FLUORO TEST

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1 FLUORO AID-1 TEST Cat. No. 4250E: 40 wells Cat. No. 4250E: 40 puits Art.-Nr. 4250E: 40 Auftragsstellen Cat. No. 4250E: 40 pocillos Cat. n. 4250E: 40 pozzetti Cat. Nº 4250E: 40 poços Aρ. Κατ. 4250E: 40 βυθισμάτων MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi, Japan Tel: Fax : URL

2 - CONTENTS - - CONTENU - - INHALTSVERZEICHNIS - - CONTENIDO - - CONTENUTI - - CONTENDO - - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ - English 1 Français 6 Deutsch 12 Espaňol Italiano 19 Português 24 Ελληνικά 29 Symbols/Symboles/Symbole/Símbolos/Simboli/ Simbolos/Σύμβολα/ 35

3 English English Intended Use The FLUORO AID-1 TEST is intended for detection of anti-mitochondrial antibodies(ama), anti smooth muscle antibodies (ASMA) and anti parietal cell antibodies (APCA) in human serum. This product is only for in vitro diagnostic use. Do not use in human beings. Summary and Explanation It is very useful for the diagnosis of hepatic diseases, in particular, primary biliary cirrhosis (PBC) and active chronic hepatitis, to detect AMA and ASMA. AMA, which had been first reported by Dr. Mackay, was subsequently shown to have a strong specificity to PBC. Though low titer of AMA may be detected in other liver disorders which include chronic active hepatitis, cryptogenic cirrhosis and drug-induced hepatitis, high titers (x40 or more) present only in PBC. Tests for AMA have been recommended as a substitute for surgical exploration of PBC. ASMA was first reported by Dr. Johnson, and shown to have a strong specificity to lupoid hepatitis and active chronic hepatitis. As ASMA are not detected in SLE, it is very useful for differentiation SLE from lupoid hepatitis. It is reported that ASMA titer shows positive in an active stage of the disease and negative in a remissive stage of the disease. APCA are associated with autoimmune gastritis type A (chronic atrophic gastritis) and pernicious anemia in about 90% of patients and helpful in diagnosis. It is reported that APCA shows positive in other autoimmune endocrine diseases such as thyroiditis and insulin dependent diabetes mellitus. Principle The FLUORO AID-1 TEST detects anti-mitochondrial antibodies, anti smooth muscle antibodies and anti parietal cell antibodies by the indirect immuno-fluorescence method. Rat stomach/kidney is used as substrates, and fluorescein isothiocyanate (FITC) is used as fluorescent dye. Materials provided Cat.No.4250E 40wells Rat stomach/kidney Substrate Slide 4 wells x 10 slides FITC conjugated goat anti-human immunoglobulins containing 2% BSA and 0.09% sodium azide PBS Buffer 4.5 ml x 1 vial 9.1g (for 1000ml) x 5 bags AMA Positive Control Serum Human serum (AMA positive) containing 2% BSA, 0.09% sodium azide ASMA Positive Control Serum Human serum (ASMA positive) containing 2% BSA, 0.09% sodium azide 0.5 ml x 1 vial 0.5 ml x 1 vial 1

4 English APCA Positive Control Serum Human serum (APCA positive) containing 2% BSA, 0.09% sodium azide Mounting Medium Grycerol with Carbonate buffer containing 0.3% Trichloro Acetic Acid Cover Slip Blotting Paper 0.5 ml x 1 vial 3.0ml x 1 vial 10 pcs 20 pcs Materials required but not provided 500ml Beaker, Wash bottle, Magnetic stirrer, Moisture chamber, Staining basket, Distilled or deionized water, Fluorescent microscope equipped with blue excitation filter unit Precautions (1) Each positive control serum is derived from human serum, in which HBs antigen, HIV antibody and HCV (HIV-1 and HIV-2) antibodies has not been detected. However, it is strongly recommended that all clinical specimens and materials should be handled as if they are capable of transmitting infectious diseases. (2) FITC-conjugated antibody and positive control serum contain sodium azide (0.09%) as a preservative and must be handled with caution - do not ingest or allow contact with skin or mucous membranes. Sodium azide may react with copper or lead in plumbing system to form explosive metal azides. Therefore, always flush with plenty of water when disposing materials containing sodium azide into a drain. (3) Some kit components contain animal origin materials, which are from non-infectious animals. These components, however, should be treated as potential biohazards in use and for disposal. (4) Mounting medium contains 0.3% trichloroacetic acid which is harmful to aquatic organisms and may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. This material and its container must be disposed of as hazardous waste. Storage and Stability All kit components must be stored at 2-8 C. All reagents are stable for 12 months after manufacturing when stored at 2-8 C. Procedure 1) Preparation of reagent Bring substrate slides to room temperature prior to unsealing, in order to avoid moisture. *Seal unused glass slides together with desiccant tightly in order to keep them dry during storage. Prepare PBS by dissolving 1 bag of PBS powder in 1000ml of distilled water. *Do not dilute the other kit components which are ready-for-use. 2) Preparation of samples Use fresh patient sera. 2

5 English a) Qualitative analysis: Dilute patient sera 1:20 with PBS. b) Quantitative analysis: In the case of patient sera which were positive in the qualitative analysis, make serial dilutions of screening samples. (i.e. 1:40, 1:80, 1:160, 1:320) *Do not repeat freezing and thawing of patient serum samples. This might result in decreased antibody titer or cause non-specific reactions. *Lipemic sera should be avoided, because it causes non-specific reactions. 3) Addition of samples Place one drop (20-30µl) each of diluted sera as well as positive control over the antigen wells and place in a moisture chamber. *Perform the analysis using the provided positive control sera as controls. *Ensure that the added sample is not mixed with the sample in the next well. Also, in a quantitative analysis, add samples with lower concentration prior to samples with higher concentration. 4) Primary reaction Incubate the slides in the moisture chamber for 20 minutes at room temperature (20-25 C). *Incubation time should be between min. *Incubation temperature above or below normal room temperature (20-25 C), shorter or longer time periods of incubation may give erroneous results. *Reaction should be performed in the moisture chamber with enough water poured not to dry the substrate slides. 5) Washing (1) Place the PBS and the staining basket into a 500 ml beaker. (2) Remove the slides from the moisture chamber one at a time and carefully rinse off the serum using a washing bottle filled with PBS. *Do not squirt PBS directly on the wells. *Do not take out all substrate slides at once, since this may lead to substrate drying out. (3) Immediately stand the slides in the staining basket, prepared in step 1). (4) After all the slides have been placed in the basket, wash them for 5 minutes using a magnetic stirrer. *The amount of PBS used for washing is 500 ml per 10 glass slides. 6) Addition of FITC conjugated antibody After washing, remove the slides from the basket one at a time, and dry all parts other than the wells, using the enclosed blotting paper. Place the slides back into the moisture chamber, and add one drop of the secondary antibody (FITC-conjugated goat anti-human immunoglobulins) to each well on the slide. *Never dry substrate slide, because this severely obstructs correct detection. *Do not touch the well or remove PBS from well with blotting paper directly. 7) Secondary reaction Incubate the slides in the moisture chamber for 20 minutes at room temperature (20-25 C). *Incubation time should be between min. *Incubation temperature above or below normal room temperature (20-25 C), shorter or longer time periods of incubation may give erroneous results. 3

6 English *Reaction should be performed in the moisture chamber with enough water poured not to dry the substrate slides. 8) Washing Wash the slides as in step 5. 9) Mount coverslip After washing, remove the slides from the staining basket one at a time. Gently remove excess moisture with a piece of blotting paper and apply 2-3 drops of the mounting medium included in the kit. Carefully place coverslip in position. *Be careful not to dry substrate slides. 10) Microscopic examination Examine the slides using fluorescent microscope at a magnification of 100. *Microscopic examination should be performed promptly after mounting. If immediate microscopic examination is not possible, keep the slides in the cool, dark place, and perform microscopic examination within 24 hours. Interpretation of Results 1) Interpretation of negative or positive results (1) ASMA (-): No specific fluorescence is seen in muscularis mucosae and muscularis. (+): As in the positive control serum, specific fluorescence is seen in muscularis mucosae, muscularis, stomach sub- mucosa and renal vessel walls. (2) AMA (-): No specific fluorescence is seen in renal tubules in epithelial structures. (+): As in the positive control serum, specific fluorescence is seen in cytoplasm of proximal and distal renal tubules and the cytoplasm of stomach parietal cells. (3) APCA (-): No specific fluorescence is seen in mucosae of stomach. (+): As in the positive control serum, specific fluorescence is seen in cytoplasm of stomach parietal cells. Since AMA also stain parietal cells, kidney tubules should also be checked before reporting APCA positive. When interpreted as positive at a dilution of 1:20 or greater, the specimen is determined to be positive for AMA, ASMA or APCA. Quality Control Positive control serum which is included in the kit should be tested in each run to insure that all reagents and procedures have performed properly. 4

7 English Limitations This product is only for diagnosis. Do not use in human beings. Test results should be used in conjunction with information available from the clinical evaluation and other diagnostic information. Expected Values and Performance Characteristics Patients samples and normal samples were tested by FLUORO AID-1 Test. Autoimmune liver disease Viral liver disease Acute hepatitis Chronic hepatitis Hepatoma Alcholic hepatitis, cirrhosis Drug-induced hepatitis Other liver disease Others Normal Primary biliary cirrhosis Autoimmune hepatitis Type A Type B AMA ASMA positive negative positive negative Non-A, Non-B Active Type B, Non-B Inactive Type B, Non-B Cirrhosis Type B Non-B References 1. Kaltskin G., Kantor F.S.,: Ann. Int. Med., 77: 553, Rodoriquez M., Paronetto F., Schaffner F., Popper H.: J.A.M.A.,208: 148, Berg P.A., Roitt IM., Doniach D., Cooper H.M.: Immunology, 17: 281, Waler J.G., Doniach D., Roitt I.M.,Sherlock S.: Lancet, 827, Mackay I.R.: N.Engl. J. Med., 258:185, Deodhar S. D., Yazbek A., Achkar E., Brown C.H.: Clev. Clin. Quart., 36: 95, Doniach D., Roitt I.M., Walker J.G., Sherlock S.: Clin. Exp. Immunol. 1:237, Berg P.A., Doniach D., Roitt I.M.: J.Exp. Med., 126:277, Doniach D., Delhanty J., Lindqvist H. J., Catterall R.D.: Clin. Exp. Immunol., 6:871,

8 Français Français BUT DU DOSAGE Le FLUORO AID-1 TEST pour la détection des autoanticorps anti-mitochondries (AMA), anti-muscle lisse (ASMA) et anti-cellules pariétales (APCA) dans le sérum. Pour utilisation en diagnostic in vitro uniquement. Ne pas utiliser sur des êtres humains. Résume et explication Les autoanticorps anti-mitochondries (AMA), anti-muscle lisse (ASMA) sont utiles pour le diagnostic des pathologies hépatiques, en particulier la cirrhose biliaire primitive (CBP) et l hépatite chronique active (HCA). Les AMA décrits par Mackay sont fortement spécifiques de la cirrhose biliaire primitive. Bien que ces anticorps puissent être également détectés dans d autres pathologies hépatiques (hépatite chronique active, cirrhose cryptogénique et hépatite médicamenteuse) à des titres faibles, des titres élevés (X40 ou plus) sont présents uniquement dans la CBP. La recherche des autoanticorps AMA est un substitut à l exploration chirurgicale des CBP. Les ASMA décrits par Johnson sont spécifiques de l hépatite lupique et de l hépatite chronique active. Bien que les ASMA ne soient pas détectés dans les LED, il peut être utile de faire la distinction entre LED et hépatite lupique. On a montré que les ASMA étaient positifs dans les stades actifs de la maladie et disparaissaient dans les stades de rémission. Les anticorps anti-cellules pariétales (APCA) sont associés à la gastrite autoimmune de type A (gastrite chronique atrophique) et à l anémie pernicieuse chez 90% des patients et sont donc une aide pour le diagnostic. Les APCA peuvent également être présents dans des affections autoimmunes endocriniennes comme les thyroïdites et le diabète sucré insulino-dépendant. Principe du Test Le TEST FLUORO AID-1 détecte les anticorps anti mitochondries, anti muscle lisse et anti cellules pariétales en immunofluorescence indirecte. Des cellules d estomac et de rein de rat sont utilisées comme substrat et un anticorps anti-humain conjugué à du fluoroisothiocyanate est utilisé comme marqueur de fluorescence. Matériel Lames: Substrat estomac/rein de rat Conjugué: Anticorps de chèvre anti humain marqué au FITC avec de l albumine bovine (2%), de l azide de sodium (0,09%) Tampon PBS Contrôle Positif AMA Sérum humain (ANA positif) avec de l albumine bovine (2%) et de l azide de sodium Cat.No.4250E 40 puits 10 lames à 4 puits 4,5 ml X 1 flacon 5 paquets de 9,1g (pour 1l) 0,5 ml X 1 flacon 6

9 Français (0,09%) Contrôle Positif ASMA Sérum humain (ASMA positif) avec de l albumine bovine (2%) et de l azide de sodium (0,09%) Contrôle Positif APCA Sérum humain (APCA positif) avec de l albumine bovine (2%) et de l azide de sodium (0,09%) Milieu de Montage Glycérol avec un tampon carbonate contenant 0,3% de Acide Trichloro-Acétique 0,5 ml X 1 flacon 0,5 ml X 1 flacon 3 ml X 1 flacon Lamelles 10 Papier Absorbant 20 feuilles Matériel nécessaire mais non fourni Becher de 500 ml, Flacon pour solution de lavage, Agitateur Magnetique, Chambre d incubation humide, Panier de coloration, Eau désionisée ou distillée, Microscope à fluorescence équipé d un filtre d excitation bleu. Précautions (1) Les sérums contrôles positif sont préparés à partir de sérums humains, qui ont été testés négatifs pour l antigène HBs, les anticorps anti HCV et HIV (1&2). Aucune méthode ne pouvant garantir l absence de ces virus ou d autres virus pathogènes, utiliser ces réactifs comme tout prélèvement potentiellement infectieux. (2) Les sérums contrôles positif ainsi que l anticorps conjugué au FITC contiennent 0,09% d azide de sodium comme conservateur ne pas ingérer ou permettre du contact avec la peau ou avec les membranes muqueuses. L azide peut provoquer des réactions explosives dans les conduites d évacuation en plomb ou en cuivre. Faire couler l eau en abondance lorsqu on se débarrasse de ces produits. (3) Certains composants de la trousse contiennent des matières d origine animale, provenant d animaux non-infectés. Cependant, ces composants doivent être manipulés comme des dangers biologiques potentiels, lors de l utilisation ainsi que lors du traitement des déchets. (4) Le milieu de montage contient 0,3% d acide trichloro-acétique qui est nuisible aux organismes aquatiques et peut engendrer des effets défavorables à long terme pour l environnement aquatique. Ce matériel et son récipient doivent être considérés comme des déchets dangereux. Conservation et Stabilité Les lames et tous les composants de la trousse de réactifs doivent être conservés à 2-8 C. Tous les réactifs sont stables 12 mois après fabrication lorsqu ils sont conservés à 2-8 C. 7

10 Français Procédure 1) Préparation des réactifs Amener les lames de substrat à température ambiante avant de desceller l étui pour éviter toute hydratation. *Sceller fortement les lames inutilisées avec du desiccant afin de les garder sèches lors du stockage. Préparer la solution de PBS en dissolvant le contenu d un paquet dans 1 L d eau distillée. *Ne pas diluer les autres constituants de la trousse qui sont prêts à l emploi. 2) Préparation des échantillons Utiliser des sérums fraîchement prélevés. a) Analyse qualitative: Diluer chaque échantillon de sérum au 1 : 20 dans du PBS. b) Analyse quantitative: Lorsqu un sérum est positif en méthode qualitative, faire des dilutions en cascade de l échantillon (1 :40, 1 :80, 1 :160, 1 :320) *Eviter les étapes de congélation-décongélation qui pourraient diminuer le titre en anticorps et également provoquer des réactions non-spécifiques. *Ne pas utiliser d échantillons Lipemiques qui provoquent des réactions non spécifiques. 3) Addition des échantillons Placer 1 goutte (20-30 µl) de chaque échantillon dilué ainsi que des contrôles positif dans les puits d antigène et placer la lame dans une chambre humide. * Effectuer l analyse utilisant les sérums contrôles positif et négatif prévus comme contrôles. *S assurer de ne pas mélanger les échantillons de deux puits consécutifs. Dans une analyse quantitative, ajouter les échantillons avec une concentration plus basse avant les échantillons avec une concentration plus haute. 4) Réaction primaire Incuber les lames en chambre humide 20 minutes à température ambiante (20-25 C). *Le délai d incubation doit être entre min. *Une température d incubation en deçà ou au-delà de la température ambiante (20-25 C), des temps d incubation raccourcis ou augmentés peuvent donner lieu à des résultats erronés. *La réaction doit être effectuée dans la chambre d incubation humide qui doit être suffisamment humidifiée de sorte que les lames de substrat ne s assèchent pas. 5) Lavage (1) Placer le PBS et le panier pour coloration dans un becher de 500 ml. (2) Retirer les lames de la chambre d incubation humide une à la fois et les laver pour éliminer le sérum avec du PBS contenu dans une pissette. *Ne pas projeter directement le PBS dans les puits *Ne pas retirer toutes les lames en une seule fois pour ne pas qu elles se dessèchent. (3) Poser immédiatement les lames dans le panier préparé à l étape 1). (4) Une fois que toutes les lames sont déposées dans le panier, laver 5 minutes sous agitation. *Utiliser 500 ml de PBS pour 10 lames. 8

11 Français 6) Addition du Conjugué Après lavage retirer les lames du panier, une à la fois, sécher les bords des lames autour des puits sans sécher les puits. Replacer les lames dans la chambre d incubation humide et ajouter une goutte de l anticorps secondaire (anti globulines humaines conjugué au FITC) dans chaque puits. *Ne jamais laisser sécher les lames de substrat car cela va empêcher une réaction correcte. *Ne pas toucher les puits ni enlever directement le PBS des puits avec le papier absorbant. 7) Réaction secondaire Incuber les lames en chambre humide pendant 20 minutes à température ambiante (20-25 C). * Ce temps d incubation doit être compris entre 20 et 30 minutes. *Une température d incubation en deçà ou au-delà de la température ambiante (20-25 C), des temps d incubation raccourcis ou augmentés peuvent donner lieu à des résultats erronés. * La réaction doit être effectuée dans la chambre d incubation (moisture chamber) en versant assez d eau de sorte que les lames de substrat ne s assèchent pas. 8) Lavage Laver comme décrit à l étape 5. 9) Montage des lames Après lavage, retirer les lames du panier de coloration, une à la fois. retirer les lames du panier de coloration, une à la fois. Prudemment mettre en position la lamelle couvre-objet. *Ne pas dessécher complètement les lames. 10) Examen microscopique Examiner les lames à l aide d un microscope à fluorescence à un grossissement de X 100. *L examen microscopique doit être fait rapidement après montage. Si on ne peut pas procéder immédiatement à l examen microscopique, conserver les lames au froid et à l obscurité et procéder à l examen microscopique dans les 24 heures. Interprétation des Résultats 1) Interprétation d un résultat négatif ou positif (1) ASMA (-): Aucune fluorescence spécifique n est détectée sur les muqueuses musculaires et les muscles. (+):Un aspect spécifique de fluorescence similaire à celui obtenu pour le contrôle positif ASMA est détecté sur la muqueuse musculaire, le muscle, la sous muqueuse stomacale et les parois des vaisseaux sanguins des reins. (2) AMA (-): Aucune fluorescence spécifique n est détectée au niveau des structures épithéliales des tubules rénaux. (+): Un aspect spécifique de fluorescence similaire à celui 9

12 Français (3) APCA obtenu pour le contrôle positif AMA est détecté dans le cytoplasme des cellules du tubule proximal et distal et dans le cytoplasme des cellules pariétales de l estomac. (-): Aucune fluorescence spécifique n est détectée au niveau de la muqueuse stomacale. (+): Un aspect spécifique de fluorescence similaire à celui obtenu pour le contrôle positif APCA est détecté dans le cytoplasme des cellules pariétales de l estomac. Lorsque le sérum est positif à une dilution positif pour les AMA, ASMA ou APCA. au 1 : 20 ou plus, on peut conclure que l échantillon est déclaré Contrôle de Qualité Le Sérum contrôle Positif et le Sérum contrôle Négatif qui sont inclus dans la trousse doivent être testés chaque fois pour vérifier si tous les réactifs et procédures ont fonctionnés comme il faut. Limitations Ce produit a un but purement diagnostique. Ne pas utiliser sur des êtres humains. Les résultats du test doivent être utilisés avec les informations disponibles des évaluations cliniques et avec d autres informations diagnostiques. Interprétation et Valeurs attendues Des échantillons de patients et des échantillons normaux ont été testés avec le FLUORO AID-1 Test. Maladies auto-immunes du foie Viral liver disease Autres Normal Hépatite aiguë Hépatite chronique Hépatome Hépatite alcolique, cirrhose positif négatif positif négatif Active Type B, Non-B Inactive Type B, Non-B Cirrhose Hépatite induite par la drogue Autres maladies du foie Bibliographie Cirrhose biliaire primaire Hépatite auto-immune Type A Type B Non-A, Non-B AMA ASMA Type B Non-B Kaltskin G., Kantor F.S.,: Ann. Int. Med., 77: 553, Rodoriquez M., Paronetto F., Schaffner F., Popper H.: J.A.M.A.,208: 148, Berg P.A., Roitt IM., Doniach D., Cooper H.M.: Immunology, 17: 281, Waler J.G., Doniach D., Roitt I.M.,Sherlock S.: Lancet, 827, Mackay I.R.: N.Engl. J. Med., 258:185,

13 Français 6. Deodhar S. D., Yazbek A., Achkar E., Brown C.H.: Clev. Clin. Quart., 36: 95, Doniach D., Roitt I.M., Walker J.G., Sherlock S.: Clin. Exp. Immunol. 1:237, Berg P.A., Doniach D., Roitt I.M.: J.Exp. Med., 126:277, Doniach D., Delhanty J., Lindqvist H. J., Catterall R.D.: Clin. Exp. Immunol., 6:871,

14 Deutsch Deutsch Verwendungszweck Der FLUORO AID-1 TEST dient dem Nachweis von Autoantikörpern gegen Mitochondrien (AMA), glatte Muskulatur (ASMA) und Parietalzellen (APCA) in Humanserum. Nur für in-vitro Diagnostik. Nicht zur Anwendung am Menschen. Zusammenfassung und Erklärung Der Nachweis von AMA und ASMA liefert hilfreiche Hinweise bei der Diagnostik von Erkrankungen der Leber, insbesondere bei primär biliärer Zirrhose (PBC) und chronisch aktiver Hepatitis (CAH). Die zuerst von Dr. Machay beschriebenen AMA besitzen eine hohe Spezifität für PBC. AMA können in niedrigen Titern zwar auch bei anderen Lebererkrankungen nachgewiesen werden, wie bei CAH, kryptogener Zirrhose und Arzneimittel-induzierter Hepatitis. Hohe Titer (x40 oder höher) kommen aber nur bei PBC vor. Empfehlungen zufolge, kann der AMA-Test eine chirurgische Diagnostik der PBC ersetzen. ASMA wurden erstmals von Dr. Johnson beschrieben. Sie besitzen eine hohe Spezifität für CAH und lupoide Hepatitis. Da ASMA bei SLE nicht nachgewiesen werden, sind sie bei der Trennung von SLE und lupoider Hepatitis sehr hilfreich. Berichten zufolge sind die ASMA-Titer bei aktiver Erkrankung erhöht, während eine Remission von negativen Titern begleitet ist. APCA kommen bei 90 Prozent aller Patienten mit autoimmuner Gastritis Typ A (chronisch atrophischer Gastritis) und perniziöser Anämie vor. Sie können daher bei der Diagnostik behilflich sein. Positive APCA-Titer wurden auch bei anderen endokrinen Autoimmunerkrankungen, wie bei Thyreoiditis und beim Insulin-pflichtigen Diabetes mellitus beschrieben. Testprinzip Mit dem FLUORO AID-1 TEST werden Autoantikörper gegen Mitochondrien, glatte Muskulatur und Parietalzellen mittels der indirekten Immunfluoreszenz nachgewiesen. Schnitte von Rattenmagen/-niere werden als Substrat und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) wird als Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt. Gelieferte Materialien Rattenmagen/-niere Objektträger FITC-markierte Ziegenantikörper gegen Human-Immunglobulin. Enthält 2% BSA, 0,09% Natriumazid und Evans Blau PBS-Puffer AMA-positives Kontrollserum Humanserum (AMA-positiv). Enthält 2% BSA, 0,09% Natriumazid ASMA-positives Kontrollserum 40 Tests (Art.-Nr.: 4250E) 10x4 Objektträger 1 Fläschchen, 4,5 ml 5 Beutel zu je 9,1 g (je1000 ml) 1 Fläschchen, 0,5 ml 1 Fläschchen, 12

15 Deutsch Humanserum (ASMA-positiv). Enthält 2% BSA, 0,09% Natriumazid APCA-positives Kontrollserum Humanserum (APCA-positiv). Enthält 2% BSA, 0,09% Natriumazid Eindeckmittel Glycerol mit Karbonatpuffer. Enthält 0,3% Trichloro-Essigsäure Deckgläschen Löschpapier 0,5 ml 1 Fläschchen, 0,5 ml 1 Fläschchen, 3,0ml 10 St. 20 St. Erforderliches, aber nicht geliefertes Material 500 ml Becher, Spritzflasche, Magnetrührer, feuchte Kammer, Färbetrog, destilliertes oder entionisiertes Wasser, Fluoreszenzmikroskop mit einem Filter für Blau-Anregung. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen (1) Die positiven und negativen Kontrollseren wurden aus Humanseren hergestellt, die negativ auf HBs-Antigen, HIV (HIV 1 und HIV 2)-Antikörper und HCV-Antikörper getestet wurden. Es wird dennoch empfohlen, alle klinischen Proben und Materialien als potentiell infektiös zu handhaben. (2) Das FITC-Konjugat, das negative Kontrollserum und das positive Kontrollserum enthalten 0,09% Natriumazid als Konservierungsmittel. Sie müssen mit Vorsicht gehandhabt werden nicht einnehmen oder mit der Haut oder den Schleimhäuten in Berührung bringen. Natriumazid kann mit Kupfer- und Bleihaltigen Rohren unter Bildung explosiver Metallazide reagieren. Falls Azid-haltige Lösungen in den Ausguss gelangen, sollte daher immer mit viel Leitungswasser gespült werden. (3) Einige Bestandteile des Kits enthalten Materialien aus nicht-infizierten Tieren. Trotzdem sollten diese Bestandteile als potentiell biogefährlich gehandhabt und entsorgt werden. (4) Das Eindeckmittel enthält 0,3% Trichloroessigsäure. Sie ist schädlich für Wasserorganismen und kann die aquatische Umwelt längerfristig schädigen. Das Eindeckmittel und sein Behältnis müssen in einen Behälter für Schadstoffe entsorgt werden. Lagerung und Haltbarkeit Alle Bestandteile des Kits müssen bei 2-8 C gelagert werden. Bei dieser Lagerungstemperatur sind alle Reagenzien 12 Monate ab Herstellungsdatum haltbar. Testdurchführung 1) Herstellung der Reagenzien Vor dem Öffnen die Beutel mit den Objektträgern auf Raumtemperatur bringen, damit kein Kondenswasser gebildet wird. *Nicht benötigte Objektträger zusammen mit dem Trockenmittel wieder in den Beutel geben und diesen zur Lagerung dicht verschließen. Gebrauchsfertige PBS-Lösung herstellen: Inhalt eines Beutels in 1000 ml Aqua dest. auflösen. *Die anderen Bestandteile des Testkits sind gebrauchsfertig. Nicht verdünnen. 13

16 Deutsch 2) Herstellung der Proben Es wird empfohlen, frisch gewonnene Patientenseren zu verwenden. a) Qualitative Untersuchung: Patientenseren 1:20 mit PBS verdünnen. b) Quantitative Untersuchung: von Patientenseren, die bei der qualitativen Untersuchung positiv reagierten, eine Reihenverdünnung herstellen (d.h. 1:40, 1:80, 1:160, 1:320) *Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Seren vermeiden, weil dann falsch niedrige Antikörpertiter oder unspezifische Reaktionen möglich sind. *Lipämische Seren sind zu vermeiden; sie können unspezifische Reaktionen verursachen. 3) Auftragen der Proben Jeweils einen Tropfen (20-30µl) der verdünnten Patientenseren sowie der positiven Kontrollseren auf die beschichteten Testfelder der Objektträger geben und die Objektträger in eine feuchte Kammer legen. *Bei der Untersuchung die positiven Kontrollen aus dem Testkit mitführen. *Beim Auftragen der Proben eine Berührung mit benachbarten Testfeldern vermeiden. Beim Austitrieren, immer erst die Probe mit der höchsten bzw. höheren Verdünnung auftragen. 4) Erste Inkubation Die Objektträger in einer feuchten Kammer 20 Min. bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. *Die empfohlenen Inkubationstemperaturen (20-25 C) und Inkubationszeiten (20 Min.) sind einzuhalten, weil sonst falsch positive Ergebnisse möglich sind. *Die Inkubation sollte in einer feuchten Kammer durchgeführt werden. Der Boden der Kammer sollte mit Wasser benetzt sein, um ein Austrocknen der Substrate zu vermeiden. 5) Waschen (1) PBS und einen Färbetrog in einen 500 ml Becher geben. (2) Die Objektträger einzeln aus der feuchten Kammer nehmen und die Seren sorgfältig mit PBS aus einer Spritzflasche abspülen. *Den Pufferstrahl nicht direkt auf die Auftragsstellen richten. *Die Objektträger einzeln abarbeiten. Wenn alle Objektträger auf einmal aus der feuchten Kammer entfernt werden, kann es sein, dass die Substrate austrocknen. (3) Objektträger sofort in den Färbetrog mit PBS (Schritt 1) stellen. (4) Sobald alle Objektträger im Färbetrog stehen, werden sie 5 Min. unter Verwendung eines Magnetrührers gewaschen. *Zum Waschen von jeweils 10 Objektträger werden 500 ml PBS benötigt. 6) FITC-Konjugat hinzufügen Die gewaschenen Objektträger einzeln aus dem Färbetrog nehmen und die Objektträgermaske mit einem Löschpapier aus dem Kit trocknen. Die Substrate auf den Testfeldern dabei nicht berühren. Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen und auf jedes Testfeld einen Tropfen des zweiten Antikörpers (FITC-markiertes Ziege-anti-Human-Immunglobulin) geben. *Die Substrate dürfen nicht austrocknen, weil die Beurteilung der Muster verfälscht werden kann. *Das Löschpapier darf die Substrate nicht berühren bzw. darf nicht zum Entfernen von PBS auf den Testfeldern benutzt werden. 14

17 Deutsch 7) Zweite Inkubation Die Objektträger in einer feuchten Kammer 20 Min. bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. *Die empfohlenen Inkubationstemperaturen (20-25 C) und Inkubationszeiten (20 Min.) sind einzuhalten, weil sonst falsch positive Ergebnisse möglich sind. *Die Inkubation sollte in einer feuchten Kammer durchgeführt werden. Der Boden der Kammer sollte mit Wasser benetzt sein, um ein Austrocknen der Substrate zu vermeiden. 8) Waschen Die Objektträger wie in Schritt 5 beschrieben waschen. 9) Deckgläschen auflegen Die gewaschenen Objektträger einzeln aus dem Färbetrog nehmen. Objektträgermaske behutsam mit einem Löschpapier aus dem Kit trocknen und 2-3 Tropfen Eindeckmittel aus dem Kit auftragen. Ein Deckgläschen auflegen. *Die Substrate auf den Testfeldern der Objektträger dürfen nicht austrocknen. 10) Auswertung am Mikroskop Die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer 100fachen Vergrößerung auswerten. *Die mikroskopische Beurteilung sollte sofort nach dem Eindecken erfolgen. Ist das nicht möglich, sollten die Objektträger dunkel und kühl gelagert und binnen 24 Std. beurteilt werden. Auswertung der Ergebnisse 1) Beurteilung negativer und positiver Ergebnisse. (1) ASMA (-): In der Muscularis mucosae und Muscularis ist keine spezifische Fluoreszenz erkennbar. (+): Die Muscularis mucosae, Muscularis, Submucosa des Magens und die Wände der Blutgefäße in der Niere zeigen eine spezifische Fluoreszenz (vgl. das ASMA-positive Kontrollserum). (2) AMA (-): An den Nierentubuli ist keine spezifische Fluoreszenz erkennbar. (+): Spezifische Fluoreszenz des Zytoplasmas der proximalen und distalen Nierentubuli sowie der Parietalzellen des Magens (vgl. das AMA-positive Kontrollserum). (3) APCA (-): In der Muscularis mucosae des Magens ist keine spezifische Fluoreszenz erkennbar. Muscularis (+): Spezifische Fluoreszenz des Zytoplasmas der Parietalzellen des Magens (vgl. das APCA-positive Kontrollserum). *Weil auch AMA die Parietalzellen des Magens färben, sollte die Reaktion der Nierentubuli beurteilt werden, ehe ein APCA-positives Ergebnis berichtet wird. Seren, die ab einer Verdünnung von 1:20 mit FLUORO AID-1 Test positiv reagieren, sind als positiv für 15

18 Deutsch AMA, ASMA und/oder APCA zu betrachten. Qualitätskontrolle Die im Kit enthaltenen positiven Kontrollseren sollten bei jedem Testlauf mitgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Reagenzien die richtige Funktion zeigten und der Test richtig durchgeführt wurde. Grenzen des Verfahrens Nur für in-vitro Diagnostik. Nicht zur Anwendung am Menschen. Die Ergebnisse sollten in Verbindung mit den Ergebnissen klinischer Untersuchungen und anderer diagnostischer Verfahren verwendet werden. Erwartete Werte und Leistungsmerkmale Patientenproben und Proben von normalen Probanden wurden mit dem FLUORO AID-1 Test untersucht. AMA ASMA positiv negativ positiv negativ Autoimmune Primär biliäre Zirrhose Lebererkrankung Autoimmunhepatitis Akute Typ A Hepatiti s Typ B Virale Non-A, Non-B Leber Aktiv Typ B Erkrank. Chron. Inaktiv Typ B Hepatiti s Zirrhose Typ B Non-B Hepatoma Alkoholische Hepatitis, Zirrhose Arzneimittel-induzierte Hepatitis Andere Lebererkrankungen Andere Normalkollektiv Literatur 1. Kaltskin G., Kantor F.S.,: Ann. Int. Med., 77: 553, Rodoriquez M., Paronetto F., Schaffner F., Popper H.: J.A.M.A.,208: 148, Berg P.A., Roitt IM., Doniach D., Cooper H.M.: Immunology, 17: 281, Waler J.G., Doniach D., Roitt I.M.,Sherlock S.: Lancet, 827, Mackay I.R.: N.Engl. J. Med., 258:185, Deodhar S. D., Yazbek A., Achkar E., Brown C.H.: Clev. Clin. Quart., 36: 95,

19 Deutsch 7. Doniach D., Roitt I.M., Walker J.G., Sherlock S.: Clin. Exp. Immunol. 1:237, Berg P.A., Doniach D., Roitt I.M.: J.Exp. Med., 126:277, Doniach D., Delhanty J., Lindqvist H. J., Catterall R.D.: Clin. Exp. Immunol., 6:871,

20 Espaňol Espaňol 18

21 Italiano Italiano Uso previsto FLUORO AID-1 TEST viene usato per il rilevamento di anticorpi anti mitocondrio (AMA), anticorpi anti muscolo liscio (ASMA) ed anticorpi anti cellule parietali (APCA) nel siero umano. Questo prodotto è solo per uso diagnostico in vitro. Non usare su esseri umani. Riassunto e Spiegazione Rilevare AMA ed ASMA è molto utile per la diagnosi di Malattie Epatiche, in particolare la Cirrosi Primaria Biliare (PBC) e l Epatite cronica attiva. AMA sono stati descritti per la prima volta da Mackay, ed è stato successivamente dimostrato che essi hanno forte specificità per PBC. Sebbene bassi titoli di AMA possano essere rilevati in altre patologie epatiche come Epatite cronica attiva, Cirrosi criptogenica ed Epatite indotta da farmaci, alti titoli (x40 o più) sono presenti solo in PBC. La ricerca di AMA è stata raccomandata in sostituzione dell esplorazione chirurgica di ASMA sono stati per la prima volta descritti da Johnson ed hanno dimostrato possedere una forte specificità per l Epatite lupoide e per l Epatite cronica attiva. Dato che ASMA non sono stati rilevati nel Lupus eritematoso sistemico, essi sono molto utili per la differenziazione di LES da Epatite lupoide. E riportato che titoli ASMA risultano positivi in una fase attiva della malattia e negativi in una fase di remissione della malattia stessa. APCA sono associati con la Gastrite autoimmune di tipo A (Gastrite autoimmune atrofica) ed Anemia perniciosa in circa il 90% dei pazienti ed è di aiuto nella diagnosi. Viene riportato che APCA risultano positivi in altre malattie endocrine autoimmuni come la tiroidite ed il diabete mellito insulino-dipendente. PBC. Principio FLUORO AID-1 TEST rileva anticorpi anti mitocondrio, anti muscolo liscio parietali con il metodo di immunofluorescenza indiretta. ed anti cellule Stomaco/rene di ratto vengono usati come substrati e fluoresceina isotiocianato (FITC) è usata come colorante fluorescente. Materiali forniti Vetrini con stomaco/rene di ratto come substrato Anti immunoglobuline umane da capra coniugate con FITC contenenti 2% BSA e 0.09% sodio azide 40 pozzetti (Cat.n.4250E) 4 pozzetti x 10 vetrini 4.5 ml x 1 vial Tampone PBS 9.1g (for 1000ml) x 5 buste AMA Siero di Controllo Positivo Siero umano (AMA positivo) contenente 2% BSA, 0.09% sodio azide 0.5 ml x 1 vial 19

22 Italiano ASMA Siero di Controllo Positivo Siero umano (ASMA positivo) contenente 2% BSA, 0.09% sodio azide APCA Siero di Controllo Positivo Siero umano (APCA positivo) contenente 2% BSA, 0.09% sodio azide Mezzo di Montaggio Glicerolo in tampone Carbonato contenente 0.3% Acido tricloroacetico 0.5 ml x 1 vial 0.5 ml x 1 vial 3.0ml x 1 vial Vetrini coprioggetto 10 Carta assorbente 20 Materiali richiesti ma non forniti Beaker da 500 ml, bottiglie per il lavaggio, agitatore magnetico, camera umida, cestello di lavaggio, acqua distillata o deionizzata, microscopio a fluorescenza dotato di unità filtro eccitazione blu. Precauzioni (1) Ogni siero di controllo positivo deriva da siero umano negativo per l antigene HBs, gli anticorpi HIV (HIV-1 ed HIV-2) e gli anticorpi anti HCV. Tuttavia è fortemente raccomandato che tutti i campioni clinici ed i materiali vengano trattati come potenzialmente capaci di trasmettere malattie infettive. (2) Come conservante, 0.09% sodio azide è stata aggiunta all anticorpo coniugato con FITC ed al siero di controllo positivo e negativo, dunque essi devono essere maneggiati con cura (non ingerire o far venire a contatto con mucose o pelle). La sodioazide può reagire con rame o piombo per formare azidi metalliche esplosive. Quindi, diluire con abbondante acqua prima di smaltire. (3) Alcune componenti dei kits contengono materiali di origine animale, derivanti da animali non infetti. Queste componenti dovrebbero essere trattate come pericolose per la salute sia al momento dell uso che a quello dello smaltimento. (4) Il mezzo di montaggio contiene acido tricloroacetico 0.3% che è dannoso per gli organismi acquatici e possono causare nei lunghi periodi effetti avversinell ambiente acquatico. Questo materiale ed i relativi contenitori devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi. Conservazione e stabilità dei reagenti Tutti i componenti del kit devono essere conservati a 2-8 C. Tutti i reagenti sono stabili per 12 mesi dalla loro preparazione se conservati a 2-8 C. Procedura 1) Preparazione dei reagenti Portare i vetrini con il substrato a temperatura ambiente prima di aprire il contenitore, per evitare formazione di umidità. *Sigillare i vetrini che non sono usati assieme a dessiccante per mantenerli lontani dall umidità durante la conservazione. Preparare tampone PBS sciogliendo 1 busta di PBS in polvere in 1000ml di acqua distillata. 20

23 Italiano *Non diluire gli altri componenti del kit che sono segnalati pronti per l uso. 2) Preparazione dei campioni Usare sieri freschi di paziente. a) Analisi qualitativa : Diluire i sieri dei pazienti 1:20 con PBS. b) Analisi quantitativa: Nel caso di sieri di pazienti che sono positivi all analisi qualitativa, fare diluizioni seriali dei campioni da testare (ad esempio 1:40, 1:80, 1:160, 1:320). *Non ripetere congelamento e scongelamento dei campioni di siero dei pazienti. Ciò potrebbe determinare una diminuizione del titolo o causare reazioni non specifiche. *L uso di sieri lipemici dovrebbe essere evitato perché esso può causare reazioni non specifiche. 3) Aggiunta dei campioni Piazzare una goccia (20-30 l) di ognuno dei sieri diluiti così come dei sieri di controllo positivi sui pozzetti e sistemare in camera umida. *Compiere l analisi usando come controlli i controlli positivi che vengono forniti. *Assicurarsi che i campioni dispensati non siano mescolati con il campione del pozzetto adiacente. Inoltre in una analisi quantitativa, aggiungere campioni con minore concentrazione prima dei campioni a più alta concentrazione. 4) Reazione primaria Incubare i vetrini in camera umida per 20 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). *Il tempo di incubazione deve essere compreso tra i 20 e 30 minuti. *Temperatura di incubazione al di sopra o al di sotto della normale temperatura ambiente (20-25 ), tempi di incubazione più lunghi o più brevi possono dare risultati falsi. *La reazione dovrebbe essere compiuta in camera umida con acqua sufficiente ad evitare che i vetrini si asciughino. 5) Lavaggio (1) Piazzare PBS e cestelli di lavaggio in un beaker da 500 ml. (2) Rimuovere i vetrini dalla camera umida uno alla volta e sciacquarli accuratamente dal siero usando una bottiglia di lavaggio contenente PBS. *Non spruzzare PBS direttamente sui pozzetti. *Non togliere tutti i vetrini in una sola volta, perché questo può comportare che il substrato si asciughi. (3) Piazzare immediatamente i vetrini nei cestelli di lavaggio preparati nello step 1). (4) Dopo che tutti i vetrini sono stati sistemati nel cestello, lavarli per 5 minuti usando un agitatore magnetico. *La quantità di PBS usata per i lavaggi è di 500 ml per 10 vetrini. 6) Aggiunta dell anticorpo coniugato con FITC Dopo i lavaggi, rimuovere i vetrini dal cestello uno alla volta ed asciugarne tutte le parti esterne ai pozzetti usando la carta assorbente fornita. Tornare a piazzare i vetrini nella camera umida ed aggiungere una goccia dell anticorpo secondario (anti immunoglobuline umane da capra coniugate con FITC) ad ogni pozzetto del vetrino. *Non asciugare mai i vetrini perché questo impedirebbe seriamente una corretta rivelazione. *Non toccare i pozzetti nè rimuovere PBS dai pozzetti direttamente con carta assorbente. 21

24 Italiano 7) Reazione secondaria Incubare i vetrini in camera umida per 20 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). *Il tempo di incubazione deve essere compreso tra minuti. *Temperatura di incubazione al di sopra o al di sotto della normale temperatura ambiente (20-25 ), tempi di incubazione più lunghi o più brevi possono dare risultati falsi. *La reazione dovrebbe essere compiuta in camera umida con acqua sufficiente ad evitare che i vetrini si asciughino. 8) Lavaggio Lavare i vetrini come descritto nello step 5. 9) Montaggio dei vetrini coprioggetto Dopo i lavaggi, rimuovere i vetrini dal cestello uno alla volta. Eliminare delicatamente l umidità con un pezzo di carta assorbente ed applicare 2-3 gocce di mezzo di montaggio incluso nel kit. Piazzare con cura i vetrini coprioggetto in posizione. *Fare attenzione a non lasciar asciugare i vetrini. 10) Esame al microscopio Esaminare i vetrini usando il microscopio a fluorescenza con ingrandimento 100. *L esame al microscopio dovrebbe avvenire prontamente dopo il montaggio. Se l esame immediato non è possibile, mantenere i vetrini in un posto fresco, protetto dalla luce e procedere all esame entro le 24 ore. Interpretazione dei Risultati 1) Interpretazione di risultati negativi o positivi (1) ASMA (-): assenza di una fluorescenza specifica nella muscularis mucosae e nella musculare. (+): come per il controllo positivo, una fluorescenza specifica è osservata nella muscularis mucosae, nella musculare, nella sottomucosa gastrica e nelle pareti dei vasi renali. (2) AMA (-): assenza di una fluorescenza specifica nelle strutture epiteliali nei tubuli renali. (+): come per il controllo positivo, una fluorescenza specifica è osservata nel citoplasma dei tubuli renali distali e prossimali e nel citoplasma delle cellule parietali dello stomaco. (3) APCA (-): una fluorescenza non specifica è osservata nella mucosa dello stomaco. (+): come per il controllo positivo, una fluorescenza specifica è osservata nel citoplasma delle cellule parietali dello stomaco. *Considerato che AMA colorano anche cellule parietali, anche i tubuli renali dovrebbero essere 22

25 Italiano esaminati prima di riportare positività APCA. Quando viene interpretato come positivo ad una diluizione essere positivo per AMA, ASMA or APCA. 1:20 o maggiore, il campione è definito Controllo di Qualità Il siero di controllo positivo che è incluso nel kit dovrebbe essere testato ad ogni seduta per assicurarsi che tutti i reagenti e la procedura sono stati usati correttamente. Limitazioni Questo prodotto è per solo uso diagnostico. Non usare su esseri umani. I risultati del test dovrebbero essere usati assieme alle informazioni disponibili provenienti dalla valutazione clinica ed altre informazioni diagnostiche. Valori Attesi e Prestazioni Caratteristiche Campioni di pazienti e di soggetti normali che sono stati testati con FLUORO AID-1 Test. Malattia autoimmune del Malattia epatica virale Epatite acuta Epatite cronica AMA ASMA positivo negativo positivo negativo Non-A, Non-B Attiva Tipo B, Non Inattiva Tipo B, Non Cirrosi Epatoma Epatite alcolica Epatite indotta da farmaci Altre patologie epatiche Altre patologie epatiche Soggetti normali Cirrosi biliare primaria Epatite autoimmune Tipo A Tipo B Tipo B Non-B Bibliografia 1. Kaltskin G., Kantor F.S.,: Ann. Int. Med., 77: 553, Rodoriquez M., Paronetto F., Schaffner F., Popper H.: J.A.M.A.,208: 148, Berg P.A., Roitt IM., Doniach D., Cooper H.M.: Immunology, 17: 281, Waler J.G., Doniach D., Roitt I.M.,Sherlock S.: Lancet, 827, Mackay I.R.: N.Engl. J. Med., 258:185, Deodhar S. D., Yazbek A., Achkar E., Brown C.H.: Clev. Clin. Quart., 36: 95, Doniach D., Roitt I.M., Walker J.G., Sherlock S.: Clin. Exp. Immunol. 1:237, Berg P.A., Doniach D., Roitt I.M.: J.Exp. Med., 126:277, Doniach D., Delhanty J., Lindqvist H. J., Catterall R.D.: Clin. Exp. Immunol., 6:871,

26 Portugues Português Aplicação Diagnóstica O dispositivo FLUORO AID-1 TEST aplica-se na detecção de anticorpos anti mitocôndrias (AMA), anticorpos anti musculo liso (ASMA) e anticorpos anti célula parietal (APCA) no soro humano. Utilização exclusiva para diagnóstico in vitro. Resumo e Explicação A detecção de AMA e ASMA é muito útil para o diagnóstico de doenças hepáticas, particularmente na cirrose biliar primária (PBC) e hepatite crónica activa. Os AMA, que foram descritos pela primeira vez pelo Dr. Mackay, apresentam uma forte especificidade para a PBC. Embora se possam detectar titulos baixos de AMA em outras desordens do figado, incluindo hepatite crónica activa, cirrose criptogenica e hepatite induzida por fármacos, titulos elevados (x40 ou superior) estão presentes apenas na PBC. Para substituir a investigação cirurgica da PBC, recomenda-se a realização de testes para os AMA. Os ASMA, descritos pela primeira vez pelo Dr. Johnson, apresentam uma forte especificidade para a hepatite lupoide e hepatite crónica activa. Como os ASMA não são detectados no Lupus Eritematoso Sistémico (SLE), são muito úteis para diferenciar o SLE da hepatite lupoide. Está descrito que os titulos de ASMA são positivos na fase activa da doença e negativos na fase de remissão da doença. Os APCA estão associados com a gastrite autoimune tipo A (gastrite atrófica crónica) e anemia perniciosa em cerca de 90% dos doentes sendo muito útil para o diagnóstico. Os APCA são positivos em outras doença endocrinas autoimunes como a tiroidite e a diabetes mellitus insulino dependente. Princípio do método O dispositivo FLUORO AID-1 TEST detecta anticorpos anti mitocôndrias, anticorpos anti musculo liso e anticorpos anti célula parietal por Imunofluorescência indirecta. São utilizados estomâgo/rim de rato como substrato e fluoresceína isotiocianato (FITC) como corante fluorescente. Composição do dispositivo Lâminas com Substrato estomago/rim de rato Conjugado FITC de cabra anti Imunoglobulinas humanas. Contêm BSA 2%, azida de sódio e azul de Evans Tampão PBS Controlo Positivo AMA Soro humano (AMA positivo), contém BSA 2%, azida de sódio Controlo Positivo ASMA Soro humano (ASMA positivo), contém BSA 2%, azida de sódio Cod.nº4250E 40 poços 4 poços x 10 lâminas 4,5 ml x 1 fras. 9,1g (para 1000 ml) x 5 saquetas 0,5 ml x 1 frasco 0,5 ml x 1 frasco 24

27 Portugues Controlo Positivo APCA Soro humano (APCA positivo), contém BSA 2%, azida de sódio Meio de montagem Glicerol com tampão carbonado com 0,3% de Tricloro Ácido Acético 0,5 ml x 1 frasco 3,0 ml x 1 frasco Lamelas 10 Papel absorvente 20 Material necessário não fornecido com o dispositivo: Matraz de 500 ml, Frasco para lavagem, Agitador magnético, Câmera húmida, cuvete, Água destilada ou desionizada, Microscópio de fluorescência equipado com filtro azul. Precauções (1) Os controlos positivos são derivados de soro humano, negativos para antigénio HBs, anticorpo HIV (HIV-1 e HIV-2) e anticorpo HCV. Contudo, todas as amostras e todo o material clinico deve ser manipulado como material potencialmente infectante. (2) O conjugado FITC e os controlos positivos contém azida de sódio (0,09%), utilizada como conservante, deve ser manipulada com cuidado não ingerir, evitar o contacto com a pele e mucosas. A azida de sódio pode reagir com o cobre ou com o chumbo das canalizações, formando azidas metálicas explosivas. Quando deitar fora os restos de reagentes deve deixar correr água em abundância para evitar a deposição de residuos na canalização. (3) Alguns componentes do dispositivo contêm materiais de origem animal, animais não-infecciosos. No entanto, estes componentes devem ser tratados como material potencialmente contaminante durante o seu uso e eliminação. (4) O meio de montagem contem 0,3% de Ácido tricloroacético, o qual é prejudicial para os organismos aquáticos e pode provocar efeitos adversos prolongados no meio aquático. Este material e o frasco têm de ser eliminados como lixo contaminante. Conservação e Estabilidade Todos os componentes do dispositivo devem ser conservados a 2-8 ºC. Todos os reagentes são estáveis durante 12 meses após a data de fabrico, quando conservados a 2-8ºC. Técnica 1) Preparação dos reagentes Deixar as lâminas atingir a temperatura ambiente dentro da saqueta, para prevenir a condensação na superficie da lâmina. * Selar as lâminas de vidro não utilizadas com dessecante, de forma a mante-las secas durante o armazenamento. Preparar o PBS concentrado, diluindo o pó de 1 saqueta de PBS em 1000 ml de àgua destilada. * Não diluir os outros reagentes, estão prontos a usar. 25