Úloha 1 a 2: Plynová chromatografia na náplňových kolónach

Transcript

1 Úloha 1 a 2: Plynová chromatografia na náplňových kolónach Analýza alkoholov plynovou chromatografiou, precvičenie kvalitatívnej a kvantitatívnej analýzy Literatúra: Knižka: M.Čakrt a kol.: Praktikum z analytickej chémie, Príncíp a pracovná technika GC : str Vyhodnotenie výsledkov GC: str Základy kvantitatívnej analýzy str text k podobnej úlohe (str ) skriptá: D.Bustin a kol.: Analytická chémia II, teória str. 5-12, elučné charakteristiky str , prístrojová technika str , Príprava na laboratórne cvičenie pozostáva zo zvládnutia informácií, ktoré sa pre plynovú chromatografiu nachádzajú v uvedených textoch. Keďže plynová chromatografia predstavuje súčasť separačných metód, ktoré využívajú pomerne veľa spoločných princípov pre získavanie údajov alebo spôsobov spracovania údajov, informácie sú v tejto literatúre niekedy uvedené spoločne. Všímajte si predovšetkým základné princípy činnosti a vysvetlenia pojmov, ktoré máte v ďalšom texte podčiarknuté. 1. Práca s plynovým chromatografom 1.1. Nastavenie prístroja Postup je uvedený pre Vašu informáciu, keďže trvá pomerne dlho vzhľadom na Vaše laboratórne cvičenie, prístroj pre Vašu prácu zapne učiteľ pred začatím cvičenia. Pri ovládaní plynového chromatografu treba vždy postupovať podľa návodu od výrobcu, ktorý obsahuje potrebné parametre a postupnosti práce. Otvoria sa ventily na tlakových fľašiach s dusíkom (používa sa ako nosný plyn), vodíkom a vzduchom (plyny do plameňovoionizačného detektora). Ihlovým ventilom resp. regulátorom tlaku na prístroji sa nastaví hodnota ktorá zodpovedá optimálnemu prietoku nosného plynu - mobilnej fázy v chromatografickej kolóne. Používajú sa nerezové náplňové kolóny buď s náplňou Porapac Q, alebo so stacionárnou fázou Carbowax 20M na nosiči. Po zapnutí prístroja a bloku na reguláciu teploty sa vyhrejú príslušné časti plynového chromatografu: termostat, dávkovač, detektor. Prístroj je vybavený regulátorom teploty, ktorý umožňuje prácu v izotermickom režime. Ihlovými ventilmi na prístroji sa nastavia prietoky vodíka a vzduchu do detektora (návod k prístroju vždy obsahuje závislosti signálu detektora od prietoku pracovných plynov). Po vyhriatí detektora na teplotu 200 C sa zapáli plamienok v detektore. Opatrne sa nasadí telo detektora, prietok vodíka sa zníži na optimálnu hodnotu. Po ustálení plameňa (asi 5 min) sa prepne elektrometer do polohy pre plameňovoionizačný detektor a zapne sa zapisovač, resp. integrátor.

2 1.2. Príprava na meranie Zoznámte sa s blokovou schémou uvedenou v učebnici a preštudujte k jednotlivým častiam chromatografu príslušné vysvetlenia činnosti Technika dávkovania Dávkovanie do prístroja sa vykonáva mikrostriekačkou cez gumové septum, ktoré utesňuje dávkovací priestor. Dávkuje sa objem 1 (prístroj 1) alebo 1-2 μl roztokov (prístroj 2). Techniku používania striekačky Vám ukáže vyučujúci. Pri stlačení piestika striekačky sa vzorka dostane do kolóny a zároveň je potrebné začať zaznamenávať signál z detektora na integratóre (integrátor sa zapne tlačítkom START). Po ukončení merania sa integrátor vypne tlačítkom STOP. Medzi nasledujúcimi dávkovaniami sa striekačka dobre premyje rozpúšťadlom, v tejto úlohe deionizovanou vodou. Dávkovanie A B Dávkovanie s vymytím ihly C D Vzorka Vzduch Vzduch Rozpúšťadlo 2. Meranie Kvalitatívna analýza alkoholov sa vykoná porovnaním základných a relatívnych elučných charakteristík zložiek vo vzorke s charakteristikami poskytnutých porovnávacích látok. Zo zásobnej fľaše odlejte do príslušnej vzorkovacej nádobky malý objem roztoku porovnávacej látky (alkoholy, izo-alkoholy a sekundárne alkoholy). Pred dávkovaním každého roztoku striekačku najprv prepláchnite rozpúšťadlom (vodou) a potom naberte zvolený objem (pre každé dávkovanie rovnaký) roztoku, ktorý sa má dávkovať, a zároveň naberte metán z prívodu pre plyn. Pomocou metánu sa v každej analyze zistí mŕtvy čas. Postupne nadávkujte roztoky všetkých porovnávacích látok (jednotlivo alebo v zmesiach homológov) a jednu vzorku s označením A (prístroj 1) alebo C (prístroj 2). Pri dávkovaní sa hneď so stlačením piestika striekačky začne odmeriavať čas analýzy, elučný čas jednotlivých látok na chromatograme sa zaznamená (čas v maxime píku). Je potrebné počkať, aby všetky látky vyšli z kolóny, až potom je možné dávkovať ďalší roztok. Každý roztok sa dávkuje 2x (v prípade, že sa dvojica chromatogramov výraznejšie líši, aj viackrát).

3 Kvantitatívna analýza etanolu vo vzorke sa vykoná kombinovanou metódou kalibračnej krivky s vnútorným štandardom. Preštudujte si prácu a výpočty pre metódu vnútorného štandardu a premyslite si ako sa táto metóda spojí s metódou kalibračnej krivky. Skonzultujte s vyučujúcim. Na získanie kalibračnej krivky nadávkujte rovnakým spôsobom postupne rovnaké objemy roztokov etanolu s koncentráciou 0,2% - 1%. Každý z nich obsahuje zároveň 0,4% propanolu ako vnútorný štandard s rovnakou koncentráciou vo všetkých roztokoch. Nadávkujte roztok vzorky s označením A (prístroj 1) alebo B (prístroj 2), Vzorky už obsahujú propanol ako vnútorný štandard s rovnakou koncentráciou ako v kalibračných roztokoch. Každý roztok sa dávkuje 3x. Vypínanie prístroja Postup je uvedený len pre Vašu informáciu. Ako prvé je potrebné vypnúť elektromer na prístroji a zapisovač, odstaviť ventilom na stole prívod vodíka do detektorov, aby zhasol plamienok. Vypnú sa teplotné panely hlavným vypínačom. Zapne sa ventilácia prístroja, resp. sa otvoria dvierka termostatu, aby sa vychladila kolóna. Prístroj sa vypne hlavným vypínačom. Zastaví sa prívod vzduchu a dusíka na stole a zatvoria sa hlavné ventily tlakových fliaš. 3. Vyhodnotenie výsledkov 1. Z chromatogramov jednotlivých roztokov zistite elučné časy pre zaznamenané píky a vypočítajte kapacitné pomery. 2. Porovnaním elučných charakteristík identifikujte zložky v neznámej vzorke A. 3. Nakreslite závislosti logaritmov kapacitných pomerov od počtu uhlíkových atómov pre homologický rad alkoholov, 2-alkoholov a izoalkoholov (do jedného grafu). Zhodnoťte získaný graf a využite ho pre kvalitatívnu analýzu. 4. Na základe plôch alebo (výšok) píkov s použitím metódy vnútorného štandardu kombinovanej s metódou kalibračnej krivky zistite množstvo etanolu v neznámej vzorke. Kalibračnú krivku znázornite a zhodnoťte vhodnosť použitia lineárnej regresie. 5. Nakreslite a vyhodnoťte aj kalibračnú krivku bez použitia vnútorného štandardu. Porovnajte odchýlky kalibrácie oboma metódami. Protokol: okrem princípu, stručného postupu a potrebných vzťahov pre výpočet musí obsahovať 1. Namerané chromatografické záznamy. 2. Tabuľky s nameranými a vypočítanými elučnými charakteristikami pre zložky neznámej vzorky a porovnávacie látky. 3. Ukážkové výpočty elučných charakteristík a výpočet koncentrácie sledovanej látky v neznámej vzorke 4. Grafy podľa bodov 3-5 Vyhodnotenia výsledkov. 5. Odpovede na otázky zadané k úlohe vyučujúcim. 6. Záver a zhodnotenie práce. (Záver musí obsahovať číslo vzorky)!

4

5 Úlohy 3 a 4: Kapilárna plynová chromatografia (CGC - capillary gas chromatography) Analýza neznámej vzorky plynovou chromatografiou, precvičenie identifikácie pomocou tabelovaných údajov, charakterizácia separačných vlastností kolóny Literatúra: Knižka: M.Čakrt a kol.: Praktikum z analytickej chémie, Príncíp a pracovná technika GC : str Vyhodnotenie výsledkov GC: str text k podobnej úlohe (str ) skriptá: D.Bustin a kol.: Analytická chémia II, teória str. 5-12, elučné charakteristiky str.13-21, prístrojová technika str , Príprava na laboratórne cvičenie pozostáva zo zvládnutia informácií, ktoré sa pre plynovú chromatografiu nachádzajú v uvedených textoch. Keďže plynová chromatografia predstavuje časť separačných metód, ktoré využívajú pomerne veľa spoločných princípov pre získavanie údajov alebo spôsobov spracovania údajov, informácie sú v tejto literatúre niekedy uvedené spoločne. Všímajte si predovšetkým základné princípy činnosti a vysvetlenia pojmov, ktoré máte v ďalšom texte podčiarknuté. 1. Práca s plynovým chromatografom 1.1. Nastavenie prístroja Postup je uvedený pre Vašu informáciu, keďže trvá pomerne dlho vzhľadom na Vaše laboratórne cvičenie, prístroj pre Vašu prácu zapne učiteľ. Pri ovládaní plynového chromatografu treba vždy postupovať podľa návodu od výrobcu, ktorý obsahuje potrebné parametre a postupnosti práce. Otvoria sa ventily na tlakových fľašiach s dusíkom (používa sa ako nosný plyn), vodíkom a vzduchom (plyny do plameňovoionizačného detektora). Ihlovým ventilom resp. regulátorom tlaku na prístroji sa nastaví hodnota tlaku nosného plynu, ktorá zodpovedá optimálnemu prietoku nosného plynu - mobilnej fázy v chromatografickej kolóne. Používa sa kremenná kapilárna kolóna s polydimetylsiloxánovou stacionárnou fázou na vnútornom povrchu kapiláry. V dávkovači sa používa delič nosného plynu do kolóny a do ovzdušia. Po zapnutí prístroja a bloku na reguláciu teploty sa vyhrejú príslušné časti plynového chromatografu: termostat, dávkovač, detektor. Prístroj je vybavený regulátorom teploty, ktorý umožňuje prácu v izotermickom režime. Ihlovými ventilmi na prístroji sa nastavia tlaky, zodpovedajúce potrebného prietoku vodíka a vzduchu do detektora (návod k prístroju vždy obsahuje závislosti signálu detektora od prietoku pracovných plynov). Po vyhriatí detektora na teplotu C sa zapáli plamienok v detektore. Po ustálení plameňa (asi 5 min) sa prepne elektromer do polohy pre plameňovoionizačný detector, zapne sa zapisovač, resp. integrator.

6 1.2. Príprava na meranie Zoznámte sa s blokovou schémou uvedenou v učebnici a preštudujte k jednotlivým častiam chromatografu príslušné vysvetlenia činnosti Technika dávkovania Dávkovanie do prístroja sa vykonáva mikrostriekačkou cez gumové septum, ktoré utesňuje dávkovací priestor. Dávkuje sa objem 1 (prístroj 1) alebo 1-2 μl roztokov (prístroj 2). Techniku používania striekačky Vám ukáže vyučujúci. Pri stlačení piestika striekačky sa vzorka dostane do kolóny a zároveň je potrebné začať zaznamenávať signál z detektora na integratóre (integrátor sa zapne tlačítkom START). Po ukončení merania sa integrátor vypne tlačítkom STOP. Medzi nasledujúcimi dávkovaniami sa striekačka dobre premyje rozpúšťadlom, v tejto úlohe deionizovanou vodou. Dávkovanie A B Dávkovanie s vymytím ihly C D Vzorka Vzduch Vzduch Rozpúšťadlo 2. Meranie Kvalitatívna analýza neznámej vzorky je založená na výpočte relatívnych elučných charakteristík - Kovátsových indexov (treba vedieť definíciu a použitie) zložiek vo vzorke a ich porovnaní s tabuľkovými hodnotami. Pred dávkovaním každého roztoku sa striekačka najprv prepláchne rozpúšťadlom v tejto úlohe n-hexánom. Z nádobky s príslušným roztokom sa naberie do striekačky 1 μl roztoku a zároveň sa musí spolu dávkovať plyn obsahujúci metán na určenie mŕtveho času v každej analýze. Je potrebné analyzovať vhodnú zmes n-alkánov, ktoré sú referenčnými látkami pre výpočet Kovátsových indexov, a roztok vzorky. Na chromatograme vzorky sa určia chromatografické píky prislúchajúce n-alkánom a vypočítajú sa Kovátsove indexy pre všetky zložky vzorky. Na hodnotenie separačných vlastností kolóny sa použijú údaje získané z analýzy n- alkánov a vzorky, elučné časy a šírky píkov v polovičnej výške, ktoré poskytuje integrátor. Hodnotí sa účinnosť, miera rozlíšenia susedných píkov a píková kapacita.

7 Vypínanie prístroja Postup je uvedený len pre Vašu informáciu. Ako prvé je potrebné vypnúť elektromer na prístroji a zapisovač, odstaviť ventilom na stole prívod vodíka do detektorov, aby zhasol plamienok. Prepínač termostatu sa prepne do polohy pre ventiláciu, resp. sa otvoria dvierka termostatu, aby sa vychladila kolóna. Prístroj sa vypne hlavným vypínačom. Zastaví sa prívod vzduchu a dusíka na stole a zatvoria sa hlavné ventily tlakových fliaš. 3. Vyhodnotenie výsledkov 1. Z chromatogramov analýz jednotlivých roztokov zistite elučné časy a vypočítajte redukované elučné časy pre zložky vzorky a n-alkány. 2. Identifikujte jednotlivé n-alkány na chromatograme z analýzy vzorky. Znázornite závislosť elučných charakteristík pre homologický rad látok v plynovej chromatografii za izotermických podmienok 3. Vypočítajte Kovátsove indexy pre zložky vzorky. 4. Vyhľadajte v poskytnutej tabuľke látky, pre ktoré sa zhodujú indexy pri 60 C, 70 C a vypočítajte ΔI/ΔT, podľa zadania vyučujúceho. 5. Vypočítajte charakteristiky účinnosti kolóny - počet teoretických priehradiek pre vybrané látky rôznej chemickej povahy, separačné číslo pre n-alkány nonán a dekán. 6. Vyberte si dvojice susediacich chromatografických píkov, ktoré sa prekrývajú v rôznej miere a vypočítajte ich rozlíšenie a elučný pomer. Navrhnite, ako by sa tieto hodnoty dali použiť pri optimalizácii pracovných parametrov. Protokol: okrem princípu, stručného postupu a potrebných vzťahov pre výpočet musí obsahovať: 1. Namerané chromatografické záznamy 2. Tabuľka s elučnými hodnotami pre n-alkány 3. Tabuľky s nameranými a vypočítanými elučnými charakteristikami (podľa bodu 1,3 z časti vyhodnotenie výsledkov) pre zložky neznámej vzorky spolu s priradenými údajmi z tabuliek indexov. 4. Vypočítané hodnoty a príslušné zhodnotenia podľa bodov 2, 5 a 6 z časti Vyhodnotenie výsledkov 5. Odpovede na otázky zadané k úlohe vyučujúcim 6. Záver a zhodnotenie práce. (Záver musí obsahovať číslo vzorky)!

8

9 Úloha č. 5 Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia na obrátených fázach (RP HPLC reversed phase high performance liquid chromatography). Literatúra: Skriptá: D.Bustin a kol.: Analytická chémia II, Princíp, prístrojová technika: str. 5-12, 21-22, 26-29, 31-32, Elučné charakteristiky: str 13-15, 18 knižka: M.Čakrt a kol.: Praktikum z analytickej chémie, Mobilné fázy v HPLC : str Vyhodnotenie výsledkov v HPLC: str Základy kvantitatívnej analýzy: str Príprava na laboratórne cvičenie pozostáva zo zvládnutia informácií, ktoré sa pre HPLC nachádzajú v uvedených textoch. Keďže HPLC predstavuje jednu zo separačných metód, ktoré využívajú pomerne veľa spoločných princípov pre získavanie údajov alebo spôsobov spracovania údajov, informácie sú v tejto literatúre niekedy uvedené spoločne. V uvedenej literature sa všímajte predovšetkým základné princípy činnosti a vysvetlenia pojmov, ktoré máte v tomto návode podčiarknuté. 1. Spracovanie vzorky Po odobratí vzorky odpadovej vody sa vzorka stabilizuje prídavkom mg siričitanu sodného na 1 l vody, upraví sa ph na hodnotu 2 prídavkom kyseliny chlorovodíkovej. Predseparácia a prekoncentrácia sa uskutoční pretlačením vzorky vody cez sorpčnú kolónku so silikagélom C18, na ktorom sa zachytia sledované zložky zo vzorky (technika SPE): Príprava kolónky: kondiciovanie prepláchnutím neskôr používanými rozpúštadlami, kolónka sa vysuší prúdom dusíka, prepláchne sa vodou s čistotou pre HPLC. Predseparácia vzorky: Predpísaný objem vzorky upravenej vody sa presaje cez sorpčnú kolónku s prietokom približne 1 ml/min pomocou slabého vákua na výstupe z kolónky, potom sa kolónka suší 10 min v prúde dusíka alebo suchého prečisteného vzduchu, analyzované látky sa eluujú z kolónky vybraným rozpúšťadlom. Výsledný roztok sa analyzuje pomocou kvapalinovej chromatografie. 2. Príprava na meranie Zoznámte sa s blokovou schémou zariadenia v študijnej literatúre a preštudujte k jednotlivým častiam princíp ich činnosti resp. úlohu, ktorú spĺňajú. Prezrite si prístroj a pokúste sa identifikovať základné prvky prístroja podľa blokovej schémy uvedenej v učebnici. Zaznamenajte potrebné informácie: kolóna, typ stacionárnej fázy, charakteristiky náplne kolóny, zloženie mobilnej fázy, prietok mobilnej fázy, pracovný tlak na vstupe do kolóny, princíp detekcie, parametre detektora. (v príprave na úlohu treba zvládnuť najdôležitejšie charakteristiky materiálov resp. rozsahy pracovných parametrov).

10 3. Technika dávkovania Dávkovací ventil prepnite do polohy Plnenie slučky. Zasuňte striekačku s dávkovaným roztokom. Miernym prítlakom pomaly stláčajte piest a sledujte pohyb kvapaliny v hadičke vedúcej do odpadu (ak sa kvapalina v nej posunie o 3-5 cm, dá sa predpokladať, že dávkovacia slučka je dostatočne premytá a naplnená). Prepnite ventil do polohy Dávkovanie a analýza. Zároveň stlačte tlačítko Mark na detektore vyšle impulz na zapisovač alebo integrátor. Ventil sa prepína z jednej krajnej polohy do druhej v priebehu asi pol sekundy (nesmie ostať v medzipolohe, pretože ventil je tak nepriechodný a začne sa rýchlo zvyšovať tlak). Striekačku vytiahnite až po prepnutí ventilu. V opačnom prípade by do dávkovacej slučky mohol vniknúť vzduch a vzduchové bubliny v detektore by spôsobili veľké skokové zmeny signálu alebo by sa hromadili v kolóne a tým zhoršovali jej vlastnosti. Plnenie slučky Dávkovanie a analýza 4. Meranie Na dávkovanie každého roztoku používajte inú striekačku. Postupne nadávkujte roztoky všetkých porovnávacích látok a vzorky. Každý roztok nadávkujte dvakrát (v prípade, že sa dvojica chromatogramov výraznejšie líši, aj viackrát). Vzorka sa dávkuje trikrát. Ako mŕtvy čas sa použije elučný čas pre malý rozpúšťadlový pík, ktorý sa objaví pri každom dávkovaní (alebo sa analyzuje látka, ktorá sa na kolóne nezadržiava).

11 Úloha č. 5 Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia na obrátených fázach Analýza aromatických uhľovodíkov vo vzorkách vôd po predseparačnej úprave extrakciou na tuhej fáze Chromatografické podmienky: Stacionárna fáza: silikagél s chemicky viazaným oktadecylsilánom - Separon SGX C18 (150x3 mm, 5 μm) Mobilná fáza: acetonitril / voda v pomere 60 / 40 (v/v) Detekcia: spektrofotometrická pri vlnovej dĺžke 254 nm Dávkovaný objem: 20 μl Prietok mobilnej fázy: 0.5 ml/min Teplota kolóny: laboratórna Predseparačná úprava vzorky vody extrakciou na tuhej fáze (SPE): - Po odobratí vzorky odpadovej vody sa vzorka stabilizuje prídavkom mg siričitanu sodného na 1 l vody, upraví sa ph na hodnotu 2 prídavkom kyseliny chlorovodíkovej (1 mol/l). - Predseparácia a predkoncentrácia sa uskutoční pretlačením vzorky vody cez sorpčnú kolónku (sorbent kolónky je tvorený chemicky viazaným oktadecylsilánom) (SEP PAK): (i) Príprava kolónky na extrakciu: kondicionovanie premytím s 2 ml metanolu a potom s 2 ml deionizovanej vody a hneď sa pokračuje podľa bodu (ii). (ii) Predseparácia vzorky na kolónke: prietokom zhruba 1 ml/min sa presaje zvolené množstvo vzorky (10 ml) cez kolónku a hneď sa pokračuje podľa bodu (iii). (iii) Premytie kolónky: kolónka sa premyje s 2 ml deionizovanej vody a následne sa (iiii) vysuší vákuom asi 10 min. Elúcia žiadaných zložiek z kolónky: analyzované látky sa vymyjú z kolónky 1 ml acetonitrilu. Výťažnosť predseparačného postupu je pre antracén 85%, pre benzén 65%, pre naftalén 86%, pre naftol 81% a pre p-xylén 75%. Výsledný roztok (extrakt) sa analyzuje pomocou kvapalinovej chromatografie. Zaznamenajte potrebné informácie: kolóna, typ stacionárnej fázy, charakteristiky náplne kolóny, zloženie mobilnej fázy, prietok mobilnej fázy, pracovný tlak na vstupe do kolóny, princíp detekcie, parametre detektora. Meranie: Pomocou pripravených porovnávacích roztokov so známou koncentráciou jednotlivých aromatických zlúčenín sa analýzou zistia príslušné elučné charakteristiky potrebné na kvalitatívnu analýzu. Na chromatograme z analýzy upravenej neznámej vzorky sa identifikujú prítomné zložky. Na určenie mŕtveho elučného času sa analyzuje roztok NaNO 2.

12 Vyhodnoťte: 1. Z chromatogramov zistite elučné časy analyzovaných látok. 2. Vypočítajte kapacitné pomery (retenčné faktory) a identifikujte zložky v neznámej vzorke. 3. Vypočítajte charakteristiky účinnosti separácie: počet teoretických priehradiek a píkovú kapacitu. Vypočítajte vzájomné rozlíšenie pre susedné píky. 4. Na základe výšok píkov s použitím metódy vonkajšieho štandardu (porovnanie s jedným vonkajším štandardom) zistite obsah jednotlivých zložiek v neznámej vzorke. Nezabudnite, že vzorkou je odpadová voda a nie len jej spracovaním vzniknutý roztok v organickom rozpúšťadle, ktorý ste analyzovali. Protokol: Okrem princípu, stručného postupu a potrebných vzťahov pre výpočet musí obsahovať: 1. Tabuľku s nameranými a vypočítanými údajmi pre HPLC elučné časy a retenčné faktory, výšky píkov, koncentrácie roztokov porovnávacích látok, charakteristiky účinnosti separácie (počet teoretických riehradiek, píkovú kapacitu, rozlíšenie). Pre opakované merania priemerné hodnoty výšok píkov a smerodajnú odchýlku. 2. Závislosť logaritmov kapacitných pomerov od počtu aromatických jadier pre benzén, naftalén, fenantrén. Slovne zhodnoťte získaný graf. 3. Vzorový výpočet obsahu identifikovaných zložiek v dávkovanom roztoku upravenej vzorky a pôvodnej vzorky vody. 5. Záver a zhodnotenie práce.

13 Úloha č. 6 Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia na obrátených fázach (RP HPLC reversed phase high performance liquid chromatography). Literatúra: Skriptá: D.Bustin a kol.: Analytická chémia II, Princíp, prístrojová technika: str. 5-12, 21-22, 26-29, 31-32, Elučné charakteristiky: str 13-15, 18 knižka: M.Čakrt a kol.: Praktikum z analytickej chémie, Mobilné fázy v HPLC : str Vyhodnotenie výsledkov v HPLC: str Základy kvantitatívnej analýzy: str Príprava na laboratórne cvičenie pozostáva zo zvládnutia informácií, ktoré sa pre HPLC nachádzajú v uvedených textoch. Keďže HPLC predstavuje jednu zo separačných metód, ktoré využívajú pomerne veľa spoločných princípov pre získavanie údajov alebo spôsobov spracovania údajov, informácie sú v tejto literatúre niekedy uvedené spoločne. V uvedenej literature sa všímajte predovšetkým základné princípy činnosti a vysvetlenia pojmov, ktoré máte v tomto návode podčiarknuté. 1. Spracovanie vzorky Po odobratí vzorky odpadovej vody sa vzorka stabilizuje prídavkom mg siričitanu sodného na 1 l vody, upraví sa ph na hodnotu 2 prídavkom kyseliny chlorovodíkovej. Predseparácia a prekoncentrácia sa uskutoční pretlačením vzorky vody cez sorpčnú kolónku s silikagélom C18, na ktorom sa zachytia sledované zložky zo vzorky (technika SPE): Príprava kolónky: kondiciovanie prepláchnutím neskôr používanými rozpúštadlami, kolónka sa vysuší prúdom dusíka, prepláchne sa vodou s čistotou pre HPLC. Predseparácia vzorky: Predpísaný objem vzorky upravenej vody sa presaje cez sorpčnú kolónku s prietokom približne 1 ml/min pomocou slabého vákua na výstupe z kolónky, potom sa kolónka suší 10 min v prúde dusíka alebo suchého prečisteného vzduchu, analyzované látky sa eluujú z kolónky vybraným rozpúšťadlom. Výsledný roztok sa analyzuje pomocou kvapalinovej chromatografie. 2. Príprava na meranie Zoznámte sa s blokovou schémou zariadenia v študijnej literatúre a preštudujte k jednotlivým častiam princíp ich činnosti resp. úlohu, ktorú spĺňajú. Prezrite si prístroj a pokúste sa identifikovať základné prvky prístroja podľa blokovej schémy uvedenej v učebnici. Zaznamenajte potrebné informácie: kolóna, typ stacionárnej fázy, charakteristiky náplne kolóny, zloženie mobilnej fázy, prietok mobilnej fázy, pracovný tlak na vstupe do kolóny, princíp detekcie, parametre detektora. (v príprave na úlohu treba zvládnuť najdôležitejšie charakteristiky materiálov resp. rozsahy pracovných parametrov).

14 3. Technika dávkovania Dávkovací ventil prepnite do polohy Plnenie slučky. Zasuňte striekačku s dávkovaným roztokom. Miernym prítlakom pomaly stláčajte piest a sledujte pohyb kvapaliny v hadičke vedúcej do odpadu (ak sa kvapalina v nej posunie o 3-5 cm, dá sa predpokladať, že dávkovacia slučka je dostatočne premytá a naplnená). Prepnite ventil do polohy Dávkovanie a analýza. Zároveň stlačte tlačítko Mark na detektore vyšle impulz na zapisovač alebo integrátor. Ventil sa prepína z jednej krajnej polohy do druhej v priebehu asi pol sekundy (nesmie ostať v medzipolohe, pretože ventil je tak nepriechodný a začne sa rýchlo zvyšovať tlak). Striekačku vytiahnite až po prepnutí ventilu. V opačnom prípade by do dávkovacej slučky mohol vniknúť vzduch a vzduchové bubliny v detektore by spôsobili veľké skokové zmeny signálu alebo by sa hromadili v kolóne a tým zhoršovali jej vlastnosti. Plnenie slučky Dávkovanie a analýza 4. Meranie Na dávkovanie každého roztoku používajte inú striekačku. Postupne nadávkujte roztoky všetkých porovnávacích látok a vzorky. Každý roztok nadávkujte dvakrát (v prípade, že sa dvojica chromatogramov výraznejšie líši, aj viackrát). Vzorka sa dávkuje trikrát. Ako mŕtvy čas sa použije elučný čas pre malý rozpúšťadlový pík, ktorý sa objaví pri každom dávkovaní (alebo sa analyzuje látka, ktorá sa na kolóne nezadržiava).

15 Úloha č. 6 Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia na obrátených fázach Analýza fenolických zlúčenín vo vzorkách vôd po predseparačnej úprave extrakciou na tuhej fáze Chromatografické podmienky: Stacionárna fáza: silikagél s chemicky viazaným oktadecylsilánom - Separon SGX C18 (150x3 mm, 5 μm) Mobilná fáza: metanol / voda v pomere 50 / 50 (v/v) Detekcia: spektrofotometrická pri vlnovej dĺžke 272 nm Dávkovaný objem: 20 μl Prietok mobilnej fázy: 0.5 ml/min Teplota kolóny: laboratórna Predseparačná úprava vzorky vody extrakciou na tuhej fáze (SPE): - Po odobratí vzorky odpadovej vody sa vzorka stabilizuje prídavkom mg siričitanu sodného na 1 l vody, upraví sa ph na hodnotu 2 prídavkom kyseliny chlorovodíkovej (1 mol/l). - Predseparácia a predkoncentrácia sa uskutoční pretlačením vzorky vody cez sorpčnú kolónku (sorbent kolónky je tvorený chemicky viazaným oktadecylsilánom) (SEP PAK): (i) Príprava kolónky na extrakciu: kondicionovanie premytím s 2 ml metanolu a potom s 2 ml 10 mmol/l HCl a hneď sa pokračuje podľa bodu (ii). (ii) Predseparácia vzorky na kolónke: prietokom zhruba 1 ml/min sa presaje zvolené množstvo vzorky (10 ml) cez kolónku a hneď sa pokračuje podľa bodu (iii). (iii) Premytie kolónky: kolónka sa premyje s 2 ml 10 mmol/l HCl a následne sa vysuší (iiii) vákuom asi 10 min. Elúcia žiadaných zložiek z kolónky: analyzované látky sa vymyjú z kolónky 1 ml metanolu. Výťažnosť predseparačného postupu je 90 %. Výsledný roztok (extrakt) sa analyzuje pomocou kvapalinovej chromatografie. Zaznamenajte potrebné informácie: kolóna, typ stacionárnej fázy, charakteristiky náplne kolóny, zloženie mobilnej fázy, prietok mobilnej fázy, princíp detekcie, parametre detektora. Meranie: Pomocou pripravených porovnávacích roztokov jednotlivých fenolických zlúčenín (p-nitrofenol, m-krezol, fenol) sa analýzou zistia príslušné elučné charakteristiky potrebné na kvalitatívnu analýzu. Na chromatograme z analýzy upravenej neznámej vzorky sa identifikujú prítomné zložky. Pre kvantitatívnu analýzu tejto zlúčeniny sa pripraví zásobný roztok identifikovanej látky s koncentráciou 1 mg/ml (rozpúšťadlo voda) a z neho sa pripravia kalibračné roztoky v rozsahu koncentrácií 0,01-0,1 mg/ml. Postupným dávkovaním kalibračných roztokov (najmenej 2x každý roztok) sa nameria kalibračná závislosť a vypočíta sa obsah zložky vo vzorke. Na určenie mŕtveho elučného času sa analyzuje roztok NaNO 2.

16 Vyhodnotenie: 1. Z chromatogramov zistite elučné časy analyzovaných látok. 2. Vypočítajte kapacitné pomery (retenčné faktory) a identifikujte zložky v neznámej vzorke. 3. Vypočítajte charakteristiky účinnosti separácie: počet teoretických riehradiek a píkovú kapacitu. Vypočítajte vzájomné rozlíšenie pre susedné píky. 4. Na základe výšok píkov s použitím metódy kalibračnej krivky zistite obsah jednotlivých zložiek v upravenom extrakte z neznámej vzorky. Nezabudnite, že vzorkou je odpadová voda a nie len jej spracovaním vzniknutý metanolický roztok, ktorý ste analyzovali. Protokol: Okrem princípu, stručného postupu a potrebných vzťahov pre výpočet musí obsahovať: 1. Tabuľku s nameranými a vypočítanými údajmi pre HPLC elučné časy a retenčné faktory pre porovnávacie látky a extrakt vzorky, výšky píkov vo vzorke a v kalibračných roztokoch a ich koncentrácie (Pre opakované merania priemerné hodnoty výšok píkov, smerodajnú odchýlku.), charakteristiky účinnosti separácie. 2. Vzorový výpočet obsahu identifikovaných zložiek v dávkovanom roztoku upravenej vzorky a pôvodnej vzorke vody. 4. Záver a zhodnotenie práce.

17 Úloha č. 7 Analýza iónových zlúčenín vysokoúčinná iónová chromatografia Porovnanie s chromatografickou analýzou na tenkej vrstve Literatúra: Skriptá: D.Bustin a kol.: Analytická chémia II, Princíp, prístrojová technika str. 5-12, 21-22, 26-29, 31-32, Elučné charakteristiky str , 18 Chromatografia na tenkej vrstve str , 32-33, knižka: M.Čakrt a kol.: Praktikum z analytickej chémie, Základy chromatografie na ionexoch str , Vyhodnotenie výsledkov HPLC str Základy kvantitatívnej analýzy: str Chromatografia na tenkej vrstve str , , HPLC Príprava na laboratórne cvičenie pozostáva zo zvládnutia informácií, ktoré sa nachádzajú v uvedených textoch. Keďže chromatografia na ionexoch predstavuje súčasť separačných metód, ktoré využívajú pomerne veľa spoločných princípov pre získavanie údajov alebo spôsobov spracovania údajov, informácie sú v tejto literatúre niekedy uvedené spoločne. Všímajte si predovšetkým základné princípy činnosti a vysvetlenia pojmov, ktoré máte v ďalšom texte podčiarknuté. 1. Nastavenie prístrojov a príprava na meranie Zoznámte sa s blokovou schémou zariadenia v študijnej literature a preštudujte k jednotlivým častiam princíp ich činnosti resp. úlohu, ktorú spĺňajú. Prezrite si prístroj a pokúste sa identifikovať základné prvky prístroja podľa blokovej schémy uvedenej v učebnici a ich funkciu. Zaznamenajte potrebné informácie: kolóna, typ stacionárnej fázy, charakteristiky náplne kolóny, zloženie mobilnej fázy, prietok mobilnej fázy, pracovný tlak na vstupe do kolóny, princíp detekcie, parametre detektora. (v príprave na úlohu treba zvládnuť najdôležitejšie charakteristiky materiálov resp. rozsahy pracovných parametrov). 2. Technika dávkovania Dávkovací ventil prepnite do polohy Plnenie slučky. Zasuňte striekačku s dávkovaným roztokom. Miernym prítlakom pomaly stláčajte piest a sledujte pohyb kvapaliny v hadičke vedúcej do odpadu (ak sa kvapalina v nej posunie o 3-5 cm, dá sa predpokladať, že dávkovacia slučka je dostatočne premytá a naplnená). Prepnite ventil do polohy Dávkovanie a analýza. Zároveň stlačte tlačítko Mark na detektore vyšle impulz na zapisovač alebo integrátor. Ventil sa prepína z jednej krajnej polohy do druhej v priebehu asi pol sekundy (nesmie ostať v medzipolohe, pretože ventil je tak nepriechodný a začne sa rýchlo zvyšovať tlak). Striekačku vytiahnite až po prepnutí ventilu. V opačnom prípade by do dávkovacej slučky mohol vniknúť vzduch a vzduchové bubliny v detektore by spôsobili veľké skokové zmeny signálu alebo by sa hromadili v kolóne a tým zhoršovali jej vlastnosti.

18 Plnenie slučky Dávkovanie a analýza 3. Meranie Na dávkovanie každého roztoku používajte inú striekačku. Postupne nadávkujte roztoky všetkých porovnávacích látok a vzorky. Každý roztok nadávkujte dvakrát (v prípade, že sa dvojica chromatogramov výraznejšie líši, aj viackrát). Vzorka sa dávkuje trikrát. Ako mŕtvy čas sa použije elučný čas pre malý rozpúšťadlový pík, ktorý sa objaví pri každom dávkovaní (alebo sa analyzuje látka, ktorá sa na kolóne nezadržiava). TLC Cieľom práce je použiť zvolený chromatografický systém na separáciu vybraných zlúčenín metódou tenkovrstvovej chromatografie (chromatografie v plošnom usporiadaní). Úloha zahŕňa identifikáciu zložiek zmesi na základe R f hodnôt. V uvedenej literatúre si všímajte predovšetkým základné princípy činnosti a vysvetlenia pojmov, ktoré máte v ďalšom texte podčiarknuté alebo sú v otázkach, ktorými sa máte zaoberať v príprave a počas laboratórneho cvičenia. 1. Príprava tenkých vrstiev a nanášanie vzoriek Z hotových tenkých vrstiev na hliníkovej fólii s adsorbentom silikagélom (Silufol) sa vystrihnú pracovné časti. Roztoky porovnávacích látok a vzorky sa na tenkú vrstvu nanesú pomocou dávkovacích kapilárok podľa vzoru. Priemer škvrny by nemal byť väčší ako 2-3 mm. Ak je škvrna veľmi slabo viditeľná, možno dávkovanie opakovať po vysušení na tom istom mieste.

19 2. Vyvíjanie tenkej vrstvy Do komôr sa naleje mobilná fáza pre adsorpčnú chromatografiu. Komora sa uzavrie zábrusovým vekom a nechá nasýtiť parami mobilnej fázy asi 10 minút (mobilná fáza je prchavá, preto treba komoru otvárať čo najmenej). Do komory sa vloží pripravená tenká vrstva s nanesenými vzorkami. Komora sa opäť uzavrie vekom. Chromatogram sa vyvíja pokiaľ čelo mobilnej fázy nedosiahne vopred stanovenú vzdialenosť. Vrstva sa po vybratí vysuší v sušiarni pri C. 3. Spracovanie meraní Na vysušenej platni sa odmerajú potrebné vzdialenosti a rozmery škvŕn a určia sa R f hodnoty (zbrzďovací faktor) pre všetky pozorované škvrny samostatných referenčných látok a ich zmesí. Šírka škvrny sa meria v smere vzlínania mobilnej fázy. Vypočítajú sa hodnoty rozlišovacieho faktora R i,j pre všetky dvojice po sebe nasledujúcich látok. Identifikujú sa zložky vo vzorke. S tým súvisia nasledujúce otázky: 1. Aké hodnoty R f by mali dosahovať analyzované látky - blízke 0, blízke 1, alebo iné? 2. Aká má byť hodnota rozlišovacieho faktora R i,j pri kvalitatívnej a kvantitatívnej analýze v TLC?

20

21 Úloha č. 7 Analýza iónových zlúčenín - vysokoúčinná iónová chromatografia Porovnanie s chromatografickou analýzou na tenkej vrstve Analýza cukrov vo vzorkách potravín Chromatografické podmienky: HPLC: Stacionárna fáza: silikagél s chemicky viazaným sulfonovaným styrén-divinylbenzénovým kopolymérom vo vodíkovej forme - Polymer IEX H-forma (250 x 8 mm, 8 μm) Mobilná fáza: roztok kyseliny sírovej s koncentráciou 5 mmol/l Detekcia: refraktometrická Dávkovaný objem: 20 μl Prietok mobilnej fázy: 0.4 ml/min Teplota kolóny: laboratórna TLC: Stacionárna fáza: platne s tenkou vrstvou silikagélu (Silufol), impregnované 0,02 mol/l roztokom octanu sodného Mobilná fáza: n-butanol etanol voda (5/3/2 v/v/v) Detekcia: vizuálna po nasýtení parami detekčného činidla (difenylamínanilín-kyselina fosforečná) Teplota sušenia: 120 o C, 20 min Zaznamenajte potrebné informácie: HPLC: kolóna, typ stacionárnej fázy, charakteristiky náplne kolóny, zloženie mobilnej fázy, prietok mobilnej fázy, tlak mobilnej fázy na vstupe do kolóny, princíp detekcie, parametre detektora. TLC: údaje o roztokoch, zloženie mobilnej fázy pre vyvíjanie tenkej vrstvy, typ tenkej vrstvy, časy vzlínania mobilnej fázy po vyznačenú líniu na vrstve. Z tenkých vrstiev po vysušení odmerajte vzdialenosti stredu škvŕn od štartu pre všetky zložky a šírku škvŕn v smere vyvíjania. Meranie: HPLC: Pripravia sa porovnávacie roztoky cukrov (sacharóza, glukóza, fruktóza, arabinóza) s koncentráciou 10 mg/ml a roztok vzorky medu s koncentráciou max 40 mg/ml. Pomocou porovnávacích roztokov jednotlivých cukrov sa analýzou zistia príslušné elučné charakteristiky potrebné na kvalitatívnu analýzu. Na chromatograme z analýzy roztoku vzorky medu sa identifikujú prítomné zložky. Obsah jednotlivých zložiek vo vzorke medu sa vypočíta metódou vnútornej normalizácie (alebo metódou kalibračnej krivky). TLC: Fólia s adsorbentom pre TLC sa rozstrihnite na časti s rozmermi 4 x 10 cm, pozorne, tak, aby boli strany na seba kolmé a z fólie sa neuvoľnil adsorbent. Zabezpečí sa tým rovnomerné vzlínanie mobilnej fázy. Do komory sa naleje asi 1 cm octanu sodného (0,02 mol/l) a vloží sa do nej platňa. Po nasýtení platne roztokom sa platňa vysuší cca 5 min pri teplote 50 o C. Zo zásobných roztokov cukrov a vzorky sa plastovými pipetkami nanesú na čistú sklenú platňu kvapky roztokov. Ceruzkou sa jemne vyznačí línia pre štart (približne 1,5 cm od spodného okraja, nesmie sa pritom porušiť nanesená vrstva adsorbentu) a vzdialenosť,

22 ktorú má dosiahnuť rozpúšťadlo. Špičkami (alebo sklenými kapilárkami) sa pozorne nanesú malé škvrny roztokov na štart impregnovanej platne. Priemer škvrny by nemal byť väčší ako 2-3 mm. Po vysušení sa vrstva vloží do komory s mobilnou fázou na vyvíjanie a komora sa zakryje vekom. Po skončení vyvíjania sa platňa vysuší pri teplote 120 o C cca 15 min a ponorí do detekčného činidla (2s). Po vysušení pri izbovej teplote (10 min) sa platňa nechá vyhrievať 120 o C cca 15 min, aby sa objavilo sfarbenie škvŕn. Vyhodnoťte: HPLC: 1. Z chromatogramov zistite elučné časy a vypočítajte kapacitné pomery (retenčné faktory), identifikujte zložky v neznámej vzorke. 2. Na základe výšok píkov s použitím metódy vnútornej normalizácie (metódy kalibračnej ktivky) zistite obsah jednotlivých zložiek v neznámej vzorke. 3. Z chromatogramu vzorky a kalibračných roztokov zhodnoťte, či sa ovplyvní rozlíšenie susedných píkov v závislosti od koncentrácie zložiek alebo či má matrica vzorky vplyv na rozlíšenie pozorovaných zložiek. TLC: 1. Hodnoty zbrzďovacieho faktoru R f pre jednotlivé zložky. 2. Hodnoty Rij pre dvojice za sebou nasledujúcich cukrov. 3. Identifikujte zložky v neznámej vzorke. Protokol: Okrem princípu, stručného postupu a potrebných vzťahov pre výpočet musí obsahovať: 1. Tabuľku s nameranými a vypočítanými údajmi pre HPLC elučné časy a retenčné faktory pre porovnávacie zlúčeniny a zložky vzorky, výšky píkov vo vzorke a v kalibračných roztokoch a príslušné koncentrácie zložiek v kalibračných roztokoch. Pre opakované merania priemerné hodnoty výšok píkov. 2. Vzorový výpočet obsahu identifikovaných zložiek v dávkovanom roztoku vzorky a v pôvodnej vzorke medu. 3. Potrebné výpočty a porovnanie k bodu 3 vyhodnotenia. 4. Tabuľku s nameranými a vypočítanými údajmi pre TLC hodnoty odmeraných vzdialeností a šírok škvŕn, zbrzďovacieho faktoru R f pre jednotlivé zložky, hodnotami Rij. 5. Vyhodnotenie analýzy vzorky na základe výsledkov TLC a HPLC. 6. Záver a zhodnotenie práce.

23 Úloha č. 8A Analýza iónových zlúčenín elektroforéza Literatúra: Knižka: J.Garaj, D.Bustin, Z.Hladký: Analytická chémia, Bratislava, str M.Čakrt a kol.: Praktikum z analytickej chémie, Bratislava, str Skriptá: D.Bustin a kol.: Analytická chémia II, str Príprava na laboratórne cvičenie pozostáva zo zvládnutia informácií, ktoré sa pre elektroforézu a elektromigračné metódy nachádzajú v uvedenej literature, všímajte si v nej predovšetkým základné princípy činnosti a vysvetlenia pojmov, ktoré máte v tomto texte podčiarknuté. Cieľom práce je separovať potravinárske farbivá metódou nízkonapäťovej elektroforézy (treba vedieť princíp, parametre a faktory ovplyvňujúce analýzu). Vzorka sa analyzuje v dvoch rôznych separačných systémoch (dva tlmivé roztoky) a na základe vypočítanej pohyblivosti sa identifikujú farbivá vo vzorke. Úloha sa rieši spoločne so separáciou na tenkých vrstvách. 1. Príprava zariadenia Do oboch komôr v zariadení, do ktorých sú zavedené elektródy, sa naleje elektrolyt, ktorým je tlmivý roztok tak, aby voľne pretekal ponad priehradky labyrintového systému. Elektródové priestory sa spoja pomocným tlačidlom a hladiny v oboch komorách sa vyrovnajú. Ako elektrolyty sa použijú Brittonove-Robinsonove univerzálne tlmivé roztoky s rôznym ph. 2. Nanášanie vzoriek Vzorky sa nanesú na nosič (papier) pomocou dávkovacích kapilárok alebo špičiek podľa vzoru. Po nanesení všetkých roztokov sa prúžky papiera navlhčia tlmivým roztokom, približne 2 cm pás okolo štartu musí ostať suchý, aby sa nevymyli nanesené vzorky. Tlmivý roztok sa nechá dovzlínať po štartovú líniu už po vložení do prístroja. 3. Vyvíjanie elektroforeogramov Prístroj sa uzavrie a zapne sa zdroj. Keď sa ustáli hodnota prúdu a napätia, začne sa odmeriavať čas. Po min (pre oba tlmivé roztoky rovnaký čas) sa vypne zdroj, zo zariadenia sa vyberú prúžky papiera a vložia do sušiarne pri C. Zo zariadenia sa vyčerpá elektrolyt naspäť do zásobnej fľaše, zariadenie sa vymyje deionizovanou vodou a nechá sa sušiť. 4. Vyhodnotenie analýz Kvalitatívna analýza zložiek dávkovaných zmesí sa vykoná na základe vzdialeností škvŕn od štartu a vypočítanej elektroforetickej pohyblivosti pre každú zložku.

24 Úloha č. 8B Chromatografická analýzy na tenkej vrstve (TLC thin layer chromatography) Literatúra: Knižka: M.Čakrt a kol.: Praktikum z analytickej chémie, Bratislava, princípy, s , , pracovná technika a vyhodnotenie výsledkov Skriptá: D.Bustin a kol.: Analytická chémia II, str , 32-33, Cieľom práce je zvoliť vhodný chromatografický systém na separáciu vybraných zlúčenín metódou tenkovrstvovej chromatografie (chromatografie v plošnom usporiadaní). Úloha zahŕňa optimalizáciu zloženia mobilnej fázy, identifikáciu zložiek zmesi na základe R f hodnôt. V uvedenej literatúre si všímajte predovšetkým základné princípy činnosti a vysvetlenia pojmov, ktoré máte v ďalšom texte podčiarknuté alebo sú v otázkach, ktorými sa máte zaoberať v príprave a počas laboratórneho cvičenia. 1. Príprava tenkých vrstiev a nanášanie vzoriek Z hotových tenkých vrstiev na hliníkovej fólii s adsorbentom silikagélom (Silufol) sa vystrihnú pracovné časti. Roztoky porovnávacích látok a vzorky sa na tenkú vrstvu nanesú pomocou dávkovacích kapilárok podľa vzoru. Priemer škvrny by nemal byť väčší ako 2-3 mm. Ak je škvrna veľmi slabo viditeľná, možno dávkovanie opakovať po vysušení na tom istom mieste. 2. Vyvíjanie tenkej vrstvy Do označených komôr sa naleje po ml príslušnej mobilnej fázy pre adsorpčnú chromatografiu. Komora sa uzavrie zábrusovým vekom a nechá nasýtiť parami mobilnej fázy asi 10 minút (mobilné fázy sú prchavé, preto treba komoru otvárať čo najmenej). Do každej komory sa vloží jedna pripravená tenká vrstva s nanesenými vzorkami. Komora sa opäť starostlivo uzavrie vekom. Chromatogramy sa vyvíjajú pokiaľ čelo mobilnej fázy nedosiahne vopred stanovenú vzdialenosť. Vrstva sa po vybratí vysuší v sušiarni pri C. 3. Spracovanie meraní Na vysušených platniach sa odmerajú potrebné vzdialenosti a rozmery škvŕn a určia sa R f hodnoty (zbrzďovací faktor) pre všetky pozorované škvrny samostatných referenčných látok a ich zmesí. Šírka škvrny sa meria v smere vzlínania mobilnej fázy. Zostrojí sa grafická závislosť R f od obsahu významnej zložky v mobilnej fáze. Závislosti sa zakreslia do jedného grafu pre všetky zložky (pre každú identifikovanú zlúčeninu sa získané hodnoty spriemerujú). Vypočítajú sa hodnoty rozlišovacieho faktora R i,j pre všetky dvojice po sebe nasledujúcich látok. S tým súvisia nasledujúce otázky: 1. Aké hodnoty R f by mali dosahovať analyzované látky - blízke 0, blízke 1, alebo iné? 2. Aká má byť hodnota rozlišovacieho faktora R i,j pri kvalitatívnej a kvantitatívnej analýze v TLC?

25 Úloha č.8 A,B Analýza iónových zlúčenín - elektroforéza a porovnanie s chromatografiou na tenkej vrstve. Optimalizácia separačných podmienok a analýza syntetických farbív vo vzorkách potravín. Chromatografické podmienky pre TLC: Stacionárna fáza: platne s tenkou vrstvou silikagélu (Silufol) Mobilná fáza: n-propanol / etylacetát / 0,5 % vodný roztok amoniaku v pomere mobilná fáza n-propanol etylacetát 0,5 % vodný roztok amoniaku Detekcia: Teplota: vizuálna laboratórna Podmienky pre ELEKTROFORÉZU: Tlmivý roztok: univerzálny tlmivý roztok podľa Brittona a Robinsona roztoky sa pripravujú zmiešaním roztoku kyselín obsahujúceho kyselinu fosforečnú, kyselinu octovú, kyselinu boritú, a roztoku hydroxidu sodného v rôznych objemových pomeroch. Použité : ph = 3.41 a ph = Napätie: 200 V Prúd: minimálne 2 ma, treba sledovať počas elektroforézy Dĺžka papiera: približne 28 cm (premerať použitý papier) Doba elektroforézy: min

26 Meranie: TLC: Zo zásobných roztokov sa plastovými pipetkami nanesú na čistú sklenú platňu kvapky roztokov. Používajú sa roztoky základných a zmesných farbív uvedené v nasledujúcom prehľade. Číslo roztoku Označenie Farbivo Názov (resp. sfarbenie roztoku) 1 E151 Brilliant Black BN čierna 2 E133 Brilliant Blue FCF modrá 3 E104, E133 zelená 4 E122, E132 Fialová svetlá 5 E122, E151 Červená marmeládová 6 E124 Ponceau 4R Červená košenilová 7 E123 Amaranth červená 8 E122 Azorubine Červená karmínová 9 E110 Sunset Yellow oranžová FCF 10 E102 Tartrazine žltá U zmesných farbív sú vyznačené hlavné zložky (podľa obsahu), môžu však obsahovať aj ďalšiu zložku s intenzívnym sfarbením. Ďalšie farbivá, ktoré sa môžu vo vzorkách vyskytovať: E104 Crisoine S žltá E 132 Indigokarmín Fólia s adsorbentom pre TLC sa rozstrihne na 9 (6) rovnakých častí tak, aby boli strany na seba kolmé a z fólie sa neuvoľnil adsorbent. Zabezpečí sa tým rovnomerné vzlínanie mobilnej fázy. Ceruzkou sa jemne vyznačí línia pre štart (približne 1,5 cm od spodného okraja, nesmie sa pritom porušiť nanesená vrstva adsorbentu) a vzdialenosť, ktorú má dosiahnuť rozpúšťadlo. Špičkami (alebo sklenými kapilárkami) sa pozorne nanesú malé škvrny roztokov na štart. Priemer škvrny by nemal byť väčší ako 2-3 mm. Po vysušení sa vrstvy vložia do komôr s mobilnou fázou na vyvíjanie a komory sa zakryjú vekom. Elektroforéza: Na papierový nosič pre elektroforézu sa ceruzkou vyznačí línia štartu, na ktorú sa špičkami alebo sklenými kapilárkami nanesú porovnávacie roztoky základných a zmesných farbív. Priemer škvrny by nemal byť väčší ako 2 mm. Dávkovanie sa opakuje podľa intenzity sfarbenia opakovane na to isté miesto. Na okraji nosiča sa ceruzkou označia roztoky v poradí nanášania. Po nanesení roztokov sa nosič zmočí tlmivým roztokom, vloží do zariadenia tak, že sa napne na rám a zaťaží keramickým ťažidlom. Obidva konce pásu sa ponoria do tlmivého roztoku. Veko sa uzavrie a zapne sa zdroj.

27 Postup úpravy neznámej vzorky pre analýzu (len pre informáciu, nerobí sa prakticky) Koncentrácie syntetických farbív vo vzorkách potravín sú pomerne nízke a priama analýza bežných vzoriek prifarbovaných potravín tenkovrstvovou chromatografiou alebo elektroforézou nie je možná. Preto sa v oficiálnych postupoch uvádza postup na zakoncentrovanie syntetických farbív zo vzorky. Keďže je časovo náročný, nebude predmetom laboratórneho cvičenia a uvádza sa len pre informáciu. Do ml vzorky (v prípade tuhej vzorky po rozpustení) sa pridá 25 ml 10% roztoku kyseliny vínnej a do roztoku sa vloží 25 cm vlnené vlákno. Obsah v kadičke sa postupne zahrieva až k varu. Var sa udržiava 30 minút, až sa farbivo dobre vyfarbí na vlnu. Vyfarbené vlákno sa vyberie a dôkladne preperie vodou (prírodné farbivá sa z vlny vyperú, syntetické ostanú adsorbované). Vlákno sa položí na porcelánovú misku, zaleje 15 ml 2% amoniaku a mierne zahrieva na vodnom kúpeli. Keď farbivo prejde do roztoku, vlákno sa vytiahne. Roztok sa odparí do sucha a odparok sa rozpustí v 0,2 ml vody (alebo etanolu). Takto zakoncentrované farbivá sa analyzujú metódou papierovej, tenkovrstvovej alebo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Zaznamenajte si údaje: Pre TLC: údaje o roztokoch, zloženie mobilných fáz pre vyvíjanie tenkej vrstvy, typ tenkej vrstvy, časy vzlínania mobilnej fázy po vyznačenú líniu na vrstve. Z tenkých vrstiev po vysušení odmerajte vzdialenosti stredu škvŕn od štartu pre všetky zložky farbív a šírku škvŕn v smere vyvíjania. Pre elektroforézu: údaje o roztokoch, zloženie tlmivého roztoku a jeho ph hodnotu, čas elektroforézy, hodnotu pracovného napätia, zmeny hodnoty prúdu v 10-minútových intervaloch počas elektroforézy. Po vysušení nosiča odmerajte vzdialenosti škvŕn od štartu. Vypočítajte: Pre TLC: Obsah n-propanolu v použitých mobilných fázach. Hodnoty zbrzďovacieho faktoru R f pre jednotlivé zložky (zlúčeniny E ) základných a zmesných farbív pre všetky použité mobilné fázy. Pre elektroforézu: Elektroforetickú pohyblivosť pre jednotlivé zložky farbív. Protokol: Okrem princípu, stručného postupu a potrebných vzťahov pre výpočet musí obsahovať: 1. Tabuľku s nameranými a vypočítanými údajmi pre TLC - hodnotami zbrzďovacieho faktoru R f pre jednotlivé zložky (zlúčeniny E ) základných a zmesných farbív pre všetky použité mobilné fázy. 2. Graf závislosti priemernej R f hodnoty pre každú zložku farbív (E ) od obsahu n-propanolu, s vyznačením odporúčaného rozsahu n-propanolu v mobilnej fáze. 3. Tabuľku s výpočtom Rij hodnôt pre dvojice za sebou nasledujúcich farebných zlúčenín (po zoradení podľa Rf hodnoty) pre všetky použité mobilné fázy. 4. Zdôvodnenie výberu optimálnej mobilnej fázy pre TLC. 5. Tabuľku s nameranými a vypočítanými údajmi pre elektroforézu - hodnotami vypočítaných rýchlostí pohybu a elektroforetickej pohyblivosti pre jednotlivé zložky (zlúčeniny E ) základných a zmesných farbív. 6. Vyhodnotenie analýzy vzorky na základe výsledkov TLC a elektroforézy. 7. Záver a zhodnotenie práce.

28

29 Úloha č. 9 Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia na obrátených fázach (RP HPLC reversed phase high performance liquid chromatography). Literatúra: Skriptá: D.Bustin a kol.: Analytická chémia II, Princíp, prístrojová technika: str. 5-12, 21-22, 26-29, 31-32, Elučné charakteristiky: str 13-15, 18 knižka: M.Čakrt a kol.: Praktikum z analytickej chémie, Mobilné fázy v HPLC : str Vyhodnotenie výsledkov v HPLC: str Základy kvantitatívnej analýzy: str Príprava na laboratórne cvičenie pozostáva zo zvládnutia informácií, ktoré sa pre HPLC nachádzajú v uvedených textoch. Keďže HPLC predstavuje jednu zo separačných metód, ktoré využívajú pomerne veľa spoločných princípov pre získavanie údajov alebo spôsobov spracovania údajov, informácie sú v tejto literatúre niekedy uvedené spoločne. V uvedenej literature sa všímajte predovšetkým základné princípy činnosti a vysvetlenia pojmov, ktoré máte v tomto návode podčiarknuté. 1. Spracovanie vzorky Po odobratí vzorky odpadovej vody sa vzorka stabilizuje prídavkom mg siričitanu sodného na 1 l vody, upraví sa ph na hodnotu 2 prídavkom kyseliny chlorovodíkovej. Predseparácia a prekoncentrácia sa uskutoční pretlačením vzorky vody cez sorpčnú kolónku s silikagélom C18, na ktorom sa zachytia sledované zložky zo vzorky (technika SPE): Príprava kolónky: kondiciovanie prepláchnutím neskôr používanými rozpúštadlami, kolónka sa vysuší prúdom dusíka, prepláchne sa vodou s čistotou pre HPLC. Predseparácia vzorky: Predpísaný objem vzorky upravenej vody sa presaje cez sorpčnú kolónku s prietokom približne 1 ml/min pomocou slabého vákua na výstupe z kolónky, potom sa kolónka suší 10 min v prúde dusíka alebo suchého prečisteného vzduchu, analyzované látky sa eluujú z kolónky vybraným rozpúšťadlom. Výsledný roztok sa analyzuje pomocou kvapalinovej chromatografie. 2. Príprava na meranie Zoznámte sa s blokovou schémou zariadenia v študijnej literatúre a preštudujte k jednotlivým častiam princíp ich činnosti resp. úlohu, ktorú spĺňajú. Prezrite si prístroj a pokúste sa identifikovať základné prvky prístroja podľa blokovej schémy uvedenej v učebnici. Zaznamenajte potrebné informácie: kolóna, typ stacionárnej fázy, charakteristiky náplne kolóny, zloženie mobilnej fázy, prietok mobilnej fázy, pracovný tlak na vstupe do kolóny, princíp detekcie, parametre detektora. (v príprave na úlohu treba zvládnuť najdôležitejšie charakteristiky materiálov resp. rozsahy pracovných parametrov).