50 ميلي مولار و با ph براي بافرهاي E,D,C,B بترتيب /9 6/3 8 و 5 4/5 استفاده گرديد. جهت تبديل پروتي ين هاي نامحلول از شكل انكلوژن بادي به پروتي ين محلول ابتدا رسوب انكلوژن بادي تخليص شده با بافر B حاوي اوره 8 مولار تيمار شده و پس از سانتريفيوژ مايع رويي حاوي پروتي ين هاي محلول شده جدا گرديد. پس از عبور نمونه فوق از ستون محصولات خروجي آن جمع آوري و سنجش غلظت پروتي ين اين نمونه ها به روش برادفورد و بررسي آنها بر روي ژل (%12) SDS-PAGE انجام گرديد (34 33). تاييد پروتي ين بياني با استفاده از روش ايمنوبلات بوسيله آنتي بادي پلي كلونال ضد His Taq براي نمونه كرود سلول بياني حاوي پروتي ين stxa موتانت انجام گرديد. اين فرآيند با استفاده از وسترن بلاتينگ ) Biorad, Western Blotting, (USA و بافر انتقال حاوي گلايسين 39 ميلي مولار تريس 48 ميلي مولار متانول 20 درصد و 37 SDS درصد و پس از انتقال بر روي غشاء PVDF (Microporous polyvinylidene difluoride membrane) انجام گرديد. غشاء PVDF در بافر (Phosphat Buffer Saline Tween-20) PBST حاوي 5 درصد شير خشك به مدت 2 ساعت در دماي آزمايشگاه تيمار شده و سپس سه بار با بافر PBST شستشو داده شد. پس از آن در بافر PBST حاوي آنتي بادي Anti His Tag (فرمنتاز) با رقت 1:8000 و سپس با آنتي بادي كانژوگه موشي ) كياژن) مجاورت داده رسوب حاصل بافر تريس 50 ميلي مولار (ph=8.5) شد. براي آشكار سازي از مخلوط 500 ميكروليتر

5 Archive of SID مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 13 شماره 5/ آذر و دي 1390 محلول (Roche: Cat. No ) MB Blue به عنوان سوبسترا و 500 ميكروليتر آب دو بار تقطير استفاده گرديد. پس از توقف واكنش با آب مقطر غشاء PVDF چند بار شستشو و خشك گرديد.(35 34) يافته ها: پيرامون دار دامنه مطالعات و بررسي از پس تعيين لوكوس هاي مناسب جهش در ژن زير واحد A و تهيه ژن صناعي stxa (واجد جهش نقطه اي در سه لوكوس (R170L, A231D,G234E بياني وكتور در pet 28a نتايج اوليه بررسي آن بر روي ژل 1 درصد آگاروز صحت آن را نشان داد (تصوير شماره 1). نتايج اوليه بيان و بهينه سازي ژن صناعي stxa موتانت براي تمام نمونه هاي حاصل از تراريختي و عليرغم تكرار در اندازه سه كميت زمان دما و ميزان ماده تصوير شماره 1: كنترل و مقايسه صحت پلاسميد صناعي اصلي با پلاسميد تخليص شده pet28a حامل ژن stxa جهش يافته چاهك 1- نشانگر وزني نوكلي وتيدي #SM0321 چاهك - 2 پلاسميد اصلي تهيه شده از شركت چيني چاهك 3- پلاسميد استخراج شده از نمونه تراريختي تصوير شماره 2: تكثير ژن stxa موتانت بوسيله PCR با استفاه از پلاسميد stxa/pet28a استخراج شده از 4 باكتري تراريختي (بيان منفي) چاهك 1 : نتيجه PCR براينمونهكنترلمنفي بدونTemplate چاهك 2: نشانگر وزني نوكلي وتيدي #SM0321 چاهك 3 تا 6: قطعه تكثير يافته stxa موتانت با وزن 882bp در 4 نمونه از نمونه هاي ترار يخت شده القاءكننده نتايج كه بود حالي در اين و شد منفي واكنش PCR با استفاده از پلاسميد تخليص شده تعدادي از همين نمونه ها مثبت گرديد (تصوير شماره 2). سپس يكي از نمونه هاي بياني منفي فوق بر روي محيط جامد 80µg/ml) LB (kanamycin مجددا كشت خطي داده شد. پس از 18 ساعت گرماگذاري تعداد 4 كلني تك حاصل از آن در محيط LB مايع كشت و رشد داده شد. سپس بررسي بيان و بدنبال آن انجام بهينه سازي براي تمام نمونه هاي اخير مثبت گرديد ) صت وير شماره 3). از ستون كروماتوگرافي تمايلي حاوي نيكل و با استفاده از شيب غلظت ايميدازول در بافرهاي مختلف آن جهت تخليص پروتي ين بياني stxa موتانت به شكل محلول استفاده گرديد. نتيجه بررسي اين محصولات بر ژل روي روش به سنجي پروتي ين و SDS-PAGE برادفورد نشان از عدم توليد پروتي ين در شكل محلول داشت. تخليص انكلوژن بادي هاي حاوي پروتي ين بياني باعث حذف نسبي بسياري از ديگر پروتي ين هاي سلولي گرديد (تصوير شماره 4). 97

6 طراحي ژن شيگاتوكسين A دكتر غلامرضا اولاد و همكاران Archive of SID درصد بالايي از پروتي ين نامحلول موجود در انكلوژن بادي هاي جدا شده از سلول با استفاده ار بافر B حاوي اوره 8 مولار به حالت محلول تبديل مي گردد. با عبور رويي مايع واسرشتي شده جدا محصولات از آن ي خروجي ستون ستون نيكل جمع روش به آوري گرديد. نتايج غلظت سنجي پروتي ين به روش برادفورد و ژل روي بر آنها بررسي SDS-PAGE دهنده نشان تخليص نسبي اين پروتي ين مي باشد (تصوير شماره ). 5 تصوير شماره 3: نتايج SDS-PAGE براي پروتي ين بياني stxa/pet28a موتانت در نمونه هاي تراريخت مثبت چاهك 1: نشانگر وزني پروتي يني #SM0671 چاهك 2: بعنوان كنترل منفي بيان تكرار نمونه چاهك 3 بدون اضافه كردن ماده القاء كننده IPTG چاهك 3: مخلوط مايع رويي هر چهار نمونه حاوي پروتي ين هاي محلول (بعد از سونيكاسيون و سانتريفيوژ سوسپانسيون باكتري بياني) چاهك 4 تا : 7 بيان پروتي ين stxa موتانت در 4 كلني حاوي پلاسميد حامل اين ژن (رسوب بعد از سونيكاسيون و سانتريفيوژ) تصوير شماره 5: بررسي پروتي ين stxa تخليص شده با ستون كروماتوگرافي نيكل به روش واسرشتي و با استفاده از شيب ph بر روي SDS-PAGE چاهك : 1 نشانگر وزني پروتي ينيSM0671 # چاهك 2 : خروجياز ستون( flow )- بافر واجداوره 8 مولار با ph=8 چاهك 3 :خروجيازستون (Wash) -بافرواجداوره 8 مولارباpH=6.3 چاهك 4 : خروجياز ستون( D )- بافر واجداوره 8 مولار با ph=5.9 چاهك 5 : خروجياز ستون (E ( بافر واجد اوره 8 مولار با ph=4.5 چاهك 6 : خروجي بافر MES از ستون تصوير شماره 4: نتايج ژل الكتروفورز جهت مشخصشدن نوع پروتي ين بيانيstxA/pET28a از نظر محلوليا نامحلول بودن چاهك 1 : كنترل منفي (كرود سلول باكتري بدون ماده القاء كننده( IPTG ) چاهك 2: نشانگر وزني پروتي يني #SM0671 چاهك 3: كرود سلول بياني (بعد از سونيكاسيون واجد باند پروتي ين بياني (stxam با وزن حدود 36 كيلودالتون چاهك 4: مايع رويي جدا شده بعد از سونيكاسيون و سانتريفيوژ نمونه چاهك 3 (حاوي پروتي ين ه يا محلول سلولي) چاهك 5 : رسوب جدا شده بعد از سونيكاسيون و سانتريفيوژ نمونه چاهك 3 (حاوي انكلوژن بادي نيمه تخليص شده) بلات وسترن نتايج همچنين (Western Blooting) با استفاده از آنتي بادي Anti-His Tag تاييد كننده صحت پروتي ين بياني stxa موتانت واجد دنباله 6His با وزن حدود 36 كيلو دالتون مي باشد (تصوير شماره 6). 98

7 Archive of SID مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 13 شماره 5/ آذر و دي 1390 تصوير شماره 6: وسترن بلات پروتي ين تخليص شده بياني StxA جهش يافته بحث: تاكنون گزارشات فراواني پيرامون توليد پروتي ين نوتركيب با كانديد واكسن عليه شيگاتوكسين اراي ه شده است. در آخرين گزارشات موجود از پروتي ين نوتركيب واجد جهش در نقاط A231D- G234E (مسير دوم با كاهش 300 برابري سميت) و در يك مورد گزارش ديگر از پروتي ين زير واحد A واجد جهش در جايگاه فعال R170L (مسير سوم با كاهش 200 برابري سميت) و معرفي آنها به عنوان كانديدهاي مناسب عليه شيگاتوكسين ذكر شده است( ). در اين مطالعه براي اولين بار طراحي اين ژن با هر سه جهش فوق بصورت همزمان صورت گرفت كه به نظر مي رسد با استفاده از اين آرايش جديدجهش كاهش تصاعدي اثر سميت پروتي ين بياني حاصل توقع دور از انتظاري نباشد. البته بديهي است كه بررسي ايمني زايي آن روشن كننده اين فرضيه خواهد بود. آنچنان كه در نتايج مشاهده گرديد بررسي هاي مكرر بيان نمونه هاي حاصل از تراريختي مرحله اول براي stxa موتانت منفي گرديد ولي بنا به يك توصيه تجربي علمي با پاساژ مجدد يكي از اين نمونه ها بر روي محيط جامد بيان براي تمام كلني هاي تك حاصل از پليت اخير مثبت گرديد. كه عليرغم بررسي هاي فراوان علت اين امر نامشخص ولي عملا اثبات گرديد. عليرغم تغيير كميت هاي سه گانه زمان و دما و ميزان ماده القاء كننده پروتي ين بياني StxA موتانت تماما بصورت انكلوژن بادي بود. در نتيجه تخليص آن بوسيله ستون نيكل و منحصرا با روش واسرشتي امكان پذير مي باشد. در عين حال نويسنده و همكاران در حال ادامه روند بهينه سازي تخليص و سپس بررسي هاي ايمني زايي پروتي ين حاصل در حيوان مي باشند. خوشبختانه تاكنون نتايج نسبتا خوبي نيز حاصل شده كه پس از تكميل نتايج آن در گزارش بعدي اراي ه خواهد شد. همچنين مشاهده باند اختصاصي مربوط به پروتي ين بياني StxA موتانت در وسترن بلات تاييد كننده صحت اين پروتي ين مي باشد. مشاهده پروتي ين بياني StxA موتانت با وزن 32 كيلودالتون در تصاوير ژل SDS-PAGE و وسترن بلات در جايگاه 36 كيلو دالتون به قطعه حدود 4 كيلو دالتون اضافه شده از سازه pet28a مربوط مي باشد. در اين مطالعه آزمايشات فراواني با استفاده از روش هاي متعدد جهت بيان و بهينه سازي و تخليص انجام موتانت StxA گرديد. اگرچه ديگر بررسي روش هاي تخليص همچنان در حال اجراست و تداوم دارد ولي به نظر مي رسد انجام پيشنهاد زير همسانه سازي ژن StxA موتانت از pet28a به pet32a راه حصول به پروتي ين بياني در شكل محلول را فراهم آورد. تشكر و قدرداني: با تشكر از پروفسور Panda..K A از دانشگاه دهلي كشور هند دكتر مير لطيف موسوي از دانشگاه شاهد دكتر علي هاتف سلمانيان از پژوهشگاه ملي ژنتيك بخاطر مشاوره هاي موثرشان و همچنين تقدير ازحمايت هاي سازمان بسيج علمي كشور. 99

8 طراحي ژن شيگاتوكسين A دكتر غلامرضا اولاد و همكاران Archive of SID منابع: 1. Clemens J, Kotloff K, Kay B. Generic protocol to estimate the burden of shigella diarrhea and dysenteric mortality. Geneva: WHO Text Book; World Gastroenterology Organisation practice guideline: Acute diarrhea. USA Shantini DG. Shiga toxin-encoding phage from Escherichia coli O 157 :H7 interactions with non-pathogenic E. coli and implications for toxin production [dissertation] Ohio: Univ Cincinnati Ghosh RN, Mallet WG, Mcgraw T, Maxifield FR. An endocytosed TGN38 chimeric protein is delivered to the TGN after trafficking through the endocytic recycling compartment in CHO cells. J Cell Biol Aug; 142(4): Goguen J. Listeria Shigella E. coli, Salmonella. J Immunol ; 5: Hurley BP, Thorpe CM, Acheson D. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect Immun. 2001; 69(10): Suhan ML, Hovde J. Disruption of an internal membran- spaning region in shiga toxin 1 reduces cytotoxicity. Infect Immun. 1998; 66(11): Sandvig K, Deurs B. Transport of protein toxins into cells: pathways used by ricin, cholera toxin and shiga toxin. FEBS Lett Oct; 529(1): Obrig JT. Shiga toxin mode of action E. coli O 157 : disease. Front Biosci Dec; 2:d Kay SA, Louise CB, Boyd B, Lingwood CA, Obrig T. Shiga toxin-associated hemolytic syndrome: interleukin-1 beta enhancement of Shiga toxin cytotoxicity toward human vascular endothelial cells in vitro. Infect Immun Sep; 61(9): Jung-Keun S, Carolyn J. Shiga toxin attacks bacterial ribosomes as effectively as eukaryotic ribosome. Biochemistry Jun; 37(26): Brown JE, Rothman SW, Doctor BP. Inhibition of protein synthesis in intact hela cells by shigella dysenteriae 1 toxin. Infect Immun. 1980; 29(1): Alto NM, Shao F, Lazar CS, Brost RL, Chua G, Mattoo S, et al. Identification of a bacterial type III effector family with G protein mimicry functions. Cell. 2006; 124(1): Sandvig K. Shiga toxins. Toxicon. 2001; 39(11): Blanco J, Blanco M, Mora A. Production of toxins ( Enterotoxin, Verotoxin and Neurotoxins) and colicins by E. coli strains isolated from septicemic and healthy chickens relationship with in vivo pathogenicity. J Clin Microbiol Nov; 35(11): Gerald T, Jacewicz M. The pathogenesis of shigella diarrhea V, relationship of shigella enterotoxin, neurotoxin, and cytotoxin. J Infect Dis May; 13(Suppl): Lafont F, Nhieu GT, Hanada K, Sansonetti P. Initial steps of shigella infection depend on the cholestrol sphingolipid raft- mediated CD44 IpaB interaction. EMBO J Sep; 21(17): Brown J, Griffin E, Rothman W. Purification and biological characterization of shiga toxin from shigella dysenteriae 1. Infect Immun. 1982; 36(3): Min Y, David BH. Shiga toxin is transported from the endoplasmic reticulum following interaction with the luminal chaperone HEDJ/ERdj3. Infect Immun. 2005; 73(4): Cherla RP, Sang-Yun L, Tesh V. Shiga toxins and apoptosis FEMS Microbiol Lett Nov; 228(2): Mari O, Masafumi Y, Chikako TM, Yoshikazu Y, Yoshifumi T, Hiroshi K. Nontoxic shiga toxin derivatives from Escherichia coli possesses adjuvant activity for the Augmentation of antigenspecific immune responses via dendritic cell activation. Infect Immun. 2005; 73(7):

9 Archive of SID مجله دانشگاه علوم پزشكي شهركرد/ دوره 13 شماره 5/ آذر و دي Levine MM. Sztein MB. Vaccine development strategies for improving immunization: the role of modern immunology. Nat Immunol. 2004; 5: Olivier A, Benoit V, Ludovic F, Protul S, Yu-Chun L, Ludger J, et al. Subunit of shiga toxin-based vaccines synergize with-galactosylceramide to break tolerance against self antigen and elicit antiviral immunity. J Immunol Sep; 179(5): Benoit V, Olivier A, Delphine P, Steffen J, Protul S. The shiga toxin B-subunit targets antigen in vivo to dendritic cells and elicits anti-tumor immunity. Eur J Immunol May; 36(5): Paola M, Thomas P, Griener GL, Mulvey Glen DA. Recombinant shiga toxin B subunitkeyhole limpet hemocyanin conjugate vaccine protects mice from Shigatoxemia. Infect Immun. 2005; 73(10): Pistone V, Creydt MF, Miyakawa F, Martín E, Zotta C, Silberstein, et al. The shiga toxin2 B subunit inhibits net fluid absorption in human colon and elicits fluid accumulation in rat colon loops. Braz J Med Biol Res. 2004; 37(6): Mona O, Saeid B, Soheila A. Immune responses of mice immunized with active recombinant shiga toxin and its derivatives. Iran J Allergy Asthma Immunol. 2008; 7(2): Sharon X. Wen LD, Teel NA, Judge Alison D, Brien O. A plant-based oral vaccine to protect against systemic intoxication by Shiga toxin type 2. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103(18): Basu I, Ferens WA, Stone DM, Hovde CJ. Antiviral activity of shiga toxin requires enzymatic activity and is associated with increased permeability of the target cells. Infect Immun. 2003; 71(1): Satoshi I, Kazuyoshi K, Yutaka K, Yasunori I, Aki K, Danbara H, et al. Protection against shiga toxin1 challenge by immunization of mice with purified mutant shiga toxin1. Infect Immun. 2003; 71(6): Panda AK, Singh SM. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng Apr; 99(4): Thatcher DR, Hitchcock A. Protein folding in biotechnology. In: Pain RH. Mechanisms of protein Folding. Frontiers in molecular biology. UK: Oxford: Series IRL Press; 1994; p: Wingfield PT, Palmer I, Liang SM. Folding and purification of insoluble (inclusion-body) proteins from Escherichia coli. Curr Protoc Protein Sci May; 6: Crowther JR. Eliza theory and practice. USA: Totowa NJ. Country of Pub; Bollage DM, Michel DR, Edesttein SJ. Protein method. NewYork: Wiley-Liss;

10 Journal of Shahrekord University of Medical Sciences (J Shahrekord Univ Med Sci) 2011 Dec, Jan; 13(5): Original article Archive of SID Shigella dysentery stxa mutant (R170L-A231D-G234E) gene design and optimization of recombinant protein expression and purification Olad GhR (PhD student)* 1, Tavalae M (PhD) 2, Mohammad-Hassan Z (PhD) 3, Ebrahimi F (PhD) 1, Salimian J (PhD) 1, Nazarean Sh (PhD student) 1, Rahimi AA (PhD) 1 1 Biological Research Center, Imam Hosain University, Tehran, Iran, 2 Applied Biotechnological Research Center, Baghiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran, 3 Medical Sciences faculty, Tarbiat Modaress University, Tehran, Iran Received: 14/Apr/2011 Revised: 5/Jan/2011 Accepted: 15/July/2011 Background and aims: Shigella dysentery is one of the most important human pathogenic intestinal bacteria. Entrance of the shigella toxin into the epithelial cells inhibits protein synthesis leading to cell death. In spite of great investigations on vaccine production against S. dysentery, studying to achieve significant stxa recombinant protein still remains important. The objective of this study was to determine the appropriate mutation loci and designing stxa subunit synthetic gene, its further expression and optimization and ultimately assaying purification method for further immunization studies. Methods: Three mutant stxa gene including (R170L-A231D-G234E) were designed and the synthetic gene in pet28a plasmid was obtained and confirmed by PCR. Thereafter the plasmid was transformed into the host cell E.coli BL21 DE3 after which gene expression was optimized and protein purity assay was then performed. Results: Preliminary studies led to mutant stop gene design, after which it was confirmed by synthetic plasmid and PCR. Expression and optimization were then performed which resulted in large amount of protein inclusion bodies. Purification of inclusion bodies and protein which resulted solubilization was done with a combinatorial method. Conclusion: With regard to the mechanism of shiga toxin effect and favorable mutation design with new arrangement, less toxicity of expressing protein is predicted than previous other mutants, posing a better vaccine candidate. Keywords: Expression optimization, Mutant stxa, Recombinant vaccine, Shiga toxin, Shigella dysentery. Cite this article as: Olad GhR, Tavalhee M, Mohammad-Hassan Z, Ebrahimi F, Salimian J, Nazarean Sh, Rahimi AA. [Shigella dysentery stxa mutant (R170L-A231D-G234E) gene design and optimization of recombinant protein expression and purification. J Sharekord Univ Med Sci Dec, Jan; 13(5): ]Persian * Corresponding author: Biological Research Center, Imam Hossain University, Tehran, Iran, Tel: , grolad@gmail.com 102