Development and Application of Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Technique Using SYBR Green I in the Diagnosis of Down Syndrome

Transcript

1 Original Article Development and Application of Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Technique Using SYBR Green I in the Diagnosis of Down Syndrome Ahmad Reza Kamyab, M.Sc. 1, Shirin Shahbazi, Ph.D. 2, Parvin Dibajnia, M.D. 3, Mina Hayt Nosaeid, M.Sc. 4, Mohammad Taghi Akbari, Ph.D. 2, Amir Reza Rafiee, B.Sc. 5, Katayun Akhlagh Tamiz, B.Sc. 4, Reza Mahdian, Ph.D. 4 * 1. Biology Department, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran 2. Medical Genetics Department, Faculty of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran 3. Psychiatrics Department, Shahid Beheshti University of Medical Science, Tehran, Iran 4. Molecular Medicine Department, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran 5. Tehran Medical School, Islamic Azad University, Tehran, Iran * Corresponding Address: P.O.Box: , Molecular Medicine Department, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran rezamahdian@yahoo.com, Received: 20/May/2009, Accepted: 2/Jan/2010 Abstract Objective: Rapid diagnosis of Trisomy 21 Syndrome (Down Syndrome) patients using Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction (Real-Time qpcr) in order to establish a novel method for prenatal diagnosis in the future. Materials and Methods: A total of 5 ml of peripheral blood was obtained from each patient and normal controls (NR). Then, genomic DNA from lymphocytes was extracted using the salting out procedure. Gene dosage levels of DSCAM and (PMP22, DSCAM) in Down Syndrome and NR were analyzed using real-time quantitative PCR. The DSCAM/ PMP22 ratio was calculated according to the 2 -ΔΔCt formula for all samples. Results: Real-time PCR showed a DSCAM/PMP22 ratio of 1.48 ± 0.18 and 1.01 ± 0.10 (p<0.001) in Down Syndrome and normal samples, respectively, demonstrating three copies of the target (DSCAM) gene in Trisomy 21 Syndrome. Conclusion: DSCAM/PMP22 ratio is increased significantly in Down Syndrome patients than NR (1.5 times). Therefore, the real-time quantitative PCR technique can be used as a sensitive, accurate and reliable technique for rapid and prenatal diagnosis of Trisomy 21 Syndrome. Keywords: Down Syndrome, Trisomy 21, Gene Copy Number, Real-Time, PCR Yakhteh Medical Journal, Vol 12, No 2, Summer 2010, Pages: Yakhteh Medical Journal, Vol 12, No 2, Summer

2 مقاله اصيل بهينه سازى و كاربرد تكنيك Real-Time PCR كمي با استفاده از SYBR-Green I در تشخيص سندرم داون احمدرضا كامياب شيرين شهبازى.Ph.D.D 2 پروين ديباجنيا.M.D.D 3 مينا حياتنوسعيد.M.Sc.D 4 1.M.Sc.D 2 اميررضا رفيعى كتايون اخلاقتميز رضا مهديان 4.Ph.D.D * محمدتقى اكبرى 4.B.Sc.D 5.B.Sc.D.Ph.D.D 1. دانشگاه ا زاد اسلامى واحد علوم و تحقيقات تهران گروه زيست شناسى تهران ايران 2. دانشگاه تربيت مدرس دانشكده پزشكى گروه ژنتيك پزشكى تهران ايران 3. دانشگاه علوم پزشكى شهيد بهشتى گروه روان پزشكى تهران ايران 4. انستيتو پاستور ايران بخش پزشكى مولكولى تهران ايران 5. دانشگاه ا زاد اسلامى واحد پزشكى تهران تهران ايران * ا درس نويسنده مسي ول: ايران تهران صندوق پستي: انستيتو پاستور ايران بخش پزشكى مولكولى پست الكترونيك: rezamahdian@yahoo.com دريافت مقاله: 88/2/30 پذيرش مقاله: 88/10/12 چكيده * هدف: تشخيص سريع بيماران مبتلا به سندرم داون (تريزومى 21) با استفاده از تكنيك Real-time PCR كمى به منظور پايه گذارى روش نوين در تشخيص پيش از تولد در ا ينده * مواد و روش ها: از افراد مورد مطالعه پنج ميلى ليتر خون محيطى گرفته شد. سپس با روش رسوب گذارى با نمك اشباع DNA ژنومى از لنفوسيت ها استخراج شد. ميزان ژن هاي DSCAM و PMP22 در افراد مبتلا به سندرم داون و نرمال با تكنيك (Real Time-PCR) Real-Time Polymerase Chain Reaction به صورت كمى سنجش و نسبت ژنى در اين افراد با فرمول -ΔΔCt 2 محاسبه گرديد. * يافته ها: نتايج حاصل از Real-Time PCR نسبت ژنى DSCAM/PMP22 را در بيماران مبتلا به سندرم داون و افراد نرمال به ترتيب ± 0/18 1/48 و ± 0/10 1/01 (0/001>p) نشان داد كه بيانگر حضور سه كپى از ژن هدف (DSCAM) در افراد مبتلا به سندرم تريزومى 21 است. * نتيجه گ ي ري: نسبت ژنى DSCAM/PMP22 در افراد مبتلا به سندرم داون به طور معنى دارى 1/5 برابر بيشتر از افراد نرمال است. بنابراين تكنيك Real-Time PCR كمى مى تواند به عنوان روشى بسيار دقيق و قابل اعتماد با حساسيت بالا در تشخيص سريع و پيش از تولد سندرم تريزومى 21 مورد استفاده قرار گيرد. * كليدواژگان: : سندرم داون تريزومى 21 تعداد كپى ژن Real-Time PCR فصلنامه پزشكى ياخته سال دوازدهم شماره 2 تابستان 89 صفحات: مقدمه سندرم داون (تريزومى 21) يكى از ناهنجارى هاى كروموزومى شايع (1 در هر تولد) است كه تشخيص و پيش گيرى از تولد بيماران مبتلا به اين سندرم از اولويت هاى وزارت بهداشت مى باشد. بيشتر مبتلايان در دوره جنيني يا اوايل نوزادي از بين مي روند. علت زمينه اي و اصلي بروز اين بيماري در همه جمعيت ها و نژادها سن بالاي مادر گزارش شده است. در اين ناهنجارى سه كپى از تمام يا بخشي از كروموزوم 21 وجود دارد. با توجه به اهميت تشخيص پيش از تولد در پيش گيرى از تولد كودكان مبتلا به اين بيمارى روش هاى مختلف تشخيصى به كارگرفته شده است. روش ا ناليز سيتوژنتيك سنتى (شمارش كروموزومى) اولين روشى است كه در تشخيص تريزومى 21 استفاده شد. در اواخر دهه 80 ميلادي براي شناسايي سندرم تريزومي 21 تكنيك (FISH) Fluorescent in Situ Hybridization معرفي شد.(1-3) تكنيك Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) يكي از روش هاي مولكولى رايج است كه بر مبناي تكثير نشانگرهاي مولكولي (STRs) Short Tandem Repeats واقع بر كروموزوم 21 عمل مي كند (4 5). علاوه بر اين از تكنيك هاى مولكولى ديگر نظير (6) Homologous Gene Quantitative PCR (HGQ-PCR) و (7) Multiplex Fluorescent PCR نيز در تشخيص بيماران مبتلا به اين سندرم استفاده مي شود (7 8). روش هاى ذكر شده در كنار مزايا و قابليت هاى تشخيصى محدوديت هاى خاص خود را دارند. بنابراين معرفى تكنيك مولكولى دقيق و قابل اعتماد كه قادر به تشخيص سندرم تريزومى 21 به ويژه در باردارى هاى پر خطر در مدت زمان كوتاه باشد ضرورى به نظر مى رسد. امروزه از تكنيك Real-Time Polymerase Chain Reaction Time-PCR) (Real در زمينه هاى متفاوتى مانند ا ناليز تغييرات نوكلي وتيدى در توالى ژن ها (جهش هاى نقطه اى) تعيين تغييرات در ميزان ژنى Dosage) (Gene (9-11) و بيان ژن ها (12 13) به فراوانى استفاده مى شود. دستگاه Real-Time PCR قادر است قطعات تكثيرى را هم زمان با پيشرفت واكنش زنجيره پليمراز مانيتور كند. تحقيق حاضر به منظور بررسى توانايى تكنيك Real-Time PCR كمى با استفاده از DNA ژنوميك در افتراق نمونه هاى بيماران مبتلا به 250 فصلنامه پزشكى ياخته سال دوازدهم شماره 2 تابستان

3 تشخيص سندرم داون با Real-Time PCR سندرم تريزومى 21 از نمونه هاى افراد سالم طراحى و اجرا گرديد تا در ادامه با استفاده از نتايج حاصل (تاييد حساسيت و اختصاصى بودن روش) بتوان از ا ن جهت پايه گذارى و اراي ه تكنيكى دقيق و قابل اعتماد با حساسيت بالا در تشخيص پيش از تولد سندرم تريزومى 21 استفاده كرد. اين مطالعه براى اولين بار در ايران كاربرد تكنيك Real-Time PCR كمى را در شناسايى و تشخيص سندرم تريزومى 21 معرفى مى كند. مواد و روش ها گردا ورى نمونه با همكاري ا زمايشگاه هاى خصوصي و مراكز مشاوره ژنتيك شهر تهران 25 بيمار 2-21 ساله مبتلا به سندرم داون به طور تصادفى انتخاب و پس از اخذ رضايت نامه از خانواده ا نها از هر فرد پنج ميلي ليتر خون محيطى تازه گرفته شد. هم چنين 10 فرد نرمال ساله به عنوان گروه كنترل نيز به طور مشابه وارد مطالعه شدند (جدول 1). جدول 1: تعداد دامنه سنى و جنسيت افراد مورد مطالعه نوع نمونه نرمال سندرم داون دامنه سنى تعداد زن 6 تعداد مرد 4 تعداد كل اين مطالعه در سال 1387 با تصويب كميته اخلاقى انستيتو پاستور ايران در بخش پزشكى مولكولى انجام گرديد. ا ناليز كروموزومى سيتوژنتيك ابتدا لنفوسيت هاى خون محيطى تازه با روش فيكول (14) جدا شده و در محيط كشت كامل كشت داده شد. پس از افزودن 150 ميكروليتر كالسميد و انكوبه در دماى 37 درجه سانتى گراد به مدت دقيقه سانتريفيوژ با دور 400 به مدت پنج دقيقه انجام شد. مايع رويى را دور ريخته و به رسوب محلول پنج ميلى ليتر كلريد پتاسيم افزوده و به مدت 15 دقيقه در دماى 37 درجه سانتى گراد انكوباسيون انجام گرديد. سپس مايع رويى را دور ريخته و به رسوب محلول تثبيت كننده افزوده شد. پس از سانتريفوژ كردن نمونه به مدت 12 ساعت در دماى 20- درجه قرار گرفت. در ادامه پس از سانتريفيوژ كردن مايع رويى را خارج كرده و به ا ن محلول تثبيت كننده افزوده شد تا لام گيرى انجام شود. لام در معرض هواى اتاق خشك شده و در محلول تريپسين (به مدت 30 ثانيه) قرار گرفت. سپس تريپسين را با بافر شست وشو داده و لام به مدت پنج دقيقه در رنگ گيمسا قرار گرفت. در نهايت كروموزوم ها با ا ب مقطر شست وشو و با ميكروسكوپ نورى مشاهده گرديدند. الكتروفورز با ژل ا گاروز Electrophoresis) (Agarose Gel ابتدا ژل ا گارز يك درصد (يك گرم پودر ا گارز در 100 ميلى ليتر بافر (Tris-Borate-EDTA 0.5X مخلوط با رنگ اتيديم برومايد تهيه گرديد سپس محصولات تكثيرى هر ژن در واكنش Real-Time PCR در ژل ا گارز بارگذارى و الكتروفورز انجام شد. اين مرحله جهت تاييد تكثير قطعات اختصاصى هر ژن و عدم حضور محصولات غيراختصاصى و جفت شدن پرايمرها (پرايمر دايمر) انجام گرديد. استخراج DNA استخراج DNA از خون محيطى با استفاده از روش رسوب گذارى با نمك اشباع انجام شد (15). در اين روش لنفوسيت ها را جدا كرده و به ا ن بافر ليزكننده هسته (NaCl 150 mm, Tris 15 mm, EDTA 10 mm PH=7.5), SDS ده درصد ا نزيم پروتي يناز K افزوده و به صورت شبانه انكوباسيون انجام شد. پس از افزودن كلريد سديم 6 مولار و سانتريفيوژ كردن (4804R (Eppendorfe مايع رويى جدا و با اتانول سرد شست وشو گرديد تا كلاف DNA تشكيل شود. سپس با حذف اتانول 100 ميكروليتر بافر (Tris 10 mm, EDTA 1 mm, PH=7-8) TE به ا ن افزوده شد. غلظت و چگالى نورى DNA تخليص شده در طول موج هاى 260 و 280 نانومتر با دستگاه اسپكتروفتومتر نانودراپ DNA تعيين گرديد. سپس از نمونه هاى (BioRad, USA) ND-1000 با نسبت طول موج 260/280 نانومتر بين 1/6 تا 1/8 جهت ا زمايش Real-Time PCR استفاده گرديد. طراحى پرايمر در اين مطالعه ژن Down Syndrome Cell Adhesion Molecule (DSCAM) واقع بر ناحيه اساسى كروموزوم 21 در سندرم داون 21q22.1) (Down Syndrome Critical Region, و ژن (PMP22) Peripheral Myelin Protein 22 واقع بر كروموزوم 17 (17p11.2) به ترتيب به عنوان ژن هدف و ژن مرجع انتخاب شدند. سپس با اخذ توالى ژن ها از سايت با نرم افزار Primer Express Ver.3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) براى ژن هاى مورد مطالعه پرايمرهاى اختصاصى طراحى گرديد. توالى پرايمرهاى مستقيم و معكوس ژن هدف DSCSM به صورت Fw-5'CCGGGCAGTCTAATTCCAGAAC3' Rv- 5'AGTATGTGCACTCAGAAACCAGCTG3 و براى ژن مرجع PMP22 به صورت Fw-5'GGAGGAGAGAAGGCTTGAATGC3' و Rv- 5'GTTCCACATGCACACAGAAACG3' مى باشد. جهت اطمينان از عدم همولوژى و مكمل بودن توالى پرايمرها با توالى هاى نوكلي وتيدى در بخش هاى ديگر ژنوم در BLAST سايت بررسى گرديد. Real-Time PCR در اين مطالعه از دستگاه Real-Time PCR مدل ABI 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA.) استفاده شد. برنامه زمانى-گرمايى دستگاه در سه مرحله انجام شد. مرحله اول كه منجر به دناتوره شدن مولكول هاى DNA و فعال شدن ا نزيم پليمراز مى گردد به صورت 95 درجه سانتي گراد به مدت 10 دقيقه مرحله دوم 95 درجه سانتيگراد به مدت 15 ثانيه و 60 درجه Yakhteh Medical Journal, Vol 12, No 2, Summer

4 كامياب و همكاران.(ΔCt= Ct target gene در ادامه ΔCt نمونه فرد نرمال Ct reference gene ) را از ΔCt فرد مجهول كم كرده تا ΔΔCt حاصل گردد: [ΔΔCt=(Ct target gene Ct reference gene ) Unknown sample (Ct target gene Ct reference gene ) Normal control )]. در نهايت ميزان -ΔΔCt 2 با نسبت ژن هدف به ژن مرجع برابر است.(16 12) (Target gene/reference gene ratio =2 -ΔΔCt ) ارزيابى و ا ناليز داده هاى حاصل از Real-Time PCR در سيستم ABI PRISM 7300 Sequence Detection System و بسته نرم افزارى (SDS) Sequence Detection System V و USA.) (Applied Biosystems, Foster City, CA, انجام گرديد. سانتي گراد به مدت 1 دقيقه براى 40 سيكل متوالى و مرحله نهايى جهت ترسيم منحنى تفكيك Curve) (Dissociation يا منحنى ذوب به صورت 95 درجه سانتي گراد به مدت 15 ثانيه 60 درجه سانتي گراد به مدت 30 ثانيه و 95 درجه سانتي گراد به مدت 15 ثانيه انجام شد. واكنش هاى Real-Time PCR در حجم نهايي 25 ميكروليتر به صورت سه تايى (Triplicate) در پليت هاى 96 چاهكى انجام شدند. مخلوط هر واكنش شامل : 12/5 ميكروليتر SYBR-Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) يك ميكروليتر (10 پيكومول) از پرايمرهاى مستقيم (Forward) و معكوس (Reverse) اختصاصي هر ژن 5 ميكروليتر DNA ژنوميك (20 نانوگرم) و به بقيه ا ب مقطر افزوده شد تا به حجم نهايي 25 ميكروليتر رسيد. در مطالعه حاضر از ماده اى با رنگ فلورسنت سبز به نام SYBR Green I استفاده شد كه قادر است در ميان شيار كوچك مولكول DNA دو رشته اى قرار گرفته و نور فلورسنت منتشر كند. ميزان توليد نور فلورسنت نسبت مسقيم با ميزان توليد محصول PCR دارد. مولكول SYBR Green I اثر مهاركنندگى بر PCR نداشته و از ا ن مى توان به جاى پروب هاى اختصاصى فلورسنت استفاده كرد. بهينه سازى واكنش Real-Time PCR ابتدا جهت تعيين غلظت مناسب و عملكرد پرايمرها از ا ن ها رقت هاى متوالى Dilution) (Serial به صورت و 13 پيكومول در ميكروليتر تهيه و واكنش Real-Time PCR انجام گرديد. هم چنين جهت ترسيم منحنى استاندارد Curve) (Standard براى هر ژن از رقت هاى متوالى DNA استاندارد (نرمال كنترل) به صورت 25 12/5 6/25 3/13 و 50 نانوگرم در ميكروليتر استفاده گرديد. از منحنى استاندارد دامنه ى غلظت بهينه DNA الگو و ميزان راندمان (PCR Efficiency) PCR براى هر ژن تعيين مى گردد. واكنش رقت هاي متوالي براي پرايمرها و DNA استاندارد به صورت سه تايي به همراه يك واكنش بدون حضور DNA الگو Control) (Non Template براي هر ژن در پليت 96 چاهكى انجام شد. Real-Time Quantitative PCR در مطالعات سنجش نسبى داده هاى كمى تغييرات ژن هدف نسبت به ژن مرجع مورد بررسى و مقايسه قرار مى گيرد. از اين رو محاسبه ميزان كارايى و راندمان واكنش تكثيرى Efficiency) (Amplification براى هر دو نوع ژن لازم و ضرورى مى باشد. بنابراين پس از اتمام واكنش رقت هاى متوالى از DNA استاندارد به عنوان الگو منحنى استاندارد بر اساس لگاريتم غلظت DNA (محور افقى) و سيكل ا ستانه يا Ct (محور عمودى) براى هر ژن ترسيم شد (نمودار 1 و 2). از شيب منحنى استاندارد در محاسبه راندمان واكنش تكثيرى استفاده مى شود كه بايد بين 3/6- تا 3/1- باشد:.PCR Efficiency Percent =[10 (-1/SLPOE) 1) 100 ا ناليز نسبى داده هاى كمى Analysis) (Relative Quantification Data در مطالعه حاضر جهت سنجش تعداد كپى هاى ژن هاى هدف و مرجع از روش مقايسه اى سيكل ا ستانه استفاده شد. در اين روش از سيكل هاى ا ستانه هر ژن (كه به صورت سه تايى يا -Trip mct سپس.(mCt) انجام شده است) ميانگين گرفته شد licate ژن هدف را از mct ژن مرجع كم كرده تا ΔCt به دست ا يد ا ناليز ا مارى ارزيابى و سنجش ا مارى داده هاى حاصل از Real-Time PCR شامل ميانگين انحراف از استاندارد (SD) ضريب تعيين داده ها ) 2 R) و نمودارها با نرم افزار SPSS (Statistical Package for Social (Science, V.16, SPSS Inc, Chicago, IL, USA انجام شد. ميزان p نيز با استفاده از (17) Student s t test جهت تعيين اختلاف ا مارى معنى دار بين دو گروه مورد مطالعه محاسبه گرديد. يافته ها پس از اتمام واكنش رقت هاى متوالى در مرحله بهينه سازى و Set up غلظت مناسب براى پرايمرها 10 پيكومول در ميكروليتر و براى DNA الگو دامنه 12/5-50 نانوگرم در ميكروليتر به دست ا مد. در اين مطالعه از DNA الگو با غلظت 20 نانوگرم در ميكروليتر استفاده شد. با ترسيم منحنى استاندارد بر اساس لگاريتم غلظت DNA و تعداد سيكل هاى واكنش PCR و تعيين شيب ا ن براى هر ژن (نمودار 1 و 2) درصد كارايى و راندمان تكثيرى ژن DSCAM و PMP22 به ترتيب 99/7 درصد و 100 درصد به دست ا مد كه بيانگر صحت و اعتبار روش مقايسه اى سيكل ا ستانه در سنجش نسبى داده هاى كمى Real-Time PCR است y = -3.32x R 2 = MEANCT Liner DNA لگاريتم غلظت سيكل ا ستانه نمودار 1: منحني استاندارد ژن PMP22 براساس لگاريتم غلظت DNA (محور افقى) و تعداد سيكل هاى واكنش PCR (محور عمودى). پس از ا ناليز واكنش رقت هاى متوالى شيب خط (SLOPE) منحنى استاندارد براى ژن 3/32- PMP22 با ضريب تعيين ) 2 R) 0/99 به دست ا مد. در مطالعه حاضر از رنگ فلورسنت SYBR Green I به عنوان ا شكارساز استفاده شد كه به طور غيراختصاصى به مولكول DNA دو رشته اى متصل مى شود. بنابراين جهت تعيين تكثير اختصاصى قطعات ژنى مورد نظر عدم وجود جفت شدن پرايمرها (پرايمر دايمر) و عدم تكثير قطعات غيراختصاصى براى هر واكنش تكثيرى منحنى ذوب يا منحنى تفكيك Curve) (Dissociation ترسيم شد (نمودار 3). 252 فصلنامه پزشكى ياخته سال دوازدهم شماره 2 تابستان

5 تشخيص سندرم داون با Real-Time PCR C A B 27.0 y = -3.32x R = Series Liner DNA لگاريتم غلظت سيكل ا ستانه نمودار 2: منحني استاندارد ژن DSCAM براساس لگاريتم غلظت DNA (محور افقى) و تعداد سيكل هاى واكنش PCR (محور عمودى). پس از ا ناليز واكنش رقت هاى متوالى شيب خط (SLOPE) منحنى استاندارد براى ژن 3/33- DSCAM با ضريب تعيين ) 2 R) 0/99 به دست ا مد. علاوه بر اين محصولات PCR هر ژن در ژل الكتروفورز بارگذارى شد كه تصوير ژل الكتروفورز باندهاى مربوط به تكثير اختصاصى قطعات مورد نظر را تاييد نمود (شكل 1). دما (سانتي گراد) مشتق رنگ فلورزسنت نمودار 3: منحنى تفكيك (ذوب) كه بر اساس دما (محور افقى) و مشتق سيگنال فلورسنت دريافتى دستگاه Real-Time PCR (محور عمودى) ترسيم مى شود. A منحنى تفكيك ژن مرجع PMP22 را نشان مى دهد كه قطعه تكثيرى مورد نظر در دماى 76 درجه سانتى گراد دناتوره مى شود. B منحنى تفكيك ژن هدف DSCAM است كه قطعه تكثيرى مورد نظر در دماى 80 درجه سانتى گراد دناتوره مى شود. C بيانگر عدم جفت شدن پرايمر (پرايمر دايمر) است. سطح زير منحنى بيانگر ميزان محصولات تكثيرى حاصل از PCR است. 1.0e e e e e e e-005 DSCAM PMP22 تغييرات فلورسانس 1.0e e چرخه PCR شكل 1: الكتروفورز محصولات تكثيرى ژن هاى PMP22 و DSCAM طى برنامه Real-Time PCR ذكر شده در بخش روش ها روى ژل ا گارز يك درصد. چاهك 1 واكنش NTC (واكنش فاقد DNA الگو) و باند چاهك هاى 2 و 3 محصولات تكثيرى ژن مرجع PMP22 را نشان مى دهد. طول قطعه تكثيرى 103 جفت باز است. چاهك 4 واكنش NTC و باند چاهك هاى 5 و 6 بيانگر محصولات تكثيرى ژن هدف DSCAM را نشان مى دهد. طول قطعه تكثيرى 99 جفت باز است. چاهك M ماركرهاى نشانگر Markers) (Size با اندازه 100 جفت بازى را نشان مى دهد. در واكنش Real-Time PCR منحنى هاى تكثيرى مربوط به واكنش هاى سه تايى هر ژن (هدف و مرجع) به طور كامل با يكديگر هم پوشانى داشتند. منحنى هاى تكثيرى ژن هدف و مرجع در فرد نرمال (نمودار 4) و تريزومى 21 (نمودار 5) نشان داده شده است كه اختلاف موجود به اندازه نيم سيكل ا ستانه (Ct) و يا به عبارتى بيانگر حضور يك كپى اضافى از ژن DSCAM در افراد مبتلا به سندرم تريزومى 21 است. در ا ناليز نسبى داده هاى كمى حاصل از Real-Time PCR با روش مقايسه اى سيكل ا ستانه (ΔΔCt) و فرمول نسبت تعداد كپى ژن هدف به ژن مرجع ) -ΔΔCt (DSCAM/PMP22 ratio=2 در افراد كنترل نرمال و بيماران مبتلا به سندرم تريزومى 21 به ترتيب ± 0/10 1/01 و ± 0/18 1/48 (نمودار 6) با value<0/001 p به دست ا مد كه اختلاف معنى دار ا مارى بين دو گروه مورد مطالعه را نشان مى دهد (جدول 2). نمودار 4: منحنى تكثيرى ژن (Ct=26.24) DSCAM و PMP22 و (Ct=26.24) در فرد كنترل نرمال. هر دو منحنى همپوشانى داشته و اختلافى را نشان نمىدهند. محور افقى بيانگر تعداد چرخههاى PCR و محور عمودى بيانگر Rn يا اختلاف رنگ فلورسنت دريافتى توسط دستگاه Real-Time PCR از رنگ زمينه است (رنگ فلورسنت زمينه=.( Rn=Rn + -Rn Rn + = كل رنگ فلورسنتى دريافتى -Rn و- 1.0e e e e e e e چرخه PCR DSCAM PMP22 تغييرات فلورسانس نمودار 5: منحنى تكثيرى ژن (Ct=25.31) DSCAM و (Ct=25.85) PMP22 در بيمار مبتلا به سندرم تريزومى 21. اختلاف منحنى تكثيرى ژن DSCAM و PMP22 به اندازه نيم سيكل ا ستانه است. (محور افقى تعداد سيكل هاى PCR و محور عمودى Rn را نشان مى دهد. رنگ فلورسنت زمينه = -Rn كل رنگ فلورسنتى دريافتى.(ΔRn= Rn + -Rn - +Rn= Yakhteh Medical Journal, Vol 12, No 2, Summer

6 كامياب و همكاران 2 P value < ratio=2 -ΔΔct 1 0 DS NR نمودار 6: نسبت تعداد كپى هاى ژن DSCAM به ژن PMP22 در افراد بيمار مبتلا به سندرم تريزومى (DS) 21 و افراد نرمال (NR) به ترتيب ± 0/18 1/48 و ± 0/10 1/01 با < 0/001 value p به دست ا مد كه اختلاف معنى دار ا مارى بين دو گروه مورد مطالعه را تاييد نمود..جدول 2: نسبت ژنى DSCAM/PMP22 در لنفوسيت هاى افراد بيمار و نرمال نوع نمونه سندرم داون نرمال تعداد Student s t test p value>0/001 Mean ± SD 1/84 ± 0/81 1/10 ± 0/ هم چنين نتايج حاصل با تكنيك ا ناليز كروموزومى سيتوژنتيك (كاريوتيپ G باندينگ) و تكنيك مولكولى QF-PCR مقايسه و مورد تاييد قرار گرفت. بحث در اين مطالعه از تكنيك بسيار حساس و دقيق Real-Time PCR كمى براى سنجش تعداد كپى هاى ناحيه اساسى كروموزوم 21 استفاده شد. به طور كلي در 99 درصد افراد مبتلا به سندرم داون (سندرم تريزومى 21) از ژن هاى واقع بر ناحيه اساسى Region) (Down Syndrome Critical سه نسخه و در افراد نرمال تنها دو نسخه وجود دارد. از اين رو ژن DSCAM به عنوان ژن هدف واقع در ناحيه اساسى كروموزوم (21q22.2) 21 و ژن PMP22 به عنوان ژن مرجع واقع بر روى كروموزوم 17 DSCAM/ انتخاب شد. در مطالعه حاضر نسبت ژنى (17p11.2) PMP22 در نمونه هاى بيمار مبتلا به سندرم تريزومى (DS) 21 و گروه كنترل نرمال (NR) به ترتيب ± 0/18 1/48 و ± 0/10 1/01 value<0/001) p) محاسبه گرديد كه بيانگر حضور سه كپي (نسخه) از كروموزوم 21 در گروه بيماران و دوكپى از اين كروموزوم در افراد نرمال است. نتايج حاصل از تكنيك Real-Time PCR با روش هاي استاندارد متداول شامل ا ناليز كروموزومي سيتوژنتيك (كاريوتيپ G باندينگ) و تكنيك مولكولى QF-PCR تاييد گرديد. از روش Real-Time PCR در سنجش ميزان بيان ژنى (18) و سنجش تعداد كپى (5 9) در تشخيص پيش از تولد سندرم تريزومى 21 استفاده شده است. در مطالعه هو و همكاران (9) از پروب هاى فلورسنت Taq-Man در تكنيك Real-Time PCR بر نمونه هاى خون و مايع ا منيون استفاده شده است هم چنين ژن (GAPDH) Glyceraldehyde 3-Phosphat Dehyrogenase به عنوان مرجع و ژن (Down Real-Time PCR3) DSCR3 به عنوان ژن هدف واقع بر كروموزوم 21 انتخاب شده است. ژن GAPDH يك ژن خانه دار Gene) (Housekeeping است كه در مطالعات سنجش بيان ژنى استفاده مى شود و تغييرات بيان ژن هدف را نسبت به ا ن مى سنجند. اين ژن داراى تعداد زيادى ژن هاى كاذب Genes) (Pseudo در نواحى ديگر ژنوم مى باشد. بنابراين استفاده از اين ژن در مطالعات ژنوميك و سنجش تعداد كپى مناسب نمى باشد. انتخاب ژن مرجع در مطالعات سنجش تعداد كپى اهميت بسيارى دارد زيرا تعداد كپى هاى ژن هدف نسبت به اين ژن مقايسه و محاسبه مى گردد. از اين رو در مطالعه حاضر ژن PMP22 به عنوان مرجع انتخاب گرديد زيرا هر گونه تغيير در تعداد كپى به صورت حذف يا مضاعف شدن به ترتيب منجر به بيمارى Hereditary Neuropathy with Liability to Pressure Palsies Charcot-) مي شود و شاركوت-مارى توث نوع A1 (HNPP) (Marie Tooth Type 1A.(19) در مطالعه يانگ و همكاران (5) ژن S100B و نشانگر مولكولى D21S167 به عنوان ژن هاى هدف و ژن فاكتور رشد شبه انسولينى نوع Growth) 1 Insulin-like (Factor 1 كه يك ژن خانه دار است به عنوان ژن مرجع انتخاب شده است. در اين مطالعه نيز از پروب هاى فلورسنت Taq-Man استفاده شده است و نسبت تعداد كپى ژن S100B به ژن مرجع ratio) (S100B/IGF-1 در نمونه هاى خون NR و DS به ترتيب ± 0/1 6/4 و ± 2/1 6 /15 و در نمونه هاى مايع ا منيون به ترتيب ± 2/5 6/3 و ± 7/0 19/1 هم چنيننسبت تعداد كپىنشان گر مولكولى D21S167 به ژن مرجع ratio) (D21S167/IGF-1 در نمونه هاى NR و DS به ترتيب 2/3 ± 0/4 و ±0 8/ 6/1 و در نمونه هاى نرمال مايع ا منيون و جنين هاى مبتلا به سندرم تريزومى 21 به ترتيب ± 1/1 3/0 و 7/0 ± 2/5 بيان شده است. در كاريوتيپ افراد مبتلا به سندرم تريزومى 254 فصلنامه پزشكى ياخته سال دوازدهم شماره 2 تابستان

7 تشخيص سندرم داون با Real-Time PCR 21 و افراد نرمال به ترتيب سه و دو كپى از كروموزوم 21 حضور دارد. از نظر تي ورى نسبت ژن هاى مستقر بر كروموزوم 21 در افراد داون نسبت به افراد نرمال 1/5 برابر است. بر اين اساس نتايج مطالعه يالي هو و همكاران مشابه با مطالعه حاضر بوده و يكديگر را تاييد نمودند اما نتايج مطالعه يانگ و همكاران به طور كامل متفاوت است به گونه اى كه نسبت هاى به دست ا مده با نسبتهاى مورد انتظار (1/5 برابر) هماهنگى ندارد. در تشخيص پيش و بعد از تولد بيماري سندرم داون از روش هاي متفاوتي استفاده مي شود در حال حاضر از روش هاي ا ناليز كروموزومى سيتوژنتيك (كاريوتيپ) و FISH به عنوان روشي استاندارد در تشخيص پيش از تولد سندرم تريزومى 21 استفاده مي شود. اين روش ها دقت زيادي به كار رفته اما با اين وجود از نظر كلينيكي بسيار كاربر پرهزينه و زمان بر هستند هم چنين به سلول زنده جهت كشت سلولى نياز دارند. پس از اتمام پروژه ژنوم انسان و ابداع تكنيك واكنش زنجيره پليمراز روش هاي مولكولي جهت تشخيص و شناسايي ناهنجارى هاى كروموزومى ابداع شدند. در تكنيك HGQ-PCR با تكثير دو ژن همولوگوس مانند فسفوفروكتوكيناز I نوع كبدى واقع بركروموزوم 1 و نوع عضلانى واقع بر كروموزوم 21 تعداد كپى هاى كروموزوم 21 را محاسبه مى كنند. اما به دلايل محدود كننده اين تكنيك به صورت استاندارد و قابل اعتماد پذيرفته نشده است. در حال حاضر از تكنيك مولكولى QF-PCR بر اساس تكثير نشانگرهاى مولكولى STRs در تشخيص پيش از تولد تريزومى 21 استفاده مى شود. اين تكنيك نيازمند يك مرحله پسا تكثيرى Amplification) (Post است كه نياز به دستگاه تعيين توالى (Sequencer) دارد همچنين نشانگرهاى مولكولى STRs در جمعيت ها و نژادهايى مختلف پلى مورفيك (چند شكلى) مى باشد. نتيجه گيرى تكنيك Real-Time PCR يكي از جديدترين روش هاي مولكولي است كه قادر است با دقت زياد حساسيت بالا و در مدت زمان بسيار كم نمونه هاي زيادى را به طور هم زمان و بدون نياز به سلول هاى زنده ا ناليز نمايد. بنابراين مى توان از اين تكنيك به عنوان روشى دقيق قابل اعتماد و با حساسيت بالا در تشخيص سندرم تريزومى 21 استفاده نمود. تقدير و تشكر از بيماران خانواده محترم ا نها و از همكاران گرامى در بخش پزشكى مولكولى انستيتو پاستور ايران كه ما را در انجام اين مطالعه يارى نمودند كمال تشكر را داريم. اين مطالعه در قالب طرح پژوهشى در انستيتو پاستور ايران با شماره ثبت طرح 417 و همكارى معاونت پژوهشى دانشگاه علوم پزشكى شهيد بهشتى انجام شده است. References 1. Acar H, Yildirim MS, Kaynak M. Reliability and efficiency of interphase-fish with alpha-satellite probe for detection of aneuploidy. Genet Couns. 2002, 13(1): Li F, Fang W, Wu B, Wang J, Zhong H, Heng W.Molecular cytogenetic detection of trisomy 21 in interphase nuclei and metaphase chromosomes. Chin Med J (Engl). 1999; 112(9): Witters I, Devriendt K, Legius E, Matthijs G, Van Schoubroeck D, Van Assche FA, et al.rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 in 5049 consecutive uncultured amniotic fluid samples by fluorescence in situ hybridisation (FISH). Prenat Diagn. 2002; 22(1): Mansfield ES. Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms. Hum Mol Genet. 1993; 2(1): Yang YH, Nam MS, Yang ES.Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 by real-time quantitative polymerase chain reaction with amplification of small tandem repeats and S100B in chromosome 21. Yonsei Med J. 2005; 46(2): Lee HH, Chang JG, Lin SP, Chao HT, Yang ML, Ng HT.Rapid detection of trisomy 21 by homologous gene quantitative PCR (HGQ-PCR). Hum Genet. 1997; 99(3): Findlay I, Matthews P, Tóth T, Quirke P, Papp Z.Same day diagnosis of Down's syndrome and sex in single cells using multiplex fluorescent PCR. Mol Pathol. 1998; 51(3): Blake D, Tan SL, Ao A. Assessment of multiplex fluorescent PCR for screening single cells for trisomy 21 and single gene defects. Mol Hum Reprod. 1999; 5(12): Hu Y, Zheng M, Xu Z, Wang X, Cui H. Quantitative real-time PCR technique for rapid prenatal diagnosis of Down syndrome. Prenat Diagn. 2004; 24(9): Zimmermann BG, Dudarewicz L. Real-time quantitative PCR for the detection of fetal aneuploidies. Methods Mol Biol. 2008; 444: Hayat No Saeed M KM, Maryami F, Edalat R, Najmabadi H, Zeinali S. Carrier detection of duchenne muscular dystrophy (DMD) in females using real time PCR. Yakhteh. 2007; 9(1): Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001; 25(4): VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Twentyfive years of quantitative PCR for gene expression analysis. Biotechniques. 2008; 44(5): Wysocki LJ, Sato VL. Panning of lymphocytes. A method for cell selection. Proc Natl Acad Sci USA. 1978; 75(6): Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988; 16(3): Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001; 29(9):e Yuan JS, Reed A, Chen F, Stewart CN Jr. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 2006; 22(7): Bustin SA. Absolute quantification of mrna using Yakhteh Medical Journal, Vol 12, No 2, Summer

8 كامياب و همكاران real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000; 25(2): Kim SW, Lee KS, Jin HS, Lee TM, Koo SK, Lee YJ, Jung SC. Rapid detection of duplication/deletion of the PMP22 gene in patients with Charcot-Marie-Tooth disease Type 1A and hereditary neuropathy with liability to pressure palsy by real-time quantitative PCR using SYBR Green I dye. J Korean Med Sci. 2003; 18(5): فصلنامه پزشكى ياخته سال دوازدهم شماره 2 تابستان