Validation procedures for in house immuno-assay methods

Transcript

1 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΑΣ Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Τεχνολογίας Ιατρικών Εργαστηρίων Τμήμα Ποιοτικού Ελέγχου ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Μέθοδοι επικύρωσης in house ανοσοδιαγνωστικών τεχνικών THESIS Validation procedures for in house immuno-assay methods ΟΝΟΜΑΤΑ ΦΟΙΤΗΤΩΝ/NAMES OF STUDENTS Βασιλική Κώτσιρα/ Vasiliki Kotsira ΟΝΟΜΑΤΑ ΕΙΣΗΓΗΤΗ κ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΑ/NAMES OF SUPERVISORS Πέτρος Καρκαλούσος, Δημήτρης Σοφιανός Petros Karkalousos, Dimitris Sofianos ΑΘΗΝΑ/ATHENS 2017 i

2 II

3 Μέθοδοι επικύρωσης in house ανοσοδιαγνωστικών τεχνικών Validation procedures for in house immuno-assay methods Η παρούσα εργασία υποβάλλεται στα πλαίσια της ολοκλήρωσης των σπουδών για την απόκτηση πτυχίου που απονέμει το τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων του Τεχνολογικού Εκπαιδευτικού Ιδρύματος (ΤΕΙ) Αθήνας. This thesis submitted in partial fulfillment of the requirements of the Honours Project of the B.Sc. in Medical Laboratories of Technological Educational Institution (TEI) of Athens. Επόπτες/Supervisors: Πέτρος Καρκαλούσος/ Petros Karkalousos, Δημήτρης Σοφιανός/Dimitris Sofianos Όνομαφοιτήτριας/Student s name: Βασιλική Κώτσιρα / Vasiliki Kotsira Στοιχεία επικοινωνίας/contactinformation: vasilikikotsira@hotmail.com III

4 IV

5 Δήλωση μη λογοκλοπής και ανάληψης προσωπικής ευθύνης Με πλήρη επίγνωση των συνεπειών του νόμου περί πνευματικών δικαιωμάτων, δηλώνω ενυπογράφως ότι είμαι αποκλειστική συγγραφέας της παρούσας Πτυχιακής Εργασίας, για την ολoκλήρωση της οποίας κάθε βοήθεια είναι αναγνωρισμένη και αναφέρεται λεπτομερώς στην εργασία αυτή. Έχω αναφέρει πλήρως και με σαφείς αναφορές, όλες τις πηγές χρήσης δεδομένων, θέσεων και προτάσεων, ιδεών και λεκτικών αναφορών. Αναλαμβάνω την προσωπική και ατομική ευθύνη ότι σε περίπτωση αποτυχίας στην υλοποίηση των ανωτέρω δηλοθέντων στοιχείων, είμαι υπόλογη ενάντι λογοκλοπής. Δηλώνω, συνεπώς, ότι αυτή η Πτυχιακή Εργασία προετοιμάστηκε και ολοκληρώθηκε από εμένα προσωπικά και αποκλειστικά και ότι, αναλαμβάνω πλήρως όλες τις συνέπειες του νόμου στην περίπτωση κατά την οποία αποδειχθεί, διαχρονικά, ότι η εργασία αυτή ή τμήμα της δεν μου ανήκει διότι είναι προϊον λογοκλοπής άλλης πνευματικής ιδιοκτησίας. V

6 VI

7 Ευχαριστίες Πρώτα από όλα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον εισηγητή μου και προϊστάμενο του τμήματος Ποιοτικού Ελέγχου του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ κ. Δημήτρη Σοφιανό για την σημαντική του καθοδήγηση τόσο στην πραγματοποίηση της πτυχιακής μου εργασίας όσο και στα πλαίσια της πρακτικής μου άσκησης. Επίσης, οφείλω πολλές ευχαριστίες στον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Πέτρο Καρκαλούσο για την πολύτιμη βοήθεια που μου παρείχε οποιαδήποτε στιγμή κατά την εκπόνηση της πτυχιακής μου εργασίας. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ. Γεώργο Κίκη υπεύθυνο του Τμήματος Ποιοτικού Ελέγχου, για την υπομονή και θέληση του να μου διδάξει όλες τις εργαστηριακές τεχνικές με τον καλύτερο τρόπο. Δεν θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω και τον κ. Γεώργο Σκαρβέλη, Διπλ. Χημικό Μηχανικό ΑΠΘ και επαγγελματία σύμβουλο εργαστηρίων με διαπιστεύσεις και πιστοποιήσεις ISO για τις πολύτιμες συμβουλές του. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου για την στήριξη τους όλα αυτά τα χρόνια. VII

8 VIII

9 Περίληψη Εισαγωγή: Ο όρος «επικύρωση μεθόδων» αναφέρεται σε ένα σύνολο απαραίτητων διαδικασιών που αποδεικνύουν ότι μία μέθοδος δοκιμής είναι κατάλληλη για τη σκοπούμενη χρήση (fit for purpose). Η αναγκαιότητα για την επικύρωση των μεθόδων προέρχεται από την απαίτηση συμμόρφωσης προς την νομοθεσία και την ανάγκη ορθού και αξιόπιστου προσδιορισμού των αποτελεσμάτων των αναλύσεων (πχ για ασθενείς). Ειδικά η επικύρωση των εσωτερικά αναπτυγμένων ποσοτικών και ημιποσοτικών μεθόδων (in house), κρίνεται απόλυτα αναγκαία και περιλαμβάνει, μεταξύ άλλων ενεργειών, τουλάχιστον τον προσδιορισμό Ορίου Ανίχνευσης, Ορίου Ποσοτικοποίησης, Ελέγχου Πιστότητας, Εκτίμησης Αβεβαιότητας, Ορθότητας και Γραμμικότητας. Σκοπός: H διαδικασία επικύρωσης μεθόδου προσδιορισμού αντισωμάτων τετάνου με in-house μέθοδο ΕLISA. Υλικά: Aντιτετανικός ορός και πιστοποιημένο εμπορικό (IVD) kit για τον τέτανο. Mέθοδος: Ο αντιτετανικός ορός αραιώθηκε κατά 1/ για τον υπολογισμό του ορίου ανίχνευσης και σε τρία επίπεδα 1/3200, 1/25600 και 1/ για τον υπολογισμό της πιστότητας εντός λειτουργικού εύρους της μεθόδου. Η εκτίμηση του επιπέδου γραμμικότητας μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης, έγινε με την εξίσωση της ευθείας παλινδρόμησηςκαι τον υπολογισμό του συντελεστή συσχέτισης r σε σύγκριση και με την αντίστοιχη ευθεία παλινδρόμησης (καμπύλη αναφοράς) της επικυρωμένης εμπορικής μεθόδου. Η ορθότητα αξιολογήθηκε και στα τέσσερα επίπεδα αραιώσεων μέσω ελέγχου ισοδυναμίας των αποτελεσμάτων της εσωτερικής μεθόδου με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από την ήδη επικυρωμένη, από τον κατασκευαστή, ποσοτική μέθοδο του εμπορίου και αφού σχεδιάστηκε η σχετική καμπύλη αναφοράς. IX

10 Αποτελέσματα: Όριο ανίχνευσης Συγκέντρωση 0,01 IU/ml Επίπεδο Αραίωσης 1/ Πιστότητα (RSD%) Ορθότητα Γραμμικότητα Στην αραίωση 1/3200: 3,65% Στην αραίωση 1/25600: 13,75% Στην αραίωση 1/102400: 14,52% Αληθής Z score 2 Zscore = 1,99 στην αραίωση 1/3200 Zscore = 1,97στην αραίωση 1/25600 Zscore = 1,97 στην αραίωση 1/ Zscore = 1,99 στην αραίωση 1/ r 2 =0,895 με 7% διαφορά από τη γραμμικότητα του εμπορικού επικυρωμένου κίτ Σχετική διευρυμένη αβεβαιότητα 30,6 % Συζήτηση: Η μέθοδος, ύστερα από την ανάλυση όλων των παραμέτρων της διαδικασίας επικύρωσης, κρίθηκε μεν, ως μη πλήρως ισοδύναμη με την εμπορική ποσοτική μέθοδο, όμως ορθή για τη σκοπούμενη χρήση. X

11 Abstract Introduction: The term method validation refers to the required set of procedures which prove that an analytical method is fit for the intended purpose. The need for method validation derives from the mandate to conform to applicable legislation and the necessity to produce credible test results as per customer and/or user requirements. The validation of in house quantitative methods includes among other parameters, at least the evaluation of the Detection Limit, the Quantification Limit, Precision, Uncertainty, Accuracy/Trueness and Linearity. Purpose: To execute all necessary steps for the validation of an in house ELISA method for the detection of antibodies against tetanus. Materials: Antitetanic serum and certified (IVD) Kit for the determination of tetanus. Method: An antitetanic serum was diluted times for the determination of the detection limit and at three differentlevels 3200, and for evaluating precision within the method working range. Evaluation of linearity between absorbance and concentration was determined through linear regression and the estimated correlation coefficient r in comparison to the reference curve calculated via the commercial validated method. Accuracy was determined in all dilution levels by plotting a reference curve of the kit. Results: Detection Limit Concentration 0,01 IU/ml Dilution Factor 1/ Precision (RSD%) In dilution 1/3200: 3,65% In dilution 1/25600: 13,75% In dilution 1/102400: 14,52% Accuracy / Trueness True Z score 2 Relative Expanded Linearity Uncertainty (95%) r 2 =0,895 30,6 % Discussion: The method, after the determination all validation parameters, and despite the fact that it was not determined as fully equivalent to the commercial IVD kit method, is considered fit for purpose and the intended use. XI

12 Πίνακας Περιεχομένων Ευχαριστίες... vii Abstract... xi ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ISO/IEC 17025: Αντικείμενο Απαιτήσεις για την διοίκηση Σύστημα ποιότητας Τεχνικές απαιτήσεις Χώροι εγκατάστασης και περιβαλλοντικές συνθήκες Μέθοδοι δοκιμών, διακριβώσεων και επικύρωση μεθόδων Ιχνηλασιμότητα μετρήσεων Ταξινόμηση καθαρών χώρων Παρακολούθηση καθαρών χώρων και συσκευών καθαρού αέρα Οδηγίες ενδυμασίας προσωπικού ανάλογα την βαθμίδα του στείρου χώρου Αρχές και κατευθυντήριες γραμμές για κανόνες καλής παραγωγής φαρμάκων (GMP) Αρχή Κανόνες Καλής Παραγωγής για Φαρμακευτικά Προϊόντα Έλεγχος Ποιότητας Ανασκόπηση Ποιότητας του Προϊόντος Διαχείριση Κινδύνου Ποιότητας Μέθοδοι ανίχνευσης αντισωμάτων Εισαγωγή Μέθοδοι προσδιορισμού λοιμογόνων παραγόντων Ανοσοενζυμική ανίχνευση αντισωμάτων Γενικά Διαγνωστικές τεχνικές Εφαρμογή μεθόδου ELISA στη διάγνωση τετάνου (Clostridium tetani), διφθερίτιδας (Corynebacterium diptheriae) και κοκκύτη (Bordetella pertussis) Αρχήμεθόδου ELISA Ανάπτυξη εσωτερικής μεθόδου Απαραίτητος εξοπλισμός Περιγραφή inhouse μεθόδου XII

13 2.1.3 Ερμηνεία αποτελεσμάτων Περιγραφή διαδικασίας ποσοτικής μεθόδου IVD kit Έλεγχος ποιότητας Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας Εσωτερικός έλεγχος ποιότητας Διαδικασία επαλήθευσης Εκτίμηση αβεβαιότητας Ορισμοί Υπολογισμός αβεβαιοτήτων Επικύρωση μεθόδων δοκιμών Εισαγωγή Εκτίμηση της Ορθότητας Εκτίμηση της πιστότητας (Precision) Μελέτη της γραμμικότητας (Linearity) Αξιολόγηση της εξειδίκευσης (Specificity) Αξιολόγηση της ανθεκτικότητας (Robustness) Καταγραφή των στοιχείων επικύρωσης Επανεπικύρωση Αποτελέσματα επικύρωσης Εισαγωγή Πρωτόκολλο Επικύρωσης Συζήτηση αποτελεσμάτων Αναλυτικοί Υπολογισμοί ΑΝΑΦΟΡΕΣ XIII

14 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1ISO/IEC 17025: Αντικείμενο Το πρότυπο ISO 17025:2005 καθορίζει τις γενικές (διαχειριστικές, λειτουργικές και τεχνικές) απαιτήσεις ικανότητας για τη διεξαγωγή δοκιμών ή/και διακριβώσεων από ένα εργαστήριο, συμπεριλαμβανομένης της δειγματοληψίας. Καλύπτει συγκεκριμένες δοκιμές και διακριβώσεις που εκτελούνται με τη χρήση πρότυπων μεθόδων κα μεθόδων που έχουν αναπτυχθεί από το ίδιο το εργαστήριο. Εφαρμόζεται σε όλους τους οργανισμούς που εκτελούν δοκιμές ή/και διακριβώσεις, όπως είναι εργαστήρια πρώτου, δεύτερου και τρίτου μέρους και εργαστήρια στα οποία οι δοκιμές ή/και οι διακριβώσεις αποτελούν μέρος του ελέγχου και της πιστοποίησης προϊόντος. Προορίζεται για χρήση από τα εργαστήρια, του πελάτες των εργαστηρίων, τους φορείς διαπίστευσης κ.λπ. Στο Πρότυπο αυτό περιέχονται υποχρεωτικής εφαρμογής απαιτήσεις για το εργαστήριο που επιλέγει να εφαρμόσει το πρότυπο για συγκεκριμένες μεθόδους δοκιμών (πεδίο εφαρμογής) και να τις διαπιστεύσει έναντι αυτού. Κατ επέκταση, η διαπίστευση του εργαστηρίου για τις αντίστοιχες μεθόδους δοκιμών που επιλέγει, από τον ανεξάρτητο Φορέα Διαπίστευσης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως επίσημη επιβεβαίωση ή αναγνώριση της επάρκειας τεχνικής ικανότητας και της εγκυρότητας του εργαστηρίου. Η συμμόρφωση με τις νομοθετικές απαιτήσεις διαχείρισης αποβλήτων, καθώς και υγείας και ασφάλειας στην εργασία εντός του εργαστηριακού εργασιακού περιβάλλοντος, δεν καλύπτεται από το Πρότυπο. Η συμμόρφωση με το Πρότυπο αυτό εξασφαλίζει πλήρως και υπερκαλύπτει τη συμμόρφωση του εργαστηρίου και με το Πρότυπο ISO 9001:2015, ενώ το αντίστροφο δεν ισχύει σε καμία περίπτωση. Δηλαδή η πιστοποίηση ενός εργαστηρίου κατά ISO 9001:2015 από ένα Φορέα Πιστοποίησης,δεν σηματοδοτεί και συμμόρφωση με το Πρότυπο ISO 17025:2005. Αυτό το γεγονός υποδηλώνει και τη διαφορά μεταξύ των λειτουργιών της Πιστοποίησης και της Διαπίστευσης. 1

15 1.1.2 Απαιτήσεις για την διοίκηση Το εργαστήριο ή ο οργανισμός που ανήκει, πρέπει να είναι μια οντότητα που να μπορεί να θεωρηθεί νομικά υπεύθυνη. Το εργαστήριο είναι υπεύθυνο για τη διεξαγωγή των δραστηριοτήτων του έτσι ώστε να καλύπτει τις απαιτήσεις του Προτύπου αυτού, των πελατών, των κανονιστικών αρχών και των οργανισμών που παρέχουν επίσημη αναγνώριση. Το σύστημα διαχείρισης πρέπει να καλύπτει τις εργασίες που εκτελούνται, μακριά από τις μόνιμες εγκαταστάσεις του, ή σε προσωρινές ή κινητές εγκαταστάσεις. Εάν το εργαστήριο εκτελεί και άλλες δραστηριότητες πέραν των δοκιμών και των διακριβώσεων, πρέπει να καθορίζονται οι ευθύνες του καθενός από το προσωπικό προκειμένου να αναγνωρίζεται η πιθανή σύγκρουση συμφερόντων. Το εργαστήριο πρέπει: 1. Να έχει διοικητικό και τεχνικό προσωπικό με την αρμοδιότητα και τους πόρους που χρειάζεται για τη διεξαγωγή των καθηκόντων τους, 2. να προνοεί ώστε το προσωπικό και η διοίκηση να είναι απαλλαγμένο από διάφορες επιρροές και πιέσεις που θα μπορούσαν να επηρεάζουν αρνητικά την ποιότητα και την αξιοπιστία των εργασιών, 3. να καθιερώνει πολιτική και διαδικασίες έτσι ώστε να εξασφαλίζεται η προστασία των εμπιστευτικών πληροφοριών του πελάτη, 4. να διαθέτει πολιτική και διαδικασίες έτσι ώστε να αποφευχθεί η συμμετοχή σε δραστηριότητες που θα κλονίσουν την αναγκαία ανεξαρτησία και την εμπιστοσύνη στο παρεχόμενο έργο, 5. να καθορίζει τη λειτουργική δομή και οργάνωσή του, 6. να καθορίζει με σαφήνεια τις διοικητικές εξουσίες, καθώς και τις αρμοδιοτήτες και ευθύνες των μελών του προσωπικού, έτσι ώστε να αποσαφηνίζεται και η αλληλεπίδραση των σχέσεων μεταξύ τους, 7. να καθιερώνει τρόπο επίβλεψης και αξιολόγησης επίδοσης όλου του προσωπικού, 2

16 8. να καθορίζει Τεχνικό Υπεύθυνο που φέρει ευθύνη για την τεχνική λειτουργία και την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων που εκδίδονται, 9. να καθορίζει Υπεύθυνο Διαχείρισης Ποιότητας πουμεριμνά για την ορθή και συμμορφούμενη με το πρότυπο, λειτουργία του εργαστηρίου, καθώς και την αποτελεσματική εφαρμογή του συστήματος διαχείρισης, 10. να ορίζει αναπληρωτές για όλες τις θέσεις εργασίας που καθιερώνονται στην οργανωτική δομή, 11. να μεριμνά για την επιμόρφωση, την εκπαίδευση και την επίγνωση του προσωπικού σε ότι αφορά το ρόλο κάθε μέλους εντός του συστήματος διαχείρισης, 12. να διερευνά την ικανοποίηση των πελατών του, 13. να αξιολογεί συστηματικά και να ελέγχει τους προμηθευτές των απαιτούμενων υλικών και εξοπλισμού, 14. να συντηρεί, διακριβώνει, βαθμονομεί και να ελέγχει βάσει προγραμματισμού τον εξοπλισμό και τα όργανα που χρησιμοποιεί, 15. να αναλαμβάνει τις κατάλληλες διορθωτικές δράσεις όταν εντοπίζονται αποκλίσεις από τις εφαρμόσιμες απαιτήσεις Σύστημα ποιότητας Το εργαστήριο πρέπει να εφαρμόζει ένα σύστημα για την ποιότητα ανάλογο με το αντικείμενο των δραστηριοτήτων του. Το εργαστήριο οφείλει να τεκμηριώνει στο σύστημά του για την ποιότητα, τις πολιτικές του, τα προγράμματα, τις διαδικασίες και τις οδηγίες στον απαραίτητο βαθμό ώστε να μπορεί να διασφαλιστεί η ποιότητα των αποτελεσμάτων που εκδίδονται. Η πολιτική του συστήματος διαχείρισης ποιότητας του εργαστηρίου πρέπει να καθορίζεται σε ένα Εγχειρίδιο Ποιότητας. Οι γενικοί στόχοι πρέπει να επανεξετάζονται κατά την τατκτική ανασκόπηση από τη διοίκηση. Η Δήλωση της Πολιτικής για την Ποιότητα γίνεται ενυπόγραφα από την ανώτατη διοίκηση και περιλαμβάνει τα εξής: 3

17 1. Δέσμευση της διοίκησης του εργαστηρίου για την ορθή εφαρμογή του συστήματος διαχείρισης και την ανεξάρτητη και αμερόληπτη άσκηση των επαγγελματικών καθηκόντων, 2. δήλωση της διοίκησης για το επίπεδο υπηρεσιών του εργαστηρίου και δέσμευση για ικανοποίηση των πελατών του, 3. στόχους συστήματος ποιότητας και δέσμευση για βελτίωση της αποτελεσματικότητας του συστήματος διαχείρισης, 4. ενημέρωση του προσωπικού για την τεκμηρίωση του συστήματος ποιότητας, 5. δέσμευση της Διοίκησης για διάθεση όλων των αναγκαίων πόρων για την ορθή, αποτελεσματική και συμμορφούμενη λειτουργία του εργαστηρίου, 6. δέσμευση του εργαστηρίου για συμμόρφωση με το πρότυπο ISO/IEC 17025: 2005 και την εφαρμόσιμη νομοθεσία Τεχνικές απαιτήσεις Η ορθότητα και η αξιοπιστία των δοκιμών ή/και των διακριβώσεων που εκτελούνται σε ένα εργαστήριο εξαρτάται από τους εξής παράγοντες: 1. Ανθρώπινους παράγοντες, 2. χώρους εγκατάστασης και περιβαλλοντικές συνθήκες, 3. μεθόδους δοκιμών, διακριβώσεων και μεθόδους επικύρωσης, 4. εξοπλισμό, 5. ιχνηλασιμότητα μετρήσεων, 6. δειγματοληψία, 7. χειρισμό αντικειμένων δοκιμής και διακρίβωσης. Ο βαθμός που οι παραπάνω παράγοντες επηρεάζουν την αξιοπιστία των εκτελούμενων δοκιμών, διαφέρει ανάλογα με τη φύση των δοκιμών, γεγονός που θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη, κατά τη διακρίβωση και επιλογή του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται και κατά την εκπαίδευση και αξιολόγηση της καταλληλότητας του προσωπικού. 4

18 1.1.5 Χώροι εγκατάστασης και περιβαλλοντικές συνθήκες Οι εγκαταστάσεις του εργαστηρίου πρέπει να διευκολύνουν τη σωστή εκτέλεση των δοκιμών ή/και των διακριβώσεων, το εργαστήριο πρέπει να ελέγχεται και να καταγράφονται όλες οι περιβαλλοντικές συνθήκες. Σε περίπτωση εσφαλμένων αποτελεσμάτων λόγω μη τήρησης των απαιτούμενων κρίσιμων περιβαλλοντικών συνθηκών, οι δοκιμές και οι διακριβώσεις πρέπει να σταματούν μέχρι να αποκατασταθεί το πρόβλημα, θα πρέπει να γίνει διαχωρισμός μεταξύ γειτονικών περιοχών που εκτελούνται μη συμβατές δραστηριότητες καθώς και να υπάρχουν μέτρα πρόληψης για αποφυγή διασταυρούμενης επιμόλυνσης (πχ περίπτωση μικροβιολογικών εργαστηρίων ή εργαστηρίων που λειτουργούν καθαρούς χώρους), πρέπει να ελέγχεται η πρόσβαση στις περιοχές εργασίας και η χρήση των περιοχών και του εξοπλσιμού που επηρεάζουν την ποιότητα των δοκιμών ή/και των διακριβώσεων, πρέπει να λαμβάνονται μέτρα που να εξασφαλίσουν την ευταξία και την καθαριότητα στο εργαστήριο Μέθοδοι δοκιμών, διακριβώσεων και επικύρωση μεθόδων Γενικά Το εργαστήριο πρέπει να χρησιμοποιεί κατάλληλες μεθόδους και διαδικασίες για όλες τις δοκιμές που εμπίπτουν στο αντικείμενο του. Πρέπει να διαθέτει ενήμερες και εύκολα προσβάσιμες για το προσωπικό, οδηγίες για τη χρήση και την λειτουργία όλου του εξοπλισμού που εμπλέκεταιστην εκτέλεση αυτών των δοκιμών. Αποκλίσεις από τις καθιερωμένες μεθοδολογίες εκτέλεσης γίνονται επιτρεπτές στην περίπτωση που η απόκλιση έχει τεκμηριωθεί, έχει αιτιολογηθεί, έχει εγκριθεί αρμοδίως και έχει γίνει αποδεκτή από τον πελάτη/χρήστη των αποτελεσμάτων. 5

19 Επιλογή μεθόδων Πρέπει να χρησιμοποιούνται μέθοδοι που είναι δημοσιευμένες σε διεθνή, περιφερειακά ή εθνικά πρότυπα και οι οποίες θεωρούνται ήδη επαρκώς επικυρωμένες (validated). Το εργαστήριο πρέπει να εξασφαλίζει ότι χρησιμοποιεί την τελευταία έγκυρη έκδοση τουαντίστοιχου προτύπου. Μπορεί να χρησιμοποιεί μεθόδους που έχουν αναπτυχθεί ή υιοθετηθεί στο εργαστήριο μόνο εάν αυτές είναι επικυρωμένες και κατάλληλες για την προβλεπόμενη/σκοπούμενη χρήση. Ο πελάτης πρέπει να ενημερώνεται για τη μέθοδο που επιλέγεται και να επιβεβαιώνεται, ακόμη και όταν η μέθοδος είναι πρότυπη, ότι αυτή εφαρμόζεται αξιόπιστα στο συγκεκριμένο εργαστήριο και συνθήκες (επαλήθευση μεθόδων method verification). Όταν η πρότυπη μέθοδος αλλάζει ή όταν αλλάζει ο χρησιμοποιούμενος εξοπλισμός η επαλήθευση πρέπει να επαναλαμβάνεται. Η επαλήθευση πρότυπων μεθόδων, προσομοιάζει με την επικύρωση των μή πρότυπων μεθόδων, περιλαμβάνοντας παρεμφερείς τεχνικές αξιολόγησης κάποιων κοινών παραμέτρων ποιότητας της μεθόδου. Η κύρια διαφορά μεταξύ επαλήθευσης και επικύρωσης είναι ότι η δεύτερη εξετάζει περισσότερες παραμέτρους για την αντίστοιχη μέθοδο, εντός μεγαλύτερου χρονικού βάθους. Μέθοδοι που αναπτύσσονται από το εργαστήριο Η εισαγωγή μεθόδων που αναπτύσσονται από το εργαστήριο για δική του χρήση πρέπει να είναι μια προσχεδιασμένη δραστηριότητα που επιτελείται από κατάλληλο προσωπικό, εφοδιασμένο με επαρκείς πόρους. Πρέπει να γίνεται συνεχής ενημέρωση του σχεδίου ανάπτυξης και να υπάρχει αποτελεσματική επικοινωνία όλου του εμπλεκόμενου προσωπικού. Μη πρότυπες μέθοδοι Όταν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν μη πρότυπες μέθοδοι (πχ εσωτερικά ανεπτυγμένες inhouse ή διαφοροποιημένες πρότυπες), αυτές πρέπει να είναι σε συμφωνία με τον πελάτη και να περιλαμβάνουν σαφή προδιαγραφή 6

20 των απαιτήσεων του πελάτη, καθώς και το σκοπό της δοκιμής. Οι μη πρότυπες μέθοδοι πρέπει να έχουν επικυρωθεί πριν τη χρήση. Για νέες μεθόδους δοκιμών πρέπει να αναπτύσσονται σαφείς, γραπτές και τεκμηριωμένες διαδικασίες που θα περιλαμβάνουν: 1. Ταυτοποίηση μεθόδου, 2. αρχή και σκοπός μεθόδου, 3. περιγραφή αντικειμένου (δείγματος) που υποβάλλεται σε δοκιμή ή που διακριβώνεται, 4. παραμέτρους ή φυσικά μεγέθη που προσδιορίζονται, συμπεριλαμβανομένων των μονάδων που χρησιμοποιούνται και των σημαντικών ψηφίων που συνθέτουν την τιμή του αποτελέσματος (τρόπος έκφρασης αποτελεσμάτων), 5. συσκευές, όργανα, εξοπλισμό και απαιτήσεις τεχνικής επίδοσης, 6. απαιτούμενα πρότυπα ή/και υλικά αναφοράς και ελέγχου, καθώς και αναλώσιμα, 7. απαιτούμενες περιβαλλοντικές συνθήκες, περίοδο σταθεροποίησης, 8. περιγραφή διαδικασίας εκτέλεσης της μεθοδολογίας και εκτελούμενων ενεργειών βήμα-βήμα, συμπεριλαμβανομένης της προετοιμασίας του δείγματος, 9. χειρισμό, κριτήρια καταλληλότητας και ταυτοποίηση δείγματος, τήρηση αντιδείγματος, 10. έλεγχους πριν την έναρξη εκτέλεσης, 11. έλεγχο καλής λειτουργίας εξοπλισμού, 12. καταχώριση σε αρχείο των παρατηρήσεων, των πρωτογενών δεδομένων, των υπολογισμών και των αποτελεσμάτων, 13. μέτρα ασφάλειας, 14. κριτήρια ή/ και απαιτήσεις έγκρισης/ απόρριψης αποτελεσμάτων (έλεγχος εγκυρότητας δοκιμής), 15. δεδομένα που αρχειοθετούνται, μέθοδο στατιστικής ανάλυσης και παρουσίασης, 16. εκτιμώμενη αβεβαιότητα αποτελέσματος και τρόπο εκτίμησης της αβεβαιότητας. 7

21 Επικύρωση Μεθόδων Με τον όρο επικύρωση εννοούμαι την επιβεβαίωση ότι ικανοποιούνται συγκεκριμένες απαιτήσεις επίδοσης της μεθόδου, που την καθιστούν κατάλληλη για τη σκοπούμενη χρήση (fit for/to purpose). Η επικύρωση περιλαμβάνει πειράματα ελέγχου συγκεκριμένων παραμέτρων, στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και αξιολόγηση των δεδομένων έναντι καθιερωμένων κριτηρίων επίδοσης/απόδοσης, πάντοτε σε συνάφεια με τη σκοπούμενη χρήση και με τη φύση της εκάστοτε μεθόδου που εξετάζεται (πχ αν είναι ποσοτική, ημιποσοτική, ποιοτική κλπ). Αυτό πρέπει να γίνεται από το εργαστήριο για όλες τις μη πρότυπες, καθώς και σε περιορισμένη έκταση και για τις πρότυπες μεθόδους (επαλήθευση μεθόδων) που χρησιμοποιούνται, έτσι ώστε να αποδειχθεί ότι η αντίστοιχη μέθοδος ανάλυσης είναι κατάλληλη για τον σκοπό για τον οποίο προορίζεται. Οι τεχνικές επικύρωσης μπορεί να περιλαμβάνουν κάποια ή συνδυασμό των παρακάτω: Xρήση προτύπων ή/και πιστοποιημένων υλικών αναφοράς, σύγκριση αποτελεσμάτων της εξεταζόμενης μεθόδου με άλλες μεθόδους (αναφοράς, διαπιστευμένες, επικυρωμένες, πρότυπες κλπ), διεργαστηριακές συγκρίσεις ή συμμετοχή σε κατάλληλα σχήματα δοκιμών ικανότητας (proficiencytestingschemes), συστηματική αξιολόγηση των παραγόντων που επηρεάζουν το αποτέλεσμα (όπως εκάστοτε και εφόσον εφαρμόζουν οι παράγοντες βάσει φύσης μεθόδου), όπως η γραμμικότητα, η ακρίβεια, η ορθότητα, η επαναληψιμότητα, η αναπαραγωγιμότητα, τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, η σταθερότητα, η ειδικότητα, η εκλεκτικότητα κλπ, εκτίμηση και αξιολόγηση της αβεβαιότητας των αποτελεσμάτων (για ποσοτικές και ημιποσοτικές μεθόδους κυρίως). Εκτίμηση της αβεβαιότητας των μετρήσεων Ένα εργαστήριο που εκτελεί δοκιμές ή/και διακριβώσεις πρέπει να εφαρμόζει διαδικασία για την εκτίμηση της αβεβαιότητας των αποτελεσμάτων. Σε 8

22 περιπτώσεις όπου η φύση της μεθόδου δοκιμής δεν επιτρέπει τον ακριβή υπολογισμό αβεβαιότητας, θα πρέπει να γίνεται μια λογική εκτίμηση, χρησιμοποιώντας κατάλληλες μεθόδους ανάλυσης και υπολογισμού των παραγόντων που συνεισφέρουν στη συνολική αβεβαιότητα και εκφράζουν τα τυχαία και συστηματικά σφάλματα που υφίστανται. Έλεγχος δεδομένων Οι υπολογισμοί και οι μεταφορές δεδομένων πρέπει να γίνονται τεκμηριωμένα και να ελέγχονται σε ότι αφορά την αξιοπιστία. Σε περίπτωση που χρησιμοποιούνται ηλεκτρονικοί υπολογιστές, εφαρμογές λογισμικού ή αυτοματοποιημένος εξοπλισμός για την διαχείριση των δεδομένων, θα πρέπει: Oι εφαρμογές λογισμικού και τυχόν υπολογισμοί να είναι τεκμηριωμένα και κατάλληλα επικυρωμένα, να έχουν καθιερωθεί και να έχουν εφαρμοστεί διαδικασίες για την προστασία των δεδομένων από απώλεια, εσφαλμένη χρήσηκαι μη εξουσιοδοτημένη πρόσβαση, οι ηλεκτρονικοί υπολογιστές και ο αυτοματοποιημένος εξοπλισμός θα πρέπει να συντηρούνται κατάλληλα για την διασφάλιση της σωστής λειτουργίας τους. Εξοπλισμός Το εργαστήριο θα πρέπει να εφοδιασμένο με όλα τα όργανα και κύριο και βοηθητικό εξοπλισμό, που απαιτούνται για την ορθή διεξαγωγή των δοκιμών ή/και διακριβώσεων που εκτελεί. Ο εξοπλισμός και το λογισμικό που χρησιμοποιούνται θα πρέπει να καθιστούν εφικτή την ακρίβεια που απαιτείται και θα πρέπει να συμμορφώνονται με τις προδιαγραφές και απαιτήσεις των μεθόδων που εφαρμόζονται. Ο εξοπλισμός θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο από εξουσιοδοτημένο προσωπικό βάση ενημερωμένων οδηγιών χρήσης και συντήρησης, καθώς και να ταυτοποιείται μονοσήμαντα. Επίσης, θα πρέπει να τηρείται αρχείο για κάθε στοιχείο του εξοπλισμού το οποίο θα περιέχει: 1. Tην ταυτότητα του εξοπλισμού και του λογισμικού του, 2. την επωνυμία του κατασκευαστή, τον τύπο, τον αριθμό σειράς ή άλλη μοναδική ταυτότητα, 9

23 3. τη συμμόρφωση του εξοπλισμού με τη δεδομένη προδιαγραφή, 4. την τρέχουσα θέση εγκατάστασης και λειτουργίας, 5. τις οδηγίες του κατασκευαστή ή αναφορά σε αυτές, 6. τις ημερομηνίες, τα αποτελέσματα και αντίγραφα εκθέσεων και πιστοποιητικών των διακριβώσεων/ ρυθμίσεων, κριτηρίων αποδοχής καθώς και την ημερομηνία της επόμενης διακρίβωσης, 7. το πρόγραμμα συντήρησης και ελέγχων, 8. αναφορά σε οποιαδήποτε ζημιά, δυσλειτουργία, τροποποίηση ή επισκευή. Το εργαστήριο πρέπει να καθιερώνει γραπτές διαδικασίες/οδηγίεςγια τον εξοπλισμό μετρήσεων κατά το χειρισμό, τη μεταφορά, την αποθήκευση, τη χρήση και την προγραμματισμένη συντήρηση του. Σε περίπτωση που ο εξοπλισμός εμφανίσει κάποιο ελάττωμα θα πρέπει να αποσύρεται από την λειτουργία, καθώς και να φέρει εμφανή σήμανση της κατάστασης του ή να απομονώνεται. Όπου είναι πρακτικά δυνατόν, κάθε όργανο του εργαστηρίου θα πρέπει να φέρει μια ετικέτα που θα αναγράφει την κατάσταση της διακρίβωσης του. Ενδιάμεσοι έλεγχοι είναι απαραίτητοι ώστε να διατηρείται η εμπιστοσύνη στη κατάσταση λειτουργίας του εξοπλισμού. Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες που να εξασφαλίζουν τη σωστή ενημέρωση τυχόν συντελεστών διόρθωσης μετρήσεων λόγω drift του οργάνου σε βάθος χρόνου Ιχνηλασιμότητα μετρήσεων Διακρίβωση Κάθε εξοπλισμός που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο και έχει επίδραση στην εγκυρότητα του αποτελέσματος της δοκιμής, πρέπει να διακριβώνεται πριν τεθεί για πρώτη φορά σε λειτουργία, καθώς και σε τακτά χρονικά διαστήματα. Γενικά, το εργαστήριο δοκιμών πρέπει να διαθέτει ένα πρόγραμμα σχετικά με την περιοδική διακρίβωση του εξοπλισμού, το οποίο να εξασφαλίζει ότι οι μετρήσεις και οι διακριβώσειςπου γίνονται, είναι ιχνηλάσιμες στο Διεθνές Σύστημα Μονάδων(SI).Όταν η ιχνηλασιμότητα προς το SI δεν είναι δυνατή, η εμπιστοσύνη παρέχεται με πιστοποιημένα υλικά αναφοράς και χρήση καθορισμένων μεθόδων ή/και συναινετικών προτύπων. Η διακρίβωση εξοπλισμού συνήθως 10

24 γίνεται από διαπιστευμένα εργαστήρια διακριβώσεων, ώστε τα Πιστοποιητικά Διακρίβωσης που παρέχονται να αποδεικνύουντην απαιτούμενη ιχνηλασιμότητα μετρούμενων μεγεθών. Οι διακριβώσεις εξοπλισμού επιτρέπουν την εκτίμηση των συστηματικών σφαλμάτων που εισάγουν τα όργανα μετρήσεων σε κάποια δοκιμή, ενώ ταυτόχρονα επιτρέπουν και τον έλεγχο της κατάστασής τους. Ενδιάμεσοι έλεγχοι, μεταξύ διαστημάτων επαναδιακρίβωσης, καθιερώνονται για τον κρίσιμο εξοπλισμό ώστε να διασφαλίζεται η ορθή λειτουργία του (πχ έλεγχος ζυγών με πρότυπα βάρη, έλεγχος πιπετών με βαρυμετρική διαδικασία κλπ). Πρότυπα αναφοράς και υλικά αναφοράς Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασία για την διακρίβωση των δικών του προτύπων αναφοράς. Τα υλικά αναφοράς πρέπει να είναι ιχνηλάσιμα ως προς τις μονάδες μέτρησης SI ή πιστοποιημένα υλικά αναφοράς. Πρέπει να διεξάγονται ενδιάμεσοι έλεγχοι ώστε να εξασφαλιστεί η εμπιστοσύνη στην κατάσταση της διακρίβωσης των υλικών αναφοράς και των προτύπων αναφοράς. Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες για τον ασφαλή χειρισμό, μεταφορά και αποθήκευση των προτύπων και υλικών αναφοράς, προκειμένου να εξασφαλίζεται η ακεραιότητα τους. Δειγματοληψία Το εργαστήριο πρέπει να έχει σχέδιο και διαδικασίες για δειγματοληψία και να είναι διαθέσιμα στη θέση που πραγματοποιείται η δειγματοληψία. Οι διαδικασίες αυτές πρέπει να βασίζονται σε κατάλληλες στατιστικές μεθόδους και να ελέγχονται όλοι οι παράγοντες ώστε να διασφαλίζεται η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων των δοκιμών επί των δειγμάτων που λαμβάνονται. Όταν ο πελάτης απαιτεί παρεκκλίσεις από την τεκμηριωμένη διαδικασία δειγματοληψίας, αυτές πρέπει να καταγράφονται λεπτομερώς και να γνωστοποιούνται στο προσωπικό. Χειρισμός αντικειμένων δοκιμής (δείγματα)ή/και διακρίβωσης Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες για την διασφάλιση της ακεραιότητας και της καταληλότητας των αντικειμένων για τις δοκιμές 11

25 (δειγμάτων) ή τις διακριβώσεις. Οι διαδικασίες αυτές πρέπει να περιλαμβάνουν οδηγίες για την μεταφορά, τον χειρισμό, την αποθήκευση και την προστασία των αντικειμένων. Πρέπει να διαθέτει ένα σύστημα απόδοσης ταυτότητας και αναγνώρισης του αντικειμένου δοκιμής ή διακρίβωσης. Τα δείγματα πρέπει να ελέγχονται κατά την παραλαβή και να καταγράφεται σε αρχείο κάθε απόκλιση από τις προδιαγεγραμμένες απαιτήσεις και κριτήρια καταλληλότητας. Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες και κατάλληλες εγκαταστάσεις για την αποφυγή υποβάθμισης, απώλειας ή ζημιάς στο αντικείμενο δοκιμής ή διακρίβωσης. Πρέπει να ακολουθούνται οι οδηγίες χειρισμού που συνοδεύουν το εκάστοτε αντικείμενο. Αν τα αντικείμενα/δείγματα πρέπει να αποθηκεύονται κάτω από συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες, θα πρέπει οι συνθήκες αυτές να τηρούνται και να καταγράφονται. Τυχόν παρατηρήσεις επί της καταλληλότητας των δειγμάτων πρέπει να καταγράφονται στην Έκθεση Αποτελεσμάτων/Πιστοποιητικό Ανάλυσης. Διασφάλιση ποιότητας αποτελεσμάτων Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει διαδικασίες για τον εσωτερικό και εξωτερικό έλεγχο ποιότητας των αποτελεσμάτων των δοκιμών που εκτελεί, με σκοπό να εξασφαλίζεται η εγκυρότητα των δοκιμών που αναλαμβάνει και ότι τα αποτελέσματα βρίσκονται εντός στατιστικού ελέγχου. Πρέπει να είναι σε θέση να εντοπίζει πιθανές αποκλίσεις από προδιαγεγραμμένα όρια και κριτήρια, ώστε να μπορεί να λάβει έγκαιρα τα ενδεδειγμένα διορθωτικά μέτρα. Το πρόγραμμα ελέγχου μπορεί να περιλαμβάνει: 1. Χρήση πιστοποιημένων υλικών αναφοράς ή/και έλεγχο ποιότητας με δευτερεύοντα υλικά αναφοράς (εσωτερικός έλεγχος ποιότητας), 2. περιοδική συμμετοχή σε προγράμματα διεργαστηριακών συγκρίσεων και σχημάτων δοκιμών ικανότητας (εξωτερικός έλεγχος ποιότητας), 3. επανάληψη των ίδιων δοκιμών ή επανάληψη περιορισμένης έκτασης επαλήθευσης σε τακτά χρονικά διαστήματα, 4. περιοδική επανάληψη δοκιμής σε αντικείμενα/δείγματα που διατηρούνται, 5. συσχέτιση των αποτελεσμάτων για διαφορετικά χαρακτηριστικά του ίδιου δείγματος. 12

26 Σύνταξη εκθέσεων αποτελεσμάτων / πιστοποιητικών ανάλυσης Τα αποτελέσματα κάθε δοκιμής ή διακρίβωσης που εκτελούνται από το εργαστήριο πρέπει να εκτίθενται με ακρίβεια, σαφήνεια, αντικειμενικότητα, χωρίς αμφιβολίες και να είναι σύμφωνα με τις ειδικές οδηγίες των μεθόδων που εκτελούνται. Τα αποτελέσματα πρέπει να παρουσιάζονται σε μια Έκθεση Δοκιμής / Πιστοποιητικό Ανάλυσης ή σε ένα Πιστοποιητικό Διακρίβωσης (όταν πρόκειται για διακρίβωση) και να περιλαμβάνουν όλες τις πληροφορίες που έχουν ζητηθεί από τον πελάτη, καθώς και όλες τις πληροφορίες που είναι απαραίτητες για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Κάθε έκθεση δοκιμής ή πιστοποιητικό θα πρέπει να περιλαμβάνει τουλάχιστον τις παρακάτω πληροφορίες: 1. Τον τίτλο του εγγράφου, 2. την επωνυμία και τη διεύθυνση του εργαστηρίου, 3. μονοσήμαντη αναγνώριση του πελάτη (επωνυμία και διεύθυνση), 4. την ταυτότητα της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε, 5. τον σαφή προσδιορισμό και περιγραφή των αντικειμένων (δειγμάτων) δοκιμής ή διακρίβωσης, καθώς και τυχόν παρατηρήσεις επί της καταλληλότητας αυτών, 6. την ημερομηνία παραλαβής των δειγμάτων και την ημερομηνία εκτέλεσης (έναρξης και λήξης) της δοκιμής. Οι ώρες αναφέρονται μόνο εφόσον ο χρόνος που μεσολαβεί από την παραλαβή δείγματος μέχρι την έκδοση αποτελέσματος είναι κρίσιμος για την καταλληλότητα του δείγματος και την εξαγωγή συμπερασμάτων (πχ περίπτωση ορισμένων διαγνωστικών εξετάσεων σε ορισμένα βιολογικά υλικά), 7. αναφορά σε σχέδιο και διαδικασίες δειγματοληψίας και Ημερομηνία δειγματοληψίας, 8. τα αποτελέσματα των δοκιμών ή των διακριβώσεων (σημαντικά ψηφία, μονάδες), 9. το όνομα, την ιδιότητα και την υπογραφή του εξουσιοδοτημένου ατόμου για την έκδοση και χορήγηση της έκθεσης δοκιμής, 10. δήλωση ότι τα αποτελέσματα αφορούν μόνο τα δείγματα που αναλύθηκαν, 13

27 11. δήλωση για την αβεβαιότητα του αποτελέσματος μόνον εφόσον αυτό απαιτηθεί από τον πελάτη, 12. σαφή προσδιορισμό του τέλους της έκθεσης/πιστοποιητικού και αρίθμηση κάθε σελίδας από το σύνολο των σελίδων που την απαρτίζουν (σελίδα Χ από Y). Πιστοποιητικά διακριβώσεων Όπου είναι απαραίτητο για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων των διακριβώσεων, τα πιστοποιητικά πέρα των ανωτέρω απαιτήσεων πρέπει να περιλαμβάνουν: 1. Τις συνθήκες υπό τις οποίες έγιναν οι διακριβώσεις, 2. την αβεβαιότητα της μέτρησης ή/και δήλωση συμμόρφωσης με καθορισμένημετρολογική προδιαγραφή, 3. τεκμηριωμένη ιχνηλασιμότητα μετρήσεων. Το πιστοποιητικό διακρίβωσης πρέπει να σχετίζεται με αποτελέσματα δοκιμών λειτουργίας και όταν γίνεται δήλωση συμμόρφωσης ως προς μια προδιαγραφή, αυτή πρέπει να προσδιορίζει ποια κεφάλαια της προδιαγραφής ικανοποιούνται ή δεν ικανοποιούνται. Όταν ένα όργανο ετοιμάζεται για διακρίβωση, πρέπει να αναφέρονται τα αποτελέσματα διακρίβωσης πριν και μετά. Στο πιστοποιητικό διακρίβωσης ή την ετικέτα δεν πρέπει να περιέχεται σύσταση για το διάστημα διακρίβωσης, εκτός εάν αυτό έχει συμφωνηθεί με τον πελάτη. [3] 1.2 Αναλυτικές τεχνικές Ταξινόμηση καθαρών χώρων Ορισμός στείρου χώρου EN/ISO : «Ένας χώρος εντός του οποίου ελέγχεται η συγκέντρωση των αερογόνων σωματιδίων, ο οποίος είναι σχεδιασμένος με τέτοιο τρόπο ώστε να ελαχιστοποιούνται οι κίνδυνοι δημιουργίας και κατακράτησης σωματιδίων και στον οποίο όλοι οι σχετικοί παράγοντες όπως για παράδειγμα, η θερμοκρασία, η υγρασία και η πίεση, ελέγχονται κατάλληλα». 14

28 Πριν την παγκόσμια υιοθέτηση από τον οργανισμό ISO, η κατάταξη/ταξινόμηση των καθαρών χώρων ελεγχόμενης επιμόλυνσης ή απλά καθαρών χώρων γινόταν με την χρήση του προτύπου FS209E. Καθώς όμως μεγάλωνε η ανάγκη για διεθνώς αναγνωρισμένα πρότυπα δημιουργήθηκε ένα νέο πρότυπο το ISO Το πρότυπο αυτό περιλαμβάνει δύο (2) επιπλέον βαθμίδες βελτιωμένης καθαρότητας και μία (1) βαθμίδα μειωμένης καθαρότητας. Κατά το νέο πρότυπο ISO η διαβάθμιση των καθαρών χώρων γίνεται ανάλογα με τον αριθμό των μικροσωματιδίων συγκεκριμένων διαστάσεων (μm) τα οποία βρίσκονται στον αέρα ανά κυβικό μέτρο (m 3 ). Στο πρότυπο ISO έχουμε τρεις διαφορετικές ταξινομήσεις: as-build at-rest (σε ετοιμότητα) at- operational status (σελειτουργία) Το «as-build» είναι η αρχική κατάσταση λειτουργίας ενός καθαρού χώρου. Στην συνέχεια, με την τοποθέτηση εργαλείων εξοπλισμού στο χώρο, το μικροβιακό φορτίο αυξάνει και περνάμε στην κατάσταση «at-rest». Τέλος, μόλις στο εργαστήριο εισέλθουν και άνθρωποι μεταφερόμαστε στην τελευταία κατάσταση, «at-operational status». Προκειμένου να πληρούνται οι «συνθήκες λειτουργίας», ο σχεδιασμός των εν λόγω χώρων, πρέπει να είναι τέτοιος ώστε να επιτυγχάνονται συγκεκριμένα επίπεδα καθαρότητας αέρα στην κατάσταση «ετοιμότητας». Ως κατάσταση «ετοιμότητας» ορίζεται εκείνη, όπου οι εγκαταστάσεις έχουν ολοκληρωθεί και είναι έτοιμες να λειτουργήσουν πλήρεις με παραγωγικό εξοπλισμό, χωρίς όμως να είναι παρόν το προσωπικό χειρισμού. Ως «κατάσταση λειτουργίας» ορίζεται εκείνη όπου οι εγκαταστάσεις λειτουργούν κατά τον προβλεπόμενο τρόπο με παρόντα τον καθορισμένο αριθμό του προσωπικού να εργάζεται. Οι καταστάσεις «λειτουργίας» ή «ετοιμότητας» πρέπει να καθορίζονται για κάθε καθαρό χώρο ή ακολουθία χώρων. 15

29 Διακρίνονται τέσσερις (4) βαθμίδες καθαρών χώρων: Βαθμίδα Α: Μία περιορισμένη ζώνη για εργασίες υψηλής επικινδυνότητας. Συνήθως, οι συνθήκες αυτές επιτυγχάνονται με τη χρήση σταθμών εργασίας με στρωτή/γραμμική ροή αέρα (laminarair-flow). Τα συστήματα στρωτής ροής αέρα πρέπει να διοχετεύουν αέρα σταθερής ταχύτητας 0,36-0,54 m/s (ενδεικτική τιμή) στη θέση εργασίας, στις εφαρμογές ανοιχτού καθαρού χώρου. ΒΑΘΜΙΔΑ Β: Αφορά τις συνθήκες χώρου που περιβάλλει το χώρο Βαθμίδας Α για τις εργασίες άσηπτης παρασκευής και πλήρωσης. ΒΑΘΜΙΔΑ Γ ΚΑΙ Δ: Καθαροί χώροι για τη διεκπεραίωση των λιγότερο κρίσιμων φάσεων παραγωγής των στείρων προϊόντων. Πίνακας 1: Βαθμίδες καθαρότητας ISO καθαρών χώρων βάση μεγέθους μικροσωματιδιακής επιμόλυνσης (μm) ανά κυβικό μέτρο αέρα (m 3 ). ISO Αριθμός μικροσωματιδίων ανά κυβικό μέτρο αέρα (m 3 ) CLASS 0,1 μm 0,2 μm 0,3 μm 0,5 μm 1,0 μm 5,0 μm ISO ISO ISO ISO ISO ISO ISO ISO ISO Πίνακας 2: Μέγιστος επιτρεπτός αριθμός αερογόνων σωματιδίων ανά κλάση Μέγιστος επιτρεπόμενος αριθμός σωματιδίων ανά m 3, μεγέθους ίσου ή μεγαλύτερου του μεγέθους ταξινόμησης Σε ετοιμότητα Σε λειτουργία Βαθμίδα 0,5 μm 5 μm 0,5 μm 5 μm Α Β Γ Δ Δεν ορίζεται Δεν ορίζεται 16

30 Κατά την ταξινόμηση σε ζώνη βαθμίδας Α, σε κάθε θέση δειγματοληψίας πρέπει να λαμβάνεται ελάχιστο δείγμα αέρα όγκου 1 m 3. Κατά την ταξινόμηση πρέπει να χρησιμοποιούνται φορητοί μετρητές σωματιδίων με αγωγό δείγματος μικρού μήκους επειδή παρατηρείται σχετικά υψηλός βαθμός καθίζησης σωματιδίων >/= 5,0 μm σε απόσταση (remote) συστήματα δειγματοληψίας με αγωγό μεγάλου μήκους. Ισοκινητικές κεφαλές δείγματος πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συστήματα στρωτής ροής αέρα (uni direction al air flow system). 17

31 1.2.2 Παρακολούθηση καθαρών χώρων και συσκευών καθαρού αέρα Οι χώροι πρέπει να παρακολουθούνται και να ελέγχονται τακτικά για το μικροβιακό φορτίο που επικρατεί. Άλλωστε και ο έλεγχος σωματιδιακού φορτίου εκτελείται διότι τα σωματίδια αποτελούν φορείς μεταφοράς μικροβίων που προσκολλώνται επί των σωματιδίων.οι θέσεις παρακολούθησης καθώς και τα αποτελέσματα πρέπει να βασίζονται σε μια επίσημη μελέτη ανάλυσης κινδύνου. Η βαθμίδα Α πρέπει να παρακολουθείται με τέτοια συχνότητα και με κατάλληλο μέγεθος δείγματος έτσι ώστε όλες οι παρεμβάσεις, τα παροδικά συμβάντα και κάθε αλλοίωση του συστήματος να γίνονται αντιληπτά και να ενεργοποιείται σήμα κινδύνου εάν ξεπεραστούν τα όρια συναγερμού. Για την βαθμίδα Β συνιστάται παρόμοιο σύστημα αν και η συχνότητα δειγματοληψίας μπορεί να μειωθεί. Οι άσηπτες εργασίες πρέπει να παρακολουθούνται στενά με μεθόδους όπως είναι τα τρυβλία καθίζησης, οι ογκομετρικές δειγματοληψίες αέρος και επιφανειών (π.χ. με τρυβλία επαφής). Οι μέθοδοι δειγματοληψίας που χρησιμοποιούνται στη φάση της λειτουργίας δεν πρέπει να παρεμβαίνουν στην προστασία των καθαρών χώρων. Μετά από κάθε κρίσιμη εργασία επιβάλλεται ο έλεγχος των επιφανειών του προσωπικού. [2, 5, 20, 21, 22, 23] Εικόνα 1.1: Microbiological Air Sampler. Ειδικό σύστημα μέτρησης μικροβίων για έλεγχο μικροβιακού φορτίου αέρα 18

32 Πίνακας 3: Μικροβιολογική παρακολούθησης καθαρών χώρων Συνιστώμενα όρια μικροβιακής επιμόλυνσης Βαθμίδα Δείγμα αέρα Πλάκες καθίζησης Πλάκες επαφής cfu/m 3 (διάμετρος 9,0 mm) cfu/4 ώρες (διάμετρος 55 mm) cfu /πλάκα Α <1 <1 <1 <1 Β Γ Δ Αποτύπωμα Χειροκτίου με 5 Δάκτυλα cfu /χειρόκτιο Οδηγίες ενδυμασίας προσωπικού ανάλογα την βαθμίδα του στείρου χώρου Το προσωπικό που είναι εξουσιοδοτημένο να εργάζεται εντός του στείρου χώρου πρέπει να έχει την κατάλληλη ενδυμασία. Απαγορεύεται η είσοδος με κοσμήματα καθώς και η χρήση καλλυντικών (μακιγιάζ, βαμμένα νύχια κλπ.). Πριν την είσοδο την είσοδο στο προθάλαμο βαθμίδας Δ πλένουμε καλά τα χέρια μας και σκουπίζουμε με χαρτί μιας χρήσης. Πριν τη μετάβαση από χώρο κάποιας βαθμίδας σε χώρο άλλης βαθμίδας απολυμαίνουμε πάντοτε τα χέρια μας (πάνω από τα χειρόκτια-γάντια). Απολυμαντικοί περιέκτες ψεκασμού βρίσκονται σε κάθε χώρο. Στη ζώνη βαθμίδας Δ αφήνουμε τα ρούχα μας και φοράμε τα υποδήματα χώρου Δ. Αρχικά φοράμε το κάλυμμα κεφαλής, αποστειρωμένα καλτσάκια, καθαρή λευκή στολή δυο τεμαχίων, γάντια και απολυμαίνουμε τα χέρια μας. Στο χώρο βαθμίδας Δ είναι τοποθετημένο μόνιμα απολυμαντικό πατάκι στη θύρα εισόδου για την βαθμίδα Γ. Καθώς μπαίνουμε στην ζώνη βαθμίδας Γ απολυμαίνουμε τα χέρια μας. Εφόσον θέλουμε να εισέλθουμε στη ζώνη βαθμίδας Β λαμβάνουμε από το θάλαμο αποθήκευσης τις σφραγισμένες συσκευασίες με τα τεμάχια της αποστειρωμένης ειδικής φόρμας. Τοποθετούμε δεύτερο ζευγάρι αποστειρωμένα καλτσάκια και φοράμε τα υποδήματα χώρου βαθμίδας Γ. Τοποθετούμε μάσκα προσώπου η οποία στερεώνεται εξωτερικά του καλύμματος κεφαλής. Οι άνδρες λαμβάνουν μέριμνα για τοποθέτηση μάσκας 19

33 που καλύπτει πλήρως τα γένια. Τοποθετούμε δεύτερο κάλυμμα κεφαλής πάνω από το πρώτο. Απολυμαίνουμε τα χέρια μας και τοποθετούμε δεύτερο ζευγάρι γάντια πάνω από τα πρώτα και τραβάμε μέχρι πάνω για να καλύψουμε τα μανίκια της φόρμας. Η μάσκα στηρίζεται έξω από το σκουφάκι. Κατά την είσοδο μας στη ζώνη βαθμίδας Β απολυμαίνουμε εκ νέου τα χέρια μας. Όταν πρόκειται να βγούμε, ακολουθούμε την ακριβώς αντίστροφη πορεία, αφήνοντας τα υποδήματα στον εκάστοτε χώρο που τα πήραμε, ενώ τις στολές τις κρεμάμε στο χώρο βαθμίδας Δ. Οι στολές και τα πανάκια καθαρισμού δίνονται για πλύσιμο στην ειδική μονάδα που ασχολείται με τον καθαρισμό του εργαστηριακού ρουχισμού, όπου και στην συνέχεια αποστειρώνονται για νέα χρήση. Εάν τα αποστειρωμένα είδη δεν χρησιμοποιηθούν εντός 2 έως 5 ημερών από τις ημερομηνίες αποστείρωσης, η αποστείρωση τους επαναλαμβάνεται. [10] 1.3 Αρχές και κατευθυντήριες γραμμές για κανόνες καλής παραγωγής φαρμάκων (GMP) Αρχή Ο κάτοχος της Άδειας Παραγωγής πρέπει να εξασφαλίζει, για την παρασκευή φαρμακευτικών προϊόντων, την καταλληλότητα τους για χρήση, για την οποία προορίζονται, να συμφωνούν με τις απαιτήσεις της Άδειας Κυκλοφορίας ή της Άδειας Κλινικής Δοκιμής όπως ενδείκνυται και ότι δεν εκθέτουν τους ασθενείς σε κίνδυνο εξαιτίας της μη επαρκούς ασφάλειας, ποιότητας ή αποτελεσματικότητας. Η υλοποίηση αυτού του στόχου ποιότητας είναι ευθύνη της ανώτερης διοίκησης και απαιτεί τη συμμετοχή και την ανάληψη ευθύνης εκ μέρους του προσωπικού σε πολλά διαφορετικά τμήματα και σε όλα τα επίπεδα μέσα στην επιχείρηση, εκ μέρους των προμηθευτών και των διανομέων. Για να επιτευχθεί λοιπόν, αυτός ο στόχος πρέπει να υπάρχει ένα καλό εφαρμοσμένο Φαρμακευτικό Σύστημα Ποιότητας, το οποίο να ενσωματώνει τους Κανόνες Καλής Παραγωγής και τη Διαχείριση Κινδύνου Ποιότητας. Πρέπει να είναι πλήρως τεκμηριωμένο και να παρακολουθείται η αποτελεσματικότητα του. Όλα 20

34 τα τμήματα του Συστήματος Ποιότητας πρέπει να εφοδιασθούν επαρκώς με κατάλληλο προσωπικό και κατάλληλες, επαρκείς εγκαταστάσεις, εξοπλισμό και μέσα. Υπάρχουν πρόσθετες νομικές ευθύνες για τον κάτοχο της Άδειας Παραγωγής και για τα Ειδικευμένα Πρόσωπα. Η διασφάλιση ποιότητας είναι μια έννοια που κυμαίνεται σε ευρεία περιοχή και η οποία καλύπτει όλα τα θέματα, τα οποία το καθένα ή όλα μαζί επηρεάζουν την ποιότητα του προϊόντος. Αποτελεί το συνολικό άθροισμα των οργανωμένων ρυθμίσεων, που γίνονται με σκοπό να εξασφαλίζεται ότι τα φαρμακευτικά προϊόντα έχουν την ποιότητα που απαιτείται για την χρήση για την οποία προορίζονται. Η διασφάλιση ποιότητας είναι μια έννοια που κυμαίνεται σε ευρεία περιοχή και καλύπτει όλα τα θέματα τα οποία επηρεάζουν την ποιότητα του προϊόντος. Αποτελεί το συνολικό άθροισμα των οργανωμένων ρυθμίσεων που σκοπό έχουν να εξασφαλίζεται ότι τα φαρμακευτικά προϊόντα έχουν την ποιότητα που απαιτείται για την χρήση για την οποία προορίζονται Κανόνες Καλής Παραγωγής για Φαρμακευτικά Προϊόντα Οι Κανόνες Καλής Παραγωγής φαρμάκων είναι μέρος της Διαχείρισης Ποιότητας και αναφέρονται τόσο στην παραγωγή όσο και στον έλεγχο ποιότητας. Εξασφαλίζει ότι τα προϊόντα παράγονται συστηματικά και ελέγχονται σύμφωνα με τα πρότυπα. Οι βασικές απαιτήσεις των Κανόνων Καλής Παραγωγής (GMP) είναι οι εξής: i. Οι διεργασίες παραγωγής καθορίζονται λεπτομερώς και αποδεικνύεται ότι είναι σε θέσηνα παράγουν συστηματικά φαρμακευτικά προϊόντα με την απαιτούμενη ποιότητα και σύμφωνα με τις προδιαγραφές τους, ii. τα κρίσιμα στάδια των διεργασιών παραγωγής καθώς και οι σημαντικές αλλαγές στη διεργασία, πρέπει να υποβάλλονται σε αξιολόγηση της αξιοπιστίας, iii. θα πρέπει να παρέχονται: - κατάλληλα ειδικευμένο και εκπαιδευόμενο προσωπικό - επαρκείς εγκαταστάσεις και χώροι - κατάλληλος εξοπλισμός και υπηρεσίες 21

35 - σωστά υλικά και περιέκτες - εγκεκριμένες διαδικασίες και οδηγίες σύμφωνα με το Φαρμακευτικό Σύστημα Ποιότητας - κατάλληλη αποθήκευση και μεταφορά, iv. οι οδηγίες και οι διαδικασίες πρέπει να είναι διατυπωμένες με καθαρό και σαφή τρόπο, v. πρέπει να γίνονται καταγραφές κατά την παραγωγή για απόδειξη ότι πραγματοποιήθηκαν όλα τα στάδια που απαιτούνται, vi. σημαντικές αποκλίσεις πρέπει να καταγράφονται με σκοπό την εύρεση της αιτίας, vii. αρχεία της παραγωγής πρέπει να αποθηκεύονται, viii. κάθε παράπονο σχετικά με τα προϊόντα πρέπει να εξετάζεται Έλεγχος Ποιότητας Με τον όρο «έλεγχος ποιότητας» εννοούμε το μέρος αυτό των Κανόνων Καλής Παραγωγής το οποίο αφορά την δειγματοληψία και τις μεθόδους ανάλυσης και ελέγχου δειγμάτων με σκοπό τον έλεγχο συμμόρφωσης με τις καθιερωμένες προδιαγραφές (specifications) του προιϊόντος. Με τη δειγματοληψία εξασφαλίζεται ότι διεξάγονται όλοι οι έλεγχοι πριν την απελευθέρωση των προϊόντων, ώστε η ποιότητα τους να είναι ικανοποιητική. Οι βασικές απαιτήσεις του Ελέγχου Ποιότητας είναι: i. Το εκπαιδευμένο προσωπικό και οι εγκεκριμένες διαδικασίες πρέπει να είναι διαθέσιμα για την δειγματοληψία και τον έλεγχο των πρώτων υλών μέχρι των τελικών προϊόντων, ii. iii. iv. αξιολογείται η αξιοπιστία των μεθόδων ελέγχου μέσω της επικύρωσής τους, οι καταγραφές πρέπει να γίνονται, με αυτόν τον τρόπο αποδεικνύεται ότι διεξάγονται πραγματικά όλες οι απαιτούμενες διαδικασίες δειγματοληψίας, επιθεώρησης και ελέγχου. Τυχόν αποκλίσεις καταγράφονται πλήρως και διερευνώνται, τα τελικά προϊόντα πρέπει να περιέχουν δραστικά συστατικά σύμφωνα με την ποιοτική καιτην ποσοτική σύνθεση της Άδειας Κλινικής Δοκιμής, καθώς 22

36 να έχουν και την απαιτούμενη καθαρότητα και να βρίσκονται μέσα σε δικούς τους περιέκτες που να φέρουν ορθή επισήμανση, v. τηρούνται αρχεία με τα αποτελέσματα της επιθεώρησης και τα αποτελέσματα από τον έλεγχο των υλικών και αξιολογούνται επίσημα έναντι των προδιαγραφών, vi. καμία παρτίδα δεν αποδεσμεύεται προς πώληση ή εφοδιασμό πριν από την πιστοποίηση από το Ειδικευμένο πρόσωπο, vii. διατηρούνται επαρκή δείγματα αναφοράς, προκειμένου να επιτρέπεται η πιθανή μελλοντική εξέταση του προϊόντος. Κάθε κάτοχος αδείας δυνατότητας παραγωγής πρέπει να έχει ένα Τμήμα Ποιοτικού Ελέγχου. Το τμήμα αυτό πρέπει να είναι ανεξάρτητο από τα άλλα τμήματα και υπό την δικαιοδοσία ενός προσώπου με τα κατάλληλα προσόντα και εμπειρία, ο οποίος έχει στη διάθεση του ένα ή περισσότερα εργαστήρια ελέγχου. Πρέπει να διατίθενται επαρκείς πόροι προκειμένου να εξασφαλίζεται ότι όλες οι ρυθμίσεις του Ελέγχου Ποιότητας διεξάγονται αποτελεσματικά και αξιόπιστα. Το τμήμα Ελέγχου Ποιότητας ως σύνολο έχει επίσης και άλλα καθήκοντα όπως να καθιερώνει, να αξιολογεί την αξιοπιστία και να εφαρμόζει όλες τις διαδικασίες ελέγχου ποιότητας, να τηρεί τα δείγματα αναφοράς των υλικών και των προϊόντων, να εξασφαλίζει την σωστή επισήμανση των περιεκτών και των υλικών και των προϊόντων, να συμμετέχει στη διερεύνηση των παραπόνων που συνδέονται με την ποιότητα του προϊόντος. Όλες αυτές οι εργασίες πρέπει να διεξάγονται σύμφωνα με γραπτές διαδικασίες και όταν είναι αναγκαίο να καταγράφονται. Η αξιολόγηση του τελικού προϊόντος πρέπει να περιλαμβάνει όλους τους σχετικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των συνθηκών της παραγωγής, των αποτελεσμάτων του ελέγχου κατά τη διαδικασία, εξέταση της τεκμηρίωσης της παραγωγής, τη συμμόρφωση με τις προδιαγραφές του τελικού προϊόντος και την εξέταση της τελευταίας τελικής συσκευασίας. Το προσωπικό του Ελέγχου Ποιότητας πρέπει να έχει πρόσβαση στις περιοχές παραγωγής για τη δειγματοληψία και τη διερεύνηση κατά περίπτωση. Το προσωπικό, οι εγκαταστάσεις και ο εξοπλισμός στα εργαστήρια πρέπει να 23

37 είναι κατάλληλα για τα καθήκοντα που επιβάλλονται από τη φύση και τη κλίμακα εργασιών παραγωγής Ανασκόπηση Ποιότητας του Προϊόντος Κάθε χρόνο πρέπει να γίνονται ανασκοπήσεις ποιότητας όλων των εγκεκριμένων φαρμακευτικών προϊόντων με σκοπό να επιβεβαιώνεται η συνοχή της υφιστάμενης διεργασίας, η καταλληλότητα των ισχυουσών προδιαγραφών τόσο για τις πρώτες ύλες όσο και για το τελικό προϊόν. Σκοπό έχει να τονίζονται τυχόν τάσεις και να εντοπίζονται οι βελτιώσεις του προϊόντος. Οι ανασκοπήσεις αυτές πρέπει να περιλαμβάνουν τα ακόλουθα: i. Ανασκόπηση των πρώτων υλών συμπεριλαμβανομένων και των υλικών συσκευασίας, ii. ανασκόπηση των κρίσιμων ελέγχων και των αποτελεσμάτων για το τελικό προϊόν, iii. ανασκόπηση όλων εκείνων των παρτίδων που απέτυχαν να ικανοποιήσουν τις προδιαγραφές, iv. ανασκόπηση όλων των σημαντικών αποκλίσεων ή μη συμμορφώσεων, v. ανασκόπηση όλων των αλλαγών, vi. ανασκόπηση των τροποποιήσεων της Άδειας Κυκλοφορίας, vii. ανασκόπηση όλων των αποτελεσμάτων από το πρόγραμμα παρακολούθησης της σταθερότητας και κάθε ανεπιθύμητης τάσης, viii. ανασκόπηση όλων των επιστροφών, ix. ανασκόπηση της επάρκειας κάθε άλλων προηγούμενων διορθωτικών ενεργειών, x. ανασκόπηση των δεσμεύσεων μετά την Άδεια Κυκλοφορίας, xi. η κατάσταση καταλληλότητας του σχετικού εξοπλισμού και των σχετικών παροχών, xii. ανασκόπηση των Τεχνικών Συμφωνιών. Ο παραγωγός και ο κάτοχος της αδείας κυκλοφορίας είναι εφικτό να είναι διαφορετικό πρόσωπο, σε αυτή την περίπτωση όμως θα πρέπει να υπάρχει σε εφαρμογή Τεχνική Συμφωνία μεταξύ των διαφόρων μερών η οποία να 24

38 καθορίζει τις αντίστοιχες υπευθυνότητες του ως προς την διεξαγωγή της ανασκόπησης ποιότητας του προϊόντος. Θα πρέπει να αξιολογούν τα αποτελέσματα αυτής της ανασκόπησης και να κρίνεται αν πρέπει να ληφθούν διορθωτικές και προληπτικές ενέργειες Διαχείριση Κινδύνου Ποιότητας Η ΔιαχείρισηΚινδύνου Ποιότητας είναι μια συστηματική διαδικασία για τη αξιολόγηση, τον έλεγχο, την επικοινωνία και την ανασκόπηση των κινδύνων στην ποιότητα του φαρμακευτικού προϊόντος και στην ορθή εφαρμογή των Κανόνων Καλής Παραγωγής. Μπορεί να εφαρμοσθεί και εκ των προτέρων και αναδρομικά. Οι αρχές της Διαχείρισης Κινδύνου Ποιότητας είναι οι εξής: Η αξιολόγηση του κινδύνου στην ποιότητα βασίζεται στην επιστημονική γνώση, στην εμπειρία σχετικά με την παραγωγική διεργασία και τελικά συνδέεται με την προστασία του ασθενούς (χρήστη φαρμακευτικού προϊόντος), το επίπεδο της προσπάθειας, της τυπικότητας και της τεκμηρίωσης της διεργασίας διαχείρισης του κινδύνου ποιότητας είναι ανάλογο του επιπέδου κινδύνου. [2, 3] 25

39 1.4 Μέθοδοι ανίχνευσης αντισωμάτων Εισαγωγή Ιστορία των αντισωμάτων Η πρώτη αναφορά σχετικά με τα αντισώματα έγινε από τον EmilVonBehring και τον ShibasaburaKitasato το 1890 σε μια δημοσίευση τους, όπου έδειχναν πως η μεταφορά ορού από ζώο το οποίο έχει εμβολιαστεί κατά της διφθερίτιδας, σε ζώο το οποίο είναι μολυσμένο, μπορεί να το θεραπεύσει. Ο Behring τιμήθηκε με βραβείο Nobel, αφού ύστερα από αυτή την ανακάλυψη ήρθε και η θεραπεία για τους ανθρώπους. Ως ένας από τους πατέρες της ανοσολογίας θεωρείται ο PaulEhrlich, ο οποίος το 1900 μίλησε για την θεωρία της πλευρικής αλυσίδας, ότι δηλαδή οι υποδοχές των κυττάρων συνδέονται με ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Ήταν από τους πρώτους που μίλησε για το μόριο του αντισώματος το οποίο αποτελείται από πολλές θέσεις, για την πρόσθεση ξένων υλικών, γνωστών σήμερα ως αντιγόνα και την ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Το 1948 ο AstridFagraeusπεριέγραψε ότι τα β-λεμφοκύτταρα εμπλέκονται στην παραγωγή αντισωμάτων. [26, 27] Αντιγόνο Ως αντιγόνο ορίζεται εκείνη η ουσία η οποία είναι ικανή να προκαλέσει ανοσολογική απόκριση και ειδικότερα την ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων για την καταπολέμηση της λοίμωξης του σώματος. Υπάρχουν δύο κύριες κατηγορίες αντιγόνων που αναγνωρίζονται, τα αντιγόνα και τα αυτό-αντιγόνα. Τα αντιγόνα μπορεί να προέρχονται από τμήματα ή ουσίες από ιούς ή μικροοργανισμούς (βακτήρια, πρωτόζωα) ή συστατικά ορού και ερυθρών αιμοσφαιρίων από άλλο άτομο. Κάθε αντιγόνο που επάγει μια ανοσολογική απόκριση δηλαδή προάγει την παραγωγή αντισωμάτων μέσω λεμφοκυττάρων ή επιτίθεται στο αντιγόνο άμεσα, ονομάζεται ανοσογόνο. [28] Αντίσωμα Αντισώματα ή ανοσοσφαιρίνες (IgG) είναι πρωτεΐνες του αίματος που παράγονται με την είσοδο ενός αντιγόνουστο αίμα. Αποτελούν το 20% των πρωτεϊνών του αίματος. Η κύρια δομή των αντισωμάτων είναι δύο όμοιες βαριές (H) πολυπεπτιδικές αλυσίδες και δύο όμοιες ελαφρές (L) πολυπεπτιδικές 26

40 αλυσίδες. Οι κύριες κατηγορίες των ανθρώπινων αντισωμάτων είναι: IgM, IgG, IgD, IgA και IgE. Η διαφορά τους είναι στην βαριά αλυσίδα μ, γ, δ, α και ε αντίστοιχα. Εξαιτίας των βαριών αλυσίδων τα αντισώματα αποκτούν ξεχωριστή διαμόρφωση με συνέπεια τις χαρακτηριστικές ιδιότητες. Τα IgM αντισώματα είναι η πρώτη κατηγορία αντισωμάτων που εκκρίνονται στο αίμα με την είσοδο ενός αντιγόνου. Χαρακτηριστικό αυτών των αντισωμάτων είναι η μεγάλη ικανότητα δέσμευσης των μικροοργανισμών. Τα IgM αντισώματα ενεργοποιούν τα μακροφάγα τα οποία είναι υπεύθυνα για τον εγκλωβισμό και την καταστροφή των βακτηρίων. Τα IgG αντισώματα είναι η μεγαλύτερη κατηγορία αντισωμάτων στο αίμα και γενικά στα ανθρώπινα υγρά. Τα αντισώματα αυτά έχουν την ιδιότητα να περνούν διαμέσου του πλακούντα από την μητέρα στο παιδί καθώς και από το μητρικό γάλα, με αυτή την διαδικασία το έμβρυο και το νεογνό προφυλάσσεται μέσω της επίκτητης ανοσίας. Τέλος, τα IgG αντισώματα ενεργοποιούν το σύστημα του συμπληρώματος, τα μακροφάγα καθώς είναι και υπεύθυνα για την εξουδετέρωση των τοξινών. Εικόνα 1.2: IgGvsIgM [ ] 27

41 Αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος Η περιοχή που αλληλεπιδρά το αντιγόνο με το αντίσωμα ονομάζεται επίτοπος. Η παραγωγή διαφορετικών αντισωμάτων οφείλεται στο ότι μπορεί ένα αντιγόνο να περιέχει πολλούς διαφορετικούς επιτόπους. Υπάρχει περίπτωση να βρεθούν όμοιοι ή παρόμοιοι επίτοποι και σε άλλα μη ομόλογα μόρια του ίδιου ή άλλου κυττάρου, αυτό οφείλεται στο ότι τα αντισώματα αναγνωρίζουν μικρές περιοχές του αντιγόνου. Η δέσμευση αντιγόνου-αντισώματος οφείλεται σε ομοιοπολικές αντιδράσεις, βρίσκοντας το σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος σε ισορροπία με ελεύθερα μόρια. Οι παράγοντες που επηρεάζουν τη σταθερότητα αυτού του συμπλόκου είναι η συγγένεια του αντισώματος για τον επίτοπο, το σθένος αντιγόνου και αντισώματος και τέλος η διαμόρφωση των μορίων στο χώρο. [29] Μέθοδοι προσδιορισμού λοιμογόνων παραγόντων Γενικά Στις μεθόδους προσδιορισμού λοιμογόνων παραγόντων, όσο αναφορά τα αντιγόνα, μπορούμε να έχουμε τις εξής περιπτώσεις: είτε ολόκληρο τον παθογόνο μικροοργανισμό, είτε ουσίες από το κυτταρικό τοίχωμα του, είτε ουσίες που εκκρίνονται από το μικροοργανισμό όπως τοξίνες, είτε κύτταρα από κυτταροκαλλιέργειες που έχουν προσβληθεί από τον λοιμογόνο παράγοντα. Στην επιλογή των αντισωμάτων για τις ορολογικές εξετάσεις έχουμε πολυκλωνικά ή μονοκλωνικά αντισώματα. Η παραγωγή των πολυκλωνικών αντισωμάτων γίνεται συνήθως σε ποντίκια ή κουνέλια. Ονομάζονται έτσι διότι στο τελικό αντιορό τα παραγόμενα IgG αντισώματα έχουν προέλθει από πολλούς διαφορετικούς κλώνους β-λεμφοκυττάρων με συνέπεια να αναγνωρίζουν πολλούς διαφορετικούς επιτόπους των αντιγόνων. Τα μονοκλωνικά αντισώματα αντιθέτως, παράγονται συνήθως σε ποντίκια, στα οποία γίνεται απομόνωση διακριτών κλώνων β-λεμφοκυττάρων καθένας εκ των οποίων παράγει ένα μόνο αντίσωμα, το οποίο αναγνωρίζει ένα μόνο επίτοπο. Το πλεονέκτημα των μονοκλωνικών αντισωμάτων είναι η μεγάλη τους ειδίκευση, 28

42 καθώς η πιθανότητα αντίδρασης με παρόμοιους επιτόπους άλλου αντιγόνου, είναι πολύ μικρή. Μέθοδοι προσδιορισμού λοιμογόνων παραγόντων: i. Συγκολλητινοαντιδράσεις, ii. ιζηματινοαντιδράσεις, iii. ανοσοφθορισμού, iv. ραδιοανοσολογικές, v. ανοσοενζυμικές. Συγκολητινοαντιδράσεις Συγκολητινοαντίδραση Latex: Στην δοκιμασία αυτή χρησιμοποιούνται αδρανή σφαιρικά σωμάτια πολυστυρενίου επικαλυμμένα με μονοκλωνικά αντισώματα. Έτσι, αν στο κλινικό δείγμα υπάρχει το υπό αναζήτησηαντιγόνο, σχηματίζεται σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος το οποίο είναι ορατό με γυμνό μάτι λόγω συγκόλλησης με τη μορφή κροκκίδωσης. Γενικά, υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός προσδιορισμός που γίνονται με την μέθοδο της συγκολλητινοαντίδρασης, όπως: i. ASTO, ii. mono-test iii. widal, iv. wright, v. le-test, vi. CRP, vii. VDRL, viii. RF. Ιζηματινοαντιδράσεις Ανοσοδιάχυση: Η ανοσοδιάχυση είναι μια μέθοδος προσδιορισμού της συγκέντρωσης ενός αντιγόνου. Υπάρχουν δύο μορφές της τεχνικής αυτής, η ακτινωτή και η διπλή. Η διπλή τεχνική αποτελεί ποιοτικό έλεγχος της ειδικότητας ενός Ag ή Ab. Η εφαρμογή της έχει περιοριστεί αλλά δεν έχει εξαλειφθεί λόγω του χαμηλού κόστους και του ελάχιστου εργαστηριακού εξοπλισμού που 29

43 απαιτεί. Η τεχνική αυτή επιτρέπει την εξέταση οποιουδήποτε υγρού του σώματος όπως αίμα, ούρα, ΕΝΥ κλπ. Η μέθοδος πραγματοποιείται σε ένα δίσκο ανοσοδιάχυσης που περιέχει ένα gel με κυκλικές τρύπες για την τοποθέτηση του ορού, έτσι η συγκέντρωση του αντιγόνου είναι ανάλογη του ορού προς το εμβαδόν του. Στα μειονεκτήματα της μεθόδου συγκαταλέγονται η χαμηλή ευαισθησία και ο υψηλός χρόνος και φυσικά ότι δεν μπορούμε να έχουμε πληροφορίες σχετικά με την δομή του αντιγόνου. Νεφελομετρία: Η νεφελομετρία είναι μία μέθοδος που μετράει την ένταση του φωτός που σκεδάζεται υπό ορισμένη γωνία προς το προσπίπτον φως όταν αυτό συναντά τα αιωρούμενα ανοσοσυμπλέγματα. Με την μέθοδο αυτή, γίνεται προσδιορισμός της συγκέντρωσης πρωτεϊνών, φαρμάκων, ορμονών καθώς και βιολογικών υγρών του ανθρώπου. Έχουμε δύο τύπους νεφελομετρικών μεθόδων α) τελικού σημείου και β) κινητική σταθερού χρόνου ή μέγιστης τιμής. Η ακτινωτή ανοσοδιάχυση έχει αντικατασταθεί από την νεφελομετρία για την μέτρηση εξετάσεων όπως είναι το συμπλήρωμα, ανοσοσφαιρίνη, CRP, RF, και ASTO. Θετικά: Αναλυτική ευαισθησία, ταχεία, εύκολη στη χρήση, απαιτεί μικρούς όγκους δείγματος, αιμολυμένα ή ικτερικά δείγματα δεν επηρεάζουν τα αποτελέσματα. Εξετάσεις: CRP, RF, ASTO, αντι DNA-άση στρεπτοκοκκίνη, μικρολευκωματίνη, ανοσοσφαιρίνες, πρωτείνες συμπληρώματος κ.α. 30

44 Ανοσοηλεκτροφόρηση: Η ανοσοηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό και ποιοτικό προσδιορισμό αντιγόνων και αντισωμάτων εφόσον διαθέτει σαν πλεονέκτημα την διαχωριστικής της ικανότητα. Η μέθοδος βασίζεται στην χαρακτηριστική κινητικότητα των αντιγόνων σε ηλεκτρικό πεδίο ως πολυπεπτίδια αλλά στην ικανότητα να καθιζάνουνσε πήκτωμα από άγαρ που περιέχει συγκεκριμένο αντίσωμα. Τα είδη ανοσοηλεκτροφόρησης είναι: Απλή ανοσοηλεκτροφόρηση, ανοσοκαθήλωση, ανοσοηλεκτροφόρηση πύραυλος, αντίθετη ανοσοηλεκτροφόρηση. Η τεχνική χρησιμοποιείται: για την ανίχνευση και την τυποποίηση μεμονωμένων συστατικών ενός δείγματος, για την αναγνώριση άτυπων πρωτεϊνών. Ανοσοφθορισμός Ανοσοφθορισμός είναι η διαδικασία εντόπισης αντιγόνου ή αντισώματος με ειδικό φθορίζον αντίσωμα. Η μέθοδος αποτελεί ποιοτικό έλεγχο, για αυτό τον λόγο μπορεί να συνδυαστεί με άλλες τεχνικές και να έχουμε ένα ποσοτικό αποτέλεσμα. Τα φθοριοχρώματα που χρησιμοποιούνται είναι ουσίες που όταν ακτινοβολούνται με φως μικρού μήκους κύματος εκπέμπουν ορατό φως μεγαλύτερου μήκους κύματος. Η τεχνική χρησιμοποιεί δυο τρόπους προσδιορισμού, τον άμεσο και τον έμμεσο. Στην άμεσο μέθοδο το σημασμένο ειδικό αντίσωμα τοποθετείται πάνω στο παρασκεύασμα που περιέχει το ομόλογο αντιγόνο, ενώ στην έμμεση μέθοδο τοποθετείται το μη σημασμένο αντίσωμα επί του υποστρώματος που περιέχει το αντιγόνο και με την προσθήκη αντισφαιρίνης σημασμένη με φθοριόχρωμα γίνεται ορατό το σύμπλεγμα. Γενικά, η ένταση του φθορισμού εξαρτάται: Την ένταση της διεγείρουσας ακτινοβολίας, τη συγκέντρωση του φθοριοχρώματος στο παρασκεύασμα. 31

45 1.4.3 Ανοσοενζυμική ανίχνευση αντισωμάτων Γενικά Η βασική αρχή των ανοσοενζυμικών μεθόδων, είναι ότι το ανοσογόνο ακινητοποιείται με ένα αντίσωμα. Στην συνέχεια, ένα δεύτερο σημασμένο αντίσωμα (conjugate) προσκολλάται στο αρχικό σύμπλεγμα αντιγόνου αντισώματος. Γενικά, οι ανοσοενζυμικές δοκιμασίες συνδυάζουν την εξειδίκευση των αντισωμάτων με την ευαισθησία των απλών ενζυμικών δοκιμών. Μερικοί από τους σημαντικότερους ανοσοενζυμικούς μεθόδους είναι: ELISA, SFIA, RIA, EIA, CIA, ICMA, FPIA,EMIT, ECL, IRMA, RIST, PACIA κ.α. Τα σημαντικότερα ένζυμα που χρησιμοποιούνται στους ανοσοενζυμικούς προσδιορισμούς είναι η υπεροξειδάση της αγριοραπανίδας και η αλκαλική φωσφατάση. Η ELISA έχει δυο κύριες παραλλαγές: Αρχικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση της παρουσίας αντιγόνων τα οποία αναγνωρίζονται από ένα αντίσωμα ή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο αντισωμάτων που αναγνωρίζουν ένα αντιγόνο. Σε σύγκριση με άλλους ανοσοενζυμικούς προσδιορισμούς, η ELISA έχει πολλά πλεονεκτήματα, με κύρια την υψηλή ευαισθησία λόγω του ενζύμου και μεγάλη ειδικότητα λόγω της επιλεκτικότητας του αντισώματος ή του αντιγόνου. Sandwich ELISA Η τεχνική sandwich ELISA χρησιμοποιείται σχετικά λιγότερο σε σχέση με τις υπόλοιπες μεθόδους ELISA, παρόλο που γίνεται ποσοτικός προσδιορισμός και έχει υψηλή αποτελεσματικότητα στην ανίχνευση του αντιγόνου. Γενικά, το προς μέτρηση αντιγόνο πρέπει να περιέχει τουλάχιστον δύο επιτόπους για την ικανή πρόσδεση των αντισωμάτων. Τα αντισώματα μπορεί να είναι είτε μονοκλωνικά είτε πολυκλωνικά. Στα θετικά ανήκουν η υψηλή ειδικότητα, υψηλή ευαισθησία και είναι κατάλληλη για σύνθετα δείγματα αφού το αντιγόνο δεν απαιτεί καθαρισμό πριν από την μέτρηση. Διαδικασία: Γίνεται προετοιμασία μιας πλάκας στην οποία είναι προσδεμένα γνωστής ποσότητας αντισώματα, 32

46 εφαρμογή δείγματος που περιέχει το υπό αναζήτηση αντιγόνο, πλύσιμο πλάκας για απομάκρυνση τυχόν μη προσδεμένων αντιγόνων, εφαρμογή δεύτερων αντιγόνων ανιχνευτών, πλύσιμο πλάκας, εφαρμογή χημικής ουσίας που χρωματίζει το ένζυμο, μέτρηση απορρόφησης. Εικόνα 1.3: SandwichELISA [ Ανταγωνιστική ELISA Σε περίπτωση που το αντιγόνο μας δεν διαθέτει περισσότερους από ένα επιτόπους ή θέλουμε ποσοτική μέτρηση του αντιγόνου αλλά διαθέτουμε μόνο ένα αντίσωμα, τότε εφαρμόζουμε την ανταγωνιστική τύπου ELISA. Στην μέθοδο αυτή το προς μέτρηση αντιγόνο και το επισημασμένο αντιγόνο, ανταγωνίζονται για την σύνδεση τους σε συγκεκριμένη ποσότητα αντισώματος που έχει καθηλωθεί στην πλάκα. Εικόνα 1.4: Ανταγωνιστική ELISA [ 33

47 Έμμεση ELISA Στην περίπτωση της έμμεσης ELISA έχουμε στην πλάκα μας καθηλωμένο το αντιγόνο και στην συνέχειαγίνεται επώαση με το εξεταζόμενο δείγμα. Η ύπαρξη των αντισωμάτων έναντι των αντιγόνων στο εξεταζόμενο δείγμα ανιχνεύεται με τη χρήση ενός αντί-αντισώματοςσυζευγμένο με ένζυμο. Η ποσότητα που θα προσκολληθεί στο σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος του πρώτου σταδίου θα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του υπό εξέταση αντισώματος στο δείγμα. [9, 26, 27, 28, 30, 31] Εικόνα 1.5: Έμμεση ELISA [ 1.5 Διαγνωστικές τεχνικές Εφαρμογή μεθόδου ELISA στη διάγνωση τετάνου (Clostridium tetani), διφθερίτιδας (Corynebacterium diptheriae) και κοκκύτη (Bordetella pertussis) Clostridium tetani Τα βακτήρια του γένους Clostridium είναι Gram θετικοί βάκιλοι, αναερόβιοι και σπορογόνοι. Συνήθως υπάρχουν στο φυσικό περιβάλλον. Για παράδειγμα, εντοπίζονται στη σκόνη, το έδαφος, το νερό, σε ιζήματα του βυθού και σε ανθρώπινους και ζωικούς πεπτικούς σωλήνες. Είναι κατά βάση παθογόνοι 34

48 μικροοργανισμοί αλλά παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλά πεδία της βιομηχανικής παραγωγής μεταβολιτών. Πολλά από τα είδη του γένους αυτού έχουν δυσμενείς επιδράσεις στα τρόφιμα και την υγεία του ανθρώπου. Από τα πιο γνωστά είναι το C. botulinum, που προκαλεί αλλαντίαση, το C. difficile, που προκαλεί νοσοκομειακές λοιμώξεις που συνδέονται με το φαγητό και το C. perfingers, που προκαλεί αέριο γάγγραινα και είναι η αιτία σοβαρής τροφικής δηλητηρίασης. Γνωστό και εξίσου επικίνδυνο είναι το C.t etani, που προκαλεί τέτανο. Αυτό εισέρχεται στον οργανισμό μέσω πληγής και τα σπόρια του αρχίζουν να αναπτύσσονται. Παράγονται τοξίνες και μεταδίδονται μέσω αίματος και των λεμφαγγείων. Ο τέτανος χαρακτηρίζεται από γενικευμένη ακαμψία και σπασμούς των σκελετικών μυών. Όλα τα παιδία εμβολιάζονται κατά του τετάνου σε μικρή ηλικία, μέσω του τριπλού εμβολίου. Ο εμβολιασμός αυτός προσφέρει ανοσία στον τέτανο για αρκετά χρόνια και χρειάζεται ανανέωση ανά δέκα περίπου έτη. [13, 32] Εικόνα 1.6:Clostridium tetani [ Corynebacterium diptheriae To C. Diptheriae είναι ένα αναερόβιος Gram θετικός βάκιλος. Η παραγωγή τοξίνης γίνεται μόνο όταν ένας ορισμένος ιός (βακτηριοφάγος), που φέρει τη γενετική πληροφορία για την τοξίνη, προσβάλλει το βάκιλο και ακολουθεί 35

49 λυσογονία. Έχει τέσσερις βιότυπους: gravis, intermedius, mitisand, belfanti. Όλοι τους μπορούν να παράγουν τοξίνη και να προκαλέσουν σοβαρή ασθένεια. Η διφθερίτιδα αποτελεί οξεία λοιμώδη κατάσταση, που προκαλείται από το C. Diptheriae και κάποτε αποτελούσε την κύρια αιτία θανάτου των παιδιών. Μεταδίδεται μέσω της αναπνευστικής οδού. Οι περισσότερες επιπλοκές της διφθερίτιδας αποδίδονται στις επιδράσεις της τοξίνης. Η σοβαρότητα της ασθένειας εξαρτάται από την έκταση της τοπικής νόσου. Όταν η τοξίνη απορροφάται, επηρεάζει τα όργανα και τους ιστούς, που βρίσκονται μακριά από την εστία μόλυνσης. Οι πιο συχνές επιπλοκές της διφθερίτιδας είναι η μυοκαρδίτιδα και η νευρίτιδα. Άλλες είναι η ωτίτιδα και η αναπνευστική ανεπάρκεια, λόγω απόφραξης του αεραγωγού, εντοπίζονται συνήθως στα βρέφη. Το εμβόλιο για την διφθερίτιδα, όπου συνδυάζεται με του κοκκύτη και του τετάνου γίνεται σε παιδία από 6 μηνών έως 6 ετών. [14,33] Εικόνα 1.7: Corynebacterium diptheriae [ 36

50 Bardetella pertussis Τα είδη της Bortedella είναι Gram αρνητικοί κόκκοι, μη σπορογόνα βακτήρια με καψίδιο. Το γένος αποτελείται από το B. pertussis, το Β. parapertussis, το B. bronchiseptica και B. avium, που προκαλούν ενζωοτικές μολύνσεις σε άγρια και οικόσιτα ζώα. Η B. Pertussisείναι το κλασικό αίτιο για κοκκύτη και υπάρχει μόνο σε όσους νοσούν. Η B. pertussis προκαλεί το 5-20% μιας πιο ήπιας και συχνά αφανούς μορφής του κοκκύτη. Ο κοκκύτης είναι μια βακτηριακή λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος. Είναι μια υψηλά μεταδοτική παιδική ασθένεια, που εμφανίζεται σπάνια σε ενήλικες. Μεταδίδεται μέσω της αναπνευστικής οδού. Η διάγνωση πρέπει να γίνεται μόνο σε ασθενείς με συμπτώματα όμοια με του κοκκύτη, όπως παρατεταμένος βήχας με παροξυσμούς και αίσθηση πνιγμού. Ωστόσο, μπορεί ο παρατεταμένος βήχας να είναι μοναδικό σύμπτωμα. Σε αυτή την περίπτωση, πρέπει να γίνονται εργαστηριακές εξετάσεις για την επιβεβαίωση της διάγνωσης του κοκκύτη. Η B. Pertussis έχει την ικανότητανα κολλάει στους κροσσούς των κυττάρων των βλεννογόνων του αναπνευστικού συστήματος. Οι φραγμοί του κυτταρικού τοιχώματος του βακτηρίου αναστέλλουν την κίνηση των κροσσών του βλεννογόνου της τραχείας. Μετά από μια περίοδο επώασης μιας έως τριών εβδομάδων η ασθένεια περνάει από τρείς φάσεις. Ο κοκκύτης ακολουθείται από φυσική επίκτητη ανοσία που είναι μεγάλης διάρκειας αλλά όχι μόνιμη. Στις περισσότερες χώρες συστήνεται εμβολιασμός με ενεργή ανοσία που οδηγεί σε προστασία 90% για 3-12 χρόνια. Συνήθως ο εμβολιασμός συνδυάζεται με τοξοειδή διφθερίτιδας και τετάνου. [34, 35] 37

51 Εικόνα 1.8: Bordetella pertussis [ Αρχή μεθόδου ELISA Ο ποσοτικός προσδιορισμός των IgG και IgM αντισωμάτων έναντι της Bordetella pertussis και των IgG αντισωμάτων έναντι του Clostridium tetani και του Corynebacterium diptheriae βασίζεται στην τεχνική ELISA. Τα πηγαδάκια (wells) είναι επιστρωμένα με τα αντίστοιχα αντιγόνα για να δεθούν με τα αντίστοιχα αντισώματα του δείγματος. Μετά το πλύσιμο των πηγαδιών για την απομάκρυνση των μη συζευγμένων δειγμάτων, προστίθεται διάλυμα συζεύγματος με αντί-ανθρώπινα IgG και IgM σημασμένα με υπεροξειδάση HRP (horse radish peroxidase). Αυτό το διάλυμα συζεύγματος προσδένεται στα ειδικά αντισώματα που βρίσκονται στον υπό εξέταση ορό. Το ανοσοσύμπλεγμα που φτιάχνεται από το δεμένο conjugate γίνεται ορατό με την προσθήκη υποστρώματος. Η ένταση αυτού του προϊόντος είναι ανάλογη της ποσότητας των IgG και IgM αντισωμάτων έναντι των βακτηρίων ή των τοξινών τους. Προστίθεται σουλφουρικό οξύ για την διακοπή της αντίδρασης στην ELISA για τον κοκκύτη και υδροχλωρικό οξύ στην ELISA για τον τέτανο και τη διφθερίτιδα. Παράγεται ένα κίτρινο χρώμα. Φωτομετρούμε σε ειδικό φωτόμετρο για πλάκες ELISA στα 450 nm για τον κοκκύτη και στα 492 nm με φίλτρο αναφοράς τα 620 nm. [36] 38

52 Ανάπτυξη εσωτερικής μεθόδου Απαραίτητος εξοπλισμός Σκοπός Σκοπός της εργασίας αυτής είναι να περιγράψει πλήρως τη μέθοδο και τον τρόπο με τον οποίο εκτελείται η ανάλυση δειγμάτων για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων με τη χρήση της τεχνικής ELISA καθώς και να γίνει αξιολόγηση εσωτερικού ελέγχου για την αξιοπιστία της μεθόδου αυτής. Εξοπλισμός Υλικά/Αντιδραστήρια Πλάκα με επιστρωμένο αντιγόνο τετάνου, διάλυμα αραίωσης (Diluent solution), διάλυμα υποστρώματος (Substrate solution), διάλυμα πλύσης (Washing buffer), διάλυμα τερματισμού (HCI- Stop solution), Conjugate (πολυκλωνικά αντί-ανθρώπινα αντισώματα IgG), ταμπλέτες O.P.D, H 2 O 2, θετικός και αρνητικός μάρτυρας για τέτανο. Όργανα Επωαστικός κλίβανος (37 ο C), πιπέτες των 1000 μl, μl, 2-20 μl και πολυκάναλες (διακριβωμένες), ρύγχη των 100 μl, μl και των 300 μl για πολυκάναλη, πλαστικοί σωλήνες των 50 ml, μηχάνημα vortex, στατώ σωληναρίων, δοκιμαστικοί σωλήνες, χρονόμετρο, αυτοκόλλητες ταινίες, φωτόμετρο (διακριβωμένο). 39

53 Πίνακας 4: Συνθήκες μεθόδου Θερμοκρασία δωματίου Θερμοκρασία επωαστικού κλιβάνου Απαιτούμενος όγκος σε κάθε πηγαδάκι Συνθήκες δειγμάτων/αντιδραστηρίων στο χώρο του εργαστηρίου πριν την ανάλυση Μέγιστο χρονικό περιθώριο για την ανάλυση δειγμάτων με χρονική καθυστέρηση 25 ο C 37 o C 100 μl Θερμοκρασία δωματίου 25 ο C 15 λεπτά Περιγραφή inhouse μεθόδου Εισαγωγή Το εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, για την διάγνωση των IgG αντισωμάτων έναντι του τετάνου, εφαρμόζει την ανοσοδιαγνωστική μέθοδο της ELISA. Η μέθοδος αποτελεί μια inhouse τεχνική η οποία χρησιμοποιείται από το 1990 και δεν έχει βασιστεί σε κάποιο εξωτερικό kit του εμπορίου αλλά αντιθέτως έχει αναπτυχθεί εξ ολοκλήρου από το εργαστηριακό προσωπικό, με πειράματα και στατιστικές αναλύσεις χρόνων. Ο τύπος της ELISA τεχνικής που χρησιμοποιείται είναι ο έμμεσος τρόπος. Το καθηλωμένο αντιγόνο στις πλάκες αποτελεί τετανική αδρανοποιημένη τοξίνη. Η τεχνική αυτή συγκρίθηκε και με τεχνικές του εμπορίου για την αξιολόγηση της αξιοπιστίας της. Όσον αφορά τα χρησιμοποιούμενα διαλύματα: Το αραιωτικό διάλυμα (Diluent Solution) παρασκευάζεται από το εργαστήριο. Η σύνθεση του αποτελείται από 1% BSA σε PBS + 0,1% tween 20. To PBS αποτελείται από NaCl, KCl, Na 2 HPO 4, KH 2 PO 4 και Thiomersal, το conjugate solution δεν παρασκευάζεται από το εργαστήριο αλλά αποτελείται από 1 ml anti-human IgG σε 1000 ml diluent ssolution (όπως προβλέπει ο παρασκευαστής), το washing buffer παρασκευάζεται από το εργαστήριο και αποτελείται από NaCl, Thiomersal και tween 20, 40

54 το substrate buffer παρασκευάζεται από το εργαστήριο και αποτελείται από κιτρικό οξύ, Na 2 HPO 4.12H 2 Oγια την ολοκλήρωση του απαιτείται η προσθήκη Ο.P.D και H 2 O 2, το διάλυμα τερματισμού αποτελείται από HCl του εμπορίου αραιωμένο με H 2 O. Διαδικασία 1. Συγκεντρώνουμε στον πάγκο εργασίας τα δείγματα (οροί), τους μάρτυρες και το διάλυμα αραίωσης (Diluent solution) για να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου, 2. πλένουμε την πλάκα με την πολυκάναλη πιπέτα βάζοντας 300 μl διάλυμα πλύσης (washing buffer) επί 3 ς φορές, 3. αναποδογυρίζουμε την πλάκα και την χτυπάμε σε απορροφητικό χαρτί για να απομακρύνουμε τυχόν υπολείμματα, 4. σχεδιάζουμε πάνω στην πλάκα το πρωτόκολλο βάσει των δειγμάτων που πρόκειται να ελεγχθούν, 5. τοποθετούμε στο στατώ από ένα σωληνάριο για κάθε μάρτυρα και κάθε δείγμα, δίπλα στον αντίστοιχο ορό και σημαίνουμε τα σωληνάρια, 6. κάνουμε αραίωση των δειγμάτων και των μαρτύρων 1/200, βάζοντας στο αντίστοιχο σωληνάριο 1 ml διαλύματος αραίωσης και 5 μl ορό, 7. βάζουμε από 100 μl αραιωτικό διάλυμα σε όλα τα πηγαδάκια της πλάκας, εκτός από την πρώτη σειρά και τις πρώτες δύο στήλες, 8. αναδεύουμε με το vortex και προσθέτουμε τους μάρτυρες και τα δείγματα στις πρώτες δύο σειρές,σύμφωνα με το πρωτόκολλο, από 100 μl, 9. κάνουμε διαδοχικές αραιώσεις ξεκινώντας από την δεύτερη σειρά, που έχει αραίωση 1/400, γίνεται ανάδευση 10 φορές, παίρνοντας 100 μl προχωράμε κάθετα εφαρμόζοντας την ίδια διαδικασία μέχρι την τελευταία σειρά που έχουμε αραίωση 1/ Την τελευταία ποσότητα που περιέχεται στα tips την πετάμε, 10. καλύπτουμε την πλάκα με αυτοκόλλητη μεμβράνη και την τοποθετούμε στον επωαστικό κλίβανο στους 37 ο C για μια ώρα, 11. ρυθμίζουμε το χρονόμετρο στη 1 ώρα, 41

55 12. πλένουμε την πλάκα με την πολυκάναλη πιπέτα βάζοντας 300 μl διάλυμα πλύσης (washing buffer) επί 3 ς φορές, 13. αναποδογυρίζουμε την πλάκα και την χτυπάμε σε απορροφητικό χαρτί για να απομακρύνουμε τυχόν υπολείμματα, 14. ετοιμάζουμε το conjugate κάνοντας αραίωση 1/6000 του conjugate σε diluents solution. Βάζουμε δηλαδή σε έναν πλαστικό σωλήνα 18 ml αραιωτικό διάλυμα και 3 μl conjugate, κάνουμε ανάδευση (vortex) το διάλυμα αυτό, 15. προσθέτουμε σε όλες τις θέσεις από 100 μl conjugate, εκτός από την πρώτη στήλη, 16. τοποθετούμε την αυτοκόλλητη ταινία και επωάζουμε στους 37 ο C για 1 ώρα. 17. πλένουμε την πλάκα με την πολυκάναλη πιπέτα βάζοντας 300 μl διάλυμα πλύσης (washing buffer) επί 3 ς φορές, 18. αναποδογυρίζουμε την πλάκα και την χτυπάμε σε απορροφητικό χαρτί για να απομακρύνουμε τυχόν υπολείμματα, 19. ετοιμάζουμε το substrate, κάνοντας αραίωση σε substratebuffer. Σε ένα πλαστικό σωλήνα βάζουμε 10 ml substrate buffer, 1 ταμπλέτα O.P.D. και 2 μlh 2 O 2, 20. προσθέτουμε 100 μl substrate σε όλα τα πηγαδάκια και αφήνουμε την πλάκα για επώαση σε σκοτεινό μέρος για 10 λεπτά, 21. τοποθετούμε από 50 μl διάλυμα τερματισμού σε όλα τα πηγαδάκια, 22. φωτομετρούμε στα 492 nm με φίλτρο αναφοράς τα 620 nm Ερμηνεία αποτελεσμάτων Πρόκειται για μία ημιποσοτική μέθοδο. Θεωρούμε ένα δείγμα θετικό όταν έχουμε μια απορρόφηση πάνω 300. Έτσι, όσο ανεβαίνει το επίπεδο αραίωσης και η απορρόφηση παραμένει πάνω από 300, σημαίνει ότι το δείγμα μας περιέχει υψηλό τίτλο IgG αντισωμάτων. Ως αποτέλσμα/απάντηση δίνουμε την τελευταία αραίωση που είχαμε απορρόφηση πάνω από 300. Δηλαδή, αν για παράδειγμα σε ένα δείγμα βλέπουμε πωςστην αραίωση 1/3200 έχουμε μια απορρόφηση 371 και στην αμέσως επόμενη αραίωση όπου είναι η 1/

56 έχουμε 198 θα δώσουμε ως απάντηση Γενικά σε όσο πιο μεγάλη αραίωση έχουμε θετικό αποτέλεσμα, σημαίνει ότι ο ασθενής έχει εμβολιαστεί σχετικά πρόσφατα, ενώ με την πάροδο των χρόνων έχουμε θετικό αποτέλεσμα σε μικρότερες αραιώσεις. Η ισχύς του εμβολίου διαρκεί περίπου 10 χρόνια. Η ίδια ακριβώς διαδικασία εφαρμόζεται και για τον προσδιορισμό IgG αντισωμάτων έναντι της διφθερίτιδας. Εικόνα 1.9: Substrate buffer και Diluent Solution Εικόνα 1.10: IgG αντισώματα 43

57 Εικόνα 1:11: O.P.D. Εικόνα 1.12: Πλάκα τετάνου ELISA Εικόνα 1.13:Επωαστικός κλίβανος 44

58 Εικόνα 1.14: Πίπετες eppendorf (πολυκάναλη, 2 20 μl, μl, 1000 μl) Εικόνα 1.15: Vortex Εικόνα 1.16: Φωτόμετρο 45

59 2.1.4 Περιγραφή διαδικασίας ποσοτικής μεθόδου IVD kit 1. Συγκεντρώνουμε στον πάγκο εργασίας τα kit και τα δείγματα (οροί) ώστε να έρθουνσε θερμοκρασία δωματίου, 2. σχεδιάζουμε το πρωτόκολλο βάσει των δειγμάτων που πρόκειται να ελεγχθούν, 3. κάνουμε αραίωση του κάθε δείγματος 1/100, βάζοντας 1 ml διαλύματος αραίωσης και 10 μl δείγμα, 4. κάνουμε vortex και τοποθετούμε με βάσει το πρωτόκολλο μας 100 μl από το εκάστοτε δείγμα, calibration (1,2,3,4,5), αρνητικό και θετικό μάρτυρα, 5. καλύπτουμε την πλάκα με την αυτοκόλλητη μεμβράνη και την τοποθετούμε στον επωαστικό κλίβανο για 1 ώρα στους 37 ο C, 6. απορρίπτουμε το περιεχόμενο της πλάκας και πλένουμε 3 φορές με 300 μl διάλυμα πλύσης, 7. αναποδογυρίζουμε την πλάκα και την χτυπάμε σε απορροφητικό χαρτί για να απομακρύνουμε τυχόν υπολείμματα, 8. συμπληρώνουμε σε κάθε πηγαδάκι από 100 μlconjugate, 9. καλύπτουμε πάλι την πλάκα με την ταινία και την αφήνουμε για επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, 10. απορρίπτουμε το περιεχόμενο της πλάκας και πλένουμε 3 φορές με 300 μl διάλυμα πλύσης, 11. αναποδογυρίζουμε την πλάκα και την χτυπάμε σε απορροφητικό χαρτί για να απομακρύνουμε τυχόν υπολείμματα, 12. προσθέτουμε 100 μl Substrate, 13. αφήνουμε την πλάκα σε σκοτεινό χώρο σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά ακριβώς, 14. προσθέτουμε 100 μl Stop Solution, 15. προετοιμάζουμε το φωτόμετρο, και φωτομετρούμε στα 450 nm στο αντίστοιχο πρόγραμμα που έχουμε περάσει. Αποτελέσματα Αν η συγκέντρωση του δείγματος είναι: < 0,1 IU/mL συνιστάται η χορήγηση εμβολίου λόγω έλλειψης αντισωμάτων, 46

60 0,1-0,5 IU/mL έχει ξεκινήσει η ανοσολογική απόκριση για παραγωγή αντισωμάτων, > 0,5-1,1 IU/mL το εμβόλιο έχει ακόμη διάρκεια 2-5 χρόνια, > 1,1-5,0 IU/mL το εμβόλιο έχει ακόμη διάρκεια 5-10 χρόνια, > 5,0 IU/mL το εμβόλιο έχει περίπου διάρκεια 10 χρόνων. Εικόνα 1.17: Πλάκα ELISA Εικόνα 1.18: Calibrations 47

61 Εικόνα 1.19: Controls (θετικόςαρνητικόςμάρτυρας), conjugate, substrate και stop solution Εικόνα 1.17: Ψαροκόκκαλο μεθόδου ELISA Η επιτυχής διεξαγωγή της μεθόδου ELISA στηρίζεται στα παρακάτω: Κατά την αιμοληψία πρέπει ναγίνει προσεκτικά και σωστά η φλεβοπαρακέντηση, η φυγοκέντρηση να γίνει σε ορισμένο χρόνο αλλά και στροφές, οι πιπέτες που χρησιμοποιούνται στην μέθοδο πρέπει να είναι διακριβωμένες, ο χειριστής να ακολουθεί πιστά το πρωτόκολλο, το φωτόμετρο να είναι διαπιστευμένο, ο επωαστικός κλίβανος να είναι διακριβωμένος και να ελέγχεται η θερμοκρασία του με διακριβωμένο θερμόμετρο (data logger), 48

62 τα kit δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται μετά την ημερομηνία λήξης τους, θα πρέπει να ελέγχεται η λειτουργία του θετικού και του αρνητικού μάρτυρα. 2.2 Έλεγχος ποιότητας Σκοπός Είναι η περιγραφή των τρόπων με τους οποίους πραγματοποιείται ο έλεγχος ποιότητας των δοκιμών που εκτελούνται από το εργαστήριο, καθώς και των κριτηρίων που έχει θέσει το εργαστήριο προκειμένου να αξιολογήσει τα αποτελέσματα των ελέγχων και να προβεί στην ανάληψη διορθωτικών ενεργειών εάν χρειαστεί. Περιγραφή Ο έλεγχος της ποιότητας των δοκιμών διακρίνεται σε εξωτερικό έλεγχο και σε εσωτερικό έλεγχο Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας Ο εξωτερικός έλεγχος ποιότητας αποτελεί τον πλέον αντικειμενικό, αμερόληπτο και ανεξάρτητο τρόπο απόδειξης ότι μία εκτελούμενη μέθοδος είναι κατάλληλη για τη σκοπούμενη χρήση. Πρόκειται ουσιαστικά για έλεγχο ορθότητας (trueness) της μεθόδου και αναπόσπαστο τμήμα των ενεργειών επικύρωσης ή επαλήθευσης μιας μεθόδου ανάλυσης. Ο προγραμματισμένος εξωτερικός έλεγχος ποιότητας είναι υποχρεωτικός για εργαστήρια που διαπιστεύουν μεθόδους δοκιμών κατά ISO 17025:2005 (πρότυπο διαπίστευσης μεθόδων δοκιμών) ή ISO 15189:2012 (πρότυπο διαπίστευσης κλινικών δοκιμών και διαγνωστικών εξετάσεων) και οι επιμέρους απαιτήσεις περιράφονται σε κατάλληλη γραπτή καθοδήγηση του Φορέα Διαπίστευσης (ΕΣΥΔ ΚΟ ΠΔΙ). Επισημαίνεται ότι δεν παρέχεται διαπίστευση σε εργαστηρία για μεθόδους όπου δεν υφίστανται τεκμηριωμένα επιτυχή αποτελέσματα συμμετοχής σε εξωτερικό έλεγχο ποιότητας. Συνήθως ο εξωτερικός έλεγχος ποιότητας πραγματοποιείται με τη συμμετοχή, τουλάχιστον μια φορά ανά έτος, του εργαστηρίου σε σχήματα δοκιμών ικανότητας ή διεργαστηριακά σχήματα για κάθε κατηγορία δοκιμών 49

63 ή/και διακριτή δοκιμή που εκτελεί. Ο οργανισμός που διοργανώνει το σχήμα πρέπει να είναι διαπιστευμένος από τον Εθνικό ή ισοδύναμο φορέα διαπίστευσης, βάσει του Προτύπου ISO 17043:2010. Ο οργανισμός που διοργανώνει το σχήμα δοκιμών ικανότητας, αποστέλει στα συμμετέχοντα εργαστήρια ένα δείγμα γνωστής τιμής προσδιοριστέας παραμέτρου (αληθής τιμή) την οποία δεν αποκαλύπτει. Τα διάφορα εργαστήρια αναλύουν το δείγμα είτε με την ίδια μέθοδο (εφόσον την καθορίζει και την απαιτεί ο διοργανωτής), είτε με διαφορετική μέθοδο και ανάλογα με ποιά εφαρμόζουν και αποστέλουν με τη σειρά τους τα αποτελέσματα στον διοργανωτή εντός συγκεκριμένου χρονικού περιθωρίου. Ο διοργανωτής λαμβάνει και επεξεργάζεται στατιστικά τα αποτελέσματα όλων τωνεργαστηρίων που συμμετέχουν και συνήθως αξιολογεί την επίδοση κάθε εργαστηρίου ανά δοκιμή, με μια στατιστική παράμετρο η οποία ονομάζεται Z-score = x μ / s, όπου x είναι η τιμή που έδωσε το εργαστήριο, μ είναι η γνωστή αληθής τιμή του δείγματος και s είναι η τυπική απόκλιση όλων των αποτελεσμάτων που έστειλαν όλα τα συμμετέχοντα εργαστήρια. Τα κριτήρια για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων είναι τα ακόλουθα: Ζ 2 ικανοποιητικό και αποδεκτό αποτέλεσμα (επιτυχής συμμετοχή) 2 < Ζ < 3 αποδεκτό αποτέλεσμα που χρήζει όμως διερεύνησης (επιτυχής συμμετοχή) Ζ 3 μη ικανοποιητικό αποτέλεσμα (αποτυχία) Επισημαίνεται ότι τα ανωτέρω αφοορύν ποσοτικόυς και ημιποςοτικούς προσδιορισμούς. Τα κριτήρια αξιολόγησης συμμετοχών για ποιοτικούς προσδιορισμούς είναι διαφορετικά και συνήθως περιλαμβάνουν αριθμό δειγμάτων που διανέμονται και απαίτηση για σωστό ποιοτικό προσδιορισμό/χαρακτηρισμό σε όλα τα δείγματα. Σε περίπτωση που το αποτέλεσμα χρήζει διερεύνησης, το εργαστήριο συνεχίζει να διεξάγει τις δοκιμές, ενώ παράλληλα διερευνούμε την πιθανή ύπαρξη μη συμμορφώσεων ή άλλων προβλημάτων. Σε περίπτωση μη ικανοποιητικού αποτελέσματος, αναστέλλεται η έκδοση εκθέσεων δοκιμών/πιστοποιητικών αναλύσεων και διερευνώνται οι παράγοντες που μπορεί να επηρεάζουν την αξιοπιστία της δοκιμής. Η 50

64 επιβεβαίωση για την άρση τυχόν μη συμμόρφωσης επιτυγχάνεται μέσω τουκαθιερωμένου εσωτερικού ελέγχου ποιότητας της δοκιμής. Σε κάθε περίπτωση πάντως το εργαστήριο φροντίζει για την άμεση εκ νέου συμμετοχή του στο σχήμα δοκιμών ικανότητας. Στις περιπτώσεις όπου δεν είναι δυνατή η εξεύρεση επίσημου και διαπιστευμένου σχήματος διεργαστηριακής σύγκρισης, σχετικού με τις υπό εκτέλεση δοκιμές, το εργαστήριο επιδιώκει την οργάνωση σύγκρισης με άλλα διαπιστευμένα εργαστήρια. Στη περίπτωση αυτή, την ευθύνη της προετοιμασίας των δειγμάτων και της στατιστικής επεξεργασίας των αποτελεσμάτων της σύγκρισης έχει ένα από τα συμμετέχοντα διαπιστευμένα εργαστήρια. Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας διερευνήθηκε η ύπαρξη διαπιστευμένου σχήματος δοκιμών ικανότητας για τη συγκεκριμένη εσωτερική in house μέθοδο που εξετάσαμε και εντοπίστηκε κατάλληλος διοργανωτής στη Γερμανία (INSTADT GmbH). Όμως επειδή η προγραμματισμένη ετήσια διανομή δείγματος δεν συνέπιπτε με τις ημερομονιακές απαιτήσεις ολοκλήρωσης της εργασίας, δεν κατέστη εφικτός ο αντίστοιχος εξωτερικός έλεγχος ποιότητας της μεθόδου. Αντ αυτού αποφασίστηκε η αξιολόγηση κρίσιμων παραμέτρων επικύρωσης της ημιποσοτικής μεθόδου ELISA μέσω σύγκρισης με ποσοτική εμπορική μέθοδο (IVD kit) που αν και δεν είναι πρότυπη, εντούτοις είναι πλήρως επικυρωμένη από τον κατασκευαστή και ως εκ τούτου θεωρείται επαρκώς αξιόπιστη. Η χρήση του τύπου του Z-score για τα αποτελέσματα μετρούμενων απορροφήσεων μεταξύ των δύο μεθόδων και ανά εξεταζόμενο επίπεδο αραίωσης, επέτρεψε τον αξιόπιστο έλεγχο ορθότητας της inhouse μεθόδου Εσωτερικός έλεγχος ποιότητας Ο Εσωτερικός Έλεγχος Ποιότητας συνιστάται στη συστηματική παρακολούθηση της μεθόδου και της σωστής εκτέλεσης των αναλύσεων, ώστε να εξασφαλίζεται η ακρίβεια και η σταθερότητα των παραγομένων αποτελεσμάτων, από το ίδιο το εργαστήριο. Ο σκοπός είναι να τεκμηριώνεται ότι τα εκδιδόμενα αποτελέσματα παραμένουν υπό επαρκή στατιστικό έλεγχο. Ο Εσωτερικός Ελέγχος Ποιότητας σε 51

65 ένα εργαστήριο δοκιμών επιτυγχάνεται με χρήση κατάλληλων τεχνικών, ανάλογα με τη φύση της κάθε μεθόδου και με τρόπο πουνα εντοπίζονται και να αναιρούνται οι αιτίες που προκαλούν τα σφάλματα, κατά την διάρκεια της αναλυτικής διαδικασίας. Οι τεχνικές, οι οποίες εφαρμόζονται για την επίτευξη αυτού του σκοπού και ειδικότερα για μεθόδους ποσοτικού προσδιορισμού είναι π.χ. η χρήση δειγμάτων ελέγχου ποιότητας (Quality Control Samples) καθώς και η χρήση διαγραμμάτων ελέγχου ποιότητας (Control Charts). Για ποιοτικούς προσδιορισμούς συνήθης πρακτική είναι η χρήση κατάλληλων θετικών ή/και αρνητικών μαρτύρων κάθε φορά που εκτελούνται αναλύσεις ρουτίνας. Το επίπεδο και ο τύπος του Εσωτερικού ΕλέγχουΠοιότητας εξαρτάται από τη φύση της ανάλυσης, τη συχνότητα της, το μέγεθος της παρτίδας, το βαθμό του αυτοματισμού, τη δυσκολία και αξιοπιστία της μεθόδου. Τα διαγράμματα ελέγχου ποιότητας στις ποσοτικές αναλυτικές μεθόδους, κατασκευάζονται με τα αποτελέσματα των πειραμάτων επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας κατά την επικύρωση ή επαλήθευση της μεθόδου και με χρήση προτύπων υλικών αναφοράς ή/και δειγμάτων γνωστής τιμής από διεργαστηριακή σύγκριση (εφόσον υφίστανται και διατηρούνται) ή/και δειγμάτων ρουτίνας συγκεκριμένης κατηγορίας. Ο έλεγχος ποιότητας των δοκιμών πραγματοποιείται με καθορισμένη συχνότητα, ήτοι με περιοδική ανάλυση του ίδιου δείγματος, το οποίο χρησιμοποιείται μόνο για το σκοπό αυτό και φυλάσσεται κατάλληλα για όσο χρονικό διάστημα διασφαλίζεται η μη αλλοίωση του.σε περίπτωση που ένα δείγμα ελέγχου ποιότητας (ΔΕΠ) λήξει, τότε θα πρέπει να επιλεγεί κάποιο νέο κατάλληλο και να κατασκευαστεί εκ νέου και το αντίστοιχο διάγραμμα ελέγχου. Οι τιμές από της μετρήσεις των διαλυμάτων/δειγμάτων ΔΕΠ τοποθετούνται σε διαγράμματα ή πίνακες ελέγχου ποιότητας. Η χρήση των διαγραμμάτων ή των πινάκων ελέγχου ποιότητας εφαρμόζεται για τον έλεγχο της σταθερότητας των αποτελεσμάτων. Υπάρχουν διάφοροι τύποι διαγραμμάτων ελέγχου ποιότητας. Τα πιο διαδεδομένα διαγράμματα είναι αυτά τύπου Shewhart, επειδή είναι τα πιο απλά ως προ την κατασκευή, τη χρήση και την ερμηνεία τους. Από αυτά, τα Διαγράμματα Μέσης Τιμής (για απλές μετρήσεις) και τα Διαγράμματα Εύρους (για διπλές και πολλαπλές μετρήσεις) είναι κατ εξοχήν χρησιμοποιούμενα. Στο 52

66 εργαστήριο όταν αναλύονται δείγματα ρουτίνας με μια αναλυτική διαδικασία, η δημιουργία ενός διαγράμματοςμέσης τιμής έχει ως κύριο σκοπό τη δημιουργία ενός ελεγκτικού μηχανισμού για τη διαπίστωση ότι η αναλυτική πορεία είναι «υπό στατιστικό έλεγχο», δηλαδή ότι η ακρίβεια και η αξιοπιστία της αναλυτικής διαδικασίας βρίσκεται μέσα στα επιθυμητά για την περίπτωση όρια. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιούνται τουλάχιστον 10 μετρήσεις/ δοκιμές σε διαφορετικές μέρες και από διαφορετικό προσωπικό, εάν είναι δυνατό. Στη συνέχεια, υπολογίζεται ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση (SD) των αποτελεσμάτων και κατασκευάζεται σε οριζόντια διάταξη το διάγραμμα ελέγχου μέσης τιμής, με τον κάθετο άξονα να αντιπροσωπεύει τις αριθμητικές τιμές που προέκυψαν από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων της δοκιμής και τον οριζόντιο άξονα να αντιπροσωπεύει χρόνο ή αριθμό δοκιμών. Στο διάγραμμα ελέγχου σχεδιάζεται η μεσαία γραμμή του διαγράμματος, η οποία αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή, ενώ πάνω και κάτω από τη μεσαία γραμμή σχεδιάζονται τέσσερις γραμμές σε αποστάσεις +2SD, +3SD, - 2SD, -3SD από το μέσο όρο. Οι γραμμές +2SD, -2SD ονομάζονται Ανώτερο Όριο Προειδοποίησης (UWL) και Κατώτερο Όριο Προειδοποίησης (LWL) αντίστοιχα, ενώ οι γραμμές +3SD, -3SD ονομάζονται Ανώτερο Όριο Ελέγχου (UCL) και Κατώτερο Όριο Ελέγχου (LCL) αντίστοιχα. Αφού κατασκευαστεί το διάγραμμα, το εργαστήριο ανά τακτά χρονικά διαστήματα εκτελεί δοκιμές στο δείγμα που χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του διαγράμματος και τα αποτελέσματα τοποθετούνται πάνω στο διάγραμμα ελέγχου κατά μήκος του οριζόντιου άξονα. Επιπλέον, καταγράφουμε τα αποτελέσματα και τα τεκμηριώνουμε σε τυποποιημένο έντυπο καταγραφής αποτελεσμάτων εσωτερικού ποιοτικού ελέγχου. Η συχνότητα ποικίλλει και μπορεί να είναι πριν από κάθε εκτέλεση δοκιμής ρουτίνας, κάθε συγκεκριμένο αριθμό δειγμάτων ρουτίνας (συνήθως κάθε 10 δείγματα) ή σε τακτά χρονικά διαστήματα κλπ. Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται εξετάζοντας την κατανομή τους γύρω από τη μεσαία γραμμή του διαγράμματος. Σε περίπτωση που αναλωθεί το αρχικό δείγμα ελέγχου ποιότητας, τότε καθορίζεται νέο και επανακατασκευάζεται το διάγραμμα ελέγχου. Προκειμένου να τεκμηριώνεται επαρκώς η τήρηση της καθορισμένης συχνότητας και η ανάλυση των δειγμάτων 53

67 ελέγχου ποιότητας, ο εκάστοτε αναλυτής όταν αναλύει ΔΕΠ, συμπληρώνει το αντίστοιχο ανά μέθοδο έντυπο καταγραφής αποτελεσμάτων εσωτερικού ποιοτικού ελέγχου. Από τα διαγράμματα ή τους πίνακες ελέγχεται αν τα αποτελέσματα βρίσκονται εντός των ορίων ελέγχου ± 3SD, οπότε και η αναλυτική διαδικασίαείναι αποδεκτή. Εκτός αυτής της πληροφορίας, η μεγάλη αξία των διαγραμμάτων ελέγχου βρίσκεται στην ικανότητα τους να ανιχνεύουν τάσεις του συστήματος που, εάν δεν διορθωθούν, μπορούν να οδηγήσουν το σύστημα «εκτός ελέγχου». Εάν 10 από 11 διαδοχικά σημεία βρίσκονται πάνω ή κάτω από τη μέση τιμή(στην ίδια πλευρά), αναλαμβάνεται κάποια δράση για να βρεθεί η αιτία της κατευθυνόμενης αυτής συμπεριφοράς ή εμφανιζόμενης τάσης. Μπορεί να γίνουν κατάλληλες ρυθμίσεις π.χ. να παρασκευαστούν νέα διαλύματα προτύπων ή τα όργανα να επαναβαθμονομηθούν. Ομοίως, αναλαμβάνεται κάποια δράση, εάν 7 διαδοχικά σημεία εμφανίζουν αντίστοιχα είτε σταθερά αυξητική, είτε σταθερά πτωτική τάση. Όσον αφορά τα όρια προειδοποίησης (95% επίπεδο εμπιστοσύνης), έχει παρατηρηθεί ότι μια ανάλυση στις 20 θα τα υπερβαίνει εάν υπάρχει τυχαία και κανονική κατανομή. Μάλιστα εάν βρεθεί ότι η συχνότητα που υπερβαίνεται το όριο προειδοποίησης ± 2SD είναι πολύ μεγαλύτερη από το 5%, σημαίνει ότι η ακρίβεια της μεθόδου μειώνεται. Επομένως, εάν 2 διαδοχικά σημεία βρεθούν εκτός ορίων προειδοποίησης, τότε το εργαστήριο αναλαμβάνει δράση για να διερευνήσει τυχόν προβλήματα κατά τις προβλέψεις της ανωτέρου παραγράφου. Τα όρια ελέγχου ± 3SD έχουν πιθανότητα να υπερβαίνονται τυχαία μόνο 0,3%. Κατά συνέπεια, εάν ένα και μόνο αποτέλεσμα βρίσκεται έξω από τα όρια αυτά, είναι αμέσως ύποπτο και το αναλυτικό σύστημα πρέπει να υποστεί έλεγχο και να γίνουν μία ή περισσότερες από τις ακόλουθες ενέργειες: Το ΔΕΠ αναλύεται πάλι, ένα νέο ΔΕΠ παρασκευάζεται και αναλύεται, έλεγχος του αναλυτικού οργάνου για τυχόν διαρροές ή άλλη δυσλειτουργία, 54

68 νέα πρότυπα βαθμονόμησης παρασκευάζονται και αναλύονται, όλες οι αναλύσεις δειγμάτων που έγιναν μεταξύ του τελευταίου έγκυρου ΔΕΠ και του επόμενου έγκυρου ΔΕΠ επαναλαμβάνονται. Σε περίπτωση που η δοκιμή θεωρηθεί εκτός ελέγχου, ο Τεχνικός Υπεύθυνος τουεργαστηρίου σχεδιάζει και υλοποιεί τις κατάλληλες διορθωτικές ενέργειες. Πιθανές αιτίες μη συμμόρφωσης μπορεί να αποτελούν παράγοντες που εμπλέκονται στη διαδικασία δοκιμής όπως: Χειρισμός-αποθήκευση δειγμάτων, περιβαλλοντικές συνθήκες διεξαγωγής της δοκιμής μέθοδος δοκιμής, εξοπλισμός, υλικά αναφοράς, το προσωπικό που διενεργεί τη δοκιμή, υπολογισμοί και έλεγχος λογισμικού. Παράλληλα, αναστέλλεται η διεξαγωγή των δοκιμών και εξετάζεται η εγκυρότητα των εκδοθέντων εκθέσεων δοκιμών από το τελευταίο επιτυχή έλεγχο ποιότητας της δοκιμής. Μόνο στη περίπτωση που δε βρεθεί κάποια αιτία σφάλματος και ο επανέλεγχος των ΔΕΠ δώσει αποδεκτά αποτελέσματα, μπορεί να θεωρηθεί ότι το αποτέλεσμα αυτό οφείλεται σε τυχαίο συμβάν ή σε λάθος του χειριστή. Αν κρίνουμε ότι όλα ή μέρος των αποτελεσμάτων των δοκιμών είναι αναξιόπιστα, ενημερώνονται εγγράφως οι πελάτες του εργατσηρίου. Όταν αρθεί η μη συμμόρφωση για τη συγκεκριμένη δοκιμή, το εργαστήριο προβαίνει σε δοκιμές των αντιδειγμάτων που τηρεί από κάθε δείγμα. Οι εκθέσεις και τα πρωτόκολλα από τους διοργανωτές των διεργαστηριακών σχημάτων με τα αποτελέσματα των αξιολογήσεων των δοκιμών, τα έντυπα καταγραφής αποτελεσμάτων εσωτερικού ελέγχου ποιότητας και τα διαγράμματα Shewhart τηρούνται στο αρχείο ποιοτικού ελέγχου με ευθύνη του Τεχνικού Υπευθύνου του εργαστηρίου. Συνοψίζοντας, ο εσωτερικός έλεγχος ποιότητας σε ποσοτικούς προσδιορισμούς γίνεται συνήθως με χρήση πρότυπου υλικού αναφοράς (ΔΕΠ) 55

69 ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Τα αποτελέσματα τοποθετούνται εντός διαγράμματος ελέγχου ποιότητας μέσης τιμής και αξιολογούνται βάσει των καθιερωμένων κριτηρίων αξιολόγησης. Τα κριτήρια αξιολόγησης είναι: Εάν βρεθεί 1 τιμή ΔΕΠ εκτός τωνορίων αποδοχής (±3SD), το εργαστήριο σταματά να εκδίδει αποτελέσματα και διερευνά την αιτία του προβλήματος, εάν 2 διαδοχικές τιμές ΔΕΠ βρίσκονται εκτός ορίων προειδοποίησης (±2SD) αλλά εντός ορίων αποδοχής, το εργαστήριο δεν σταματάει να εκδίδει αποτελέσματα και διερευνά την αιτία του προβλήματος, εάν 10 από 11 διαδοχικές τιμές ΔΕΠ βρίσκονται εντός ορίων προειδοποίησης (±2SD) αλλά από την μεριά της γραμμής μέσης τιμής, το εργαστήριο δεν σταματά να εκδίδει αποτελέσματα αλλά διερευνά την πιθανή αιτία της συγκεκριμένης τάσης, εάν 7 διαδοχικές τιμές ΔΕΠ εμφανίζουν σταθερά αυξητική ή σταθερά φθίνουσα πορεία, το εργαστήριο δεν σταματά να εκδίδει αποτελέσματα αλλά διερευνά την πιθανή αιτία της συγκεκριμένης τάση. [16] 2.3 Διαδικασία επαλήθευσης H επαλήθευση όπως έχει προαβαφερθεί κατά την επεξήγηση της έννοιας της επικύρωσης μεθόδων, προσομοιάζει με την επικύρωση και εκτελείται όταν εφαρμόζεται κάποια πρότυπη, ήδη επικυρωμένη, μέθοδος στο εργαστήριο. Οι ενέργειες είναι σχεδόν ίδιες με αυτές της επικύρωσης, αλλά με παράβλεψη κάποιων σταδίων και παραμέτρων αξιολόγησης επίδοσης μεθόδου και εντός σαφώς πολύ μικρότερου χρονικού ορίζοντα. Σκοπός της διαδικασίας επαλήθευσης είναι η εξασφάλιση της ποιότητας των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται κατά την εκτέλεση των δοκιμών, ακολουθώντας τις αντίστοιχες μεθόδους και ο προσδιορισμός της συμμόρφωσης των δοκιμών αυτών με τις απαιτήσεις που προδιαγράφονται από την πρότυπη μέθοδο και τη σχετική διεθνή προδιαγραφή. 56

70 Οι επαληθεύσεις μεθόδων δοκιμών ανασκοπούνται περιοδικά και περιλαμβάνουν, όπου αυτό είναι κατάλληλο, αλλά χωρίς να περιορίζονται σε αυτά, τα κάτωθι: Υπολογισμό της αβεβαιότητας των εκτελούμενων δοκιμών, συμμετοχή σε δοκιμές ικανότητας ή άλλες διεργαστηριακές συγκρίσεις (εξωτερικός έλεγχος ποιότητας), σύγκριση με αποτελέσματα άλλης έγκυρης μεθόδου (έλεγχος ισοδυναμίας), τακτική χρήση πιστοποιημένων υλικών αναφοράς ή/και και έλεγχο της ποιότητας με τη χρήση δευτερευόντων υλικών αναφοράςκαι διαγραμμάτων Shewhart (εσωτερικός έλεγχος ποιότητας), συσχετισμό των αποτελεσμάτων για διαφορετικά χαρακτηριστικά του ίδιου δείγματος. Τηρούνται στο αρχείο δοκιμών ή ή τεχνικής ικανότηταςτου εργαστηρίου όλα τα αποτελέσματα των επαληθεύσεων μεθόδων που έχουν διενεργηθεί. [17] 57

71 2.4 Εκτίμηση αβεβαιότητας Ορισμοί Σκοπός της διαδικασίας εκτίμησης αβεβαιότητας είναι να περιγράψει τον τρόπο με τον οποίο υπολογίζεται η συνολική αβεβαιότητα των αποτελεσμάτων δοκιμών που εκτελούνται από το εργαστήριο. Οιβασικοί ορισμοί των όρων που χρησιμοποιούνται παρατίθενται ακολούθως: Σφάλμα Σφάλμα είναι η διαφορά μεταξύ ενός αποτελέσματος και της πραγματικής τιμής του μετρήσιμου μεγέθους. Τυχαία σφάλματα Είναι σφάλματα που αποδίδουν αποτελέσματα μετρήσεων τυχαία διασκορπισμένα γύρω από μια μέση τιμή. Ονομάζονται και σφάλματα Τύπου Α. Συστηματικά σφάλματα Είναι σφάλματα που παραμένουν σταθερά όταν η μέτρηση επαναλαμβάνεται με τις ίδιες συνθήκες και προκαλούν μια μετατόπιση της πειραματικής μέσης τιμής από την πραγματική τιμή του μετρήσιμου μεγέθους. Ονομάζονται και σφάλματα Τύπου Β. Αβεβαιότητα μετρήσεων Είναι μια εκτίμηση που προσδίδεται σε μια μέτρηση και η οποία χαρακτηρίζει την περιοχή των τιμών μέσα στην οποία βρίσκεται η πραγματική τιμή. Εκφράζεται με την τυπική ή τη σχετική τυπική απόκλιση. Συνδυασμένη τυπική ή σχετική τυπική αβεβαιότητα Είναι μια εκτιμώμενη τυπική ή σχετική τυπική απόκλιση ίση με την τετραγωνική ρίζα του αρθροίσματος των τετραγώνων όλων των τυπικών αποκλίσεων που προκύπτουν από τα επιμέρους σφάλματα Τύπου Α και Β και τα οποία συνεισφέρουν στο τελικό σφάλμα του αποτελέσματος μιας δοκιμής. Διευρυμένη αβεβαιότητα 58

72 Προκύπτει πολλαπλασιάζοντας τη συνδυασμένη τυπική ή σχετική τυπική αβεβαιότητα με τον παράγοντα κάλυψης k (k = 2 για 95% διάστημα εμπιστοσύνης και κανονική κατανομή, k = 3 για 99% διάστημα εμπιστοσύνης) Υπολογισμός αβεβαιοτήτων Το αποτέλεσμα κάθε μέτρησης είναι μόνο μια προσέγγιση της τιμής του μετρηθέντος και είναι πλήρες μόνο όταν συνδυάζεται από μία δήλωση της αβεβαιότητας. Η αβεβαιότητα δηλώνει την περιοχή μέσα στην οποία εκτιμάται (με βεβαιότητα 95% ή 99%) ότι βρίσκεται η πραγματική τιμή του μετρηθέντος. Τα σφάλματα σε μετρήσεις έχουν δυο συνιστώσες, την τυχαία και τη συστηματική. Τα τυχαία σφάλματα (Τύπου Α) προκαλούν ένα διασκορπισμένο αριθμό μετρήσεων γύρω από μια μέση τιμή και συνήθως εκτιμώνται μέσω των πειραμάτων αναπαραγωγιμότητας που εκτελούνταικατάτην επικύρωση ή επαλήθευση της μεθόδου. Τα συστηματικά σφάλματα (Τύπου Β) παραμένουν αμετάβλητα όταν η μέτρηση επαναλαμβάνεται με τις ίδιες συνθήκες και προκαλούν μια μετατόπιση της πειραματικής μέσης τιμής από την πραγματική τιμή του μετρηθέντος. Αυτά συνήθως προκύπτουν από τα όργανα και τα υλικά που χρησιμοποιούνται και εκτιμώνται απευθείας από τα αντίστοιχα Πιστοποιητικά Διακρίβωσης οργάνων και τα Πιστοποιητικά Ανάλυσης των υλικών. Τυχαία σφάλματα που προκύπτουν από ανθρώπινα λάθη ή κακή χρήση του εξοπλισμού, δεν υπολογίζονται ξεχωριστά στην στατιστική ανάλυση, αλλά θεωρείται ότι συμπεριλαμβάνονται στην ανάλυση των αποτελεσμάτων αναπαραγωγιμότητας που μας προσδιορίζουν τα γενικότερα τυχαία σφάλαματα. Δίνεται όμως ιδιαίτερη βαρύτητα στην εκπαίδευση του προσωπικού που εκτελεί τις δοκιμές, ώστε να διασφαλίζεται η σωστή εκτέλεση των δοκιμών και η σωστή χρήση των οργάνων. Η αβεβαιότητα εκφράζεται με την τυπική ή τη σχετική τυπική απόκλιση, που αναφέρονται και ως τυπική ή σχετική τυπική αβεβαιότητα. Συνήθως αυτή διπλασιάζεται και καλείται διευρυμένη σε διάστημα εμπιστοσύνης 95%. Τούτο πρακτικά σημαίνει ότι επαναλαμβάνοντας τη δοκιμή μας, μόνο 5 στα

73 αποτελέσματα αναμένεται να πέσουν εκτός του διαστήματος που καθορίζει αυτής η διευρυμένη αβεβαιότητα (± Uexpanded %). Η διαδικασία υπολογισμού της αβεβαιότητας περιλαμβάνει τα επόμενα 5 βήματα: Περιγραφή της δοκιμής Είναι η περιγραφή της δοκιμής, των βημάτων που περιλαμβάνει και τη σχέση του αποτελέσματος με τις παραμέτρους στις οποίες βασίζεται (π.χ. μετρούμενες ποσότητες, πρότυπα διακρίβωσης, σταθερές κλπ). Προσδιορισμός των πηγών αβεβαιότητας Για κάθε παράμετρο και βήμα της δοκιμής καταγράφονται πιθανές πηγές αβεβαιότητας. Τέτοιες μπορεί να είναι: Δειγματοληψία (ομογενοποίηση, αντιπροσωπευτικότητα), προετοιμασία δείγματος (διάλυση, μόλυνση, συγκέντρωση), προετοιμασία υλικών αναφοράς (καθαρότητα, συγκέντρωση), διακρίβωση οργάνων (πιστοποιημένα υλικά αναφοράς, διακρίβωση με υλικά αναφοράς), δοκιμή (μόλυνση, καθαρότητα αντιδραστηρίων, επιδράσεις χειριστή, συνθήκες), επεξεργασία δεδομένων (μέσος όρος, αλγόριθμοι, στατιστική, στρογγυλοποιήσεις). Ποσοτικοποίηση των πηγών αβεβαιότητας Μέτρηση ή εκτίμηση του μεγέθους της αβεβαιότητας που σχετίζεται με κάθε πιθανή πηγή αβεβαιότητας. Καθώς μόνο ένας μικρός αριθμός πηγών αβεβαιότητας έχουν σημαντική συνεισφορά στην συνδυασμένη αβεβαιότητα, πηγές που ως τιμές δεν είναι μεγαλύτερες από το ένα τρίτο (1/3) της μεγαλύτερης τιμής (πηγής) δεν υπολογίζονται στους υπολογισμούς. Η ποσοτικοποίηση γίνεται με έναν από τους παρακάτω τρόπους: Με πειραματική εργασία από το εργαστήριο, με τη χρήση μετρήσεων σε υλικά αναφοράς, 60

74 με τη χρήση δεδομένων και αποτελεσμάτων από προηγούμενες εργασίες που έγιναν στο εργαστήριο ή αλλού, με την κρίση του τεχνικού υπευθύνου στηριζόμενη στην εμπειρία. Η τυπική αβεβαιότητα τύπου Α, μετράται με πειράματα επαναληψιμότητας και εκφράζεται ως η τυπική απόκλιση των μετρούμενων τιμών. Οι μετρήσεις σε υλικά αναφοράς δίνουν πληροφορίες πάνω στις συνδυασμένες επιδράσεις πολλών πιθανών πηγών αβεβαιότητας. Όλες οι πηγές αβεβαιότητας εκφράζονται ως τυπικές αποκλίσεις (αβεβαιότητες) ως εξής: Όταν οι πηγές αβεβαιότητας υπολογίζονται πειραματικά, μπορούν τα αποτελέσματα να εκφραστούν ως τυπικές αποκλίσεις, όταν η αβεβαιότητα προκύπτει από προηγούμενες ή εξωτερικές εργασίες, τότε αυτή πιθανόν να έχει ήδη εκφραστεί ως τυπική απόκλιση (π.χ. διακρίβωση ζυγού 5 g ± 2 mg). Εάν είναι γνωστό το επίπεδο εμπιστοσύνης (π.χ. 95%), τότε η κατανομή θεωρείται κανονική και η τυπική απόκλιση υπολογίζεται διαιρώντας δια 2. Εάν δίδεται μόνο το ±2 και δεν είναι γνωστό το επίπεδο εμπιστοσύνης, θεωρείται ότι η κατανομή είναι ορθογώνια, και η τυπική απόκλιση δίδεται από το πηλίκο 2/, όταν η εκτίμηση βασίζεται στην κρίση του αναλυτή ή σε ιστορικά δεδομένα, τότε αυτή εκτιμάται κατ ευθείαν σε τυπική απόκλιση. Υπολογισμός της συνδυασμένης αβεβαιότητας Η συνδυασμένη αβεβαιότητα υπολογίζεται ως η τετραγωνική ρίζα του αθροίσματος των τετραγώνων των επιμέρους αβεβαιοτήτων. Υπολογισμός της διευρυμένης αβεβαιότητας Η διευρυμένη αβεβαιότητα εκφράζει το διάστημα, το οποίο αναμένεται να καλύψει ένα μεγάλο ποσοστό της κατανομής των τιμών που λογικά θα μπορούσαν να αποδοθούν στο μετρηθέν. Η διευρυμένη αβεβαιότητα υπολογίζεται πολλαπλασιάζοντας τη συνδυασμένη αβεβαιότητα με έναν παράγοντα κάλυψης k ο οποίος είναι 2 (95% διάστημα εμπιστοσύνης), εκτός εάν 61

75 δηλώνεται διαφορετικά. Η διευρυμένη αβεβαιότητα είναι αυτή που εμφανίζεται στην αβεβαιότητα της μέτρησης με το σύμβολο ±, καθώς αυτό εκφράζει διάστημα αβεβαιότητας. Η διαδικασία υπολογισμού της αβεβαιότητας για κάθε δοκιμή και οι παράγοντες που συμβάλουν σ αυτή φαίνονται στην διαδικασία εκτέλεσης της δοκιμής και στις σχετικές οδηγίες εργασίας. Οι υπολογισμοί που οδηγούν στην διευρυμένη αβεβαιότητα τεκμηριώνονται σε φύλλα εργασίας κατάλληλου λογισμικού στους Η/Υ του εργαστηρίου. [18, 19] 2.5 Επικύρωση μεθόδων δοκιμών Εισαγωγή Επικύρωση είναι η επιβεβαίωση, μέσω εξέτασης και παροχής αντικειμενικών αποδείξεων, ότι ικανοποιούνται οι ιδιαίτερες απαιτήσεις για την προβλεπόμενη χρήση. Σκοπός της διαδικασίας αυτής λοιπόν, είναι η εξέταση της αξιοπιστίας της μεθόδου δοκιμής και συνίσταται μεταξύ άλλων παραμέτρων, στην εκτίμηση τουλάχιστον της επαναληψιμότητας, της αναπαραγωγιμότητας, καθώς και της αβεβαιότητας αυτής. Η διαδικασία της επικύρωσης εφαρμόζεται όταν το κατά περίπτωση εργαστήριο, χρησιμοποιεί μεθόδους που είτε έχουν αναπτυχθεί από αυτό, είτε προέρχονται από τροποποίηση διεθνών μεθόδων.τέλος, η διαδικασία που ακολουθείται κατά την επικύρωση εξαρτάται και από την φύση της μεθόδου, δηλαδή ανάλογα με το πρωτόκολλο της, κρίνεται απαραίτητη ή όχι, η εκτίμηση και η αξιολόγηση κάποιων συγκεκριμένων στοιχείων. Στα επόμενα παρατίθενται διάφοροι παράγοντες που εκτιμώνται στην επικύρωση μεθόδων και οι έννοιες που εκφράζουν. Επαναληψιμότητα (repeatability) είναι η στενότητα της συμφωνίας μεταξύ των αποτελεσμάτων επαναλαμβανόμενων μετρήσεων, δηλαδή το μέτρο της διασποράς των αποτελεσμάτων διαδοχικών ανεξάρτητων ελέγχων στο ίδιο δείγμα οι οποίες εκτελούνται κάτω από τις ίδιες ακριβώς συνθήκες μέτρησης, συνήθως την ίδια ημέρα ή σε δύο διαδοχικές ημέρες από τον ίδιο αναλυτή.εκτιμάται με τον υπολογισμό της τυπικής απόκλισης ή/και του συντελεστή διακύμανσης (RSD% ή CV%). 62

76 Αναπαραγωγιμότητα (reproducibility) είναι η στενότητα της συμφωνίας μεταξύ των αποτελεσμάτων επαναλαμβανόμενων μετρήσεων, δηλαδή το μέτρο της διασποράς των αποτελεσμάτων διαδοχικών ανεξάρτητων ελέγχων στο ίδιο δείγμα οι οποίες διεξάγονται όμως υπό μεταβαλλόμενες συνθήκες μέτρησης σε βάθος χρόνου (διαφορετικός αναλυτής, χρόνος, εξοπλισμός κλπ).εκτιμάται με τον υπολογισμό της αντίστοιχης τυπικής απόκλισης ή/και του συντελεστή διακύμανσης (RSD% ή CV%) Αβεβαιότητα είναι μια παράμετρος που συνδέεται με το αποτέλεσμα μιας μέτρησης και η οποία χαρακτηρίζει την διασπορά των τιμών, που θα μπορούσε λογικά να αποδοθεί στη συγκεκριμένη μετρούμενη ποσότητα. Οι παράγοντες που επηρεάζουν τα αποτελέσματα μιας δοκιμής και την αβεβαιότητα τους διακρίνονται σε: Τεχνικούς παράγοντες: Δειγματοληψία, ομοιογένεια, μέθοδος δοκιμής, εξοπλισμός. Η επίδραση των ανωτέρω παραγόντων ελαττώνεται και ελέγχεται μέσω: Του καθορισμού με ακρίβεια του εξοπλισμού που χρησιμοποιείται, της διαθεσιμότητας προτύπων μεθόδων και σαφών οδηγιών εργασίας, συμπεριλαμβανομένης της λειτουργίας του εξοπλισμού, της διαθεσιμότητας διαδικασιών επαλήθευσης και διακρίβωσης. Καθώς και της εξασφάλισης της ιχνηλασιμότητας των μετρήσεων. Ανθρώπινους παράγοντες, οι οποίοι ελέγχονται μέσω της: Εκπαίδευσης, επιμόρφωσης/πρακτικής εμπειρίας, παρακολούθηση της επίδοσης, συμμετοχή σε δοκιμές ικανότητας. Περιβαλλοντικούς παράγοντες: 63

77 Ελεγχόμενες συνθήκες για την αποθήκευση των δειγμάτων και για τη διεξαγωγή των δοκιμών, όπου αυτό απαιτείται. Η τεκμηρίωση που δημιουργείται κατά την επικύρωση μιας μεθόδου, τηρείται ανάλογα με τα εξεταζόμενα στοιχεία του συστήματος για την ποιότητα στα αντίστοιχα αρχεία, όπως είναι το αρχείο τεχνικής ίκανότητας, το αρχείο δοκιμών, το αρχείο προσωπικού, το αρχείο εξοπλισμού κ.α. Το κύριο αντικείμενο της επικύρωσης (validation) μιας αναλυτικής μεθόδου είναι ο έλεγχος της αξιοπιστίας και της καταλληλότητας της μεθόδου για τον σκοπό για τον οποίο προορίζεται προκειμένου να γίνει αποδεκτή. Η παρούσα εργασία αναφέρεται σε μεθόδους προς διαπίστευση και έχει ως σκοπό να συνοψίσει βασικές οδηγίες και μεθόδους στατιστικής επεξεργασίας πειραματικών αποτελεσμάτων διαφόρων παραμέτρων για την επικύρωση τους. Στόχος του εργαστηρίου, μέσω της επικύρωσης των μεθόδων είναι τα παραγόμενα αναλυτικά αποτελέσματα να έχουν επαρκή ακρίβεια, η οποία αποδεικνύεται στο μέλλον με την εφαρμογή κατάλληλου προγράμματος ελέγχου ποιότητας. Το εργαστήριο επιλέγει την κατάλληλη αναλυτική μέθοδο που μπορεί να ικανοποιήσει την απαιτούμενη χρήση, επικυρώνει τη μέθοδο τεκμηριωμένα, εφαρμόζει τη μέθοδο μετά την επικύρωση και τέλος σχεδιάζει πρόγραμμα ελέγχου ποιότητας για μελλοντικό έλεγχο χρήσης της μεθόδου σε αναλύσεις ρουτίνας. Όταν η μέθοδος είναι πρότυπη, τότε η αξιοπιστία της πρέπει τουλάχιστον να επιβεβαιώνεται με επαλήθευση. Ως επαλήθευση (verification) νοείται τουλάχιστον ο έλεγχος της ορθότητας και της πιστότητας. Η πλήρης επικύρωση μιας μεθόδου γίνεται αξιολογώντας την ορθότητα (trueness), την πιστότητα (precision), την αβεβαιότητα, την ευαισθησία / όριο ανίχνευσης (sensitivitylimitofdetection), την ανθεκτικότητα (robustness), την εξειδίκευση (specificity), την εκλεκτικότητα (selectivity) και λοιπές παραμέτρουςανάλογα και με τη φύση της μεθόδου και την έκταση της απαιτούμενης επικύρωσης. 64

78 2.5.2 Εκτίμηση της Ορθότητας Η ορθότητα αναφέρεται στη διαφορά - μ (σφάλμα), μεταξύ της μέσης τιμής και της τιμής μ η οποία γίνεται αποδεκτή ως αληθής τιμή της μετρούμενης ποσότητας. Μπορεί να εκτιμηθεί με τον όρο Σχετική Τυπική Ορθότητα % που υπολογίζεται με τον ακόλουθο τύπο: Συνηθέστερα όμως ως μέτρο της ορθότητας εκλαμβάνεται η τιμή του παράγοντα Z-score που αναφέρθηκε προηγούμενα στο εδάφιο του εξωτερικού ελέγχου ποιότητας και κατά πόσο η απόλυτη αυτή τιμή είναι μικρότερη του 2. Εφόσον χρησιμοποιηθούν εμβολιασμένα δείγματα πρότυπης προσδιοριστέας ουσίας σε τυφλό για την εκτέλεση πειραμάτων επαναληψιμότητας και αναπαρωγιμότητας τότε το μέτρο ελέγχου της ορθότητας είναι ο υπολογισμός των αντίστοιχων ανακτήσεων (recoveries % = (Cmeasured / Cexpected) X 100). Επισημαίνεται στο σημείο αυτό ότι η Ορθότητα ουσιαστικά είναι μία παράμετρος τελικής αξιολόγησης της ακρίβειας μιας δοκιμής, ή της αξιολόγησης των παραμέτρων accuracy και bias (σφάλμα που οφείλεται στην απόσταση από μία γνωστή αληθή τιμή), δηλαδή κατά πόσο η εξεταζόμενη τιμή απέχει από μία αληθή τιμή. Ο όρος precision (πιστότητα) αποτελεί μέτρο του πόσο καλά επαναλαμβάνονται οι μετρήσεις μας (διασπορά τιμών) και εκφράζει φυσικά και αυτός σφάλμα, αλλά δεν αρκεί από μόνος του για να αξιολογηθεί επαρκώς μια ποσοτική δοκιμή. Απαιτείται να ελεγχθεί και η ορθότητα για να έχουμε πιο ολοκληρωμένη εικόνα της αξιοπιστίας της μεθόδουκαι των σχετιζόμενων μετρήσεων. Η αληθής-γνωστή τιμή μ μπορεί να ληφθεί: Α. Από ειδικά παρασκευάσματα (εμβολιασμένο, spiked) δείγμα. Η ορθότητα προσδιορίζεται με εφαρμογή της μεθόδου σε τυφλά δείγματα, που αποδεδειγμένα δηλαδή δεν περιέχουν την προσδιοριστέα ουσία (blankformulation), τα οποία εμβολιάζονται με προσθήκη συγκεκριμένης ποσότητας προσδιοριστέας ουσίας από τεχνικώς καθαρή ουσία γνωστής 65

79 συγκέντρωσης (πρότυπη ουσία). Γίνεται μέτρηση των εμβολιασμένων δειγμάτων σύμφωνα με τη μέθοδο. Η ανάκτηση υπολογίζεται από το λόγο της μέσης τιμής των συγκεντρώσεων που μετρήθηκαν στα εμβολιασμένα δείγματα προς τη θεωρητικά αναμενόμενη συγκέντρωση εμβολιασμού. Γίνονται σε ένα ή δυο επίπεδα συγκεντρώσεων και εκτελούνται τουλάχιστον έξι επαναλήψεις σε κάθε επίπεδο. Β. Από τα αποτελέσματα μιας άλλης μεθόδου γνωστής ορθότητας και επαναληψιμότητας, δηλαδή επικυρωμένης ή μεθόδου αναφοράς. Συγκρίνονται ομάδες αποτελεσμάτων που ελήφθησαν με την μία μέθοδο και με την άλλη μέθοδο επί του ιδίου δείγματος. Ο έλεγχος ισοδυναμίας των δύο ομάδων τιμών συνήθως γίνεται μέ χρήση τέστ σημαντικότητας της στατιστικής (significancetests) και περιλαμβάνει έλεγχο ισοδυναμίας διακυμάνσεων με F- test, ακολουθούμενο με ανάλογο έλεγχο ισοδυναμίας μέσων τιμών με t-test είτε για ίσες, είτε για άνισες διακυμάνσεις. Συγκεκριμένα συγκρίνονται η μέση τιμή 1 των μετρήσεων της εξεταζόμενης μεθόδου, με τη μέση τιμή 2 της επικυρωμένης μεθόδου. Τα αποτελέσματα της μεθόδου που αναπτύσσεται θεωρούνται αξιόπιστα όταν η πειραματικά προσδιοριζόμενη τιμή t (t πειρ. ) είναι μικρότερη από την θεωρητικά αναμενόμενη τιμή (t crit. ) που λαμβάνεται από πίνακες στατιστικής. Επιπλέον η σύγκριση των αποτελεσμάτων των δύο μεθόδοων μπορεί να ελεγχθεί και με προσδιορισμό της τιμής Z-score = X- μ /S, όπου Χ είναι η μέση τιμή των αποτελεσμάτων της εξεταζόμενης μεθόδου, μ είναι η μέση τιμή των αποτελεσμάτων της επικυρωμένης μεθόδου και s είναι η τυπική απόκλιση όλων των αποτελεσμάτων και από τις δύο μεθόδους, πάντοτε στο αντίστοιχα εξεταζόμενο επίπεδο συγκέντρωσης εντός του λειτουργικού εύρους της μεθόδου που θέλουμε να επικυρώσουμε. Αυτή η προσέγγιση ακολουθήθηκε προκειμένου να ελεγχθεί η ορθότητα της εξεταζόμενης inhouse μεθόδου της παρούσας εργασίας, αφού πρώτα επιβεβαιώθηκε μέσω ελέγχου γραμμικότητας η αναλογικότητα της σχέσης μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης αντισωμάτων. 66

80 Γ. Από πιστοποιημένο υλικό αναφοράς γνωστής ή γενικά αποδεκτής σύνθεσης. Πραγματοποιείται ανάλυση 6 φορές του πιστοποιημένου υλικού αναφοράς. Η ορθότητα είναι αποδεκτή όταν η μέση τιμή εντός των παρακάτω ορίων: τιμή των 6 μετρήσεων βρίσκεται όπου: μ είναι η πιστοποιημένη τιμή του υλικού και s d η τυπική απόκλιση των μέσων τιμών των μετρήσεων όλων των εργαστηρίων που έλαβαν μέρος στη διαδικασία πιστοποίησης του υλικού. Εάν για το πιστοποιημένο υλικό δεν είναι γνωστή η τιμή s d τότε υπολογίζεται η τιμή: Όπου Ν ο αριθμός των μετρήσεων, S η τυπική απόκλιση τους και η μέση τιμή τους, η οποία για να μη διαφέρει σημαντικά από την πιστοποιημένη τιμή μ θα πρέπει να είναι t πειρ <t θεωρ. Για Ν=6 είναι t θεωρ =2,571 σε στάθμη εμπιστοσύνης 95% Εκτίμηση της πιστότητας (Precision) Η πιστότητα εκφράζει τη συμφωνία μεταξύ των αποτελεσμάτων επαναλμβανόμενων μετρήσεων της μεθόδου. Αποτελεί μέτρο της διασποράς μιας σειράς μετρήσεων από μέτρηση σε μέτρηση στην ίδια σειρά μετρήσεων και εκφράζεται με κάποιο στατιστικό μέτρο της διασποράς (π.χ. με την τυπική απόκλιση s). Εκτός της τυπικής απόκλισης που έχει μονάδες των επιμέρους αποτελεσμάτων (π.χ. mg/l, μg/ml, ppm, %, κ.λ.π) ως μέτρο της επαναληψιμότητας χρησιμοποιείται και η σχετική τυπική απόκλιση (relativestandarddeviation, RSD) ή αλλιώς συντελεστής μεταβλητότητας ή συντελεστής διακύμανσης, CV, που είναι καθαρός αριθμός: Υποσύνολα της πιστότητας είναι οι όροι: Α. Ενδοεργαστηριακή επαναληψιμότητα (repeatability, within laboratory precision). Είναι το μέτρο της διασποράς των αποτελεσμάτων διαδοχικών 67

81 ελέγχων στο ίδιο δείγμα, που εκτελούνται κάτω από τις ίδιες συνθήκες, δηλαδή ίδια μέθοδος ελέγχου, ίδιος αναλυτής, ίδια συσκευή, ίδιο εργαστήριο και ίδια ημέρα. Εκτιμάται με την τυπική απόκλιση S r υπό συνθήκες επαναληψιμότητας ή την αντίστοιχη σχετική τυπική απόκλιση ή διακύμανση RSDr% = CV% υπό συνθήκες επαναληψιμότητας. Β. Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα (within laboratory reproducibility ή intermediate precision).είναι το μέτρο της διασποράς των αποτελεσμάτων διαδοχικών ελέγχων στο ίδιο δείγμα, που εκτελούνται με μια τουλάχιστον από τις παραμέτρους που επηρεαζουν τη δοκιμή (πχ αναλυτής, συσκευή, χρόνος διενέργειας κλπ) να διαφέρει. Εκτιμάται με την τυπική απόκλιση S R υπό συνθήκες ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας ή την αντίστοιχη σχετική τυπική απόκλιση RSD R % = CV% πό συνθήκες αναπαραγωγιμότητας. Αποδεκτές τιμές για τη σχετική τυπική απόκλιση RSD R υπολογίζονται συχνά από την εξίσωση του Horwitz: όπου RSD R είναι η σχετική τυπική απόκλιση υπό συνθήκες αναπαραγωγιμότητας, C είναι η συγκέντρωση του αναλύτη στο σκεύασμα εκφρασμένη σαν δεκαδικό κλάσμα (decimalfraction). Κατά την επικύρωση της inhouse μεθόδου της παρούσας εργασίας εκτιμήθηκε η ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα τιμών απορρόφησης, αφού πρώτα επιβεβαιώθηκε η γραμμικότητα της αναλογικής σχέσης μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης αντισωμάτων. Εκτίμηση της αβεβαιότητας: Η επίδραση των επιμέρους συστατικών στην ολική αβεβαιότητα (π.χ. αβεβαιότητα δειγματοληψίας του δείγματος, επαναληψιμότητα μέτρησης, κ.α.) μπορεί να εκτιμηθεί, έτσι ώστε μόνο τα συστατικά με σημαντική επίδραση να λαμβάνονται υπόψη. Επισημαίνεται ότι η σημαντικότερη συσνεισφορά στην αβεβαιότητα δοκιμών οφείλεται στην αναπαραγωγιμότητα αποτελεσμάτων και ισούται με το διπλάσιο της τυπικής απόκλισης ή της σχετικής τυπικής απόκλισης της αναπαραγωγιμότητας εκφρασμένης ως διευρυμένη% για διάστημα 68

82 εμπιστοσύνης 95%. Αυτη η προσέγγιση ακολουθήθηκε για την εκτίμηση της αβεβαιότητας της εξεταζόμενης inhouse μεθόδου της παρούσας εργασίας αφού πρώτα εκτιμήθηκε η ο βαθμός γραμμικότητας της αναλογικής σχέσης μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης αντισωμάτων Μελέτη της γραμμικότητας (Linearity) Η αξιολόγηση της γραμμικότητας κατά την επικύρωση ποσοτικών μεθόδων είναι πολύ σημαντική, ειδικότερα όταν η αρχή της μεθόδου εδράζει σε ποσοτικοποίηση και υπολογισμό του αποτελέσματος μέσω κατασκευής κατάλληλης καμπύλης βαθμονόμησης της προσδιοριστέας ουσίας έναντι κάποιας άλλης παραμέτρου με την οποία υφίσταται αναλογική σχέση. Τέτοιες περιπτώσεις αποτελούν οι κλασσικές τεχνικές χημικών αναλύσεων όπως η υγρή και η άερια χρωματογραφία, η ατομική απορρόφηση, η απορρόφηση σε συγκεκριμένα μήκη κύματος (φωτομέτρηση) κλπ όπου προσδιορίζονται τιμές συγκέντρωσης προσδιοριστέας ουσίας μέσω κατάλληλων καμπυλών βαθμονόμησης που κατασκευάζονται με πρότυπα διαλύματα αναφοράς. Επιπρόσθετα ό έλεγχος γραμμικότητας επιτρέπει να αξιολογήσουμε αυτή την αναλογική σχέση σε όλο το λειτουργικό εύρος (working range) της εξεταζόμενης μεθόδου, ήτοι από του ορίου ποσοτικοποίησης μέχρι του ανώτερου ορίου όπου μπορούμε να ποσοτικοποιήσουμε με στατιστική σιγουριά και αξιοπιστία. Η γραμμικότητα πρέπει να αποδεικνύεται με την εξέταση της γραφικής παράστασης κάποιας παραμέτρου ως συνάρτησης της συγκέντρωσης της προσδιοριστέας παραμέτρου. Στην περίπτωση της παρούσας εργασίας η γραμμικότητα εξετάσθηκε προκειμένου να αποδειχθεί η αναλογική σχέση μεταξύ απορρόφησης (άξονας Υ) σε συγκεκριμένο μήκος κύματος της in house μεθόδου Elisa, έναντι της συγκέντρωσης των αντισωμάτων (άξονας Χ) στο υπό αξιολόγηση λειτουργικό εύρος της μεθόδου, παρά το γεγονός ότι η εσωτερική μας μέθοδος δεν είναι απολύτως ποσοτική, αφού δεν δίνουμε συγκέντρωση αντισωμάτων ως τελικό αποτέλεσμα. Παρά ταύτα όμως, είναι σαφές ότι η αξιοπιστία της μεθόδου μας εξαρτάται από την προαναφερθείσα αναλογικότητα μεταξύ απορρόφησης (absorbance) και συγκέντρωσης (concentration). 69

83 Τα αποτελέσματα του ελέγχου γραμμικότητας αξιολογούνται με έλεγχο της κατασκευής ευθείας παλινδρόμησης (regression line) με τη μέθοδο των ελάχιστων τετραγώνων (least square method) και ειδικότερα μέσω ελέγχου του αντίστοιχου συντελεστή συσχέτισης r 2 ή r. Τα δεδομένα της ευθείας παλινδρόμησης μπορούν επίσης από μόνα τους να χρησιμοποιηθούν για την εξαγωγή μαθηματικών εκτιμήσεων για το βαθμό της γραμμικότητας. Ο συντελεστής συσχέτισης (correlation coefficient, r) ή η τεταγμένη επί την αρχή, ή κλίση της ευθείας παλινδρόμησης και το άθροισμα των τετραγώνων των υπόλοιπων (sum o fresidual squares) είναι παράμετροι που μπορούν να εξετασθούν. Επιπλέον, η ανάλυση των αποκρίσεων των πραγματικών σημείων των δεδομένων από την ευθεία παλινδρόμησης μπορεί να είναι χρήσιμη και για την αξιολόγηση και της ορθότητας μιάς μεθόδου. Στις κλασικές μεθόδους πσοτικής αναλυτικής χημείας ο συντελεστής συσχέτισης είναι συνήθως αναμενόμενο να είναι r > 0,995 προκειμένου να θεωρηθεί επαρκής η αντίστοιχη γραμμικότητα. Στην περίπτωση της παρούσας εργασίας όπου η εξεταζόμενη μέθοδος ειναι εσωτερικά ανεπτυγμένη και η σκοπούμενη χρήση δεν επιβάλει να δώσουμε ακριβή συγκέντρωση αντισωμάτων ως τελικό αποτέλεσμα, θεωρείται επαρκές να καταδειχθεί ότι η γραμμικότητα είναι τουλάχιστον εφάμιλλη και παρεμφερής (δηλαδή δεν διαφέρει σημαντικά) της γραμμικότητας που επιδεικνύει η εμπορική επικυρωμένη μέθοδος IVD kit με την οποία γίνεται σύγκριση. Εάν η σχέση απορρόφησης και συγκέντρωσης είναι μη αναλογική πρέπει να δοθεί κάποια ικανοποιητική εξήγηση ενώ η εξεταζόμενη μέθοδος ενδέχεται να θεωρηθεί μη κατάλληλη για τη σκοπούμενη χρήση Αξιολόγηση της εξειδίκευσης (Specificity) Ο έλεγχος της εξειδίκευσης κατά την επικύρωση μεθόδων δοκιμών συνίσταται στην αξιολόγηση της ικανότητας της εξεταζόμενης αναλυτικής μεθόδου να διακρίνει τον αναλυτή (προσδιοριστέα ουσία) από γνωστές προσμίξεις, 70

84 μεταβολίτες, προϊόντα διασπάσεως και συστατικά του μητρικού υλικού του δείγματος (matrix effect). Η ιδανική απόδειξη της εξειδίκευσης γίνεται με ανάλυση σκευάσματος που δεν περιέχει την προσδιοριστέα ουσία (blank formulation) στις ίδιες συνθήκες ανάλυσης του δείγματος ρουτίνας Αξιολόγηση της ανθεκτικότητας (Robustness) H ανθεκτικότητα δείχνει αξιοπιστία και συνέπεια (reliability) μιας ανάλυσης σε σχέση με προσχεδιασμένες μεταβολές ήσσονος σημασίας στις πειραματικής παραμέτρους της μεθόδου. Αποδεικνύει δηλαδή ότι δεν υπάρχουν διαφορές που να οφείλονται στην εμπειρία του αναλυτή, σε αντιδραστήρια και αναλώσιμα από διαφορετικούς προμηθευτές, και στις περιβαλλοντικές συνθήκες του εργαστηρίου. Για την αξιολόγηση μιας μεθόδου ως προς την ανθεκτικότητα της υπολογίζονται οι αντοχές της κατά τη μικρή μεταβολή των πειραματικών παραμέτρων, μέσω σύγκρισης μετρήσεων πριν την επιβολή των μεταβολών και μετά την επιβολή των μεταβολών Καταγραφή των στοιχείων επικύρωσης Τα στοιχεία της επικύρωσης των μεθόδων καταγράφονται και φυλάσσονται στο αρχείο των μεθόδων, μαζί με όλα τα πειραματικά στοιχεία που αφορούν την επικύρωση. Τα στοιχεία δίνονται κατά κανόνα υπό μορφή συγκεντρωτικώνπινάκων και με τέτοιο τρόπο ώστε να γίνεται εύκολα αντιληπτή η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έναντι των καθιερωμένων κριτηρίων Επανεπικύρωση Επανεπικύρωση απαιτείται όταν υπάρχουν σημαντικές τροποποιήσεις κατά την αναλυτική πορεία της μεθόδου π.χ. όργανα, αντιδραστήρια, χρονικοί παράγοντες κ.λπ., τα στοιχεία επανεπικύρωσης της μεθόδου πρέπει να καταχωρούνται και αυτά στο φάκελο τεχνικήςικανότητας του εργαστηρίου. 71

85 2.6 Αποτελέσματα επικύρωσης Εισαγωγή Για την επικύρωση της μεθόδου που θα αναλυθεί παρακάτω, χρησιμοποιήθηκε αντιτετανικός ορός tetagam γνωστής συγκέντρωσης και η τεχνική σύγκρισης της εσωτερικά ανεπτυγμένης in house μεθόδου με πιστοποιημένη ποσοτική μέθοδο του εμπορίου IVD/CE kit που είναι επαρκώς επικυρωμένη από τον κατασκευαστή. Λόγω ασυμφωνίας ημερομηνιών μεταξύ εσωτερικών πειραμάτων του εργαστηρίου και διανομής δειγμάτων κατάλληλου σχήματος δοκιμών ικανότητας που εντοπίστηκε στη Γερμανία, δεν κατέστη εφικτός ο έλεγχος ορθότητας μέσω και ανεξάρτητου και αμερόληπτου εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Η σχετική αίτηση συμμετοχής όμως έχει πραγματοποιηθεί και αναμένεται η ολοκλήρωση και αυτού του ελέγχου προκειμένου η μέθοδος να θεωρηθεί οριστικά ως κατάλληλη για τη σκοπούμενη χρήση. Τα επίπεδα αραιώσεων που μελετήσαμε και στηριχτήκαμε για να γίνει η επικύρωση της μεθόδου, είναι 1/3200, 1/25600, 1/ και 1/ Ο λόγος της επιλογής τόσο υψηλών συγκεντρώσεων είναι, όπως θα δούμε και στο διάγραμμα παρακάτω, η παρουσία ενός φαινομένου που ονομάζεται πλατό. Λόγω υψηλής συγκέντρωσης του αντιτετανικού όρου, στα πρώτα επίπεδα αραίωσης βλέπουμε ότι υπάρχει μια ευθεία και όχι μια πτώση όπως θα ήταν το αναμενόμενο. Έτσι το πρώτο επίπεδο αραίωσης που επιλέξαμε για την μελέτη μας είναι εκείνο που αρχίζει να κινείται και να υπάρχει μια πτώση. 72

86 concentration vs. absorbance ,01 0, Figure 1. concentration vs. absorbance Διάγραμμα 1: Στο παραπάνω διάγραμμα απεικονίζονται η απορρόφηση έναντι συγκέντρωσης στον εσωτερικό inhouseέλεγχο. Η επιλογή του πρώτου επιπέδου ανάλυσης ήταν το 1/3200 λόγω του φαινομένου «πλατό» στα προηγούμενα επίπεδα. Στα διάφορα επίπεδα αραίωσης που εξετάζονται αναμένεται αντίστοιχα συγκεκριμένη συγκέντρωση αντισωμάτων. Αυτή τη συγκέντρωση πρέπει να την επιβεβαιώσουμε πρώτα με την επικυρωμένη ποσοτική μέθοδο του εμπορίου προκειμένου να προχωρήσουμε στην αξιολόγηση περαιτέρω παραμέτρων για την εσωτερική μας μέθοδο, εκτιμώντας πλέον τις αντίστοιχες μετρήσεις απορρόφησης που πήραμε μετρώντας τα αραιωμένα δείγματα. Η κατασκευή επομένως της καμπύλης αναφοράς με την επικυρωμένη μέθοδο του εμπορίου, μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης αντισωμάτων ήταν το κλειδί για να προχωρήσει η αξιολόγηση όλων των παραμέτρων επικύρωσης της εσωτερικής μεθόδου. Αυτές οι αναμενόμενες θεωρητικές συγκεντρώσεις στα διάφορα επίπεδα αραίωσης εξετάστηκαν και ήταν 0,7 IU/ml (1/3200), 0,1IU/ml (1/25600), 0,03 IU/ml (1/102400) και 0,01 IU/ml (1/204800), μετρήθηκαν και επιβεβαιώθηκαν με ακρίβεια με την επικυρωμένη εμπορική ποσοτική μέθοδο όπου τα αντίστοιχα αποτελέσματα ήταν 0,7, 0,13, 0,03 και 0,02 IU/ml. Η μικρή απόκλιση στα αποτελέσματα των συγκεντρώσεων, είναι αναμενόμενη λόγω των πολύ υψηλών επιπέδων αραίωσης όπου δουλεύουμε. Η σχετική καμπύλη 73

87 αναφοράς επομένως μεταξύ απορρόφησης (άξονας Υ) και συγκέντρωσης άξονας (άξονας Χ) που κατασκευάστηκε με το εμπορικό κιτ και βάσει της οποίας έγινε η ποσοτικοποίηση θεωρείται αξιόπιστη. Επισημαίνεται ότι σε κάθε επίπεδο αραίωσης έγιναν έξι (6) επαναλήψεις μετρήσεων με το εμπορικό κίτ. Το επόμενο πολύ σημαντικό στοιχείο της επικύρωσης ήταν να επιδειχθεί η εφάμιλλη γραμμικότητα μεταξύ επιβεβαιωμένων συγκεντρώσεων αντισωμάτων στα εξεταζόμενα επίπεδα αραιώσεων και αντίστοιχων τιμών απορρόφησης. Τούτο θα επέτρεπε την αξιολόγηση των επιμέρους τυπικών αποκλίσεων αυτών των τιμών απορρόφησης της εσωτερικής μεθόδου και της θεώρησής τους ως αντιπροσωπευτικών των αντίστοιχων τιμών συγκεντρώσεων αντισωμάτων Πρωτόκολλο Επικύρωσης Α. Προσδιορισμός Ορίου Ανίχνευσης και Ορίου Ποσοτικοποίησης Στο πλαίσιο ελέγχου αναπαρωγιμότητας, αλλά και για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης (LOD) εκτελέστηκαν δέκα (10) ανεξάρτητες μετρήσεις αραιωμένου tetagam ορού με την εσωτερική μέθοδο στα τέσσερα (4) αυτά επίπεδα αραιώσεων που αναφέρθηκαν προηγουμένως.ως LODθεωρήσαμε το επίπεδο αραίωσης 1/ με συγκέντρωση 0,012 IU/mL, αφού στο αμέσως επόμενο επίπεδο (1/409600) δεν ήταν δυνατή η λήψη απορρόφησης από το αραιωμένο δείγμα. Η αναλογικότητα στη σχέση μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης που θα δειχτεί στα επόμενα επέτρεψε να θεωρήσουμε την αντίστοιχη επιβεβαιωμένη συγκέντρωση του επιπέδου αραίωσης 1/ ως αξιόπιστο Όριο Ανίχνευσης της εσωτερικής μεθόδου, αφού οι τιμές τυπικής απόκλισης της απορρόφησης μπορεί να θεωρηθούν αντιπροσωπευτικές και των αντίστοιχων τιμών συγκεντρώσεων αντισωμάτων. Συγκεκριμένα οι μετρήσεις απορρόφησης σε αυτό το επίπεδο αραίωσης 1/ έδωσαν: 1. SD= = 20,43 και 2. RSD%= 100 = 15,96< 20% 74

88 To όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) κάτω από το οποίο θεωρούμε ότι μία μέθοδος δεν δίνει στατιστικά ασφαλές ποσοτικό αποτέλεσμα, υπολογίστηκε ως το γινόμενο του Ορίου Ανίχνευσης επί 3, δηλαδή 3 0,012 = 0,036 IU/mL, όπου επιβεβαιώθηκε ως η συγκέντρωση στο αμέσως προηγούμενο επίπεδο αραίωσης μας 1/ και μέσω του εμπορικού κίτ. Επομένως και το όριο Ποσοτικοποίησης επιβεβαιώθηκε πειραματικά. Για επαλήθευση του ορίου ανίχνευσης και ορίου ποσοτικοποίησης, έγιναν αντίστοιχα έξι (6) επαναλαμβανόμενες μετρήσεις με εξωτερικό πιστοποιημένο kit. Στην διαδικασία αυτή υπολογίστηκαν η τυπική απόκλιση (SD),η σχετική τυπική απόκλιση επί τοις εκατό (RSD%) καθώς και η συγκέντρωση σε κάθε επίπεδο αραίωσης μέσω πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης. Συγκεκριμένα: Επίπεδο Ορίου Ανίχνευσης (LOD) με αραίωση 1/204800: 1. SD = 19,32 2. RSD% = 3,75 <20% Επίπεδο Ορίου Ποσοτικοποίησης (LOQ) με αραίωση 1/102400: 1. SD = 43,84 2. RSD% = 5,26 <20% Β. Έλεγχος Γραμμικότητας (linearity) και Ορθότητας (trueness) Για την αξιολόγηση της γραμμικότητας της μεθόδου, έγιναν αρχικά από δέκα ανεξάρτητες (10) μετρήσεις στα τέσσερα (4) επίπεδα αραιώσεων του tetagam γνωστής συγκέντρωσης με την in house μέθοδο. Συγκεκριμένα, μετρήθηκαν τα επίπεδα αραίωσης 1/3200, 1/25600, 1/ και 1/ με αναμενόμενες θεωρητικές συγκεντρώσεις 0,7 IU/mL, 0,1 IU/mL, 0,03 IU/mL και 0,012 IU/mL αντίστοιχα. Στην συνέχεια, έγιναν 6 μετρήσεις στα ίδια επίπεδα αραίωσης με το επικυρωμένο εμπορικό kit. Αφού σχεδιάστηκε η πρότυπη καμπύλη αναφοράς με τα δεδομένα των calibration παρατηρήθηκε ότι ο μέσος όρος των απορροφήσεων σε κάθε επίπεδο αραίωσης δίδει την αναμενόμενη θεωρητική συγκέντρωση γεγονός που επιβεβαιώνει την αναλυτική διαδικασία προετοιμασίας των αραιωμένων δειγμάτων και επιπλέον επιτρέπει την 75

89 absorbance αξιοποίηση των αντίστοιχων τιμών απορρόφησης σε αυτά τα επίπεδα αραίωσης που ελήφθησαν με την inhouse εξεταζόμενη μέθοδο. Κατασκευάστηκε κατόπιν με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων η ευθεία παλινδρόμησης μεταξύ των μέσων τιμών απορρόφησης (άξονας Υ) και των μέσων τιμών συγκέντρωσης αντισωμάτων (άξονας Χ) που ελήφθησαν με την επικυρωμένη εμπορική μέθοδο του κιτ στα αντίστοιχα επίπεδα αραίωσης. Ο συντελεστής συσχέτισης βρέθηκε να είναι 0,8375. Κατασκευάστηκε στη συνέχεια με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων και η ευθεία παλινδρόμησης μεταξύ των μέσων τιμών απορρόφησης (άξονας Υ) και των μέσων τιμών συγκέντρωσης αντισωμάτων (άξονας Χ) που ελήφθησαν με την εσωτερική inhouse μέθοδο στα αντίστοιχα επίπεδα αραίωσης. Ο συντελεστής συσχέτισης βρέθηκε να είναι 0,8954 και να μην διαφέρει περισσότερο από 7% από τον συντελεστή συσχέτισης της επικυρωμένης μεθόδου, γεγονός που αποδεικνύει ότι η γραμμικότητα μεταξύ των δύο μεθόδων είναι παρεμφερής. Έτσι αποδεικνύεται και η αναλογικότητα μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης αντισωμάτων της inhouse μεθόδου για το εξεταζομενο λειτουργικό της εύρος abs vs.con Σειρά ,001 0,01 0, concentration Διάγραμμα 2: Στο παραπάνω λογαριθμικό διάγραμμα απεικονίζονται η απορρόφηση έναντι συγκέντρωσης στον εξωτερικό έλεγχο με το kit. Ο μέσος όρος των 76

90 απορροφήσεων σε κάθε επίπεδο πέφτει πάνω στην ίδια συγκέντρωση εσωτερικού ελέγχου. με του Παρακάτω, παρατίθενται οι σχετικές ευθείες παλινδρόμησης που κατασκευάστηκαν αντίστοιχα για την IVD και την IN HOUSE μέθοδο και φαίνονται με διακεκομμένες trend line. IVD Kit Method y: Absorbance x: Concentration y = 2865,5x + 845,4 R² = 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 In House Method y: Absorbance x:concentration y = 1894,7x + 324,9 R² = 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 77

91 Για τον έλεγχο της Ορθότητας έγινε αρχικά έλεγχος ισοδυναμίας μεταξύ των τιμών απορρόφησης που ελήφθησαν ανά εξεταζόμενο επίπεδο αραίωσης, από την επικυρωμένη εμπορική και από την inhouse μέθοδο. Σε όλα τα επίπεδα αραίωσης αποδείχθηκε μέσω F-test και t-test ότι οι αντίστοιχες ομάδες τιμών απορρόφησης δεν εμφανίζουν ισοδυναμία διακυμάνσεων και μέσων όρων γεγονός αναμενόμενο βάσει και της φύσης της ποσοτικής εμπορικής μεθόδου και της διαφοράς που παρατηρήθηκε οπτικά όταν συγκρίθηκαν οι τιμές. Όμως αυτή η διαφορά δεν είναι υπεροβολική και ως εκ τούτου εξετάσθηκε η τιμή Z- score σε κάθε επίπεδο αραίωσης θεωρώντας ως αληθή τιμή την μέση τιμή απορρόφησης που ελήφθη με το εμπορικό κίτ. Τα αποτελέσματα έδειξαν τιμές Z-score οριακά κάτω από 2 σε όλα τα επίπεδα αραίωσης, γεγονός που καθιστά ορθή την εξεταζόμενη inhouse μέθοδο. Συγκεκριμένα οι απόλυτες τιμές Ζ-score υπολογίστηκαν ως 1,99 (επίπεδο 1/3200), 1,97 (επίπεδο 1/25600), 1,97 (επίπεδο 1/102400) και 1,99 (επίπεδο 1/204800). Γ. Έλεγχος Πιστότητας (precision) με αναπαραγωγιμότητα Ο έλεγχος πιστότητας έγινε στο επίπεδο αραίωσης 1/3200 με συγκέντρωση 0,7 IU/mL. Εκτελέστηκαν 10 μετρήσειςυπολογίζοντας τηντυπική απόκλιση (SD) και την σχετική τυπική απόκλιση (RSD%). Συγκεκριμένα: Επίπεδο αραίωσης 1/3200 με συγκέντρωση 0,7 IU/mL: 1. SD = 58,94 2. RSD% = 3,65 <20% Ακόμα, ο έλεγχος πιστότητας έγινε στο επίπεδο αραίωσης 1/25600 με συγκέντρωση 0,1 IU/mL. Εκτελέστηκαν 10 μετρήσειςυπολογίζοντας τηντυπική απόκλιση (SD) και την σχετική τυπική απόκλιση (RSD%). 1. SD = 110,83 2. RSD% =13,75 <20% (όριο ελέγχου πιστότητας μεθόδου) O έλεγχος πιστότητας έγινε και στο επίπεδο αραίωσης 1/ με συγκέντρωση 0,03 IU/mL. Εκτελέστηκαν 10 μετρήσειςυπολογίζοντας τηντυπική απόκλιση (SD) και την σχετική τυπική απόκλιση (RSD%). 78

92 1. SD = 49,33 2. RSD% = 14,25 <20%(όριο ελέγχου πιστότητας μεθόδου) Ο έλεγχος πιστότητας έγινε και στοεπίπεδο αραίωσης 1/ με συγκέντρωση 0,012 IU/mL. Εκτελέστηκαν 10 μετρήσειςυπολογίζοντας τηντυπική απόκλιση (SD) και την σχετική τυπική απόκλιση (RSD%). 1. SD= 20,43 2. RSD% = 15,96 <20% ( όριο ελέγχου πιστότητας μεθόδου) Δ. Υπολογισμός Αβεβαιότητας Η διευρυμένη σχετική τυπική αβεβαιότητα εκτιμήθηκε στο 30,6% στο επιπέδου αραίωσης του Ορίου Ποσοτικοποίησης (αραίωση 1/102400) που ήταν και η χειρότερη περίπτωση, όπως αναμενόταν. Οι αβεβαιότητες αναμένονται υχηλές στις πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Οι αβεβαιότητες που εκτιμήθηκαν αφορούν την αβεβαιότητα αναπαραγωγιμότητας (τύπου Α) και την αβεβαιότητα τύπου Β (φωτόμετρα και πιπέτες). Η τελική υπολογιζόμενη συνδυασμένη σχετική αβεβαιότητα είναι σε διάστημα εμπιστοσύνης 95%. Άρα έχουμε ένα U C = 15,3% και επομένως U ex = 2 U c = 30,6%. Στην αραίωση 1/3200 η σχετική τυπική αβεβαιότητα μας εκτιμήθηκε στο 7,4%, άρα επιβεβαιώνεται η θεωρία ότι σε πιο υψηλά επίπεδα συγκέντρωσης δηλαδή σε χαμηλότερες αραιώσεις έχουμε χαμηλότερη αβεβαιότητα. Γενικά, η συμβολή των αβεβαιοτήτων Τύπου Β από τα συστηματικά σφάλματα των οργάνων σχεδόν πάντοτε είναι τόσο μικρή οπότε και θεωρείται αμελητέα σε αντιδιαστολη με τη συνεισφορά της αβεβαιότητας Τύπου Α της αναπαραγωγιμότητας και για αυτό παραλείπεται όπως οι διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες επιτρέπουν. H γραμμικότητα είναι μία από τις παραμέτρους που πρέπει να εξετάζεται για την επικύρωση των μεθόδων. Συγκεκριμένα, η γραμμικότητα εξετάζεται σε όλο το εύρος της λειτουργικής περιοχής των συγκεντρώσεων της αναλυτικής μεθόδου. Στο όργανο μέτρησης, μεταξύ του ορίου ανίχνευσης (LOD) και του ανώτερου σημείου μέτρησης, υπάρχει μια γνωστή σχέση η οποία καλείται γραμμική ή καμπυλογραμμή κλπ. Κατά την επικύρωση μιας μεθόδου είναι αναγκαία η επιβεβαίωση μιας τέτοιας παραμέτρου διότι: 79

93 i. Αποδεικνύει ότι η κλίμακα εργασίας του οργάνου είναι συμβατή με το διάστημα που αναφέρεται στη μέθοδο, ii. επαληθεύει ότι η προτεινόμενη διαδικασία βαθμονόμησης του οργάνου είναι επαρκής Συζήτηση αποτελεσμάτων Αξιολογώντας τους κυριότερους και βασικότερους παράγοντες, για την επικύρωση μιας τέτοιου είδους μεθόδου, η in house ανοσοδιαγνωστική μέθοδος για την διάγνωση τετάνου, κρίνεται κατάλληλη για τη σκοπούμενη χρήση και τον ακριβή τρόπο έκφρασης των αποτελεσμάτων όπως έχει καθοριστεί να εκδίδονται και που δεν περιλαμβάνουν παράθεση τιμών συγκέντρωσης αντισωμάτων, αλλά μόνο επίπεδο αραίωσης με τιμές απορρόφησης πάνω από 300 ώστε να υποδεικνύεται μόνο αναμενόμενη υψηλή ή χαμηλή συγκέντρωση αντισωμάτων. Η επιβεβαίωση των αναμενόμενων θεωρητικών συγκεντρώσεων ανά επίπεδο αραίωσης με το εμπορικό επικυρωμένο κίτ ποσοτικής μεθόδου ήταν το πρώτο βημα που επέτρεψε την επαλήθευση καταλληλότητας της προετοιμασίας των δειγμάτων και την αξιοποίηση των αντίστοιχων τιμών απορρόφησης που ελήφθησαν με την εσωτερική μέθοδο σε κάθε επίπεδο συγκέντρωσης. Εν συνεχεία η επιβεβαίωση της αναλογικής σχέσης μεταξύ της συγκέντρωσης και της απορρόφησης στην συγκεκριμένη περίπτωση εξετάζοντας τα στατιστικά στοιχεία ευθείας παλινδρόμησης με κάθε μέθοδο και δεδομένης της μικρής διαφοράς μεταξύ συντελεστή συσχέτισης της εσωτερικής μεθόδου με το συντελεστή συχέτισης της ποσοτικής επικυρωμένης εμπορικής μεθόδου, μας οδήγησε στο συμπέρασμα πως στην εσωτερική μέθοδο υπάρχει σαφής γραμμική αναλογική σχέση μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης σε όλο το λειτουργικό εύρος συγκεντρώσεων που εξετάστηκε, αν και με μεγαλύτερη αβεβαιότητα αφού και ο έλεγχος ισοδυναμίας των απόλυτων τιμών απορρόφησης υπέδειξε διαφορά μεταξύ των δύο μεθόδων. Όμως η εκτίμηση του παράγοντα Z-score που βρέθηκε κάτων από 2 απέδειξε ότι η ανωτέρω διαφορά δεν ήταν αρκετή για να καταστήσει την 80

94 εσωτερική μέθοδο μη κατάλληλη. Ο έλεγχος ορθότητας υπέδειξε οριστικά την καταλληλότητα της εσωτερικής μεθόδου. Συγκεκριμένα, για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης έγιναν μια σειρά πειραμάτων και αραιώσεων διαπιστώνοντας πως το (LOD) βρίσκεται στην αραίωση 1/ Παρατηρούμε όμως, ότι η συγκέντρωση στο όριο ανίχνευσης του εσωτερικού ελέγχου βρίσκεται στα 0,012 IU/ml ενώ στον εξωτερικό έλεγχο με το kit βρίσκεται στα 0,02 IU/ml, η συγκεκριμένη απόκλιση είναι φυσιολογική λόγω των πολύ υψηλών αραιώσεων, άρα πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις, που πραγματοποιήθηκαν για την αξιολόγηση μιας τέτοιου είδους παραμέτρου. Το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) βρέθηκε πολλαπλασιάζοντας 3 την συγκέντρωση του ορίου ανίχνευσης, με αποτέλεσμα να έχουμε συγκέντρωση 0,03 IU/ml σε αραίωση 1/ Ο έλεγχος της πιστότητας πραγματοποιήθηκε σε τρία επίπεδα 1/3200, 1/25600 και 1/ Στον εσωτερικό έλεγχο τα RSD% και των τριών επιπέδων ήταν κάτω από 20% όπου είναι το όριο. Αναλυτικότερα, στο επίπεδο 1/3200 το RSD% είναι RSD% = 3,65, στο επίπεδο 1/25600 είναι RSD%= 13,75, στο επίπεδο 1/ το RSD% είναι 14,25. Παρατηρούμε αντίστοιχα και εδώ, ότι όσο μεγαλώνει η αραίωση το RSD% τείνει να αυξάνεται. Το αποτέλεσμα αυτό είναι απόλυτα φυσιολογικό εφόσον δουλεύουμε σε τόσο μικρές συγκεντρώσεις. Μετρήθηκε το RSD% και στον εξωτερικό έλεγχο kit και όπως αναμενόταν οι τιμές στα ίδια επίπεδα ήταν πιο χαμηλές και από του εσωτερικού ελέγχου. Συγκεκριμένα στο επίπεδο 1/3200 το RSD% είναι 3,05 και στο επίπεδο 1/25600 το RSD% είναι 1,38 και στο επίπεδο 1/ το RSD% είναι 5,26. Η σχετική διευρυμένη αβεβαιότητα της μεθόδου εκτιμήθηκε στο 30,6% στο επίπεδο 1/ Φυσικά, σε μικρότερες αραιώσεις η αβεβαιότητα είναι λογικό να είναι μικρότερη λόγω των χαμηλότερων RSD%, για παράδειγμα η σχετική διευρυμένη αβεβαιότητα στο επίπεδο αραίωσης 1/3200 είναι 7,4%, αμέσως καταλαβαίνουμε ότι σε ακόμα μικρότερα επίπεδα αραίωσης η σχετική διευρυμένη αβεβαιότητα θα είναι ακόμα πιο χαμηλή. 81

95 Πίνακας 5: Πίνακας συνοπτικής αναφοράς και αξιολόγησης αποτελεσμάτων επικύρωσης Όριο ανίχνευσης (LOD) και όριοποσοτικοποίησης (LOQ) Πιστότητα (RSD%) και Standard Deviation Αβεβαιότητα (k=2, διάστημα εμπιστοσύνης 95%) Ορθότητα με εξωτερικό kit 0,012 IU/mL και 0,03 IU/mL Επαλήθευση Ορίου Ανίχνευσης 0,012 IU/mL Επαλήθευση Ορίου Ποσοτικοποίησης 0,03 IU/mL Επίπεδο Συγκέντρωσης Τιμής 6,25 IU/mL Επίπεδο Συγκέντρωσης Τιμής 0,7 IU/mL Επίπεδο Συγκέντρωσης Τιμής 0,03 IU/mL 3,75% < 20% ,32 5,26% < 20% 43,84 4,24% < 20% 74 Επιτυχής 7,4% 3,65% < 20% 30,6% 58,94 14,25%< 20% 49,33 82

96 2.6.4 Αναλυτικοί Υπολογισμοί Πίνακας 6: Αναλυτικά αποτελέσματα Ορίου Ανίχνευσης ΟΡΙΟ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ (αραίωση 1/204800) Αναπαραγωγιμότητα 1. 98Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb. Μέση Τιμή 128 Absorb. Συγκέντρωση 0,012 IU/mL SD 20,43 RSD% 15,96 Πίνακας 7: Αναλυτικά αποτελέσματα εξωτερικού ελέγχου Ορίου Ανίχνευσης με kit ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΟΡΙΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ Αναπαραγωγιμότητα Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb. Μέση Τιμή 515,2 Absorb. Συγκέντρωση 0,02 IU/mL SD 19,32 RSD% 3,75 83

97 Πίνακας 8: Αναλυτικά αποτελέσματα Ορίου Ποσοτικοποίησης ΟΡΙΟ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ (αραίωση 1/102400) Αναπαραγωγιμότητα Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb. Μέση Τιμή 346,2 Absorb. Συγκέντρωση 0,03 IU/mL SD 49,33 RSD% 14,25 Πίνακας 9: Αναλυτικά αποτελέσματα εξωτερικού ελέγχου Ορίου Ποσοτικοποίησηςμε kit ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΟΡΙΟΥ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ Αναπαραγωγιμότητα Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb. Μέση Τιμή 833,7 Absorb. Συγκέντρωση 0,03 IU/mL SD 43,84 RSD 5,26 84

98 Πίνακας 10: Αναλυτικά αποτελέσματα επιπέδου αραίωσης 1/3200 για έλεγχο Πιστότητας ΠΙΣΤΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΑΡΑΙΩΣΗΣ 1/3200 Αναπαραγωγιμότητα Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb. Μέση Τιμή 1614,8 Absorb. Συγκέντρωση 0,7 IU/mL SD 58,94 RSD% 3,65 Πίνακας 11: Αναλυτικά αποτελέσματα επιπέδου αραίωσης 1/25600 για έλεγχο Πιστότητας ΠΙΣΤΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΑΡΑΙΩΣΗΣ 1/25600 Αναπαραγωγιμότητα Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb. Μέση Τιμή 805,9 Absorb. Συγκέντρωση 0,1 IU/mL SD 110,83 RSD% 13,75 85

99 Πίνακας 12: Αναλυτικά αποτελέσματα επιπέδου αραίωσης 1/ για έλεγχο Πιστότητας ΠΙΣΤΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΑΡΑΙΩΣΗΣ 1/ Αναπαραγωγιμότητα Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb Absorb. Μέση Τιμή 346,2 Absorb. Συγκέντρωση 0,03 IU/mL SD 49,33 RSD% 14,25 86

100 Εικόνα 2.1.: Πιστοποιητικό αντιτετανικού ορού tetagam 87

101 Εικόνα 2.2: Πιστοποιητικό καλής λειτουργίας φωτόμετρου 88