ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΑΣ Τμήμα Ποιοτικού Ελέγχου Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων

Transcript

1 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΑΣ Τμήμα Ποιοτικού Ελέγχου Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Διαδικασίες επικύρωσης μεθόδων στειρότητας μέτρησης βακτηριακών ενδοτοξινών THESIS Validation procedures measuring sterility methods of bacterial endotoxins ΟΝΟΜΑ ΦΟΙΤΗΤΗ/NAME OF STUDENT Χαλίλι Ολιγκέρτα Ηalili Oligerta ΟΝΟΜΑΤΑ ΕΙΣΗΓΗΤΗ κ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΑ/NAMES OF SUPERVISORS Καρκαλούσος Πέτρος - Σοφιανός Δημήτρης Karkalousos Petros - Sofianos Dimitris ΑΘΗΝΑ/ATHENS 2016

2 2

3 3

4 Διαδικασίες επικύρωσης μεθόδων στειρότητας μέτρησης βακτηριακών ενδοτοξινών 4

5 Πίνακας Περιεχομένων Ευχαριστίες... 7 Περίληψη... 8 Abstract Θεωρητικό Μέρος Αρχές για κανόνες καλής παρασκευής φαρμάκων Έλεγχος Ποιότητας Βασικές απαιτήσεις Ελέγχου Ποιότητας Τεκμηρίωση Δειγματοληψία Διεξαγωγή του Ελέγχου Πρόγραμμα εξελισσόμενης σταθερότητας Αναλυτικές Τεχνικές Ταξινόμηση Καθαρών χώρων Επιτήρηση καθαρών χώρων και συσκευών καθαρού αέρα ΕΝΙSO/IEC 17028: Αντικείμενο Απαιτήσεις για τη διοίκηση Σύστημα ποιότητας Τεχνικές απαιτήσεις Μέθοδοι ανίχνευσης βακτηριακών ενδοτοξινών Εισαγωγή Μέθοδοι προσδιορισμού βακτηριακών ενδοτοξινών Το LAL ως επίσημη μέθοδος ανίχνευσης πυρετογόνων Η μέθοδος Ειδικό Μέρος Έλεγχος Στειρότητας Απαραίτητος εξοπλισμός Περιγραφή Διαδικασίας Έλεγχος επικύρωσης Έλεγχος στειρότητας του προς εξέταση δείγματος Παρατήρηση και ερμηνεία αποτελεσμάτων Προσδιορισμός βακτηριακών ενδοτοξινών

6 2.2.1 Απαραίτητος εξοπλισμός Περιγραφή Μεθόδου Επισκόπηση & καταγραφή αποτελεσμάτων Έλεγχος Ποιότητας Εξωτερικός Έλεγχος Ποιότητας Εσωτερικός Έλεγχος Ποιότητας Διαδικασία επαλήθευσης Εκτίμηση αβεβαιότητας Ορισμοί Υπολογισμός Αβεβαιοτήτων Επικύρωση μεθόδων δοκιμών Εισαγωγή Εκτίμηση της Ορθότητας Εκτίμηση της πιστότητας (PRECISION) Μελέτη της γραμμικότητας (LINEARITY) Αξιολόγηση της εξειδίκευσης (SPECIFICITY) Αξιολόγηση της ανθεκτικότητας (ROBUSTNESS) Καταγραφή των στοιχείων επικύρωσης Επανεπικύρωση Αποτελέσματα Επικύρωσης Πρωτόκολλο Επικύρωσης Δήλωση καταλληλότητας Πίνακες Αναλυτικών Υπολογισμών

7 Ευχαριστίες Στα πλαίσια της παρούσας πτυχιακής, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους βοήθησαν στην ολοκλήρωσή της. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον εισηγητή μου και προϊστάμενο του Τμήματος Ποιοτικού Ελέγχου στο Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ, κ. Δημήτρη Σοφιανό, για την πολύτιμη βοήθεια αλλά και τις γνώσεις που μου προσέφερε πάνω στο αντικείμενο, τόσο για την πραγματοποίηση της συγκεκριμένης πτυχιακής, όσο και στα πλαίσια της πρακτικής μου άσκησης στο συγκεκριμένο εργαστήριο. Στη συνέχεια, θέλω να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Καρκαλούσο Πέτρο για τη σωστή καθοδήγηση, τις εύστοχες συμβουλές και παρατηρήσεις του στην εκπόνηση της πτυχιακής μου. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον κ. Κίκη Γεώργιο που μου δίδαξε με τον καλύτερο τρόπο τις εργαστηριακές τεχνικές, πάνω στις οποίες βασίστηκε η πτυχιακή αυτή εργασία. Τέλος, δεν θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω την οικογένεια μου για όλα όσα, με αγώνα μου έχουν προσφέρει. 7

8 Περίληψη Εισαγωγή: Η εργασία αυτή πραγματεύεται τις διαδικασίες που ακολουθούνται για την επικύρωση των μεθόδων προσδιορισμού βακτηριακών ενδοτοξινών, που εκτελούνται στο Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ. Στην εργασία αυτή περιγράφεται λεπτομερώς η μέθοδος και ο τρόπος με τον οποίο εκτελείται η ανάλυση δειγμάτων για τον προσδιορισμό των βακτηριακών ενδοτοξινών, που βασίζεται στην κινητική χρωματομετρική μέθοδο. Παρουσιάζεται αναλυτικά το πρωτόκολλο επικύρωσης που ακολουθείται ώστε να εξασφαλίζεται η ακρίβεια και η σταθερότητα των παραγομένων αποτελεσμάτων. Σκοπός: Η εργασία αυτή έχει ως στόχο να παρουσιάσει όλες τις διαδικασίες που απαιτούνται για την επικύρωση των διαδικασιών ελέγχου βακτηριακών ενδοτοξινών ώστε να αναγνωρίζεται η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων. Σκοπός της διαδικασίας αυτής είναι η εξέταση της αξιοπιστίας της Μεθόδου Δοκιμής και συνίσταται στην εκτίμηση της επαναληψιμότητας, της αναπαραγωγιμότητας, καθώς και της αβεβαιότητας αυτής. Η διαδικασία της επικύρωσης εφαρμόζεται όταν το κατά περίπτωση Εργαστήριο χρησιμοποιεί μεθόδους που είτε έχουν αναπτυχθεί από αυτό, είτε προέρχονται από τροποποίηση διεθνών μεθόδων. Υλικά Μέθοδος: Για τις τεχνικές που περιγράφονται παρακάτω χρησιμοποιούμε αποστειρωμένα υλικά ή υλικά μίας χρήσεως, όπως σωληνάρια, tips και γάντια. Οι εργασίες που αφορούν ελέγχους στειρότητας εκτελούνται σε θαλάμους νηματικής ροής. Για τον έλεγχο μικροβιακού φορτίου του αέρα είναι απαραίτητο το ειδικό σύστημα μέτρησης μικροβίων (Microbiological Air Sampler) και για το σωματιδιακό φορτίο του αέρα το ειδικό σύστημα laser (TSI). Σχετικά με τη δοκιμασία LAL, χρησιμοποιούμε Endosafe PTS Cartridge με αποξηραμένα αντιδραστήρια Cat, LAL Reagent Water για αραιώσεις δειγμάτων, όπου χρειάζεται Cat, σωληνάρια ή φιαλίδια πλαστικά ή υάλινα ελεύθερα πυρετογόνων για τη δειγματοληψία ή για πιθανές αραιώσεις, Parafilm και ρύγχη ελεύθερα πυρετογόνων. Αποτελέσματα: Στους ελέγχους στειρότητας ελέγχουμε μακροσκοπικά για ενδείξεις μικροβιακής ανάπτυξης και αν εμφανίζεται θόλωμα στο θρεπτικό υλικό μεταφέρουμε το υλικό σε νέους περιέκτες με το ίδιο υλικό. Αν δεν υπάρχει 8

9 μικροβιακή ανάπτυξη το υλικό θεωρείται στείρο. Στον προσδιορισμό βακτηρικαών ενδοτοξινών πυρετογόνων ελέγχουμε αν πληρούνται τα κριτήρια αποδοχής ανάλυσης και παίρνουμε σαν αποτελέσματα τα αποτελέσματα που εμφανίζονται στο ειδικό όργανο (Sample EU/mL, Sample %CV + % CV Spike, % Spike Recovery). Στις διαδικασίες επικύρωσης της μεθόδου προσδιορισμού βακτηριακών ενδοτοξινών περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του Ορίου Ανίχνευσης και Ορίου Ποσοτικοποίησης, έλεγχο Πιστότητας, Ορθότητας, Αβεβαιότητας, Γραμμικότητας. Με βάση τα ανωτέρω συνοπτικά αποτελέσματα επικύρωσης κρίνουμε εάν η μέθοδος είναι κατάλληλη για τη σκοπούμενη χρήση. μπορούμε να Συζήτηση: Οι μέθοδοι που εφαρμόζονται στο εργαστήριο είναι πρότυπες μέθοδοι ή μέθοδοι που έχουν αναπτυχθεί στο εργαστήριο. Όταν η μέθοδος είναι πρότυπη, τότε η αξιοπιστία της πρέπει τουλάχιστον να επιβεβαιώνεται. Ως επιβεβαίωση (verification) νοείται ο έλεγχος της ορθότητας και της πιστότητας. Η πλήρης επικύρωση μιας μεθόδου γίνεται αξιολογώντας την ορθότητα (trueness), την πιστότητα (precision), την αβεβαιότητα, την ευαισθησία, την ανθεκτικότητα (robustness) και την εξειδίκευση (specificity). 9

10 Abstract Background: This thesis deals with the procedures for the validation of bacterial endotoxin assays, performed in the Quality Control Laboratory of the Greek Pasteur Institute. This paper describes in detail the method and the way in which the analysis of samples is performed to determine the bacterial endotoxins, based on kinetic colorimetric method. Analytically presents the validation protocol followed to ensure the accuracy and stability of the produced results. Scope: This paper aims to present all the processes required for the validation of bacterial endotoxin testing procedures to recognize the validity of the results. The purpose of this process is to examine the reliability of the test method and the assessment of repeatability, reproducibility, and uncertainty. The process of validation is applied when whichever laboratory uses methods either developed it, whether by amendment of international methods. Material Method: For the techniques described below, we use sterilized materials or disposable materials, such as tubes, tips and gloves. Sterility controls tests are performed in a laminar flow chambers. For the microbial load of the air control is necessary of the specific microbe measurement system (Microbiological Air Sampler) and particulate air load specific laser system (TSI). About LAL assay we use Endosafe PTS Cartridge with Dried reagents, LAL Reagent Water for sample dilutions, where necessary, tubes or plastic bottles or glass depyrogenated for sampling or for possible dilutions Parafilm and tips depyrogenated. Results: In sterile controls we check visually for evidence of microbial growth and if turbidity appears we transport the material in new containers with the same 10

11 material. If there is no microbial growth material is considered sterile. In LAL test check of whether the analysis acceptance criteria (Sample EU / ml, Sample% CV +% CV Spike, % Spike Recovery) and get results as the results are displayed in a special instrument. In procedures for validation of bacterial endotoxins assay involves identifying the Limit of Detection and Limit of Quantification, control Loyalty, Accuracy, Uncertainty, linearity. Based on the above summary validation results we can decide whether the method is suitable for the intended use. Discussion: The methods used in the laboratory are standard methods or methods developed in the laboratory. When the method is standard, then the reliability of at least be confirmed. As confirmation (verification) means a check of the correctness and conformity. A full validation of a method is evaluating the accuracy, precision, uncertainty, sensitivity, robustness and specificity. 11

12 Θεωρητικό Μέρος 1 Αρχές για κανόνες καλής παρασκευής φαρμάκων Ο κάτοχος Άδειας Παραγωγής πρέπει να παρασκευάζει φαρμακευτικά προϊόντα με τρόπο, ώστε να εξασφαλίζεται, ότι είναι κατάλληλα για την χρήση, για τη οποία προορίζονται, ότι είναι σύμφωνα με τις απαιτήσεις της Άδειας Κυκλοφορίας τους και ότι δεν εκθέτουν τους ασθενείς σε κίνδυνο εξαιτίας μη επαρκούς ασφάλειας, ποιότητας ή αποτελεσματικότητας. Η επίτευξη αυτού του σκοπού ποιότητας είναι ευθύνη της ανώτερης διοίκησης και απαιτεί την συμμετοχή και την ανάληψη ευθύνης εκ μέρους του προσωπικού σε πολλά διαφορετικά τμήματα και σε όλα τα επίπεδα μέσα στην επιχείρηση, εκ μέρους των προμηθευτών της επιχείρησης και εκ μέρους των διανομέων. Για να επιτευχθεί ο σκοπός της ποιότητας με αξιόπιστο τρόπο πρέπει να υπάρξει ένα σύστημα Διασφάλισης της Ποιότητας, το οποίο να έχει σχεδιαστεί κατάλληλα και να έχει εφαρμοσθεί σωστά και το οποίο να ενσωματώνει την Ορθή Πρακτική κατά την Παραγωγή με τον τρόπο αυτό να επιτυγχάνεται ο Έλεγχος Ποιότητας. Πρέπει να είναι πλήρως τεκμηριωμένο και να παρακολουθείται η αποτελεσματικότητα του. Όλα τα τμήματα του συστήματος Διασφάλισης Ποιότητας πρέπει να εφοδιασθούν επαρκώς με κατάλληλο προσωπικό και κατάλληλες επαρκείς εγκαταστάσεις, εξοπλισμό και χώρους. Υπάρχουν πρόσθετες νομικές ευθύνες για τον κάτοχο Άδειας Παραγωγής και για το Ειδικευμένο Προσωπικό. Η Διασφάλιση Ποιότητας είναι μια έννοια που κυμαίνεται σε ευρεία περιοχή και η οποία καλύπτει όλα τα θέματα, τα οποία το καθένα ή όλα μαζί επηρεάζουν την ποιότητα του προϊόντος. Αποτελεί το συνολικό άθροισμα των οργανωμένων ρυθμίσεων, που γίνονται με σκοπό να εξασφαλίζεται, ότι τα φαρμακευτικά προϊόντα έχουν την ποιότητα, που απαιτείται για την χρήση, για την οποία προορίζονται. Η διασφάλιση ποιότητας είναι μια έννοια που κυμαίνεται σε ευρεία περιοχή και καλύπτει όλα τα θέματα, τα οποία επηρεάζουν την ποιότητα του προϊόντος. Αποτελεί το συνολικό άθροισμα των οργανωμένων ρυθμίσεων, που 12

13 σκοπό έχουν να εξασφαλίζεται, ότι τα φαρμακευτικά προϊόντα έχουν την ποιότητα που απαιτείται, για την χρήση για την οποία προορίζονται. 1.1 Έλεγχος Ποιότητας Ο έλεγχος ποιότητας είναι το μέρος των Κανόνων Καλής Παραγωγής το οποίο περιλαμβάνει τη δειγματοληψία, τις προδιαγραφές και τον έλεγχο και το οποίο μαζί με τις διαδικασίες διοργάνωσης, τεκμηρίωσης και αποδέσμευσης εξασφαλίζει ότι πραγματικά διεξάγονται οι αναγκαίοι και σχετικοί έλεγχοι και ότι τα υλικά δεν αποδεσμεύονται προς χρήση, ούτε τα προϊόντα αποδεσμεύονται προς πώληση ή προμήθεια μέχρι να έχει κριθεί ότι είναι ικανοποιητική η ποιότητα τους. Ο Έλεγχος Ποιότητας δεν περιορίζεται σε εργαστηριακές εργασίες, αλλά πρέπει να περιλαμβάνεται σε όλες τις αποφάσεις, οι οποίες είναι δυνατόν να αφορούν την ποιότητα του προϊόντος. Η ανεξαρτησία του Ελέγχου Ποιότητας από την Παραγωγή θεωρείται θεμελιώδης για την ικανοποιητική λειτουργία του Ελέγχου Ποιότητας Βασικές απαιτήσεις Ελέγχου Ποιότητας Διατίθενται επαρκείς παροχές, εκπαιδευμένο προσωπικό και εγκεκριμένες διαδικασίες για τη δειγματοληψία, την επιθεώρηση και τον έλεγχο αρχικών υλικών, των υλικών συσκευασίας, των ενδιάμεσων προϊόντων, των χύμα και των τελικών προϊόντων και όπου είναι κατάλληλο για την παρακολούθηση των περιβαλλοντικών συνθηκών, από τα αρχικά υλικά, τα υλικά συσκευασίας, τα ενδιάμεσα προϊόντα, τα χύμα προϊόντα και τα τελικά προϊόντα λαμβάνονται δείγματα από προσωπικό και μεθόδους που έχουν εγκριθεί από τον έλεγχο Ποιότητας αξιολογείται η αξιοπιστία των μεθόδων έλεγχο, τηρούνται αρχεία, χειρόγραφα και/ή με όργανα καταγραφής, τα οποία δείχνουν ότι διεξάγονται πραγματικά όλες οι απαιτούμενες διαδικασίες δειγματοληψίας, επιθεώρησης και ελέγχου. Οποιεσδήποτε αποκλίσεις καταγράφονται και διερευνώνται πλήρως, τα τελικά προϊόντα περιέχουν δραστικά συστατικά, που συμφωνούν με την ποιοτική και ποσοτική σύνθεση της Άδειας Κυκλοφορίας, έχουν την 13

14 απαιτούμενη καθαρότητα και περιέχονται μέσα στους περιέκτες και φέρουν την ορθή επισήμανση, τηρούνται αρχεία με τα αποτελέσματα της επιθεώρησης και ότι ο έλεγχος των υλικών, των ενδιάμεσων, των χύμα και των τελικών προϊόντων αξιολογείται τυπικά έναντι των προδιαγραφών. Η αξιολόγηση του προϊόντος περιλαμβάνει εξέταση και αξιολόγηση της σχετικής τεκμηρίωσης παραγωγής και αξιολόγηση των αποκλίσεων από τις καθορισμένες διαδικασίες, δεν αποδεσμεύεται καμία παρτίδα προϊόντος προς πώληση ή εφοδιασμό πριν από την πιστοποίηση από Ειδικευμένο Πρόσωπο ότι αυτή συμφωνεί με τις απαιτήσεις της Άδειας Κυκλοφορίας, διατηρούνται επαρκή δείγματα αναφοράς των αρχικών υλικών και των προϊόντων προκειμένου να επιτρέπεται η μελλοντική εξέταση του προϊόντος, αν είναι αναγκαίο, και ότι το προϊόν διατηρείται στην τελική του συσκευασία εκτός αν παραχθούν κατ εξαίρεση μεγάλες συσκευασίες. Κάθε κάτοχος άδειας δυνατότητας παραγωγής πρέπει να έχει ένα Τμήμα Ποιοτικού Ελέγχου. Το τμήμα αυτό πρέπει να είναι ανεξάρτητο από τα άλλα τμήματα και υπό την δικαιοδοσία ενός προσώπου με τα κατάλληλα προσόντα και εμπειρία, ο οποίος έχει στη διάθεσή του ένα ή περισσότερα εργαστήρια ελέγχου. Πρέπει να διατίθενται επαρκείς πόροι προκειμένου να εξασφαλίζεται ότι όλες οι ρυθμίσεις του Ελέγχου Ποιότητας διεξάγονται αποτελεσματικά και αξιόπιστα. Το τμήμα Ελέγχου Ποιότητας ως σύνολο έχει επίσης άλλα καθήκοντα, όπως να καθιερώνει, να αξιολογεί την αξιοπιστία και να εφαρμόζει όλες τις διαδικασίες ελέγχου ποιότητας, να τηρεί τα δείγματα αναφοράς των υλικών και των προϊόντων, να εξασφαλίζει τη σωστή επισήμανση των περιεκτών των υλικών και των προϊόντων, να εξασφαλίζει την παρακολούθηση της σταθερότητας των προϊόντων, να συμμετέχει στη διερεύνηση των παραπόνων που συνδέονται με την ποιότητα του προϊόντος. Όλες αυτές οι εργασίες πρέπει να διεξάγονται σύμφωνα με γραπτές διαδικασίες και, όταν είναι αναγκαίο να καταγράφονται. Η αξιολόγηση του τελικού προϊόντος πρέπει να περιλαμβάνει όλους τους σχετικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των συνθηκών της παραγωγής, των αποτελεσμάτων του ελέγχου κατά τη διαδικασία, εξέταση της τεκμηρίωσης της 14

15 παραγωγής, τη συμμόρφωση με τις Προδιαγραφές του τελικού προϊόντος και την εξέταση της τελευταίας τελικής συσκευασίας. Το προσωπικό του Ελέγχου Ποιότητας πρέπει να έχει πρόσβαση στις περιοχές παραγωγής για τη δειγματοληψία και τη διερεύνηση κατά περίπτωση. Το προσωπικό, οι εγκαταστάσεις και ο εξοπλισμός στα εργαστήρια πρέπει να είναι κατάλληλα για τα καθήκοντα, που επιβάλλονται από τη φύση και τη κλίμακα εργασιών παραγωγής Τεκμηρίωση Στο Τμήμα Ποιοτικού Ελέγχου πρέπει να είναι άμεσα διαθέσιμες οι παρακάτω λεπτομέρειες: Οι προδιαγραφές, οι διαδικασίες δειγματοληψίας, οι διαδικασίες ελέγχου και τήρησης αρχείων, οι εκθέσεις ανάλυσης και /ή τα πιστοποιητικά, τα δεδομένα από την παρακολούθηση του περιβάλλοντος, τα αρχεία αξιολόγησης της αξιοπιστίας των μεθόδων, οι διαδικασίες για την βαθμονόμηση των οργάνων και τη συντήρηση του εξοπλισμού και τα σχετικά αρχεία. Κάθε τεκμηρίωση του Ελέγχου Ποιότητας, που συνδέεται με τα αρχεία παρτίδων, πρέπει να διατηρείται επί ένα χρόνο μετά από την ημερομηνία λήξης των παρτίδων και τουλάχιστον 5 έτη μετά από την πιστοποίηση Δειγματοληψία Η λήψη δείγματος πρέπει να γίνεται σύμφωνα με εγκεκριμένες γραπτές διαδικασίες οι οποίες να περιγράφουν: Τη μέθοδο δειγματοληψίας, τον εξοπλισμό που χρησιμοποιηθεί, την ποσότητα του δείγματος που θα ληφθεί, τις οδηγίες για οποιαδήποτε κατάτμηση του προϊόντος, 15

16 τον τύπο και τις συνθήκες του περιέκτη που θα χρησιμοποιηθεί το δείγμα, την ταυτοποίηση των περιεκτών που θα δειγματιστούν, οποιεσδήποτε ειδικές προφυλάξεις που πρέπει να τηρούνται, ιδιαίτερα ως προς τη δειγματοληψία στείρων ή επιβλαβών υλικών, τις συνθήκες αποθήκευσης, τις οδηγίες για τον καθαρισμό και την αποθήκευση του εξοπλισμού για τη δειγματοληψία. Τα δείγματα αναφοράς πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικά της παρτίδας υλικών ή προϊόντων από την οποία ελήφθησαν. Επίσης είναι δυνατόν να ληφθούν άλλα δείγματα των πιο κρίσιμων μερών μιας διαδικασίας. Οι περιέκτες των δειγμάτων πρέπει να φέρουν ετικέτα, η οποία να υποδεικνύει τα περιεχόμενα, με τον αριθμό παρτίδας, την ημερομηνία δειγματοληψίας και από ποιους περιέκτες ελήφθησαν τα δείγματα Διεξαγωγή του Ελέγχου Οι αναλυτικές μέθοδοι πρέπει να έχουν υποβληθεί σε έλεγχο αξιοπιστίας. Όλες οι εργασίες ελέγχου, που περιγράφονται στην άδεια κυκλοφορίας, πρέπει να διεξάγονται σύμφωνα με εγκεκριμένες μεθόδους. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται, πρέπει να καταγράφονται σε αρχεία και να ελέγχονται, ώστε να είναι βέβαιο ότι συμφωνούν μεταξύ τους. Οι υπολογισμοί πρέπει να εξετάζονται με προσοχή. Οι έλεγχοι που διεξάγονται πρέπει να καταγράφονται και τα δελτία πρέπει να περιλαμβάνουν τουλάχιστον τα παρακάτω δεδομένα: Το όνομα του υλικού ή του προϊόντος και η δοσολογική μορφή, τον αριθμό της παρτίδας, τον παραγωγό ή προμηθευτή, τις αναφορές σε σχετικέ προδιαγραφές και διαδικασίες ελέγχου, τα αποτελέσματα ελέγχου, τις ημερομηνίες διεξαγωγής του ελέγχου, τα αρχικά του προσώπου που διεξήγε τον έλεγχο, 16

17 τα αρχικά του προσώπου που επαλήθευσε τον έλεγχο και τους υπολογισμούς, μια σαφή δήλωση για αποδέσμευση ή απόρριψη με ημερομηνία και υπογραφή του υπεύθυνου προσώπου. Όλοι οι έλεγχοι κατά τη διάρκεια της παραγωγής πρέπει να γίνονται σύμφωνα με μεθόδους εγκεκριμένες από τον Έλεγχο Ποιότητας και τα αποτελέσματα να καταγράφονται. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στην ποιότητα των εργαστηριακών αντιδραστηρίων, των ογκομετρικών υάλων, των διαλυμάτων, των προτύπων αναφοράς και των μέσων για καλλιέργειες. Τα εργαστηριακά αντιδραστήρια που προορίζονται για παρατεταμένη χρήση, πρέπει να επισημαίνονται με ημερομηνία παρασκευής και την υπογραφή του προσώπου που τα παρασκεύασε. Η ημερομηνία λήξης ασταθών αντιδραστηρίων και μέσων για καλλιέργειες πρέπει να αναγράφεται στην ετικέτα, μαζί με τις ειδικές συνθήκες φύλαξης. Επιπλέον, για τα ογκομετρικά διαλύματα πρέπει να αναφέρονται η τελευταία ημερομηνία τιτλοδότησης και ο τελευταίος ισχύων δείκτης. Εφόσον απαιτείται, στον περιέκτη πρέπει να υποδεικνύεται η ημερομηνία παραλαβής κάθε πρότυπης ουσίας που χρησιμοποιείται για εργασίες ελέγχου. Οι οδηγίες για την φύλαξη καθώς και για την χρήση πρέπει να ακολουθούνται. Σε ορισμένες περιπτώσεις είναι αναγκαίο να διεξάγεται έλεγχος ταυτοποίησης ή άλλος έλεγχος κατά την παραλαβή ή πριν από τη χρήση. Τα ζώα που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο συστατικών, υλικών ή προϊόντων, πρέπει να απομονώνονται πριν από την χρήση. Πρέπει ακόμα αυτά να τηρούνται και να ελέγχονται κατά τρόπο ο οποίος να εξασφαλίζει την καταλληλότητά τους για την χρήση, για την οποία προορίζονται. Τέλος πρέπει να τακτοποιούνται και να τηρούνται επαρκή αρχεία που να παρουσιάζουν το ιστορικό της χρήσης τους Πρόγραμμα εξελισσόμενης σταθερότητας 17

18 Μετά την κυκλοφορία στην αγορά, πρέπει να παρακολουθείται η σταθερότητα του φαρμακευτικού προϊόντος σύμφωνα με ένα συνεχές κατάλληλο πρόγραμμα που θα επιτρέπει την ανίχνευση κάθε ζητήματος σταθερότητας που σχετίζεται με το παρασκεύασμα στη συσκευασία που κυκλοφορεί στην αγορά. Αυτό έχει ως στόχο την παρακολούθηση του προϊόντος κατά τη διάρκεια της ζωής του και το να προσδιορίζει ότι το προϊόν παραμένει και μπορεί να αναμένεται να παραμένει εντός των προδιαγραφών, σε συνθήκες φύλαξης, που αναγράφονται στην ετικέτα. Το ίδιο συμβαίνει και με τα χύμα προϊόντα και τα ενδιάμεσα προϊόντα. Το πρόγραμμα εξελισσόμενης σταθερότητας πρέπει να περιγράφεται σε γραπτό πρωτόκολλο και τα αποτελέσματα να παίρνουν τη μορφή έκθεσης αναφοράς. Επιπλέον, πρέπει να εκτείνεται μέχρι τέλους της λήξης της διάρκειας ζωής και πρέπει να περιλαμβάνει τις ακόλουθες παραμέτρους: Τον αριθμό παρτίδων ανά περιεκτικότητα και τα διάφορα μεγέθη παρτίδας, αν έχει εφαρμογή, τις σχετικές φυσικές, χημικές, μικροβιολογικές και βιολογικές μεθόδους ελέγχου, τα κριτήρια αποδοχής, τις αναφορές για τις μεθόδους ελέγχου, την περιγραφή του συστήματος για το κλείσιμο του περιέκτη, τα διαστήματα μεταξύ των ελέγχων, την περιγραφή των συνθηκών αποθήκευσης, άλλες εφαρμόσιμες παραμέτρους, ειδικές για το φαρμακευτικό προϊόν. Ο αριθμός των παρτίδων και η συχνότητα διεξαγωγής των ελέγχων πρέπει να παρέχουν επαρκή δεδομένα, που θα επιτρέπει την ανάλυση τάσης. Για προϊόντα όπου η παρακολούθηση της εξελισσόμενης σταθερότητας κανονικά θα χρειαζόταν τη διεξαγωγή ελέγχου με χρήση πειραματόζωων και δεν υπάρχουν διαθέσιμες κατάλληλες εναλλακτικές τεχνικές με αξιολογημένη αξιοπιστία, η συχνότητα διεξαγωγής του ελέγχου είναι δυνατόν να λαμβάνει υπόψη την προσέγγιση οφέλους-κινδύνου. Τα αποτελέσματα των μελετών εξελισσόμενης σταθερότητας πρέπει να είναι διαθέσιμα στο σημαντικό νευραλγικό προσωπικό και ιδιαίτερα στα 18

19 Ειδικευμένα Πρόσωπα. Όταν διεξάγονται μελέτες εξελισσόμενης σταθερότητας σε χώρο άλλο από τον χώρο παραγωγής του χύμα ή του τελικού προϊόντος, πρέπει να υπάρχει γραπτή συμφωνία μεταξύ των ενδιαφερόμενων μερών. Τα αποτελέσματα των μελετών πρέπει να είναι διαθέσιμα στον χώρο παραγωγής για εξέταση από την αρμόδια αρχή. Πρέπει να διερευνώνται τάσεις εκτός των προδιαγραφών και κάθε σημαντική αρνητική τάση, πρέπει να αναφέρεται στις σχετικές αρμόδιες αρχές. Μια συνοπτική παρουσίαση όλων των δεδομένων, που προκύπτουν, συμπεριλαμβανομένων των ενδιαμέσων συμπερασμάτων για το πρόγραμμα, πρέπει να είναι γραπτή και να διατηρείται. Η συνοπτική παρουσίαση πρέπει να υπόκειται σε περιοδική εξέταση. Η δοκιμασία στειρότητας που διενεργείται στο τελικό προϊόν πρέπει να θεωρείται μόνο ως η τελευταία σειρά ελέγχων με τους οποίους επιβεβαιώνεται η στειρότητα. Η δοκιμασία πρέπει να έχει ελεγχθεί και επιβεβαιωθεί ως προς την αξιοπιστία της σε σχέση με τα συγκεκριμένα προϊόντα. Στις περιπτώσεις εγκεκριμένης παραμετρικής απελευθέρωσης πρέπει να επιδεικνύεται ιδιαίτερη προσοχή στον έλεγχο και την επιβεβαίωση της αξιοπιστίας και στην παρακολούθηση ολόκληρης της διαδικασίας παραγωγής. Τα δείγματα που προορίζονται για τον έλεγχο στειρότητας πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικά του συνόλου της παρτίδας και να περιλαμβάνουν οπωσδήποτε δείγματα από μέρη της παρτίδας που θεωρούνται περισσότερο εκτεθειμένα στον κίνδυνο επιμόλυνσης [1]. 1.2 Αναλυτικές Τεχνικές Ταξινόμηση Καθαρών χώρων Η παραγωγή στείρων προϊόντων υπόκειται σε ειδικές απαιτήσεις προκειμένου να ελαχιστοποιούνται οι κίνδυνοι μικροβιακής επιμόλυνσης, και επιμόλυνσης από σωματίδια και πυρετογόνα. Η Διασφάλιση της ποιότητας είναι ιδιαίτερα σημαντική, και ο εν λόγω τύπος παραγωγής πρέπει να ακολουθεί, με αυστηρότητα, μεθόδους 19

20 παρασκευής και διαδικασίες που έχουν καθιερωθεί μετά από προσεκτική μελέτη και των οποίων ο έλεγχος και η αξιοπιστία έχει επιβεβαιωθεί (validated). Η εξασφάλιση της στειρότητας ή άλλων ποιοτικών παραμέτρων δεν πρέπει να παραπέμπεται αποκλειστικά στις καταληκτικές διαδικασίες ή στις δοκιμασίες τελικού προϊόντος. Οι καθαροί χώροι για την ταξινομούνται με βάση τα απαιτούμενα χαρακτηριστικά του χώρου εργασίας. Κάθε εργασία παραγωγής απαιτεί κατάλληλα επίπεδα καθαρότητας του χώρου εργασίας υπό συνθήκες λειτουργίας, προκειμένου να ελαχιστοποιούνται οι κίνδυνοι μικροβιακής επιμόλυνσης και επιμόλυνσης από σωματίδια των υπό χειρισμό προϊόντων ή υλικών. Προκειμένου να πληρούνται οι όροι «λειτουργίας», ο σχεδιασμός των εν λόγω χώρων πρέπει να είναι τέτοιος ώστε να επιτυγχάνονται συγκεκριμένα επίπεδα καθαρότητας αέρα στην κατάσταση «ετοιμότητας». Ως κατάσταση «ετοιμότητας» ορίζεται εκείνη όπου οι εγκαταστάσεις έχουν ολοκληρωθεί και είναι έτοιμες να λειτουργήσουν πλήρεις με παραγωγικό εξοπλισμό, χωρίς όμως να είναι παρόν το προσωπικό χειρισμού. Ως κατάσταση «λειτουργίας» ορίζεται εκείνη όπου οι εγκαταστάσεις λειτουργούν κατά τον προβλεπόμενο τρόπο με παρόντα τον καθορισμένο αριθμό του προσωπικού να εργάζεται. Οι καταστάσεις «λειτουργίας» ή «ετοιμότητας» πρέπει να καθορίζονται για κάθε καθαρό χώρο ή ακολουθία (suite) καθαρών χώρων. Διακρίνονται 4 βαθμίδες καθαρών χώρων. Βαθμίδα Α: Μία περιορισμένη ζώνη για εργασίες υψηλής επικινδυνότητας π.χ. πλήρωση, πωματισμός, χρήση ανοικτών φυσίγγων και φιαλιδίων, πραγματοποίηση άσηπτων συνδέσεων. Συνήθως, οι συνθήκες αυτές επιτυγχάνονται με τη χρήση σταθμών εργασίας με στρωτή ροή αέρα. Τα συστήματα στρωτής ροής αέρα καλούνται να διοχετεύσουν αέρα σταθερής ταχύτητας 0,36 0,54 m/s (ενδεικτική τιμή) στη θέση εργασίας, στις εφαρμογές ανοιχτού καθαρού χώρου. Βαθμίδα Β: Αφορά στις συνθήκες του χώρου που περιβάλλει το χώρο Βαθμίδας Α. για τις εργασίες άσηπτης παρασκευής και πλήρωσης. 20

21 Βαθμίδα Γ και Δ: Καθαροί χώροι για τη διεκπεραίωση των λιγότερο κρίσιμων φάσεων. Οι καθαροί χώροι και οι συσκευές καθαρού αέρα πρέπει να ταξινομούνται βάσει του προτύπου ΕΝ ISO Η ταξινόμηση θα πρέπει να διαφοροποιείται από τον περιβαλλοντικό έλεγχο που γίνεται κατά τη διάρκεια της παραγωγικής διαδικασίας. Ο παρακάτω πίνακας ταξινομεί τις διάφορες βαθμίδες με βάση τον αριθμό σωματιδίων που υπάρχουν στον αέρα: Πίνακας 1: Επιτρεπόμενος αριθμός σωματιδίων [2] Μέγιστος επιτρεπόμενος αριθμός σωματιδίων ανά m 3, μεγέθους ίσου ή μεγαλύτερου του μεγέθους ταξινόμησης Σε ετοιμότητα Σε λειτουργία Βαθμίδα 0,5 μm 5 μm 0,5 μm 5 μm Α Ι Β Γ Δ Δεν ορίζεται Δεν ορίζεται Η μέτρηση των σωματιδίων στηρίζεται στην χρήση μετρητή διακριτών αερομεταφερόμενων σωματιδίων και μετράται η συγκέντρωση των σωματιδίων που είναι μεγαλύτερου ή ίσου μεγέθους προς τα οριζόμενα όρια. Για τον έλεγχο επιτήρησης (ρουτίνας), ο συνολικός όγκος του δείγματος δεν πρέπει να είναι μικρότερος από 1 m 3 για τους χώρους βαθμίδας Α και Β και για τους χώρους βαθμίδας Γ επίσης κατά προτίμηση Επιτήρηση καθαρών χώρων και συσκευών καθαρού αέρα Επιβάλλεται η επιτήρηση των χώρων κατά τη λειτουργία, προκειμένου να ελέγχεται η σωματιδιακή καθαρότητα των διαφόρων βαθμίδων. Οι άσηπτες εργασίες πρέπει να παρακολουθούνται στενά με μεθόδους όπως οι πλάκες καθίζησης, οι 21

22 ογκομετρικές δειγματοληψίες αέρος και επιφανειών (π.χ. με στειλεούς και πλάκες επαφής). Οι δειγματοληπτικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στη φάση της λειτουργίας δεν πρέπει να παρεμβαίνουν στην προστασία των καθαρών χώρων. Τα αποτελέσματα της παρακολούθησης πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την εξέταση των σχετικών με τη συγκεκριμένη παρτίδα στοιχείων κατά τη φάση της αποδέσμευσης του τελικού προϊόντος. Μετά από κάθε κρίσιμη εργασία επιβάλλεται ο έλεγχος των επιφανειών και του προσωπικού. Απαιτείται επίσης πρόσθετη μικροβιολογική παρακολούθηση πέραν των διεργασιών παραγωγής π.χ. μετά τον έλεγχο και την επιβεβαίωση αξιοπιστίας (validation) των συστημάτων, τον καθαρισμό και απολύμανσή τους. Συνιστώμενα όρια για τη μικροβιολογική παρακολούθηση των καθαρών χώρων κατά τη λειτουργία: Πίνακας 2: Μικροβιολογική παρακολούθησης καθαρών χώρων [2] Βαθμίδα Δείγμα αέρα cfu/m 3 Συνιστώμενα όρια μικροβιακής επιμόλυνσης Πλάκες πλάκες επαφής καθίζησης (διάμετρος 55 (διάμετρος 9,0 mm) cfu mm) cfu/4 ώρες /πλάκα Αποτύπωμα Χειροκτίου με 5 Δάκτυλα cfu /χειρόκτιο Α <1 <1 <1 <1 Β Γ Δ Πρόκειται για μέσες τιμές. Ορισμένες πλάκες καθίζησης δύνανται να εκτεθούν για χρονικό διάστημα μικρότερο των τεσσάρων ωρών. Επιβάλλεται ο καθορισμός κατάλληλων ορίων συναγερμού και αντιδράσεως, σε συνάρτηση με τα αποτελέσματα της σωματιδιακής και μικροβιολογικής παρακολούθησης. Σε περίπτωση υπέρβασης των εν λόγω ορίων, οι διαδικασίες [2,3]. 22

23 1.3 ΕΝΙSO/IEC 17028: Αντικείμενο Αυτό το Διεθνές Πρότυπο καθορίζει τις γενικές απαιτήσεις ικανότητας για τη διεξαγωγή δοκιμών ή/και διακριβώσεων, συμπεριλαμβανομένης της δειγματοληψίας. Καλύπτει δοκιμές και διακριβώσεις που εκτελούνται με τη χρήση προτύπων μεθόδων, μη προτύπων μεθόδων και μεθόδων που έχουν αναπτυχθεί από το εργαστήριο. Εφαρμόζεται σε όλους τους οργανισμούς που εκτελούν δοκιμές ή/και διακριβώσεις και σε όλα τα εργαστήρια ανεξαρτήτως του αριθμού του προσωπικού ή του εύρους του πεδίου εφαρμογής των δοκιμών ή/και διακριβώσεων. Προορίζεται για χρήση από τα εργαστήρια, τους πελάτες των εργαστηρίων, τους φορείς διαπίστευσης κ.λπ. Στο Πρότυπο περιέχονται διευκρινίσεις, παραδείγματα και σημειώσεις για καθοδήγηση και δεν αποτελούν απαιτήσεις. Η συμμόρφωση με τις νομοθετικές απαιτήσεις ασφάλειας δεν καλύπτεται από το Πρότυπο. Η συμμόρφωση με το Πρότυπο αυτό εξασφαλίζει τη συμμόρφωση με το Πρότυπο ISO 9001: Απαιτήσεις για τη διοίκηση Οργάνωση Το εργαστήριο ή ο οργανισμός του οποίου αποτελεί μέρος, πρέπει να είναι μια οντότητα που να μπορεί να θεωρηθεί νομικά υπεύθυνη. Το εργαστήριο είναι υπεύθυνο για τη διεξαγωγή των δραστηριοτήτων δοκιμών και διακριβώσεων, με τέτοιο τρόπο ώστε να ικανοποιεί τις απαιτήσεις του Προτύπου αυτού, τις ανάγκες των πελατών, των κανονιστικών αρχών και των οργανώσεων που παρέχουν αναγνώριση. Το σύστημα διαχείρισης πρέπει να καλύπτει τις εργασίες που εκτελούνται στις μόνιμες εγκαταστάσεις ή κινητές εγκαταστάσεις. Εάν εργαστήριο είναι μέρος ενός οργανισμού που ασκεί δραστηριότητες πέραν των δοκιμών και των διακριβώσεων, πρέπει να καθορίζονται οι ευθύνες του 23

24 προσωπικού του οργανισμού που κατέχει καίριες θέσεις, προκειμένου να αναγνωρίζεται η πιθανή σύγκρουση συμφερόντων. Το εργαστήριο πρέπει: 1. Να έχει διοικητικό και τεχνικό προσωπικό με την αρμοδιότητα και τους πόρους που απαιτούνται για τη διεξαγωγή των καθηκόντων του, 2. να προνοεί ώστε να διασφαλίζεται ότι η διοίκηση και το προσωπικό του είναι ελεύθερα από οποιεσδήποτε πιέσεις, 3. να διαθέτει πολιτικές και διαδικασίες που να εξασφαλίζουν την προστασία των εμπιστευτικών πληροφοριών του πελάτη, 4. να διαθέτει πολιτικές και διαδικασίες έτσι ώστε να αποφευχθεί η συμμετοχή σε δραστηριότητες που θα μπορούσαν να μειώσουν την εμπιστοσύνη στην ικανότητα, αμεροληψία ή κρίση της λειτουργίας του, 5. να καθορίζει την οργανωτική και διοικητική δομή του εργαστηρίου, 6. να ορίζει τις ευθύνες και τις αρμοδιότητες όλου του προσωπικού, 7. να παρέχει επαρκή επίβλεψη του προσωπικού δοκιμών και διακριβώσεων, 8. να διαθέτει τεχνική διοίκηση, 9. να ορίζει υπεύθυνο ποιότητας, 10. να διορίζει αναπληρωτές για το προσωπικό διαχείρισης Σύστημα ποιότητας Το εργαστήριο πρέπει να εφαρμόζει ένα σύστημα για την ποιότητα κατάλληλο για το αντικείμενο των δραστηριοτήτων του. Το εργαστήριο οφείλει να τεκμηριώνει τα συστήματα του, τις πολιτικές του, τα προγράμματα, τις διαδικασίες και τις οδηγίες στον απαραίτητο βαθμό ώστε να μπορεί να διασφαλιστεί η ποιότητα των αποτελεσμάτων των δοκιμών ή των διακριβώσεων. Η πολιτική του συστήματος διαχείρισης ποιότητας του εργαστηρίου πρέπει να καθορίζεται σε ένα εγχειρίδιο ποιότητας. Οι γενικοί στόχοι πρέπει να επανεξετάζονται κατά την ανασκόπηση από τη διοίκηση. Η δήλωση της πολιτικής για την ποιότητα γίνεται από την ανώτατη διοίκηση και περιλαμβάνει τα παρακάτω: 24

25 1. Τη δέσμευση της διοίκησης του εργαστηρίου για ορθή επαγγελματική πρακτική και για την ποιότητα των δοκιμών και των διακριβώσεων, 2. τη δήλωση για το επίπεδο των υπηρεσιών του εργαστηρίου, 3. τους στόχους του συστήματος ποιότητας, 4. απαίτηση προς όλο το προσωπικό να ενημερώνεται με την τεκμηρίωση του συστήματος ποιότητας και να εφαρμόζει την πολιτική και τις διαδικασίες στην εργασία του, 5. τη δέσμευση του εργαστηρίου για συμμόρφωση με αυτό το διεθνές πρότυπο και βελτίωση του συστήματος διαχείρισης σε συνεχές επίπεδο Τεχνικές απαιτήσεις Η ορθότητα και η αξιοπιστία των δοκιμών ή των διακριβώσεων που εκτελούνται από ένα εργαστήριο καθορίζεται από τους παρακάτω παράγοντες: 1. Τους ανθρώπινους παράγοντες, 2. τους χώρους εγκατάστασης και τις περιβαλλοντικές συνθήκες, 3. τις μεθόδους δοκιμών και διακριβώσεων και τις μεθόδους επικύρωσης, 4. τον εξοπλισμό, 5. την ιχνηλασιμότητα των μετρήσεων, 6. την δειγματοληψία, 7. τον χειρισμό των αντικειμένων δοκιμής και διακρίβωσης. Όλοι οι παραπάνω παράγοντες επηρεάζουν σε διαφορετικό βαθμό την κάθε δοκιμή και διακρίβωση και πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την ανάπτυξη των μεθόδων δοκιμών και διακριβώσεων, κατά τη διακρίβωση και επιλογή του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται και κατά την εκπαίδευση και αξιολόγηση της καταλληλότητας του προσωπικού. Χώροι εγκατάστασης και περιβαλλοντικές συνθήκες 1. Οι εγκαταστάσεις του εργαστηρίου πρέπει να διευκολύνουν την σωστή εκτέλεση των δοκιμών ή των διακριβώσεων. 25

26 2. Πρέπει να ελέγχονται και να καταγράφονται όλες οι περιβαλλοντικές συνθήκες που μπορούν να επηρεάσουν την ποιότητα των αποτελεσμάτων. 3. Πρέπει να υπάρχει αποτελεσματικός διαχωρισμός μεταξύ κοντινών περιοχών στις οποίες εκτελούνται μη συμβατές δραστηριότητες και να υπάρχουν μέτρα πρόληψης της επιμόλυνσης. 4. Πρέπει να ελέγχεται η πρόσβαση και η χρήση περιοχών που μπορούν να επηρεάσουν την ποιότητα των δοκιμών. Μέθοδοι δοκιμών και διακριβώσεων και επικύρωση μεθόδων Γενικά Το εργαστήριο πρέπει να χρησιμοποιεί τις κατάλληλες μεθόδους που αφορούν το αντικείμενό του. Αυτές περιλαμβάνουν χειρισμό, μεταφορά, δειγματοληψία, αποθήκευση και προετοιμασία των αντικειμένων που πρόκειται να υποβληθούν σε δοκιμή ή διακρίβωση. Αποκλίσεις από τις μεθόδους δοκιμών επιτρέπονται μόνο εάν η απόκλιση έχει τεκμηριωθεί, έχει αιτιολογηθεί, έχει εγκριθεί και έχει γίνει αποδεκτή από τον πελάτη. Ακόμα πρέπει να διαθέτει οδηγίες που αφορούν τη λειτουργία και τη χρήση του εξοπλισμού. Όλες οι οδηγίες, τα πρότυπα, τα εγχειρίδια, που σχετίζονται με τις εργασίες του εργαστηρίου, πρέπει να είναι διαθέσιμα στο προσωπικό και να τηρούνται ενήμερα. Επιλογή Μεθόδων Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται πρέπει να είναι δημοσιευμένες σε διεθνή, περιφερειακά ή εθνικά πρότυπα στην τελευταία τους έκδοση. Όταν ο πελάτης δεν καθορίζει τη μέθοδο που θα χρησιμοποιηθεί, το εργαστήριο πρέπει να επιλέξει την κατάλληλη μέθοδο που είναι δημοσιευμένη σε διεθνή ή εθνικά πρότυπα. Μπορεί ακόμα να χρησιμοποιήσει μεθόδους οι οποίες έχουν αναπτυχθεί στο εργαστήριο, με την προϋπόθεση ότι αυτές είναι κατάλληλες για την προβλεπόμενη χρήση και είναι επικυρωμένες. Ο πελάτης πρέπει πάντα να ενημερώνεται για την μέθοδο. Το εργαστήριο πρέπει να διασφαλίζει ότι μπορεί να εκτελεί ορθώς τις πρότυπες μεθόδους. Όταν η πρότυπη μέθοδος αλλάζει η επιβεβαίωση πρέπει να 26

27 επαναλαμβάνεται. Το εργαστήριο οφείλει να ενημερώσει τον πελάτη, όταν η μέθοδος που προτείνεται από αυτόν θεωρείται παρωχημένη ή μη ενδεδειγμένη. Μέθοδοι που αναπτύσσονται στο εργαστήριο Η εισαγωγή μεθόδων που αναπτύσσονται από το εργαστήριο για δική του χρήση, πρέπει να είναι μια προσχεδιασμένη δραστηριότητα που επιτελείται από κατάλληλο και επαρκώς εφοδιασμένο προσωπικό. Μη πρότυπες μέθοδοι Όταν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν μέθοδοι που δεν καλύπτονται από πρότυπες μεθόδους, αυτές πρέπει να υπόκεινται σε συμφωνία με τον πελάτη και πρέπει να περιλαμβάνουν μια σαφή προδιαγραφή των απαιτήσεων του πελάτη και το σκοπό της δοκιμής ή της διακρίβωσης. Η μέθοδος που επιλέγεται πρέπει να έχει κατάλληλα επικυρωθεί πριν από τη χρήση. Επικύρωση μεθόδων δοκιμών Επικύρωση είναι η αξιολόγηση των χαρακτηριστικών ποιότητας της μεθόδου μέσω πειραματικής τεκμηρίωσης και η εξέταση της ανταπόκρισης της στις προδιαγραφές για να αποδειχθεί ότι είναι κατάλληλη για τον σκοπό για τον οποίο προορίζεται. Το εργαστήριο πρέπει να επικυρώνει τόσο κάθε μη πρότυπη μέθοδο που χρησιμοποιεί, όσο και κάθε πρότυπη μέθοδο η οποία είναι εκτός του πεδίου εφαρμογής της και κάθε τροποποιημένη πρότυπη μέθοδο, ώστε να επιβεβαιώνει ότι οι μέθοδοι είναι κατάλληλες για την σκοπούμενη χρήση. Η επικύρωση είναι τόσο εκτεταμένη όσο είναι απαραίτητο για να ικανοποιήσει τις απαιτήσεις της δεδομένης χρήσης. Το εργαστήριο τηρεί κατάλληλα αρχεία με τα αποτελέσματα από την επικύρωση των μεθόδων. Το εύρος και η ακρίβεια των τιμών που μπορεί να λαμβάνονται από επικυρωμένες μεθόδους, όπως το όριο ανίχνευσης, η αβεβαιότητα, η ευαισθησία, η ειδικότητα, η αναπαραγωγιμότητα και η επαναληψιμότητα πρέπει να είναι συναφείς με τις ανάγκες των πελατών. Επικύρωση γίνεται σε: Μη πρότυπες μεθόδους, μεθόδους που σχεδιάζονται από το εργαστήριο, 27

28 πρότυπες μεθόδους εκτός αντικειμένου, ενισχυμένες και τροποποιημένες πρότυπες μεθόδους. Εκτίμηση της αβεβαιότητας των μετρήσεων Κάθε εργαστήριο που εκτελεί διακριβώσεις πρέπει να διαθέτει διαδικασία για την εκτίμηση της αβεβαιότητας των μετρήσεων για όλες τις διακριβώσεις. Σε περίπτωση που η φύση της μεθόδου της δοκιμής δεν επιτρέπει τον ακριβή υπολογισμό αβεβαιότητας των μετρήσεων, το εργαστήριο πρέπει να εντοπίσει όλες τις συνιστώσες της αβεβαιότητας. Πρέπει να χρησιμοποιούνται όλες οι κατάλληλοι μέθοδοι ανάλυσης και να λαμβάνονται υπόψη όλες οι συνιστώσες τις αβεβαιότητας που θεωρούνται σημαντικές στην δεδομένη περίσταση. Έλεγχος δεδομένων Οι υπολογισμοί και οι μεταφορά δεδομένων πρέπει να ελέγχονται συστηματικά. Σε περίπτωση που χρησιμοποιούνται υπολογιστές ή αυτοματοποιημένος εξοπλισμός για την διαχείριση και έλεγχο των δεδομένων, πρέπει να διασφαλίζεται ότι: Το λογισμικό του υπολογιστή είναι τεκμηριωμένο και κατάλληλα επικυρωμένο, εφαρμόζονται διαδικασίες για την προστασία των δεδομένων, οι ηλεκτρονικοί υπολογιστές και ο αυτοματοποιημένος εξοπλισμός συντηρούνται κατάλληλα για την διασφάλιση της σωστής λειτουργίας τους. Εξοπλισμός Το εργαστήριο πρέπει να είναι εφοδιασμένο με όλα τα είδη εξοπλισμού που απαιτούνται για την ορθή εκτέλεση των δοκιμών ή διακριβώσεων που εκτελεί. Ο εξοπλισμός πρέπει να εξασφαλίζει την ακρίβεια που απαιτείται και να συμμορφώνεται με τις απαιτήσεις και προδιαγραφές των δοκιμών ή διακριβώσεων. Πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο από εξουσιοδοτημένο προσωπικό και να τηρείται αρχείο για κάθε στοιχείο του εξοπλισμού το οποίο πρέπει να περιλαμβάνει: Την ταυτότητα του εξοπλισμού, τον κατασκευαστή, τον τύπο, τον αριθμό σειράς, 28

29 τη συμμόρφωση του εξοπλισμού με τη συγκεκριμένη προδιαγραφή, την τρέχουσα θέση του, τις οδηγίες του κατασκευαστή, τις ημερομηνίες, τα αποτελέσματα και αντίγραφα εκθέσεων και πιστοποιητικών των διακριβώσεων, ρυθμίσεων και την ημερομηνία της επόμενης διακρίβωσης, το πρόγραμμα συντήρησης και ελέγχων, αναφορά για κάθε ζημιά, δυσλειτουργία, επισκευή ή τροποποίηση. Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες για τον ασφαλή χειρισμό του εξοπλισμού κατά τη μεταφορά, την αποθήκευση, τη χρήση και την συντήρηση. Ο εξοπλισμός που παρουσιάζεται ελαττωματικός πρέπει να αποσύρεται άμεσα και να απομονώνεται για να αποφευχθεί η χρήση του ή να φέρει σήμανση ότι είναι εκτός λειτουργίας. Πρέπει να δηλώνεται η κατάσταση διακρίβωσης και να διασφαλίζεται ότι πριν επιστρέψει σε λειτουργία ένας εξοπλισμός που είχε τεθεί εκτός λειτουργίας, έχει ελεγχθεί και αποδειχθεί η ικανοποιητική κατάσταση της λειτουργίας του. Ενδιάμεσοι έλεγχοι είναι απαραίτητοι ώστε να διατηρηθεί η εμπιστοσύνη στη κατάσταση διακρίβωσης του εξοπλισμού. Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες που να εξασφαλίζουν τη σωστή ενημέρωση των αντιγράφων των συντελεστών διόρθωσης. Ιχνηλασιμότητα Διακρίβωση Όλος ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται για δοκιμές ή διακριβώσεις πρέπει να ελέγχεται πριν χρησιμοποιηθεί για πρώτη φορά. Σε περίπτωση εκτέλεσης κάποιων εσωτερικών διακριβώσεων, οι απαιτήσεις διενέργειας τους ισχύουν εις το ακέραιο. Το πρόγραμμα εσωτερικών ή εξωτερικών διακριβώσεων πρέπει να σχεδιάζεται έτσι ώστε να εξασφαλίζει την ιχνηλασιμότητα των μετρήσεων στο Διεθνές Σύστημα Μονάδων (SI). Όταν η ιχνηλασιμότητα προς το SI δεν είναι δυνατή απαιτούνται οι ίδιες απαιτήσεις για ιχνηλασιμότητα σε πιστοποιημένα υλικά αναφοράς και 29

30 συμφωνημένες μεθόδους. Για εργαστήρια δοκιμών οι παραπάνω απαιτήσεις εφαρμόζονται για τον εξοπλισμό μετρήσεων και δοκιμών, με τον οποίο εκτελούνται λειτουργίες μέτρησης. Πρότυπα αναφοράς και υλικά αναφοράς Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασία για την διακρίβωση των δικών του προτύπων αναφοράς. Τα υλικά αναφοράς πρέπει να είναι ιχνηλάσιμα ως προς της μονάδες μέτρησης SI ή προς πιστοποιημένα υλικά αναφοράς. Πρέπει να διεξάγονται ενδιάμεσοι έλεγχοι ώστε να εξασφαλιστεί η εμπιστοσύνη στην κατάσταση της διακρίβωσης των υλικών αναφοράς και των προτύπων αναφοράς. Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες για τον ασφαλή χειρισμό, μεταφορά και αποθήκευση των προτύπων αναφοράς και υλικών αναφοράς, προκειμένου να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα τους Δειγματοληψία Το εργαστήριο πρέπει να έχει διαδικασίες δειγματοληψίας, οι οποίες πρέπει να είναι διαθέσιμες στην θέση που διενεργείται η δειγματοληψία. Οι διαδικασίες αυτές πρέπει να βασίζονται σε κατάλληλες στατιστικές μεθόδους. Στην διαδικασία της δειγματοληψίας πρέπει να ελέγχονται όλοι οι παράγοντες ώστε να διασφαλίζεται η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων των δοκιμών ή των διακριβώσεων. Όταν ο πελάτης απαιτεί παρεκκλίσεις από την τεκμηριωμένη διαδικασία δειγματοληψίας, αυτές πρέπει να καταγράφονται λεπτομερώς και να γνωστοποιούνται στο προσωπικό. Χειρισμός αντικειμένων δοκιμής και διακρίβωσης Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες για την διασφάλιση της ακεραιότητας των αντικειμένων για τις δοκιμές ή τις διακριβώσεις. Οι διαδικασίες αυτές πρέπει να περιλαμβάνουν τις απαραίτητες οδηγίες για την μεταφορά, τον χειρισμό, την αποθήκευση και την προστασία των αντικειμένων. Πρέπει ακόμα να υπάρχει κατάλληλο σύστημα για την απόδοση ταυτότητας και αναγνώρισης του αντικειμένου δοκιμής ή διακρίβωσης. Τα αντικείμενα πρέπει να ελέγχονται κατά την παραλαβή και να καταγράφεται σε αρχείο κάθε απόκλιση από τις 30

31 προδιαγεγραμμένες απαιτήσεις. Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει κατάλληλες εγκαταστάσεις για την αποφυγή υποβάθμισης, απώλειας ή ζημίας στο αντικείμενο δοκιμής ή διακρίβωσης. Πρέπει να ακολουθούνται οι οδηγίες χειρισμού που συνοδεύουν το εκάστοτε αντικείμενο. Διασφάλιση της ποιότητας των αποτελεσμάτων Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες για τον έλεγχο ποιότητας με σκοπό να εξασφαλίζεται η εγκυρότητα των δοκιμών ή διακριβώσεων που αναλαμβάνει και των αποτελεσμάτων που εκδίδει. Πρέπει να είναι σε θέση να εντοπίζει πιθανές αποκλίσεις από προδιαγεγραμμένα όρια και κριτήρια, ώστε να μπορεί να λάβει τα ενδεδειγμένα διορθωτικά μέτρα. Το πρόγραμμα ελέγχου περιλαμβάνει: 1. Χρήση πιστοποιημένων ή μη υλικών αναφοράς, 2. συμμετοχή σε προγράμματα διεργαστηριακών συγκρίσεων, 3. επανάληψη των ίδιων δοκιμών ή διακριβώσεων, 4. επανάληψη δοκιμής ή διακρίβωσης σε αντικείμενα που διατηρούνται, 5. συσχέτιση των αποτελεσμάτων για διαφορετικά χαρακτηριστικά του ίδιου αντικειμένου. Σύνταξη εκθέσεων αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα κάθε δοκιμής ή διακρίβωσης που εκτελούνται από το εργαστήριο πρέπει να εκτίθενται με ακρίβεια, σαφήνεια, αντικειμενικότητα, χωρίς αμφιβολίες και να είναι σύμφωνες με τις ειδικές οδηγίες των δοκιμών ή διακριβώσεων. Τα αποτελέσματα πρέπει να παρουσιάζονται σε μία έκθεση δοκιμής ή σε ένα πιστοποιητικό διακρίβωσης και να περιλαμβάνουν όλες τις πληροφορίες που έχουν ζητηθεί από τον πελάτη, καθώς και όλες τις πληροφορίες που είναι απαραίτητες για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Η έκθεση δοκιμής να έχει τυποποιημένη μορφή και πρέπει να περιλαμβάνει τα παρακάτω: 1. Τον τίτλο, 2. την επωνυμία και διεύθυνση του εργαστηρίου, 3. το όνομα και τη διεύθυνση του πελάτη, 4. μονοσήμαντη αναγνώριση της έκθεσης, 31

32 5. την ταυτότητα της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε, 6. τον σαφή προσδιορισμό του αντικειμένου δοκιμής, 7. την ημερομηνία παραλαβής του αντικειμένου και ημερομηνία εκτέλεσης της δοκιμής, 8. τις διαδικασίες δειγματοληψίας, 9. το αποτέλεσμα των δοκιμών, 10. το όνομα, την ιδιότητα και την υπογραφή του εξουσιοδοτημένου ατόμου για την χορήγηση της έκθεσης δοκιμής, 11. Δήλωση ότι τα αποτελέσματα αφορούν μόνο τα αντικείμενα που δοκιμάστηκαν. Το πιστοποιητικό διακρίβωσης πρέπει να σχετίζεται μόνο με μεγέθη και με αποτελέσματα δοκιμών λειτουργίας. Όταν ρυθμίζεται ή επισκευάζεται ένα όργανο για διακρίβωση πρέπει να αναφέρονται τα αποτελέσματα πριν και μετά. Για την ερμηνεία αποτελεσμάτων διακριβώσεων τα πιστοποιητικά των διακριβώσεων πέραν των ανωτέρω απαιτήσεων πρέπει να περιλαμβάνουν τα παρακάτω: 1. Τις συνθήκες στις οποίες έγινε η διακρίβωση, 2. την αβεβαιότητα της μέτρησης, 3. τεκμηριωμένη ιχνηλασιμότητα μετρήσεων [4,5]. 1.4 Μέθοδοι ανίχνευσης βακτηριακών ενδοτοξινών Εισαγωγή Οι ενδοτοξίνες είναι μεγαλομοριακές ενώσεις οι οποίες βρίσκονται στην εξωτερική μεμβράνη των κατά Gram αρνητικών βακτηρίων. Οι ενδοτοξίνες που βρίσκονται στο περιβάλλον αποτελούνται από λιπίδια, υδρογονάνθρακες και πρωτεΐνες. Οι ενδοτοξίνες όμως που έχουν απομονωθεί σε καθαρή μορφή και χρησιμοποιούνται σαν πρότυπα δεν περιέχουν πρωτεΐνη και αναφέρονται συνήθως ως λιποπολυσακχαρίτες. Αποκαλούνται και πυρετογόνα διότι η εμφάνιση πυρετού είναι το πιο σημαντικό σύμπτωμα της τοξικότητας τους στα θηλαστικά. Όλες οι ενδοτοξίνες είναι πυρετογόνα διότι προκαλούν την απελευθέρωση ιντερλευκίνης με αποτέλεσμα την εμφάνιση πυρετού. Όλα τα πυρετογόνα δεν είναι όμως 32

33 ενδοτοξίνες. Το βακτηριακό λιποπολυσακχαρίδιο αποτελείται από τρία τμήματα. Τον κεντρικό πολυσακχαρίτη που έχει την ίδια δομή και σύνθεση σε ομάδες βακτηρίων που ανήκουν σε διαφορετικά γένη, τις πλευρικές αλυσίδες από επαναλαμβανόμενες μονάδες ολιγοσακχαριτών σε διαφορετική κάθε φορά διάταξη και το λιπίδιο Α που περιλαμβάνει ένα σκελετό από γλυκοζαμίνη, φωσφορικό οξύ και μακριές αλυσίδες λιπαρών οξέων, Η δομή των ενδοτοξινών συνοπτικά είναι η ακόλουθη: [Αλυσίδα Ο]-[Πυρήνας]-[Λιπίδιο Α] Η Αλυσίδα-Ο παρουσιάζει μεγάλη ποικιλομορφία διότι είναι ειδική για κάθε είδος βακτηρίου. Το Λιπίδιο Α είναι σταθερό μεταξύ των ειδών και περιλαμβάνει όλες τις φαρμακολογικές δραστηριότητες που σχετίζονται με τις ενδοτοξίνες. Το σακχαρικό μέρος του μορίου παίζει σπουδαίο ρόλο στη διαμόρφωση μερικών βιολογικών δραστηριοτήτων των βακτηριακών ενδοτοξινών. Η δοκιμασία πυρετογόνων είναι μια δοκιμασία σχεδιασμένη για να περιορίσει σε ένα αποδεκτό επίπεδο τους κινδύνους πυρετικής αντίδρασης σε ασθενή, στη χορήγηση ενός φαρμακευτικού προϊόντος. Πυρετική αντίδραση αυτού του τύπου μπορεί να προέλθει από ένα ευρύ φάσμα εξωγενών πυρετογόνων όπως βακτήρια, μύκητες, ιοί, πολυνουκλεοτίδια, σύμπλοκα αντιγόνων-αντισωμάτων, αλλά και από ενδογενή πυρετογόνα. Σύμφωνα με τα όσα μέχρι σήμερα είναι γνωστά, οι πιο δραστικές πυρετογόνες ουσίες είναι οι βακτηριακές ενδοτοξίνες. Είναι θερμοανθεκτικές και απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες για την αδρανοποίηση τους. Είναι ικανές να προκαλέσουν μία μεγάλη ποικιλία βιολογικών αντιδράσεων όπως πυρετό, υπόταση και θάνατο. Είναι χαρακτηριστικό ότι η ενδοτοξιναιμία μεταβάλλει τα επίπεδα του συμπληρώματος και ελαττώνει την αγγειακή αντίσταση και τα επίπεδα καλλικρεϊνογόνου. Τα ιογενούς αιτιολογίας πυρετογόνα εκτός από ελάχιστες εξαιρέσεις προέρχονται αποκλειστικά από την ομάδα των Μυξοϊών. Χαρακτηριστικό αυτών των πυρετογόνων είναι ότι δεν μπορούν να διαχωριστούν από τους ίδιους τους ιούς, ότι με την επίδραση της θερμοκρασίας αδρανοποιούνται πιο εύκολα από τα 33

34 βακτηριακά πυρετογόνα, ότι εξουδετερώνονται από αντισώματα και ότι ο πυρετός θα εμφανισθεί με καθυστέρηση 1-2 ωρών. Τα ενδογενή πυρετογόνα προέρχονται από κύτταρα του ίδιου του σώματος που καταστρέφονται και διαφέρουν από τα βακτηριακά πυρετογόνα στην μη ανάπτυξη ανθεκτικότητας από τον οργανισμό πειραματόζωων. Η ανθεκτικότητα έναντι των πυρετογόνων εξετάστηκε για πρώτη φορά από τον Beeson που παρατήρησε ότι μετά από καθημερινή, για αρκετό χρόνο, χορήγηση πυρετογόνων, έπαψε η εκδήλωση πυρετού. Ο πυρετός επανήλθε όταν η χορήγηση επαναλήφθηκε μετά από παύση μιας εβδομάδας. Στα περισσότερα ιογενή πυρετογόνα αρκεί μια μόνο δόση για να αναπτυχθεί καθολική ανθεκτικότητα που διαρκεί 12 μέρες Μέθοδοι προσδιορισμού βακτηριακών ενδοτοξινών Μέχρι τώρα έχουν αναπτυχθεί πολλές in-vivo δοκιμασίες για την ανίχνευση των ενδοτοξινών, που συχνά στηρίζονται στις αναγνωρισμένες παθοφυσιολογικές εκδηλώσεις που οφείλονται στις ενδοτοξίνες. Πολλές από τις εκδηλώσεις αυτές των ενδοτοξινών ακολουθούν μια διφασική καμπύλη. Ενώ δηλαδή αρχικά παρατηρείται π.χ. ελάττωση του συμπληρώματος του ορού, μετά την πάροδο μιας εβδομάδας τα επίπεδα του συμπληρώματος βρίσκονται σε μεγαλύτερα επίπεδα από το φυσιολογικό. Άλλες πάλι εξαρτώνται από τη δόση που θα λάβει ο μεγαλοοργανισμός. Ο έλεγχος για βακτηριακές ενδοτοξίνες χρησιμοποιεί ένα προϊόν λύσεως αμοιβαδοκυττάρων που προέρχονται από τον πεταλοειδή καρκίνο, Limulus polyphemus. Αν σε διάλυμα του προϊόντος λύσεως προστεθεί διάλυμα που περιέχει ενδοτοξίνες, προκαλείται θολερότητα, καθίζηση ή πηκτωματοποίηση του μίγματος. Η ταχύτητα της αντίδρασης εξαρτάται από τη συγκέντρωση της ενδοτοξίνης, το ph και τη θερμοκρασία. Η αντίδραση απαιτεί την παρουσία ορισμένων δισθενών κατιόντων. Επίσης απαιτούνται και παρέχονται από το προϊόν λύσεως ενζυματικό σύστημα που προωθεί την πήξη και πρωτεΐνη που υφίσταται πήξη. Η συγκέντρωση ενδοτοξινών μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της συγκέντρωσης απελευθερούμενου χρώματος από τη λύση χρωμογόνου πεπτιδίου σε διάλυμα του προϊόντος λύσεως, η 34

35 οποία προκαλείται από τις ενδοτοξίνες. Έτσι λοιπόν έχουμε τις παρακάτω μεθόδους: 1. Μέθοδος πηκτωματοποίησης 2. Ημιποσοτική μέθοδος πηκτωματοποίησης 3. Θολωσιμετρική κινητική μέθοδος 4. Κινητική μέθοδος χρωμογόνου πεπτιδίου 5. Μέθοδος τελικού σημείου χρωμογόνου πεπτιδίου Πριν την εκτέλεση του ελέγχου για ενδοτοξίνες στο εξεταζόμενο παρασκεύασμα, είναι απαραίτητο να διαπιστωθεί: 1. Ότι τα όργανα που χρησιμοποιούνται δεν προσροφούν ενδοτοξίνες, 2. η τιμή (λ) του χρησιμοποιούμενου προϊόντος λύσεως. Ως τιμή (λ) ορίζεται η δηλούμενη ευαισθησία του προϊόντος ή η κατώτατη συγκέντρωση ενδοτοξινών που χρησιμοποιείται για τον σχεδιασμό της πρότυπης καμπύλης, 3. η απουσία παρεμβαινόντων παραγόντων. Στον έλεγχο χρησιμοποιούνται τα ακόλουθα αντιδραστήρια και παρασκευάσματα αναφοράς: 1. Πρότυπο ενδοτοξίνης, 2. προϊόν λύσεως των αμοιβαδοκυττάρων του Limulus, 3. νερό κατάλληλο για τον έλεγχο LAL, 4. 0,1 Μ υδροχλωρικό οξύ και 0,1 Μ υδροξείδιο του νατρίου για την ρύθμιση του ph. Μέθοδοι πηκτωματοποίησης Οι δυο μέθοδοι πηκτωματοποίησης βασίζονται στο σχηματισμό στερεού πηκτώματος σε διάλυμα που περιέχει βακτηριακές ενδοτοξίνες και επωάζεται μετά την ανάμιξη με το προϊόν λύσεως. Και οι δυο μέθοδοι απαιτούν αφενός να επιβεβαιωθεί η ευαισθησία του προϊόντος λύσεως και αφετέρου να εξετασθεί η παρουσία παρεμβαινόντων παραγόντων. 35