Cloning and sequencing the plasmid encoding Toxoplasma gondii Microneme 3 protein

Transcript

1 Original Article Cloning and sequencing the plasmid encoding Toxoplasma gondii Microneme 3 protein Jafari-Modrek M 1, Ghaffarifar F 1*, Sharifi Z 2, Dalimi-Asl A 1 1- Department of Parasitology, Faculty of Medicine, Tarbiat Modares University of Medical Sciences, Tehran, I.R. Iran. 2- Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, I.R. Iran Abstract: Received May 15, 2011; Accepted July 31, 2011 Background: Toxoplasma gondii, an obligatory intracellular protozoan parasite, causing toxoplasmosis in human and animal with worldwide spread. Microneme 3 (MIC3) protein, a 90 kda parasite factor attaching to the host cells in the beginning of the invasion, is secreted in all stages of parasite development (e.g. sporozoite, tachyzoite and bradyzoite) and also is considered as a potent antigen. Therefore, besides the immunogenicity and the candidacy for vaccine design, the protein is used for diagnostic purposes, as well. The aim of the present study was to transfer MIC3 gene into plasmid vector (PTZ57R/T) for subcloning in eukaryotic and prokaryotic plasmids. Materials and Methods: Toxoplasmia genomic DNA extracted using phenol-chloroform method and MIC3 gene was then amplified by PCR with specific primers. Electrophoresis was performed by using agarose gel and PCR product was purified by T4 DNA ligase enzyme into a cloning vector. Finally, recombinant plasmid was transformed into E.coli (Top10 strain). The extracted clone was verified with PCR, digestion enzymes and sequencing. Results: The PCR product was seen as a 1052bp band in agarose gel (1%). The recombinant plasmids was restricted by HindIII and EcoRV enzymes and two obtained 2886 and 1052bp bands showed that the MIC3 gene was cloned in PTZ57R/T plasmid. Conclusion: The results revealed that the cloning and transformation of MIC3 gene in ptz57r/t was done successfully. Keywords: Toxoplasma gondii, MIC3, Cloning, Sequencing * Corresponding Author. ghafarif@ modares.ac.ir Tel: Fax: Conflict of Interests: No Feyz, Journal of Kashan University of Medical Sciences, Autumn, 2011; Vol. 15, No 3, Pages Please cite this article as: Jafari-Modrek M, Ghaffarifar F, Sharifi Z, Dalimi-Asl A. Cloning and sequencing the plasmid encoding Toxoplasma gondii Microneme 3 protein. Feyz 2011; 15(3):

2 كلونينگ و توالي يابي پلاسميد كد كننده پروتي ين ميكرونم (MIC3) 3 توكسوپلاسما گوندي خلاصه 1 محمد جعفري مدرك فاطمه غفاري فر 3 *2 زهره شريفي 4 عبدالحسين دليمي اصل سابقه و هدف: توكسوپلاسما گوندي انگل تكياخته درون سلولي اجباري و عامل توكسوپلاسموزيس در انسان و حيوانات بوده كه در سراسر جهان انتشار دارد. پروتي ين ميكرونم (MIC3) 3 با وزن ملكولي 90 كيلو دالتون عامل چسبيدن انگل به سلولهاي ميزبان در آغاز تهاجم است و در تمام مراحل تكاملي از انگل ترشح شده و يك آنتي ژن قوي محسوب ميشود از اين نظر علاوه بر ايمونوژن بودن و كانديد ساخت واكسن در تشخيص نيز كاربرد دارد. هدف از اين تحقيق آماده سازي ژن MIC3 در پلاسميد ناقل جهت سابكلونينگ در پلاسميدهاي يوكاريوت و پروكاريوت است. مواد و روشها: DNA ژنومي توكسوپلاسما با روش فنل-كلروفرم استخراج شد. با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ژن MIC3 ژن مورد نظر با روش PCR تكثير شده و با استفاده از ژل آگارز الكتروفورز گرديد. محصول PCR خالص شده و بهكمك آنزيم T4DNA Ligase بهداخل يك وكتور كلونينگ كلون شد. در نهايت پلاسميد نوتركيب بهداخل E.coli سوش TOP10 ترانسفورم گرديد. با روشهاي PCR و برش آنزيمي و توالي يابي كلون مورد نظرتاي يد شد. نتايج: محصول PCR بهصورت يك باند 1052 جفت باز در ژل آگارز 1 درصد مشاهده گرديد. پلاسميدهاي نوتركيب تحت برش آنزيمي دو آنزيم محدود كننده HindIII و EcoRV قرار گرفت و دو باند 1052 و 2886 جفت باز بهدست آمد كه نشان داد قطعه MIC3 در پلاسميد ptz57r/t كلون شده است. است. نتيجه گيري: نتايج بهدست آمده نشان داد كلونينگ و ترانسفورم ژن MIC3 در پلاسميد ptz57r/t با موفقيت انجام شده واژگان كليدي: توكسوپلاسما گوندي MIC3 كلونينگ توالي يابي فصلنامه علمي پژوهشي فيض دوره پانزدهم شماره 3 پاييز 1390 صفحات مقدمه توكسوپلاسما گوندي gondii) (Toxoplasma تك- ياختهاي با انتشار جهاني است كه طيف وسيعي از مهره داران خون گرم را آلوده ميكند. توكسوپلاسما در افراد با اختلال ايمني (immunocompromised) بهخصوص در مبتلايان به نقص ايمني اكتسابي (ايدز) فرصت طلب بوده و بيماري وخيمي ايجاد ميكند كه عمدتا مغزي بوده و تهديد كننده حيات است. يماري مادرزادي آن تظاهرات خفيف تا شديدي دارد كه در فرم شديد سبب هيدروسفالي يا ميكروسفالي كلسيفيكاسيون مغزي و كوريورتينيت ميگردد [1]. 1 دانشجوي دكتري انگل شناسي گروه انگل شناسي دانشكده علوم پزشكي دانشگاه تربيت مدرس 2 دانشيار گروه انگل شناسي دانشكده علوم پزشكي دانشگاه تربيت مدرس 3 استاديار مركز تحقيقات انتقال خون موسسه عالي آموزشي و پژوهشي طب انتقال خون تهران 4 استاد گروه انگل شناسي و حشره شناسي دانشكده علوم پزشكي دانشگاه تربيت مدرس * نشاني نويسنده مسوول: تهران بزرگراه جلال آل احمد پل گيشا دانشگاه تربيت مدرس گروه انگل شناسي دورنويس: تلفن: پست الكترونيك: ghafarif@ modares.ac.ir تاريخ دريافت: 90/2/25 تاريخ پذيرش نهايي: 90/5/9 بĤلودگي به توكسوپلاسما از شايعترين عفونتهاي انگلي بشر در جهان ميباشد [2]. توكسوپلاسموزيس بهشكل بدون علامت و مزمن در 500 ميليون تا يك ميليارد نفر از جمعيت انساني در جهان وجود دارد [3]. از آنجا كه انتشار اين انگل بسيار وسيع بوده و انتقال آن بهراحتي توسط تمام ميزبانهاي واسط صورت ميگيرد بهنظر ميرسد بهترين راه كاهش زيانهاي ناشي از اين بيماري پيشگيري از ابتلاي انسان و دام به انگل از طريق تهيه داروهاي جديد و يا تهيه واكسن مناسب بر عليه بيماري است. در ايران در مورد تهيه واكسن عليه توكسوپلاسموزيس تحقيقات محدودي شده است. محمودي و همكاران اثر محافظت كنندگي توكسوپلاسما گوندي سويه جدا شده از انسان در ايران (سويه تهران) را در برابر سويه RH در موش سفيد آزمايشگاهي بررسي كردند. براي اين منظور موشهاي سفيد كوچك آزمايشگاهي با سوسپانسيون مغز حاوي كيستهاي توكسوپلاسما سويه تهران بهطور داخل صفاقي آلوده شدند سپس اين موشها با تعداد مختلف از تاكيزوي يتهاي سويه RH در يكي از روزهاي چهارم تا دهم بعد از تزريق با سويه تهران چالش شدند. نتايج نشان داد مقاومت به آلودگي با توكسوپلاسما در موشهايي ديده ميشود كه فاصله زماني بين تزريق 2 سويه در آنها بيشتر باشد [4]. درياني و همكاران در يك 201

3 ه ب جعفري مدرك و همكاران مطالعه تاكيزوي يتهاي توكسوپلاسما گوندي را در محيط كشت غير سلولي (1640 (RPMI كشت دادند محيط رويي كشت جمعآوري شده و به ستون كروماتوگرافي تعويض يوني اضافه شد. در نهايت دو فراكشن ESA-F1 و ESA-F2 دست آمد. براي ايمن سازي موشها 50 موش در 5 گروه 10 تايي بررسي شدند. گروههاي يك تا چهار به ترتيب دوبار با آنتي ژن دفعي ترشحي (ESA) تام فراكشن (F1) 1 فراكشن (F2) 2 و با آنتيژن ليز شده توكسوپلاسما ايميونيزه شدند. يك گروه نيز بهعنوان گروه شاهد قرار گرفت. نتايج نشان داد كه آنتي ژن ESA تام F1 و F2 در موشهاي ايمن شده منجر به واكنش ) DTH افزايش حساسيت تاخيري) و پاسخهاي تكثير و تمايز لنفوسيت گرديد. تمام موشها شاهد ظرف مدت 10 روز مردند درحاليكه موشها ايمن شده براي مدت طولانيتري زنده ماندند. بيشترين ميزان بقا در موش- هايي مشاهده شد كه فراكشن F2 را دريافت كرده بودند [5]. واكسنهاي زنده خطر عفونت تصادفي و موتانتهاي معكوس مضر غيرقابل پيشبيني براي انسان دارند. براي غلبه بر اين مشكلات تحقيقات اخير بر روي واكسنهاي سابيونيت نوتركيب و واكسنهاي DNA انجام شده كه اين نوع از واكسنها آينده بسيار روشني را براي پيشگيري از بيماري توكسوپلاسموزيس اراي ه كرده است [6]. صلح جو و همكاران واكسن DNA را با استفاده از ژن SAG1 براي ايمنسازي عليه توكسوپلاسما گوندي انجام دادند كه ميزان بقاي موشهاي ايمن شده بيش از موشهاي گروه شاهد بود [7]. از جمله كانديدهاي مناسب براي تهيه واكسن آنتيژنهاي ميكرونمايي هستند. ميكرونمها تعداد زيادي پروتي ينهاي عبوري از عرض غشاء و محلول بنام MIC ترشح ميكنند كه در مراحل اوليه تهاجم نقش اساسي دارند. از پروتي ينهاي اصلي ميكرونم آنتي ژن MIC3 (پروتي ين شماره 3 ترشح شده از اندامك ميكرونم توكسوپلاسما گوندي ميباشد) را ميتوان نام برد كه با داشتن گيرندههاي خارجي نقش مهمي را در شناسايي اوليه سلولهاي ميزبان وآغاز تهاجم ايفا ميكند [8]. MIC3 با شناسايي سلول ميزبان شرايط را براي ورود س ر خوردن و تهاجم انگل فراهم مي- كند. MIC3 بهعنوان يك آنتيژن عمده توكسوپلاسما گوندي شناخته شده و از اينرو بهعنوان يك كانديد موثر با پتانسيل قوي براي تهيه واكسن در نظر گرفته شده است [9]. MIC3 از اسپروزوي يتها براديزوي يتها و تاكيزوي يتها ترشح ميشوند و در تمام مراحل زندگي انگل بيان ميشوند از اينرو بهعنوان يك آنتيژن با كارآيي بالا ميتوان در ارزيابي آنتيباديهاي بدن افراد مبتلا و تستهاي تشخيصي كاربرد داشته باشد [9]. ژن كدكننده MIC3 بهصورت تكنسخه و فاقد اينترون است [10]. هدف از اين كار آماده سازي ژن MIC3 در پلاسميد ناقل براي ساب كلونينگ در پلاسميدهاي يوكاريوتيك و پروكاريوتيك است. مواد و روشها در اين تحقيق ابتدا مايع صفاقي حاوي تاكيزوي يت انگل سوش RH توكسوپلاسما گوندي بهطور داخل صفاقي به 5 سر موش Balb/c ماده تلقيح گرديد. 3-4 روز بعد موشها كشته شده و مايع صفاقي موشهاي آلوده بهوسيله سرنگهاي 5 سيسي يا 10 سي سي جمعآوري شد [11]. استخراج DNA بهروش فنل - كلروفرم انجام شد. 100 ميكروليتر (حدود 10 5) 7 از تاكيزوي يتهاي تغليظشده و شست و شو شده با بافر PBS درون يك ويال 1/5 سيسي ريخته شده و با 900 ميكروليتر بافر ليز مخلوط شد. بهمنظور ليز شدن تاكيزوي يتها 10 ميكروليتر پروتيناز 55 C به ويال اضافه شده و به-مدت دو ساعت در بنماري K قرار داده شد. با استفاده از اسپكتروفتومتر و روش جذب نوري غلظت DNA در طول موج 260 نانومتر اندازهگيري گرديد. مي- توان DNA استخراج شده را تا مرحله بعدي در 20- درجه سانتي گراد نگهداري كرد [12]. بهمنظور طراحي پرايمرهاي Forward (جلويي) و Reverse (برگشتي) ابتدا توالي DNA ژن كدكننده MIC3 از اطلاعات بانك ژني از سايت اينترنتي http// با شماره AJ بهدست آمد. سپس با استفاده از اين اطلاعات و به كمك نرم افزار GenRuner جفت پرايمرها بهصورت زير طراحي شدند: F: 5 -CACA AGCTTATGGCGCTCACCTTCATGGGGG-3 محل اثر آنزيم Hindш R: 5 -ACAGAT ATCTCACGTCACGGTGTGGGCATGGT-3 محل اثر آنزيم EcoRV پرايمر جلويي داراي 31 نوكلي وتيد و شامل جايگاه شناسايي برش آنزيمي Hindш بوده و پرايمر برگشتي داراي 32 نوكلي وتيد و شامل جايگاه شناسايي برش آنزيمي EcoRV ميباشد. محصول واكنش PCR در حجم 25 ميكروليتر تهيه شد كه شامل تركيبات زير بود: 2/5 ميكروليتر بافر 0/75 10x ميكروليتر كلريد منيزيوم 50 ميليمولار 0/5 ميكروليتر 10dNTP ميليمولار 0/5 ميكروليتر DNA پليمراز (Taq DNA polymerase) Taq 3 ميكروليتر DNA استخراج شده) 1 ميكروليتر از هر يك از پرايمرها (10 پيكو مول در ميكروليتر) و 15/75 ميكروليتر.ddH2O مواد فوق درون ويال ريخته شد و پس از همزدن در داخل دستگاه ترموسايكلر قرار داده شد. ژن MIC3 بهوسيله PCR طي 35 سيكل طبق برنامه Initial Denaturation بهمدت 5 دقيقه در 202

4 توكسوپلاسما گوندي MIC3 كلونينگ و توالي يابي... دماي 94 درجه سانتيگراد Denaturation بهمدت يك دقيقه در دماي 94 درجه سانتيگراد Annealing بهمدت 30 ثانيه در دماي 56 درجه سانتيگراد Extention بهمدت يك دقيقه در دماي 72 درجه سانتيگراد و Final Extention بهمدت 5 دقيقه در دماي 72 درجه سانتيگراد تكثيرگرديد. در نهايت جهت بررسي محصول 100bp برروي ژل آگارز 1 درصد همراه با م اركر PCR الكتروفورز شد. در اين مطالعه بهمنظور كلونينگ ژن MIC3 از كيت كلونينگ InsT/A clonetm PCR product clonin Kit شركت Fermentas ساخت ليتواني استفاده گرديد. واكنش اتصال با استفاده از 3 ميكروليتر از بافر Ligation 10X 1-5 واحد از 15 (PTZ57R/T)Vector ميكروليتراز 3 T4 DNALigase ميكروليتر از (DNA) Insert و حدود 30 ميكروليتر ddh2o انجام شد. مواد فوق در يك لوله ميكروفيوژ 0/5 ميكروليتري ريخته شده و بهمدت يكساعت در دماي 22 درجه سانتيگراد و پس از آن بهمدت يكشب در دماي 4 درجه سانتيگراد انكوبه گرديد. ترانسفورم پلاسميد بهداخل باكتري بهكمك روش شوك حرارتي انجام شد كه بهطور خلاصه بيان ميشود: باكتري در مرحله اول بهكمك روش كلريد كلسيم مستعد شده و سپس كل محصول حاصل از واكنش اتصال به آن اضافه گرديد. مخلوط فوق بهآرامي و بدون استفاده از Vortex تركيب شده و بهمدت 20 دقيقه در يخ انكوبه گرديد. پس از آن بهمدت 90 ثانيه در بن ماري 42 درجه سانتيگراد شوك حرارتي داده شد سپس مخلوط بهمدت 2 دقيقه در يخ قرار گرفت. 500 ميكروليتر محيط( Bertani LB (Luria مايع بدون آنتي بيوتيك به مخلوط اضافه شده و بهمدت 60 دقيقه در انكوباتور شيكردار در 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد. پس از طي اين مدت ميتوان باكتريها را در محيط حاوي آنتيبيوتيك آمپيسيلين كشت داد. براي بررسي وجود يا عدم وجود قطعه مورد نظر اين باكتريها در محيط كشت حاوي آمپيسيلين سوبستراي Isopropylβ-D1-) همراه با يك القاء كننده آنزيم يعني X-Gal IPTG (thiogalactopyranoside كشت داده شدند. كلونيهاي فاقد پلاسميد نوتركيب كه در آنها بتاگالاكتوزيداز سنتز شده -X Gal را تجزيه كرده و سبب توليد ايندوليل شده كه رنگ آن آبي است و كلونيها را آبي ميكند. اما كلونيهاي حاوي پلاسميد نوتركيب چون فاقد آنزيم بتاگالاكتوزيداز هستند نميتوانند -X Gal را تجزيه كنند بنابراين كلوني آنها سفيد ميباشند. در زير هود و در شرايط استريل مقدار ميكروليتر سلولهاي ترانسفورم شده به يك پليت حاوي X-Gal و IPTG اضافه شده و به كمك ميله شيشهاي در تمام نقاط پليت پخش شد. پليتها به- صورت وارونه و بهمدت يك شب (16-18 ساعت) در 37 درجه سانتيگراد انكوبه شد. سپس بهمدت چند ساعت در دماي 4 درجه سانتي گراد قرار داده شد تا كلونيهاي سفيد يا آبي ظاهر شوند [12]. پلاسميدها بر اساس دستورالعمل كيت شركت سازنده (Fermentas) از كلونيهاي سفيد و آبي استخراج شد. سپس روي ژل آگارز با يكديگر مقايسه شدند. پلاسميدهاي موجود در كلونيهاي سفيد بهعلت وجود قطعه كلون شده در آن سنگينتر از كلونيهاي آبي هستند [12]. براي تعيين توالي قطعه كلون شده در پلاسميد PTZ57R/T ابتدا پلاسميدهاي موجود در كلونيهاي سفيد با استفاده از كيت شركت Fermentas مطابق دستورالعمل شركت سازنده كيت استخراج شده و براي تعيين توالي ارسال گرديدند. تعيين توالي قطعه كلون شده در پلاسميد PTZ57R/T بهوسيله شركت ژن فناوران انجام گرديد و بهكمك سايت اينترنتي از نظ ر تشابهات و تفاوتها با سويه RH استاندارد توكسوپلاسما گوندي در بانك ژني مقايسه شد. نتايج نتايج PCR به كمك DNA ژنومي نتايج حاصل از واكنش PCR با DNA ژنومي فقط يك باند حدود 1052 جفت باز روي ژل آگارز نشان داد كه هماندازه ژن MIC3 توكسوپلاسما گوندي است و هيچ ژن ديگري غير از آن تكثير نشده بود بنابراين پرايمرهاي طراحي شده جهت تكثير ژن MIC3 اختصاصي بودند (شكل شماره 1). شكل شماره 1- الكتروفورز محصول PCR استخراج DNA ژنومي روي ژل آگارز 0/8 درصد ستون شماره 1 ماركر 100 جفت باز ستون شماره 2 و 3 قطعه MIC3 اندازه 1052 جفت باز نتايج ترانسفورماسيون باكتريها با محصول واكنش اتصال ظهور كلوني باكتريها (كلونيهاي سفيد و آبي) روي محيط LB حاوي آنتيبيوتيك آمپي سيلين و آغشته به X-Gal وIPTG نشان دهنده 203

5 جعفري مدرك و همكاران تران سفورماسيون موف ق پلاس ميد در ب اكتريه ا ب ود. بيش از 95 درصد كلونيها كلونيهاي سفيد بود كه نشان داد قطعه ژني حاصل از PCR توسط پلاسميد TTZ57R/ p دريافت گرديده و پلاسميدهاي نوتركيب ptmic3 تشكيل شدهاند. مقايسه پلاسميدهاي استخراج شده از كلونيهاي سفيد و كلوني- هاي آبي بعد از PCR بر روي ژل آگارز نشان داد كه هر دو پلاسميد سه باند تشكيل دادهاند. باندها بهترتيب از بالا به پايين عبارتن د: حلق وي ب از (OpenCircular) خط ي (Linear) و سوپركويل.(Supercoil) باندهاي پلاسميد ptmic3 در مقايسه با پلاسميد كلونيهاي آبي بر روي ژل آگارز بالاتر قرار داشتند. ميتوان استنباط كرد كه پلاسميدهاي استخراج شده از كلونيهاي سفيد از پلاسميدهاي استخراج شده از كلونيهاي آبي سنگينتر هستند بنابراين ميتوان نتيجه گرفت كه قطعه MIC3 در پلاسميد ptz57r/t كلون شده است (شكل شماره 2). شكل شماره 3- الكتروفورز محصول Coloni PCR روي ژل آگارز 1 درصد ستونهاي و 5 : محصول PCR به دست آمده از كلونيهاي حاوي پلاسميد نوتركيب (1052 جفت باز) ستون 3: محصول PCR بهدست آمده از كلونيهاي آبي ستون آخر: ماركر 100 جفت باز نتايج برش آنزيمي پلاسميد نوتركيب ptmic3 نتايج برش آنزيمي ptmic3 با آنزيمهاي HindIII و EcoRV دو باند نشان داد كه يكي حدود 2886 جفت باز بود و باند ديگر حدود 1052bp كه هم اندازه قطعه MIC3 است و كلونينگ تاييد شد (شكل شماره 4). شكل شماره 2- نتايج الكتروفورز پلاسميدهاي استخراج شده از كلونيهاي سفيد روي ژل آگارز 1 درصد ستون هاي 1 و 2: پلاسميد نوتركيب ptmic3 ستون 3: ماركر 100 جفت باز با تاييد كلون نوتركيب كلونيهاي مذكور كشت داده شد. سپس پلاسميدها استخراج شدند (شكل شماره 3). شكل شماره 4- برش آنزيمي پلاسميد ستون: 1 ماركر 100 جفت باز ستون Mono Digest ستون :3 Double Digest :2 1 acaagcttat ggcgctcacc ttcatggggg ccgtgtggat gtgcacccca gcggaggctt tgccgattca aaagtctgtg cagctgggca gctttgacaa 101 agttgtgccg agccgcgaag tcgtctctga gagtcttgct ccgtctttcg cggtgactga gactcactcg tctgtgcaat cccccagcaa ggaggagacg 201 cagctctgtg ctatctcgag tgaaggcaag ccatgtcgaa accgtcagtt gcacactgac aacgggtact tcatcggggc cagttgcccc aagagcgctc 301 gctgcagcaa gaccatgtgc ggccccggcg gctgcggaga attctgctcc agcaactgga ttttttgcag cagttcgctc atctaccatc ctgacaaaag 401 ctatggagga gaccgcagct gtgaaaagca gggccatcgg tgcgacaaaa acgcagaatg cgtcgaaaac ttggacgcg gtgggggtgt gcactgcaag 501 tgcaaagacg gcttcgtcgg cactgggttg acttgctccg aggatccttg ttcaaaaaga gggaacgcga agtgcggacc caacgggacg tgcatcgtcg 601 tcgattcagt cagctacaca tgcacctgcg gcgacggcga gactctagtg accctcccgg aagggggaca aggatgcaag aggactggat gtcatgcctt 701 cagggagaac tgcagccct gtagatgtat tgatgacgcc tcgcatgaga atggctacac ctgcgagtgc cccacagggt actcacgtga ggtgacttcc 801 aaggcggagg agtcgtgtgt ggaaggagtc gaagtcacgc tggctgagaa atgcgagaag gagttcggca tcagcgcgtc atcctgcaaa tgcgataacg 901 gatactccgg atctgcttcc gcaacctccc accatgggaa aggagaatcg ggatccgagg ggagcttgag tgaaaaaatg aatattgtct tcaagtgccc 1001 cagtggctac catccaagat accatgccca caccgtgacg tgagatatct gt شكل شماره 5- نتايج تعيين توالي ژن پروتي ين ميكرونم (MIC3) 3 توكسوپلاسما گوندي سويه RH 204

6 توكسوپلاسما گوندي MIC3 كلونينگ و توالي يابي... نتايج تعيين توالي نتايج حاصل از تعيين توالي ژن MIC3 در پلاسميد ptz57r/t نشان داد كه اين ژن با ژن MIC3 توكسوپلاسما گوندي سويه RH داراي شماره AJ در بانك ژني حدود 98 درصد تشابه دارد (شكل شماره 5). بحث مطالعه حاضر نشان داد پلاسميد ptz57r/t براي كلون كردن ژن MIC3 مناسب است. در اين تحقيق آناليز توالي ژن MIC3 توكسوپلاسما گوندي در پلاسميد ptz57r/t نشان داد قطعه 1052 جفت بازي در اين پلاسميد كلون شده و هيچ اينتروني در ژن مذكور ديده نشد. اين ژن با سويه RH توكسوپلاسما گوندي با شماره AJ در بانك ژني داراي 98 درصد تشابه بود همچنين با دو سويه ديگر توكسوپلاسما گوندي با شمارههاي EU و AF نيز حدود 98 درصد شباهت داشت كه اين شباهتها حاكي از حفظ توالي ژن در سويههاي گوناگون توكسوپلاسما گوندي است. در اين تحقيق از پروتي ين كد كننده ژن MIC3 استفاده گرديد. اين ژن به- دليل داشتن گيرندههايي كه هم به سلول ميزبان و هم به انگل مي- چسبد در شناسايي اوليه سلولهاي ميزبان در آغاز تهاجم انگل نقش مهمي دارد [10] از اينرو جهت طراحي ساخت واكسن اميد محققين به اين ژن مي باشد زيرا معتقدند كه جهت مصون بودن از آثار زيانبار انگل توكسوپلاسما گوندي بايستي در مرحله اوليه تهاجم انگل ميزبان را بهوسيله ايمني زايي با پروتي ينهايي نظير پروتي ين ميكرونمي و القاي پاسخهاي ايمني تجهيز كرد. از اين جهت مطالعه ما نيز مانند ساير مطالعات محققين كه در جهان انجام ميگيرد روي ژن MIC3 متمركز بود. در بخش كلونينگ مطالعه ما كه اولين قدم مطالعه محققان در سراسر جهان ميباشد نتايج به- دست آمده حاكي از شباهتهايي است كه ساير محققان انجام دادند. تفاوت از نظر نوع پلاسميد و سويه باكتري E.coli ميباشد كه در مطالعههاي مختلف متفاوت است. در مطالعه ما از پلاسميد كلونينگ ptz57r/t استفاده شد كه در سال 1992 ميلادي Kaluz و همكاران جهت كلونينگ معرفي كردند [13]. از اين پلاسميد در كلونينگ ژنهاي متعددي استفاده شده ولي براي اولين بار است كه جهت ژن MIC3 استفاده ميشود. نتايج آزمايش كلونينگ براي اين ژن نشان ميدهد كه اين پلاسميد نيز جهت كلون كردن ژن MIC3 مناسب ميباشد. در مورد ترانسفورم سويه باكتري نيز از سويه TOP10 باكتري E.coli استفاده گرديد و پيشنهاد ميشود كه TOP10 سويه مناسبي جهت ترانسفورم است. Ismael و همكاران در سال 2003 در تحقيقاتشان از پلاسميد pgm-csf و ژن MIC3 استفاده كردند و به اين نتيجه رسيدند كه در مرحله حاد عفونت توكسوپلاسموزيس اين پلاسميد نوتركيب بهخوبي عمل ميكند ولي در مرحله مزمن بايد ژن MIC3 با ساير ژنهاي توكسوپلاسما گوندي فيوژن گردد [9]. (MIC3) و همكاران توانستند پروتي ين شماره 3 ميكرونم Jiang را در پلاسميد pmd18-t كلون كنند آنها سپس اين ژن را در يك وكتور بيانيpcDNA3 سابكلون كردند. و در نهايت توانستند با استفاده از هضم آنزيمي و PCR پلاسميد نوتركيب توليد شده را وارد سلولهاي 2- IBRS ترانسفكت نمايند [14]. Jiang و همكاران با استفاده از پلاسميد نوتركيب rmic3 تست لاتكس آگلوتيناسيون سريع را ابداع كردند. اين تست در سرودياگنوزيس عفونت توكسوپلاسمايي در خوكها كاربرد دارد [15]. Fang و همكاران پاسخ ايمني ناشي از پلاسميد نوتركيب با استفاده از ژن MIC3 را در موشهاي Balb/c بررسي نمودند. آنها به اين نتيجه رسيدند كه ايمني ايجاد شده در اثر تلقيح پلاسميد نوتركيب p SCA/MIC3 محافظت كننده است از اينرو پيشنهاد دادند كه ژن MIC3 جهت ساخت DNA واكسن كانديد موثر و اميدبخش ميباشد [16]. Artama و همكاران پروتي ين شماره 3 ميكرونم (MIC3) را مورد مطالعه قرار دادند. آنها ژن كد كننده MIC3 تاكيزوي يتهاي توكسوپلاسما گوندي را با روش PCR و پرايمرهاي اختصاصي تكثير كردند. سپس قطعه DNA تكثير شده را در پلاسميد pgem-t كلون نموده و داخل E.coli سويه XL-1Blue ترانسفورم كردند. نتايج نشان داد كه ترانسفورم در باكتري مذكور با پلاسميد pgem-t توليد يك كلون كرد كه حاوي ژن كد كننده پروتي ين MIC3 بود ولي نتيجه هضم آنزيميEnzymes Double توليد قطعات كوچك جفت باز كرد كه ناشي از وجود سايتهاي برش زياد بر روي آنزيم محدود كننده است [17]. نتايج كلونينگ مطالعه ما با مطالعات محققان مذكوردر بخشهاي اوليه كلونينگ مشابهت زيادي دارد اما بر خلاف مطالعه Artama در قسمت هضم آنزيمي (برش بهوسيله دو آنزيم (Double Enzymes توليد قطعات كوچك باند ديده نشد كه بهنظر ميرسد Artama در انتخاب نوع آنزيم انتخاب ايدهآلي نكرده است. نتيجه گيري از اين مطالعه نشان ميدهد كلونينگ و حاصل نتايج 205

7 جعفري مدرك و همكاران ترانسفورم ژن MIC3 در پلاسميدpTZ57R/T با موفقيت انجام شده است. بنابراين پلاسميد ptz57r/t و نيز باكتري اشريشياكلي سويه TOP10 جهت كلونينگ و ترانسفورم ژن MIC3 مناسب ميباشند. تشكر و قدر داني مطالب اين مقاله مربوط به بخشي از رساله دوره دكتري دانشگاه تربيت مدرس است و تمامي اعتبارات آنرا دانشگاه مذكور تا مين كرده است. از تمامي اعضاي محترم گروه انگلشناسي پزشكي معاونت محترم پژوهشي دانشكده پزشكي و معاونت محترم پژوهشي دانشگاه تربيت مدرس كمال تشكر و قدرداني به- عمل ميآيد. References: [1] Montaya JG, Liesenfeld O. Toxoplasmosis. Lancet 2004; 363(9425): [2] Satio S, Aosai F, Rikihisa N, Mun HS, Norose K, Chen M, et al. Establishment of gene-vaccinated skin grafting against Toxoplasma gondii infection in mice. Vaccine 2001; 19(15-16): [3] Jung C, Lee CY, Grigg ME. The SRS superfamily of Toxoplasma surface proteins. Int J Parasitol 2004; 34(3): [4] Mahmudi M. Evaluation the effect of Toxoplasma isolated from human in Iran against RH strain in mice. Presented for the [Dissertation]. Tehran. Tehran Medical Sciences University, [in Persian] [5] Daryani A, Zavaran Hosseini A, Dalimi A. Immune response against excreted/ secreted antigens of Toxoplasma gondii tachyzoites in the murine model. Vet Parasitol 2003; 113(2): [in Persian] [6] Bout DT, Mevelec MN, Velge Roussel F, Dimier Poisson I, Lebrun M. Prospect for a human Toxoplasma vaccine. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 2002; 2(3): [7] Solhjoo K, Ghaffari far F, Dalimi Asl A, Sharifi Z. Enhancement of Antibody immune response to a Toxoplasma gondii SAG1 encoded DNA vaccine by formulation with Aluminium Phosphate. J Med Sci 2006; 7(3): [in Persian] [8] Cerede O, Dubremetz JF, Soete M, Deslee D, Vial H, Bout D, et al. Synergistic role of micrinemal proteins in Toxoplasma gondii virulence. J Exp Med 2005; 201(3): [9] Ismael AB, Sekkai D, Colli C, Bout D, Mevelec MN. The MIC3 gene of Toxoplasma gondii is a novel potent vaccine candidate against toxoplasmosis. Infect Immune 2003; 71(11): [10] Garcia-Reguet N, Lebrun M, Fourmaux MN, Mercereau-Puijalon O, Mann T, Beckers CJM, et al. The microneme protein MIC3 of Toxoplasma gondii is a secretory adhesin that binds to both the surface of the host cells and the surface of the parasite. Cell Microbiol 2000; 2(4): [11] Chai JY, Lin A, Shin EH, Oh MD, Han ET, Nan HW, et al. Laboratory passage and characterization of an isolate of Toxoplasma gondii from an ocular patient in Korea. Korean J parasitol 2003; 41(3): [12] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning a laboratory manual. 3 rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; p [13] Kaluz S, Kolble K, Raid KBM. Directional cloning of PCR products using exonuclease III. Nucl Acids Res 1992; 20: [14] Jiang T, Gong D, Ma LA, Nie H, Zhou Y, Yao B, et al. Evaluation of a recombinant MIC3 based Latex agglutination test for the rapid serodiagnosis of Toxoplasma gondii infection in swines. Vet Parasitol 2008; 158: [15] Jiang T, Zhang D, Nie H, Yao B, Zhao J. Construction and expression of the eukaryotic expressed plasmid of MIC3 gene from Toxoplasma gondii in IBRS-2 cells. Front Agric China 2008; 2(4): [16] Fang R, Nie H, Wang Zh, Tu P, Zhou D, Wang L, et al. Protective immune response in BALB/c mice induced by a suicidal DNA vaccine of the MIC3 gene of Toxoplasma gondii. Vet Parasitol 2009; 164: [17] Artama WT, Dewi NNA, Subekti DT. Cloning gene encoding Micronema3 (MIC3) Protein of Tachyzoite Toxoplasma gondii local Isolate. Indonesian Journal of Biotechnology 2005; 10(1):