EPR spektroskopia. E E(M s

Transcript

1 EPR spektroskopia Elektrónová paramagnetická rezonancia (EPR) patrí do skupiny magnetických rezonančných metód. Najširšie uplatnenie z rezonančných metód zaznamenáva jadrová magnetická rezonancia, ktorá sa zaoberá štúdiom správania sa jadrových spinov v magnetickom poli [1,2]. Naproti tomu použitie EPR je obmedzené len na systémy, ktoré majú paramagnetickú povahu. Avšak aplikácia tejto techniky poskytuje veľmi cenné informácie o štruktúre a vlastnostiach látok a má svoje miesto medzi modernými spektroskopickými technikami. 1. Základný princíp EPR Voľný nespárený elektrón má spinové kvantové číslo s = 1/ 2. V magnetickom poli môže zaujať len určité diskrétne orientácie. Jeho projekciou do smeru siločiar vonkajšieho magnetického poľa získame hodnotu tzv. magnetického spinového kvantového čísla M s. Počet možných orientácií spinu s v magnetickom poli možno všeobecne vyjadriť rovnicou: M s = 2s + 1 (1) čo v prípade elektrónu predstavuje dve možné orientácie ( M = ±1/2 ). Energetický stav elektrónu s hodnotou M s = 1/2 sa označuje ako stav α, hodnota s M s = 1/2 zodpovedá stavu β. V magnetickom poli dochádza k rozštiepeniu existujúcej energetickej hladiny na dve hladiny s odlišnou energiou. Tento jav sa označuje ako Zeemanove štiepenie a energetické hladiny, ktoré štiepením vznikli, sa nazývajú Zeemanove. Ich vznik je znázornený na obr. 1 [1]. E E(M s = 1/2)=g e β e B/2 0 E=g e β e B r =hν 0 E(M s = 1/2)= g e β e B/2 B=0 B br. 1. Schéma závislosti vzdialenosti medzi Zeemanovými hladinami od indukcie magnetického poľa B. Vzdialenosť medzi Zeemanovými hladinami je závislá od indukcie magnetického poľa - s rastúcou hodnotou indukcie B sa zvyšuje.

2 Ak je magnetické pole orientované v smere osi,z, potom zložka indukcie magnetického spinového momentu voľného elektrónu v smere orientácie magnetického poľa je µ= z γ e h M s = g e β e M s (2) kde γ e je gyromagnetický pomer elektrónu; ћ je h/2π, 34 h = 6, J.s ; M s je magnetické spinové číslo; g e je g-faktor voľného elektrónu (g e = 2, ); e h β e je Bohrov magnetón β e = = 9, J T 2 m e 24 1 Pre energiu elektrónu v magnetickom poli po zohľadnení predchádzajúcich úvah platí: E = µ z B= g e β e M s B (3) Z rovnice (3) možno po dosadení prípustných hodnôt pre M s (±1/2) získať vzťah, popisujúci vzdialenosť oboch Zeemanovych hladín E= h ν = µ z B = g e β e B r (4). Táto rovnica je zároveň rovnicou rezonančnej podmienky v EPR spektroskopii. B r predstavuje indukciu statického magnetického poľa, ν je frekvencia zdroja žiarenia, pri ktorej sa pozoruje prechod elektrónu medzi oboma energetickými hladinami (splnenie rezonančnej podmienky) [1-3]. Rezonančnú podmienku možno v EPR spektroskopii splniť dvomi spôsobmi. Buď sa meranie uskutočňuje pri konštantnej frekvencii ν r, pri ktorej sa plynule mení indukcia magnetického poľa B až do dosiahnutia rezonancie; alebo druhým spôsobom, využívaným v pulznej EPR spektroskopii, keď sa pri konštantnej hodnote indukcie magnetického poľa mení frekvencia. Častejšie je však využívaný prvý spôsob. Pre hodnoty indukcie magnetického poľa okolo 0,35 T je rezonančná podmienka splnená približne pri frekvencii ν=9,5 GHz, teda v mikrovlnnej oblasti pri vlnovej dĺžke 3 cm (pre tzv. X-pásmové spektrometre). V závislosti na frekvencii s akou EPR spektrometer pracuje, možno EPR spektroskopiu rozdeliť na niekoľko pásiem. Prehľad pásiem a im zodpovedajúcich frekvencíí EPR spektrometrov je v Tabuľke 1. [4]. Každé pásmo (frekvencia) umožňuje získať osobitné informácie o štruktúre vzorky, a preto sa na jej lepšiu identifikáciu často využíva kombinácia viacerých pásiem [1, 4].

3 Tabuľka 1. Prehľad pásiem a frekvencií EPR spektrometrov Pásmo Frekvencia (GHz) L pásmo (EPR imaging) 1 S pásmo 3 X pásmo 9 10 K pásmo 24 Q pásmo 34 W pásmo harakteristiky spinových systémov g-faktor. V každej vzorke môže okrem vonkajšieho magnetického poľa o indukcii B ext existovať aj lokálne magnetické pole B loc, ktorého vektorovým sčítaním s B ext získame tzv. celkové efektívne magnetické pole B eff B eff = B + B (5) ext loc Lokálne polia môžu byť dvojaké - indukované vonkajším magnetickým poľom, ktoré sú závislé na veľkosti tohto poľa; - vlastné (stále), tj. nezávislé od veľkosti B ext Častejší je prípad, kedy sa lokálne magnetické pole v látke indukuje. Pre takéto látky platí: B eff = B (1 σ) = (g g ) B (6) e Vzťah (1 σ) = (g g e) je obdobou tieniacej konštanty, bežne zaužívanej v NMR spektroskopii. Parameter g je tzv. efektívny Zeemanov g-faktor. Každá paramagnetická látka má svoju charakteristickú hodnotu g-faktora, ktorá slúži na charakterizáciu polohy signálu [1, 2]. dchýlka g od g e závisí od schopnosti vonkajšieho poľa B ext indukovať v paramagnetickej látke lokálne magnetické pole [2]. harakteristickým rysom mnohých voľných radikálov a niektorých prechodných kovov je, že ich hodnota g je veľmi blízka hodnote g e. Naproti tomu mnohé systémy (aj niektoré prechodné kovy) vykazujú od tejto teoretickej hodnoty značné odchýlky a vo výnimočných prípadoch sa pozorovali aj záporné hodnoty g-faktora [2]. U anizotropných systémov je potrebné uvažovať o závislosti hodnoty g-faktora od orientácie látky v magnetickom poli. Hodnoty g sa v takýchto prípadoch udávajú v maticovom tvare. Systémy s izotropnými vlastnosťami, medzi ktoré patria aj roztoky s nízkou viskozitou majú hodnotu g-faktora nezávislú od orientácie vzorky v magnetickom poli, teda

4 g x = g y = g z (7) a udávaná hodnota g predstavuje v týchto systémoch tzv. efektívnu (spriemernenú hodnotu) g- faktorov zo všetkých možných orientácií látky v magnetickom poli [1, 2]. V izotropných systémoch je g-faktor zároveň identický so stredom spektra [27]. Hyperjemné štiepenie EPR spektier. Nespárený voľný elektrón môže interagovať s magnetickými dipólovými momentmi vo svojom okolí. Má dva príspevky [1,2]: - dipól-dipólová interakcia má anizotropný charakter, t.j. jej veľkosť a charakter závisia od orientácie elektrónu vzhľadom na vonkajšie magnetické pole. Pozoruje sa len u radikálov, zachytených v tuhých látkach. Zaniká s možnosťou voľného pohybu radikálu. Je charakteristická pre látky, ktorých elektróny sa nachádzajú v orbitáli p. - Fermiho kontaktná interakcia charakteristická pre látky, ktorých elektróny sa nachádzajú v orbitáli s. Elektrónová hustota tohto orbitálu je okolo jadra sféricky rozložená. Jedná sa o izotropnú interakciu magnetickej povahy, tj. jej veľkosť nezávisí na orientácii radikálu v magnetickom poli. Prejavuje sa aj u voľne pohyblivých častíc za predpokladu, že aspoň časť ich elektrónovej hustoty sa nachádza v orbitáli s. Hyperjemné štiepenie vedie k vzniku hyperjemnej štruktúry EPR spektier. Každé jadro je zdrojom magnetického poľa, ktoré v závislosti od orientácie jadrového spinu zvyšuje, alebo naopak znižuje lokálne magnetické pole B loc = B r + α m i (8) α - konštanta hyperjemnej interakcie m i magnetické jadrové kvantové číslo (I, I-1,...-I) B r indukcia magnetického poľa, pri ktorej je splnená rezonančná podmienka Vo všeobecnosti prítomnosť,n chemicky ekvivalentných jadier so spinom I spôsobí štiepenie všetkých čiar v EPR spektre na ( 2 n I + 1) rezonančných čiar. Hodnoty spinov niektorých, v EPR spektroskopii často sa vyskytujúcich jadier sú spolu s ich základnými charakteristikami uvedené v Tabuľke 2. Veľkosť štiepnej konštanty α závisí od rozloženia elektrónovej hustoty v blízkosti interagujúcich jadier. Počet rezonančných čiar v EPR spektre spolu s hodnotami štiepnych konštánt a poloha spektra, charakterizovaná hodnotou indukcie magnetického poľa B, resp. hodnotou g-faktora, sú dôležitými charakteristikami, ktoré umožňujú spoľahlivú identifikáciu

5 radikálu v systéme. S určením koncentrácie resp. množstva radikálov, prítomných vo vzorke je spätá plocha EPR spektra. Za určitých podmienok (pokiaľ sa nemení šírka spektrálnej čiary), je mierou koncentrácie radikálov v systéme aj intenzita (výška) EPR signálu. Tabuľka 2. Vybrané charakteristiky niektorých jadier [28] Jadro Prirodzený výskyt (%) Spin I Magnetický moment M i 1 H 99,9850 1/2 ± 1/2 13 1,11 1/2 ± 1/2 14 N 99,63 1 0, ± ,038 5/2 ± 5/2, ± 3/2, ± 1/2 55 Mn 100 5/2 ± 5/2, ± 3/2, ± 1/2 57 Fe 2,15 1/2 ± 1/2 59 o 100 7/2 ± 7/2, ± 5/2, ± 3/2,± 1/2 3. EPR spektroskopia v kvapalnej fáze Zriedené roztoky kvapalín sú častým objektom EPR štúdií. Pozorovaná hyperjemná štruktúra spektier umožňuje posúdiť štruktúru a distribúciu elektrónu po skelete skúmaných paramagnetických častíc. Vysoká citlivosť EPR techniky umožňuje študovať radikálové medziprodukty s krátkou dobou života v chemických a biochemických systémoch. Keďže sú tieto zlúčeniny často veľmi labilné, vysoké nároky sú kladené najmä na výber vhodných rozpúšťadiel ako aj ostatných reakčných činidiel [1, 2]. Priame metódy detekcie nízkych hladín voľných radikálov, ktoré sa bežne využívajú pri štúdiu fyziologických procesov sú limitované spodným prahom detekovateľnosti EPR spektroskopie (10 8 mol dm 3 ). Pomocou výpočtovej techniky je možné uskutočniť viacnásobnú akumuláciu, čím sa potlačí veľkosť šumu. V týchto prípadoch možno detekovať radikály aj s koncentráciou okolo 10 9 mol dm 3. Radikálové procesy v biosystémoch však často prebiehajú pri ešte nižšej koncentrácii. Hranicu detekcie možno v takých prípadoch posunúť využitím metód nepriamej detekcie, napríklad metódy spinových lapačov [1, 5, 6].

6 Spinové lapače a spinové značky 1. Spinové lapače Princíp tejto metódy spočíva v transformácii reaktívnych kyslíkatých a organických radikálov s krátkou dobou života na dlhšie žijúce nitroxylové radikály prostredníctvom spinových lapačov, najčastejšie na báze pyrolínoxidov alebo nitrónov [2, 5, 6]. Z pôvodne diamagnetických lapačov sa tak stávajú paramagnetické zlúčeniny. Analýza hodnôt štiepnych konštánt a g-faktora umožňuje následnú charakterizáciu (identifikáciu) zachyteného radikálu. Spinové lapače na báze pyrolínoxidov. DMP (5,5-dimetyl-1-pyrolín-N-oxid) je jedným z najčastejšie používaných lapačov z tejto skupiny. Molekula DMP má labilnú násobnú väzbu v heterocyklickom pyrolínovom kruhu, ktorá H 3 + umožňuje efektívnu adíciu krátko žijúcich radikálov. H N 3 - Jeho veľkou výhodou je rozpustnosť v polárnych aj v nepolárnych rozpúšťadlách a pufrových roztokoch, čo umožňuje jeho využitie aj pri Štruktúra DMP sledovaní radikálových reakcií za fyziologických podmienok [5]. Selektivita štiepnych konštánt spinových aduktov DMP umožňuje pomerne dobrú identifikáciu zachyteného radikálu. Najčastejšie sa používa na identifikáciu radikálov H, H, R, R 2 a rôznych typov uhlíkom centrovaných radikálov, vo všeobecnosti R. Napriek tomu, že je DMP najvyužívanejším spinovým lapačom kyslíkomcentrovaných radikálov, jeho schopnosť zachytávať hydroperoxylový radikál (H ) má svoje obmedzenia. Jedným z hlavných problémov je krátka životnosť DMP-H aduktu najmä vo vodných roztokoch a biologických médiách. Pri jeho rozklade vzniká DMP-H spinový adukt. Je tiež možná oxidácia DMP na katiónový radikál, ktorý sa reakciou s vodou transformuje na DMP-H spinový adukt [7, 8]. Spinové lapače na báze nitrónov. Spinové lapače na báze nitrónov reagujú s voľnými radikálmi prostredníctvom atómu uhlíka, ktorý sa nachádza v α polohe vzhľadom k atómu dusíka (rovnica 9). '' R H N + R ' + Ṙ R '' H R. N R ' (9)

7 Výsledný tvar EPR spektra ako aj veľkosť štiepnych konštánt pri tomto type spinových lapačov sú závislé najmä od veľkosti prekryvu štiepnych konštánt dusíka (I N =1) z nitroxylovej skupiny a β-vodíka. Hodnota štiepnej konštanty β-vodíka (vodík, vzdialený od nitroxylovej skupiny cez dve väzby) ( a H β ) vo výslednom adukte je ovplyvnená najmä veľkosťou molekuly zachyteného radikálu. Všeobecne možno povedať, že pre malé radikály R H je štiepna konštanta a β malá. Na veľkosť štiepnych konštánt spinových aduktov má vplyv aj polarita použitého rozpúšťadla. S rastúcou polaritou rozpúšťadla sa zvyšuje spinová hustota na dusíku a zároveň s ňou rastie aj štiepna konštanta dusíka v adukte [9-14]. Najpoužívanejším lapačom z tejto skupiny je α-fenyl-ntercbutyl-nitrón (PBN). Má lipofilný charakter, čo obmedzuje jeho + t N Bu rozpustnosť a tým aj využitie vo vodných prostrediach. Na druhej strane táto vlastnosť predurčuje jeho využitie napr. ako lapača H radikálov vznikajúcich pri oxidačných procesoch lipidov Štruktúra PBN v bunkových stenách [15, 16]. krem bežne používaného PBN sa najmä pri štúdiu radikálových procesov, prebiehajúcich vo vodnom prostredí efektívne využíva jeho hydrofilnejší + N H N (H 3 ) 3 + derivát α-(4-pyridyl-1-oxid)-n-tercbutylnitrón (PBN). Štruktúra PBN Často sa tento spinový lapač využíva ako alternatívny lapač kyslíkom-centrovaných radikálov namiesto DMP. Jeho nevýhodou je však nižšia selektivita štiepnych konštánt spinových aduktov, čo sťažuje presnejšiu špecifikáciu zachyteného radikálu. 2. Spinové značky Vo všeobecnosti ich možno definovať ako stabilné radikály, zámerne pridávané do reakčného systému. Prostredníctvom zmien fyzikálnochemických vlastností systému v prítomnosti spinovej značky je možné určiť rôzne kvalitatívne i kvantitatívne parametre reakčného systému umožňuje napríklad sledovanie kinetiky radikálových reakcií [17], resp. na základe zmien konštánt hyperjemnej interakcie a hodnôt g-faktora spinových značiek možno získať cenné informácie o okolí spinovej značky v experimentálnom systéme [2]. Ich hlavné výhody sú: - citlivosť na vlastnosti lokálneho okolia; - schopnosť merať rýchly pohyb molekúl; - EPR signál nie je ovplyvňovaný diamagnetickým okolím; - veľká variabilita dostupných spinových značiek (výber spinovej značky podmieňujú najmä vlastnosti študovaného systému).

8 EPR spektrum, ktoré sa pozoruje pre spinové značky významne závisí od dvoch parametrov: - relatívna ľahkosť, ktorou sa nitroxylový koniec molekuly môže pohybovať a - reorientovať, - stupeň hydrofobicity alebo hydrofility okolia. Veľkosť konštanty hyperjemného štiepenia (a N ) a hodnota g-faktora nitroxylových spinových značiek sú závislé od vlastností rozpúšťadla. Konštanta hyperjemného štiepenia je obvykle o 0,1 až 0,2 mt menšia v nepolárnych rozpúšťadlách ako v polárnych, pričom hodnota g-faktora stúpa v polárnych rozpúštadlách približne o 0,0005. To znamená, že hodnoty týchto parametrov nitroxylových spinových značiek prinášajú informácie o okolí spinovej značky v experimentálnom systéme [2]. Metóda spinových značiek sa v súčasnosti používa najmä pri štúdiu biologických systémov (enzýmy, lipidy, membrány) a polymérnych materiálov [18] Voľba spinovej značky závisí od charakteru prostredia a vlastností reakčného systému. Pri výbere vhodnej spinovej značky sú dôležitým kritériom štruktúrne vlastnosti spinových značiek a ich vplyv na reaktivitu [19]. Bežne sa využívajú napr. deriváty kyseliny stearovej (napr. štúdium správania hydrofóbne modifikovaných celulózových polymérov) [20], deriváty 3-karbamoyl-2,2,5,5- tetrametylpyrolidín-n-oxyl (PRXYL), alebo deriváty spinovej značky 2,2,6,6- tetrametylpiperidinyl-n-oxyl (TEMP) [19]. Vzhľadom k vyššie uvedeným vlastnostiam, obmedzeniam a využitiu spinových značiek ich existuje veľké množstvo. Uvádzajú sa v rôznych špecializovaných katalógoch (napr. Landolt-Börnstein [21]). Spinová značka TEMPL. Táto spinová značka je hydroxyderivátom spinovej značky TEMP. krem hydroxyderivátu sa v EPR spektroskopii využíva aj oxoderivát- TEMPN a aminoderivát (4-amino-TEMP) [19, 20]. TEMPL sa využíva v kvantitatívnej EPR spektroskopii, ktorej hlavný problém spočíva v presnom určení počtu EPR aktívnych častíc v systéme [22]. Sú známe jej reakcie v prítomnosti kyseliny askorbovej (AH), ktorú oxiduje na kyselinu dehydroaskorbovú (DHA) za vzniku diamagnetického hydroxylamínu. Schematicky možno tento proces popísať reakciami: + AH 2 AH + H (10) AH + RN R NH + A (11)

9 2 2 A + H AH + DHA (12) Tieto reakcie sa v kvantitatívnej EPR spektroskopii využívajú na štandardizáciu roztokov TEMPL [22, 23]. H H 3 H 3 N H 3 H 3 br. 2. Štruktúra spinovej značky 4-hydroxy-2,2,6,6-tetrametylpiperidinyloxyl (TEMPL) a jej charakteristické EPR spektrum v etanole (šírka magnetického poľa 6 mt). Podľa niektorých prác TEMPL dokáže pôsobiť ako prooxidant, aj ako antioxidant [24]. Bola dokázaná jeho schopnosť inhibovať peroxynitrátmi sprostredkovanú nitráciu fenolov, zatiaľ čo na druhej strane pozitívne ovplyvňuje zavádzanie nitrózo skupiny do molekuly fenolu [25, 26]. V literatúre sa tiež popisuje jeho schopnosť zachytávať a zneškodňovať superoxidový radikál. Túto reakciu možno zapísať [25]: 2 2 R N + R N + (13) Sú známe tiež reakcie TEMPL, pri ktorých dochádza ku zhášaniu singletového kyslíka [27-29], resp. ku vzniku diamagnetickým zlúčenín reakciou s hydroxylovými radikálmi [19]. UV-VIS spektrum TEMPL pozostáva z absorpčného pásu s maximom pri 437 nm [22]. Jeho EPR spektrum tvorí charakteristický triplet, ktorý vzniká v dôsledku hyperjemnej interakcie nespáreného elektrónu s jadrom dusíka (obr. 2). Stabilný voľný radikál 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH). DPPH je jedným z najčastejšie využívaných voľných radikálov v EPR experimentoch. Prvýkrát bolo jeho EPR spektrum zmerané v roku 1950 a v priebehu niekoľkých rokov sa začal využívať ako štandardná látka v kvantitatívnej EPR spektroskopii [56].

10 N 2 2 N N N N 2 br. 3. Štruktúra stabilného voľného radikálu 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH) a jeho charakteristické EPR spektrum v etanole (šírka magnetického poľa 6 mt). Roztoky DPPH sú značne fotosenzitívne, podliehajú rozkladu, resp. protón-výmenným reakciám, pri ktorých sa z pôvodne paramagnetickej zlúčeniny opätovne tvorí diamagnetický pikrylhydrazín. Rýchlosť tejto reakcie možno výrazne ovplyvniť výberom vhodného rozpúšťadla. Niektoré práce tiež uvádzajú možný vplyv atmosféry na stabilitu DPPH. [30]. Napriek opísaným skutočnostiam je DPPH dostatočne stabilný voľný radikál, čo umožňuje jeho použitie pri sledovaní reakčných mechanizmov reaktívnych radikálových zlúčenín. V UV-VIS spektre DPPH sa nachádzajú dva absorpčné pásy pri 517 nm a 330 nm [30]. Na spoľahlivú identifikáciu DPPH sa využíva absorpčný pás pri 517 nm. Pri tejto vlnovej dĺžke sa často uskutočňujú aj rôzne časovo-závislé experimenty. Absorpcia DPPH je ovplyvnená aj interakciami s rozpúšťadlom, rovnako ju môžu ovplyvňovať aj rôzne kontaminanty, prítomné v roztoku. V polárnych vodných roztokoch za prítomnosti kyslíka tvorí EPR spektrum DPPH singlet, v etanolových roztokoch je jeho EPR spektrum charakteristický kvintet s pomerom intenzít 1:2:3:2:1, vznikajúci interakciou dvoch približne ekvivalentných jadier dusíka so spinom I=1 (obr.3)

11 Literatúra 1. P. Pelikán, A. Staško, EPR spektroskopia, SVŠT Bratislava (1989). 2. J. E. Wertz, J. R. Bolton, Electron Spin Resonance, Elementary Theory and Practical Applications, McGraw-Hill Book ompany, New York (1972). 3. P. W. Atkins, Fyzikálna chémia časť 2b, 6. vydanie, xford/stu Bratislava (1998). 4. Bruker Almanac A. Tkáč, PharmaJournal 4 (1994) J. L. Berliner, V. Kharmatsov, H. Fujii, T. L. lanton, Free Rad. Biol. Med. 30 (2001) B. Tuccio, R. Lauricella,. Fréjaville, J.. Bouteiller, J. hem. Soc. Perkin Trans 2 (1995) L. Eberson, M. P. Hartshorn,. Persson, J. hem. Soc. Perkin Trans 2 (1997) G. Riegel, J. R. Bolton, J. Phys. hem. 99 (1995) D. Jaeger, A. J. Bard, J. Phys. hem. 83 (1979) J. R. Harbour, M. L. Hair, an. J. hem. 57 (1979) J. R. Harbour, J. Tramp, M. L. Hair, an. J. hem. 63 (1985) H. Noda, K. ikawa, H. hya-nishiguchi, H. Kamada, Bull. hem. Soc. Jpn. 66 (1993) R. Kanaka, E. Kasahara, W.. Dunlap, Y. Yamamoto, K.. hien, M. Inoue, Free Rad. Biol. Med. 27 (1999) D. Milatovic, Z. Radic, M. Zivin, W. D. Dettbarn, Free Rad. Biol. Med. 28 (2000) M. J. Pérez, A. L. ederbaum, Free Rad. Biol. Med. 30 (2001) E. E. Voest, E. Van Faassen, J. J. Marx, Free Rad. Biol. Med. 15 (1993) L. W. Berliner (Ed.), Spin Labeling II. Theory and Applications, Academic Press, New York (1979). 19. K. Takeshita, K. Sato, J. Ueda, K. Anzai, T. zava, Biochim. Biophys. Acta 1573 (2002) R. Tanaka, J. Meadows, G.. Phylips, P. A. Williams, arbohydr. Polym. 12 (1990) K.-H. Hallwage (Ed.) Landolt-Börnstein, Numerical data and functional relationships in science and technology, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York (1965). 22. N. D. Yordanov, K. Ranguelova, Spectrochim. Acta A 56 (2000) Y. Lin, W. Liu, H. hno, T. gata, Anal. Sci. 15 (1999) V. Brezová, M. Polovka, A. Staško, Spectrochim. Acta A 58 (2002) R. T. arroll, P. Galatsis, S. Borosky, K. K. Kopec, V. Kumar, J. S. Althaus, E. D. Hall, hem. Res. Toxicol. 13 (2000) M. G. Bonini, R. P. Mason,. Augusto, hem. Res. Toxicol. 15 (2002) S. Kishioka, M. Umeda, A. Yamada, Anal. Sci. 18 (2002) A. Samuni, J. B. Mitchell, W. DeGra,. M. Krishna, U. Samuni, A. Russo, Free Radic. Res ommun (1991) R. E. Belford, G. R. Seely, D. Gust, T. A. Moore, A. Moore, N. J. herepy, J Photochem Photobiol. A: hem 70 (1993) N. D. Yordanov, Appl. Magn. Reson. 10 (1996) 339.