ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η Η σύγκριση µεθόδων για την καταµέτρηση E.coliσε σύγκριση µε την επίσηµη µεθοδο που προτείνει η Ευρωπαϊκή οδηγία για την ποιότητα

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η Η σύγκριση µεθόδων για την καταµέτρηση E.coliσε σύγκριση µε την επίσηµη µεθοδο που προτείνει η Ευρωπαϊκή οδηγία για την ποιότητα"

Ὀφιοῦχος Παπαδόπουλος
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Equivalency testing of TTC- Tergitol Agar (ISO :2000) with 5 culture media for the detection of E. coli in water samples in Greece Mavridou A, E. Smeti, P. Boufa, M. Vagiona- Arvanitidou, A. Vantarakis, G. Mandilara, G. Vassilandonopoulou, O. Pappa, V. Roussia, A. Tzouanopoulos, M. Livadara, I Aisopou, V. Maraka, E. Nikolaou, V. Karaouli, and A. Vatopoulos.

2 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η Η σύγκριση µεθόδων για την καταµέτρηση E.coliσε σύγκριση µε την επίσηµη µεθοδο που προτείνει η Ευρωπαϊκή οδηγία για την ποιότητα του πόσιµου νερού. Η Η σύγκριση των µεθόδων σύµφωνα µε συγκεκριµένο πρωτόκολλο αποτελεί µιά εναλλακτική δυνατότητα για τα εργαστήρια που δεν θέλουν για διάφορους λόγους να χρησιµοποιήσουν την µέθοδο αναφοράς. Eπισης µπορεί να χρησιµοποιηθεί σαν ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ των µεθόδων. Εποµένως τα εργαστήρια που θέλουν να διαπιστευθπούν γαι µια από αυτές τις µεθόδους πρέπει να κανουν απλώς επαλήθευση

3 Προβλήµατα µεθόδου αναφοράς Για καθαρά δείγµατα! Χαµηλή αναγνωριµότητα «κανονικών» δειγµάτων µε χλωρίδα Μεγάλος χρόνος τελικού αποτελέσµατος Τα περισσότερα ελληνικά εργαστήρια προτιµούν άλλες µεθόδους Η Η διαπίστευση ή οι υποχρεώσεις προς τα Υποουργεία υποχρεώνει την χρήση της µεθόδου αναφοράς

4 Επιλογή µεθόδων Εγινε σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα διερεύνησης που πραγµατοποιήθηκε από το διεργαστηριακό σχήµα EQUASE Greece ( ). Εργαστήρια % µέθοδος 41.2% TTC- Tergitol agar 29.4% LSA, 11.7% TBX, 11.7% MFc 6% Chromocult Coliform Agar Επίσης προστέθηκε το Colilert-18/ Quantitrayεπειδή πολλά εργαστήτιαδήλωσαν ότι σκοπεύουν να το χρησιµοποιήσουν

5 Τα εργαστήρια που συµµετείχαν ΚΕ Υ ΕΥ ΑΠ ΕΣ Υ Εργαστήριο Υγιεινής ΑΠΘ Εργαστήριο Υγιεινής ηµοκρίτειο Γεν Χηµείο Ρόδου ΕΥΑ Χανίων ΕΥΑ Ηρακλείου ΕΛΚΕΘΕ Ηράκλειο Εργαστήριο ελέγχου τροφίµων (ιδιωτικό) Η Η εργασία συντονίστηκε και χρηµατοδοτήθηκε από το ΤΕΙ Αθήνας (Τµήµα Ιατρικών Εργαστηρίων)

6 Προετοιµασία δειγµάτων Χρησιµοποιήθηκε διεθνές πρωτόκολλο The Microbiology of Drinking Water Part 3 (Standing Committee of Analysts, 2002). ηµιουργήθηκαν χλωριωµένα και µή-χλωριωµένα δείγµατα.. Tην παραµονή νερό έµεινε στο ψυγείο για να καθιζάνουν τα αιωρούενα στερεά. Μη Χλωριωµένα: : εµβολιάστηκαν µε λύµατα ώστε η τελική συγκέντρωση E.coli και είανι cfus/100ml Xλωριωµένα: εµβολίαστηκαν χλωριοµένα δείγµατα και προστέθηκε επι πλέον χλώριο ώστε η τελική συγκέντρωση να είανι ppm

7 Test method (reference) Incubation Interpretation, confirmation TTC Tergitol 7 agar (ISO ) Membrane Faecal coliforms agar (APHA,9222D,1998) Chromocult Coliform agar Membrane Lauryl Sulfate agar (HPA,W2,2005) TBX (Tryptone Bile x-glucoronide) (ISO ) Colilert 18/Quantitray (DWI,2000) 36±2 C/21±3 h 44.5±0.2 C/2 4±2 h 36±1 C/24±2 h 44.5±0.2 /24±2 h yellow or yellow-green, oxidase-negative, produce acid from lactose, produce indole from tryptophan at 44.0±0.5 C β-glucuronidase production Colilert medium 36±2 C 18 h various shades of blue, oxidase-negative, produce acid from lactose, produce indole from tryptophan at 44.0±0.5 C dark-blue to violet colonies (Salmon-GAL and X-glucuronide reaction), positive indole formation after coating the typical colonies with KOVACS' indole reagent yellow colonies, oxidase-negative, produce acid from lactose, produce indole from tryptophan at 44.0±0.5 C 44 C/ 4±3 h blue/green colonies oxidase-negative, produce acid from lactose, produce indole from tryptophan at 44.0±0.5 C 36±2 C/18 h yellow colour with fluorescence oxidasenegative, produce acid from lactose produce

8 Eπιβεβαίωση Ως προς το είδος των αποικιών: µόνο της τυπικές από κάθε θρεπτικό υπόστρωµα Ως προς τον αριθµό: τουλάχιστον το 5% οπως ορίζει το ISO Ορισµένα εργαστήρια επιβεβαίωσαν µεγαλύτερο αριθµό αποικιών Ως προς την µέθοδο: οξειδάση, ινδόλη.

9 Συµπληρωµατική επιβεβαιωτική δοκιµή Ορισµένες µέθοδοι βασίζονται στην ανίχνευση της β-glucuronidase Πολλοί ερευνητές θεωρούν αυτή την δοκιµασία σταθερότερο κριτήριο ταυτοποίησης της Ε.coli λόγω της Klebsiella oxytoca που δίνει Ινδόλη + Αποφασίστηκε η δοκιµασία αυτή να προστεθεί στις µεθόδους σαν επιπλέον κριτήριο ταυτοποίησης. Εκ των υστέρων εκδόθηκε το ISO : 2000 Technical corrigentum1 που προτείνει την ανίχνευση β-glucuronidase (οχι υποχρεωτικά).

10 ISO αριθµός των εργαστηρίων και των δειγµάτων αποφασίστηκε µε βάση τις επιταγές του ISO «for the establishment of equivalence between quantitative microbiological methods». Κάθε εργαστήριο εξέτασε > 30 δείγµατα µε 3-4 methods (MLSA, MFc, TBX, Chromocult Coliform Agar,)παράλληλα µετην µέθοδο αναφοράς. Ενα εργαστήριο ανάλυσε 76 δείγµατα µε Chromocult Coliform Agar παράλληλα µετην µέθοδο αναφοράς. Ενα εργαστήριο ανάλυσε 76 δειγµατα µε Colilert 18/ Quantitrayπαράλληλα µετην µέθοδο αναφοράς.

11 Στατιστική επεξεργασία Η στατιστική επεξεργασία που προτείνεται από το ISO is based στην µέση σχετική διαφορά των µετρήσεων (RD) µετά από επιβεβαίωση λογαριθµοποίηση και χρησιµοποιεί παραµετρικές σταατιστικές µεθόδους. Επειδή είναι συνηθισµένη η έλλειψη κανονικότητας χρησιµοποιούντάι και µη παραµετρικές µέθοδοι ή συνδιασµός των δύο Χρησιµοποιήθηκε το Shapiro-Wilk Normality test για τον υπολογισµό του RD% Η εναλλακτική µέθοδος θεωρήθηκε καλύτερη όταν η µέση της απόδοση ήταν ίση ή υψηλότερη από την µέθοδο αναφοράς. Η εναλλακτική µέθοδος θεωρήθηκε ότι έδινε καλύτερη αναζωογόνηση αν η διευρηµένη αβεβαιότητα περί το RD ήταν >0. Ισότιµη όταν αν η διευρηµένη αβεβαιότητα περί το RD ήταν =0. Η εναλλακτική µεθοδος δεν έπρεπε να παρουσιάζει >10% λιγότερη αναζωογόνηση από την µέθοδο αναφοράς.

12 Μη κανονική κατανοµή Η Η αξιολόγηση χρησιµοποίησε το Wilcoxon signed rank test (Lehmann, 1975), µεχρήση του διάµεσου RD% αντί του µέσου RD%. εν εγιναν συγκρίσεις µεταξύ των εναλλακτικών µέθόδων Χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS 13.0 for Windows

13 Χλωριωµένα-µη µη χλωριωµένα Για τον υπολογισµό του RD µεταξύ χλωρωµένων και µη χλωριοµένων δειγµάτων χρησιµοποιήθηκε το t test ή το non-parametric Mann-Whitney

14 Στατιστική ανάλυση Ι RD i % = 100*[ln(a i ) - ln(b i )] Τυπικό σφάλµα του µέσου: ISO Std. Error = s// n Εκτεταµένη Αβεβαιότητα: U = 2* s/ n Άνω όριο διαστήµατος εµπιστοσύνης: LO = RD% - U Κάτω όριο διαστήµατος εµπιστοσύνης: ΗΙ = RD% + U Μέγιστη αποδεκτή απόκλιση: D = 10% Μη παραµετρική µέθοδος: Wilcoxon signed rank test

15 f comparisons derived from the tests of non-chlorinated (chlorinated) samples per participating laboratory, and per alternative method vs. Laborator y Alternative methods compared to TTC Tergitol 7 agar MFc* Chromocu lt MLSA* TBX* Colilert Total 1 34 (0) 32 (0) 33 (0) 30 (0) 76 (0) 205 (0) 2 28 (10) 28 (9) 28 (9) 84 (28) 3 39 (0) 39 (0) 39 (0) 117 (0) 4 29 (8) 29 (8) 28 (8) 86 (24) 5 38 (0) 38 (0) 38 (0) 114 (0) 6 27 (9) 55 (19) 28 (10) 110 (38) 7 38 (0) 38 (0) 37 (0) 113 (0) 8 38 (0) 38 (0) 38 (0) 114 (0) 9 25 (12) 24 (12) 25 (12) 74 (36) (9) 33 (9) 33 (9) 102 (27)

16 RD% κάθε µεθόδου vs TTC Tergitol 7 for confirmed E.coli Ν mean RD% SD MFC Chro mocul t MLSA 302 TBX 297 Colile rt 18/ quanti ST err U P- value Exp U Interv LO Exp U Interv HI < Eval uation + ND 9.61 ND 3.88 ND

17 Λεζάντα πίνακα + η εναλλακτική µεθοδος σηµαντικά καλύτερη αναζωογόνηση αποικίων από την µέθοδο αναφοράς ND Not different P-value H 0 : mean RD%=0 vs H 1 mean RD% 0 N number of comparisons

18 ιάγραµµα διασποράς m-fc vs Lactose TTC agar (σε λογαριθµική κλίµακα)

19 ιάγραµµα διασποράς Chromocult vs Lactose TTC agar (σε λογαριθµική κλίµακα)

20 ιάγραµµα διασποράς LSA vs Lactose TTC agar (σε λογαριθµική κλίµακα)

21 ιάγραµµα διασποράς TBX vs Lactose TTC agar (σε λογαριθµική κλίµακα)

22 ιάγραµµα διασποράς Colilert vs Lactose TTC agar (σε λογαριθµική κλίµακα)

23 Συµπεράσµατα Οι εναλλακτικές µέθοδοι τουλάχιστον ισοδύναµες µε την Lactose TTC agar, αν οχι καλύτερες.

24 Ευχαριστίες Ειδικός Λογαρισµός Κονδυλίων Ερευνας ΤΕΙ Αθήνας (πρόγραµµα Θαλής) γαι την χρηµατοδότηση Εταιρεία Metrolab για προσφορά ορισµένων αντιδραστηρίων. Ολο το προσωπικό των συµµετεχόντων εργαστηρίων. Την Καθ Βαγιωνά-Αρβανιτίδου - για τις εύστοχες παρατηρήσεις Ιδιαίτερες ευχαριστίες στην κα Ελένη Σµέτη για την στατιστική επεξεργασία και συµµετοχή στις πολλαπλές διορθώσεις για την δηµοσίευση. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στην ρ Γ Μανδηλαρά για την συµµετοχή της στην συγγραφή της δηµοσίευσης στην αρχή και σε όλες τις φάσεις.

25 ιήθηση ISO n(2000) Rapid method Επώαση TSA medium, 36 ± 2 C/4 C/4-5h Μεταφορά µεµβράνης TBA medium, 44 ± 0,5 C/19 C/19-20 h ή Χρήση ενός υλικού διπλής στρώσης TBA/TBA, επώαση 36 ± 2 C/4 C/4-5hκαι 44 ± 0,5 C/19 C/19-20 h

26 Επιβεβαίωση ISO n(2000) Rapid method Μεταφορά της µεµβράνης σε τρυβλίο που περιέχει ένα pad µε Kovacs Tυπικές αποικίες: : κόκκινες Υπολογισµός αποτελεσµάτων: ISO 8199 Οριο ανίχνευσης της µεθόδου <2

Σχετικά έγγραφα

I ΙΑΙΤΕΡΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΙΑΠΙΣΤΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ ΝΕΡΟΥ ΚΑΤΑ ISO 17025. ΠΗΓΕΣ ΑΝΟΜΟΙΟΓΕΝΕΙΑΣ ΚΑΙ ΛΑΘΩΝ

I ΙΑΙΤΕΡΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΙΑΠΙΣΤΕΥΣΗΣ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ ΝΕΡΟΥ ΚΑΤΑ ISO 17025. Ρ. Αθηνά Μαυρίδου Καθ. Μικροβιολογίας ΤΕΙ Αθήνας ΠΗΓΕΣ ΑΝΟΜΟΙΟΓΕΝΕΙΑΣ ΚΑΙ ΛΑΘΩΝ Φυσική ανοµοιογένεια νερού στην προέλευση