TRANSFORMACIJA sprejem in vključitev proste DNA v genom recipienta, pri čemer celice niso v medsebojnem kontaktu Pogoji za uspešno transformacijo

Transcript

1 Genetika izpit: nekaj pomembnejših tem. TRANSFORMACIJA Transformacija je sprejem in vključitev proste DNA v genom recipienta, pri čemer celice niso v medsebojnem kontaktu. Prenaša se le gola DNA. Celice sposobne sprejema so kompetentne celice. Gre za najbolj razširjen način razširjanja informacij. Pogoji za uspešno transformacijo: - minimalna velikost DNA ( fragmentov DNA/ celico; obrambni mehanizmi režejo DNA in na vsakem fragmentu ni našega gena in DNA se ne lomi na optimalne fragmente) Kompetenca je lahko naravna ali umetno inducirana. Celica postane kompetentna, ko se sprožijo SOB in SOS sistemi. G +, so naravno kompetentne, G -, niso naravno kompetentne (umetna indukcija v fazi eksp. rasti s Ca in temp. šokom) Frekvenco transformacije lahko povečamo s PEG (ostrani peptidoglikansko plast), z elektroporacijo, biolistiko Potek transformacije: 1. Dvojna DNA se pripne na površino celice. 2. Pri prehodu v celico se DNA odvija, v notranjost pride enojna DNA, zunanja nitka hidrolizira. Nastane eklipsni kompleks (enojna DNA in proteini za kompetenco). Ta gre v gostiteljevo DNA. 3. Nastane heterodupleks (povezava obeh DNA). Ključno vlogo ima protein reca. Pri evkariontih pride do rekombinacije brez homologije. 4. Izguba heterodupleksa in ekspresija. KONJUGACIJA Konjugacija je prenos DNA med dvema bakterijama, ki sta v neposrednem celičnem stiku. Stik omogočajo strukture pili. Iz bakt. celice donorja se v recipienta ponavadi prenese plazmidna DNA, če pa je plazmid integriran v kromosom donorja, se v celico recipienta prenese poleg plazmidne tudi kromosomska DNA donorja (Hfr sevi). Konjugacija poteka tudi med nesorodnimi celicami in med evkarionti in prokarionti. Pogoji za konjugacijo: - celice morajo biti sposobne vzpostaviti kontakt z drugimi celicami - potrebna je določena gostota celic - vsaj nekaj donorjeve DNA se mora mobilizirati Na začetku konjugacije se tvori konjugacijski agregat. Prenos Dna steče, ko je konjugacijski par stabiliziran. Konj. par nastane tako, da se F pilus donorja poveže s specifičnim receptorskim mestom na površini recipienta. Prenos se začne s prekinitvijo DNA na mestu orit. Za prekinitev je odgovorna endonukleaza. Ob prekinitvi se aktivira specifični gen, ki začne s podvojevanjem DNA v smeri 5-3 po modelu rolling circle. Za prenos DNA je odgovorna tra regija. Če bi želeli prenesti celoten plazmid, ki se je vgradil v kromosom recipienta, bi se zaradi lege orit mesta moral prenesti cel kromosom (traja dolgo), to se zgodi redko. Največ se prenese lastnosti blizu orit mesta, najmanj pa tistih, ki so daleč od tega mesta Če je na delu DNA, ki se prenese v recipienta mesto začetka sinteze DNA, bo sinteza potekla. Poleg tega se bo lahko preneseni del homologno rekombiniral s kromosomom recipienta (to omogoča reca) in informacija se bo ohranila. Če ni reca se bo informacija ob nadaljnih cel.delitvah izgubila. Razlike med donorsko in recipientsko celico: Donorske so moške ( so F+), recipientske so ženske in so F-. Prenos gebnetske materiala vedno poteka iz moške v žensko in nikoli obratno. F faktor je dvojna krožna molek. DNA, ki je v celici prisotna v eni sami kopiji, nosi inf. Za nastanek pilov (tra gen kodira pilin). 1

2 TRANSPOZICIJA Transpozicija je intracelularen prenos transpozicijskih elementov (Tn ali IS). Je premik dela DNA znotraj genoma. Vsi transponibilni elementi imajo na obeh koncih obrnjeno ponovitvi (IR), dolgi od bp. Nosijo tudi zapis za transpozazo, ki omogoča premikanje. Poznamo 2 mehanizma transpozicije - pri enostavna (konjugativni) transpoziciji se Tn izreže iz donorske in gre v tarčno DNA - pri replikativni transpoziciji se Tn podvoji, ena kopija ostane na istem mestu, druga pa se prenese drugam. Model transpozicije: (SHEMA!) a) Transpozaza veže oba konca Tn s tarčnim mestom in izreže Tn (eden konec se veže na notr.verigi, drugi pa na zunanji) - lahko se odvija intracelularno ali intercelularno - lahko se odvija med replikani ali znotraj enega replikana - Tn uporabljajo encime gostitelja, celica pa dobi npr.rezistenco na Ab Enostavna transpozicija b) Dodatna 2 reza ločita Tn od donorske DNA,, v donorju ostane praznina, ki je za celico smrtna c) Tn se v celoti prenese v recipienta d) DNA polimeraza doda nekaj nukleotidov in tako naredi kopijo tarčnega mesta (drop dead?) Replikativna transpozicija e)dna polimeraza kopira Tn verigi (kointegrat) f) Resolvaza povzroči delitev kointegrata na dve ločeni DNA, od katerih vsaka nosi kopijo Tn g) Če resolvaze ni, ostane kointegrat kot končni produkt ali pa pride do nepravilne cepitve. HOMOLOGNA REKOMBINACIJA Homologna rekombinacija se pojavi med dvema regijama, ki vsebuje homologni ali skoraj homologni sekvenci. Najprej mora priti do prekinitve povezave med verigama. Tu nastopi recbc protein, ki deluje kot nukleaza in helikaza. Veže se na konec DNA, potuje vzdolž DNA in pri tem odvija in nazaj zavija verigo. Ker je hitrost odvijanja večja, nastanejo začja ušesa (zanke DNA). Zanki rasteta dokler ne naletita na mestoχ, ta deluje kot nukleaza in reže vrvico. Prosti 3 OH konec je sedaj pripravljen za vezavo. RecA bo prepoznal ta konec in se povezal v spec.zaporedju (1 polipeptid na 5 nukleotidov). To enojno DNA bo priključil homologni dvojni vezi. Najprej bo odvijal dele dupleksa toliko časa, dokler ne najde homolognega zaporedja za DNA. Tako nastane hibridna DNA, reca pa se odcepi. Vmes dobimo začasni trojni heliks. RecA in recbc potrebujejo za delovanje ATP. Pogoji za homol.rekombinacijo: - zaporedji morata biti identični ali vsaj zelo podobni - dvojna vijačnica: kompl.baze so obrnjene navznoter, obstajati mora mehanizem, ki prepozna kompl.dele še pred odprtjem DNA- reca - potrebni so različni encimi (ATP-aze, endonukleaze, helikaze) Različni modeli: 1. najstarejši je model Hollidaya, pri rekombinaciji dveh dvojnih DNA vijačnic se pojavi intermediat Hollidayev mostiček, prosta rotacija osi DNA dopušča, da na mestu Holl. stika prehaja enojna veriga iz ene dvojne vijačnice na drugo vijačnico in obratno(dve dvojni DNA sta povezani z enojnima nitkama). Druga lastnost Hollidayeve strukture je zmožnost izomeracije. Branch migration- premikanje Holl. vezi MESTNOSPECIFIČNA REKOMBINACIJA Gre za premeščanje določenih odsekov iz enega mesta na drugo, prerazporeditev genov ali DNA. Pogoji: - kratki homologni odseki 2

3 - spec.encimi, ki odseke prepoznajo Prerazporeditev omogočajo transpozicijski elementi TRANSDUKCIJA Transdukcija je vnos DNA ali RNA s pomočjo virusa. Ločimo 2 vrsti transdukcije: 1. Splošna transdukcija: katerikoli del bakt.dna ali RNA postane del virusa. Da se bo nova genska informacija ohranila mora priti do homologne rekombinacije (reca). Tako pridobi bakt.sev nove lastnosti. Transdukcija je iz 2 procesov: - pakiranje gostiteljeve DNA v fagne glave - stabilna vključitev DNA v genom gostitelja Modelni bakt.fag je P22, po infekciji se DNA zaokroži, omogočeno je podvojevanje po modelu rolling circle in DNA ni več občutljiva na eksonukleaze. Virusna DNA se lahko s homol.rekombinacijo vključi v kromosom. DNA lahko ostane neintegrirana v citoplazmi, če ni mesta za podvajanje, jo razgradijo eksonukleaze S splošno transdukcijo ugotavljamo medsebojno lego genov na kromosomu. Če se dva gena kotransducirata (prenašata skupaj) sta blizu na kromosomu. 2. Specializirana transdukcija: je prenos specifične genske informacije, torej mora imeti fag nujno lizogeni cikel (znač. za temperirane fage), ki imajo specifično mesto vključitve. Imajo informacijo za 2 encima, prvi posreduje inf.za integracijo v bakterijo, drugi posreduje inf.za ekscizijo (če je ekscizija pravilna, se izreže le fagni genom, če je nepravilna pa se izreže tudi del bakt.genoma) Modeli bakt.fag je λ. Na konceh ima repe (mesti cos), kjer pride do cirkularizacije. λ prenaša informacijo, ki je najbližje mestu za integracijo faga. TRANSKRIPCIJA Transkripcija je prepis informacij iz DNA na mrna. Pri evkariontih poteka v jedru. Nastane premrna, ki vsebuje introne in eksone, introni se izrežejo, zrela mrna potuje v citoplazmo. Pri prokariontih ni jedra, prepis poteka v celici, ni procesiranja, istočasno s transkripcijo poteče translacija. Potek: Helikaza odvije heliks, RNA polimeraza je velik encimski kompleks iz σ faktorja in katalitičnega jedra. Ko faktor σzapusti ta kompleks nastane transkripcijski mehur, enojna RNA je sparjena z verigo DNA znotraj mehurja, RNA se sprosti. Spredaj se DNA odvija, zadaj zavija, mehur se pomika naprej- ves čas je odprtih 12-20bp. RNA se pomika naprej in dodaja bp, RNAp (polimeraza?) naleti na konec transkripcije, na ustrezno terminacijsko zaporedje. Pri evkariontih poteka podobno, le da tam sodelujejo 3 RNAp. TRANSLACIJA 3 Skupina zapletenih procesov, kjer sodelujejo mnogi encimi in pomožni proteini ter molekule trna, mrna in ribosomi. * ribosomi: 50S + 30S podenoti = 70S ribosomi (evkarionti 80S). Po končani translaciji ribosom razpade na podenoti, na začetku nove translacije pa se ponovno združita v ribosom. * rrna: prepisana iz DNA, vse rrna nastanejo kot večje prekurzorske molekule, ki se med procesiranjem zmanjšajo * trna: posebni encimi iz translacije aktivirajo aminoksl. in jih pritrdijo na trna, po obliki in funkciji so si trna podobne. 3 mesto CCA, na A se pritrdi specif. aminokislina

4 trna se približajo mrna in se razporedijo skladno z zaporedjem nukleotidov v mrna. Zaporedje tripletov na mrna je kodon. Ta kodira vrsto aminokislin, ki se vežejo v peptidno verigo. Kodon in ustrezna trna se prepoznata s pomočjo antikodona na trna. Na vsako trna je pritrjene samo ena ak. DNA Strukture DNA * Linearne strukture( enojni, dvojni, trojni heliks) (evkarionti, nekat.virusi) * Krožna struktura (virusi, večina vrst bakt.) Po obliki ločimo (vse so 2 verižne): A-DNA (desnosučna) B-DNA (desnosučna) Z-DNA (levosučna) Zgradba: iz purinskih (A; G) in pirimidinskih baz (T, C) A-DNA je kompaktna oblika, ki se pojavlja, ko je na razpolago malo vode. Je krajša, debelejša, med sosednjima baznima paroma je razdalja 2,7 A, bazni pari 30 iz osi. Veliki jarek je globok in ozek, mali jarek plitev in širok. B-DNA je najpogostejša oblika desnosučnega heliksa. Je dolga, tanka, med sosednjima bazanima paroma je razdalja 3,4 A, bazni pari so pribl. V osi heliksa. Veliki jarek je širok, mali jarek pa ozek. Z-DNA je levosučna z cik-cak izgledom, je daljša in tanjša kot B-DNA oblika, med sosednjima baznima paroma je razdalja 3,8 A, mali jarek je zelo ozek in globok. Z nastane iz B oblike in sicer: - če je v molek. izmenično purin-pirimidin in se G zavrti iz anti v sin - če pride do metilacije C na mestu 5 Trojni heliks: začasno nastane pri homol.rekombinaciji. Vpliva encim RecA, trojni heliks pa je stabilen tudi kasneje ko ni več reca. Enojna DNA po nekem mehanizmu prepozna dvojni heliks, se veže s purini in se vleže v veliki jarek in tako nastane trojni heliks. To omogoča zaščito DNA pred restriktazami in blokado nekaterih genov. Enojna DNA: le pri nekaterih bakt.fagih (M13), DNA je enojna le v fagu, ko fag okuži celico, se DNA podvoji. Je bolj zavita kot dvojna. Veljavni način podvojevanja DNA 4 Podvajanje je semikonservativno, v sintezni fazi interfaznega jedra. Iz materinskega heliksa nastaneta 2 hčerinska heliksa, ki imata vsak po eno matrično verigo in eno novo sintetizirano, zato je potrebno, da se heliksa ločita. Potek: * Helikaze odvijejo heliks, Za cepitev potrebujejo ATP. Ena helikaza se veže na lagging verigo in se pomika v smeri 5 3, druga helikaza pa se veže na leading verigo in se pomika v kontra smeri. * Stabilizacija izpostavljene enojne verige DNA s proteini SSB (nimajo encimske funkcije, ne potrebujejo ATP) * nastanejo replikacijske vilice * začetek sinteze z RNA polimerazo na mestu ori, začne prepisovati matrično DNA na RNA, primerje za okazakijeve fragmente naredijo posebne RNA- polimeraze= primaze, ki prepoznajo specif.zaporedja enojne verige DNA. V povezavi s 6 proteini primaza tvori primasom. Vsak okazakijev fragment se začne z RNA primerjem, ki ga naredi primosom. Ta se pomika od 5 3 koncu. Primosom začne sintezo RNA primerja na na specifičnih sekvencah. Primosom se pomika po verigi DNA v nasprotni smeri kot kadar katalizira sintezo lastne RNA.

5 * DNA polimeraza III zapolni razpoke med okazakijevimi fragmenti in hkrati odstranjuje odstranjuje RNA primerje na 5 koncu sosednjega fragment, ima polimerazno in hkrati eksonukleazno funkcijo za smer 3 5 in 5 3, zato lahko odstrani deoksiribonukleotide kot tudi ribonukleotide. * Na koncu delujejo še ligaze, ki dokončno zlepijo vrvice. Najprej pride do sinteze leading verige (kontinuirano podvajane v smeri 5 3), nato še do sinteze lagging verige (podvajanje z okazakijevimi fragmenti v smeri 3 5). Podvojevalni kompeks proteinov= replisom (DNA polimeraza III + primasom * helikaza), replisom je najpomembnejši del, ki vodi podvojevalni proces. MEHANIZMI S KATERIMI SE POPRAVLJAJO NAPAKE PRI PODVAJANJU a) EKSCIZIJSKA POPRAVLJANJA + EKSCIZIJSKO POPRAVLJANJE Z odstranitvijo poškodovne baze ali celega segmenta nukleotidov pride do nadomestne sinteze odstranjenega z matrico. Pri popravljanju sodeluje sistem proteinov: - prost OH konec - UvrA pripelje UvrB na mesto popkodbe - UvrB izreže 12 nukleotidov dolg segment - DNA polimeraza začne s popravljalno sintezo - UvrC zlepi - ligaza naredi fosfodiestrsko vez Popravljanje je lahko vezano na transkripcijo (RNA polimeraza se ustavi zaradi poškodbe, encimi ekscizijskega popravljanja se sprožijo) 5 + EKSCIZIJSKI POPRAVLJALNI MEHANIZEM Z GLIKOZILAZAMI Je mehanizem popravljanja poškodovane DNA z glikolzilazami na osnovi spremenjenih baz. - endonukleaze zaznajo luknje, odstranijo baze tako, da fosfodiestrska vez ni poškodovana - DNA polimeraza manjkajoče dele nadomesti z sintezo - ligaza zlepi in naredi fosfodiestrsko vez + KOREKCIJSKO POPRAVLJANJE (missmatch) Popravi napake, ki so ušle endonukleazni aktivnosti, tako da odstrani poškodovano bazo ali cel segment nukleotidovpopravljanje kodirajo geni MutH, MutL in MutS. Korekcijski mehanizem izreže, DNA polimeraza sintetizira nove, ligaza zlepi in naredi fosfodiestrsko vez. b) REKOMBINACIJSKO POPRAVLJANJE Popravljanje s pomočjo rekombinacije v 1 ali 2 verigah, genetična izmenjava Pomaga takrat, ko ni na voljo komplementarne verige DNA, da bi prišlo do popravljanja. Inform. je tako izgubljena. Evkario: celice v kromosomu diploidne in imajo kopijo, prokario: σ ima vedno eno ali več kopij istega kromosoma. c) REVERZNO POPRAVLJANJE Ko je DNA poškodovana z UV svetlobo, RNA in DNA polimeraza se ustavita na poškodovanem mestu, pojavi se enojna veriga, aktivira se popravljalni mehanizem. Fotoreaktivacija popravljanje z reverzijo(nastanek pirimidinskih dimerov) ERROR-PRONE REPAIR

6 Baze, ki so preveč poškodovane za parjenje pospešujejo mutacije. Celica izbere tehniko, da je bolje vključiti bazo, ki je verjetno napačna in omogočiti nadaljevanje replikacije, kot pa da je sploh ni. Mutacije so tu zelo številne. (poskus z apurinsko verigo). Sodeujete gena UmuC in UmuD, ter reca. 6 INICIACIJA Začetna (iniciatorska) trna, začne se z metioninom, ki pa ga encimi naknadno odstranijo. Prokarionti: amino skupina je blokirana s formilno skupino Sinteza se začne z nastankom iniciacijskega kompleksa (mrna + f-trna met f + 30S ribososka podenota) pod vplivom specifičnih proteinov = iniciacijskih faktorjev (vsaj 3) Energija se sprošča iz GTP. Nato pride do vezave z večjo ribosomsko podenoto- 50S, f-trna se veže na mesto P- na ribosomu( to je mesto sinteze polipeptidov). ELONGACIJA Potrebna sta 2 elongacijska faktorja. Tri stopnje: - aminoacil-trna molekula se veže na mesto A tako, da se antikodon na trna poveže z kodonom na mrna - karboksilni konec polipeptidne verige se loči od trna na mestu P in se poveže s peptidno vezjo na aminoksl., vezano na trna na mestu A. Reakcijo katalizira encim peptidil transferaza. - nova peptidil-trna na mestu A se premakne na mesto P, ko se ribosom premakne natanko za en kodon vzdolž mrna. Ta korak potrebuje energijo, ki jo dobi iz hidrolize GTP. Molekule trna, ki se pri tem sprostijo, se vrnejo v citoplazmo. Ribosomi se pomikajo vzdolž mrna v smeri 5 3, ki je tudi smer sinteze RNA.